MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

CAPITOLUL 5
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECȚIILOR PRODUSE DE LEVURI (M. Mareș)

5.1. Generalități
Levurile sunt fungi unicelulari care se multiplică vegetativ (asexuat)
prin burjeonare (înmugurire) sau prin fisiune. Habitatul lor natural este
extrem de diversificat. Levurile sunt întâlnite la plante, insecte, animale şi
om (pe piele, mucoase şi în tractul digestiv), în sol, apă (dulce şi sărată) şi
aer. Au caracter ubicuitar, fiind răspândite din zonele polare până în cele
ecuatoriale sau tropicale.
Levurile de interes clinic sunt microorganisme aerobe sau facultativ
anaerobe, mezofile şi acidofile. Temperatura optimă de cultivare variază
pentru marea majoritate a levurilor între 25° şi 30°C, însă cele patogene
tolerează şi temperatura de 37°C (Candida albicans tolerează temperatura de
45°C).

5.2. Identificarea levurilor

A. Examenul microscopic direct al produselor patologice recent
recoltate poate orienta diagnosticul către o infecţie levurică şi uneori poate
chiar oferi indicii importante privind etiologia acesteia.
Produsele patologice pentru care există suspiciunea că ar conţine
levuri se pot examina microscopic într-una din următoarele forme: foto la
fiecare
• preparat extemporaneu între lamă şi lamelă, cu soluţie 20% KOH
(scuame, fragmente unghiale, secreţii); sensibilitatea metodei este
relativ scăzută, depinzând de abilitatea şi experienţa anterioară a
examinatorului.
• preparat extemporaneu cu soluţie 20% KOH + substanţă fluorescentă
sau frotiu colorat cu aceeaşi substanţă fluorescentă (Calcofluor,
Blankophor etc.); este metoda optimă de detecţie a fungilor în
prelevate datorită unei sensibilităţi şi specificităţi excelente, dar
necesită microscopie în lumină ultravioletă (figura 5.1.).

76
 CAPITOLUL 5

Figura 5.1. - Hife și artrospori col. calcofluor 0,1%, x 400

• frotiu colorat Gram (pune cu uşurinţă în evidenţă filamentele,

pseudohifele, artrosporii şi blastosporii de dimensiuni mari, însă
este inadecvată pentru detecţia celulelor levurice de dimensiuni
mici – de exemplu, Candida glabrata) (figura 5.2);
• preparat extemporaneu colorat cu tuş de India (pune în evidenţă
levurile capsulate din genul Cryptococcus, în sedimentul LCR,
urinar, etc.);

Figura 5.2. Preparat extemporaneu din sediment LCR;

col. tuș de India, x 400
• frotiu colorat May-Grunwald-Giemsa (este coloraţia de rutină pentru
depistarea levurilor intracelulare de tip Histoplasma, dar poate fi
utilizată şi pentru detectarea levurilor prin microscopie directă);

77
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

• frotiu necolorat sau colorat cu albastru de metilen 3% (metoda se

poate folosi pentru detectarea levurilor din hemoculturi, însă alte tehnici
cu specificitate mai ridicată sunt recomandate);
• preparat extemporaneu cu bandă adezivă, colorat cu albastru de
metilen în lactofenol (este o metodă expeditivă de diagnostic tip „one-
step” a leziunilor tegumentare produse de Malassezia și de evaluare a
portajului de levuri din acest gen).

În cursul examenului microscopic se urmăresc cu atenţie prezenţa,

forma şi dimensiunile formaţiunilor caracteristice levurilor: blastospori,
pseudohife, filamente (hife), eventual artrospori. Detalii precum prezenţa sau
absenţa capsulei, modul de înmugurire, ataşarea blastosporului la celula-
mamă, grosimea peretelui, prezenţa eventualelor formaţiuni sexuate (asce cu
ascospori, basidii cu basidiospori) vor fi reţinute ca aspecte deosebit de
importante pentru viitoarea identificare.

