ELECTROFOREZA

Definiie
Electroforeza reprezint o tehnic de separare a proteinelor bazat pe migrarea acestora n
cmp electric.

Aceste metode nu sunt utilizate pentru a purifica mari cantiti de proteine deoarece
exist metode alternative mai simple iar metodele electroforetice afecteaz structura i
funcia proteinelor.
Electroforeza este util ca metod analitic.
Avantajul major este acela c proteinele pot fi vizualizate i separate n acelai timp,
permind estimarea rapid a numrului de proteine dintr-un amestec sau gradul de
puritate al unui preparat proteic specific.
Electroforeza permite, de asemenea, determinarea proprietilor fundamentale ale
proteinelor cum ar fi punctul izoelectric sau greutatea molecular.

Generaliti
Migrarea electroforetic a unei molecule n orice tip de mediu are loc n direcia
electrodului cu ncrcare electric de sens opus ncrcrii nete a moleculei. Astfel,
moleculele ncrcate negativ vor migra spre electrodul pozitiv; cationii vor migra spre
catod (-) iar anionii spre anod (+). Mediul de migrare trebuie s fie tamponat la un pH
care determin o direcie i o rat de migrare specifice. Mobilitatea proteinelor crete cu
ct pH-ul este mai ndeprtat de punctul izoelectric (pI), crescnd astfel ncrcarea net.
Cu toate acestea, rezoluia de separare bazat pe diferenele de ncrcare net este mai
bun dac diferena de ncrcare este redus sau se apropie de zero la pI.

Electroforeza se desfoar fie pe hrtie sau pe geluri. Gelurile pot fi de agaroz sau
poliacrilamid.

Electroforeza pe gel de poliacrilamid
Gelul de poliacrilamid acioneaz ca o sit molecular, ncetinind micarea proteinelor
proporional cu raportul mas molecular / ncrcare electric. Migrarea poate fi afectat
i de forma moleculelor. n concluzie, migrarea unei proteine n gel este o funcie de
dimensiune i form.


Electroforez vertical pe gel de poliacrilamid
(schem). Proteinele migreaz n gel la aplicarea unui
cmp electric. Gelul inhib dezvoltarea curenilor de
convecie datorai gradienilor mici de temperatur sau
migrrile induse de alte cauze dect cmpul electric.
Identificarea proteinelor dup colorarea
proteinelor din gel cu albastru Coomassie.
Fiecare band din gel reprezint o protein
diferit. Proteinele mai mici se deplaseaz n
gel mai rapid dect cele mari. Acest exemplu
ilustreaz separarea unei enzime. Prima
coloan prezint migrarea proteinelor din
extractul celular nepurificat. Celelalte coloane,
de la stnga la dreapta reprezint proteinele
migrate dup fiecare pas. Pe ultima coloan se
observ migrarea celor 4 subuniti ale
enzimei.

Pentru a migra proteinele n gel este nevoie de extragerea lor din context. Cele mai
comune metode electroforetice de determinare a puritii i masei moleculare utilizeaz
pentru extracie un detergent, numit SDS (sodium-dodecil-sulfat). Acesta se cupleaz la
proteine n cantiti relativ proporionale cu greutatea molecular a proteinei, adic 1
molecul SDS la fiecare 2 reziduuri de aminoacizi. SDS determin o ncrcare negativ
net, fcnd nesemnificativ ncrcarea intrinsec a proteinei i oferind tuturor
proteinelor din amestec un raport mas/ncrcare similar. Astfel, electroforeza n prezena
SDS ine cont aproape n exclusivitate de masa molecular, polipeptidele mici migrnd
mai repede.
Dup electroforez, vizualizarea proteinelor se face prin adugarea unui colorant (cel mai
folosit albastru Coomassie) care se leag la proteine, fr a colora gelul.
Prin aceast metod, cercettorul poate monitoriza progresiunea unui proces de purificare
proteic cum ar fi fracionarea celular. Compararea poziiilor benzilor de migrare cu
geluri standard face facil identificarea unor proteine cu greutate molecular
necunoscut.
DE MEMORAT
pI punctul izoelectric punctul izoelectric este pHul la care ncrcarea net total a
unei molecule amfotere devine zero. Punctul izoelectric depinde de tria ionic a
solventului, de speciile contraionice i de concentraia de solvii n timp ce punctul
izoionic este punctul izoelectric n absena contraionilor i la concentraii sczute de
solvit. Punctul izoelectric este uor de determinat ca pHul la care molecula este imobil
ntr-un experiment de electroforez (focusare izoelectric). Punctul izoelectric se apropie
de punctul izoionic la o trie ionic sczut, cnd legturile ionice sunt inactivate. La
punctul izoelectric, moleculele amfotere se agreg i devin insolubile deoarece nu exist
repulsie electrostatic ntre molecule cu aceeai ncrcare net.

