CUPRINS

INTRODUCERE................................................................ 3
OBIECTIVE.....................................................................4

PARTEA GENERALA
CAPITOLUL I - NITRAII SI NITRIII COMPONENTE
NATURALE ALE PRODUSELOR ALIMENTARE......................5
CAPITOLUL II - NITRAII I NITRIII ADITIVI
ALIMENTARI...................................................................7
CAPITOLUL III - NITRAII I NITRIII PRECURSORI AI
NITROZAMINELOR.........................................................12

PARTEA EXPERIMENTALA
CAPITOLUL IV - ANALIZA CANTITATIV A NITRAILOR I
NITRIILOR DIN PRODUSE ALIMENTARE........................... 18
IV. 3. 4. DETERMINAREA NITRIILOR.......................................18
IV. 3. 5. DETERMINAREA NITRAILOR......................................20
IV. 4. REZULTATE.............................................................22
CAPITOLUL V - EVIDENIEREA FORMRII
NITROZAMINELOR N PREPARATELE DIN CARNE..............25
V. 2. OBIECTIVE..............................................................26
V. 3. 4. METODE..............................................................27
V. 4. REZULTATE..............................................................29
CAPITOLUL VI - ESTIMAREA APORTULUI DE NITRAI I
DE NITRII PRIN CONSUM DE ALIMENTE...........................35
VI. 5. OBIECTIV..............................................................35
VI. 6. MENIURI...............................................................35
VI. 8. REZULTATE............................................................ 36
CAPITOLUL VII - EFECTUL ADMINISTRRII
NITROZODIETILAMINEI ASUPRA UNOR PARAMETRI
BIOCHIMICI I HEMATOLOGICI LA OBOLANI...................38
VII. 2. OBIECTIVE............................................................39
VII. 3. 3. ANIMALE DE LABORATOR........................................39
VII. 3. 5. INVESTIGAIA BIOCHIMIC.......................................39
VII. 3. 6. INVESTIGAIA HEMATOLOGIC..................................40
VII. 4. REZULTATE...........................................................41
CONCLUZII GENERALE...................................................42
1

BIBLIOGRAFIE SELECTIV............................................. 45

INTRODUCERE
Preocuparea pentru asigurarea resurselor alimentare pe tot
parcursul anului a condus la necesitatea conservrii alimentelor. Primele
metode de conservare aplicate au fost deshidratarea, srarea i
afumarea. Odat cu descifrarea mecanismelor prin care se produce
alterarea alimentelor, s-au putut descoperi i aplica metode eficiente de
conservare, care s asigure att stabilitatea chimic i microbiologic
a produselor alimentare, ct i satisfacerea exigenelor
consumatorilor, prin meninerea nemodificat a proprietilor
senzoriale i a valorii nutritive a alimentelor.
Nitriii prezint toxicitate direct, manifestat prin oxidarea
hemoglobinei la methemoglobin, respectiv toxicitate indirect,
datorat participrii nitriilor la formarea de nitrozamine.
Toxicitatea nitrailor se manifest i prin capacitatea de a se
transforma n nitrozamine; nitrozaminele se pot forma att n produsele
alimentare (origine exogen), n timpul pstrrii acestora, ct i n
aparatul digestiv (origine endogen), n special n stomac.

Cele mai frecvente nitrozamine ntlnite n produsele din carne sunt:

nitrozodimetilamina
(NDMA),
nitrozodietilamina
(NDEA),
nitrozodipropilamina (NDPA), nitrozodibutilamina (NDBA),
nitrozopirolidina (Npir) i nitrozopiperidina (Npip).
Expunerea populaiei la doze sczute de nitrozamine
volatile poate avea loc i pe cale dermic, n principal n urma
utilizrii produselor cosmetice i pe baz de cauciuc, dar i pe
cale inhalatorie, att prin fumat activ, ct i prin fumat pasiv.
Agenia Internaional pentru Cercetarea Cancerului a
clasificat nitrozo-dimetilamina i nitrozodietilamina n categoria 2
de carcinogenitate i mutagenitate.
Legislaia alimentului limiteaz coninutul de nitrai,
nitrii i nitrozamine al produselor alimentare.
Formarea nitrozaminelor n timpul pstrrii alimentelor pe
seama nitritului rezidual a fost evideniat prin analiza n dinamic a
concentraiilor de nitrat, nitrit i nitrozamine iar toxicitatea NDEA a
fost studiat la animale de laborator (obolani masculi din rasa
3

Wistar).
1

OBIECTIVE
Cercetrile din cadrul tezei de doctorat au urmrit ca obiective:
1. Determinarea coninutului n nitrai i nitrii al unor
produse alimentare (fructe, legume, brnzeturi fermentate
i preparate din carne).
2. Determinarea coninutului n nitrozamine volatile
(nitrozodimetilamina NDMA i nitrozodietilamina NDEA) al unor produse alimentare (brnzeturi fermentate
i preparate din carne); pentru evaluarea dinamicii
formrii nitrozaminelor s-a urmrit prin experiment,
coninutul acestora n produse din carne (preparate n
laborator), respectiv produse industriale.
3. Estimarea aportului de nitrai i nitrii prin consum de
alimente.
4. Studiul experimental privind evoluia unor parametri
biochimici i hematologici n intoxicaia subacut
experimental cu nitrozodietilamin, la animale de laborator.

PARTEA GENERAL
CAPITOLUL I
NITRAII SI NITRIII COMPONENTE NATURALE ALE
PRODUSELOR ALIMENTARE
I.1. Introducere
Multe dintre produsele de origine vegetal, consumate ca
alimente, pot conine n mod natural compui care sunt considerai
responsabili de mbolnviri ale organismului consumatorului. Pentru
marea majoritate a acestor produse este cunoscut substana
responsabil de aciunea toxic, precum i modalitile prin care se
poate reduce nocivitatea asupra organismului.

Azotaii i azotiii au o origine dubl n produsele

alimentare. Sunt componeni naturali ai alimentelor vegetale (n
special legume i fructe) dintre care unele au capacitatea de a
acumula aceste substane din sol.
n acelai timp, azotaii i azotiii sunt aditivi alimentari adugai
pentru meninerea culorii roz a preparatelor de carne, dar i

n scop conservant (preparate de carne, brnzeturi).

Reducerea nitrailor la nitrii se realizeaz de ctre
reductazele microorganismelor din produsul alimentar; nitriii
rezultai sunt mult mai toxici dect nitraii. Efectele toxice sunt
directe, prin apariia methemoglobinemiei, i indirecte, prin
formarea nitrozaminelor cu aciune cancerigen i mutagen.
I.3. Coninutul de nitrai i de nitrii al produselor vegetale
Nitraii i nitriii pot s apar n apa potabil ca urmare a
activit ilor agricole. Compuii ce conin azotai sunt de obicei solubili
i pot s migreze usor n apele subterane. Folosirea ngrmintelor
pe baz de azot, precum i a ngrmitelor naturale pot crete
7

concentraia de nitrat n sol i implicit n ap. Compusul predominant

n apele de suprafa ct i n cele subterane este

nitratul, nitritul gsindu-se de obicei n concentraii mici, acesta

fiind uor oxidat la nitrat. Apele de fntn din zonele poluate
pot s conin niveluri ridicate de nitrai (Knobeloch et al., 2000).
n alimentaia unei persoane, apa potabil este
considerat a fi cea mai important surs de nitrai, dup legume,
de aceea au fost stabilite anumite limite pentru nitrai i nitrii n apa
potabil : 50 mg/L, respectiv 0,5 mg/L. n Romnia, coninutul n
nitrai al unor ape mbuteliate este redus, cu mult sub valoarea
admis de legislaia sanitar, de 50 mg/L
Concentraiile de nitrai n produsele de origine vegetal
depind de condiiile climatice, caracteristicile plantelor ct i de
proprietile solului unde au fost cultivate: mrimea plantei,
vrsta plantei, intensitatea luminii, temperatura aerului, umiditate,
perioada de cultivare, tipul de ngrmnt, momentul recoltrii,
condiiile de pstrare i depozitare, etc. ngrmintele pe
baz de azot i intensitatea luminii sunt principalii factori care
influeneaz coninutul de nitrai din plante (Santamaria, 2006).
n funcie de aceste niveluri legumele pot fi mprite n trei
categorii (Tamme et al., 2006):
a) plante cu un coninut n nitrai > 1000 mg/kg : rucol
(voinicic), salat verde, spanac, sfecl roie, etc.
b) plante cu un coninut n nitrai cuprins ntre 50-1000 mg/kg
: morcovi, fasole verde, conopid, ceap, dovleac,
vinete, cartofi, etc.
c) plante cu un coninut n nitrai mai mic de 50 mg/kg :
fructe, fructe de pdure, cereale, etc.
n general, legumele care acumuleaz cele mai mari cantiti
de nitrat aparin familiei Brassicaceae (rucol, ridiche, mutar, etc),
Chenopodiaceae (sfecl, spanac), Amaranthaceae (Amarathus),
Asteraceae (salat) i Apiaceae (elin, ptrunjel) (Santamaria 2006).
Cantiti mari au fost gsite n rucol, o legum exotic ce este
originar din rile mediteraneene. Utilizarea excesiv a
ngrmintelor pe baz de azot n ultimii ani au dus la creterea
concentraiilor de nitrai n plantele de cultur ct i n sursele de ap

potabil (Santamaria, 2006).

Plantele consumate integral (rdcin, tulpin i frunze) conduc
9

la un aport mai mare de nitrai dect n cazul plantelor a cror pri

10

comestibile sunt doar fructele (Fytianos et al.,1999). n mod similar

Santamaria et al. (1999) a afirmat c nivelul de nitrai n diferite organe
ale plantei difer n funcie de intensitatea unor procese metabolice.
Concentraia de nitrai scade dup cum urmeaz: peiol > frunze >
tulpin > rdcin > inflorescen > tubercul > bulb > fruct

> semine.
ntr-un studiu realizat de Uwah et al., (2009) sunt prezentate i
valorile nitriilor, care sunt mult mai mici n comparaie cu cele ale
nitrailor: 14,46 0,32 mg/kg n varz, 28,83 14,53 mg/kg n
salat, 44,85 3,42 mg/kg n spanac.
Alte studii prezint valori mult mai mici ale nitriilor n legumele
proaspete: 0,09-0,77 mg/kg n spanac (Jaworska, 2005), 0,472 mg/kg n
varz alb, 0,29 mg/kg n castravei, 0,23 mg/kg n roii (Zhong et al.,
2002), 0,2 mg/kg n varz alb, 0,3 mg/kg n salat verde, 1,2 mg/kg
n cartofi (Suin et al., 2006), 4,15 mg/kg n morcovi, 2 mg/kg n elin
(Menard et al., 2008). Unii autori au raportat valori ale nitriilor mai mici
de 4,77 mg/kg n varz alb. Pentru salat verde, o valoare maxim
de 25 mg/kg a fost obinut de Menard et al. (2008) i pentru spanac
a fost raportat o valoare maxim de 220 mg/kg.

