Lucrare de laborator Nr.

Metode microscopice de studiu a celulelor şi ţesuturilor.

Microscopia optică. Pregătirea preparatului microscopic temporar

Obiective:
1. Familiarizarea studenţilor cu metodele de cercetare în domeniul biologiei celulare.
2. Studierea părţilor componente şi a principiului de lucru al microscopului optic.
3. Formarea deprinderilor de utilizare a microscopului optic.
4. Însuşirea metodelor şi procedeelor de preparare a obiectelor biologice pentru cercetări
citologice şi histologice.
Materiale: microscoape, lame, lamele, spatule de unică folosinţă, bisturiu, pipetă, hârtie de filtru,
coloranţi, apă distilată, metanol absolut, metanol 70%, fuxină bazică etc.
Noţiuni teoretice:
Biologia celulară este o ştiinţă relativ nouă care îşi propune drept scop studiul morfologic,
funcţional şi molecular al celulei. Biologia celulară modernă foloseşte metode de studii morfologice,
funcţionale, biochimice, moleculare etc., combinate cu succes în studierea unor procese de biosinteză
şi localizare a unor componente celulare în condiţii normale, experimentale şi patologice.
Studiul celulei a evoluat în ultima perioadă de timp datorită perfecţionării metodelor de
investigare, fapt ce a permis realizarea unor noi observaţii. Microscopia electronică de transmisie cu
voltaj înalt a permis observarea pentru prima dată a celulei vii. Prin utilizarea metodei de difracţie cu
raze X a fost descifrată structura spaţială a proteinelor şi a acizilor nucleici. Rezonanţa magnetică
nucleară de înaltă rezoluţie a fost utilizată pentru elucidarea interacţiunilor moleculare din
membranele biologice şi pentru studiile metabolice pe celulele intacte. Perfecţionarea tehnicilor
spectro-fotometrice/fluorometrice a făcut posibilă aprecierea pe baza probelor de fluorescenţă a
viscozităţii membranelor, a difuziei şi/sau a rotaţiei proteinelor membranare. Tehnicile biochimice şi
de biologie moleculară sunt de neînlocuit în ultimii ani, fiind elaborate tehnologii noi, moderne şi
complexe bazate pe culturi de celule, fuziuni de celule, purificare de gene etc.
Dimensiunile mici ale celulelor şi componentelor matricei extracelulare impun utilizarea
microscopului ca element indispensabil al investigaţiilor la nivel celular şi tisular. Metoda folosită cel
mai frecvent pentru studierea celulelor şi ţesuturilor este microscopia optică.
Microscopia optică este o metodă clasică de studiu pe larg utilizată în studiul celulei şi
ţesuturilor. Scopul microscopiei optice este de a putea observa obiecte ale căror dimensiuni sunt mai
mici de 0,1mm, dar şi acela de a observa şi analiza detalii ale obiectelor macroscopice, care nu pot fi
observate cu ochiul liber. Microscopia optică constă în prepararea secţiunilor sau amprentelor
celulare ce pot fi examinate la microscopul optic.
Microscopul optic (fotonic) este un aparat tehnic de mărit care foloseşte fotonul ca sursă de
radiaţie. Puterea de rezoluţie maximă este de 0,2μ şi nu poate fi depăşită din cauza lungimii mari de
undă a fotonului.
Microscopul fotonic obişnuit este alcătuit din:
1. partea mecanică (stativul) este formată din:
talpa (piciorul) – asigură stabilitatea aparatului şi conţine: sursa de lumină, oglinda
proiectoare şi diafragmul.
coloana - este ataşată la picior şi conţine:
platina (măsuţa) – dispozitivul pe care se fixează preparatul de examinat.
tubul – are montate la extremitatea superioară sistemul ocular şi la extremitatea
inferioară sistemul obiectiv.
revolverul – format din discul mobil, pe care se montează obiectivele cu puteri
măritoare crescânde şi discul fix, ataşat în partea inferioară a tubului.
dispozitivul de punere la punct – format din viza macrometrică (mişcări
grosiere şi rapide) şi viza micrometrică (mişcări reduse şi lente).
2. partea optică este formată din:

1
 sistemul ocular – două lentile montate într-un tub metalic ce se introduce în partea
superioară a tubului ( valori tipice ale măririi 5×, 7×, 10× şi 15×).
sistemul obiectiv – asociaţie de lentile montate într-un tub metalic ce se ataşează la
capul revolver (valori tipice ale măririi 6×, 8×, 10×, 20×, 40× şi 90×,
interschimbabile)
3. sursa de lumină şi dispozitivul de transmisie cuprinde:
sursa de lumină - bec de 6V, alimentat de la transformator.
dispozitivul de transmisie – oglindă plană cu rolul de a orienta razele luminoase în
axul optic.
condensorul de lumină – sistem de lentile, montat sub platină, prevăzut cu o
diafragmă, cu rolul de a focaliza lumina pe preparat.

