INGINERIA GENETICA

Obtinerea de forme rezistente la boli, prin metodele clasice este limitata, ca

putandu-se reahza numai daca exista cel putin o sursa de rezistenta cu o ereditate care sa
permita obtinerea de descendenti rezistenti. Lipsa acuta a acestor surse este intalnita mai
ales in pririinta rezistentei la viroze. Aceste motive au determinat reculgerea 1a metode
moderne, de inginerie genetica, metode . care, se pare ca pot oferi iesirea dn aceasta
dilema.
Ingineria genetica rcprezinta totalitatea metodelor si tehnicilor prin care se
actioneaza in vitro asupra genelor, cromozomilor sau celulelor, cu scopul
realizarii unor structuri genetice noi, posibil prestabilite (Botez, 1991).
1. Cercetarile de histologie si fiziologie efectuate au impus totodata o
noua metoda de inmultire cunoscuta sub numele de "inmultire in vitro" sau
prin cultura de meristeme si alte tesuturi vegetale.
^micropropagare
2. Culturile de tesuturi vegetale se bazeaza pe totipotentialitatea celulelor,
prin care se intelege capoacitatea acestora de a genera noi celule,iar prin
dirijarea organogenezei, un nou organism.
Folosirea acestei metode in obtinerea plantelor rezistente la boli in
general si la virusuri in special, este posibila datorita faptului ca viteza de
multiplicare si inaintare a virusurilor spre meristemul apical este mai mica decat
ritmul in care se multiplica celulele meristematice; se considera ca meristemul
apical are intotdeauna un numar considerabil de mare de celule libere de virus.
Tehnica culturilor de tesuturi consta in prelevarea varfului de crestere
(1-2m"m) al plantei si depunerea acestuia pe un mediu nutritiv organizat aseptic
care contine macro si microelemente, vitamine, hormoni de crestere
(citochinine), anxine, giberelina) si zaharoza. Pe parcurs se mai adauga
regulatori de crestere - citochinina - in taza de multiplicare a celulelor, la
formarea mugurilor si lastarilor si anxina - pentru formarea radacinilor. Culturile
se rnentin in mediu steril, la 23 - 26'C si 3000-6000 lucsi in functie de specia de
plante. In final plantulele sunt transferate in sol, la ghivece.
Daca in cazul metodelor conventionale, manipularea genotipului plantelor
se face in mod indirect, fiind obligatorie actiunea selectiei, ingineria genetica
permite interventia directa asupra bazei ereditare a organismului cu care se
lucreaza.
Cele mai importante metode de inginerie genetica utilizate in ameliorarea
rezistentei la boli sunt transgeneza si varietatea somaclonala.
Aceste celule cultivate aseptic pe un mediu nutritiv solid, prolifereaza
dand nastere unei aglomerari care poate fi divizata si reprodusa de mai multe
ori.
Prin tratarea cu hormoni vegetali (anxine, citochine si gibereline)
calusurile (aglomerarile de celule) neorganizate se diferentiaza in plante
complete avand toate proprietatile plantei vitale.

Transgeneza
Transgeneza este una dintre rnetodele ingineriei genetice prin care este
posibila manipularea materialului genetic si realizarea unei structuri genetice
noi, ceea ce confera plantelor caracteristici particulare noi, gratie introducerii
unei/unor gene straine in genomul lor.
 Transgeneza consta in transferarea si functionarea unei gene sau a mai
multor gene noi de la o celula donor la o celula receptor (gazda) care sufera
prin aceasta un proces de transformare genetica, dobandind insusiri ereditare
noi.
Pentru a se evita degradarea enzimatica a genei (genelor) ce urmeaza a
fi transferata (gene pasager), aceasta trebuie sa fie legata de un vehicul adecvat
numit vector. Pasagerul impreuna cu Vectorul constituie ADN-ul recombinat care
poate sa functioneze ca atare in celula gazda (Botez, 1991). Exista numerosi
vectori care pot fi utilizati. Plasmidele sunt cel mai des folosite; acestea sunt
niste molecule mici de ADN, de forma circulara sau lineara, prezente in
citoplasma bacteriilor unde se pot replica autonom si pot sa posede markeri
genetici (ex. Rezistenta la antibiotice).
Cand transformarea genetica este stabila, gene introdusa este integrata
in genomul organismului transformat. Ea se mentine, se exprima (transcriptia
ARNm si traducerea in proteine) si este transmisa la descendenti la fel ca
celelalte gene ale organismului flempe si Sorin, 1989).
Obiectivele majore ale transgenezei sunt aceleasi ca si ameliorarea
clasica: productivitate, calitate, rezistenta. Diferenta consta in faptul ca precizia
si sursele de variabilitate pentru fransgeneza sunt mult mai mari.
Avantajele ameliorarii prin transgeneza, comparativ cu metodele clasice,
sunt :