Concentraiile de nitrii pot crete foarte mult n legume prin

reducerea nitrailor prin mecanisme microbiologice, n timp ce
concentraia de nitrai va scdea la temperatura camerei..
CAPITOLUL II
NITRAII I NITRIII ADITIVI ALIMENTARI
II.1. Introducere
Majoritatea produselor alimentare i modific proprietile
organoleptice i uneori chiar i compoziia chimic dac, dup
recoltare, nu sunt pstrate n condiii optime sau nu se
ntreprind msurile necesare pentru conservarea lor.
Conservarea alimentelor reprezint modalitatea prin
care se intervine pentru a preveni procesele de alterare, deci pentru a
le menine nemodificate proprietile organoleptice i valoarea
11

nutritiv un timp ct mai ndelungat.

5

12

Metodele utilizate pentru conservarea alimentelor sunt variate;

se bazeaz pe principii i aciuni diferite, iar rezultatele obinute
sunt diferite, n funcie de metoda aplicat i de natura produsului
alimentar supus conservrii. Primele metode de conservare
aplicate au fost deshidratarea, srarea i afumarea. n timp, prin
cunoaterea mecanismelor prin care se produce alterarea alimentelor,
s-au putut aplica metode eficiente de conservare, care s asigure
stabiliatea chimic i microbiologic a produselor alimentare.
Metodele de conservare aplicate n prezent (metode fizice
i metode chimice) urmresc n tot mai mare msur satisfacerea
exigenelor consumatorilor, prin meninerea nemodificat a
proprietilor organoleptice i a valorii nutritive a alimentelor.
Calitatea alimentului conservat chimic depinde, n primul
rnd, de calitatea materiei prime i de gradul iniial de
contaminare microbian; conservanii nu pot mbunti
proprietile
unui
aliment
alterat,
ci
conserv
caracteristicile iniiale ale produsului pentru un anumit
interval de timp.
Utilizarea conservanilor chimici este justificat numai
dac substana propus rspunde urmtoarelor cerine:
; este eficient n concentraii minime;
; este utilizat numai atunci cnd nu se pot aplica alte
metode;
; are capacitatea de a prelungi viaa util a alimentului;
; nu diminueaz proprietile senzoriale ale alimentului;
; este uor solubil;
; este activ la un interval larg al variaiilor de pH;
; este lipsit de toxicitate la concentraiile n care se
utilizeaz;
; se poate analiza chimic prin metode accesibile;
; nu influeneaz negativ activitatea enzimelor digestive;
; nu interacioneaz cu componente ale alimentului cu
formarea unor componente toxice sau cu utilizare
digestiv redus;
; se poate ncorpora uniform n aliment;
; manifest un spectru antimicrobian larg.
13

n general, la dozele n care sunt utilizai, conservanii

chimici nu sunt substane bactericide, ci doar bacteriostatice.
6

14

Aciunea conservanilor chimici este influenat de diferii

factori: specia microbian, natura alimentului, pH,
temperatur, timpul de contact (Cuciureanu, 2005).
II. 2. Legislaie
rile Uniunii Europene (UE) utilizeaz o legislaie
comun cu privire la aditivii utilizai n industria alimentar.
Organisme specializate din cadrul UE au examinat rolul unor
substane chimice n elaborarea alimentelor i au stabilit
distincii ntre substane exercitnd asupra alimentului un efect
funcional permanent (aditiv) i acela de a fi un simplu
component cu efect tranzitoriu (auxiliar tehnologic).
Referitor la utilizarea nitriilor de sodiu, respectiv de potasiu

(E249-E250), Regulamentul (UE) nr. 1129/2011 al Comisiei din

11.11.2011 de modificare a anexei II la Regulamentul (CE) nr.
1333/2008 al Parlamentului European i al Consiliului prin stabilirea
unei liste a Uniunii a aditivilor alimentari face urmtoarele precizri:
Este necesar s se foloseasc nitrii (E 249-250) ca i conservani
n produsele din carne pentru a controla eventuala dezvoltare a unor
bacterii duntoare, n special Clostridium botulinum. Utilizarea
nitriilor n carne poate duce ns la formarea de nitrozamine, care
sunt substane cancerigene. Autorizarea actual a nitriilor ca
aditivi alimentari reprezint o cale de mijloc ntre aceste efecte,
innd cont de avizul tiinific al autoritii i de necesitatea de a
menine anumite alimente tradiionale pe pia.

II. 3. Mecanismul de aciune al nitrailor i nitriilor utilizai

pentru conservarea alimentelor
Nitraii i nitriii de sodiu i de potasiu (E 249 - E 252) se
folosesc att pentru aciunea conservant, dar mai ales pentru
fixarea culorii crnii i preparatelor de carne, alturi de clorura
de sodiu, acidul ascorbic i sorbatul de potasiu.
Ionul azotat ca atare nu are efect asupra culorii crnii, el
servind ca surs de azotit. Transformarea azotatului n azotit are loc
15

pe cale bacterian, de ctre nitrat-reductaze, la pH mai mare de 5,8.

16

Reducerea nitrailor n nitrii este lent; aceasta are loc la

4-6C, n mediu microaerofil i n prezenta unor mici cantiti de
zahr. Nitraii, odat transformai n nitriii se comport ca acetia
Mecanismul de aciune al azotiilor este explicat prin reacia
monoxidului de azot cu mioglobina, cu formarea nitrozo-mioglobinei
(coloratul specific al crnii srate, netratate termic); prin fierbere,
nitrozo-mioglobina trece n nitrozo-hemocromogen. Hemoglobina
reacioneaz n acelai mod cu nitriii adugai ca aditiv.
n afar de aciunea de fixare a culorii crnii, nitraii
introdui n aliment au rol important n formarea aromei i
gustului crnii; este unanim acceptat faptul c savoarea
alimentelor n care au fost ncorporai nitrai este mai plcut. Acest
fenomen s-ar explica prin participarea florei microbiene, care
realizeaz reducerea nitrailor la nitrii, la formarea aromei i gustului
crnii.
Nitriii, adugai ca atare n aliment sau provenii din
reducerea nitrailor, manifest aciune antimicrobian moderat
(mai ales n asociere cu clorura de sodiu, n mediu acid), aciune
antioxidant (datorit caracterului reductor); nitriii sunt implicai
n formarea unui inhibitor eficace al creterii bacteriei anaerobe
sporulate, Clostridium botulinum, care produce neurotoxine foarte
active.
Marele risc al utilizrii nitriilor l reprezint proprietatea
acestora de a reaciona cu aminele, aminoacizii, i de a forma
nitrozaminele, compui puternic cancerigeni; de altfel, chiar
nitriii ca atare, ar putea fi cancerigeni.
Risc crescut de formare a nitrozaminelor apare n produsele
ce urmeaz a fi prelucrate termic nainte de consum (are loc
reoxidarea NO la NO2).
Utilizarea concomitent a nitriilor i a acidului ascorbic
ca aditivi n preparatele de carne, manifest o aciune
benefic, deoarece acesta din urm, blocnd excesul de nitrii,
inhib formarea nitrozaminelor.
Factorii care afecteaz consumul nitriilor n preparatele
din carne, sunt:
-coninutul n proteine i lipide
17

-pH-ul crnii, temperatura de maturare i durata

procesului de maturare
8

18

-prezena agenilor reductori (ascorbai, erithorbai)

-coninutul de mioglobin i hemoglobin rezidual din
carne -activitatea enzimelor proprii crnii care contribuie la
oxidarea nitritului la nitrat
-numrul i tipul microorganismelor existente n carne
sau adugate sub form de culturi starter.
Valoaraea pH-ului i a temperaturii influeneaz
consumarea nitritului din preparate din carne, n sensul c la
valori mici ale pH-ului i la temperaturi ridicate, dispariia acestui
agent de nroire este rapid (Banu et al., 1997). Intevalul optim de
pH este 5,8-6,0 cnd NaNO2 este instabil. Sub valoarea pH-ului de 5,6
nitritul dispare rapid din mediu, iar sub valoarea de pH de 5,2 formarea
NO este practic inhibat. Peste valoarea de pH 6,0 nitritul devine
stabil, oxidant i toxic.(Madrid et al., 2000).

II. 4. Mod de utilizare a nitrailor i nitriilor

Nitraii sunt utilizai ca surs de nitrit; reacia decurge sub
aciunea bacteriilor denitrificatoare, att n condiii aerobe, ct i
n condiii anaerobe (Izumi et al., 1989); produii denitrificrii pot fi
acidul azotos, azotul, amoniacul i hidroxilamina.
n practic se pot aplica trei procedee de conservare a
produselor din carne cu nitrai - nitrii:
; metoda lent, utiliznd nitrai (NaCl + NaNO3);
; metoda rapid, utiliznd nitrii (NaCl + NaNO 2);
; metoda mixt, cu amestec de nitrai i nitrii (NaCl +
NaNO3 + NaNO2).
Utilizarea azotitului de sodiu n locul azotatului permite
suprimarea scderii masei produsului prin depozitarea n
vederea dezvoltrii i aciunii germenilor care realizeaz
reducerea nitrailor la nitrii.
n prezent, pe plan mondial se manifest dou tendine
n privina utilizrii azotailor i azotiilor:
; de interzicere a utilizrii azotailor n procesul de srare a
crnii,
deoarece
acesta
nu
prezint
aciune
antimicrobian, iar procesul de transformare n nitrii este
19

necontrolabil i cantitatea de nitrat rezidual din produs depinde

de activitatea nitrat-reductoare a microorganismelor;

20

de reducere a nivelului de azotii la o valoare ct mai

sczut posibil, n aa fel nct azotitul rezidual s nu
poat forma nitrozamine (Honikel, 2007).
II. 5. Poate fi redus nivelul de nitrai din produsele vegetale?
Autoritatea European pentru Sigurana Alimentar
recomand reducerea aportului de nitrai prin consum de
vegetale. Problema este c odat cu reducerea nitrailor are
loc i scderea coninutului n alte componente nutritive,
indispensabile pentru organism (vitamina C, elemente minerale).
Modalitile de reducere a nitrailor prezeni n alimente:
- gtitul n ap, fr a consuma lichidul respectiv;
- cojitul legumelor i fructelor (n cartofi nitraii sunt
localizai n coaj i n zonele apropiate acesteia); cojirea
cartofilor reduce nitraii din produsul final (cartofi
prjii) cu pn la 30%. Prenclzirea cartofilor nainte
de tiere reduce 20% din cantitatea de nitrai. De
asemenea, procesul de albire poate diminua
coninutul n nittrai cu nc 30%. Renclzirea
legumelor procesate culinar nu contribuie la creterea
coninutului n nitra.
- achiziionarea pentru consum a legumelor cultivate
n sistem descoperit i nu n solarii, fr acces direct
a radiaiilor solare.
;

CAPITOLUL III
NITRAII I NITRIII PRECURSORI AI
NITROZAMINELOR
III. 1. Introducere
n toate recomandrile din perioada 1990-1995, Comitetul
tiinific pentru alimentaie al UE a inclus necessitatea de a
reduce expunerea la nitrozamine preformate n produsele alimentare
prin diminuarea cantitilor de nitrit adugate la minimul necesar
pentru a garanta conservarea i sigurana microbiologic pe
toat perioada de viat a produsului (EFSA, 2003).
Cercetrile efectuate n domeniu au identificat urmtoarele
surse de nitrozamine: alimente (preparatele din carne, petele), buturi
21

(bere, whiskies), substane utilizate n industrie i agricultur

(pesticide), fum de igar, gaze de eapament, produse

cosmetice, farmaceutice i din cauciuc.
Nitrozaminele pot determina apariia cancerului la
diferite organe, la o mare varietate de specii de animale (Andrade et
al., 2005) Atunci cnd sunt activate metabolic, nitrozaminele pot fi
cauza apariiei cancerului uman (Arranz et al., 2007).
III. 4. Formarea nitrozaminelor n aliment
Formarea nitrozaminelor n preparatele din carne depinde de:
concentraia nitritului utilizat ca aditiv, concentraia nitritului
rezidual, concentraia acidului ascorbic, a ascorbailor sau a tocoferolului, precursorii nitrozaminelor, procedurile i condiiile
de preprocesare, umiditate, procentul de esut adipos, prezena
catalizatorilor/inhibitorilor reaciei de nitrozare, procedeul de
afumare i de metoda de preparare culinar.(Byun et.al., 2004).
Mecanismul de formare a nitrozaminelor n aliment are loc
dup reaciile propuse de Honikel (2007), illustrate n figura III. 2.
+

NaNO2 + H HNO2 +
+
+
+
Na HNO2 + H NO +
H2O 2HNO2 N2O3 + H2O
N2O3 NO + NO2
+
+
NO + M NO + M
Amine primare
Amine secundare
Amine teriare

RNH2 + NO RNHN=O + H ROH + N2

+

R2NH + NO R2NN=O + H

R3N + NO nu formeaz nitrozamine

Fig. III. 2. Succesiunea reaciilor de formare a nitrozaminelor

n preparatele din carne (Honikel, 2007)
Lijinski (1999) afirm c, n alimente, concentraia
nitrozocompuilor este adesea foarte sczut i astfel, expunerea
22

uman la aceti compui este mic, dar nu ar trebui s fie ignorat

din cauza potenialului cancerigen ridicat al acestor compui.

