BIOCHIME LP

Lucrarea nr.1

NOŢIUNI DE ANALIZĂ CHIMICĂ

Analiza chimică constă în efectuarea unor reacţii chimice în baza cărora

urmărim să precizăm natura sau cantitatea unei substanţe. Când scopul este de a
determina numai natura compuşilor necunoscuţi avem de-a face cu o anliză
calitativă, iar cînd ne interesează să precizăm şi cantitate acestora, determinările
efectuate aparţin de domeniul analizei cantitative.
Analiza calitativă prezintă importanţă în scopul evidenţirii unor compuşi
care apar patologic în urină, suc gastric şi alte lichide sau materiale biologice.
Din acest punct de vedere se cunoaşte valoarea pe care o are depistarea
glucidelor din urină.
Analiza cantitativă se poate efectua atât la componenţii care se găsesc
normal ca şi constituienţi ai unui lichid biologic (ex. Aciditatea sucului gastric),
dar care datorită anumitor condiţii poate să apară crescut sau scăzut faţă de
normal, ceea ce vine în sprijinul precizării diagnosticului clinic cât şi la stabilirea
limitelor cantitative ale unor compuşi patologici.

Noţiunea de atom-gram, moleculă-gram, echivalent-gram

Atomul-gram reprezintă cantitatea în grame dintr-un element, egală
numeric cu masa atomică a elementului. De exemplu:
Cl, MA = 35,45, atom-gram =35,45
Na, MA = 23, atom-gram = 23

Echivalentul-gram: reprezintă cantitatea dintr-un element, exprimată în

grame, care se combină cu un atom-gram de hidrogen sau cu jumătate dintr-un
atom-gram de oxigen sau care poate înlocui aceste cantităţi de hidrogen sau
oxigen din combinaţiile lor.
Molecula-gram (mol) reprezintă cantitatea în grame dintr-o substanţă egală
cu valoarea numerică a masei moleculare a substanţei respective.

1
De exemplu:
Molecula Masa moleculară Molecula-gram
Cl2 70,914 70,914
HCl 36,465 36,465
NaOH 40,010 40,010
Este foarte important ca în calculul echivalentului să ţinem seama neapărat
de reacţia chimică ce are loc, în caz contrar calcularea greşită a echivalentuluk-
gram poate duce la erori foarte mari ale rezultatului analizei.
Cantităţile de substanţă care reacţionează sau se înlocuiesc într-un proces
chimic sunt echivalente între ele.
Echivalentul-gram la acizi: se calculează împărţind molecula-gram la
numărul atomilor de hidrogen ai acidului, care participă la reacţia respectivă.
Eg HCl = 36,465/1 = 36,465
Eg H2SO4 = 98,08/ 2 = 49,04
Eg H3PO4 = 98,04/3 = 32,68
Echivalentul-gram la baze se calculează împărţind molecula-gram la
numărul de grupări hidroxil care iau parte la reacţia respectivă.
Eg NaOH = 40,005/1 = 40,005
Eg Ca(OH)2 = 74,1/2 = 37,05
Echivalentul gram la săruri se calculează împărţind molecula-gram la
cifra care arată numărul de hidrogeni înlocuiţi de metal sau cifra obţinută prin
înmulţirea valenţei maxime a ionului metalic prin numărul acestor ioni.
EgFeSO4.7H2O = 273,01 / 2 = 136,505
EgFe2(SO4)3 = 399,9 / 6 = 66,66
Echivalentul-gram în reacţiile de oxido-reducere reprezintă cantitatea
de substanţă care reacţionează cu un echivalent-gram în reacţia respectivă.
Exemplu:
MnO4- în care Mn este heptavalent reacţionează diferit în funcţie de mediul
în care are loc reacţia. Astfel în mediu puternic acid (acid sulfuric) Mn +7 primeşte
5e- trecând în Mn+2 conform reacţiei:
EgKMnO4 = 158,03 / 5 = 31,606

2
În mediu slab acid sau neutru are loc reacţia:
EgKMnO4 = 158,03 / 3 = 52,67

În mediu puternic alcalin, permanganatul reacţionează cu un singur electron

conform reacţiei:
EgKMnO4 = 158,03 / 1 = 158,03

Soluţii. Modul de exprimare a concentraţiilor

O soluţie este un amestec omogen de două sau mai multe substanţe, una
care predomină numită dizolvant, iar cealaltă care sau celelalte care se
dispersează omogen şi se numeşte dizolvat.
Orice soluţie care urmează să fie folosită ca reactiv se prepară la balon
cotat.
Exprimarea cantitaţii de substanţă dizolvată într-o soluţie la un anumit
volum, poartă numele de concentraţia soluţiei, care se poate exprima în diferite
moduri, şi anume:
a. Concentraţia procentuală reprezintă cantitatea de substanţă exprimată
în grame fie la 100g soluţie, fia la 100 ml soluţie.
Exemplu: Soluţia 2% NaCl conţine: 2g NaCl şi 98g H2O.
b. Concentraţia molară exprimă numărul de molecule-gram dizolvate la 1
1000 ml de soluţie.
Exemplu: Soluţia 0,15m NaCl conţine: 0,15 moli NaCl la 1000 ml
soluţie sau 8,75 g substanţă la 1000 ml soluţie.
Trecerea de la concentraţia procentuală la cea molară se face multiplicând
prima cu 10 şi împărţind greutatea moleculară a dizolvatului.
c. Concentraţia normală exprimă numărul de echivalenţi-gram dintr-o
substanţă aflaţi în 1000ml soluţie.

Unităţi şi moduri de exprimare în laboratorul clinic

Valorile diferitelor analize se raportează mai ales sub formă de mg/dl

pentru sânge, lichid cefalorahidian sau de mg (g) în 24 de ore pentru eliminarea
urinară. În ultimul timp se tinde însă spre un mod de exprimare uniform : mmol/l
respectiv mmol eliminaţi în 24 de ore.

3
 De un interes deosebit în clinică sunt valorile concentraţiilor principalilor
ioni: Na+, K+, Ca+2, Mg+2, Cl-, HCO3- . Exprimarea acestora se face face cel mai
adesea în mEg/l. O valoare utilă este şi modul de exprimare osmoli, respectiv
mosmoli. Prin osmol se înţelege presiunea osmotică generată de o soluţie 1M a
unei substanţe neionizate la 00C la interfaţa unei membrane impermeabile pentru
substanţa dizolvată. În cazul ionizării se va face suma totalităţii ionilor exprimaţi
în moli.
Pentru enzime şi uneori pentru vitamine se utilizează nomenclatura de
unitate internaţională (U.I. sau U).
Exprimarea rezultatelor obţinute în urma diferitelor măsurători se face în
funcţie de gradul de sensibilitate şi precizie al instrumentelor de măsură utilizate.
Un rezultat nu poate conţine mai multe cifre decât permite gradul de sensibilitate
şi precizie a aparatului utilizat.

Lucrarea nr.2

DETERMINAREA REZERVEI ALCALINE

Echilibrul acido-bazic sangvin este menţinut de 3 sisteme:

 cuplul: Na2CO3 /NaHCO3
 Hb.oxigenată - Hb.deoxigenată
 proteine serice

În laboratorul clinic explorarea se face printr-o metodă laborioasă, care

permite determinarea parametrilor principali şi a echilibrului acido – bazic. În
scop orientativ, serveşte însă o metodă titrimetrică de dozare a cuplului
carbonat/bicarbonat.
Dozarea cuplului carbonat/bicarbonat se face cu o soluţie HCl 0,1 N.
a. Într-o primă etapă se dozează carbonatul în prezenţa fenolftaleinei,
b. Se dozează întreaga cantitate de bicarbonat cu o soluţie de HCl 0,1 N, în
prezenţa metiloranjului.
Na 2 CO 3  HCl 
 NaHCO 3  NaCl
NaHCO 3  HCl 
 NaCl  CO 2  H 2 O

4
Interpretarea rezultatelor
Bicarbonatul actual are valori cuprinse între 25 – 27 mEq/l, iar valoarea
carbonatului este de 1,2mEq.
Rezultă ca raportul bicarbonat/carbonat este de aproximativ 20.
Sângele uman are în mod obişnuit un pH în jur de 7,4. (+/- 0,04 )
Valori ale pH-ului:

 7,36 în acidoză,
 7,44 în alcaloză.