B. Cultivarea pe medii de izolare

În general, însămânţarea prelevatelor se face pe Agar Sabouraud
aditivat cu cloramfenicol; acest mediu permite o bună dezvoltare a levurilor
şi supresează multipli-carea eventualelor bacterii con-taminante. Pentru
levurile lipo-dependente ale genului Malassezia, cultivarea prelevatelor se
face fie pe Agarul Sabouraud cu cloram-fenicol pe suprafaţa căruia s-a etalat
prin striere o fină peliculă de ulei de măsline sterilizat prin autoclavare, fie
pe medii speciale (Dixon, Leeming).
Pe Agar Sabouraud cu cloramfenicol, culturile mixte date prin
asocierea a două sau mai multe specii de levuri sunt uneori dificil de
observat, de aceea ideal ar fi ca însămânţarea prelevatelor să se facă pe un
mediu diferenţial cromogen, care pe lângă discriminarea între speciile
levurice poate aduce informaţii esenţiale pentru identificarea agentului
etiologic (figura 5.3.). Se realizează astfel într-o singură etapă, atât izolarea,
cât şi identificarea levurii/levurilor incriminate (figura 5.4.) Numărul
speciilor identificabile prin cultivare pe astfel de medii este variabil şi
depinde de compoziţia fiecărui mediu (tabel 5.1.).

78
 CAPITOLUL 5

Figura 5.3 - Aspectul coloniilor aparţinând speciilor levurice

identificabile prin cultivare pe CandiSelect ™ 4.

A B
Figura 5.4. - Aspectul coloniilor aparţinând speciilor levurice
identificabile prin cultivare pe:
A - Chromogenic Candida Agar; B - CHROMagar Candida
Numărul speciilor identificabile prin cultivare pe astfel de medii este
variabil şi depinde de compoziţia fiecărui mediu (tabel 5.1.).

79
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

Tabelul 5.1.
Utilitatea diagnostică a unor medii cromogene
Denummirea mediului şi Specii identificate Aspectul coloniilor
firma producătoare
CandiSelect ™ 4 Candida albicans Culoare roz-violet,
(Bio-Rad) contur regulat
C. tropicalis Culoare turcoaz intensă,
bombate, contur
regulat, de tip S.
C. glabrata Culoare turcoaz mai
estompată,
strălucitoare, plate,
contur regulat, de tip S.
C.krusei Culoare verde-turcoaz,
mate, contur neregulat,
de tip R.
Chromogenic Candida C. albicans Culoare verde
Agar (Oxoid) C. tropicalis Culoare albastru-închis
C. krusei Culoare roz-închis,
mate, contur neregulat
C. glabrata Culoare galben-bej
C. parapsilosis Culoare brună
CHROMagar Candida C. albicans Culoare verde-smarald
(BD Sciences) C. glabrata Culoare violet-deschis
(lila), mate
C. krusei Culoare roz-pal,
albicioase la periferie,
de tip R
C. tropicalis Culoare albastră-
verzuie până la
albastru-metalizat
Candida ID2 C. albicans Culoare albastră
(bioMérieux) C. tropicalis
C. lusitaniae Culoare roz
C. kefyr
Agar cu extract de Cryptococcus Culoare brună
seminţe de Niger neoformans
(Birdseed Agar) Alte levuri Culoare albicioasă

80
 CAPITOLUL 5

Pe mediile de izolare, levurile de interes medical se dezvoltă în 24-72

ore de incubare. În funcţie de provenienţa prelevatului se va face şi alegerea
temperaturii de incubare. Pentru prelevatele provenind din situsuri în care în
mod normal temperatura este identică cu cea a organismului, se va alege
temperatura de 37°C pentru incubare. În cazul celor provenind de la nivelul
tegumentului sau unghiilor, incubarea se va face atât la 37°C, cât şi la 30°C,
deoarece unele levuri cultivabile la 30°C dar necultivabile la 37°C, pot avea
semnificaţie clinică fiind cauza unor micoze superficiale.
Coloniile pot îmbrăca diverse aspecte în funcţie de genul şi specia în
cauză. În general, au formă rotundă, sunt bombate şi nu prezintă pigment
(unele genuri – Rhodotorula, Sporobolomyces, prezintă colonii pigmentate în
roz-roşu). Suprafaţa poate fi netedă, uneori neregulată şi are aspect umed sau
uscat. Consistenţa este păstoasă, mucoidă sau cerată (figura 5.5.).