11

23

Mecanismul i amploarea formrii nitrozoaminelor sunt

dependente att de structura aminoacizilor i proveniena
agentului de nitrozare, precum i de condiiile de reacie (Challis,
1985). Prin urmare, pH-ul mediului, bazicitatea aminei i
temperatura sunt factori importani care influeneaz rata de
formare a nitrozoaminelor (Mirvish, 1975; Ward et al., 1987).
III.4.1.Coninutul
alimentare

nitrozamine

al

produselor

Nivelul de toleran a expunerii umane la nitrozamine

variaz ntre 5-10 g/kg corp. n multe ri se aplic un program de
monitorizare a concentraiei nitrozaminelor volatile n alimente; de
exemplu, n Statele Unite ale Americii s-a stabilit o concentraie maxim
admis de 10 g N-nitrozopirolidin (NPYR)/kg pentru introducerea
pe pia a produselor alimentare (Ventanas et al., 2006).

Formarea nitrozaminelor n alimente este rezultatul

utilizrii nitritului, afumrii, uscrii la cald, marinrii,
contaminrii fungice sau a contactului produselor alimentare cu
unele ambalaje.(Thicker, 2000).
Principala cauz n formarea nitrozaminelor volatile o
reprezint nitritul rezidual; Lijinsky (1999) a determinat Nnitrozodimetilamina, N-nitrozopirolidina i N-nitrozopiperidina n
probe de crnai, dar speciile i coninutul nitrozaminelor pot
varia de la ar la ar, n funcie de obiceiurile alimentare.
III. 5. Formarea nitrozaminelor n organismul uman
Conform datelor din literatur, nitrozocompuii produc
tumori n 39 de specii de animale. Studiile efectuate asupra a mai
mult de 130 de nitrozocompui identificai n alimente,
elemente de mediu i din interaciunea medicamente-nitrii,
indic faptul c peste 80% dintre acetia sunt cancerigeni
pentru animalele de laborator. Aceste constatri sugereaz c
nitrozocompuii pot fi deasemenea cancerigeni pentru om, dar n
24

prezent nu a fost riguros confirmat o asociere ntre expunerea la

nitrozocompui i cancerul uman.(Brambilla et. al., 2007).
12

25

Expunerea uman la nitrozocompui poate fi:

- exogen - din alimentaie, elemente de mediu sau
exercitarea anumitor profesii;
- endogen formarea nitrozocompuilor in vivo, din
precursori nitrozabili i ageni de nitrozare.
Formarea neenzimatic a nitrozaminelor are loc dup
reaciile de mai jos:
2HNO2 N2O3 + H2O
R2NH + N2O3 R2N-NO + HNO2
Sinteza endogen a nitrozaminelor are loc preferenial
n stomac, deoarece prezena acidului clorhidric favorizeaz
reacia de nitrozare. Unul din factorii majori care
reglementeaz formarea nitrozaminelor la nivelul stomacului
+
este concentraia agenilor de nitrozare (N2O3, NO i ON-NCS)
care deriv din ionul nitrit i acidul azotos. Nitritul gastric poate
proveni din aportul de alimente i ap, dar se poate forma prin
reducere enzimatic din nitrat, n saliv sau n sucul gastric.
Au fost identificate dou mecanisme distincte ale
formrii endogene ale nitrozaminelor. Primul, const n reacia
direct ntre aminele secundare i nitrit, este puternic
dependent de pH i nu poate avea loc la pH neutru.
Al doilea tip de mecanism este o reaciei de nitrozare
de natur bacterian, avnd loc mult mai rapid la pH neutru.
Nitrozaminele produc diferite efecte biologice adverse,
inclusiv inducerea tumorilor ca rezultat al activrii metabolice
la compui reactivi n iniierea patologiei neoplazice.
Organismul uman este capabil de a efectua astfel de
transformri metabolice, fapt indicat de detectarea efectelor
genotoxice induse de nitrozamine n celulele umane i/sau
formarea unor aduci ai ADN. S-a constatat faptul c degradarea
i repararea ADN-ului au fost induse de concentraii subtoxice de
nitrozamine (NDMA, NDEA i altele), de ctre N-nitrozoderivaii
unui numr de ase medicamente -blocante (Robbiano et al.,
1991) n culturi primare de hepatocite umane.
26

13

27

III. 6. Farmacocinetica nitrozaminelor

Studiile realizate pe animale de laborator arat ca NDMA
ingerat este absorbit rapid, preponderent n partea inferioar a
tubului digestiv (Pegg et al., 1981). Mai mult dect att, detectarea
NDMA n urina obolanilor i a cinilor expui la NDMA prin
inhalare, arat c aceast nitrozamin este absorbit i la
nivel pulmonar.
Metabolizarea NDMA are loc prin alfa-hidroxilare sau prin
denitrozare. n ambele cazuri se presupune c metabolismul
implic un radical intermediar comun [CH3(CH2)N-N=O] produs
de aciunea sistemului oxidaz cu funcie mixt dependent de
citocromul P450 CYP2E1 (Haggerty et al., 1990; Lee et al., 1996).
n timpul metabolizrii prin alfa-hidroxilare, hidroximetilnitrozamina
(HOCH2CH3N-N=O)
se
descompune
n
formaldehid
(transformat apoi n CO2) i n monometilnitrozamin
(CH3NHN=O). Din cauza instabilitii, monometilnitrozamina sufer
o transformare pentru a forma ionul metildiazoniu, care produce
alchilarea macromoleculelor de ADN, ARN i proteine.
n baza rezultatelor obinute n testele biologice in vitro
pe culturi de celule hapatice de obolani, Lee et al. (1996) a
atribuit hepatotoxicitatea NDMA ionului metildiazoniu care se
formeaz prin alfa-hidroxilare; denitrozarea, dimpotriv, ar
avea o contribuie redus la efectul hepatotoxic al acestei
nitrozamine la obolani. Datele disponibile sugereaz c
efectul toxicologic al NDMA depinde direct de transformarea
metabolic dependent de citocromul P450 [CYP2E1] a acestei
nitrozamine n speciile chimice cu reactivitate ridicat. Etanolul
este un inhibitor competitiv al metabolismului dependent de
citocromul P450 CYP2E1 al NDMA (Anderson et al., 1994).

III. 7. Mecanismul aciunii toxice la animal

Nitrozocompuii reprezint o categorie mare de ageni
carcinogeni. Aproximativ 300 de nitrozocompui posed aciune
carcinogenic i cel puin 30 de specii de animale sunt sensibile
28

la efectele acestora (Hecht, 1997). IARC a decis c exist suficiente

14

29

dovezi pentru a confirma efectul carcinogen la animale al nitrozaminelor.

n contrast cu alte categorii de compui carcinogeni a cror activitate
a fost dovedit doar la un numr mic de specii, nitrozaminele i
manifest aciunea n cazul multor specii animale. De exemplu, a
fost dovedit faptul c NDMA induce tumori la toate speciile pe care a
fost testat, iar NDEA induce tumori la cel puin

25 de specii (Lijinsky, 1980).

Dovezi clare ale efectului genetic au fost deasemenea
colectate n urma studiilor efectuate in vivo. Au fost observate efecte
clastogene (formarea de micronuclee, schimb de cromatide surori,
aberaii cromozomiale) n: celulele hepatice (Cliet et al, 1992),
celulele mduvei osoase (Morison et al, 1994), celulele splinei
(Krishna et al, 1991), limfocitele sngelui capilar (Sato et al., 1992),
celulele esofagului (Metha et al, 1987) i n rinichi (Robbiano et al,
1997) la roztoarele (obolani, oareci i hamsteri) expuse la
NDMA pe cale oral sau prin injecie intraperitoneal.
Au fost observate, deasemenea, aberaii cromozomiale,
formarea de micronuclee, mutaii genetice, rupturi de ADN la
puii femelelor de hamsteri (Inui et al, 1979) i ai femelelor de
oareci (Bolognesi et al, 1988) care au fost expuse la NDMA n
perioada gestaiei.
La roztoarele (obolani, oareci i hamsteri) crora li
s-a administrat NDMA pe cale oral sau prin injecie
intraperitoneal s-au observat degradri ale ADN-ului la nivel
hepatic, renal i pulmonar (Jorquera et al, 1993; Asakura et al 1994;
Tinwell et al, 1994; Webster et al, 1996).
III. 8. Mecanismul aciunii toxice la om
Cancerul gastric i cancerul pulmonar sunt asociate cu
prezena nitrozocompuilor n mediul nconjurtor (Jalas et al., 2003;
Raj et al., 2003; Jakszyn et al., 2006). Surse de expunere la astfel de
compui pot fi: expunerea profesional (industria metalurgic,
tbcrie i pielrie etc ), stilul de via (inclusiv dieta, fumatul),
precum i utilizare unor produse cosmetice. Expunerea profesional
este cea mai cunoscut surs exogen de nitrozamine (de Vocht et al.,
30

2007). La acestea se adaug i expunerea endogen prin aportul

15

31

de precursori ai aminelor i formarea de compui cancerigeni

n saliv i n sucul gastric. (Raj et al., 2003). De aceea, este foarte
important s se evalueze riscurile poteniale cauzate de
expunerea la nitrozocompui
Helguera et al. (2008) au folosit modelul QSAR
(Quantitative Structure-Activity Relationship) pentru a estima
potenialul cancerigen al unui set de nitrozocompui, printre
care NDMA i
NDEA.
Modelarea QSAR este din ce n ce mai important,
deoarece exploateaz cunotinele chimice existente, pentru a
nelege interaciunile dintre substanele chimice i
organismele vii. Autorii au dezvoltat un model QSAR pentru a
prediciona potenialul cancerigen al nitrozocompuilor
administrai pe cale oral, la obolani. Au identificat o serie de
caracteristici structurale sau alerte structurale (SA) la o serie de
compui chimici, particulariti asociate cu carcinogenitatea lor.
Nitrozaminele ajung la ficat prin fluxul sanguin. Enzimele
prezente n microzomii hepatici, sunt responsabili pentru faza I
i faza a II-a de biotransformare a nitrozaminelor. Scopul principal al
ambelor faze de biotransformare a compuilor xenobiotici este
de a crete solubilitatea lor n ap, care faciliteaz excreia lor
(Rostkowska et al., 1998). Este faza principal a metabolismului
care iniiaz carcinogenitatea nitrozaminelor. Aceste reacii sunt
catalizate de enzimele microzomale ale citocromului P450.
Activarea metabolic a nitrozaminelor este mediat de oxidarea
la carbonul fa de gruparea nitrozo, care genereaz
aldehida corespunztoare, precum i un diazohidroxil instabil,
care se descompune la ion diazoniu i apoi ntr-un ion carboniu.
Particulele electrofile rezultate reacioneaz cu ADN-ul n centre
cu densitate electronic crescut pentru a provoca perturbri ale
structurii ADN, care ar putea iniia procese de carcinogenitate.
Radicalii metil i etil, acioneaz suplimentar drept
carcinogeni (Helguera et al., 2008). Este cunoscut faptul c ambele
nitrozamine (NDEA i NDMA) sunt oxidate la compui genotoxici
i c enzima CYP2E1 joac un rol major n activarea acestor doi
32

puternici ageni cancerigeni (Yamazaki et al., 1992).