Ambele stări sunt periculoase şi se manifestă clinic prin semne de afectare a

sistemului nervos.
Menţinerea unor limite de +/- 0,04 unităţi de pH se face prin 3 mecanisme
principale :
1. capacitatea de tamponare a sistemelor din plasmă şi hematii;
2. controlul respirator al eliminării CO2;
3. reglarea renală a acidifierii urinii.

Primele 2 mecanisme intervin imediat, iar cel de-al treilea după un interval
de timp mai lung.
Principalul sistem de tampon este:
 în hematii: este sistemul hemoglobina/hemoglina oxigenată,
 în plasmă: sistemul carbonat/bicarbonat.

Datorită pătrunderii ionului bicarbonat prin membrana hematiilor cele 2

sisteme sunt legate funcţional. În plus datorită reversibilităţii reacţiei catalizate
de una din cele mai active enzime = anhidraza carbonică; excesul de acid
carbonic poate fi eliminat prin respiraţie.
anhidraza carbonicã
+ -
CO2 + H2O H + HCO3

Alcalozele şi acidozele se împart în metabolice şi respiratorii.

5
 Acidoza respiratorie apare în condiţii de creştere a concentraţiei CO2 ca
urmare a unei deficienţe respiratorii (emfizem pulmonar, obstacole pe căile
respiratorii, etc.) şi se compensează prin stimularea respiraţiei.
Acidoza metabolică apare ca urmare a ingestiei accidentale de soluţii
acide, sau scăderea rezervei de bicarbonat a sistemelor tampon.
Se corectează în final prin eliminarea urinară sau prin neutralizarea din sucul
gastric al excesului de acizi.
Alcaloza respiratorie apare ca urmare a hiperventilaţiei sau a ingestiei de
bicarbonat. Se corectează prin hipoventilaţie sau, în clinici, prin respirarea unui
amestec bogat în CO2.
Alcaloza metabolică apare ca urmare a ingestiei accidentale de soluţii sau
săruri bazice sau în cazul pierderii de acizi prin vărsături. Se corectează prin
mecanisme renale.
Lucrarea nr.3
Măsurarea pH-ului

Determinarea pH-ului se poate realiza cu indicatori coloraţi sau cu pH-

metru (determinare electrometrică).
Exemple de indicatori de pH:
Schimbarea de culoare în Interval de
Indicator sensul creşterii de pH viraj
Acid Bază
Albastru de timol roşu galben 1,2 – 2,8
Roşu de Congo albastru roşu 3,0 – 5,0
Albastru de bromfenol galben albastru 3,0 – 4,6
Metiloranj roşu galben 3,1 – 4,4
Verde de bromcrezol galben albastru 3,8 – 6,3
Turnesol roşu albastru 6,0 – 8,0
Roşu de fenol galben roşu 6,8 – 8,4
Fenolftaleină incolor violet 8,3–10,0

6
 Timolftaleină incolor albastru 9,3–10,5
Galben de alizarină R galben roşu 10,1-12,1

Metoda de măsurare a pH-ului cu pH-metrul este mai exactă decât cea cu

substanţe (hârtie) indicatoare şi se foloseşte ori de câte ori este necesară
stabilirea cu exactitate a valorii pH-ului.
PH-metru este un potenţiometru care măsoară potenţialul dezvoltat între un
electrod de sticlă şi unul de referinţă. Instrumentele moderne fososesc electrozi
combinaţi (electrodul de sticlă şi electrodul de referinţă sunt combinaţi într-un
singur electrod.
pH-ul izoelectric al aminoacizilor și proteinelor
Principiu
Fiecare aminoacid are cel puţin două grupări ionizabile legate la atomul de
Cα: una acidă (carboxilul) şi alta bazică (gruparea amino).
Pentru cazul cel mai simplu, acela al unui aminoacid
monoaminomonocarboxilic, cum este glicocolul, există cele două trepte de
disociere, fiecare cu pKa care pot fi scrise astfel:

+ + - +
H3N - CH2 - COOH H3N - CH2 - COO + H

+ - - +
H3N - CH2 - COO H2N - CH2 - COO + H

Atât pentru aminoacizi cât şi pentru marea majoritate a proteinelor există

un pH la care numărul sarcinilor pozitive este egal cu cel al sarcinilor negative.
Acest pH la care sarcina netă a moleculei este zero se numeşte punct izoelectric
şi se notează cu pHi.

7
 Valoarea să se poate considera ca fiind media aritmetică a valorilor pK a.
Pentru treptele de disociere din jurul speciei moleculare cu un număr egal de
sarcini pozitive şi negative.
Modificând concentraţia protonilor prin adăugarea de acizi sau baze la
soluţia unui aminoacid monoaminomonocarboxilic se poate aprecia valoarea pK a
din forma curbei de neutralizare.
În jurul acestei valori pH-ul variază foarte puţin faţă de echivalenţii
adăugaţi, comparativ cu valorile extreme de la începutul şi sfârşitul titrării
soluţiei, ceea ce se poate deduce din ecuaţia lui HENDERSON-
HASSELBACH.

Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

Datorită raportului dintre grupările funcţionale libere: -COOH şi –NH 2

proteinele se comportă fie ca acizi, fie ca baze.
Disocierea grupărilor carboxil este cu atât mai intensă cu cât aciditatea
mediului este mai redusă.
- +
(H2N)m - R - (COOH)n (H2N)m - R - (COO )n + nH

Gradul de disociere al grupărilor aminice este condiţionat de alcalinitatea

mediului: cu cât concentraţia ionilor H+ este mai mică cu atât disocierea
grupărilor amino este mai intensă, şi invers:
+ -
R - NH3]OH R - NH3 + OH

Sarcina electrică globală a unei proteine este suma algebrică a sarcinilor

pozitive şi negative şi care depinde de reacţia (pH-ul) mediului:
- în mediu alcalin proteina posedă o încărcare electrică negativă,
- în mediu acid o încărcare electrică pozitivă. Pentru fiecare proteină
exista o concentraţie a ionilor de hidrogen la care suma algebrică a

8
 sarcinilor pozitive şi negative este egală cu zero, proteina fiind
indiferentă faţă de curentul electric.
- Acest pH al mediului se numeşte punct izoelectric. La acest pH
proteina precipită, deoarece are cea mai mică presiune osmotică şi
cea mai mică solubilitate. În consecinţă, proteinele în soluţii tampon
cu pH corespunzător pHi pierd sarcinile electrice, devin neutre,
nestabile şi precipită.
- pH-ul izoelectric reprezintă o constantă importantă deoarece fiecare
proteină are un pHi caracteristic, de exemplu: hemoglobina = 6,8;
caseina = 4,7 ; gelatina = 4,6.
Lucrarea nr. 4

REACŢII DE IDENTIFICARE ALE AMINOACIZILOR

Toate reacțiile de identificare ale aminoacizilor sunt reacții de culoare.

1. REACŢIA NINHIDRINEI
Reacţia ninhidrinei constituie o reacţie de grup pentru aminoacizii şi
proteinele cu grupări aminice libere (culoare albastră și culoare violetă).
Prin încălzirea soluţiei unui aminoacid în prezenţa ninhidrinei are loc
iniţial o dezaminare oxidativă şi o decarboxilare a aminoacidului. Se formează
astfel o aldehidă, NH3 şi CO2.
Ninhidrina este redusă la hidridantină şi în etapa următoare are loc
condensarea unei molecule de ninhidrină cu hidridantină şi NH3, cu formarea
unui complex albastru–violet.
Reacţia are o mare sensibilitate, de aceea poate fi utilizată la evidenţierea
aminoacizilor separaţi prin cromatografie, evidenţierea eliminării urinare
crescute a aminoacizilor.

2. REACŢIA CU IONII DE CUPRU (Cu+2) ÎN MEDIU ALCALIN

Aminoacizii formează cu Cu+2 în mediu alcalin un complex colorat în
albastru.

3. REACŢIA XANTOPROTEICĂ
Această reacţie este specifică pentru aminoacizii aromatici, cum ar fi:
tirozina, fenilalanina şi triptofanul.

9
 Proteinele care conţin aminoacizi aromatici reacționează cu HNO3,
rezultând ulterior o culoare galben portocalie, datorită formării de nitroderivaţi.