A B C

D E F

Figura 5.5. - Aspecte culturale pe SDA

A - colonii de C. albicans în primocultură; B - cultură de C. neoformans;
C - cultură de Rhodotorula mucilaginosa; D - Colonii de Malassezia spp.
în primocultură pe SDA aditivat cu ulei de măsline; E - Cultură de
Trichosporon cutaneum; F - Colonie de Geotrichum candidum
C. Purificarea izolatelor
După obţinerea primoculturii, se va verifica obligatoriu puritatea
acesteia deoarece contaminarea bacteriană este indezirabilă în acţiunea

81
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

ulterioară de identificare a speciei. În acest scop, se pregătesc fie preparate

între lamă şi lamelă, fie frotiuri colorate Gram care se examinează la
microscop, cu obiectivul de imersie. În cazul prezenţei bacteriilor, se recurge
la pasarea tulpinii pe bulion Sabouraud aditivat cu acid clorhidric soluţie 1N,
conform schemei prezentate în figura 5.6.
După incubare şi reverificare prin coloraţia Gram, se epuizează 0,1 ml
din tubul cu numărul maxim de picături de HCl care a permis dezvoltarea
levurilor pe suprafaţa unui Agar Sabouraud cu cloramfenicol în vederea
obţinerii coloniilor purificate.

Figura 5.6. - Purificarea izolatelor – metodologie de lucru

82
 CAPITOLUL 5

D. Teste de identificare
Algoritmul de identificare a unei tulpini levurice se bazează pe o
combinaţie de caractere morfologice macro- şi microscopice, biochimice şi
genetice. În figura 5.7. propunem o schemă de identificare a levurilor
plecând de la un aspect uşor sesizabil în primocultură: culoarea coloniilor.
Acest prim caracter diferenţial este coroborat apoi cu o serie de particularităţi
morfologice şi biochimice care vor orienta identificarea tulpinii către o
specie sau alta.

Figura 5.7. - Algoritmul de identificare a levurilor

83
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

Obţinerea şi examinarea preparatelor extemporanee cu tuş de India

Pe o lamă de sticlă curată şi degresată se etalează o picătură de tuş în
care se suspensionează apoi cu ajutorul unei anse microbiologice un mic
fragment din colonia levurii de identificat. Se acoperă cu o lamelă şi se
examinează la microscop cu obiectivul 20 (40). Observarea unor levuri
rotunde sau ovoidale, înconjurate de un halo necolorat, clar, pe fondul brun-
negru, indică prezenţa capsulei.

Testul de filamentare (testul de blasteză sau germ-tube test)

Ca medii pentru blasteză se utilizează serul sanguin de cal sau medii
artificiale comercializate de diverse firme (Germ Tube Solution – Remel,
SUA). În fiole cu capacitatea de 2 ml se pun în contact 0,5 ml suspensie
levurică şi 0,5 ml ser sanguin de cal. Fiolele se menţin apoi în baia de
termostatare la 36ºC timp de 2 ore. Suspensia levurică se prepară în soluţie
salină fiziologică, densitatea acesteia ajustându-se la 0,5 Mc Farland (cca.
105-106 celule/ml). După expirarea celor 2 ore, fiolele se agită şi din fiecare
amestec se prelevează un volum de 25 µl care se etalează apoi între lamă şi
lamelă. Preparatul extemporaneu astfel obţinut se examinează la microscop
în vederea decelării tubilor germinativi caracteristici tulpinilor de Candida
albicans şi Candida dubliniensis – filamente scurte care emerg din
blastospor fără ştrangulare (figura 5.8.). Ca martor al filamentării, se
utilizează de fiecare dată o tulpină-tip de Candida albicans. Se va avea în
vedere că şi alte levuri pot produce formaţiuni similare de tipul
pseudofilamentelor, însă ele se diferenţiază de adevăraţii tubi germinativi
prin existenţa unei ştrangulări la locul de emergenţă din blastospor.

