UNIVERSITATEA “AUREL VLAICU” DIN ARAD

FACULTATEA DE INGINERIE ALIMENTARĂ TURISM ȘI

PROTECȚIA MEDIULUI
DOMENIUL: INGINERIA PRODUSELOR ALIMENTARE
PROGRAMUL DE STUDIU: MANAGEMENTUL CALITATII
PRODUSELOR ALIMENTARE, MASTER

REFERAT LA DISCIPLINA
METODE MODERNE DE
ANALIZA A ALIMENTELOR

ÎNDRUMĂTOR ŞTIINŢIFIC MASTERAND

Prof.univ.dr. FLORENTINA D. MUNTEANU Costea Patricia Andreea

ARAD
 2018

UNIVERSITATEA “AUREL VLAICU” DIN ARAD

FACULTATEA DE INGINERIE ALIMENTARĂ TURISM ȘI
PROTECȚIA MEDIULUI
DOMENIUL: INGINERIA PRODUSELOR ALIMENTARE
PROGRAMUL DE STUDIU: MANAGAMENTUL CALITATII
PRODUSELOR ALIMENTARE, MASTER

Metode de determinare a micotoxinelor din

alimente

ÎNDRUMĂTOR ŞTIINŢIFIC MASTERAND

Prof.univ.dr. FLORENTINA D. MUNTEANU Costea Patricia Andreea

ARAD
2018
2
 CUPRINS:

Introducere 4
Capitolul I. ELISA 5
Capitolul II. CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE 6
Capitolul III. HPLC 7
Capitolul IV. SPECTROMETRIE DE MASA 8
Bibliografie 10

Metode de determinare a micotoxinelor din alimente

3
 Micotoxinele sunt metaboliti toxici produsi de miceti pe diferite substraturi,în special
alimente si furaje, capabili sa produca îmbolnavirea celor care le consuma (om sau animal).
Se gasesc în sporii si talul micetilor sau ca produsi de secretie ai acestora în substraturile unde
se dezvolta. Acesti metaboliti apar în diferite stadii ale productiei de cereale (unele în
perioadade dezvoltare a cerealelor, altele in timpul depozitarii acestora). Cele trei genuri de
fungi producatori de micotoxine, importante din punct de vedere economic, sunt Aspergillus,
Penicillium si Fusarium.
Micotoxinele prezente în mod natural în diversele produse alimentare constituie o
problema serioasa de siguranta alimentara, mai ales în anumite regiuni ale globului în care
conditiile climatice sau standardele din agricultura sunt precare. Organizatia pentru Alimente
si Agricultura (FAO) estimeaza ca pe plan mondial pâna la 25% din culturile alimentare sunt
semnificativ contaminate cu micotoxine. In literatura sunt citate date conform carora în natura
ar exista un mare numar de micotoxine, din care au fost identificate peste 200 de specii.
Practic, nu se cunosc zone pe glob indemne si se apreciaza ca 25-60% din cerealele lumii sunt
contaminate cu micotoxine cunoscute, produse mai ales de fungi din genurile Aspergillus,
Fusarium, Penicillium amintite anterior. Raspândirea diferitelor specii de fungi, precum si
concentratia în micotoxine a hranei este influentata de conditiile pedo-climatice. O situatie
precisa a distributiei geografice a micotoxinelor a fost facuta într-un studiu prezentat în 1977,
la prima conferinta despre micotoxine a Organizatiei pentru Alimentatie si Agricultura (FAO),
Organizatiei pentru Sanatate Mondiala (WHO) si Programului Natiunilor Unite pentru Mediu
(UNEP).Aceasta a aratat ca în alimentele si nutreturile contaminate natural cu fungi se gasesc
în concentratii mari doar sapte micotoxine: aflatoxina, ochratoxina A, patulina, zearalenona,
tricotecenele, citrinina si acidul penicilic.

Tehnicile de determinare pentru micotoxine sunt laborioase şi necesită echipament

sofisticat. Determinarea micotoxinelor presupune eşantionare, extracţie cu solvenţi organici
sau apă, purificare pe coloane cromatografice şi detectare cantitativă. Metodele analitice
cuprind: metode cantitative, teste de screening;
Prima categorie cuprinde tehnica cromatografiei în strat subţire pentru separare finală
şi detecţie, de asemenea, tehnica imunoenzimatică ELISA, dezvoltată pentru screening rapid
şi cuantificare a micotoxinelor din cereale.
Metodele cantitative cuprind următoarele etape: extracţie, curăţare, separare şi
detecţie.