16

33

PARTEA EXPERIMENTAL
CAPITOLUL IV
ANALIZA CANTITATIV A NITRAILOR I NITRIILOR
DIN PRODUSE ALIMENTARE
IV. 2. Obiective
Cercetrile efectuate au urmrit evaluarea coninutului
n nitrai i nitrii al unor produse alimentare (fructe, legume,
brnzeturi fermentate i preparate din carne).
IV. 3. Material i metod
Au fost analizate n vederea determinrii coninutului n
nitrai i nitrii probe de legume, fructe, brnzeturi fermentate i
preparate din carne.
IV. 3. 4. Determinarea nitriilor
Principiul metodei
Determinarea nitriilor se realizeaz prin metoda
spectrofotometric cu reactiv Peter-Griess. Nitriii diazoteaz
acidul sulfanilic, n mediu acid, iar sarea de diazoniu format se
cupleaz cu alfa-naftilamin dnd un compus azoic, colorat n
roz, cu maximum de absorbie la = 520nm.
Determinarea cantitativ a nitriilor, se realizeaz n mai
multe etape: extracia analitului din proba de analizat, purificarea
extractelor i determinarea propriu-zis (trasarea curbei de
calibrare, determinarea nitriilor).
Extracia nitriilor
Peste 5 g de prob omogenizat se adaug 50 ml ap distilat
la temperatura de 60C -70C i cte 2,5 ml soluie saturat de borax; se
menine pe baia de ap n fierbere15 20 minute, agitnd din cnd

n cnd. Se las la rcit la temperatura camerei, se adaug

cte 1 ml de soluie de ferocianur de potasiu, i cte 1 mL
soluie de acetat de zinc, agitnd dup fiecare adaos.
Se las n repaus 30 minute, se filtreaz prin hrtie de filtru
34

cantitativ i se completeaz volumul filtratului la 100 ml cu ap

17

35

distilat. Soluia servete la determinarea spectrofotometric a

nitriilor.
Trasarea curbei de calibrare pentru determinarea
nitriilor
ntr-o serie de eprubete se introduc volume de soluie etalon
nitrit a cror concentraie variaz ntre 0 i 10 g NO 2 (1 ml etalon =
-

10 g NO2 ); se aduc la volumul de 19 ml cu ap distilat, se adaug

cte 0,5 ml reactiv Griess I, respectiv Griess II; se las n repaus 20
minute, apoi se citesc extinciile la = 520 nm, fa de martor. Se
traseaz curba de etalonare E = f (C) (fig. IV.1)
0.6

absorbanta

0.5

y = 0.0483x + 0.0017
R

0.4

= 0.9977

0.3
0.2
0.1
0
0

10

micrograme nitrit

Fig. IV.1. Curba de calibrare pentru determinarea nitriilor

Determinarea coninutului de nitrii din probe

Volume de 1-10 ml de extract purificat se aduc la 19 ml cu
ap distilat, se adaug cte 0,5 ml reactiv Griess I, respectiv
reactiv Griess II i dup 20 de minute se citesc extinciile la
lungimea de und = 520 nm, fa de martor.
IV. 3. 5. Determinarea nitrailor
Principiul metodei
Determinarea nitrailor se realizeaz sub form de nitrii
(dup reducerea acestora cu pulbere de cadmiu), prin metoda
spectrofotometric cu reactiv Peter-Griess. Nitriii rezultai dup
36

12

reducere diazoteaz acidul sulfanilic, n mediu acid, iar sarea de

18

37

diazoniu format se cupleaz cu alfa-naftilamin dnd un compus

azoic, colorat n roz, cu maximum de absorbie la = 520 nm.

Trasarea curbei de calibrare pentru determinarea

nitrailor
ntr-o serie de eprubete se introduc volume de soluie etalon
nitrat a cror concentraie variaz ntre 0 i 10 g NO 3 (1 ml etalon =
-

10 g NO3 ); se aduc la volumul de 19 ml cu ap distilat, dup care

se introduc cte 1 g pulbere de cadmiu i 5 ml tampon; se agit
coninutul eprubetelor timp de 30 minute, pentru a avea loc reacia
de reducere a nitratului la nitrit; dup ndeprtarea cadmiului, se
adaug 0,5 ml reactiv Griess I, respectiv 0,5 ml reactiv Griess II i
dup 20 de minute se citesc extinciile la = 520 nm, fa de martor.
Curba de calibrare este reprezentat n figura IV. 2.
0.6
0.5

absorbanta

y = 0.048x - 0.0072
0.4
0.3

R = 0.9985

0.2
0.1
0
-0.1 0

10

12

micrograme nitrit

Fig. IV. 2. Curba de calibrare pentru determinarea nitrailor

Determinarea coninutului de nitrai din probe

Nitraii se determin prin aceeai metod, dup reducere
la nitrii cu pubere de cadmiu. Se fac n paralel dou determinri:
una pentru determinarea nitriilor i a doua pentru determinarea
nitritului total (obinut dup reducerea nitratului la nitrit).
Volume de 1-5 ml extract, aduse cu ap distilat la 19 ml, se
introduc n eprubete mpreun cu 1 g pulbere de cadmiu i 5 ml
tampon; se agit energic timp de 30 minut e, dup care se las n
38

repaus; se separ pulberea de cadmiu, apoi se adaug cte 0,5 ml

19

39

reactiv Griess I, respectiv reactiv Griess II i dup 20 de

minute se citesc extinciile fa de martor, la aceeai lungine
de und ( = 520 nm), fa de martor. n aceste condiii se
determin coninutul total de nitrit.
Prin diferen se obine cantitatea de nitrit echivalent
cu cantitatea de nitrat din probe.
nainte de utilizare pulberea de cadmiu se spal cu ap
distilat, apoi, succesiv cu 25 ml soluie HCl 0,1 M, 50 mL ap
distilat i 25 mL soluie tampon 1:9. ntre determinri, pulberea
de cadmiu se pstreaz n soluie de clorur de sodiu.
Pentru probele de preparate din carne s-a urmrit evoluia
concentraiei nitrailor i nitriilor pe o perioad de 28 de zile;
monitorizarea concentratiei s-a realizat sptmnal.
Evaluarea randamentului reaciei de reducere a
nitratului la nitrit
Pentru a calcula randamentul reaciei de reducere s-a construit
curba de calibrare pentru sistemul nitrit nitrat redus la nitrit, astfel:

ntr-o serie de epubete se introduc volume de soluie

etalon nitrit, cu concentraii cuprinse ntre 0 i 10
micrograme de nitrit, respectiv volume de soluie etalon
nitrat, cu concentraii cuprinse ntre 0 i 10 micrograme
de nitrat i se aduc la 19 ml cu ap distilat; se adaug
cte 1 g de cadmiu, se agit timp de 30 minute pentru
a se realiza reducerea nitratului la nitrit.

dup ndeprtarea cadmiului se adaug cte 0,5 ml reactiv

Griess I, respectiv Griess II i se citesc extinciile la =

520 nm, fa de martor.

Curba de calibrare este reprezentat n figura IV. 3.

40

20
0.6
0.5

y = 0.0238x + 0.0169
R

absorbanta

0.4

= 0.9929

0.3
0.2
0.1
0
0

10

15

20

micrograme nitrit

Fig. IV. 3. Curba de calibrare pentru evaluarea randamentului

reaciei de reducere a nitrailor la nitrit

Randamentul reaciei de reducere se calculeaz,

conform datelor din tabelul IV.5., pentru fiecare nivel de
concentraie din scara de etalonare, dup relaia:
= C2 100/ C1
Tabelul IV. 4. Randamentul reaciei de reducere a
nitratului la nitrit
C1

C2

(g nitrit)

(g nitrit obtinut dup

reducere)

, %

mediu

4
8
12
16
20

3.494
7.254
11.634
15,827
19.632

87.36
90.68
96.95
98.92
98.16

94.25 %

41

25

IV. 4. Rezultate
Rezultatele obinute la determinarea nitrailor din probele de
preparate din carne, brnzeturi fermentate, legume i respectiv, fructe

21

42

sunt prezentate n tabelele 1, 2, 3 i 4. Rezultatele sunt media a trei

determinri.
Tabelul 1. Coninutul n nitrai i nitrii al preparatelor
din carne
Nr.
Proba
mg NO3 /kg
mg NO2 /kg
crt.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Salam porc
Salam ssesc
Cremwurti polonezi
Cremwuti pui
Cabanos
Crnai afumai
Crnai semiafumati
Bacon
Parizer pui
unc pui
Salam de var
Salam italian
Salam Victoria
Pastram porc
unc presat

61,94
37,36
27,54
38,41
61,97
45,46
32,50
40,28
65,91
74,84
70,14
61,34
68,85
79,31
73,09

8,71
1,56
22,85
32,24
2,55
6,20
0,74
3,71
15,42
1,69
2,39
1,31
4,78
0,94
16,91

Tabelul 2. Compoziia n nitrai i nitrii a brnzeturilor

fermentate
Nr.
Proba
mg NO2 / kg
mg NO3 / kg
crt.
1 Especial pasta
0,92
5,32
2 Rapitalia
0,64
1,64
3 Parmezan rzuit
0,43
0,91
4 Paesano italiano
1,05
1,67
5 Cacaval afumat Hochland
0,70
1,35
43

22
Nr.
crt.
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Proba

mg NO2 / kg

mg NO3 / kg

Cacaval clasic Hochland

Brnz de burduf
Hochland-brnz tartinabil
Hochland-brnz topit felii
Brnz de capr
Brnz de capr cu verdea
Brnz de capr cu piper
Cacaval DEL
Brnz de vaci
Brnz de oi

0,46
0,41
0,43
1,16
0,65
0,31
0,85
0.29
0.72
0.38

1,77
1,90
2,29
3,12
2,20
15,20
1,98
2.23
14.03
16.84

Tabelul 3. Compoziia n nitrai i nitrii a legumelor

Nr.
crt.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

Proba

mg NO2 / kg

Salat verde, frunze din interior

Salat verde, frunze din exterior
Varz alb, frunze din interior
Varz alb, frunze din exterior
Varz roie, frunze din interior
Varz roie, frunze din exterior
elin frunze
elin rdcin
Morcov
Ardei Kapia rou
Ardei gras alb
Gogoari
Ardei gras rou
Ardei gras galben
Ardei gras verde
Ceap alb

0,69
2,24
0,42
0,46
7,49
0,65
0,46
0,41
0,38
0,29
0,34
0,31
0,34
0,35
0,39
0,32

44

mg NO3 / kg

138,10
1363,80
18,.32
30,71
164,88
218,36
113,84
111,29
21,55
18,04
28,02
19,58
14,39
17,82
25,15
26,02

17
18
19

Ceap roie
Usturoi
Cartofi albi

0,34
0,62
0,38

24,00
35,07
165,59

23
Nr.
crt.
20
21
22
23
24
25

Proba
Cartofi roz
Roii
Castravei
Vinete
Mrar
Ptrunjel frunze

mg NO2 / kg

mg NO3 / kg

0,30
0,37
0,42
0,57
3,65
2,58

39,26
23,87
17,96
227,19
382,32
1245,20

Tabelul 4. Concentraiile n nitrii i nitrai a fructelor

Nr.
crt.