Figura 5.8. - Candida albicans- Tubi germinativi, preparat extemporaneu cu

lactofenol şi albastru de anilină; x 400

84
 CAPITOLUL 5

Testele biochimice
Sunt mijloace imperios necesare în laboratorul clinic, pentru
identificarea levurilor de interes medical. Deşi importanţa lor este
covârşitoare şi incontestabilă, aceste teste nu reuşesc de fiecare dată să
elucideze apartenenţa taxonomică exactă a unei anumite tulpini şi sunt
necesare teste suplimentare, în principal de biologie moleculară, pentru
identificarea acesteia. Deoarece testele de biologie moleculară bazate pe
analiza ADN-ului sunt accesibile doar laboratoarelor din Centrele de
Referinţă, utilizarea profilul biochimic şi a caracterelor morfologice
reprezintă o soluţie acceptabilă pentru laboratoarele clinice. Acest profil
biochimic cuprinde datele obţinute prin efectuarea unei multitudini de teste,
între care sunt mai importante următoarele:
Fermentarea zaharurilor
Utilizarea metabolică a zaharurilor în condiţii de anaerobioză
presupune cultivarea levurilor pe medii minimale conţinând 0,3% extract de
drojdie şi 0,5% peptonă, aditivate cu un anumit substrat glucidic în proporţie
de 2%. Interpretarea se face pe baza dioxidului de carbon acumulat în
tubuleţele Durham întroduse în mediu. Cele mai utilizate zaharuri sunt: D-
glucoza, D-galactoza, maltoza, sucroza, rafinoza, trehaloza şi D-xiloza.
Acest test este util în diferenţierea diverselor specii aparţinând genului
Candida; levurile din genurile Cryptococcus şi Rhodotorula sunt
nefermentative.
Capacitatea de asimilare a surselor de carbon
Abilitatea levurilor de a creşte pe diverse medii în prezenţa anumitor
substanţe chimice adăugate ca unică sursă de carbon, poartă numele de
auxanogramă. Substanţele folosite pentru acest test sunt mai numeroase şi
mai diverse în ceea ce priveşte complexitatea structurală:
- hexoze: D-glucoză, D-galactoză, L-ramnoză, L-sorboză
- pentoze: D-xiloză, D-riboză, L-arabinoză, D-arabinoză
- dizaharide: sucroză, maltoză, celobioză, trehaloză, lactoză,
melibioză
- trizaharide: rafinoză, melezitioză
- polizaharide: amidon solubil, inulină
- alcooli: eritritol, adonitol, D-manitol, m-inozitol, metanol, etanol,
glicerol, glicol, 1,2-propandiol, 2,3-butandiol, dulcitol, D-sorbitol