4
 De exemplu, extracţia deoxinivalenolului din probă se poate realiza prin agitare
mecanică sau omogenizare cu soluţie de acetonitril sau metanol, timpii de extracţie
influenţând gradul de extracţie a toxinei din matrice. Curăţarea (separarea) nu este necesară în
cazul metodelor imunochimice, fizico-chimice. Aceasta se bazează pe o serie de metode, cum
sunt: partiţie lichid-lichid, extracţie pe faza solidă, separare pe coloana cromatografică,
coloane de imunoafinitate şi coloane multifuncţionale. Pentru determinare cantitativă a
deoxinivalenolului şi ochratoxinei A se utilizează metoda ELISA. Metoda kit-urilor test
ELISA este o metoda rapidă ce permite obţinerea de rezultate în timp scurt, domeniul de
sensibilitate fiind de ordinul microgramelor. Pentru investigaţii de mare precizie şi acurateţe
(domeniul nanogramelor) şi confirmarea rezultatelor obţinute prin ELISA este necesar a se
aborda o metodă mai sensibilă.

1. ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) reprezintă un lanţ de

reacţii în care primul reactant (antigenul sau anticorpul, în funcţie de scopul urmărit) este
imobilizat pe un suport solid. Al doilea reactant al lanţului se leagă de elementul fix, în baza
specificităţii dintre antigen şi anticorp. Imunocomplexul format cuplează cel de-al treilea
reactant marcat enzimatic tot printr-o reacţie antigen-anticorp. Sfârşitul reacţiei are loc prin
adăugarea de substanţe cu rol de stopare.
Metode de analiză pentru determinarea rapidă, sensibilă, şi corectă a acestor
micotoxine din cereale neprelucrate şi produsele pe bază de cereale sunt foarte necesare, în
scopul de a evalua în mod corect atât riscul de expunere relevante şi riscul relevant
toxicologic pentru oameni şi animale, precum şi pentru a se asigura că nivelurile de
reglementare stabilite de UE sau de alte organizaţii internaţionale sunt îndeplinite.
Teste imunologice, cum ar fi ELISA, au devenit foarte populare în screening-ul
micotoxină la sfârşitul anilor 1970. În general, ELISA nu are nevoie de alte proceduri, şi
extracţia care conţine micotoxină este analizată în mod direct. Chiar dacă de multe ori le
lipsesc precizia la concentraţii foarte scăzute şi sunt limitate în gama de matrice a examinat,
imunităţi oferind teste rapide, necostisitoare de screening. Mai multe kituri ELISA care
utilizează anticorpi monoclonali sau policlonali împotriva micotoxinelor au fost dezvoltate
pentru analize calitative, semi-cantitative sau cantitative ale principalele micotoxine
cunoscute în matrice pe bază de cereale.
Printre metodele de detecţie se pot enumera:

cromatografia în strat subţire (TLC);

5
 gaz cromatografia (GLC);

. cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC);

spectroscopia de masă (MS).

2. CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE

Necesitatea analizei compusilor cu greutate moleculara mare, instabili termic sau a
compusilor biologici, fara efectuarea unor reactii auxiliare de derivatizare au impulsionat in
mod hotarator dezvoltarea cromatografiei de lichide. In prezent se poate afirma ca din totalul
amestecurilor de compusi naturali si sintetici, 80% pot fi separati si analizati prin
cromatografia de lichide.
Cromatografia pe strat subtire este o tehnica simpla ca aparatura, care ne ofera
posibilitati multiple de separare. Aceasta tehnica se mai numeste si cromatografia plana. In
ultimul deceniu s-au inregistrat progrese insemnate atat in privinta fazelor stationare cat si a
perfectionarii aparaturii de masurare. Aceasta dezvoltare a permis obtinerea unor limite de
detectie de ordinul μg si chiar a pg in cazul unor compusi adecvati.
In cazul cromatografiei pe strat subtire nu exista ingradiri in privinta utilizarii unor
solventi ca eluenti ce absorb in UV (de exemplu: toluen, acetona, acetat de etil etc.) si care
prezinta selectivitati bune intr-o serie de separari. De asemenea nu exista limitari in privinta
utilizarii unor reactivi pentru detectie sau identificare.
Principiul cromatografiei pe strat subtire:
Cromatografia pe strat subtire este o tehnica foarte raspandita datorita simplitatii ei si
posibilitatii de analizare a unor amestecuri complexe din punct de vedere calitativ si cantitativ.
Tehnica de lucru consta in aplicarea probei (solutiei), sub forma de spot sau banda la
1-2 cm de marginea inferioara a placii cromatografice, pe o linie imaginara numita linie de
start. Probele pot fi aplicate automat sau manual cu microcapilare, micropipete sau
microseringi. Placa cromatografica este formata dintr-o placa de sticla sau folie de aluminiu
acoperita cu un strat subtire de adsorbent (silicagel, silicagel chimic modificat, alumina,
celuloza microcristalina etc.). Dupa ce solventul in care a fost dizolvata proba s-a evaporat,
placa este introdusa cu partea inferioara intr-o cuva ce contine solventul sau amestecul de
solventi de developare. Developarea se poate realiza in camere normale (N) sau camere
sanwich (S). Nivelul eluentului se va situa sub nivelul liniei de start. Eluentul migreaza de-a
lungul placii cromatografice datorita fortelor de capilaritate, purtand cu viteze diferite
componentii amestecului de analizat, fapt care se concretizeaza in separarea lor. Nivelul pana

6
la care se ridica eluentul se numeste linie de front. Dupa ce frontul eluentului parcurge o
anumita distanta (≈8cm) placa se scoate si se usuca. Vizualizarea se realizeaza prin
pulverizare cu reactivi de culoare specifici.

3. HPLC (high performance liquid chromatography- cromatografie

cu lichid de inalta performanta)
Metoda HPLC realizeaza cuantificare de mare precizie. Este o metoda de referinta si
poate realiza cuantificarea compusului de analizat aflat in cantitati foarte mici (ng). In cazul
metodei HPLC dezvoltate limita de detectie poate ajunge pana la 0,02 ppm, in timp ce limita
de cuantificare este de 0,06 ppm. HPLC este o metoda folosita pentru analiza numeroaselor
micotoxine ca: zearalenina, ochratoxina A, fumonisina B1, vomitoxina si alfatoxine. Desi este
o metoda cu un pret ridicat, care necesita experienta si timp, aceasta metoda este foarte mult
folosita ca tehnica de confirmare in cazul determinarilor folosind cromatografia in strat
subtire sau folosind teste de imunoafinitate. Avantajele acestei metode raportata la
cromatografia in strat subtire: precizie. Exista doua tipuri de cromatografie cu lichid de inalta
performanta: cu faza normala si cu faza inversa (RP-HPLC). Daca prima a avut o perioada de
glorie acum 20 de ani, astazi cel mai des folosita este cea de a doua. Totusi trebuie specificat
faptul ca in cazul folosirii (RP-HPLC), fluorescenta aflatoxinelor B1 si G1 scade.
Ansamblul cromatografic HPLC este un sistem compus dintr-un modul de separare si
unul de detectie.
Modulul de separare – controleaza urmatorii parametri cromatografici: programare
metoda, compozitie solvent, viteza de elutie, spalarea garniturilor, injectia probei, semnalarea
a unor evenimente externe, operarea detectorului prin interfata IEEE- 488, termostatare
coloana, termostatare probe, degajare eluent. Modul de separare consta din doua sisteme- un
sistem de administrare a solventului (compus din 4 pompe si o valva de realizare a
gradientului) si un sistem de administrare a probei (compus din autosampler cu 5 carusele a
cate 24 de flacoane si un injector automat)
Modul de detetie - este un detector performant UV/Vis, cu doua canale, destinat
aplicatiilor HPLC si opereaza in domeniul 190- 700 nm. Soft-ul prin intermediul caruia se fac
achizitiile de date, cat si prelucrarea lor, este MILLENIUM.
Proba de la care se pleaca este reprezentata de cereale macinate. Fiind o proba solida,
trebuie sa se faca extractia prealabila a compusului de analizat, DON fiind solubil in solventi
folositi in mod curent pentru extractie.

