STRUCTURA ACIZILOR NUCLEICI

Dup provenienta lor, respectiv dup materialele din care au fost extrasi, acizii nucleici erau considerati de dou tipuri: acizi timonucleici (acizi nucleici animali) acizi zimonucleici (acizi nucleici vegetali). Ulterior denumirile lor au fost nlocuite cu denumirile de: acizi dezoxiribonucleici (ADN) acizi ribonucleici (ARN).

Secvente: - oligonucleotidice - polinucleotidice ( acizii nucleici) Unitatea de structura a acizilor nucleici este NUCLEOTIDUL alcatuit din : - baza azotata - pentoza ( zahar, glucid) - radical fosfat.

Bazele azotate - purinice : adenina(A),6-amino purina si guanina(G),2-amino-6-oxipurina - pirimidinice : citozina(C), timina(T) si uracilul(U)

Bazele azotate prezint fenomenul de tautomerie

NH C N NH

NH2

NH2 C N

NH

forma amino

forma imino

Citozina

C HN O N

C OH

forma lactam

forma lactim

Zaharul este o pentoza cu 5 atomi de C. Radicalul fosfat(P) formeaza legaturi esterice cu pentozele. ribonucleotid (ADENOZIN-5-FOSFAT)

5
dezoxiribonucleotid (DEOXIADENOZIN-5-FOSFAT)

Riboza
HO CH2
4 3 2

Dezoxiriboza
HO CH2 OH O

OH O
1

OH OH

OH

lipsete 2-OH

 Combinaia dintre o baz i o pentoz se numete nucleosid Combinaia celor trei componente nucleotid.

ribonucleotid (ADENOZIN-5-FOSFAT)

baz azotat (ADENIN)

nucleozid (ADENOZIN) dezoxiribonucleotid (DEOXIADENOZIN-5-FOSFAT)

Legtur -N-glicozidic

Baza

Nucleozidul

Nucleotid

Adenina Adenozina (A) (A)

Adenozin monofosfat (AMP) sau adenilat Adenozin difosfat (ADP) Adenozin trifosfat (ATP)

Terminologie Ribonucleozide/Ribonucleotide (cnd pentoza = riboz)

Baza Adenina (A) Nucleozidul Adenozina (A) Nucleotidul Adenozin monofosfat (AMP) Adenozin difosfat (ADP) Adenozin trifosfat (ATP) Guanozin monofosfat (GMP) Guanozin difosfat (GDP) Guanozin trifosfat (GTP) Citidin monofosfat (CMP) Citidin difosfat (CDP) Citidin trifosfat (CTP)

Guanina (G) Guanozina (G)

Citozina (C)

Citidina (C)

Uracil (U)

Uridina (U)

Uridin monofosfat (UMP) Uridin difosfat (UDP) Uridin trifosfat (UTP)

Dezoxiribonucleotide
Dezoxiadenozin monofosfat (dAMP) sau dezoxiadenilat

Dezoxiadenozin difosfat (dADP)

Dezoxiadenozin trifosfat (dATP)

Terminologie Dezoxiribo-nucleozide/nucleotide (cnd pentoza = dezoxiriboz)

Baza Adenina (A) Nucleozidul Dezoxiadenozina (A) Nucleotidul Dezoxiadenozin monofosfat (dAMP) Dezoxiadenozin difosfat (dADP) Dezoxiadenozin trifosfat (dATP) Dezoxiguanozin monofosfat (dGMP) Dezoxiguanozin difosfat (dGDP) Dezoxiguanozin trifosfat (dGTP) Dezoxicitidin monofosfat (dCMP) Dezoxicitidin difosfat (dCDP) Dezoxicitidin trifosfat (dCTP) Dezoxitimidin monofosfat (dTMP) Dezoxitimidin difosfat (dTDP) Dezoxitimidin trifosfat (dTTP)

Guanina (G) Dezoxiguanozina (G)

Citozina (C)

Dezoxicitidina (C)

Timina (T)

Dezoxitimidina (T)

Structura primara ADN

Lantul unei catene de ADN este format prin insiruirea celor 4 tipuri de nucleotide care se unesc intre ele cu ajutorul acidului fosforic.