85
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

- acizi organici: succinat, citrat, DL-lactat, D-gluconat, D-

glucuronat, 2-ceto-D-gluconat, 5-ceto-D-gluconat
- alţi compuşi: D-glucozamină HCl, N-acetil-glucozamină
Capacitatea de asimilare a surselor de azot
Principiul acestui test este similar cu cel al testului anterior; sursele de
azot testate sunt: nitraţii, etilamina, L-lizina, cadaverina, nitriţii, creatina,
creatinina. Testul de asimilare a nitratului de sodiu este important pentru
diferenţierea levurilor aparţinînd genurilor Cryptococcus şi Rhodotorula.
Producerea de urează
Acest test pune în evidenţă capacitatea levurilor de a produce enzima
numită urează. Se folosesc medii lichide care conţin uree şi un indicator
(roşu-fenol): bulion Christensen preparat în laborator, medii gata de utilizare
comercializate de diverse firme (BD Diagnostics, BioMérieux, Remel etc.).
În urma scindării ureei de către ureaza secretată de levuri, se produce o
creştere a pH-ului datorită amoniacului, fapt semnalat de virarea culorii
indicatorului de la galben-chihlimbar la roz-roşu. Ca metodologie, se
însămânţează 0,5 ml mediu de testare cu o ansă încărcată, prelevată din
cultura levurii de identificat. În paralel, se însămânţează obligatoriu un
martor pozitiv (Cryptococcus neoformans) şi unul negativ (Candida
albicans). Rezultatele se citesc după 3, respectiv 24 ore de incubare la 37°C.
Interpretare: testul este pozitiv pentru genurile Cryptococcus, Rhodotorula,
Trichosporon şi negativ pentru Blastoschizomyces, Candida şi Geotrichum.
Rezistenţa la cicloheximidă
Testul se referă la abilitatea levurilor de a se dezvolta pe medii de
cultură conţinând 2 concentraţii de cicloheximidă – 0,01%, respectiv 0,1%.
Aceste concentraţii pot fi critice pentru anumite specii, supresându-le total
sau parţial dezvoltarea, sau dimpotrivă, pot fi permisive pentru altele,
creşterea lor nefiind deloc stânjenită.
Producerea de fenol-oxidază
Producerea acestei enzime este detectată prin cultivarea levurilor pe
medii bogate în polifenoli de tip acid cafeic (Agar pe bază de extract din
seminţe de niger sau Agar cu acid cafeic şi citrat feric) şi permite
identificarea speciei Cryptococcus neoformans pe baza unei reacţii de
culoare; sub acţiunea fenol-oxidazei, care catalizează oxidarea polifenolilor

86
 CAPITOLUL 5

şi transformarea lor în pigment melanic, apare o brunificare a mediului într-

un interval de aproximativ 4 ore de incubare la 30°C.
Producerea altor enzime cum ar fi β-galactozaminidaza, L-prolin-
aminopeptidaza etc., este evidenţiabilă prin cultivarea levurilor pe medii
cromogene (CandiSelect™ 4, Candichrom®II, Albicans ID2 agar,
CHROMagar Candida, Oxoid Chromogenic Candida Agar).

Diferite combinaţii ale acestor însuşiri biochimice au fost folosite

pentru conceperea unor teste comercializabile, utile pentru identificarea
rapidă a speciilor levurice de interes medical în laboratoarele clinice. Aceste
teste pot identifica un număr diferit de specii, după cum urmează:
• o singură specie: Caffeic Acid Disk (Remel), C. albicans Screen
(Remel), Rapid Trehalose Assimilation (Remel), RTT Glabrata
(Fumouze);
• câteva specii: CandiSelect (Bio-Rad), CHROMagar Candida (BD
Sciences), Candida ID2 (bioMérieux), Candichrom II (International
Microbio), Chromogenic Candida Agar (Oxoid);
• specii multiple (din câteva genuri): API Candida (figura 5.9.) și ID
32C (bioMérieux), RapID Yeast Plus Panel (Remel), Uni-Yeast Tek
Plates (Remel), Auxacolor 2 (Bio-Rad), Microplate (Biolog).

Figura 5.9. - Galerie API Candida

Date suplimentare privind unele aspecte morfologice şi caractere
biochimice utile identificării se pot găsi pe site-ul Centraalbureau voor
Schimmelcultures (CBS)–Olanda, accesând adresa URL:
www.cbs.knaw.nl/yeast/biolomics.aspx. Aceste date pot fi folosite pentru

87
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

verificarea propriei identificări şi pentru obţinerea de informaţii despre

specia în cauză.
Pentru identificarea on-line a levurilor, micologii experimentaţi pot
utiliza programul BioloMICS postat pe acelaşi site al CBS, accesând adresa
URL: www.cbs.knaw.nl/yeast/BioloMICSID.aspx. Programul necesită
cunoştinţe avansate despre morfologia, fiziologia, multiplicarea şi genetica
levurilor, precum şi o bază logistică adecvată pentru obţinerea datelor
necesare identificării.