7
 Deoarece extractul este foarte complex este necesara realizarea unei separari
prealabile, care are rolul de a inlatura eventualii interferenti, dar si de a proteja coloana
cromatografica.
Pentru separare s-a optat pentru utilizarea a doua tipuri de coloane, pe de o parte,
coloane de iminoafinitate DONprep, care leaga micotoxina, la trecerea acesteia prin coloana,
de anticorpul specific aflat in umplutura coloanei, iar pe de alta parte, coloane
multifunctionale, Mycosep® 225 si coloana Multisep® 216, care lasa sa treaca micotoxina
prin coloana, in timp ce compusi de interferenta sunt retinuti in umplutura coloanei.
In selectarea metodei HPLC si a conditiilor initiale se porneste de la proba de analizat.
In urma extractiei si a separarii se obtine o proba care contine molecule cu mase moleculare
mici. Caracteristicile chimice ale compusului de analizat, DON-ul, indica abordarea unei
cromatografii cu faza inversa.
Alegerea coloanei de separare se face cunoscand ca DON-ul are masa moleculara mai
mica de 2000, este solubil in solventi aposi, nu este ionic si nici polar. Coloana de separare
aleasa pentru analiza este Symetry C18, avand lungimea de 25 cm si diametrul interior de
0,46 cm. Faza stationara este octadecilsilanul, care prezinta o retentie foarte buna deoarece
lungimea lantului hidrocarbonat grefat pe suportul silanic este mare (18 atomi de carbon).
Dimensiunea porilor este de 100 Å, iar dimensiunea particulelor este de 5 μm, optiunea fiind
justificata de masa moleculara mica a compusului de analizat.

4. SPECTROMETRIE DE MASA
Spectrometria de masa permite masurarea maselor moleculare relative a unor compusi
unitari, respectiv evidentierea anumitor specii atomice si grupari functionale existente in
compusul analizat.
In spectrometrul de masa moleculele organice neutre sunt transformate in ioni, radicali
si molecule neutre simple; ionii generati prin fragmentare sunt ulterior deviati in campuri
magnetice si/sau electrice. Devierea ionilor este dependenta de masa si sarcina acestora (in
cazul substantelor organice sarcina este de obicei 1). Cel mai simplu exemplu de spectrometru
este cel cu impact electronic in care moleculele aflate in stare de vapori in vid inaintat sunt
bombardate cu un fascicul electronic de inalta energie. In urma acestui proces rezulta ioni
pozitivi de energie mare (ionul molecular sau ion parinte), care se poate fragmenta mai
departe in ioni mai mici (fragmente ionice). Pierderea unui electron de catre molecula
conduce la un radical cationic, denumit ion molecular.

8
 Ionii moleculari si fragmentele ionice sunt accelerati in camp electric si apoi separati
prin deviere intr-un camp magnetic variabil in functie de masa si sarcina lor si genereaza un
curent ionic proportional cu abundentele relative ale ionilor. Spectrul de masa este o
reprezentare a abundentei ionilor in functie de valoarea raportului m/z (masa / sarcina).
Majoritatea ionilor produsi au sarcina egala cu unitatea (z=1). In cazul acestora, cu cat masa
este mai mica cu atat ionul este mai usor deviat in camp magnetic. Particulele neutre produse
prin fragmentare, (molecule neincarcate electric, sau radicali), nu pot fi detectate direct in
spectrometrul de masa.
In concluzie, un spectrometru de masa este un instrument care masoara masa unei
molecule dupa ce aceasta a fost transformata in ioni. Pentru a nu se face confuzii reamintim ca
nu se masoara direct masa moleculei ci mai exact raportul masa/ sarcina pentru un ion. In
cazul in care sarcina este egala cu unu (z=1) acest raport corespunde cu masa moleculare
(ionului) dar exista si cazuri in care z≠1.

Bibliografie

1. https://www.scribd.com/document/249393826/Analiza-Hplc-a-Micotoxinelor
2. http://proalimente.com/metode-determinare-micotoxinelor-alimente/

9
3. https://biblioteca.regielive.ro/proiecte/industria-alimentara/determinarea-
aflatoxinelor-din-produsele-alimentare-metode-de-analiza-si-echipamente-
moderne-336812.html
4. https://biblioteca.regielive.ro/cursuri/industria-alimentara/metode-moderne-in-
procesarea-alimentelor-148095.html
5. http://www.scrigroup.com/educatie/chimie/CROMATOGRAFIA-PE-STRAT-
SUBTIRE75881.php
6. http://www.scritub.com/stiinta/chimie/SPECTROMETRIE-DE-
MASA92727.php

10