4. REACŢIA MILLON
Este specifică pentru un singur aminoacid aromatic: tirozina.
În prezenţa reactivului Millon (azotat şi azotit de mercur în mediu de
HNO3), soluţia de tirozină dă prin încălzire o culoare roşie. În aceleași condiții,
proteinele dau un precipitat alb, care prin încălzire uşoară (600C) devine roz.

5. REACŢIA ADAMKIEWICZ-HOPKINS

Este specifică pentru triptofan.

Proteinele conţinând triptofan reacţionează cu acidul glioxilic în mediu de

H2SO4 conc. şi formează o culoare violetă.

Reacţia are aplicabilitate la evidenţierea triptofanului din lichidul cefalo-

rahidian (LCR).

6. REACŢIA SAKAGUCHI
Este specifică pentru arginină.
Arginina datorita restului guanidinic reacţionează cu alfa-naftolul în
prezenţa hipobromitului de sodiu şi formează o coloraţie roşie.

7. REACŢIA ERLICH-PAULI
Este specifică pentru histidină.
Histidina în prezenţa acidului diazobenzensulfonic dau o coloraţie roşie-
portocalie. Reacţia este dată şi de fenoli şi amine.

8. REACŢII SPECIFICE AMINOACIZILOR CU SULF

Aminoacizii cu sulf din proteine, cum ar fi cisteina, prin încălzire cu
hidroxizi alcalini formează sulfura de sodiu, care în prezenţa sărurilor de plumb
formează un precipitat negru de sulfură de plumb.
Aminoacizii care conţin în moleculă grupări SH se pot doza
spectrofotometric cu acid 5,5’ ditio-bis-2-nitrobenzoic (DTNB).

10
 Cisteina datorită grupei SH pe care o conţine, reacţionează cu acidul 5,5 ’
ditiobis –2- dinitrobenzoic, formând un produs colorat în galben care se
determină spectrofotometric la 412 nm.

9. Metoda GOODWIN
Metodă mai nouă de determinare a aminoacizilor, fiind utilizată la dozarea
acestora din plasmă şi urină.
Metoda constă în reacţia aminoacizilor cu 2,4 – dinitrofluorbenzen (2,4-
DNTFB) mai exact în reacţia grupării aminice a aminoacidului în mediu alcalin
cu 2,4-dinitrofluorbenzen.

Lucrarea nr.5.

REACŢII DE IDENTIFICARE A PROTEINELOR

Proteinele se identifică prin:
- reacţii de culoare
- reacţii de precipitare.

Reacţiile de culoare, de identificare a proteinelor se suprapun cu reacţiile de

identificare ale aminoacizilor.
Pe lângă reacţiile de identificare descrise la aminoacizi, amintim reacţia
biuretului şi reacţia cu beta-naftochinonă.
Reacții de culoare specifice proteinelor

1. Reactia biuretului
Această reacţie permite identificarea proteinelor, respectiv a compuşilor
care conţin în structura lor cel puţin două legături peptidice (-CO-NH-).
Denumirea de reacţia biuretului se datoreşte faptului ca biuretul, compus
obţinut din 2 molecule de uree, prin eliminarea unei molecule de amoniac, la
încălzire, şi care conţine gruparea –CO-NH- repetată de doua ori, dă reacţie
pozitivă.
Culoarea albastră este proprie reactivului (amestec de CuSO 4 şi NaOH) şi
se reţin ca pozitive doar reacţiile de culoare roz sau violetă.

11
Astfel, biuretul dă o culoare roz şi cu exces de CuSO4, o culoare violet –
roşietică cu pepetidele şi o culoare violet – albastră cu proteinele.
Mecanismul reacţiei se poate explica prin formarea complecşilor de tip
chelaţi.
În complexul format de către biuret, peptide sau proteine cele 4 molecule
de apă legate normal de ionul Cu+2, sunt eliminate şi înlocuite cu grupările
amino.

2. Reactia cu beta-naftochinona
Aminoacizii, peptidele şi proteinele cu grupări alfa-amince libere se
condensează în mediu alcalin cu formarea unei coloraţii roşii sau roşie-brună.

Cu ajutorul acestei metode se determină totalitatea grupărilor α-aminice

libere sau azotul α - aminic al serului, care este un indicator pentru cantitatea
aminoacizilor liberi.

Reacţii de precipitare ale proteinelor

Proteinele, datorită structurii lor pot fi separate, identificate şi dozate prin

intermediul reacţiilor de precipitare.
În funcţie de natura şi concentraţia agenţilor de precipitarea se pot realiza
precipitări reversibile şi ireversibile.

A. Reacţii de precipitare reversibile

1. Precipitarea proteinelor cu săruri ușoare (salefierea)

Sub influenţa unor săruri ale metalelor uşoare ca: sulfat de amoniu,
sodiu, magneziu, clorură de sodiu se produce deshidratarea particulelor proteice
care precipită reversibil, deoarece proteinele se solubilizează din nou prin diluare
sau prin îndepărtatarea sărurilor precipitante prin dializă.
Metoda este aplicată la fracţionarea proteinelor (separarea globulinelor de
albumine; globulinele precipită la semisaturare cu sulfat de amoniu, iar
albuminele numai la saturare).

12
 2. Precipitarea proteinelor cu reactivii alcaloizilor

În această categorie de agenţi de precipitare se include reactivii care

precipită alcaloizii în mediu acid, dintre care cei mai importanţi sunt:
 taninul,
 acidul picric,
 hexacianoferatul de potasiu.

3. Precipitarea proteinelor cu acizii organici

În prezenţa acizilor organici, ca de exemplu:

- acidul tricloracetic,
- acidul sulfosalicilic,
- amestecul de acid citric-picric (reactivul Essbach)
- Precipitarea proteinelor cu acidul tricloracetic
a) Precipitarea proteinelor cu acidul tricloracetic este frecvent folosită în
laboratorul clinic pentru deproteinizarea serului sau a sângelui.
b) Precipitarea proteinelor cu acid sulfosalicilic
Această metodă este una din cele mai utilizate reacţii pentru depistarea
proteinelor din urină.
4. Precipitarea proteinelor prin încălzire
Majoritatea proteinelor prin încălzire la diferite temperaturi coagulează şi
se produce o precipitare ireversibilă.
Precipitarea este maximă la punctul izoelectric al proteinei şi în consecință,
la acest tip de precipitare un rol deosebit îl are pHi.

Lucrarea nr.6.

13
 Analiza biochimică a vitaminelor
Pentru analiza vitaminelor se pot aplica metode fizico-chimice şi
biologice.
Cele biologice au avantajul specificităţii, dar sunt mai greu de efectuat
(necesită animale de experienţă, culturi de microorganisme şi un timp mai
îndelungat), de aceea se aplică, cel puţin orientativ, metodele fizico-chimice care
corespund analizei preparatelor farmaceutice, alimentelor şi lichidelor biologice.

REACŢII PENTRU CAROTINOIDE (VITAMINELE A)

Identificarea carotenoidelor şi vitaminelor A cu SbCl3
Reacţia CARR-PRICE

Principiu
Se cunosc reacţii comune vitaminelor A, care în prezenţă de fenoli, acizi
minerali sau organici, a clorurilor acide generează compuşi coloraţi.
Cea mai uzuală este reacţia de culoare cu clorura de Stibiu SbCl3 =
reacţia Carr-Price.
Observaţii
1. Mulţi compuşi prezenţi în grăsimile naturale (de ex. acizii graşi polinesaturaţi)
interferează cu vitamina A şi falsifică rezultatele, de aceea se recomandă
eliminarea lor prin saponificare.În acest scop se fierbe produsul de analizat cu
KOH, soluţie alcoolică sau apoasă, după caz şi se extrage cu eter care ulterior se
evaporă şi rezidiul se reia cu cloroform ( soluţiile pure sau farmaceutice nu
necesită aceste operaţii).
2. Reacţia este dată şi de către produşii de oxidare ai clorofilei, iar viatmina D dă
o reacţie cu o culoare diferită.
3. Urmele de apă transformă triclorura de stibiu în oxiclorura, care nu
reacţioneaza cu vitamina A şi de aceea este absolut necesar să se lucreze în
eprubete uscate şi cu reactivi lipsiţi de apă sau să se adauge câteva picături de
anhidridă acetică.
4. Reacţia se pretează determinării cantitative a vitaminei A, prin măsurarea
intensităţii albastre la 620 nm. Pentru aceast