Electroforeza reprezint o metod de analiz i separare bazat pe migrarea particulelor
solide dispersate ntr-un lichid sub aciunea unui cmp electric. Denumirea de
electroforez provine din greaca veche i latin, unde cuvntul electron (electric)
combinat cu cel latin phore (purttor), evideniaz astfel rolul esenial al cmpului
electric n procedeul descris.
Dei este cunoscut nc de la sfritul secolului XIX, electroforeza se afirm ca o
metod analitic de separare abia n urma lucrrilor referitoare la stadiul unor proteine
(1937) elaborate de Arne Tiselius, laureat al premiului Nobel, numit i printele
electroforezei.

Electroforeza este o metod standard utilizat n studiile de biologie molecular.
Principiul metodei se bazeaz pe migrarea n cmp electric a moleculelor ncrcate
negative n funcie de dimensiunea i forma lor. Astfel moleculele de dimensiuni mici vor
migra mai rapid spre polul pozitiv (anod) comparativ cu moleculele de dimensiuni mai
mari.

Electroforeza este o metod fizico-chimic de analiza ce permite separarea
macromeculelor (proteine sau acizi nucleici) sau a monomerilor specifici (aminoacizi,
nucleotide), pe baza diferenelor ntre vitezele de deplasare ntr-un cmp electric aplicat
mediului respectiv. Ca urmare a caracterului lor amfoter, proteinele posed o sarcin
electric ce depinde de natura moleculei, pH i de compoziia mediului. Moleculele
ncrcate electric, aflate n soluie i supuse aciunii unui cmp electric, vor migra ctre
electrodul de polaritate opus.
Electroforeza este o metoda analitic ce permite:
- vizualizarea i separarea n acelai timp, permind estimarea rapid a numrului
de proteine dintr-un amestec sau gradul de puritate al unui preparat proteic
specific;
- determinarea proprietilor fundamentale ale proteinelor cum ar fi punctul
izoelectric (pI) sau greutatea molecular. pI punctul izoelectric este pH-ul la
care ncrcarea net total a unei molecule amfotere devine zero i mobilitatea
este nul.)

Viteza cu care se deplaseaz o particul ntr-un cmp electric depinde de mai muli
factori: densitatea de sarcin electric la suprafaa particulei (funcie de mrimea sarcinii
i de volumul particulei), densitatea particulei, gradientul de potenial (reprezentat de
raportul dintre diferena de potenial dintre electrozi i distana dintre acestea), fora
ionic a mediului, vscozitatea lui, temperatura. De aceeai factori depinde i gradul de
rezoluie al unei metode electroforetice, natura suportului folosit i pH-ul mediului fiind
decisive.

TIPURI DE ELECTROFOREZ
De-a lungul timpului s-au folosit mai multe suporturi electroforetice, gelul de agaroz
fiind cel care asigur cea mai bun rezoluie. Se cunosc mai multe tipuri de electroforeza
n gel de agaroz: tehnica standard, electroforeza n gel de SDS-agaroza (la care
adugarea SDS - sodium dodecil sulfat n compoziia suportului electroforetic permite
separarea fraciunilor pe baza masei moleculare) i focalizarea izoelectric
n studiile de biologie molecular migrarea poate fi efectuat prin utilizarea a dou tipuri
de gel: de agaroz i de poliacrilamid. Pe lng componentul de baz utilizat, cele
dou geluri se difereniaz i prin rezoluia de separare.

ELECTROFOREZA PE GEL DE AGAROZ
Agaroza este preferat n cazul moleculelor de acid nucleic mai mari, cu dimensiuni
cuprinse n intervalul 0,5-25 kpb, iar gelul de poliacrilamid pentru fragmentele de pn
la 1000 perechi de baze (bp).

