Microinmultirea plantelor

C1
Swcolul 20: Celula vegetala contine in nucleu informatia toata pentru a putea regensra un
organism complet. Ea se supune principiului clasic al totipotentei.

Tehnica inmultirii plantelor in vitro:

Celula haploida sau diploida > Planta.

Pionieri: Gottlieb Haberlandt - o lucrare "Experimente pe culturile izolate de plante".

Vôchting si Rachinger etc.

Calusul este un tesut nediferentiat care apare pe rani.

Cultura in vitro (in sticla) care trebuie sa aibe, intr-un mediu izolat, totate conditiile pentru crestere si
dezvoltare a plantei.

Cultura in vevo e cultira cacuta afara.

Murashige si Skoog au creat un mediu numit M.S., care este cel mai folosit si astazi in toata lunea (85%).
Au demonstrat eficienta tehnica a aceste metode (pe orodee atunci in 1978).

C5 Laboratorul de cultura in vitro

Cuprinde 2 spatii: zona nesterila si zona generalitatii (sterila).

Zona nesterila: nu e necesara o curatenie exagerata. Aici avem spalatorul in care au loc
totalitatea Chestiilor de pegatire a materialului vegeal (radacini, bulbili, ramuri, frunze, fructe): curatirea
si spalarea acestuia. Aici se prepara mediile de cultura, este zona in care se prepara mediile de cultura si
care trebuie sa fie dotata cu sticlaria uzuala pentru pregatirea mediului, substantele chimice uzuale sau
folosite frecvent, instrumente de masurat si cantarit, frigiderul pentru substante cu temp 2-5 grade si restul
dotarilor.

Aici mai e si camera de crestere in care sunt duse explantele dupa inoculare.

Daca e loc putem avea si depozitul de sticlarie: o camera speciala in care se pastreaza sticlaria care e
foarte rar utilizara sa pastrata pentru inlocuirea celor care se deterioreaza.

Camera de depozitare a substantelor e o camera specifica unde se depoziteaza toate substabtele chimce
necesare care nu sunt folosite frecvent.
Incaperea de sterilizare, daca avem spatiu, e zona in care se realizeaza sterilizarea (cu autoclav, etc.) si
dezinfectia atat a materialului vegetal cat si a sticlariei si instrumentalului de lucru.

Aseptic inseamna curat, steril, lipsit de microbi.

Zona sterila

Aici domneste curatenia. In aceasta zona se face micropropagarea. Pornind de la dezinfectarea lui
completa, prelevarea explantelor, inocularea sau punerea lor pe mediul de cultura si repasarile
(inmultirea) sau repicari sau subculturi.

Aici avem hotele cu flux laminar de aer steril. Cand se construieste un laborator trebuie luat in
considerare un mod usor de a face curat. Nu numai in zona sterila sa face curat cu strasnicie. Si dotarea cu
un sistem de aerisire/climatizare centralizata separat de sistemul central.

Exista laboratoare didactice & de cercetare si laboratoare de productie. Alcatuirea lor de baza e
aceeasi, insa difera dimensiunea. Mobilierul e la el, difera doar dimensiunea. Exemplu: un laborator de
culturi de meristeme.

Prelevarea meristemelor se face la lupa binocular (pentru hota) sau stereomicroscop. Mai trebuie
si o incapere pentru termoterapie, este o incinta in care plantele stau la 35-37 grade celsius (la vie, gen)
inainte de prelevarea probelor, cu scopul de a inactiva virusurile si o crestere mai rapida a meristemului.
Mai trebuie o camera de testare pentru a certifica materialului. O camera de crestere; o sera de
aclimatizare a culturii si pastrarea materialului de unde am prelevat explantul.

Distilatorul, o sursa de gaz, spalatorul, apa rece si calda, pompa pentru vid, gunoiul reciclabil (pe
categorii). Intotdeauna curatenia vasului se face in recipiente care sunt duse la gunoi si nu in canalizare,
chiar daca mediul de cultura e lichid (pentru ca se raceste si infunda canalzarea si poate fi o sursa de
infectie). pH-metrul, agitator, frigider de mare capacitate cu congelator. Este bine sa fie si un Deionizator
de apa care are rolul de a indeparta ionii toxici din apa.

Sterilizarea

Apa distilata: e indispensabila laboratorului. Se foloseste la clatit (material vegetal sau alta natura), pentru
pregatirea apei sterile, in lucrul la hota.

Se sterilizeaza TOT: mediul de cultura, apa distilata, instrumentalul, sticlaria se impacheteaza in hartie si
se sterilizeaza, hartia de filtru. Se sterilizeaza la autoclav (umed) sau in etuva (uscat). Autoclavul este ca
un vas de fierbere sub presiune.
 Camera de crestere: e destinata pastrarii in conditi optime a inoculatilor, in vederea asigurarii
bunei dezvoltari ale acestora. Tempratura 21-23 grade (±2 grade fata de temperatura dorita) si umiditate
de 50%, dar nu sub 50%, deoarece prin doape se produce un schimb de gaze si se poate dezbidrata usor,
vasele nu sunt etanse.

Arhitectura: etajerele trebuie sa fie metalice pentru a ocupa un volum din camera cat mai inguste. Sistem
de iluminare automatizat, controlabil. Peretii, gresia cat de curat posibil. sistemul de iluminare tre facut
din tuburi floescente cu lumina alba de la 2-4 KiloLucsi. Tuburile sa fie la o distanta de 30-40 cm de
neon, altfel trebuie izolat ca sa nu se incalzeasca si deshidrateze mediul de cultura. Lumina trebuie sa fie
pornita 16 ore. Ideal ar fi sa avem mai multe camere de crestere, camere de crestere sub forma de modul
cu conditii autonome, ideale pentru laboratoarele de cercetare deoarece e usor sa alterezi conditiile in
functii de specii.