14
 REACŢII PENTRU VITAMINELE D

1. Reacţia Liebermann-Burchard
Vit.D în prezenţa anhidridei acetice şi a acidului sulfuric concentrat dă
naştere unei culori, care virează de la roz-violaceu la albastru şi apoi la verde.
2. Reacţia cu anilina și HCl
Vitaminele din grupul D, în prezenţa anilinei şi a HCl dau o coloraţie
roşie.
Într-o eprubetă se ia 1 ml soluţie de vitamina D sau ulei de peşte şi se
adaugă câteva picături de soluţie anilină-HCl (părţi egale de anilină şi HCl) şi se
observă apariţia unei coloraţii roşii.
3. Reacţia CARR-PRICE
1ml soluţie cloroformică de vitamina D 0,5% se tratează cu 4 ml soluţie
cloroformică de clorură de stibiu (SbCl3) şi se obţine o culoare galben-
portocalie, diferită de culoarea albastră pe care o dă vitamina A în aceleaşi
condiţii.
4. Identificarea vitaminelor D cu aldehide aromatice

Vitaminele D în prezenţa aldehidelor aromatice (vanilina, furfurol,

aldehida anisdinică) şi în prezenţa acidului percloric dau compuşi coloraţi.
Reacţia efectuată în condiţii bine specificate permite şi determinarea
cantitativă a vitaminelor D.
5. Diferenţierea între vitaminele D2 şi D3
Vitaminele D2 şi D3 dau culori diferite cu acidul sulfuric concentrat.
În două eprubete se iau câte 1ml soluţie alcoolică 0,1% de vitamina D 2 şi,
respectiv soluţie alcoolică 0,1% vitamina D3 şi apoi se adaugă în fiecare eprubetă
câte 2 picături apă, după care se adaugă cu precauţie pe pereţii eprubetei câte 1
ml acid sulfuric concentrat. La zona de contact apare o culoare portocalie ce
trece în roşu pentru vitamina D2, în timp ce vitamina D3 dă o coloraţie galbenă.

REACŢII PENTRU IDENTIFICAREA ŞI DOZAREA

VITAMINEI C

15
 1. Identificarea vitaminei C cu azotat de argint
Într-o eprubetă la 1 ml sol.0,5% de acid ascorbic se adaugă 0,5 ml acid
azotic 10% şi 0,3 ml azotat de argint 2%, când se observă apariţia unui precipitat
cenuşiu (Ag metalic).
2. Identificarea vitaminei C cu nitroprusiat de sodiu
1 ml sol.5% de vit.C se tratează cu 4 picături de nitroprusiat şi 3 picături de
NaOH 10%, când se observă apariţia unei coloraţii galben-verzuie, care la
adăugare de acid acetic 10% trece în albastru-violet.

3. Dozarea vitaminei C prin metoda iodometrica

Reacţiile folosite uzual în scopul evidenţierii şi dozării vitaminei C se
bazează pe proprietăţile sale reducătoare.
Acidul ascorbic are proprietatea de a reduce soluţia de iod 0,01N. Această
metodă de dozare a vitaminei C serveşte la dozarea vitaminei din preparatele
farmaceutice şi din extractele vegetale.

4. Dozarea vitaminei C din sânge şi urină prin metoda ROE şi

Kuether
Acidul ascorbic este oxidat în prealabil la acid dehidroascorbic cu ajutorul
noritului (cărbune animal activat).
Acidul dehidroascorbic reacţioneaza cu 2,4-dinitrofenilhidrazina în
prezenşa acidului sulfuric formând un compus colorat.
5. Reacţii de identificare şi dozare a vitaminei B1
 Identificarea vitaminei B1 sub formă de tiocrom
Identificarea vitaminei B1 se bazează pe oxidarea tiaminei sub acţiunea
hexacianoferatului (III) de potasiu în mediu alcalin, la tiocrom, compus ce
prezintă o fluorescenţă albastră.
 Dozarea vitaminei B1 prin diazotare
Metoda se bazează pe reacţia de diazotare-cuplare pe care vitamina B1 o dă
cu acidul diazo-benzensulfonic, cu formarea unui compus colorimetrabil.
Adausul de aldehidă formică sau alcool butilic stabilizează culoarea, în
timp ce substanţele reducătoare (cisteina, ionii de cupru, mercur, argint)
deranjează reacţia.

16
 Tabel 3. Vitaminele şi implicaţiile lor

VITAMINA FUNCŢIE DEFICIENŢA SEMNE ŞI

SIMPTOME
- Transferul grupărilor - Anemie - Anemie.
cu un atom de carbon; megaloblastică.
- Sinteza de metionină, - Defecte de tub - Malformaţii
Acid folic purine şi neuronal congenitale
timidinmonofosfat

- Cofactor pentru - Anemie pernicioasă - Anemie

reacţii: megaloblastică.
Vitamina B12 1.Homocisteină → - Demenţă.
(cobalamina) metionină - Simptome neuro-
2.Metilmalonil CoA → - Degenerare psihice
succinil CoA medulară .

- Antioxidant. - Gingivită, gingii moi

- Cofactor pentru
Vitamina C - Dinţi mobili în
reacţii de - Scorbut
(acid ascorbic) hidroxilare alveole dentare
- Vindecare lentă a
plăgilor

Vitamina B6 - Cofactor enzimatic în

(piridoxină, - Glosită
metabolismul
- Rară
piridoxamină, aminoacizilor - Neuropatie
piridoxal)

17
 - Cofactor enzimatic
în catalizarea:
Piruvat → acetil CoA - Beri-beri - Tahicardie,
α cetoglutarat → vărsături, convulsii.
- Sindromul
succinil CoA Wernicke-
Vitamina B1 Korsakoff - Apatie, pierderi de
Ribozo-5-P → memorie, nistagmus
(tiamină) xilulozo-5-P (mai ales la alcoolici)
Sedoheptulozo-7-P →
gliceraldehid-3-P
- Oxidarea
aminoacizilor cu lanţ
ramificat

Niacină = Vit. - Dermatită

PP (din Vit. B)
- Transfer de electroni - Pelagră - Diaree
(acid nicotinic, - Demenţă
nicotinamidă)

Vitamina B2 - Dermatită.
- Transfer de electroni - Rară
(riboflavina) - Stomatită.

Biotină - Reacţii de - Rară - Dermatite

carboxilare
(Vit. B7 sau B8)
-
Acid pantotenic - Transport de grupări - Rară
acil
(Vit. B5)

- Funcţia - Impotenţă - Creşterea pragului

Vitamina A reproducătoare vizual.
- Cecitate nocturnă
(retinol, retinal, - Funcţia vizuală - Uscăciunea corneei
- Retard de creştere
acid - Promovarea creşterii - Xeroftalmie
retinoic, βcaroten) - Diferenţierea şi
întreţinerea ţesuturilor
epiteliale

18
 Vitamina D - Rahitism (la copii)
-Oase moi, flexibile
(colecalciferol, - Absorbţia de calciu - Osteomalacie (la
ergocalciferol) adulţi)

- γ-carboxilarea
Vitamina K
restului glutamat din - La nou-născuţi. - Hemoragie
(menadionă, componenţa factorilor
menachinonă, - Rară la adulţi
filochinonă) de coagulare şi a altor
proteine

Vitamina E - Fragilitatea
- Antioxidant - Rară
eritrocitelor determină
(α-tocoferol)
anemie hemolitică

Lucrarea nr.7.

