Cursul 7

NEUROGENEZA LA ADULT
S-a considerat mult timp c sistemul nervos central nu i poate nlocui celulele degenerate. Aceast incapacitate era pus pe seama interferenei cu cicatricile gliale, lipsei factorilor neurotrofici care susin supravietuirea i creterea celular, prezenei factorilor neurotoxici care mpiedic remielinizarea. Formele de neuroplasticitate cunoscute explicau recuperarea parial a funciei unui sistem prin preluarea funciei de ctre alte structuri nervoase, prin activarea unor circuite secundare, prin mecanisme adaptatorii celulare (ex. nmugurirea sau sproutingul neuronal) sau prin renvare. Cercetri recente au demonstrat c neuroplasticitatea este susinut i la nivelul producerii i integrrii funcionale a unui numr mare de neuroni n creierul adult. Studierea sistemelor care continu s produc noi neuroni de-a lungul vieii poate fi cheia stimulrii neurogenezei n creierul lezat (ex: boli degenerative, epilepsie, traumatisme cranio-cerebrale severe, accidente vascularcerebrale), dar exist dovezi i asupra implicrii neurogenezei ca suport specific al memorrii i nvrii. Revenind la definiia pe care am propus-o la inceput pentru neuroplasticitate, notm c i neurogeneza la adult are drept scop tot optimizarea functional a sistemului nervos. Conceptul de neuroplasticitate evolueaz pe mai multe dimensiuni. Se remarc dimensiuni ale manifestrilor neuroplastice, fiind cunoscute astzi fenomene de plasticitate sinaptic i plasticitate neuronal sub forma de neurogenez i creteri ale numrului sau dimensiunii prelungirilor neuronale ce susin modificrile continue ale hrilor corticale ca suport al exerciiului nvrii i memoriei. Mai distingem o evolutie a acestui concept de neuroplasticitate pe dimensiunea temporal n perioada de dezvoltare i n viaa adult. De asemenea, neuroplasticitatea poate fi studiat n funcie de nivelul de aciune, cercetrile pivotnd de la neuroplasticitatea sistemelor cerebrale, la cea a reelelor neuronale, a celulelor nervoase individuale i a resorturilor moleculare ce se moduleaz n urma procesrilor specifice nvrii i memoriei. n fine, neuroplasticitatea permite flexibilitatea reaciilor structurale i functionale solicitate de scopuri diferite: neuroplasticitatea compensatorie, care se manifest pentru repopularea unor zone degenerate, reconstrucia sau preluarea funciei unor circuite neuronale perturbate i neuroplasticitatea constructiv, care asigur suportul nervos pentru realizarea nvrii i memoriei. Iniial, se credea c neurogeneza, procesul de generare al neuronilor integrai din punct de vedere funcional din celule progenitoare, are loc doar n timpul etapelor embrionare ale sistemului nervos central (SNC) al mamiferelor.
1

Cursul 7 ns descoperiri recente au artat c noi neuroni apar n regiuni discrete ale mamiferelor adulte. La majoritatea mamiferelor, neurogeneza apare n timpul vieii n zona subventricular (SVZ) a ventriculului lateral i n zona subgranular (SGZ) a girusului dentat din hipocampus. Neurogeneza apare extrem de rar n afara acestor regiuni sau chiar nu exist. Dup stimularea patologic, cum ar fi leziuni ale creierului, neurogeneza la adult apare i n regiuni considerate non-neurogenetice.

Metode de investiare a neurogenezei la adult

Analiza neurogenezei endogene la adult in vivo 1. Analiza bazat pe ncorporarea de nucleotide analoge n timpul diviziunii celulare n timpul replicrii ADN-ului n faza S a ciclului celular, nucleotidele exogene de tipul timidinei sau 5-bromodeoxiuridina (BrdU) sunt ncorporate n ADN-ul nou sintetizat i apoi transmise la celulele viitoare (fig. 7-1). Doi analogi diferii pot fi folosii secvenial pentru a msura lungimea ciclului celular. Aceast tehnic simpl permite analiza cantitativ a proliferrii, diferenierii i supravieuirii celulelor nou formate. BrdU poate fi detectat imunohistochimic i permite att analiza fenotipic ct i cuantificarea stereologic a celulelor noi. Fig. 7-1 Analiza bazat pe ncorporarea de nucleotide analoge n timpul replicrii ADN-ului n faza S a ciclului celular.