E. Tehnici moleculare
Aceste tehnici de analiză a structurii diverselor regiuni ale ADN-ului
extras din celulele levurice sunt expeditive, precise şi oferă informaţii
importante asupra poziţiei taxonomice a unei tulpini, dar şi asupra gradului
de omologie a două sau mai multor tulpini. Sunt posibile astfel, studii
epidemiologice deosebit de complexe menite să depisteze de exemplu sursa
unei infecţii nosocomiale sau tulpinile cu un profil particular de
susceptibilitate la antifungice. Singurul inconvenient este costul lor ridicat,
ceea ce le face accesibile doar laboratoarelor din centrele de referinţă. Ele se
bazează în principal pe amplificarea şi secvenţializarea unor regiuni unanim
prezente în genomul levurilor, atât la ascomicete, cât şi la basidiomicete: 18S
rDNA, domeniul D1/D2 al 26S rDNA, ITS.

Regiunile ţintă sunt amplificate prin PCR cu ajutorul a două secvenţe

nucleotidice cunoscute, denumite amorse sau primers (engl.). Aceste amorse
sunt diferit concepute, existând indicaţii de utilizare a lor în funcţie de
regiunea amplificată.
După amplificare şi secvenţializare, fragmentele nucleotidice obţinute
sunt prelucrate în vederea eliminării erorilor, iar apoi sunt comparate cu cele
dintr-o bază de date destinată identificării fungilor, în vederea detectării
speciilor cu un grad înalt de omologie a secvenţelor. Sistemul Basic Local
Alignment Search Tool (BLAST ) şi baza de date GenBank a National Center
for Biotechnology Information (NCBI) – Bethesda, SUA sunt cele mai
utilizate mijloace pentru identificarea microorganismelor (adresa URL:
www.ncbi.nlm.nih.gov).

88
 CAPITOLUL 5

5.3. Descrierea principalelor genuri de levuri de interes

clinic
Genul Blastoschizomyces
Este un gen obţinut prin contopirea denumirii a doi taxoni -
Blastoschizomyces pseudotrichosporon şi Trichosporon capitatum. Se
caracterizează macroscopic prin colonii alb-crem, plate, glabre, cu striaţii
radiare, iar microscopic prin prezenţa hifelor, pseudohifelor şi a
aneloconidiilor (formaţiuni alungite, de formă cilindrică, similare
artroconidiilor, însă dispuse lateral pe hife). Datorită multiplelor similitudini
cu genul Trichosporon, este dificil de diferenţiat faţă de acesta. Totuşi,
capacitatea de dezvoltare pe SDA la 45°C şi rezistenţa la cicloheximidă a
levurilor speciei B. capitatus, ajută la diferenţierea de levurile aparţinând
genului Trichosporon.

Genul Candida
Acest gen destul de pletoric (cuprinde peste 200 specii) reprezintă de
fapt o asociere de specii neînrudite între ele, fapt relativ uşor de intuit
datorită faptului că formele teleomorfe ale levurilor genului Candida aparţin
unui mare număr de genuri. Ca definiţie pentru acest gen s-a propus o
asociere de caractere negative, astfel că orice levură care nu produce acid
acetic, nu prezintă pigment roz, roşu sau orange, colonii cu aspect mucoid,
artrospori, burjeonare uni- sau multipolară cu bază largă de implantare a
celulei-fiice, conidii terminale de formă aciculară, balistoconidii şi nu
asimilează inozitolul ca unică sursă de carbon, este inclusă în genul Candida.
O importantă caracteristică întâlnită la unele specii aparţinând acestui
gen este abilitatea de a adera la diverse suprafeţe inerte şi de a forma
biofilme (importante mai ales pentru medicina umană). Dezvoltarea acestor
comunităţi microbiene solidarizate printr-o matrice polizaharidică pe
suprafaţa diverselor dispozitive protetice, pe catetere, sonde şi tuburi de dren,
reprezintă un factor de patogenitate deosebit de important prin perpetuarea
sursei generatoare de levuri care pot determina într-un final infecţii invazive
şi pot compromite succesul altor manopere medico-chirurgicale ducând
uneori chiar la decesul pacientului. În plus, rezistenţa biofilmelor levurice la
chimioterapia antifungică este remarcabilă comparativ cu cea manifestată de
formele planctonice ale aceloraşi levuri.