- posibilitatea transferarii unui singur caracter la o varietate evaluata ca

performanta, dar careia ii lipseste caracterul respectiv;
- posibilitatea transferarii unor "gene de interes" provenite din orice
sursa, ceea ce extinde in mod nelimitat posibilitatile de ameliorare (Badea,
2000).
- Obtinerea de forme rezistente sau tolerante la virusuri, prin transgeneza,
presupune introducerea de fragmente genoimice virale, clonate, prin intermediul
plasmidelor de la Agrobacterium tumefaciens fii-Tumori inducing; Ri-root
inducing) intr-unul din cromozorn ii celulei vegetale (Macovei,l 995).
Transformarea genetica mediata de Agrobacterium presupune :
- identificarea si izolarea genei; utilizarea enzimelor de restrictie pentru a
taia secventa de nucleotide; clonarea genelor identificate;
- introducerea genei intr-o zona similara plasmidei;
- transferul genei in planta ;
- testari de verificare a transferului caracterului dorit (lsac, 1994).

Modul in care au fost obtinute forme transgenice de catre cercetatorii

francezi si americani poate fi sintetizat astfel:
Prin manipulari de ADN, cercetatorii au reusit descifrarea secventei
nucleotidice a genei ce codifica formarea invelisului proteic al virusului.Aceasta
constructie genica a fost transferata in genomul celulelor plantelor prin
intermediul plasmidelor Ti de la Agrobacterium tumefaciens, folosite ca vectori.
Procedeul de transformare s-a realizat la nivel celular dupa care a urmat
regenerarea plantelor transgenice pe mediu de cultura. ldentificarea celulelor
transformate s-a facut cu ajutorul markerilor genetici (in cazul de fata rezistenta
la kanamicina) continuti de plasmide. Proportia de plante transgenice
regenerate a fost de 1,2-3 o/o la plantele lemnoase destul de slaba fata de cea
obtinuta la speciile erbacee (circa 10 0/0, la tutun). Dupa regenerare s-a evaluat
rezistenta plantelor prin infectii artificiale, urmate de teste imunoenzimatice
ELISA si tehnici moleculare de diagnosticare a virusurilor (Polymerase Chain
Reaction si Western blotting).
Mecanismul rezitentei plantelor transgenice a fost pe deplin elucidat.
Aceasta rezistenta,se datoreaza, probabil, unei inhibitii a replicarii virale in
planta ce poarta gena transferata (Rayelonandro si colab,1998).
Desi pentru elucidarea mecanismului rezistentei se fac inca cercetari,
plantele noi, rezistente, rezultate in urma diferentierii si regenerarii, reprezinta un
inceput pentru salvarea plantelor de efectele dezastruoase ale virozelor
deoarece aceste forme dobandesc proprietati noi ce vor fi transmise ereditar la
descendenti (Zagrai si colab, 1999)

Variab iI itate a som aclo n ala

Dupa Roggemens (1984), variabilitatea somaclonala reprezinta

variabilitatea genetica evidentiata printre plantele regenerate in vitro din culturi
de celule si tesuturi somatice.
Mecanismele care genereAza variabilitatea somaclonala sunt greu de
explicat deoarece, la baza multiplicarii celulelor somatice sta mitoza, un
mecanism conservativ care, in mod teoretic, asigura identitatea genetica a
celulelor fiice. Unii autori sustin ca variabilitatea somaclonala este consecinta
preexistentei unmor alterari ale genotipurilor, in timp ce altii o pun pe seama
unor factori de mediu. Se presupune ca principalele cauze responsabile de
aparitia variabilitatii somaclonale sunt rnutatiile numeric si structural
cromozomale (poliploidia, aneuploidia, deletia, inversia, translocatia), mutatiile
somatice, crossing-overul somatic, transpozitia, am plificarea gen ica.
D Amato (1991) considera ca mecanismul variabilitatii somaclonale
actioneaza asupra unei singure gene, marind astfel sansele de selectie a unor
anumite forme cu rezistenta la patogeni.
Utilitatea acestei metode in ameliorarea rezistentei la agentii patogeni
este de maxima importairta, deoarece materialul initial poate fi reprezentata de
soiuri locale, adaptate, cu caracteristici agronomice si de calitate acceptate
(Skirvin si colab, 1994).
Modul de manifestare a variabilitatii somaclonale poate fi influentat si de
compozitia rnediului. De aceea, pentru izolarea unor variatiuni rezistente la
anumite boli, se utilizeaza adesea diferite patotoxine care distrug celulele
obisnuite, fara rezistenta. O alta strategie de selectie pentru rezistenta la boli se
bazeaza pe folosirea patogenului ca agent de selectie.