Exist totui cteva limitri ale acestei abordri. n primul rnd, necesit fixarea esutului i denaturarea ADN-ului i astfel nu este potrivit pentru analiza celulelor vii. n al doilea rnd, marcarea celulelor este restricionat doar

Cursul 7 la nucleu i necesit microscopie confocal pentru a confirma colocalizarea cu diferii markeri celulari specifici (fig. 7-2). Fig. 7-2 Co-localizarea BrdU cu diferii markeri specifici: DCX pentru neuroni imaturi; NeuN pentru neuroni maturi.

n al treilea rnd, cantitatea de analogi nucleotidici ncorporat dentr-o singur injecie este diluat ctre nivele nedetectabile dup cteva diviziuni celulare. 2. Analiza bazat pe marcarea genetic cu retrovirui Expresia transgenelor din retrovirui necesit integrarea viral n genomul gazdei. Pentru retrovirusuri ce nu posed mecanisme de import nucleare, cum ar fi n cazul virusul leucemiei murine, integrarea viral are loc doar atunci cnd membrana nuclear se rupe n timpul mitozei, fiind astfel un bun indicator al diviziunii celulare (fig. 7-3). Fig. 7-3 - Analiza bazat pe marcarea genetic cu retrovirui.

Cursul 7 Expresia GFP (proteina fluorescent verde) permite vizualizarea direct i analiza celulelor nou formate. Acest tehnic necesit ns injectarea invaziv n regiuni specifice ale creierului. 3. Analiza bazat pe expresia unor markeri specifici Neuronii n curs de dezvoltare exprim markeri distinci n timpul procesului lor de maturare. Dintre markerii comuni folosii pentru neuronii imaturi putem aminti PSA-NCAM (poly-sialytated-neuronal cell-adhesion molecule), Tuj1 ( tubulina izoforma III) i DCX (doublecortin). Markerii folosii pentru neuronii maturi includ MAP-2ab (microtuble-associated protein-2 formele a i b) i Neu N (nuclei neuronali). Neuronii nou formai pot fi identificai prin prezena de markeri imaturi i absena de markeri maturi ai neuronilor. Un progres important n neurogeneza la adult l-a constituit generarea de modele animale ce permite vizualizarea i manipularea specific a neuronilor nou formai n SNC adult (fig. 7-4). Fig. 7-4 - Analiza bazat pe expresia unor markeri specifici.

Au fost generai civa oareci transgenici pentru a exprima genele specifice interesate sub aciunea unui promotor ales. De exemplu, oarecii aduli ce exprim GFP sub controlul regiunilor reglatorii ale genei Nestin (marker neuronal timpuriu) arat att progenitorii naturali ct i neuronii imaturi. Analiza fenotipic a celulelor nou formate necesit examinarea colocalizrii markerilor specifici celulari. Deoarece celulele sunt strns legate ntre ele n SNC adult, metoda actual i propune reconstrucia tridimenional cu ajutorul mocroscopiei confocale (vezi fig. 7-2). Microscopul electronic a fost utilizat de asemenea pentru a arta ultrastructura celulelor nou formate. Analiza neurogenezei la adult in vitro i ex vivo Progenitorii neuronali multipoteni au fost izolai din regiuni variate ale SNC adult al mamiferelor. Aceste celule au fost dezvoltate i modificate genetic i pstrez n continuare capacitatea lor multipotent de-a lungul mai multor
4

Cursul 7 generaii. Datorit accesibilitii uoare i condiiilor de cultur definite, manipularea progenitorilor neuronali aduli n monostrat permite analiza precis a mecanismelor intrinseci i extrinseci ce controleaz etapele variate ale neurogenezei, incluznd proliferarea, supravieuirea, soarta, migrarea neuronal, maturarea i formarea sinapselor. Culturile progenitorilor neuronali din SNC adult sunt stabilite n mare msur pe baza creterii prefereniale fa de alte alte tipuri de celule n medii de cultur definite cu factori de cretere specifici (fig. 7-5).