Performanţele microscopului optic sunt:

a) puterea de mărire,
b) puterea de rezoluţie.
Puterea de mărire a microscopului optic reprezintă produsul dintre puterea de mărire a
obiectivului şi cea a ocularului (max 1500x).

Puterea de rezoluţie (putere separatoare minimă) reprezintă cea mai mică distanţă dintre două
puncte la care acestea pot fii percepute distinct în câmpul de vedere al microscopului (max 0,2 μ). De ea
depinde claritatea şi bogăţia în detalii a imaginii. Puterea de rezoluţie depinde de lentila obiectivului şi se
determină după formula lui Abbe:

d0=l/ n sinα, unde

d0 – este distanţa separatoare minimă;

l - lungimea de unda a radiatiei electromagnetice (0,55 µm), o constanta naturala ce nu poate fi influenţată;
n - indicele de refracţie al mediului dintre preparat şi obiectiv. Mediul dintre preparat si obiectiv este de obicei
aer (n = 1);
a - apertura unghiulara a obiectivului (unghiul de deschidere al lentile, format de axa optică a obiectivului şi
razele divergente extreme);
Mărimea „n sin α” este numită şi apertura numerică a obiectivului (A).
În acest mod, cu cât este mai mică lungimea de undă a luminii utilizate şi mai mare apertura
unghiulară a obiectivului, cu atât mai mare este puterea de rezoluţie a microscopului. De aceea
pentru a micşora lungimea de undă a luminii deseori se utilizează filtre albastre, iar pentru mărirea
aperturii se utilizează mediile de imersie: apa distilată (n=1,33), glicerina (n=1,45) sau uleiul de
imersie (n=1,51). Caracteristicile celor mai răspândite obiective sunt prezentate în tabel:
Marcarea Imersia Mărire Apertura Puterea de
obiectivului a numeric rezoluţie, μ
ă
8×0,20 - 8 0,20 1,80
20×0,40 - 20 0,40 0,90
40×0,65 - 40 0,65 0,55
40×0,75 Apa 40 0,75 0,48
90×1,25 Ulei de imersie 90 1,25 0,29

Formarea imaginii în microscopul fotonic:

Posibilitatea studierii detaliate a celulelor cu ajutorul microscopului optic se datorează
proprietăţilor luminii (natura ei ondulatorie), a proprietăţilor optice ale materiei (dimensiuni, indici de
refracţie, coeficienţi de absorbţie) şi a proprietăţilor fiziologice ale ochiului.
Formarea imaginii este supusă legilor opticii. Microscoapele optice utilizează pentru obţinerea
unei imagini mărite a preparatelor efectele optice ale lentilelor asupra radiaţiilor fotonice ale
spectrului luminos.

2
 Pe retină se formează imaginea redusă şi răsturnată a tuturor obiectelor spre care se îndreaptă
privirea. Capacitatea ochiului de a distinge detaliile obiectivelor vizibile se numeşte acuitate vizuală.
1. Lumina traversează proba microscopică.
2. Lumina este absorbită diferenţiat de componentele probei.
3. Este nevoie frecvent de colorarea artificială a probei pentru a vizualiza mai bine
anumite componente celulare etc.
4. Imaginea finală obţinută la microscop este virtuală, mărită şi răsturnată.

