BIOTEHNOLOGIA OBTII\ERII DE PLANTE HORTICOLE LIBERE DE

VIRUSURI PRIN CULTURI DE MERISTEME

Una din metodele de oblinere de plante sdndtoase, libere de virusuri,

microplasme qi chiar alqi agengi patogeni este aceea a culturilor de meristeme.
lnmullirea vegelativd a plantelor prin organe de inmulfre vegetativd bulbi,
rdzomi" tuberculi butagi qi marcote, atrage dupi sine qi transmiterea agengilor
menlionafi la descendenf .

inmulgirea generativd prin seminte ?nl6turi in parte transmiterea virusurilor.

Ea nu poate fi folosita insd la roate speclile deoarece:
- nu toate speciile farmeazd, serninle, sau num5rul seminfelor este insuficient;
- inflorirea sau fructificarea descendengilor obflnuli din sdmAn{d sunt intdrziate
datoritd perioadei j uvenile lungi;
- o serie de viroze se transmit prin polen qi sdm6nld;

Av6nd in vedere c5 o serie de soiuri de plante se ?nmultesc vegetative apar,.^

riscul degenerlrii sub influenla atacului de virusuri.

in perioad a atilor 1949-1950 s-a constatat Limasset qi Cornvet cd intensitatea
vnozdrli organelor vegetative cregte propo4ional cu distanla zonei analizate fa{d de
apex. Astfel, s-a agezat fesut meristemal apical (calota * cAteva prirnordii foliare)
pe rana existent5 pe o frunzd de futun. DupS un timp s-a constatat vkazarea
frunzelor de tutun in propor{ie de 60%. Atunci cdnd s-au folosit ca inoculi zone mai
depdrtate cie meristeme, infectare s-a produs in proporlie de l0A%.

Plec6nd de la aceste observatii in 1952 (Morel) se reuqegte sd se obfn plante

sindtoase, devtrozate, prin cultivarea unor apexuri meristernatice de dirnensiuni
reduse (75-100pm 151ime qi 150-200pm lungime) cu I-2 primordii foliare
provenite de la plante bolnave. Primele rezultate privind obtinerea de plante libere
 de virusuri prin culturi de meristem s-au ob{inut la dalii qi in continuare metoda a

fost extinsd la orhidee gi cartof.

I Mai ttrziu s-a aplicat (Quak 1957) devirozarea prin culturi de meristeme la
garoafe. Din acest moment s-au pus bazele biotehnologiilor industriale de
devirozare a materialului biologic vegetal. Plantele devirozate obfnute sunt in
continuare inmulgite "in vitro" pentru a obfine o descendentd suficient de
numeroasi.
Ulterior, ele se pdstreazdin izolatoare speciale (depozitare) qi constituie capetele
de clond furniz6nd rnaterialul inilial penJru inmultirea in condilii de ciimp.
Folosirea culturilor de meristeme pentru devirozarea materialului biologic a
fEcut posibila eradicarea qi a altor boli produse de ciuperci sau bacterii.

itt ceea ce "priveqte rnotivalia faptului cd ceiuleie meristematice sunt iibere cie

virusuri existd o serie de ipoteze:

1.- s-ar pdrea cd datoritd, diviziunii intense a celulelor in meristem, existd o
competilie intre acestea gi particular virald, pentru folosirea acizilor nucleici
srntetizali. Acizii nucleici se pare ci sunt pugi la dispozilia diviziunii celulare in
detrimetrul virale (Quak, T966);
2. - o altd ipatezd se referd la faptul cd absenta plasmodesmei gi a structurilor
vasculare in meristem impiedicl rdsp6ndirea virusului;

3. - alte explicagii precizeazd" ca datoritd concentragiilor ridicate de auxine gi

citochinine din apexurile meristernatice penetrarea particulelor virale este opritd sau
chiar are loc inactivarea acestora (Quak, 1977).
4.- alli autori afirmd cd dezvoltarea virusurilor este impiedicatd in apexurile
meristematice datorita iipsei unor enzime specifice de care acestea au nevoie
pentru multiplicarea sau datoriti prezentei unor substan,te inhibitoare;
5. - o explica{ie este qi aceea cd ritmul diviziunilor celulare in meristeme este
mult mai mare dec6t ritmul replicdrii virusului. Acest lucru este evident in special