Fig. 7-5 Metodologia pentru analiza neurogenezei adulte in vitro i ex vivo. Progenitori neuronali multipoteni au fost cultivai din regiuni variate ale SNC adult.
5

Cursul 7 Celulele extrase din esuturile specifice sunt plasate fie direct, sau dup o purificare parial n prealabil pentru a nltura contaminanii majori. Metodele de izolare prospectiv folosind sortarea celulelor fluorescent-active (FACS) au fost dezvoltate recent pe baza proprietilor celulelor. Se folosesc dou tipuri de culturi celulare progenitoare. n culturile neurosferice, progenitorii neuronali individuali prolifereaz pe un substrat non-adeziv i genereaz un grup de celule suspendate. n culturile adezive, progenitorii neuronali cresc n monostrat pe laminin. Cei mai frecveni factori de cretere folosii pentru a menine rennoirea progenitorilor neuronali aduli cultivai sunt EGF (factorul de cretere epidermal) i FGF-2 (factorul de cretere al fibroblatilor). Neurogeneza activ are loc doar n regiuni discrete ale SNC adult intact. Neuronii sunt generai continuu n zona subventricular (SVZ) i migreaz anterior de-a lungul reelei migratorii rostrale (RMS) ctre bulbul olfactiv pentru a deveni interneuroni (fig. 7-6).

Fig. 7-6 Generarea de noi interneuroni n bulbul olfactiv din celule stem neuronale din zona subventricular. Neurogeneza la adult n zona subventricular/sistemul olfactiv prezint patru etape: 1. Proliferarea: celulele stem (albastru) din zona subventricular a ventriculului lateral dau natere la celule amplificatoare tranzitorii (albastru deschis). 2. Diferenierea: celulele amplificatorii tranzitorii se difereniaz n neuroni imaturi (verde). Celulele ependimale adiacente (cenuiu) ale ventriculului lateral sunt eseniale pentru stabilirea soartei neuronilor prin furnizarea de inhibitori de glicogenez.

Cursul 7 3. Migrarea: Neuronii imaturi (verde) migreaz n lan de-a lungul reelei migratorii rostrale ctre bulbul olfactiv. Odat ajuni la bulb, noii neuroni migreaz radial ctre straturile celulare exterioare. Cum pot ns aceste celule s se mite i s se orienteze de-a lungul unor distane att de mari i s traverseze parenchimul dens al creierului adultului? n zona subventricular adult (SVZ) i n RMS, celulele A (galben) au o morfologie elongat cu un proces proeminent (fig. 7-7).

Fig. 7-7 - Migraia n lan neuronii tineri din reeaua SVZ i din RMS migreaz alturi cu formarea de lanuri lungi. Lanurile de celule migratorii (rou) sunt flancate de ctre celulele gliale (albastru) ce au caracteristici de astrocite. Aici sunt ilustrate 2 lanuri. n lanurile reconstituite in vitro, neuroblatii se deplaseaz cu pai mruni la o vitez de ~120m/h. Mecanismul celular ce propulseaz neuronii tineri cu o astfel de vitez nu este cunoscut. Este posibil ca polimerizarea microtubulilor i depolimerizarea s joace un rol important. Dublucortina (DCX), o protein asociat microtubulului este exprimat predominant de ctre celulele din lanurile reelei migratorii rostrale, sugernd c migrarea ctre bulbul olfactiv (OB) la adult presupune mecanisme moleculare cheie asemntoare celor care au loc n dezvoltarea embrionar. 4. Integrarea sinaptic: neuronii imaturi se difereniaz fie n neuroni granulari (portocaliu), fie neuroni periglomerulari (rou). Aceti interneuroni neobinuii nu au axon, i n schimb elibereaz neurotransmitorul din spinii dendritici.

Cursul 7 Neurogeneza hipocampic la primatele adulte Neurogeneza la adult a fost semnalat prima dat la roztoare, unde neuronii granulari sunt generai de-a lungul vieii dintr-o populaie de celule progenitore prezent n zona subgranular a girusului dentat. Aceste celule migreaz pn n stratul celulelor granulare, se difereniaz i exprim fenotipuri neuronale (fig. 7-8).