89
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

Genul Cryptococcus
Cuprinde levuri capsulate al căror habitat natural este reprezentat de
mediul ambiant. Contaminarea este predominant aerogenă, mai rar cutanată,
prin leziuni ale tegumentului. Specia cea mai impotantă din punct de vedere
a implicării în apariţia infecţiilor criptococice este C. neoformans; celelalte
specii sunt mai rar semnalate.
În cadrul speciei C. neoformans sunt recunoscute 4 serotipuri care
corespund celor 3 varietăţi: serotipul A – var. grubii, serotipul D – var.
neoformans, serotipurile B şi C – var. gattii (care în ultimul timp este
considerată o specie de sine stătătoare). Distribuţia geografică şi biotopul
celor 4 serotipuri sunt diferite şi oarecum specifice. Astfel, serotipul A este
cosmopolit şi se întâlneşte în sol, în dejecţiile păsărilor şi uneori pe citrice,
serotipul D are o răspândire care se limitează la teritoriul european populând
aceleaşi biotopuri, serotipurile B şi C sunt descrise în regiunile tropicale şi
subtropicale, fiind asociate cu diversele specii de eucalipt, respectiv migdal.
Diferenţierea speciilor genului Cryptococcus de alte levuri ureazo-
pozitive, nefermentative şi uneori capsulate (genul Rhodotorula) se face pe
baza utilizării metabolice a inozitolului şi absenţei pigmentului carotenoid al
coloniilor. Între ele, speciile de Cryptococcus se disting prin profilul de
asimilare al zaharurilor şi nitratului de potasiu, capacitatea de dezvoltare la
37°C (C. albidus, C. laurentii şi C. neoformans) şi secreţia de fenol-oxidază
(C. neoformans).

Genul Geotrichum
Speciile incluse în acest gen se caracterizează prin producerea de hife
care se fragmentează în artrospori şi prin absenţa blastosporilor (figura 5.10).
Ele se diferenţiază de cele aparţinând genului Trichosporon prin profilul de
asimilare al zaharurilor, absenţa ureazei şi a blastosporilor. Între ele, speciile
de interes medical din componenţa acestui gen, se diferenţiază prin
caracterele biochimice şi fiziologice (tabelul 5.2.). Capacitatea patogenă a
acestor specii este redusă, ele izolându-se de obicei din tubul digestiv sau
căile aeriene inferioare pe care le colonizează destul de des la pacienţii
supuşi cortico- sau antibioticoterapiei.

90
 CAPITOLUL 5

Figura 5.10. - Geotrichum candidum – aspect microscopic;

Preparat extemporaneu cu lactofenol şi albastru de anilină, x 200

Tabelul 5.2.
Diferenţierea speciilor de interes medical din genul Geotrichum
Specia Capacitatea de Capacitatea de
dezvoltare la dezvoltare la D-xiloza Celobioza
37°C 40°C
G. candidum +/- - + -

G. capitatum + + - -

G. clavatum + ? - +

Legendă: + (pozitiv), - (negativ), +/- (variabil), ? (nu sunt date).

Genul Rhodotorula
Cuprinde levuri care produc pigmenţi carotenoizi, ceea ce explică
nuanţele de roz, orange sau roşu-coral în care sunt pigmentate coloniile.
Acest caracter împreună cu incapacitatea de asimilare a inozitolului
diferenţiază speciile genului Rhodotorula de cele ale genului Cryptococcus.
Între ele, cele 3 specii de interes medical se deosebesc prin capacitatea
diferită de asimilare a unor surse de azot, respectiv carbon (tabelul 5.3.).