Agaroza este un polizaharid extras din anumite specii de alge care prin polimerizare
formeaz o reea neutr. Structura neutr a gelului de agaroz constituie un avantaj
deoarece acesta nu va interaciona
cu moleculele hidrofobe supuse migrrii electroforetice. Dimensiunea porilor difer n
funcie de concentraia de agaroz utilizat, ntre cele dou existnd o relaie de invers-
proporionalitate. (Clarck, 2010)
- Prepararea gelului de agaroz 2%:
o gelul de agaroz se obine prin dizolvarea agarozei ntr-o soluie tampon
prin nclzire
o dup rcire, cteva minute, soluia de agaroz se toarn ntr-o tvi
special
o se fixeaz pieptenele pentru formarea godeurilor i se las la rcit.
o n urma rcirii, gelul de agaroz se va prezenta sub forma unei reele cu
pori de dimensiuni cuprinse ntre 100 i 300 nm.
o ncrcarea probelor: n fiecare godeu se depune o cantitate de 5l AND
amestecat cu 1l de tampon de ncrcare. Tamponul de ncrcare utilizat
conine un amestec de doi colorani, albastru de brom fenol i xilen cianol.
Cei doi compui au mas molecular determinat ceea ce permite
observarea evoluiei electroforetice a probelor ncrcate.
o condiii de migrare: s-a utilizat ca tampon de migrare TBE 1x (Tris-Borat-
EDTA) i s-a aplicat o tensiune de 5 V/cm.
o vizualizare: pentru vizualizarea fragmentelor de ADN se folosete
coloraia cu bromur de etidiu. Bromura de etidiu este un agent intercalant
fluorescent care se fixeaz ntre bazele azotate ale moleculelor de ADN.
Prin expunerea la lampa UV moleculele de ADN apar sub forma
unor benzi de culoare portocalie. Utilizarea bromurii de etidiu presupune
o serie de msuri de protecie deoarece este considerat a fi un puternic
agent mutagen.



Fig. 1 Etapele electroforezei n gel de agaroz. Agaroza se dizolv ntr-o soluie tampon
prin nclzire i se toarn ntr-o tvi special (a, b) Pentru formarea godeurilor se
fixeaz un pieptene astfel nct probele s migreze de la acelai nivel (c). Dup rcire,
gelul se depune n cuva de migrare, n care se afl tamponul de migrare n cantitate
suficient ct s acopere gelul. Probele sunt ncrcate n godeuri separate dup ce au fost
amestecate n prealabil cu un colorant - loading dye (d.). Dup ncrcarea probelor se
pune capacul la cuva de migrare, se fixeaz anodul la captul opus godeurilor cu probele
de analizat i se seteaz la un voltaj de 5 V/cm (e.)

ELECTROFOREZA N GEL DE POLIACRILAMID (PAGE)
Migrarea electroforetic n gel de poliacrilamid este preferat pentru separarea
fragmentelor de ADN de mici dimensiuni datorit puterii de rezoluie mare, care permite
diferenierea fragmentele ce se deosebesc chiar i printr-o singur pereche de baze.
Gelul de poliacrilamid se obine n urma reaciei de polimerizare dintre
acrilamid,unitatea de baz i N,N-metilen-bis-acrilamid, agentul de reticulare.
Reacia de polimerizare este catalizat de: TEMED (N,N,N,N-tetra-metilen-diamin) i
APS (persulfat de amoniu).
n urma reaciei se formeaz o reea de pori. Dimensiunea porilor este invers
proporional cu concentraia de acrilamid: bis-acrilamid din soluie.

Electroforeza n gel de agaroza prezint cteva avantaje, cele mai importante fiind:
gradul mare de rezoluie, specificitate i sensibilitate
rapiditatea, conferit de posibilitatea analizei simultane a mai multor parametri, ca
urmare a independenei totale a celor dou module (de migrare i colorare)
gradul mare de reproductibilitate prin implicarea minim a factorului uman la
metodele manuale)
diversificarea parametrilor investigai (proteine, lipoproteine, izoenzime,
hemoglobine normale i patologice)
Aplicabilitatea n cazul mai multor lichide biologice (ser dar i urin, LCR i altele),
precum i faptul c pentru aceste lichide nu mai este nevoie de concentrarea lor, fiind
astfel nlturat un neajuns important care fcea, de multe ori, impracticabila metod
pentru electroforeza proteinelor urinare, din LCR i din alte fluide hipoproteice