Imunitatea celular specific

Imunitatea celular specific - limfocitele

Se mpart n dou mari categorii: Limfocite T
rspunzatoare de imunitatea celular

circul n snge, limf, dar cea mai important fracie se gsete cantonat n organele limfoide se gsesc n circulaie, n drum spre organele limfoide primare sau n interiorul acestora, aflate n diferite stadii de maturare

Limfocite B
rspunzatoare de imunitatea umoral au originea, iniial n ficatul fetal i ulterior n mduva hematogen n sngele periferic aproximativ 10-20 % din limfocite aparin liniei B. trec prin mai multe stadii pn s devin efectori competeni ai imunitii umorale

Maturaia limfocitelor T

Limfocitele T - funcii
Limfocitele T se mpart n mai multe populaii celulare cu funcii specifice. Ele nu se deosebesc din punct de vedere morfologic:
limfocitele CD8+ sau citotoxice limfocitele CD4+ sau ajutatoare (helper)
Th1:

Th2:

secret IL-2, IL-12, IFN gamma, TNF beta; activeaz macrofagele, amplificndu-le capacitatea de secreie a citokinelor i potenialul de prezentare a antigenelor; activeaz sinteza anticorpilor IgG, dar nu a IgE; sunt implicate n reaciile de hipersensibilitate ntarziat; sunt activate de semnalele date de virusuri i bacterii intracelulare; secret IL-4, IL-5, IL-6, IL-10; activeaz sinteza de IgE; stimuleaz proliferarea i activarea eozinofilelor; sunt stimulate de alergene sau componente parazitare;

Diferenierea Ly T CD4
Diferenierea limfocitului CD4+ naiv, activat, n limfocit efector de tip Th1 sau Th2 este influenat de o serie de factori, dintre care cei mai importani par s fie citokinele prezente n fazele precoce de activare i de expansiune clonal:
n prezenta IL-12 i a IFN-gamma CD4+ naive se vor diferenia n limfocite Th1 limfocitul Th2 se difereniaz n prezena IL-4

Modificri ale Ly T CD4

Scderea CD4 apare n: Infecii intercurente Leucopenii de diferite etiologii Terapie cu steroizi sau cu imunosupresoare Efort fizic excesiv Intervenii chirurgicale Graviditate Stres psihic Variaie diurn CD4 scad spre amiaz i cresc seara

Modificri ale Ly T CD8

Creterea CD8 se ntlnete n: Boli autoimune Infecii virale Reactii imune patologice de tipul Graft versus host disease, rejet de transplant Deficiene imune congenitale sau dobndite (SIDA)
Scderea CD8 se ntlnete n: LES sau dup tratament cu corticosteroizi

Raportul CD4/CD8 normal este dovada unui sistem imun sntos i are valoarea ntre 1 i 4. n infecia HIV scade numrul Ly CD4 iar raportul devine subunitar.

Alte tipuri limfocitare T

Celulele T (celule T gamma delta)

reprezint un mic subset al celulelor T, care posed un alt receptor T la suprafa (TCR). majoritatea celulelor T au TCR alctuit din 2 lanuri gp - i -. Spre deosebire de acestea celulele T au TCR alctuit dintr-un lan gamma i unul delta. sunt abundente n mucoasa intestinal

Celulele T natural killer (NKT)

sunt un grup heterogen de celule T, care au proprietile att ale celulelor NK, ct i ale celulelor T reprezint doar 0.2% din totalul limfocitelor T circulante n snge

Clasele limfocitare
Clasa de limfocite Functia limfocitelor Liza celulelor infectate viral si a celulelor tumorale Elibereaza cytokine i factori de crestere ce regleaza alte celule imune % Markeri fenotipici

NK

7% (2-13%)

CD16, CD56 dar nu CD3

T helper T citotoxic

46% (28-59%)

TCR , CD3 i CD4

Liza celulelor infectate viral si a celulelor tumorale si alogrefelor

Imunoreglare si citotoxicitate Secretie de anticorpi

19% (13-32%)