']
atunci cAnd plantele bolnave sunt crescute in conditii foarte favorabile, fapt ce duce
la alungirea rapidd a ldstarilor;
: S. - o altd explicagie ar fi meristemui excizat suferS un traumatism puternic (cu
atdt mai mare cu cdt el este de dimensiuni mai mici) prin secfionare, fapt care duce

la eliininaiea v'irusurilor. Acest luci-u a fost reinarcat d"^ Hollings ;i Stone (l96a) la
garoafr gi de Walkey qi colab. La cireq (1969)
Din picate nu toate virozele pot fi inl5turate prin cultura de meristeme. in acest
caz se recomanandd combinarea microinmullirii prin culturi de meristeme cu
tennoterapia.
Acestd metodd consti din cultivarea plantelor supuse devirozarii timp de 5-10
sdptdmdni la temperatura de 35-390 C, fapt care detennind o inactivare a virusului.
Acest efect Se obgine prin pistrarea organelor furnizoare de meristeme la
temperaturi ridicate (ex. tuberculii de cartof la 37-380 C).
IJrmeazd, apoi excizarea meristemelor qi inocularea lor pe mediu. in acest sens
se face sterilizarea v6rfurilor de listari in alcool TAYy urnatd de imersia in
hiplocorit de sodiu sau calciu. Se ?nl5tur5 apoi frunzele inclusiv cele mai tinere din
vdrf qi se repeti sterilizarea cu alcool (7A%) fbri sI se mai faci clStirea cu ap6,

deoarece picdturile de api ingreuneazl detaqarea meristemelor.

Meristemul izolat este apoi detaqat qi inoculat pe mediul de cu1tur6.
Dimensiunile explantului trebuie sd fie reduse (0,1 mm diametru gi 0,2 * 0,4 mm
indltime).
inainte de inceperea multiplicarii propriu-zise este esen{ial sd se facd testarea
gradului de devirozare a materialului biologic, apelAnd la tehnici serologice de tipul
testuiui ELISA.
In anumite situatii,
situatii, ldstarii obflnuli nu inrdddcineaz1,.In
In acest
acest caz se recomandd
altoirea in vitra a listarului devirozat pe un portaltoi obfinut din seminle in yitr.o
{Morel. 1964). Tehnica poartd denumirea de microaltoire qi va fi prezentatd in
contmuare.

Microaltoirea in vitro
Oblinerea plantelor libere de virusuri se poate realiza prin diferite metode de
microaltoire.
Microaltoirea plantelor poate fi definita ca iin ansamblu de tehnici moderne,
prin care se realizeazd imbmarea intre un explant de dirnensiuni mici (crescut qi

multiplicat in ttitro ) qi un portaltoi adecavt, microinmultit sau oblinut prin metode

tradifionale (Stanici qi colab. 1992).
Genditd pentru prima data de Morel qi Martin (1952) ca metodi pentru
devirozarea dalliei, microaltoirea a fost folositd cu succes de cdtre Mureshige gi
colab. (1972) gi apoi de cdtre lrlavarro qi colab. (1975).
Datoritd faptului cd in urlna termoterapiei rneristemul izolat are o capacitate
redusd de cregtere sau c[, uneori, ldstarii regenera{i din meristeme nu formeazd
rbddcini. se recurge la altoirea pe portaltoi stabiliza{i, provenili de la plante
sdndtoase.

De la caz la caz, microaltoirea se realizeazS, in condilii aseptice, concregterea

partenerilor unnSnd a fi frcuti in prima fazd in vitro, sau in condifi septice "la
mas5", cAnd prinderea are loc in ser5.
Microaltoirea oferd cercetdtorului qi pepinieristului un cAmp larg de posibilitSli
pentru rezolvarea unor probleme existen{iale la culturile in vitro gi pentru
inldturarea unor neajunsuri ale inmulfrii clasice prin altoire.
Principalele cdqtiguri pe care le aduce microaltoirea sunt:
- se rezolvd problema producerii unei mari cantita! de plante altoite intr-un timp
relativ scurt;
 - se foloseqte pentru devirozarea materialul genetic virozat in urmdtoarele
cazuri; cdnd acestea nu suportd tratamentele de termoterapie; c$nd existd pericolul
apariiiei unor mutalii in urma termoterapiei; la specii care se inmuifesc greu in
vitro;
- se poate folosi pentru specii care deqi se multiplici foarte brne in vitro nu
inrdddcineaz6";