91
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

Tabelul 5.3.
Diferenţierea speciilor genului Rhodotorula
Specia Nitrat Eritritol N-acetil-D-
glucozamină

R. glutinis + - -
R. minuta - - +
R. mucilaginosa - - -
Legendă: + (pozitiv), - (negativ)

Genul Malassezia
Acest gen reuneşte actualmente 14 specii de levuri lipofile şi/sau
lipodependente, întâlnite ca microorganisme comensale pe tegumentul
omului şi animalelor. Ele pot deveni patogene în anumite condiţii,
determinând dermatopatii sau infecţii sistemice. Pentru izolare sunt necesare
medii suplimentate cu acizi graşi cu lanţ lung de atomi de carbon (Leeming,
Dixon, SDA + ulei de măsline) şi incubare la temperaturi de 32-35°C.
Singura specie care se poate dezvolta pe medii neaditivate cu lipide este M.
pachydermatis. În general, coloniile au culoare crem-bej sau alb-gălbuie,
sunt netede sau cutate, prezintă un aspect cerat şi o textură fragilă.
Microscopic, se observă celule levurice de diferite forme şi
dimensiuni (sferice, ovoidale, cilindrice), cu burjeonare unipolară (figura
5.11.). Caracteristice sunt baza largă de implantare a celulei-fiice şi prezenţa
unei cicatrici circulare (coleretă).

Figura 5.11. - Malassezia pachydermatis – aspect microscopic;

Col. Gram, x 900

92
 CAPITOLUL 5

Identificarea speciilor genului Malassezia se face pe baza

morfologiei, fiziologiei şi proprietăţilor biochimice: utilizarea unor surse
lipidice precum tween-urile 20, 40, 60, 80 şi cremoforul EL – ulei de ricin
hidrogenat, producerea de esculinază şi catalază (tabelul 5.4.).

Tabelul 5.4.
Diferenţierea unor specii din genul Malassezia
Specia Dezvoltarea pe
Dezvoltarea pe SDA la

Tween 80 % (0,1%)
mediul Dixon

Hidroliza esculinei
modificat la:

Tween 40 (0,5%)

Tween 60 (0,5%)
Tween 20 (10%)
32°C

Cremofor EL
32° 37° 40°

Catalaza
M. dermatis - + + + + + + + + + -

M. furfur - + + + + + + + + + ±

M. globosa - + ±/- - - - - - + - -

M. japonica - + + - - ± + - + ? ?

M. nana - + + v v + + ± + - -

M. obtusa - + ±/+ - - - - - + - +

M. + + + + - + + + ±/+ ±/- v
pachydermatis

M. restricta - + + - - - - - - - -

M. slooffiae - + + + ±/+ + + - + - -

M. sympodialis - + + + - + + + + - +

M. yamatoensis - + + - + + + + + ? ?

Legendă: + (pozitiv), - (negativ), +/- (variabil), ± (slab pozitiv), ? (nu sunt date)

93
 MICOLOGIE CLINICĂ VETERINARĂ - GHID PRACTIC

Genul Trichosporon
Levurile acestui gen se caracterizează prin producerea de hife,
pseudohife, artrospori şi blastospori. Unele specii (T. inkin şi T. ovoides)
produc în culturile pe lamă nişte formaţiuni terminale ramificate neregulat cu
rol de ataşare numite apresorii. În cazul prezenţei unui număr mic de
blastospori în cultură, diferenţierea de Geotrichum este imposibilă pe baza
caracterelor morfologice şi se va recurge la testul de urează: Trichosporon –
ureazo-pozitiv, Geotrichum – ureazo-negativ. Diferenţierea celor 6 specii de
interes medical se realizează prin coroborarea unor însuşiri morfo-fiziologice
cu capacitatea de asimilare a unor substanţe chimice (tabelul 5.5.).
Tabelul 5.5.
Diferenţierea speciilor genului Trichosporon
Caracterul urmărit
T. asteroides

T. cutaneum

T. mucoides

T. ovoides
T. asahii

T. inkin

L-arabinoză + + + +/- + +/-

Inozitol - - + + + -

Rafinoză - - + - + +/-

Sorbitol - - + - + -

Melibioză - - + - + -

Rezistenţa la 0,1% + +/- - +/- +/- -

cicloheximidă

Dezvoltare la 37°C + +/- - + + +/-

Dezvoltare la 42°C - - - +/- - -

Prezenţa - - - + - +
apresoriilor

Legendă: + (pozitiv), - (negativ), +/- (variabil)

94