Proba

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

Pepene rou
Pepene galben
Grape-fruit alb
Grape-fruit rou
Portocale
Lmi
Banane
Piersici
Nectarine
Pere
Caise
Prune albe
Prune
Mere Golden
Mere Red
Mere de var

mg NO2 / kg

0,45
0,58
0,55
0,58
0,53
0,63
0,65
0,68
0,68
0,65
1,03
1,35
1,17
0,67
0,63
0,78
45

mg NO3 / kg

2.25
7.40
5.57
5.47
4.11
10.98
20.26
14.64
7.32
12.71
17.95
16.83
15.61
5.23
8.73
6.85

17
18
19
20
21
22

Mere pentru diabetici

Strugure de mas alb
Strugure de mas rou
Strugure Ceasla
Mure
Coarne

0,64
0,58
0,75
0,95
3,08
3,05
24

46

6.89
7.02
18.82
3.98
21.27
18.82

CAPITOLUL V
EVIDENIEREA FORMRII NITROZAMINELOR N
PREPARATELE DIN CARNE
V. 2. Obiective
Cercetrile incluse n acest capitol au urmrit determinarea n
dinamic a concentraiilor nitrailor, nitriilor, nitrozodimetialaminei
i nitrozodietilaminei pentru produse preparate industrial, respectiv
preparate n laborator, pe o perioad de 28 de zile.
V. 3. Materiale i metode
Aparatura necesar determinrii nitrailor, nitriilor i
nitrozaminelor este redat n tabelul V. 2.
Tabelul V. 2. Aparatura utilizat pentru dozarea
cantitativ a nitrailor, nitriilor i nitrozaminelor

Aparat
Sistem HPLC
Module:
Detector UV-VIS
Cuptor coloane
Pomp cuaternar
Degazor on-line
Coloan 25 / 4.6
mm, 5 m
Agitator magnetic
Balanta
SCALTEC
Rotavapor
Module:

Producator
Shimadzu

Tip

Shimadzu
Shimadzu
Shimadzu
Shimadzu
Grace

SPD 20AV
CTO 20AC
LC 20AD
DGU 20A3
ODS

IKA WERKE

GMB&CO.KG
SCALTEC
INSTRUMENTS
GmbH
BCHI
47

IKAMAG RT15power
SBC32
R 210

Baie termostatat
Controler vid
Aparat
Pomp de vid
Spectrofotometru
JASCO

BCHI
BCHI

B 491
V850

25
Producator
BCHI
JASCO

Tip
V -700
V-550 UV-VIS.

V. 3. 3. Probe de analizat
Analiza n dinamic a coninutului n nitrai, nitrii i
evidenierea
formrii
nitrozodimetilaminei
(NDMA)
i
nitrozodietilaminei (NDEA) au fost realizate pe probe de preparate din
carne (unc de pui, salam bnean uscat, salam franuzesc
uscat, crnai tradiionali i pastram de porc), procurate direct de
la productor, n prima zi n care puteau fi comercializate.
Al doilea set de determinri s-a realizat pe loturi de cte
cinci tipuri de preparate din carne (crnai, cremwurti, muchi
file, salam, unc) procurate din reeaua comercial.
Al treilea set de probe a fost constituit din 5 loturi de crnai
de porc, preparai conform datelor din tabelul V. 4.Determinrile s-au
efectuat iniial i la intervale de 7 zile, timp de 28 de zile.

V. 3. 4. Metode
a) Determinarea nitrailor i nitriilor
Nitriii au fost determinai prin metoda spectrofotometric
cu reactiv Peter-Griess; nitraii au fost determinai prin aceeai
metod, dup reducerea acestora la nitrii, cu pubere de cadmiu.

b) Determinarea nitrozaminelor
Determinarea nitrozaminelor se realizeaz n mai multe
48

etape: separarea nitrozaminelor din probe, trasarea curbelor de

calibrare, determinarea nitrozaminelor.
Separarea nitrozaminelor
Cte 10 g din fiecare prob mrunit a fost tratat cu
50 ml de tampon fosfat-citrat de pH=6,5 i 0,175 g acid ascorbic
i omogenizat la blender. Amestecul s-a adus cantitativ n pahar
26

49

Erlenmeyer, s-a adaugat 150 ml tampon fosfat-citrat i 0,700 g acid

ascorbic, s-a omogenizat timp de dou ore , apoi s-a filtrat pe
hrtie de filtru cantitativ.
Purificarea extractelor s -a realizat prin filtrare prin coloane
de Celite 545. Eluatele au fost extrase cu 300 ml diclormetan i
anhidrizate pe sulfat de sodiu anhidru.
Faza organic s-a evaporat la sec la rotavapor i a
servit la determinarea prin cromatografie de lichide de nalt
performan a nitrozodimetilaminei i a nitrozodietilaminei.
Condiii de cromatografiere
Instrument: sistem HPLC Shimadzu
Coloana: Grace 25 4,6 mm, 5 m, ODS
Faza mobil: acetonitril - acid acetic 1% (20:80,
v/v) Debit: 0,8ml / minut
Volum injectare: 20 l
Temperatura coloanei: 25C
Detecia : UV (230 nm)
Timp de retenie NDMA: 4,56 min.
Timp de retenie NDEA: 9,11 min.
Timp de analiz / prob : 10 minute.

n condiiile de cromatografiere stabilite, nitrozodimetilamina

(NDMA) i nitrozodietilamina (NDEA) au picuri distincte.

Standardele de calibrare au fost preparate prin diluarea

unor volume din soluiile de lucru ale NDMA, respectiv
NDEA, la un anumit volum.
Trasarea curbelor de calibrare pentru NDMA i NDEA
Pentru trasarea curbelor de calibrare s-a lucrat pe concentraii
de NDMA i respectiv, NDEA cuprinse ntre 0 i 25 g.
Determinarea nitrozaminelor
Reziduul obinut n urma evaporrii extractului purificat
s-a reluat cu 1 ml de faz mobil, acetonitril-acid acetic 1%
50

(20:80, v/v). Un volum de 20 l a fost injectat n lichid cromatograf.

27

51

c) Determinarea concentraiilor de NDMA i NDEA

Cromatogramele au fost procesate utiliznd programul
informatic LC Solution Software.
Concentraiile
nitrozodimetilaminei
i
ale
nitrozodietilaminei au fost calculate automat de programul
informatic pe baza datelor analitice utiliznd aria picului i
metoda standardului extern. Curba de calibrare a fost obinut prin
fitarea datelor utiliznd regresia liniar.
Ecuaia curbei de
calibrare: y = b + ax,

unde: x concentraia analitului (g / ml); y aria picului; a, b

coeficienii curbei de calibrare standard.
V. 4. Rezultate
Cromatogramele soluiilor standard de nitrozamine sunt
redate n figura V. 3 (pentru NDMA), respectiv n figura V. 4. (pentru
NDEA). Curbele de etalonare pentru nitrozodimetilamin
(NDMA), respectiv nitrozodietilamin (NDEA), sunt redate n
figura V. 5., iar n figura V. 6, cromatograma probelor de muchi file
Meda i pastram vrac.
NDMA 0.4 micrograme
13000
11000
9000
7000
5000
3000
1000
-1000
-3000
-5000
0

52

10

12

Fig. V. 3 . Cromatograma soluiei standard de NDMA

28
NDEA 0.4 micrograme

9000
7000
5000
3000
1000
-1000
-3000
-5000
0

10

12

Fig. V. 5. Cromatograma soluiei standard de NDEA

3500000
y = 157821x
R2 = 0,9998

3000000

ariapicului

2500000
2000000

y = 149768x
R2 = 0,9991

1500000
NDEA

1000000

NDMA

500000
0
0

10

15

concentraia, micrograme

53

20

25

Fig. V. 3. Curbele de etalonare pentru determinarea

NDMA i NDEA
15000
Proba A
Proba B
NDEA standard
NDMA standard

10000

NDMA

5000

-5000

NDEA

10

15

20

Legenda: proba A-muchi file

Meda proba Bpastram de porc

Fig. V. 6. Cromatograma pentru preparate din carne tip

jambon
Pe durata studiului concentraia nitratului i nitritului
rezidual n probele de preparate din carne (unc de pui, salam
bnean uscat, salam franuzesc uscat, crnai tradiionali i
pastram de porc), procurate direct de la productor, n prima
zi n care puteau fi comercializate, scade, dup cum este redat
n tabelul V. 9.
Concentraia nitrozaminelor crete, pe durata studiului, la
toate preparatele analizate (tabelul V.10).
Tabelul V. 9. Monitorizarea concentraiei
nitratului i nitritului n produse din carne preparate
industrial

Proba

Concentraia
iniial

Concentraia
dup 28 de zile
54

Scderea
concentraiei,%

1
2
3

Nitrit,
mg/kg
26.7
4.46
10.78

Nitrat,
mg/kg
60.4
14.1
27.67

Nitrit,
mg/kg
1.87
0.18
0.39

Nitrat,
mg/kg
17.1
6.12
7.27

Nitrit

Nitrat

92.3
82
96.38

71.68
56.59
73.72

Concentraia
Concentraia
Scderea
iniial
dup 28 de zile
concentraiei,%
Proba
Nitrit,
Nitrat,
Nitrit, Nitrat, Nitrit
Nitrat
mg/kg
mg/kg
mg/kg
mg/kg
4
2.7
18.59
0.04
9.12
98.51
82.57
5
25.82
57.56
0.78
3.24
96.97
94.37
Legenda: 1- unc de pui; 2-salam bnean uscat; 3-salam
franuzesc uscat; 4-crnai tradiionali; 5-pastram de porc
Tabelul V. 10. Monitorizarea concentraiei NDMA i
NDEA n produse din carne preparate industrial
Concentraia iniial

Concentraia
dup 28 de zile
Proba
NDMA
NDEA
NDMA
NDEA
g/kg
g/kg
g/kg
g/kg
1
nd
0.43
29.00
11.60
2
nd
nd
10.50
22.50
3
nd
2.10
5.30
27.50
4
nd
2.70
0.80
61.90
5
nd
nd
23.40
40.00
Legenda: 1- unc de pui; 2-salam bnean uscat; 3-salam
franuzesc uscat; 4-crnai tradiionali; 5-pastram de porc;
nd-nedetectabil
Evoluia concentraiilor nitrailor, nitriilor i
nitrozaminelor n probele de crnai de porc preparai n
55

laborator sunt redate in tabelele V. 5, V. 6, V. 7, respectiv V.8.