O HN H2N
5' e nd HO

Guanine
N N

Lanul polinucleotidic al ADN

N
CH 2

NH2 N

Cytosine
O

3linkage
O

O P O O
CH 2

N
O

5linkage
O

P O

O
O H3C

Thymine
NH

NH

P O

CH 2

OH 3' e nd

Reprezentarea simplificat a catenei de ADN

O HN H2N
5' end HO

Guanine
N N

N
CH 2

NH2 N

Cytosine
O

Prin convenie o caten de ADN se scrie n direcia 5- 3. ex. GCT nseamn 5GCT 3

O O P O O
O CH 2

N
O

O P O O
H3C O

Thymine
NH

NH

O P O O

CH 2

OH 3' end

U.M.F IAI

STRUCTURA PRIMAR ADN este un macro-polimer de dezoxiribonucleotide;

[P 5dR - N]n

Grup fosfat
(ac.ortofosforic)

Baz azotat:
Pentoz Pur A, G Pir T, C

D-2-dezoxiriboza

U.M.F IAI

Polimerizarea nucleotidelor: legturi covalente (puternice) fosfodiesterice Se formeaz o caten (lan): - continu, - linear (neramificat!) o parte "constant" (ax) fosfo-glucidic i o parte variabil bazele azotate

 Periodiocitate celor 4 nucleotide, adica o ordonare regulata:

A-T-G-C-A-T-G-C-A-T-G-C-A.
Chargaff a demonstra prin metode fizico-chimice ordinea aperiodica a nucleotidelor din monocatena de AND : .. A-T-T-A-G-C-G-A-T-C-C-A-C-A-T.

Informaia genetic codificat = secvena (ordinea) nucleotidelor determin ordinea aminoacizilor n proteine. 5'- ATGCCTAGATCA - 3' aa1- aa2-aa3- aa4

alfabet nucleic = patru "litere": A, T, G, C

"cuvinte" de trei litere = triplet sau codon aminoacid

ATG Met asamblate ntr-o "fraz" = o gen = unitatea de informaie genetic; secvena nucleotide secvena AA n protein.
ATG TGT AAA CCA Met cis lys pro

Structura secundara ADN

Bazele azotate se leaga complementar : A-T si G-C (formand un cuplu sau o pereche de baze pb).

Analizele chimice ale ADN au dus la stabilirea regulii lui Chargaff (1951) conform careia : A+G=T+C A/T si G/C =1 si A+T/G+C este diferit de 1 si caracteristic fiecarei specii (la om e de 1,7)

Intotdeauna adenina se leaga de timina prin 2 legaturi de hidrogen si guanina se leaga de citozina prin 3 legaturi de hidrogen.

Forma clasica de ADN descrisa de Watson si Crick reprezinta tipul B. In alte conditii, duplexul de ADN se poate gasi sub alte forme structurale.

AND de tip B Diametrul este de 20 A, pasul elicei (distanta pentru o rotatie completa de 360) este de 34 A si cuprinde o spira cu 10 perechi de nucleotide. Deci distanta dintre 2 nucleotide este de 3,4 A.

STRUCTURA TERTIARA ADN AND-ul celulelor eucariote se asociaza cu proteine histonice formand nucleoproteina. Proteinele au o dispozitie discontinua la exteriorul helixului complementar.

ACIDUL RIBONUCLEIC (ARN)

Complex macromolecular, structural i funcional, similar n anumite privine, ADN-ului. ARN-ul rezult din polimerizarea unor ribonucleotizi, care determin formarea unor lanuri lungi, monocatenare (structur primar). Pe anumite poriuni scurte monocatena de ARN se poate rsuci n jurul ei, determinnd apariia unei structuri duble ntre secvenele complementare de baze (structur secundar).

Exista diferente nete la nivelul structurii acizilor nucleici:

Compozitia chimica a acizilor nucleici

Compus chimic

ADN

ARN

Baze azotate
a) Purinice Adeninia, Guanina Adeninia, Guanina

b) Pirimidinice

Citozina, Timina

Citozina, Uracil

Pentoza

2-Dezoxiriboza

Riboza

Acid fosforic

Radical

Radical

TIPURI DE ADN
Tipul A caracterizat printr-un helix larg, prezinta bazele azotate orientate puternic spre interior. Duplexurile hibride ADN-ARN apartin structural formei A. Tipul B reprezinta structura generala a macromoleculei de ADN in celulele active metabolic. Diferentele dintre baze sunt de obicei usor de evidentiat in scobitura principala, care reprezinta locul ADN A principal de contact pentru proteine care leaga specific secventele de ADN. Tipul Z, singurul cu rasucire la stanga, este in contrast cu forma clasica, respectiv tipul B. Este o forma compacta avand cele mai multe perechi de baze pe rotatie. Numele este dat de forma in zig-zag a catenei fosfo-glucidice.