Fig. 7-8 Neurogeneza n girusul dentat adult Sus - seciune transversal a hipocampului ilustrnd diviziunile citoarhitectonice majore: DG (girusul dentat), EC (cortexul entorinal), S (subiculum); Jos celulele progenitoare neruonale (NPCs) sunt distribuite de-a lungul zonei subgranulare (SGZ), la grania dintre stratul celular granular (GCL) i hil (H); ML-strat molecular; MF-fibre muchioase. Gould et al (1999) au investigat n ce mod neurogeneza la adult se produce i la primate. Unsprezece maimue adulte Maccaca fascicularis i Maccaca mulatta care aveau ntre 5 i 23 de ani au primit injecii intraperitoneale de 5-bromodeoxiuridin (BrdU, ex. un analog al timinei care este ncorporat de celule n faza S, de sintez a ADN, a diviziunii mitotice). Erau considerai aduli tineri indivizii maturi sexuali (4 ani fem./masc.), dar care nu au atins greutatea corporal maxim (6 ani fem./9 ani masc.) i adulti de vrst medie indivizii care au trecut de perioada greutii corporale maxime. Pentru
8

Cursul 7 identificarea fenotipului celulelor, s-a realizat marcarea dubl cu BrdU i cu markeri specifici celulari (ex. TOAD-64, pentru celulele n curs de diviziune, NSE, NeuN i calbidina pentru neuroni i GFAP pentru celule gliale) i examinarea prin metode imunocitochimice pentru aceti markeri. Intervalul dintre ultima injecie BrdU i prelevarea seciunilor a variat de la 2h, perioada suficient pentru ca BrdU s fie preluat de celulele n faza S, dar insuficient pentru mitoz sau migrare, la 1-2 saptmni, pentru maximizarea ansei de a observa celule noi (BrdU pozitive) care exprim markerii neuronali i minimizarea probabilitii ca aceste celule s moar n interval. Rezultatele au indicat c, la toi indivizii, celulele BrdUp pot fi observate n girusul dentat, n zona subventricular (SVZ) aliniat la peretele ventriculilor laterali i ntr-o regiune corespunztoare reelei migratorii rostrale (RMS). La lotul la care seciunile au fost prelevate la 2h dup ultima infuzie BrdU, celulele BrdUp erau observate ocazional n reeaua migratorie rostral, girusul dintat i zona subventricular, iar grupuri mici de celule BrdUp erau identificate n zona subgranulara i n hilus. n general, tinerii aduli prezint mai multe celule BrdUp n girusul dintat fa de maimuele de vrst medie sau senescente (23 ani). La animalele sacrificate la 1-2 sptmni dup ultima injecie, celulele noi (BrdU/TOAD-64, NSE, NeuNp, dar nu BrdU/GFAPp) erau prezente n aspectul profund al girusului dentat n proporii variind de la 780 la 4308 celule; multe din celule prezentau caracteristicile morfologice ale neuronilor granulari, ex. corpuri celulare de mrime medie, rotunde sau ovale. La animalele care au primit injecii multiple de BrdU, numrul mediu de celule BrdUp era semnificativ: 1230 celule BrdUp n curs de diviziune (TOAD-64p), 822,1 celule BrdUp cu fenotip neuronal (NSE, NeuNp), 793 celule BrdUp cu fenotip neuronal granular (calbidinap). Celulele noi n curs de diviziune prezentau caracteristicile morfologice ale neuronilor granulari, inclusiv dendrite care se extindeau prin stratul molecular. Analizele stereologice au relevat scderea numrului de celule BrdU/TOAD-64p cu naintarea n varsta. Se tie c stresul determin creterea nivelului glucocorticoizilor circulani care reduce neurogeneza la adult. O posibilitate este ca scderea neurogenezei adulte n funcie de vrst s fie mediat tot de creterile asociate ale glucocorticoizilor. Nu s-au observat diferene ntre distribuia celulelor BrdUp sau TOAD-64p ntre cele dou specii. Neurogeneza n hipocampul uman adult Generarea de neuroni se credea c este limitat la o perioad discret de dezvoltare, majoritatea neuronilor fiind deja prezeni n a aptea lun de gestaie i desvrindu-i migrarea n viaa prenatal. Un studiu al lui Eriksson et al

