MICROSCOPIE SI COLORATII

Bacteriile sunt studiate cu microscoape optice in produse patologice sau in cultura, fie in
stare nativa, vie (preparate umede, necolorate), fie dupa fixare si colorare (preparate colorate).

- Preparatele umede (lama – lamela):

Se poate efectua din produsul patologic (se depune o mica portiune din produsul
microbian in centrul lamei de microscop) sau dintr-o cultura bacteriana (pe o lama de
microscop se depune o picatura de ser fiziologic, in ea se omogenizeaza o mica portiune din
colonie); se acopera picatura cu o lamela pentru a obtine un strat fin de lichid;
Se examineaza la microscop cu obiectiv uscat.
Este indicat pentru evidenţierea formei şi mobilitaţii bacteriilor.
O varianta de examinare este microscopia cu fond întunecat, examenul de elecţie
pentru observarea rapida a spirochetelor (leptospire).

- Preparate uscate, fixate si colorate (frotiu colorat).

Colorarea mareste contrastul intre microorganism, celule si fondul preparatului.
Frotiul este materialul microbian etalat în strat cât mai subţire şi uniform pe
suprafata unei lame de microscop.
Frotiul colorat permite evidenţierea caracterelor morfologice ale bacteriilor (mǎrime,
formǎ, aşezare, unele structuri particulare) şi afinitatea tinctoriala.
Pentru realizarea frotiurilor se folosesc lame curate, degresate, de preferinţă noi pentru a
avea siguranţa că nu au bacterii restante de la examinari anterioare. Materialul bacterian se
întinde din centrul lamei spre periferie cu ansa pentru a obţine un strat continuu de celule.

Efectuarea frotiului: se realizeaza in trei timpi:

- Etalarea: - din cultura bacteriana pe mediu lichid se preleva cu ansa o picatura si se
etaleaza in centrul lamei in straturi mai subtiri prin miscari circulare;
- din cultura pe mediul solid se preleva cu ansa 1-2 colonii si se depun in
centrul lamei langa o picatura de apa distilata sterila care se omogenizeaza
progresiv pana la obtinerea unui frotiu subtire cu elementele bine dispersate.
- din prelevate patologice fluide se procedeaza ca pentru cultura in mediul
lichid, in timp ce din cele fibrinoase sau fibrino-purulente se fragmenteaza si se
depune in centrul lamei un mic flocon iar prin miscari radiare si excentrice ale
ansei se intinde in strat cat mai subtire
- Uscarea: se face rapid deasupra unui bec de gaz sau prin uscare spontana la temperatura
camerei
- Fixarea frotiului – diferit in functie de metoda de colorare

METODE DE COLORARE:
- simple, cu albastru de metilen sau Giemsa: evidenţiaza morfologia microbilor, dimensiunea,
asezarea, prezenta sporilor sau capsulei si morfologia leucocitelor in cazul unui produs patologic.

Coloratia simpla cu albastru de metilen: pune lama pe suportul de colorare cu frotiul in sus;
acopera frotiul cu solutie coloranta de 3 % albastru de metilen; mentine 30-60 secunde; spala cu
 apa, usuca si examineaza la microscop pein obiectivul cu imersie; toate elementele (leucocite,
bacterii) apar colorate in albastru.

Coloratia Giemsa:
Fixarea frotiului: se face cu alcool metilic timp de 1 minut

Colorarea frotiului:
- se pune lama cu frotiul in sus pentru colorare
- se imerseaza cu colorant Giemsa (solutie de lucru ) timp de 10 minute dupa care
se spala cu apa distilata
- se scurge excesul de lichid prin tamponare cu hartie de filtru si se pune lama
vertical in stativ.
Examinarea microscopica: se examineaza lama cu obiectivul de *40 si cel cu imersie

- diferenţiale:
 Coloraţia Gram: identifica bacteriile Gram pozitive şi pe cele Gram negative;
 Coloraţia Ziehl – Neelsen: identifica bacilii acido – alcoolo – rezistenţi (baar: Mycobacterium
tuberculosis).