ADN B

ADN Z

TIPURI DE ARN
Exista 3 tipuri importante de ARN: ARN mesager (ARNm) ARN de transfer (ARNt)

ARN ribozomal (ARNr).

ARN t : - bucla 1 prezinta o secventa specifica cu rol de situs pt fixarea temporara a ARNt la ribozom in timpul sintezei proteice - bucla 4 (bucla dihidrouracilului) - bucla 3 ( bucla anticodonului) prezinta o tripleta de nucleotide (3-5) care recunoaste codonul din ARNm (5-3) cu care formeaza leg de H in timpul fixarii ARNt pe complexul ARNm-ribozom.

FUNCTIILE ACIZILOR NUCLEICI

ADN
o autocatalitica (autoreplicare, reparare)-conserva informatia genetica; o heterocatalitica-datorita structurii primare aperiodice transcrie informatia genetica in ARN- proteine-caracter. o variabilitate- asigura posibilitatea de recombinare sau de mutatie a ADN

ARN
ARNm-in transcriptie ARNr-cupleaza ribozomii in procesul de translatie.

ARNt-transporta aminoacizii la locul sintezei proteice.

Funcia heterocatalitic a ADN

ADN
ADN ARN-m

ARN
Informaia genetic

Proteine

Informaia genetic

Proteine

Funcia autocatalitic a ADN

autoreplicare semiconservativa Ca urmare a sintezei ADN-ului, prin diviziunea celulara informatia genetica (parentala) se conserva si

apoi se transmite (in mare parte

nemodificata) celulele fiice ADN helicazele desfac dublu helixul

de ADN (folosind energia furnizat

de ATP).

Replicarea ADN la eucariote debutez n mai multe puncte de origine, ce corespund unor mici uniti de replicare numite repliconi.

 Replicarea progreseaz bidirecional pentru fiecare replicon i, dup ce se termin, repliconii fuzioneaz treptat pn ce ntreagul AND este duplicat.

Complex multiproteic, o veritabil main de replicarecare realizeaza replicarea =REPLISOM : HELICAZE GIRAZE (topoizomeraze) POLIMERAZE PRIMAZE

Proteinele de replicare A (RPA) numite i proteine SSB (de la single-strand binding proteins) LIGAZE

 Proteine SSB (de la single-strand binding proteins) mpiedic remperecherea bazelor.

ADN polimeraze-tipurile ,,,,

sintetizeaza ADN in prezenta dezoxinucleotid-trifosfatului
si a ionului de Mg2+ ADN polimeraza (Pol) tip alungeste primer-ul cu pana la 20 de nucleotide, fiind apoi preluata functia de Pol (care are si proprietatea de a cauta greselile) pe catena conducatoare si respectiv Pol (aceeasi functie) pe catena decalata. Pol este implicata in repararea ADN-ului, excizand baze si sintetizand unele complementare matritei Pol de asemenea cu capacitate de cautare a greselilor in directia 3 -5, replica si repara ADN-ul mitocondrial

ADN polimerazele prezinta dou caracteristici generale: toate ADN polimerazele sintetizeaz ADN numai n direcia 53 nu tiu s nceap sinteza unei catene ci numai s o alungeasc, adugnd un nucleotid la extremitatea 3OH

 Sub aciunea primazei se sintetizeaz amorse scurte = primeri..

 Schematic, dubla spiral a ADN se separ n cele dou catene componente formnd o structur n form de Y numit furc de replicare.

Sinteza ADN se face diferit pe cele 2 catene : pe catena CONDUCATOARE se face direct, in sensul de actiune a ADN polimerazei5-3 pe catena DECALATA se face pe segmente scurte fragmente OKAZAKI in prezenta primerului.

 Astfel, o molecul bicatenar de ADN va forma dou molecule noi, identice ntre ele precum i cu molecula parental

ETAPELE REPLICARII ADN

Desfacerea ( derularea ) helixului in prezenta ADN helicazei SSB- proteinele nu permit monocatenelor sa se apropie

Replicarea incepe simultan pe ambele catene in directia 5-3: - pe catena conducatoare este continua in prezenta ADN polimerazei epsilon si dNTP. - pe catena decalata sinteza se face discontinuu in prezenta ADN polimerazei delta + dNTP+ primaza +primer fragmentele Okazaki (unite prin ligaze, dupa indepartarea si inlocuirea primerului cu ADN) Cele 2 molecule nou formate se rasucesc

Replicarea catenei decalate

- Helicaza desface

catenele - Primaza sintetizeaza si alipeste un primer ARN, apoi ADN polimeraza delta fixeaza dNTP in directia 5 3 formandu-se fragmentele Okazaki

In final toate golurile ramase in catena vor fi eliminate prin interventia ligazei, ce uneste fragmentele Okazaki.