Tabelul V. 5. Evoluia concentraiei ionilor nitrit
(mg/kg) n probele de crnai de porc preparai
n laborator

Data /
lotul
L1
L2

iniial

7 zile

14 zile

21 zile

28 zile

0,35
6.73

0.34
6.62

0.25
5.04

0.21
4.47

0.17
3,81

Data /
lotul
L3
L4
L5

iniial

7 zile

14 zile

21 zile

28 zile

0.42
10.16
9.74

0.38
9.11
8.10

0.29
8.01
7.60

0.21
7.53
6.81

0.15
6.47
6.69

31

Legenda: Lotul 1: carne de porc, sare de buctrie (4%).

Lotul 2: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu

(100 mg/kg), extract de usturoi (25 ml) .
Lotul 3: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotat de potasiu
(200mg/kg), extract de usturoi (25 ml).
Lotul 4: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu
(100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml).
Lotul 5: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu
(100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml),
condimente pentru crnai (1g/kg).

Tabelul V. 6 Evoluia concentraiei ionilor nitrat

(mg/kg) n probele de crnai de porc preparai n
laborator

Data /
lotul
L1
L2

iniial

7 zile

6.28
7.78

5.16
4.16
56

14 zile

21 zile

28 zile

4.02
2.56

2.52
2.44

2.20
1.98

L3
L4
L5

53.09
194.90
193.17

36.23
126.38
174.79

33.27
119.18
110.19

25.23
82.69
70.30

22.94
50.92
49.92

Legenda: Lotul 1: carne de porc, sare de buctrie (4%).

Lotul 2: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu

(100 mg/kg), extract de usturoi (25 ml) .
Lotul 3: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotat de potasiu
(200mg/kg), extract de usturoi (25 ml).
Lotul 4: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu
(100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25
ml).
Lotul 5: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu
(100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25
ml), condimente pentru crnai (1g/kg).

32

57

Tabelul V. 7. Evoluia concentraiei NDMA (g/kg) n probele

de crnai de porc preparai n laborator
Data /
lotul
L1
L2
L3
L4
L5

iniial

7 zile

14 zile

21 zile

28 zile

nd
nd
0,09
0,16
0,10

0,11
0,15
0,17
0,30
0,29

0,18
0,29
0,27
0,39
0,37

0,27
0,47
0,30
0,47
0,42

0,28
0,47
0,31
0,56
0,48

Tabelul V. 8. Evoluia concentraiei NDEA (g/kg) n probele

de crnai de porc preparai n laborator
Data /
lotul
L1
L2
L3
L4
L5

iniial

7 zile

14 zile

21 zile

28 zile

nd
nd
nd
nd
nd

nd
0,09
nd
0,11
0,10

0,09
0,14
0,08
0,18
0,12

0,11
0,20
0,14
0,21
0,15

0,13
0,24
0,16
0,25
0,29

Legenda: Lotul 1: carne de porc, sare de buctrie (4%).

Lotul 2: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu (100
mg/kg), extract de usturoi (25 ml) .
Lotul 3: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotat de potasiu
(200mg/kg), extract de usturoi (25 ml).
Lotul 4: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu
(100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml).
Lotul 5: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu
(100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml),
condimente pentru crnai (1g/kg).
nd nedetectabil

Domeniile de variaie ale concentraiilor momentane ale

nitrailor, nitriilor i nitrozaminelor n preparatele din carne sunt
inserate n tabelul V.9.
58

33

59

Tabelul V. 9. Concentraiile analiilor n preparate

din carne
Proba
nitrat/nitrit
NDMA/NDEA
Crnai Cabanos
(40.97 - 89.20) mg
(nd 2.34)
nitrat/kg
g/kg
Crnai de cas
afumai Elit
Crnai de cas afumai
Meda
(1.25 8.64)
(nd - 6.14)
Crnai Plecoi
mg nitrit/kg
g/kg
Crnai trandafir Caroli
Cremwurti polonezi Elit (29.45 - 55.63)
(nd 0.36)
Cremwurti de pui Meda mg nitrat/kg
g/kg
Cremwurti de pui
Kosarom
(9.59 24.06)
(nd - 0.84)
Cremwurti Devro
Cremwurti Caroli
mg nitrit/kg
g/kg
Muti file Azuga
Muti file Elit
Muti file Marex
Muti file Radic
Muti file Meda
Salam Pontic
Salam cu ierburi fine
Salam de Sibiu Angst
Salam Parmezan Zimbo
Salam piperat
unc de Praga
unc de Praga Luca
Pastram de porc Vio
unc de Praga Meda
unc de porc

(89.48-112.35)
mg nitrat/kg

(nd - 0.64)
g/kg

(10.50 18.78)
mg nitrit/kg
(54.15-105.25)
mg nitrat/kg

(nd - 0.84)
g/kg
(nd - 0.46)
g/kg

(2.41 11.03)
mg nitrit/kg
(100.23-146.36)
mg nitrat/kg

(0.04 2.7)
g/kg
(0.08 0.52)
g/kg

(5.45 20.09)
mg nitrit/kg

(0.77 4.0)
g/kg

60

34

61

CAPITOLUL VI
ESTIMAREA APORTULUI DE NITRAI I DE NITRII
PRIN CONSUM DE ALIMENTE
VI. 5. Obiectiv
Estimarea aportului de nitrai i de nitrii prin trei tipuri de
diet (vegetalian, vegetarian i convenional), pe baza
determinrii coninutului n nitrai i nitrii a produselor alimentare.
VI. 6. Meniuri
Au fost selectate alimente, astfel nct valoarea energetic a
fiecrui tip de diet s fie de aproximativ 2500 kcal/zi.
S -a considerat, pentru fiecare tip de diet, un consum zilnic
de 1,5 L de ap potabil cu un coninut de 50 mg NO 3 /L, precum i
o cantitate de 200 g pine neagr (cu un coninut de 4,3 mg
NO2 /kg i 20 mg NO 3 /kg), inclus n dieta vegetalian, respectiv
200 g pine alb (cu un coninut de 3,4 mg NO 2 /kg i 13 mg
NO3 /kg), inclus n dieta vegetarian i n cea convenional.

VI. 7. Materiale i metod

Concentraiile nitrailor i nitriilor n probe de legume,
fructe, brnzeturi fermentate i preparate din carne, exprimate
n mg/kg, determinate n modul prezentat la capitolul IV, au fost
calculate n mg/cantitate aliment propus n fiecare tip de diet.
n acest mod s-a determinat aportul zilnic de nitrai i
nitrii prin consum de alimente.
VI. 8. Rezultate
Aportul de nitrii prin consum de alimente este prezentat
comparativ la tipurile de diet considerate n figura VI. 1, iar
aportul de nitrai este redat n figura VI.2.
Dieta vegetarian furnizeaz cele mai mici cantiti de nitrat
i de nitrit, comparativ cu celelalte tipuri de diet. Cel mai mare aport
de nitrit a fost nregistrat la dieta convenional, de 1,48 ori mai mare
dect cantitatea de nitrit furnizat de dieta vegetalian i de 2,62 ori
62

mai mare dect aportul de nitrit prin dieta vegetarian.

35

63

n ceea ce privete coninutul n nitrai, la dieta vegetalian

s-a determinat cea mai mare concentraie (368,52 mg nitrat/zi),
comparativ cu 78,373 mg nitrat/zi furnizat de dieta vegetarian,
respectiv 99,05 mg nitrat/zi la dieta convenional (mixt).

Aportul de nitrai, prin consum de alimente, este cu mult mai

mare dect aportul de nitrii.

concentratia, mg nitrit/zi

3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
dieta vegataliana

dieta vegetariana

dieta conventionala

Fig. VI. 1. Aportul de nitrii prin diet

concentratia, mg nitrat/zi

400
350
300
250
200
150
100
50
0
dieta vegataliana

dieta vegetariana

dieta convrentionala

Fig. VI. 2. Aportul de nitrai prin diet

Mare parte din cantitarea de nitrat provine din apa de but;
64

astfel, n dieta vegetarian ponderea apei este de 95,69%, n dieta

36

65

vegetalian 20,36%, respectiv 75,71% n dieta convenional.(figura

VI. 4).

300
250

concentratia, mg/zi

200
150

66

100
dieta conventionala

50

dieta vegetariana
0

dieta vegataliana
nitrat din apa

nitrat

nitrit

Fig. VI. 4. Ponderea nitrailor din ap n dietele

considerate

Pentru un adult cu masa de 60 de kilograme, care ar urma

oricare din dietele luate n studiu, s-au calculat dozele de nitrit i de
nitrat exprimate n mg/kg corp/zi (tabelul VI. 6.).
Tabelul VI. 6. Dozele zilnice de nitrat i de nitrit
Tipul de diet

mg nitrit/kg
corp/zi
0.030
0.017
0.044

Dieta vegetalian
Dieta vegetarian
Dieta convenional

mg nitrat/kg
corp/zi
6.138
1.306
1.650

Din estimrile efectuate rezult depiri ale cantitii

maxime admise (0,003 mg nitrit/kkg corp pentru un adult cu masa
de 60 d kg) la toate tipurile de diete dup cum urmeaz: de
5,66 ori la dieta vegetalian, de 10 ori la dieta vegetarian i
de 13,33 ori la dieta convenional.
37

67

CAPITOLUL VII
EFECTUL ADMINISTRRII NITROZODIETILAMINEI
ASUPRA UNOR PARAMETRI BIOCHIMICI I
HEMATOLOGICI LA OBOLANI
VII. 2. Obiective
Cercetrile incluse n acest capitol au urmrit evaluarea
toxicitii dietilnitrozaminei prin determinarea unor parametri
biochimici i hematologici, dup administrarea unei doze unice
de 100 mg NDEA/kg corp, la obolani
VII. 3. 3. Animale de laborator
Studiul s-a realizat pe obolani masculi, rasa Wistar,
achiziionai de la Institutul Cantacuzino Bucureti.
Protocolul experimental pentru acest studiu a fost aprobat de
Comisia de Etic a cercetrii a Universitii de Medicin i
Farmacie Gr.T.Popa Iai.
obolanii masculi, n vrst de 8 luni, sunt meninui
timp de apte zile nainte de nceperea experimentului n cuti
colective, n condiii ambientale relativ constante.
Att n timpul perioadei de aclimatizare, ct i n timpul
perioadei experimentale animalele primesc hran standard
pentru obolani i ap, ad libitum.
Animalele au fost repartizate n dou loturi de cte 5
animale: lotul de control (martor) la care s-a administrat ser fiziologic i
lotul cruia i s-a administrat prin gavaj doza unic de
100 mg NDEA/kg corp.
Probele de snge au fost recoltate prin puncie cardiac, la 10
zile de la ultima administrare a soluiei de nitrozodietilamin,
dup 12 ore fr hran, sub anestezie cu ketamin. Probele s-au
recoltat n vacutainere adaptate tipului de analiz preconizat.
VII. 3. 4. Interpretarea statistic
n interpretarea statistic a datelor a fost utilizat o
metod de analiz a factorilor de variabilitate n experimentul
biologic - ANOVA.
38

Datele statistice au fost prelucrate de programul Stats Direct,

versiunea 2.7 i Microsoft Excel 2007. Datele calculate pentru
fiecare grup sunt exprimate ca valoare medie eroarea standard a
mediei.
VII. 3. 5. Investigaia biochimic
Dup recoltare, probele de snge destinate
determinrilor biochimice au fost centrifugate pentru 15 minute, la
3000 rotaii pe minut, la centrifuga Hettich-Rotifix 32A. Plasma
obinut a fost supus imediat determinrilor biochimice care

s-au realizat prin metode standardizate folosind kituri ELITech .