Cursul 7 (1998) confirm neurogeneza la adult ca pe o form de neuroplasticitate prezent i la om. S-a prelevat post-mortem esut hipocampic i din SVZ adiacent nucleului caudat de la cinci pacieni cu cancer care primiser o injecie cu BrdU n scopuri diagnostice (ex. pentru monitorizarea metastazelor). Celulele BrdUp au fost cuantificate n stratul granular, zona subgranular a girusului dentat i n hilus (ex. aria CA4). Variaia inter-individual a numrului de celule BrdUp a fost determinat de diferena intervalului post-infuzie (16-781 zile) i vrsta diferit a subiectilor (57-72 de ani). Celulele gliale stelate cu nuclei neregulai i corpi celulari mici (BrdU/GFAPp:18,1+1,8%) erau prezente n jurul neuronilor, dar nu coincideau cu celulele BrdUp cu fenotip neuronal. Acestea din urm erau localizate n stratul granular sau n apropierea acestuia, prezentau corpi celulari mici sau medii cu nuclei rotunzi sau ovali; proporia medie de celule noi cu fenotip neuronal era de 22,0+2,4%, iar numrul celulelor BrdU/NSEp (neuroni) i BrdU/calbidinap (neuroni granulari) era de 22,7+2,8%, respectiv, 7,9+2,2%. n zona subventricular, toate seciunile au coninut celule BrdUp, dar nu au exprimat markerii specifici celulelor post-mitotice. Aceste celule noi au un nucleu mic rotund sau oval, similare cu progenitorii observai la SVZ a roztoarelor. Deci SVZ uman conine populaii mari de celule pluripotente care e nevoie s migreze pentru a se putea diferenia. Neurogeneza cortical la adult: un posibil suport pentru nvare Unele studii (Altman et al, 1965, 1967) indicau o corelaie interesant ntre comportamente complexe (ex. construirea cuibului care solicit refacerea repetat a drumului, comportamentele de extindere a teritoriului care se sprijin pe abiliti spaiale complexe) i neurogenez. Intensificarea ciclurilor neurogenice se coreleaz cu creteri ale performanei. Dat fiind rolul cunoscut al hipocampului n sarcinile de memorare i nvare, s-a sugerat ideea c neurogeneza la adult ar asigura un suport pentru sarcinile de nvare dependente de hipocamp. Ulterior, cercetrile efectuate la psri adulte au artat c neurogeneza se produce i n hiperstriatum, o structur omoloag cortexului cerebral de la mamifere. Pe aceste premise, evidenierea neurogenezei neocorticale la mamiferele adulte era previzibil. Experimentele s-au realizat la 12 maimue Maccaca fascicularis adulte care au fost injectate cu BrdU. La intervale de 2h/1-3 sptmani s-au prelevat seciuni din cortexul prefrontal, cortexul temporal inferior, posterior parietal
10

Cursul 7 (localizri implicate n procesri cognitive laborioase) i cortexul striat (unde se realizeaz procesarea primar a stimulilor vizuali) care au fost analizate prin metode histochimice pentru markerii celulari. La animalele la care seciunile s-au prelevat la 2h dup injecia BrdU, celulele BrdUp au fost localizate n SVZ, aliniate cu peretele ventriculilor laterali. Aceste celule precursor originare n SVZ migreaz ca neuroblati prin substana alb ctre regiunile din neocortex unde se difereniaz n neuroni maturi. La animalele la care s-au prelevat seciuni la 1-3 sptmani dup injecia BrdU, s-au observat celule cu nuclei ovali sau rotunzi, cu morfologie specific neuronal, n cortexul prefrontal, posterior parietal i temporal inferior, precum i n substana alb din poriunea intermediar SVZ-zona neocortical. n cortexul striat s-au identificat celule gliale noi, dar nici un neuron nou. Prin metoda etichetrii retrograde, s-a determinat c celulele nou generate i care au migrat n respectivele zone corticale i extind axoni i se integreaz n circuite locale. Deci neuroblatii se diferentiaz, se agreg i devin funcionali numai n zonele implicate n procesri cognitive laborioase. Oferim drept posibil explicaie faptul c neurogeneza depinde i de aciunea neurotrofinelor care, asa cum am vazut, acioneaz preferenial asupra sinapselor activate. Zonele prefrontal, parietal i temporal inferioar sunt implicate n plasticitatea comportamental. Neuronii noi adugai acestor zone pot servi ca substrat specific pentru nvare. Adugarea de noi neuroni neocortexului n timpul vieii adulte asigur un continuum de neuroni de diferite vrste, care ar putea forma complexul neuronal al dimensiunii temporale a memoriei (Gould, 1999). Descifrarea neurogenezei adulte pare s readuc, cel puin temporar, teoriile nvrii i memorrii la nivel celular. n aceast etap, eforturile teoretice de sintez i elaborarea unor modele alternative care s ncerce explicarea felului n care neurogeneza la adult susine nvarea pot debloca cercetarea.

11