DOVEZI ale replicarii semiconservative a ADN

EXPERIMENTUL MESELSOHN si STAHL

Metode de analiza a acizilor nucleici

Metode de analiz a acizilor nucleici: hibridizarea extracia i amplificarea ADN; reacia polimerizrii n lan polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie. secvenierea ADN

U.M.F IAI

Denaturarea i hibridizarea ADN

n condiii experimentale (tratare termic sau chimic) ruperea (desfacerea) legturilor de hidrogen = denaturare monocatene *.
monocatenele de ADN rcite lent se pot reasocia pe baza complementaritii = renaturare sau hibridizare. rcire brusc monocatene separate

U.M.F IAI

DENATURAREA I HIBRIDIZAREA ADN

Monocatenele ADN separate se pot uni, pe baz de complementaritate, cu alte monocatene de ADN sau ARN formnd hibrizi moleculari; HM folosii n diagnostic i tratament:

hibridizare ntre o monocaten de ADN

nativ i o "sond de ADN (secven de ADN obinut artificial) ce corespunde unei gene, marcat fluorescent: - hibridizarea sondei prezena semnalului prezena genei; - absena semnal = deleia genei
del

Izolarea i purificarea acizilor nucleici

In funcie de tipul de molecule de acizi nucleici i de organismul de origine au fost elaborate numeroase metode de izolare i purificare. Indiferent de metoda utilizat este necesar parcurgerea mai multor etape: obinerea (cultivarea) materialului biologic; liza celulelor pentru eliberarea acizilor nucleici; ndeprtarea componentelor celulare nedorite (resturi celulare, proteine etc); purificarea acizilor nucleici de interes; concentrarea acizilor nucleici obinui

Reacia polimerizrii n lan

PCR este reactia de copiere si amplificare a informatiei ADN. PCR const n repetarea ciclic a unui sistem de trei etape : amplificarea-denaturarea ADN dublu catenar matri care trece n form monocatenar. renaturarea (alinierea perechilor de primeri la matriele de ADN monocatenar) prin hibridizare n zona 3, la monocatene elongarea noilor catene de ADN sub aciunea ADN polimerazei. PCR prezint numeroase aplicaii clinice: diagnosticul molecular al bolilor genetice i al predispoziiilor ereditare la boli, detectarea rapid i precis a mutaiilor implicate n determinismul bolilor monogenice, diagnosticul precoce i evaluarea prognosticului bolii canceroase, depistarea infeciilor virale i bacteriene, diagnosticul prenatal efectuat pe celulele fetale prezente n sngele gravidei.

Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie (RFLP)

Aceast tehnic evideniaz polimorfismele existente la nivelul situsurilor enzimelor de restricie. Tehnica RFLP, bazat pe PCR, utilizeaz o enzim de restricie pentru digerarea unui produs de amplificare, obinut cu primeri specifici, iar n gelul de agaroz se vor obine benzi de dimensiuni diferite, corespunztoare celor trei genotipuri (homozigoi pe una din cele dou alele i heterozigoi). RFLP poate fi folosit ca un marker genetic. Identificarea markerului poate ajuta la diagnosticarea unei boli genetice sau poate determina izolarea genei. Polimorfismul de restricie are importan deosebit i n criminalistic, determinarea paternitii, precum i n alctuirea harilor de restricie.

Secventierea AND
Secventializarea AND reprezinta identificarea tipului si succesiunii nucleotidelor dintr-un fragment ADN. Metoda Maxam-Gilbert bazata pe inducerea unor modificari chimice ale AND-ului si apoi clivarea lantului la nivelul acestor modificari. Metoda enzimatica Sanger (dideoxi) se bazeaz pe ntreruperea controlat a sintezei enzimatice a ADN, amplificat prin PCR; fragmentele sintetizate sunt separate elecroforetic O metod mult mai precis este marcarea fluorescent a fragmentelor i secvenierea automat. Fragmentele de ADN sunt migrate ntrun gel de poliacrilamid iar secveniatorul, prevzut cu un fascicul laser, excit fiecare molecul marcat i transform valorile fluorescente n secvena nucleotidica a fragmentului analizat.