INDUCEREA DE MUTATII

Dupa Mayer (1963) orice modificare discontinua cu efect genetic se

numeste mutatie. Prin rnutatie se obtin efecte fenotipice noi, neidentificate in
ascendenta. Multe plante mutante prezinta pe langa insusiri noi, folositoare, si
caracteristici daunatoare (vigoare siu stabilitate redusa, deficiente clorofiliene,
sterilitate) (Cociu si colab, 1989)
Mutatiile pot avea loc la nivelul genelor (mutatie genica), cromozomilor
(mutatie cromozomala) sau a genomului (mutatie genomala).
Mutatiile genice (punctiforme) apar la nivelul unei singure gene si, prin
modificarile produse, duc la formarea unor noi secvente de perechi de baze,
care pot determina activitati metabolice specifice, deosebite de activitatea
determinata de structura initiala (Cristea, 1988).
Mutatiile cromozomale pot afecta structura cromozomilor (mutatii structural
cromozomale) sau numarul lor (mutatii ngmeric cromozomale sau genomale).
Mutatiiie structural cromozomale presupun fragmentarea cromozomului, urmata
de pierderea unor fragmente sau realipirea lor nerestitutionala.
Mutatiile numeric cromozomale se produc la nivelul genomuiui afectand numarul
de cromozorni. Eie pot afecta intregul set cromozomal de baza (euploidie) sau pot
determina aparitia de mai multe sau mai putine ori decat normal a unuilunor anumiti
cromozomi ai setului (aneuploidie).
Aparitia mutatiilor este determinata de factori chimici, fizici sau biologici, care
pot actiona liber in natura, producand mutatii naturale sau dirijati de om, provocand
mutatii artificiale sau induse.
Pentru ameliorare este important de subliniat ca frecventa mutatiilor folositoare
este reiativ scazuta, cele mai multe dintre ele fiind daunatoare. De aceea, pentru obtinerea
unor mutatii folositoare este absolut necesara tratuea unui numar mare de seminte sau
plante.
Inducerea variabilitatii prin mutageneza este necesara mai ales in cazul unor
caracteristici pentru care nu exista surse de gene care sa poata fi transferate prin
hibridge. Un exemplu il reprezinta rezistenta ia virusul plum pox. Incercari in acest sens
s-au facut, insa rezultatele sunt mult prea modeste.
Eficacitatea mutatiilor depinde de mai multi factori : agentul mutagen utilizat,
modul de aplicare a tratamentului, materiaiul bioiogic, nivelul de ploidie, gradul de
hidratare a tesutului.
Demarly (1971) recomanda efectuarea unor tratamente repetate, cu doze reduse,
care sa afecteze un numar mare de loci minori. Pe aceasta caie se vor obtine modificari
poligenice mai avantajoase decat un dezechilibru brutal in functiile unor trupe de gene.
Cociu si colab.(1989) recomanda folosirea penku ameliorare prin mutageneza , a
unor soiuri ce necesita imbunatatirea unei singure insusiri, determinata poligenic si
puternic heterozigota. Aceiasi autori afirma ca, intrucat mutatia se produce intr-o
singura ceiula, pentru ca ea sa se regaseasca in noua planta este indicat sa fie utrltzate
meristemele varfurilor de lastari pentru tratamentul mutagenic. De asemenea, semintele
pot constitui un material convenabil pentru tratamente cu agenti rnutageni chimici.
Un material biologic potrivit pentru tratamentele de mutageneza il constituie
culturile pe mediu asepti.c, provenite din varfuri de lastari, meristeme mugurale, embrioni
sau celuie singulare (Cociu si Oprea, 1989).
Nivelul de ploidie reprezinta un a1t factor cwe influenteaza eficacitatea
tratamentului mutagen. Cociu si Oprea (1989) afirma ca poliploizii raspund mai bine la
ffatamentul cu agenti mutageni decat diploizii, fiind mai accesibili schimbarilor de
structura. De asemenea, hapioizii reprezinta un material foarte bun pentru mutageneza,
deoarece pot fi identificate atat mutatiile dominante, cat si cele recesive, oferindu-se
posibilitatea obtinerii unor genotipuri homozigote prin dublarea numarului de
cromozomi.
Eficacitatea tratamentului mutagen depinde si de gradul de hidratare al
tesuturilor. Cu cat acesta creste. cu atat efectul este mai puternic. Cea mai mare
sensibilitate la actiunea agentilor mutageni o are radacina, apoi organele vegetative
si semintele.