Investigaiile biochimice realizate au urmrit:
Testarea integritii celulare a esutului hepatic dup
administrarea de NDEA evidenierea modificrii
permeabilitii membranei hepatocitului, prin evaluarea
activitii urmtorilor parametri biochimici:
- activitatea aspartat-aminotransferazei (AST sau GOT);
- activitatea alanin-aminotransferazei (ALT sau GPT);
- determinarea activitii -glutamil transferazei (-GT
sau GGT)
Evaluarea activitii hepatice prin:
- determinarea bilirubinei totale i a bilirubinei directe;
- determinarea colesterolului total i a HDL-, respectiv
LDL-colesterolului;
- determinarea ferului plasmatic;
Evaluarea activittii renale prin:
- determinarea concentraiei ureei;
- determinarea concentraiei acidului uric;
- determinarea concentraiei creatininei.
Toate rezultatele prezentate reprezint media a 5
determinri (fiecare parametru a fost determinat individual pe
plasma recoltat de la 5 obolani).
VII. 4. 2. Investigaia hematologic
Au fost determinai 11 parametri hematologici, dup cum
urmeaz:
39

numrul de eritrocite, RBC - a fost determinat pentru

evaluarea eritropoiezei; prin msurarea concentraiei de
hemoglobin (HGB) i a hematocritului (HCT),
analizorul a calculat indicii eritrocitari (VEM- volumul
eritrocitar mediu, HEM- hemoglobina eritrocitar medie,
CHEMconcentraia
eritrocitar
medie
de
hemoglobin, RDW- lrgimea distribuiei eritrocitare),
care evalueaz calitativ populaia eritrocitar.
numrul de trombocite (PLT)- plachetele sunt implicate
n hemostaz i n procesele de reparare tisular.

-numrul de leucocite (WBC): neutrofile (PMN), euzinofile (EO),

bazofile (BASO), limfocite (LYMPH) i monocite (MONO)-a fost
determinat pentru evaluarea rspunsului imun.
-formula leucocitar- const n diferen ierea numrului total de
leucocite circulante n cele cinci tipuri de leucocite, exprimate
procentual i respectiv n numr absolut i a fost corelat cu
numrul de leucocite.
VII. 4. Rezultate
Variaia parametrilor biochimici i hematologici n urma
administrrii dozei unice de 100 mg NDEA/kg corp sunt
nregistrate n tabelele VII. 2, respectiv VII. 8.
Tabelul VII. 2. Variaia parametrilor biochimici n urma
administrrii a 100 mg NDEA/kg corp la obolani

Parametrul
ALT
AST
GGT
Bilirubina
total
Bilirubina
direct
Colesterol total

U.M.
(U/L)
(U/L)
(U/L)
(mg/dL)

Lotul martor
46,6 4,47
125,6 7,69
1,0 0,0
(0,16 0,01

Lotul NDEA
62,4 6,11
153,2 10,41
1,4 0,24
0,22 0,01

(mg/dL)

0,03 0,01

0,05 0,01

(mg/dL)

61,8 3,13

66,4 3,74

40

Parametrul
HDL-colesterol
LDL-colesterol
Fier
Uree
Creatinin
Acid uric

U.M.
(mg/dL)
(mg/dL)
(g/dL)
(mg/dL)
(mg/dL)
(mg/dL)

Lotul martor
19,4 0,87
4,2 0,3
275,2 42,9
38,0 4,03
0,61 0,01
0,97 0,05

Lotul NDEA
24,4 1,96
5,0 0,31
259,8 17,65
37,0 2,73
0,63 0,02
1,17 0,06

Tabelul VII. 8. Variaia parametrilor hematologici n

urma administrrii a 100 mg NDEA/kg corp la obolani

Parametrul

Numrul de
eritrocite
Hematocrit
Hemoglobin
Concentraia
eritrocitar medie
de hemoglobin
Lrgimea
distribuiei
eritrocitare
Hemoglobina
eritrocitar medie
Volum eritrocitar
mediu
Numarul de
trombocite
Numrul de
leucocite

x10 celule/

U.M.

Lotul martor
7,75 0.71

Lotul NDEA
8,50 0.12

L
%
g/dL
g/dL

44,80 0.74
15,52 0.28
34,64 0.38

44.30 0.78
15,48 0.25
34,28 0.12

20,27 0.56

20,81 0.57

pg/celul

18,34 0.25

18,24 0.09

52,96 1.29

53,14 0.26

1072,50 53.00

1060,40 87.48

4,82 0.59

4,27 1.16

fL (m )
3

x10 celule/

x10 celule/

L
CONCLUZII GENERALE

Pentru determinarea nitriilor din produse alimentare

(legume, fructe, preparate din carne i brnzeturi fermentate) s-a

41

aplicat metoda spectrofotometric cu reactiv Peter-Griess.

Determinarea nitrailor s-a realizat prin aceeai metod, dup
reducerea acestora la nitrii, cu pulbere de cadmiu. Randamentul
reaciei de reducere a fost de peste 90%.
Au fost analizate 77 probe de produse alimentare, dintre care
15 probe de preparate din carne, 15 probe de brnzeturi fermentate,
25 probe de legume i 22 probe de fructe, obinndu-se rezultate
concordante cu cele din literatur. Cele mai mari concentraii de
nitrai s-au determinat la salata verde (1363,80 mg/kg) i la frunzele
de ptrunjel (1245,20 mg/kg), la polul opus aflndu-se ardeiul gras
rou (14,39 mg/kg) i ardeiul gras galben (17,82 mg/kg).
Concentraiile nitriilor n probele de legume au variat ntre 0,29
mg/kg la ardeiul Kapia rou i 7,49 mg/kg la varza roie.
n probele de fructe, cele mai mici cantiti de nitrai i de
nitrii s-au determinat la pepenele rou (2,25 mg nitrat/kg, respectiv
0,45 mg nitrit/kg). Murele au avut concentraia cea mai mare de
nitrai i nitri (21,27 mg nitrat/kg, respectiv 3,08 mg nitrit/kg).
La preparatele din carne analizate coninutul de nitrai a
nregistrat variaii mari, ntre 27,54 mg/kg la proba de cremwurti
polonezi i 79,31 mg/kg la proba de pastram de porc.
Concentraiile nitriilor s-au situat ntr-un interval larg, far a se depi
concentraia maxim admis (0,74 mg/kg la proba de crnai
semiafumai, respectiv 32,24 mg/kg la proba de cremwurti de pui).

n probele de brnzeturi fermentate concentraiile nitrailor

i nitriilor au fost cu mult sub limitele maxime admise. Domeniile
de variatie ale concentraiilor analiilor au fost: 0,91 mg nitrat/kg
(la proba de parmezan rzuit) -16, 84 mg nitrat/kg (la proba de
brnz de oi), respectiv 0,29 mg nitrit/kg (la proba de cacaval
DEL) 1,16 mg nitrit/kg (la proba de brnz topit Hochland).
Dozarea nitrozaminelor s-a realizat prin cromatografie de lichide
de nalt performan cu detecie UV. S-a evideniat formarea
nitrozaminelor n preparate din carne, pe seama nitritului rezidual, prin
monitorizarea concentraiilor nitrailor, nitriilor i nitrozaminelor pe o
perioad de 28 de zile, att pentru preparate din carne procurate direct
de la productor n prima zi n care puteau fi

42

comercializate ct i n probe de crnai preparai experimental, n

laborator. S-a constat scderea concentraiei nitrailor i nitriilor n
paralel cu apariia i creterea concentratiei nitrozaminelor.
La proba de unc de pui, concentraia nitratului a sczut
n procent de 71,68 % iar cea a nitritului n procent de 92,3 %; n proba
de salam bnean uscat, scderea concentraiilor nitratului i
nitritului a fost de 56,59 %, respectiv de 82 %; n salamul franuzesc
uscat concentraiile nitratului i nitritului s-au micorat n procent
de 73,72 %, respectiv 96,38 %: n proba de crnai tradiionali
descreterea concentraiilor a fost de 82,57 % pentru nitrat i de
98,51 % pentru nitrit, iar n proba de pastram de porc 94,37 %
pentru nitrat, respectiv 96,97 % pentru nitrit.
n cadrul loturilor de crnai proaspei preparai experimental
s-au constatat descreteri ale concentraiilor nitrailor i nitriilor n
procente mai mici comparativ cu scderea concentraiilor analiilor
n preparatele industriale, care s-au ncadrat ntre 31,31 % i 64,28 %
pentru nitrit, respectiv 56,79 % i 74,55 % pentru nitrat.
Cercetrile ntreprinse au evideniat faptul c procesul de
formare a nitrozaminelor n preparatele din carne este lent i
progresiv; intervalul de evideniere a primelor valori cuantificabile
ale nitrozaminelor a fost cuprins ntre 14 i 21 de zile. Remarcm
faptul c pentru unele produse preparate industrial, nivelul de NA
determinat dup 28 de zile a fost peste limita maxim admis
pentru acest tip de produse (1g/kg). La preparatele din carne
obinute industrial, la finalul studiului, concentraia NDMA
(nitrozodimetilaminei) a variat ntre 0,80-23,40 g/kg, iar
concentraia NDEA a variat ntre 11,60 i 61,90 g/kg. Pentru
probele de crnai de porc preparai n laborator, la finalul
studiului, concentraiile nitrozaminelor s-au situat n intervalele de
valori 0,28-0,56 g NDMA/kg i (0,13-0,29) g NDEA/kg.
n funcie de tipul dietei alimentare abordate, aportul de nitrai i
nitrii prin alimentaie este diferit. Expunerea uman la nitrai i nitrii
prin consum de alimente, evaluat n urma efecturii studiului, este
n concordan cu recomandrile OMS (157 mg nitrat/zi) n cazul
dietelor vegetarian i convenional, n timp ce n dieta vegetalian
cantitatea de nitrat evaluat este de 2,34 ori mai

43

mare dect cantitatea recomandat. EFSA recomand un consum

zilnic de 400 g legume, ceea ce nseamn un aport de 0,003 mg
nitrit/kg corp/zi pentru un adult cu greutatea de 60 de kg. Din estimrile
efectuate rezult depiri ale cantitii recomandate la toate tipurile
de diete dup cum urmeaz: de 5,66 ori la dieta vegetalian, de 10
ori la dieta vegetarian i de 13,33 ori la dieta convenional.