Camera de crestere(nu sunt sigur) are rolul de a duce plantele de la in vitro la in vivo.

Camera sterila: hota cu aer steril e o incinta care realizeaza asemsia aerului cu ajutorul unor filtre
de la dimensiuni macro la dimensiuni micrometrice impingand aerul cu o viteza constata spre operator.
Filtrele trebuiesc schimbate din timp in timp iar incaperea trebuie sa fie continuu intr-o presiune pozitiva
de aer pentru a impiedica patrunderea aerului din exterior in interior. Hotele astea pot fi de o sau doua
persoane, pot fi dotate cu lampi cu raze ultraviolete pentru sterilizarea aerului din incinta.

C7
Asepsia in culturile vegetale in vitro
Asepsizarea e un proces prin care incercam sa distrugem chimic sau fizic, spalre, filtrare sau
inlaturare a germenilor si sporilor acestora.

Arderea prin flambre. Introducerea unui obiect prin alcool, trecerea lui prin flacara pana se stinge,
dupa care se lasa la racit. Instrumentarul rezista la aceste operatii.

Incalzirea cu caldura uscata sau vapori supraincalziti.

Iradiere cu razele gamma, microunde sau UV.

Agenti chimici: alcool etilic, solutii clorurare, oxid sau pentaoxid de etilena (INFLAMABIL!)

Inlaturare prin detergenti, filtre etc.

Infectiile primare. Apar ca urmare a nerespectarea protocolului de dezinfectie a culturii.

Infectiile secundare apar dupa cateva saptamani.

Prevenire:

- respectarea regurlilor de asepsie la nivelul materialului vegetal;

- respect asepsiei recipientelor, mediului, plantelor;

- asepsia la inoculare, cu instrumental sterilizat;

- respectarea manipularii flacoanelor, fara contaminare.

Personalul trebuie sa aibe cunostinte despre microinmultire, natura germenilor (virusuri, bacterii,
drojdii, mucegaiuri) caile de transmitere si reproducere ale acestora.

Sterilizarea incaperilor, suprafetelor si instrumentalului.

Sterilizarea hotelor: hotele se pornesc (cu tot cu lampile cu UV) cu 30 minute inainte de folosire,
se aeriseste dupa din cauza lampilor de UV. Nu se lucreaza sub lampile cu UV sub nici o forma.

Sterilizarea casoletelor: ele se dezinfecteaza goale la etuva (macar o data pe saptamana), si in

autoclav cu sticlutel cu mediu.

Se dezinfecteaza si manerele bisturielor macar o data pe saptamana la etuva, autoclav, alcool, chiar si o
fierbere de peste 90 grade.

Sterilizarea recipientelor de cultura: cele de plastic vin sterilizate (cu raze gamma) din fabrica.
Dar exista si recipiente din plastic care suporta sterilizarea.

Recipientele din sticla care sunt noi trebuie sterilizate singure de cel putin doua ori inainte de folosite.

Dopurile pot fi de pluta, plastic, cauciuc etc. Toate dopurile se presterilizeaza de cel putin doua ori.
Dopurile folosite de noi sunt din vata cu tifon legat, acoperite cu staniol.

Sterilizarea lichidelor, apei si mddiului de cultura

Vasele nu se umblu mai mult de 3/4, risc de explozie. Mediul sta 2 zile la odihnit. Auticlavare la 120
grade, 20-30 minute.

Supraautoclavare (se intareste), subautoclavare (apar infectii).

Autoclavul se spala lunar, se schimba apa.

Exista oalele Kukta (sterilizare in oala sub oresiune).

Sterilizarea la rece se aplica in general mediilor lichide prin filtre cu nuci filtrante de sticla sau portelan
sau filtre Milipor.

O alta practica este de adaugarea de substante strilizante in mediu pentru inhibarea cresterii (cu
antibiotice) bacteriilor si chiar si virusurilor. Exista un risc, pot cauza mutatii.

Suflamidele in mediul de cultura (in principiu la sterilizarea explante).

Uneori in mediul de cultura se introduce alcool care in timp se evapora si in principiu sterilizeaza.

Materialul vegetal trebuie sterilizat, asepsizat. In prinipiu facem asta cu agenti chimici.

Factorii sunt: specia, conditii ecologice, varsta, pozitia pe planta, fenofaza plantei.

Trebuie sa-mi aleg substantele pentru sterilizare, in functie de organul pe care-l folosesc.

Concentratia, tipul si substanta sunt legate unele de altele. Avem organe care sunt paroase, pe care sporii
adera usor. Asa ca trebuie sa folosesc un detergent special care sparge presiunea superficiala si permite
bacteriilor sa intre in perisorii absorbanti.

Agentul dezinfectant trebuie sa fie nici prea slab,ar nici puternic. Trebuie sa poata fi indepartat usor.
Sterilizarea e doar la suprafata.

Infectiile cu bacterii provoaca un halou galben in jurul plantei. Se folosesc deregula 2 substante de
dezinfectie.

Tipurile de dezinfectantil:

Alcool etilic: 70- 96%-absolut, poate provoca dezhidratarea extrema a tesutului. Se clateste de 2-3 ori cu
apa distilata pentru rehidratare.

Apa bromata

Bromura ...

Hipocloritul de calciu sau sodiu (apa de Javel). Concentratii de 1-8%. Clatire de 2-3 ori cu apa distilata.

Proceduri recomandate: Fructe perisabile: alcool etilc absolut...

Flori

Funze

Fragmente de tulpina

Seminte

Organe de rezerva.

In functie de organe se folosesc diferite subst, concentratii. Daca apare necfozare - am depasit
timp/concentratie, au aparut infectii - nu am ajuns la standarde.