Coloratia Gram
Principiu: Germenii Gram pozitivi si Gram negativi sunt colorati neselectiv de violetul de
gentiana. Adaugarea de iod formeaza un complex de cristal violet plus iod in peretele celular al
bacteriei. Decolorantul extrage lipidele din peretele celular a germenilor gram negativ; in plus
peretele este mai subtire si are o structura bidimensionala, laxa. In acest fel peretele permite
migrarea colorantului iar bacteriile devin incolore. Germenii gram pozitivi au peretele celular
mai gros, cu structura tridimensionala, cu ochiuri stranse, drept urmare, colorantul este prins ca
intr-o capcana si bacteriile raman colorate.

Fixarea frotiului: se face prin trecerea lamei cu frotiul in sus prin flacara unui bec de gaz
timp de cateva secunde, dosul maini sa suporte atingerea lamei astfel incalzite

Colorarea frotiului:
Se pune lama cu frotiul in sus pentru colorare
1. se acopera un minut cu violet de gentiana si se spala bine cu apa distilata
2. se acopera doua minute cu solutie lugol si se spala cu apa distilata
3. se acopera cu solutia de decolorare (amestec de alcool-acetona) dand lamei
usoare miscari de inclinare pana ce “norii” de substanta colorata nu se mai degaja din
partile groase ale frotiului
4. se acopera 1 minut cu solutie de fuxina diluata si se spala cu apa distilata
Se scurge excesul de lichid prin tamponare cu hartie de filtru si se pune lama
vertical in stativ.
Examinarea microscopica: se examineaza lama cu obiectivul de imersie, germenii Gram
pozitivi apar in violet purpuriu, iar cei Gram negative se coloreaza in rosu.
 Perete G + (gros) Perete G – (subţire)
1. Colorarea: violet violet
2. Mordanţarea: violet violet
3. Diferenţierea: violet incolor
4. Recolorarea: VIOLET ROŞU

Controlul de calitate: amestec în suspensie a unor bacterii gram positive (Staphylococcus

aureus) şi gram negative ( Escherichia coli).

Descrierea frotiului:
Bacteriile observate trebuie descrise in termeni de categorie microscopica (forma, marime
relativa, asezare, afinitate tinctoriala), numar si raporturile cu cellule din prelevatul pathologic
(cellule inflamatorii sau cellule epiteliale scuamoase)

Coloraţia Ziehl – Neelsen:

Principiu: bacilii acido-rezistenti, datorita structurii peretelui, rezista la decolorarea cu amestec
acid clorhidric-alcool dupa colorarea cu fucsina fenicata si apar colorati in rosu; bacteriile
neacido-rezistente se decoloreaza dupa colorarea cu fucsina fenicata si se recoloreaza cu albastru
de metilen, aparand albastre pe frotiu.
Etapele coloratiei:
1. Colorarea: se acopera frotiul cu solutie de fucsina fenicata Ziehl; se incalzeste lama cu
lampa de spirt pana la emiterea de vapori; se mentine 3-5 minute la aceasta temperatura;
dupa racire, se spala abundent cu apa.
2. Diferentierea: se acopera frotiul cu solutie 3% de acid clorhidric in alcool de 960; se
decoloreaza pana cand frotiul devine alburiu dupa spalarea cu apa.
3. Recolorarea: se acopera frotiul cu solutie de albastru de metilen pentru 30 secunde; se
spala cu apa, se usuca si se examineaza la microscop cu obiectul cu imersie.

Bacilii acido-rezistenti apar rosii, iar bacteriile neacido-rezistente si leucocitele albastre.

Controlul de calitate: se coloreaza si se examineaza doua frotiuri, unul dintr-o suspensie de
bacilli acido-rezistenti si unul dintr-o suspensie de bacilli neacido-rezistenti. Pe primul frotiu
trebuie sa vedem numai bacilli rosii, iar pe al doilea numai albastri.

Examinarea la microscop
- Se apasa pe butonul on-off
- se deschide becul microscopului cu ajutorul rozetei
- se alege obiectivul de examinare
- pentru examinare cu obiectivul cu imersie se depune o picatura de ulei de cedru pe
frotiul examinat
- se prinde imaginea cu macroviza
- cu ajutorul microvizei se regleaza imaginea pentru detalii fine
La sfarsitul examinarii
- se sterge obiectivul de ulei de cedru cu ajutorul unui servetel curat
- se inchide becul de la rozeta
- se inchide microscopul de la butonul on-off