ANALIZA BIOCHIMICĂ A ENZIMELOR

Enzimele sau biocatalizatorii sunt substanţe de natură proteică, care au

rolul de a cataliza procesele biochimice, care se desfăşoară în organism.
Principiile generale şi procedeele de preparare a enzimelor în forma pură
sunt cele valabile pentru proteine. Se alege o sursă bogată în enzimă care ne
interesează şi se aplică tehnicile cele mai adecvate, exploatând diferenţele între
proprietăţile enzimei şi ale tuturor celorlalţi componenţi prezenţi, între care pot fi
zeci sau sute de alte proteine. De regulă este necesară o succesiune de etape care
să conducă în final la un preparat de puritate avansată, cu un bun randament.
Prima operaţie este eliberarea enzimei în formă solubilă din celula intactă.
Tehnica de degradare a membranelor celulare (prin mijloace mecanice, tratament
de congelare-decongelare, sonicare, liză cu enzime adăugate sau detergenţi) şi
vehiculul se aleg în funcţie de natura şi localizarea enzimei. Extractul astfel
obţinut este supus apoi fracţionării, care constituie purificarea propriu-zisă,
realizată prin îndepărtarea diferiţilor contaminanţi micro- şi macromoleculari şi
ionici.
În acest scop sunt aplicate o serie de operaţii bazate pe:

19
 - dimensiunile moleculare: dializa, ultrafiltrarea, centrifugarea de zonă, gel
filtrarea;
- solubilitate: precipitări cu săruri neutre, cu solvenţi organici, precipitarea
la pHi, tratament termic;
- incărcare electrică: electroforeza, cromatografia pe schimbători de ioni;
- adsorbţia selectivă: pe coloane de silicagel;
- afinitatea biologică pentru un ligand specific: cromatografia de afinitate.
În prezent există procedee standard care aplică iniţial tehnicile bazate pe
dimensiunile moleculare şi solubilitate şi apoi separări cromatografice. În final,
este adesea posibil să se cristalizeze enzima purificată. Pentru o anumită enzimă,
secvenţa etapelor de purificare se determină experimental, prin analogie cu
metodele folosite la proteine similare.
Puritatea este confirmată de omogenitatea preparatului, stabilitatea
prin criterii fizico-chimice valabile şi pentru alte proteine ca: electroforeza pe gel
de poliacrilamidă, analiza de sedimentare la ultracentrifugare, gel-filtrarea. In
paralel se urmăreşte, în permanenţă, regăsirea activităţii enzimatice totale
procedeului de izolare şi purificare.

MODALITĂŢI DE EXPRIMARE ŞI DE DETERMINARE A

ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

În condiţii optime viteza unei reacţii depinde direct proportional de

cantitatea enzimei care o catalizează.
Măsurând viteza reacţiei, cantitatea de substrat ce se transformă per unitate
de timp, obţinem o valoare proporţională cu concentraţia enzimei. Un asemenea
mod de dozare este mult mai comod, (adesea singurul posibil) decât dozarea
cantităţii absolute.
Enzimele fiind proteine nu pot fi deosebite una de alta prin reacţii generale,
de exemplu reacţia biuretului.
Modul de exprimare a cantităţii substratului şi respectiv a unităţii de timp
la care se raportează, exprimarea activităţii se face în: -UI, o unitate
internatională de activitate enzimatică fiind cantitatea de enzimă care transformă
1 mol substrat (10-6moli) în timp de 1 minut, la 250C, în condiţii optime de
reacţie.

20
 Pentru enzimele din preparate biologice sau enzime pure, activitatea se
raportează la mg proteină şi se notează cu Act. Specifică.
- Activitatea enzimatică se poate exprima şi în moli de substrat
transformaţi de enzimă pe secundă, katal (Kat), Kat (moli/sec) sau nKat
( nmoli/sec).

EFECTUL TEMPERATURII ŞI A pH -ului ASUPRA ACTIVITĂŢII

ENZIMEATICE
Viteza reacţiilor enzimatice creşte cu temperatura între anumite limite, în
care enzima este stabilă.
Există o valoare numită temperatură optimă pentru care creşterea este
maximă, peste care însă intervine procesul de denaturare termică a enzimei, cu
reducerea vitezei. Determinarea activităţii enzimatice în raport cu temperatura
permite, deci cunoaşterea temperaturii optime, a stabilităţii termice (temperatura
de denaturare) cât şi evaluarea energiei de activare din reacţia dată.
În ceea ce priveşte pH-ul, se ştie că există o valoare sau un domeniu
restrâns de valori în care viteza unei reacţii enzimatice este maximă, definită ca
pH optim.

Măsurarea activităţii unei enzime în funcţie de anumite valori ale pH-ului

permite stabilirea pH-ului optim.

Influenţa pH-ului asupra activităţii enzimatice

Observaţie: Tampoanele pot fi înlocuite cu tampoane fosfat de concentraţii 50
mM şi pH între 5,0 şi 8,2.

ANALIZA BIOCHIMICĂ A URINII

ASPECTE GENERALE
Urina este un lichid biologic de excreţie cu o compoziţie complexă: apa,
săruri minerale, substanţe organice, etc. În condiţii fiziologice proprietăţile
fizico-chimice şi compoziţia urinei variază în funcţie de cantitatea şi felul
alimentaţiei.

21
 Examenul sumar de urină bazat pe investigaţii calitative se practică în
prima emisie de urină, de dimineaţă, aceasta fiind mai concentrată.
Investigaţiile cantitative ale componentelor patologice detectate în
examenul sumar, se practică din fracţiuni de urină preluate din cantitatea
colectată în 24 de ore sau din emisiuni separate de la anumite intervale din zi,
pentru urmărirea debitului fracţionat al componentului investigat sau pentru a
detecta ritmul circadian al eliminării acestuia. În situaţii clinice speciale pot fi
dozate la cerere, în urina de 24 de ore: cloruri, uree, ioni de calciu, fosfor
anorganic, porfirine, hormoni.
Pentru examenele practicate în urina de 24 de ore, recoltarea se face în
modul următor:
- bolnavul urinează dimineaţa;
- această urină se aruncă;
- în timpul zilei şi nopţii se colectează într-un vas de sticlă.
- a doua zi dimineaţa se recoltează prima emisiune de urină într-un
vas separat; acesta serveşte pentru executarea examenului sumar şi în special
pentru o corectă investigare a sedimentului organizat.
Examenul sedimentului se practică numai în urinile proaspete.
Examenul de laborator al urinei presupune :
- examen macroscopic
- examen microscopic
- examen fizico-chimic
- examen citologic.

În cadrul analizelor de laborator efectuate pe urină se vor urmări

investigaţiile cerute în cadrul examenului sumar de urină (examen macroscopic,
examen microscopic si cercetarea calitativă a unor compuşi care apar în urina în
condiţii patologice ).
Pentru dozarea acestora se utilizează urina din 24 de ore, datorită faptului
că apar variaţii ale unor constituienţi în funcţie de ritmul nicteremal.
Pentru determinările cantitative se recoltează o proba de urină din emisiile
reunite. Conservarea urinei se face în prezenţa unor substanţe care nu trebuie să
modifice compoziţia ei chimică (timol 10% în izopropanol utilizat în cazul
determinării electroliţilor, aminoacizilor, proteinelor, creatininei, etc.): HCl 10N

22
în cazul determinării catecolaminelor si substanţelor steroidice; formaldehida
40% pentru conservarea elementelor morfologice ale sedimentului).
Pentru examenul bacteriologic nu se utilizează conservanţi, în acest caz
recoltarea se face steril şi în vase sterile.
Identificarea glucidelor se face pe urina proaspăt recoltată, la cel puţin 40
de ore după ce subiectului supus analizei nu i s-a mai administrat nici un
medicament.

Dozarea calciului urinar

Dozarea calciului din lichidele biologice se poate realiza prin mai multe
metode:
a. Metoda volumetrică, se bazează pe precipitarea calciului cu oxalat de
amoniu sub formă de oxalat de calciu.
b. Metoda fotometrică în flacără, este comodă, rapidă şi sensibilă. În
laboratoarele de specialitate este o metodă curentă ce serveşte şi la
dozarea altor cationi.
c. Metoda complexonometrică, prezintă avantajul sensibilităţii şi a rapidităţii,
dar nu este specifică, deoarece unii cationi, cum ar fi Mg +, pot să
interfereze reacţia.
Dozarea calciului cu EDTA

Calciul în prezenţa de EDTA şi a murexidului ca indicator formează un

complex chelat, complexul de calciu, colorat în violet.
Iniţial murexidul fixează calciul, culoarea soluţiei devenind roz, iar la titrare
cu EDTA, indicatorul este eliberat şi soluţia se colorează în violet.
Interpretarea rezultatelor
Cantitatea de calciu urinar eliminată în 24 de ore este:

0,07 – 0,3 g/24 de ore.

 Cantităţi crescute apar în: hiperviatminoza D, hiperparatiroidism,
osteoporoza după fracturi.