- este un instrument util pentru studiul afinitatii la altoire a noilor soiuri gi

portaltoi oblinuli in lucrdrile de ameliorare. Se pot studia mecanismele de

declanqare a lipsei de afinitate;

' ara avantajul cd altoiul nu vine in contact cu mediul de cultur[ gi astfel nu

este supus riscului mutaliilor sau influenlei drecte a hormonilor;

- existS pbsibilitatea juvenilizdri materialului imbdtrd.nit prin microaltoire

repetatd pe portaltoi juvenili;

- condifile de culturd gi de mediu sunt mai bine controlate.

Microaltoirea in vitro constd in altoirea ?n condifli aseptice in vitro a unui aplex
meristematic pe un portaltoi obfnut din sernin,te sau din minibutaqi.
Portaltoii folosili trebuie sd indeplineascd urmdtoarele condiqii:
- sd aibd seminte cu bund germinabilitate si cregtere pe mediile artificiale de
culturS;
- minibutaqul si aibi ,tesuturi elastice qi trngescente;
- minipuietul sd aibl cambiu activ uqor depistabil;
- sd aibd lesuturi rezistente la oxidare qi care se inverzesc dupd trecerea la
lurnind;
- sd aibd un aparat radicular bine format, capabil sd creascd qi sd trdiascd in
mediu lichid de culturd.
 In cazul folosirii inmullirii vegetative a portaltoiului (minibutaqire), in plus,
aceasta trebuie si aibi o ratd de multiplicare ridicatd, si inrdddcineze uqor gi sd nu
aiba probleme de aclimatuare.

1. Oblnerea pofialtoiul se poate face din seminfe. in acest sens, pentru inceput,
sernin,tele sunt scoase din stare de donnans prin una din rnetodele cunoscute:
stratificare; tratamente cu citochinine gi gibereline (benzil-aminopurinS, BAP 20
mg/T,respective acid gibeiic, GAs 100 mg/l); tramente cu frig (40C; etc.
Se inlSturd apoi endocarpul pdstr6nd tegumentele seminale.

in continuare, se face verificarea viabilrtatii semintelor prin scufundarea, timo

de 20 de ore, a unor probe inff-o solulie lo/o de clorur6 de 2,3,5 trifenil-tetrazoliu.

Seminfele cu lesuturi colorate rogu-intens sunt viabile.

Materialul 6ste supus apoi la 1-2 steriliziri cu etanol 70o ,1 min., hipoclorit de
sodium {A,7a/o clor activ) + Tw'een 20 0,3o/o tirnp de 20 minute, dupd care se fac
spalari repetate cu apd distilati sterilS. Dupd caz, se face o a doua sterilizare.

Seminlele sterilizate se pun la germinat pe rnediu Murashige&Skoog + 10 g/i

agar, in termostat 7a 200C, la intuneric. Dupd 1B-20 zile seminfele germtneazl. qi
puielii se alungesc.

Portaltoii se pot oblne qi din rninibutagi. Minibutagii (fragmente uninodale) se

preleveazd de la plante libere de virugi. Se sterilizeazd apoi cu hipoclorit de calciu
(4,7o/o clor activ) + Tween 20 $,3%) qi se trec pe mediu adecvat.
Pentru obginerea portaltoilor se pot folosi gi meristeme apicale sau laterale.
Dupd mai multe rnultiplicdri, listarii se trec pe un mediu de inriddcinare. de
exemplu, la sAmburoase cu I mgll IBA.
2. Pregltirea altoiului. Altoiul constb dintr-un apex meristematic provenit fie de
la ldstari crescufi in vitro, fie de al ldstari sau ramuri in vivo. in al doilea caz,
inainte de prelevare, se executd un protocol penfu sterilizarea explantelor.