TCR , CD3 i CD8

T Limfocit B

TCR i CD3 23% (18-47%) CMH clasa II, CD19, CD20

Modificrile seriei limfoide

Limfocitoza:
Fr modificri morfologice: Dup efort fizic Stress Boli endocrine Post splenectomie Tuse convulsiv Cu modificri morfologice: Modificri reactive: mononucleoz, toxoplasmoz, bruceloz, TBC, lues, HIV, hepatite virale, CMV, LED, sarcoidoz Creterea numrului de limfocite mari granulare apare uneori n infecia HIV, HVB, EBV; Vacuolizri apar la pacieni cu boli metabolice (ex. glicogenoze) Limfoproliferri maligne: LLC, limfoame

Limfocite reactive

Citometria n flux
Citometria n flux este o tehnic folosit pentru numrarea, examinarea i sortarea particulelor microscopice suspendate n fluid. Permite de asemenea analiza multiparametric a caracteristicilor fizice i/sau chimice a unei singure celule ce trece printr-un aparat de detecie optic i/sau elecronic. Fluorocromii care pot fi utilizai sunt alei n funcie de laserul folosit pentru excitare i de detectorii disponibili.

Citometria n flux
Forward scatter (FS, FSC)
Lumin transmis prin mprtiere la 180 Proporional cu suprafaa (dimensiunea) celulei
Detector lumin mprtiat la 90

Side scatter (SS, SSC)

Lumin refractat i mprtiat la 90 Proporional cu complexitatea structural intern a celulei (granularitate)

Sursa de lumin

Detector lumin 180

Citometria n flux
Datele generate pot fi reprezentate sub form de ploturi ntr-o singur dimensiune, sub form de histograme sau n dou sau chiar trei dimensiuni. Regiunile din aceste ploturi pot fi separate pe baza intensitii fluorescenei cu ajutorul porilor. Citometrele moderne analizeaz cteva mii de particule pe secund, n timp real i pot separa i izola particule cu anumite proprieti.

Pozitiv CDX2

Dublu pozitiv CDX1 i CDX2

Negativ

Pozitiv CDX1

Interpretarea expresiei, respectiv a co-expresiei unui antigen

Citometria n flux
Citometria n flux utilizeaz principiile mprtierii, excitrii i emisiei de ctre moleculele de fluorocromi, pentru a genera date multiparametrice despre particule i celule cu diametre ntre 0,5 i 40m. Celulele sunt hidro-dinamic focusate n flux de PBS, nainte s ntlneasc o surs de lumin optim focusat. Ca sursa de lumin se folosete cel mai frecvent laserul. Un citometru are 5 componente principale:
Fluxul care antreaz celulele prin dreptul razei laser Sistemul optic Componenta electronic

Detectori care transform semnalele SSC, FSC, fluorescente n impulsuri electrice Sistem de amplificare liniar (SSC, FSC) sau logaritmic (FL) Computer pentru analiza semnalelor

Sistemul fluidic

Sistemul optic

Sistemul electronic

Aplicaii ale citometriei n flux

Hematologie volum, complexitate intern, CD. Citometria n flux a devenit metoda preferat pentru stabilirea liniei, stadiului de maturaie, stabilirea clonalitii, markerilor aberani (Imunofenotiparea). ADN ciclu celular, proliferare i cinetic celular ARN Expresia i localizarea unor proteine Antigene intracelulare diferite citokine, mediatori secunzi Activitate enzimatic Apoptoz, viabilitate celular Caracterizarea multirezistenei la droguri n celulele canceroase Combinaii

Aplicaii practice
Analiza cantitativ a seturilor limfocitare din sngele periferic.
Se folosesc markerii CD45, CD3, CD4, CD8, CD16+56, CD19. CD45 este antigen comun leucocitar folosit pentru investigarea celulelor hematopoetice.

Limfocitele exprim nalt CD45

Aplicaii practice

Separarea Ly T CD 4 i CD8

Aplicaii practice

Separarea populaiilor limfocitare T, B, NK

Aplicaii practice

Aplicaii practice
Leucemia limfatic cronic (LLC) - patternul LLC

Aplicaii practice

Caz tipic de LLC: demonstrarea clonalitii (lanuri uoare kappa), co-expresia CD19 cu CD5 i CD23 pozitiv

Aplicaii practice Leucemie acut mieloid

Strategia de gating a blatilor CD45/SSC n cazul unui pacient cu LAM. Se observ populaia blastic bine delimitat, cu expresie joas n funcie de CD45 i SSC.