23
  Cantităţi scăzute ale calciului urinar apar în: rahitism,
hipoparatiroidism, spasmofilie etc.

Dozarea fosfatului anorganic

Principiu
Majoritatea metodelor utilizate pentru dozarea fosfatului anorganic se
bazează pe formarea fosfomolibdatului de amoniu, în mediu acid, care prin
reducerea cu diferiţi agenţi formează un compus colorat care se poate doza
fotometric.
Interpretarea rezultatelor
Normal, cantitatea de fosfat eliminată în 24 ore este de 1-5g (dacă se
exprimă ca P2O5) respectiv de 0,4-2g dacă se exprimă în fosfor.
Hiperfosfaturii întâlnim în efort muscular, epilepsie, cancer, boli osoase,
tuberculoza pulmonară, leucemii.
Hipofosfaturii apar în boli febrile, nefrite, infecţii acute, atrofia galbenă a
ficatului.
Lucrarea nr. 9
DETERMINAREA COMPONENŢILOR PATOLOGICI AI
URINII
Determinarea componenţilor patologici ai urinii se referă la identificarea
acestor componenţi prin reacţii calitative ce se efectuează pe urina provenită
dintr-o singură emisie sau din urina de 24 de ore. Această determinare este
cunoscută sub denumirea de analiza sumară a urinii. În unele cazuri se impune
şi un examen mai complet al urinii, realizându-se şi determinări cantitative.
Rezultatele sunt exprimate la litru sau la urina pe 24 de ore.
REACŢII DE EVIDENŢIERE A GLUCIDELOR URINARE
Reacţiile de evidenţiere a glucidelor se bazează pe caracterul lor reducător.
Reducerea ionilor metalici
Se realizează în mediu alcalin, la cald. Aceste teste nu sunt specifice
deoarece nu permit diferenţierea glucozei de alte glucide reducătoare , care pot
să apară în urină.Totuşi, există unii compuşi reducători, care pot să interfere

24
reacţia, ca de exemplu: acid uric, fenol, acidul homogentisic, acidul ascorbic,
penicilina, streptomicina.
Determinările calitative se fac pe urina de la o singură emisie, nedefecată,
deoarece dacă reacţia este intens pozitivă, defecarea este inutilă.
a. Reactia Trommer
– se bazează pe reducerea hidroxidului de cupru la oxid cupros, având loc
dispariţia culorii albastre şi apariţia unui precipitat roşu.
b. Reacţia Fehling
- se bazează pe acelaşi principiu ca şi reacţia Trommer. În acest caz, însă
excesul de hidroxid de cupru neredus, care prin deshidratare la CuO negru ar
deranja reacţia, este legat sub formă solubilă de tartratul dublu de sodiu şi
potasiu.
Apariţia unui precipitat roşu-cărămiziu indică prezenţa glucidelor
reducătoare.
c. Reacţia Benedict
- se bazează pe principiul reacţiei Fehling, doar că sarea Seignette este înlocuită
cu citratul de sodiu. Reacţia este sensibilă şi se utilizează pentru determinări
semicantitative.
e. Reacţia Nylander.
Reacţia se bazează pe reducerea bismutului trivalent la bismut metalic.
Bi(OH ) 2 NO 3  NaOH 
 Bi(OH ) 3  NaNO3

2Bi( OH ) 3  3R  CHO 
 2Bi  3R  COOH  3H 2 O

f. Testul rapid CLINITEST

Este o variantă a recţiei Benedict. În acest caz, însă reactivul se prezintă sub
formă de pastile ce conţin sulfat de cupru, acid citric, hidroxid de sodiu şi
carbonat de sodiu.
Melituriile

25
 Melituriile se caracterizează prin prezenţa altor glucide, diferite de glucoză,
în urină, este vorba în principal de identificarea: lactozei, fructozei, galactozei,
precum şi a unor pentoze.
La gravide în ultima perioadă de sarcină se pune problema diferenţierii
lactozei de glucoza urinară.
Lactozuria este însoţită de o glucozurie uşoară, care în acest caz nu este
considerată cu caracter patologic.
Fructozuria este o boală ereditară rară, care se datorează blocării în ficat a
convertirii fructozei la glucoză. Fructozuria se întâlneşte în diabet şi boli
hepatice.
Pentozuriile pot însoţi diabetul zaharat şi apar după ingerarea unor cantităţi
mari de fructe. Pentozuria esenţială (caracterizată prin eliminarea xilulozei) este
o boală congenitală, rară.
Galactoza este uneori excretată în urină în ultimul trimestru de sarcină. Se
cunoaşte, însă şi un defect metabolic ereditar, în care galactoza nu poate fi
transformată în glucoză, deoarece lipseşte enzima numită galactozo-uridin-
transferaza, motiv pentru care galactoza poate fi depistată în urină.
Punerea în evidenţă a acestor glucide în urină se poate realiza prin
reacţiile caracteristice identificării glucidelor.

REACŢII DE IDENTIFICARE A PROTEINELOR URINARE

Proteinele urinare sunt reprezentate în special de albumine şi globuline şi
provin în general din plasmă.
Determinările se fac de regulă pe urina clară. Dacă urina este tulbure,
aceasta se filtrează sau se centrifughează, iar dacă se menţine totuşi o slabă
tulbureală, atunci se fac probe paralele.
Reacţia urinei trebuie să fie slab acidă la emisie, iar în caz contrar aceasta se
acidulează cu câteva picături de acid acetic.
Identificarea proteinelor urinare se realizează în principal prin reacţii de
precipitare.
1. Reacţia cu acid sulfosalicilic

26
 Într-o eprubetă se pipetează 5 ml urină şi 5-10 picături de acid sulfosalicilic
20%. În funcţie de cantitatea de proteină prezentă se va obţine o tulbureală sau
un precipitat. Dacă tulbureala persistă la încălzire, ea se datorează proteinelor, iar
dacă dispare sunt prezente albumozele. Reacţia poate să fie fals pozitivă în cazul
unui tratament cu antibiotice orale sau prin administrarea de substanţe de
contrast.
2. Reacţia cu acid tricloracetic
Într-o eprubetă peste 5 ml de urină se adaugă 1 ml acid tricloracetic 10%.
Apariţia unui precipitat alb floconos indică prezenţa proteinelor.
3. Reacţia ESSBACH
Într-o eprubetă se tratează 5 ml urină cu 1 ml reactiv Essbach ( acid picric
10 g, acid citric 20 g, apă distilată la 1000 ml). Apariţia unui precipitat alb-
galben indică prezenţa proteinelor urinare. Această reacţie poate să fie folosită şi
la determinarea semicantitativă a proteinelor urinare.
4. Testul rapid cu ALBUSTIX
Proteinele produc schimbarea culorii unor indicatori, fără legătură cu
modificarea pH-ului. La pH constant schimbarea culorii este în funcţie de
concentraţia proteinelor.
Pentru determinarea proteinelor cu ajutorul acestui test se folosesc baghete
de celuloză impregnate cu albastru de tetrabrom fenol şi aduse la pH 3 cu un
tampon citrat. Aceste baghete se introduc în urină, după care se scot imediat. În
prezenţa proteinelor culoarea se schimbă de la galben la albastru , trecând prin
verde. Dacă se compară cu o scară de culori se poate aprecia şi cantitatea de
proteină. Acest test este mai specific decât probele de precipitare.

Interpretarea rezultatelor

Urina normală nu conţine decât urme de proteine (20-40 mg%0),

nedecelabile prin metodele uzuale.
Cantitatea de proteină excretată în cursul zilei variază, de aceea
determinarea se va face pe urina de 24 de ore. Proteinuriile patologice variază în

27
limite destul de largi, de la 2 g/l la cantităţi masive de 10 g/l. Se disting trei tipuri
de albuminurii, şi anume:
- albuminurii tranzitorii – până la 2 g/l şi dispar odată cu vindecarea stării
patologice care le-a produs. Acest tip poate să apară în tulburări circulatorii
(insuficienţa cardiacă), în edem pulmonar acut, accidente neurologice, stări
febrile, boli infecţioase, unele intoxicaţii.
- albuminurii intermitente – în condiţii de efort fizic, oboseală accentuată.
- albuminurii permanente - ce apar constant în glomerulo-nefrite. Cantităţile
eliminate pot varia de la valori foarte mici până la valori foarte mari (20 g/24 de
ore) însoţite de hematurie. De asemeni pot să apară şi în alte nefropatii (la
gravide, în diabet, în litiaza, tuberculoza, cancer).