Tehnica de lucru cu microscopul fotonic:

- se pune în funcţiune sursa de lumină;
- se aduce în axa microscopului obiectivul 10×;
- se coboară condensorul până la obţinerea unei lumini uniforme şi de intensitate
potrivită;
- se aşează pe platină lama cu preparatul de studiat cu lamela în sus şi se fixează cu
ajutorul valeţilor;
- se aduce în axa optică obiectul cu ajutorul vizelor de pe partea laterală a platinei;
- privind din lateral se ridică platina, cu ajutorul vizei macrometrice până la o
distanţă mai mică decât distanţa focală a obiectivului (înscrisă pe obiectiv);
- se fixează distanţa interpupilară prin apropierea sau îndepărtarea celor două
oculare;
- privind apoi prin ocular se coboară încet tubul prin manevrarea şurubului
macrometric, până când apare imaginea. Prin mişcarea vizei micrometrice se
obţine o imagine clară şi luminoasă. (imaginea se caută prin urcarea tubului
deoarece prin coborâre se poate sparge lama sau deteriora lentila frontală a
obiectivului);
- Nu se va căuta niciodată imaginea prin ridicarea platinei fiindcă există riscul de a
deteriora lama şi obiectivul, mai ales când întrebuinţăm obiective puternice;
- în timpul examinării se va ţine în permanenţă mâna pe viza micrometrică, în
vederea menţinerii unei imagini clare în timpul deplasării câmpului;
- cu ajutorul celor două vize de pe partea laterală a platinei se va mişca lama cu
preparatul pentru a se examina în totalitate;
- pentru examinarea cu obiectivul 20× (sau 40×) se roteşte revolverul pentru a aduce
în axul optică acest obiectiv, fără a mişca viza micrometrică;
- la utilizarea obiectivului 90× (cu imersie) se ridică la maximum condensatorul şi
se deschide complet diafragma iris; pe preparatul fixat se pune o picătură de ulei
de cedru şi se coboară tubul până când lentila frontală a obiectivului a făcut
contact cu picătura de ulei.
- se ridică tubul 1-2 cm, se dă jos lama şi se îndepărtează uleiul de cedru de pe
lentila frontală prin ştergere cu vată îmbibată în xilol sau benzen;
- se deconectează de la reţea şi se acoperă cu husa.
Prin montarea unor dispozitive speciale se pot realiza tehnici speciale de microscopie
fotonică:
- microscopia cu contrast de fază;
- microscopia cu interferenţă;
- microscopia cu lumină fluorescentă;
- microscopia cu fond întunecat;
- microscopia cu lumină polarizată.

Metode folosite pentru examenul citologic în microscopie

Examinarea morfo-funcţională a celulelor se face pe preparate microscopice. În cazul
microscopiei optice, fasciculul luminos străbate secţiunile şi dă naştere unor imagini care sunt mărite
şi apoi percepute de examinator. Un preparat microscopic este realizat în funcţie de scopul analizei
şi anume: pot fi preparate proaspete sau temporare (extemporanee) şi preparate permanente sau
3
fixate (durabile). Celulele vii, straturile tisulare subţiri sau membranele transparente prezente în
organismul diferitor animale (ex. celulele epiteliale bucale, mezenterul, coada mormolocului, peretele
pungii obrazului la hamster) pot fi observate în mod direct la microscop, fără a fi necesară o
prelucrare prealabilă a unor secţiuni. Acestea pot fi studiate prin etalarea lor în monostrat pe lama
port-obiect sub formă de frotiu sau amprentă.

Întrebări de control:
1. Care sunt metodele moderne de studiere a celulelor şi ţesuturilor?
2. Ce este microscopul optic?
3. Care sunt părţile componente ale microscopului optic?
4. Care sunt performanţele microscopului optic?
5. Definiţi puterea de rezoluţie a microscopului.
6. Cum se calculează puterea de mărire a microscopului?
7. Care sunt părţile componente ale microscopului optic?
8. Cum se formează imaginea în microscopul optic?
9. Care este tehnica punerii la punct a imaginii la microscop?
10. Descrieţi principiul de lucru al tehnicilor speciale de microscopie optică.