Studiile efectuate asupra a trei tipuri diferite de diete:

vegetalian, vegetarian i convenional, au scos n eviden
importana unei conduite alimentare care s aduc n
organism cantitatea minim posibil de nitrit.
Modificarea unor parametri biochimici i hematologici n
urma
administrrii
unei
doze
unice
de
100
mg
nitrozodietilamin/kg corp la obolani masculi din rasa Wistar,
concretizat prin creterea valorilor AST, ALT, GGT, bilirubin,
colesterol (care caracterizeaz activitatea hepatic) i prin
micorarea hematocritului, a concentraiei eritrocitare medii de
hemoglobin, a hemoglobinei asociat cu scderea concentraiei
fierului, sugereaz manifestarea toxicitii nitrozodeietilaminei.

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
Knobeloch L, Salna B, Hogan A, Postle J, Anderson H. Blue babies
and nitrate-contaminated well water. Environ Health Persp
2000; 108: 675-678.
Tamme T, Reinik M, Roasto M, Juhkam K, Tenno t, Kiis A, Nitrates
and nitrites in vegetable- based products, and their intakes by
the Estonian population, Food Additives and Contaminants,
2006; 23: 355-361.
Santamaria P, Nitrate in vegetables: Toxicity, content, intake and EC
regulation, Journal of the Science of Food and
Agriculture,2006; 86:10-17.
Santamaria P, Elia A, Serio F, Todaro E, A survey of nitrate and
oxalate content in fresh vegetables, Journal of the Science of
Food and Agriculture, 1999; 79: 1882-1888.
44

Zhong et al., 2002 Zhong W, Hu C, Wang M, Nitrate and nitrite in

vegetables from north China: content and intake.Food
Additives and Contaminants, 2002; 19: 1125-1129.
Suin J, Kmeci V, Gregorcic A, A survey of nitrate and nitrite content
of fruit and vegetables grown in Slovenia during 1996-2002.
Food additives and Contaminants, 2006; 23: 385-390.
Menard et al. (2008) Menard C, Heraud F, Volatier J.L, Assesment of
dietary exposure of nitrate and nitrite in France. Food
Additives and Contaminants, 2008; 25: 971-988.
Cuciureanu R. Elemente de Igiena alimentaiei. Iai: Ed. Gr.T. Popa,

2005.
Regulamentul (UE) nr. 1129/2011 al Comisiei din 11.11.2011 de
modificare a anexei II la Regulamentul (CE) nr. 1333/2008 al
Parlamentului European i al Consiliulu
Banu C, Alexe P, Vizireanu C. Procesarea industrial a crnii.
Bucureti: Ed. Tehnnic, 1997, 208-213, 455.
Madrid VA, Madrid CJ. Los aditivos en los alimentos (Segn la
a
Unin Europea y la Legislacin Espaola), 1 Edicin, AMV
Ediciones, Mundi Prensa, 2000;
Honikel K. The use and control of nitrate and nitrite for the
processing of meat products, Meat Sci 2008; 78: 6876.
EFSA, Opinion of the scientific panel on biological hazards on the
request from the commission related to the effects of
nitrates/nitrites on the microbiological safety of meat
products, EFSA Journal, 2003; 14 (1), 31.
Andrade R, Reyes FGR, Rath S. A method for the determination of
volatile N-nitrosamines in food by HS-SPME-GC-TEA.
Food Chemistry 2005; 91: 173179.
Arranz N, Hanza AI, Garcia A, Rafter J, Morales P. Protective effect
of vitamin C towards N nitrosamine - induced DNA damage
in the single-cell gel electrophoresis(SCGE)/HepG2 assay.
Toxicol In Vitro 2007; 21(7): 1311-1317.
Byun MW, Ahn HJ, Kim JH, Lee JW, Yook HS, Han SB.
Determination of volatile N-nitrosamines in irradiated
fermented sausage by gas chromatography coupled to a
thermal analyzer. J Chromatogr A 2004; 1054: 403-407.
45

Lijinsky W. N-nitroso compounds in the diet. Mutat. Res 1999; 443 :

129138.
Challis BC. Nutrition and nitrosamine formation. P Nutr Soc 1985;
44: 95100.
Mirvish SS. Formation of N-nitroso compounds: Chemistry, kinetics
and in vivo occurrence, Toxicol Appl Pharm 1975; 31: 325
351.
Ward FW, Coates ME. Dietary fats and N-nitrosation in the rat. Brit
J Nutr1987; 58: 221231.
Ventanas S, Ruiz J. On-site analysis of volatile nitrosamines in food
model systems by solid-phase microextraction coupled to a
direct extraction device. Talanta 2006; 70: 1017-1023.
Thicker, 2000).Thicker A.R, in F.J. Francis (Ed.), Encyclopedia of
Food Science and Technology, second ed., vol.2, Wiley, New
York, 2000, p.1707.
Brambilla G, Martelli A. Genotoxic and carcinogenic risk to humans
of drug-nitrite interaction products. Mutat Res 2007; 635: 1752.
Robbiano L, Martelli A, Allavena A, Mazzei M, Gazzaniga GM,
Brambilla G. Formation of the N- nitroso derivates of six Badrenergic-blocking agents and their genotoxic effects in rat
and human hepatocytes. Cancer Res 1991; 51: 2273-2279.
Pegg AE, Perry W. Alkylation of nucleic acids and metabolism of
small doses of dimethylnitrosamine in the rat. Cancer Res
1981; 41: 3128-3132.
Haggerty HG, Holsapple MP. Role of metabolism in dimethyl
nitrosamine-induced
immunosuppression:
a
review.
Toxicology 1990, 63:123.
Lee VM, Keefer LK, Archer MC. An evaluation of the roles of
metabolic denitrosation and alpha-hydroxylation in the
hepatotoxicity of N-nitrosodimethylamine. Chem Res Toxicol
1996; 9: 13191324.
Anderson LM, Koseniauskas R, Burak ES, Logsdon DL, Carter JP,
Driver CL et al. Suppression of in vivo clearance of Nnitrosodimethylamine in mice by cotreatment with ethanol.
Drug Metab Dispos 1994; 22:43-49.
46

Hecht SS. Approaches to cancer prevention based on an

understanding of N -Nitrosamine carcinogenesis. Proc Soc
Exp Biol Med 1997; 216: 181-191.
Lijinsky W. Comparative carcinogenesis of N-nitroso compounds in
different species. In: Walker EA, Griciute L, Categnaro M,
Borzsoni M editors. N-Nitroso Compounds:Analysis,
Formation and Occurrence. IARC Scientific Publications
No.31,International Agency for Research on Cancer. Lyon,
France, 1980, 745-753.
Cliet I, Fournier E, Melcion C, Cordier A. In vivo micronucleus test
using mouse hepatocytes, Mutat Res 1989; 216: 321-326.
Morison V, Ashby J. Reconciliation of five negative and four positive
reports of the activity of dimethylnitrosamine in the mouse
bone marrow micronucleus assay. Mutagenesis 1994; 9: 361365.
Sato S, Taketomi M, Morita T. Simplified mouse peripheral
reticulocyte micronucleus test with dimethylnitrosamine,
Mutat. Res 1992; 278: 103-107.
Robbiano L, Mereto E, Morando AM, Pastore P, Brambila G. An in
vivo micronucleus assay for detecting the clastogenic effect
in rat kidney cells. Mutat Res 1997; 390: 51-57
Inui N, Nishi Y, Taketomi M, Mori M. Transplacental action of
sodium nitrite on embryonic cells of Syrian golden hamster,
Mutat Res 1979; 66:149-158.
Bolognesi C, Rossi L, Santi L. A new method to revealthe genotoxic
effects of N-nitrosodimethylamine in pregnant mice. Mutat
Res. 1988; 207:57-62.
Jorquera R, Castonguay A, Schuller HM. Effects of age ethanol on
DNA single-strand bresks and toxicity induced by 4 (methylnitrosamino) - 1 - (3-pyridyl) 1 - butanone or Nnitrosodimethylamine in hamster and rat liver. Cancer Lett
1993; 74: 175-181.
Asakura S, Sawada S, Daimon H, Fukuda T, Ogura K, Yamatsu K et
al. Effects of dietary restriction on induction of unscheduled
DNA synthesis (UDS) and replicative DNA sunthesis (RDS)
in rat liver. Mutat Res 1994; 322(4): 257-264.
47

Tinwell H, Lefevre PA, Ashby J. Mutation studies with

dimethylnitrosamine in young and old lac I transgenic mice,
Mutat Res 1994; 307: 501-508.
Webster KS, Gawde MD, Bhattacharya RK. Protective effect of
rutin, a flvonol glycoside, on the carcinogen-induced DNA
damage and repair enzymes in rats, Cancer Lett 1996; 109:
185-191.
Jalas JR, McIntee EJ, Kenney PM, Upadhyaya P, Peterson LA,
Hecht SS. Stereospecific deuterium substitution attenuates
the tumorigenicity and metabolism of the tobacco-specific
nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1butanone (NNK), Chem Res Toxicol 2003; 16: 794806
Raj A, Mayberry JF, Podas T. Occupation and gastric cancer.
Postgrad Med J 2003; 79: 252258.
Jakszyn P, Bingham S, Pera G, Agudo A, Luben R, Welch A et al.
Endogenous versus exogenous exposure to N-nitroso
compounds and gastric cancer risk in the European
Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC EURGAST) study. Carcinogenesis 2006; 27(7): 14971501.
de Vocht, Burstyn I, Straif K, Vermeulen R, Jakobsson K, Nichols L,
Peplonska B et al. Occupational exposure to NDMA and
NMor in the European rubber industry, J Environ Monit 2007;
9: 253259.
Helguera AM, Gonzalez MP, Cordeiro MNDS, Cabrera MA.
Quantitative structure-carcinogenicity relationship for
detecting structural alerts in nitroso compounds: species, rat;
sex, female; route of administration, gavage. Chem Res
Toxicol 2008; 21:633642
Rostkowska K, Zwierz K, Raski A, Moniuszko-Jakoniuk J,
Roszczenko A. Formation and metabolism of Nnitrosamines. Polish J Environ Stud 1998; 7: 321325.
Yamazaki H, Oda Y, Funae Y, Imaoka S, Inui Y, Guengerich FP et al.
Participation of rat liver cytochrome P450 2E1 in the
activation
of
N-nitrosodimethylamine
and
Nnitrosodiethylamine to products genotoxic in an
acetyltransferase-overexpressing Salmonella typhimurium
strain (NM2009). Carcinogenesis 1992; 13: 979985.
48

Jaworska G. Content of nitrates, nitrites, and oxalates in New Zealand

spinach. Food Chemistry 2005; 89(2): 235-242.
Uwah EI, Abah J, Ndahi NP, Ogugbuaja VO. Concentration levels of
nitrate and nitrite in soils and some leafy vegetables obtained
in Maiduguri, Nigeria. JASES 2009; 4 (3): 233-244.
LUCRRI PERSONALE PUBLICATE IN EXTENSO DIN
DOMENIUL TEZEI

1. Avasilci L., Cuciureanu R. (2008) Nitraii i nitriii din

preparatele din carne-precursori ai nitrozaminelor, disciplina
Chimia mediului i alimentului Facultatea de Farmacie,
Universitatea de Medicin i Farmacie Gr.T.Popa Iai,
Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iai-2011-vol115, nr.2.
2. Avasilci L., lencu B., Ciobanu C., Cuciureanu R.
(2011) Effects of sodium selenite administration during
diethylnitrosamine intoxication in rats. Studia Universitatis
Vasile Goldi, Seria tiinele Vieii Vol.21, issue 2,
2011, pp.169-174.

49