DEPISTAREA PUROIULUI (PIURIA)

Puroiul este constituit în principal din leucocite care au suferit o
degenerescenta granuloasă și lichide biologice. Acesta apare în urma proceselor
inflamatorii de origine microbiană.
Identificarea puroiului se poate realiza prin: proba Donne.
Pentru determinare, într-o eprubeta se pipetează 5 ml urină şi câteva picături
de NaOH 20%, se închide eprubeta şi răstoarnă brusc, readucând-o la poziţia
iniţială. Apariţia unor bule de aer care persistă mai mult timp în soluţie şi se
ridică încet la suprafaţă denotă prezenţa puroiului.
Certitudinea piuriei este dată de examenul microscopic. Se consideră, astfel
pentru urina de 24 de ore, următoarele stări:
- Stare normală - 10-15 leucocite/mmc
- Stare patologică - 20-25 “ “ “
- Piurie discretă - 100-500 “ “ “
- Cistită usoară - 1000-5000 “ “ “
- Cistită intensă - 5000-40000 “ “ “
O urină ce conţine sub 200 leucocite/mmc poate să dea reacţie negativă
pentru proteine, iar la valori mai mare reacţia pentru proteine este pozitivă.

28
 Examenul urinii ce constă în punerea în evidenţă a proteinelor, glucidelor
şi puroiului este cunoscut în practica sub denumirea de:
APZ (albumină-puroi-zahăr).
Lucrarea nr.10.

ANALIZA BIOCHIMICĂ A SÂNGELUI

ASPECTE GENERALE

Analiza biochimică a sângelui constituie unul din principalele mijloace de

investigare în laboratorul clinic. Variaţiile componenţilor plasmatici sau
eritrocitari pot da indicaţii preţioase asupra unor modificări la nivel celular.
Sângele este un lichid biologic cu compoziţie heterogenă cuprinzând:
- masa celulară reprezentată de elementele sale figurate
- soluţie apoasă în care acestea sunt suspendate elementele celulare, numită
plasmă.
Se lucrează pe sânge integral, plasma sau ser. În primele două cazuri
recoltarea se face pe anticoagulanţi, care sunt diferiţi ( NaCl, citrat de sodiu,
EDTA-disodic ).
Plasma reprezintă fracţiunea din sânge din care au fost îndepărtate
elementele figurate prin centrifugare.
Serul se obţine din sângele recoltat fără anticoagulant. Serul reprezintă
fracţiunea de sânge integral din care au fost îndepărtate elementele figurate.
O tulburare a sângelui sau plasmei ne duce la o lipemie, o coloraţie verzuie
la icter, iar o coloraţie roz la o recoltare proastă, care a dus la hemoliză.
Deproteinizarea sângelui reprezintă îndepărtarea proteinelor sanguine cu
agenţi deproteinizanţi diverşi şi îndepărtarea precipitatului format prin filtrare
sau centrifugare.

Recoltarea sângelui
Pentru efectuarea determinărilor biochimice sângele se recoltează de
regulă prin puncţie venoasă.
În cazul determinărilor ultramicro, ori la determinarea hematocritului, se
poate utiliza sânge capilar, recoltat din pulpa degetului.
Este recomandabil ca recoltarea să se facă dimineaţa, pe nemâncate.
Totuşi, micul dejun influenţează rezultatul numai la determinarea glicemiei, a
lipidelor serice, a aminoacidemiei, a fosforului anorganic, în timp ce restul

29
determinărilor se pot efectua chiar dacă bolnavul a dejunat (excluzând
bineînteles o masă copioasă).
Folosirea plasmei sau a serului prezintă importanţă în unele cazuri, cum ar
fi determinarea unor enzime care se află şi în trombocite, deci eliberate în cursul
coagulării (fosfataza acidă, lactat-dehidrogenaza şi aldolaza). Folosirea serului
sau a sângelui integral se poate face dacă componentul de analizat are aceeaşi
concentraţie în eritrocite şi în plasmă (glucoza,azotul ureic).
Serul sau plasma lipemică influenţează determinările fotometrice, mai ales
dacă măsurătorile se fac în domeniul 300-500 nm.
Determinările trebuie efectuate cât mai rapid posibil după recoltarea
sângelui. Dacă aceasta nu este posibil se vor congela serurile (nu se vor păstra la
40C).Trebuie ţinut cont de această indicaţie specială la determinarea următoarelor
componente: glucoza - valorile scad prin păstrarea sângelui; fosforul anorganic
seric creşte (determinarea se va face la cel mult 3 ore de la recoltare); potasiul
seric creşte dacă eritrocitele nu sunt separate de ser în decurs de 60 de minute de
la recoltarea sângelui; bicarbonatul trebuie determinat în decurs de o oră; pH-ul
sângelui creşte în decurs de 4 ore de la 7,4 la 8; dacă sângele ajunge în contact
cu aerul, CO2 difuzează din eritrocite şi clorul din ser îi ia locul.
Deci la determinarea clorului se va evita contactul cu aerul; în privinţa
precauţiilor care trebuie luate la determinarea enzimelor acestea sunt descrise la
capitolul de enzime.
Ca exemple de anticoagulante folosite în laboratorul clinic, amintim:
- oxalat de sodiu, citrat de sodiu, EDTA sodic, heparinat de sodiu,
heparinat de litiu, heparinat de amoniu.
COMPUŞI MINERALI ÎN PLASMĂ
Este recomandabil ca exprimarea concentraţiei electroliţilor să se facă în
mEg/litru.
Conversia din mg% în mEg/l se poate calcula folosind formula:

mEg/l = mg/100ml x 10 x valenţa / greutate atomică

Folosind această formulă s-au calculat factorii de conversiune, care permit

o mai uşoară conversiune din mg% în mEg/l, pentru electroliţii serici.

30
Dozarea sodiului şi a potasiului
Pentru dozarea acestor două elemente se foloseşte astăzi fotometria de
flacără, metoda fizică foarte rapidă, care nu necesită decât cantităţi foarte mici de
sânge.
Metodele chimice mai vechi sunt foarte laborioase, necesită cantităţi
importante de sânge, motiv pentru care nu se mai folosesc astăzi.

Principiu. Proba se introduce în flacără şi pentru o temperatură constantă a

flacării în anumite condiţii, intensitatea radiaţiei emise este proporţională cu
concentraţia metalului în soluţie. Se determină intensitatea liniei emise,
selecţionate cu ajutorul unor filtre (de interferenţă, specifice fiecărui metal).

Aparatura : fotometrul cu flacără, vase din material plastic pentru păstrarea

soluţiilor etalon şi efectuarea diluţiilor, pipete, baloane cotate sau biurete.
Procedeul de măsurare a intensităţii radiaţiei emise depinde de tipul
fotometrului cu flacără care se utilizează.

Valori normale :

Vârsta Na (mEg/l) K (mEg/l)

Nou născuţi 130-139 3,5-5,1

2-3 ani 138-145 3,5-4,7
Adulţi 135-150 3,4-5,4

Dozarea calciului

Calciul se află în plasmă sub trei forme:

a. calciu ionic
b. calciu legat de proteine
c. o mică fracţiune complexată cu citratul.
Calciul ionic reprezintă fracţiunea de care depinde excitabilitatea
neuromusculară, având deci importanţă patogenetică. În laboratorul clinic nu

31
există încă metode de rutină pentru dozarea calciului ionic. Astfel de măsurători
se pot face cu electrod de ion selective care nu au intrat încă în practică.
Din determinarea calciului total şi a proteinelor se poate evalua doar în
mod aproximativ calciul ionizat după o nomogramă, numită nomograma
ZEISSLER.

Interpretarea rezultatelor

Valorile normale pentru calciul ionic

4,2 - 5,2 mg/100ml, respectiv 2,1 - 2,6 mEg/l.
Valorile normale pentru calciu total (calciu seric)
9 - 11,6 mg/100ml.

Dozarea magneziului

Există variate metode de dozare a magneziului în lichidele biologice.