Activitatea practică I:
Sarcina 1. De studiat construcţia şi principiul de lucru al microscopului optic.
Sarcina 2. De efectuat un preparat temporar al epiteliului bucal prin metoda etalării
materialului biologic în monostrat, respectând următorii paşi:
1) Se degresează cu alcool sanitar o lamă de sticlă curată.
2) După igienizarea cavităţii bucale prin clătire cu apă, se raclează cu o spatulă mucoasa de pe
faţa laterală a vestibulului bucal, îndepărtând astfel celulele moarte, detritusurile celulare şi
saliva.
3) Se repetă operaţia cu o altă spatulă, recoltând celulele din epiteliul mucoasei bucale.
4) Printr-o mişcare de glisare celulele recoltate se etalează pe o lamă, obţinându-se astfel
frotiul.
5) Se lasă lama la uscat câteva minute.
6) Se colorează frotiul cu fuxină bazică, prin imersarea lamei, pe rând, în pahare Benzelius cu:
1) metanol absolut, 15-30 min; 2) metanol 70%, 5 min; 3) apă distilată, 10 min; 4) fuxină
bazică, 15-30 min.
7) Se clăteşte lama cu apă curgătoare pentru îndepărtarea excesului de colorant, apoi se trece
prin: 5) metanol 70%, 1 min, 6) metanol absolut, 1 min.
În primele două soluţii are loc fixarea, în a treia rehidratarea, în a patra colorarea integrală a nucleilor, iar în ultimele
două decolorarea nucleilor, cu excepţia corpusculului Barr, care are o afinitate mare pentru colorant , astfel încât
rămâne colorat.
8) Preparatul se acoperă cu o lamelă subţire şi poate fi examinat la microscop.
Sarcina 3. De studiat celulele epiteliului bucal pe preparatul temporar obţinut.
Epiteliul bucal conţine celule poligonale mari, plate, cu nucleu voluminos, unite prin
intermediul unei substanţe amorfe. Majoritatea celulelor sunt moarte şi prezintă nuclei compacţi,
coloraţi în roz-violet. Deoarece aceste celule ale epiteliului bucal sunt înalt diferenţiate şi procesele
metabolice sunt diminuate, nucleolii sunt foarte mici sau lipsesc. În unii nuclei (la persoane de sex
feminin) se observă corpusculul Barr – cromozomul sexual X în interfază. Acesta are aspectul unui
mic triunghi colorat în violet închis cu baza la periferia nucleului sau poate avea formă semilunară
sau de cupolă cu suprafaţa convexă spre interiorul nucleului, dar totdeauna tangent la periferia
nucleului. Citoplasma este colorată în roz, iar în celulele vii aceasta conţine mitocondrii şi numeroase
vezicule.
Sarcina 4. De reprodus sub formă de desen structura celulei epiteliale cu descrierea de
rigoare, completând următorul tabel:
Desen Descriere Concluzii

4
Activitatea practică II:
Sarcina 1. De efectuat un preparat temporar din ficatul de şobolan, respectând următorii paşi:
1) Se degresează cu alcool sanitar o lamă de sticlă curată.
2) Ficatul de şobolan, proaspăt recoltat, se taie în bucăţi mici de circa 1 cm3, care se presează,
în mai multe locuri, pe o lamă curată şi degresată.
3) Lama se usucă la aer, după care se introduce în soluţie fixatoare de alcool metilic:acid acetic
glacial (3:1), timp de 10-15 min.
4) Se colorează frotiul cu fuxină bazică, prin imersarea lamei, pe rând, în
pahare Benzelius cu: 1) metanol absolut, 15-30 min; 2) metanol 70%, 5 min; 3) apă
distilată, 10 min; 4) fuxină bazică, 15-30 min.
5) Se clăteşte lama cu apă curgătoare pentru îndepărtarea excesului de
colorant, apoi se acoperă cu o lamelă subţire şi poate fi examinat la microscop.
Sarcina 3. De studiat celulele ficatului de şobolan pe preparatul temporar obţinut.
Celulele hepatice apar izolate sau în grupuri mici şi prezintă un contur neregulat (cu franjuri). Pe
fundalul citoplasmei colorate în roşu se evidenţiază unul sau doi nuclei violeţi ce conţin granule de cromatină.
Între celulele hepatice se mai pot observa celule albe sanguine care prezintă nucleul de formă neregulată.
Sarcina 4. De reprodus sub formă de desen structura celulei epiteliale cu descrierea de rigoare,
completând următorul tabel:
Desen Descriere Concluzii

DESCRIEREA UNEI CELULE ÎN MICROSCOPIA OPTICĂ

Forma

Membrana Mărimea sau talia

Adaptări funcţionale

Volumul

1 celulă în MO Citoplasma Culoarea

Organite specifice

Număr

Nucleul Formă şi mărime

Poziţie

Culoare (nucleol)

5
A. B.
Fig. 1. Celulele epiteliului bucal (coloraţie cu fuxină bazică): A – imagine preparat; B-reproducere
schematică: 1- nucleu; 2- citoplasmă; 3 – corpuscul Barr; 4 – mitocondrii.