Determinarea prin spectrofotometrie de absorbţie atomică; este specifică şi
foarte sensibilă.
Determinarea prin fotometrie de flacără este posibilă doar cu anumite
tipuri de aparate, iar exactitatea nu este suficient demonstrată.
Tehnicile bazate pe precipitarea Mg ca fosfat de magneziu şi amoniu sau
cu 8-hidroxi-chinoleina sunt nespecifice şi laborioase.
Metoda complexonometrică este privită cu rezervă. Metoda fluorometrică
este specifică, sensibilă şi rapidă, însă necesită aparatură specială.
Metoda de elecţie în această situaţie este cea care utilizează colorantul
Mann şi Yoe, reactiv de culoare specific pentru magneziu, care prezintă avantajul
sensibilităţii şi rapidităţii.
Valori normale:
1,8 - 2,9 mg/100ml ( 1,5- 2,4 mEg/l)

Dozarea clorului
Clorul reprezintă principalul anion al plasmei şi poate fi dozat prin:
 titrare cu azotat de mercur sau de argint,
 prin metode colorimetrice
 prin metode potenţiometrice.

32
Procedeul titrimetric Schales si Schales
Principiu:
Ionii de clor sunt determinaţi prin titrare în mediu acid ( pH sub 3 ) cu
azotat mercuric, cu care formează clorura mercurică nedisociată. Câtă vreme sunt
prezenţi ionii de clor,
1.HNO3 şi cca 700 ml apă , după aceea se aduce volumul la 1000ml,
2. Soluţia indicator difenilcarbazona 0.01 M: se prepară cât mai puţină
soluţie în proporţia: 5 mg difenilcarbazona la 2 ml metanol sau etanol 95 0. Se
păstrează în frigider în flacon de culoare brună de preferinţă din polietilenă şi se
utilizează timp de o lună. După această perioadă culoarea soluţiei se schimbă din
portocalie-roşietică în galbenă, iar detectarea punctului final devine dificilă.
3. Soluţia H 2SO4 conc. şi 53 părţi de apă.
4. Soluţie standard clorura de potasiu 0,1N: se dizolvă 7,455g KCl ( uscat
şi răcit în exicator) în apă bidistilată şi se completează cu apă la 1000 ml după ce
se adaugă 1 ml cloroform. Se conservă un an la frigider, în vas de polietilenă
ionii de Hg+2 reacţionează pentru a forma HgCl 2. La punctul final ionii de Hg+2 în
exces reacţioneaza cu indicatorul (difenilcarbazona) dând o coloraţie violetă.
Valori normale: Nou-născut 96-116 mEg/l.
2-3 ani 101-108 mEg/l.
Adulţi 97-108 mEg/l.

Exprimată în mg NaCl/100 ml concentraţia normală în ser este pentru

adulţi de 580-630 mEg/l.
Lucrarea nr.11.
DOZAREA COLESTEROLULUI

Determinarea colesterolului total prin metoda Rappaport

Colesterolul se găseşte în sânge, fie liber, fie esterificat, legat de alfa- şi
beta-globuline.
Principiu
Colesterolul formează cu acidul sulfuric şi anhidrida acetică compuşi
intens coloraţi în verde.
În prezenţa acidului sulfosalicilic se poate lucra fără deproteinizare,
proteinele rămânând în soluţie.

33
Dozarea colesterolului liber şi esterificat
Principiu
Se precipită colesterolul liber cu digitonină. Rezultatul obţinut se scade
din colesterolul total obţinându-se colesterol esterificat.
tehniValori normale:
până la 50 de ani :150 - 200 mg/100ml ser
peste 50 ani: 160 – 230 mg/ml
Variaţii patologice:
Crescut: ateroscleroză, diabet zaharat, obezitate, hipotiroidii, sindrom
nefrotic, mixedem, alcoolism.
Scăzut: insuficienţe hepatice grave (ciroză), unele maladii infecţioase
severe, pneumonie, febra tifoidă, endocardită, hipertiroidism.
Raportul colesterol esterificat/colesterol total = E/T = 0,65 – 0,75.
Raportul E/T prezintă interes practic în diferenţierea şi prognosticul
icterelor, în ateromatoza, în infarct miocardic şi accidente vasculare cerebrale.

Lucrarea nr.12.
Determinarea glicemiei

Diabetul zaharat este un exemplu cheie al condiţiei medicale cronice cu un

impact semnificativ asupra sănătăţii orale.
Odată ce boala s-a instalat, natura cronică a acestei infecţii contribuie la
înrăutăţirea stării diabetice ducând la un diabet mai sever-complicaţii. Totuşi,
tratamentul periodontal rezultă în îmbunătăţirea controlului metabolic al
diabetului şi într-o scădere a cerinţelor de tratament al acestuia.
Un posibil mecanism biologic este că acumularea produsului final glicat
mediat de glucoză, activează funcţia chemotactică şi fagocitică a leucocitelor
polimorfonucleare. Consecinţa acestui proces rezultă într-o producere crescută
de IL-1 şi TNF-α. Aceste citokine proinflamatorii joacă un rol nu doar în
patogeneza complicaţiilor diabetice ci şi în patogeneza periodontitei.
Pe de altă parte, diabetul zaharat slab controlat poate produce o
hiperlipidemie prelungită care poate afecta funcţia celulelor mieloide. Pacienţii
cu diabet de tipul II slab controlat şi hiperlipidemie prezintă inflamaţie gingivală
severă şi tind să prezinte concentraţii mari de interleukin IL-1 în fluidul
crevicular.

34
 Metabolismul lipidic este influenţat de IL-1, IL-6, IL-8 şi de factorul de
necroză tumorală (TNF-), care cresc sinteza de lipoproteine în ficat.

Dozarea glucozei o-toluidină

Glucoza formează în prezenţa o-toluidinei în mediu de acid acetic, la cald,
un compus colorat în verde, care se dozează fotometric.
În condiţii normale glucoza sanguină variază între:
70-110 mg/100ml sânge integral.
Glicemia variază fiziologic cu alimentaţia şi în funcţie de unii factori
externi: frig, emoţie, efort muscular.
Scăderea exprimată a glucozei sanguine = hipoglicemia
Hipoglicemiile apar după administrarea unor doze excesive de insulină şi
alte preparate hipoglicemiante (de ex. Tolbutamid). Sunt prezente şi în
adenoame ale insulelor Langerhans (Insulinom) precum şi insuficienţe hepatice
grave, insuficienţa hipofizară sau insuficienţa suprarenală.
Hiperglicemia trecătoare se poate observa postprandial sau în legătură cu
stări emoţionale sau după administrarea de catecolamine.
Hiperglicemiile de durată sunt caracteristice pentru diabetul zaharat clinic
manifest. În formele de diabet asimptomatic (chimic), glicemia a`jeun este
adeseori normală iar defectul metabolic se evidenţiază prin probe de încărcare.
Cea mai des utilizată probă de încărcare constă în administrarea pe cale
orală a 50 g glucoză ( sau 1g/kg greutate corporală) dizolvată în 250 ml apă şi
urmărirea glicemiei din 30 în 30 de minute, pe timp de 2 ore sau 2 ore ½.
La subiecţi normali creşterea maximă a glicemiei după încărcare nu
depăşeşte 160 mg/100 ml, iar la maxim două ore de la administrarea glucozei,
glicemia trebuie să fie sub 120 mg/100 ml.
În diabetul zaharat nivelul maxim al hiperglicemiei atinge cifre mari după
1-2 ore, iar revenirea la o valoare apropiată de cea iniţială durează 3-5 ore. La
subiectul prediabetic timpul de revenire a glicemiei la valoarea iniţială se
situează între normal şi diabetic.
Toleranţa faţă de glucide este scăzută în diabet, hiperadrenalism, acidoză,
caşexie, boli hepatice, boli infecţioase. Toleranţa crescută apare în boala lui
Addison, hiperinsulinism.

Lucrarea nr.13

35
 DOZAREA HEMOGLOBINEI ÎN SÂNGE (METODA DRABKIN)

Principiu
Fericianura de potasiu oxidează Fe+2 din hemoglobină la Fe+3. Aceasta
face ca toate felurile de hemoglobină din sânge (exceptând verdohemoglobina)
să treacă în methemoglobină, iar methemoglobina pe măsură ce se formează, se
combină cu cianura de potasiu trecând în cianmethemoglobină, derivatul de
hemoglobină cel mai stabil.
Observaţii: pH-ul trebuie să fie 7,2-7,5. La pH acid, precipită proteinele, iar la
pH alcalin, precipită lipidele.
Valorile normale sunt:
- femei: 11 –15 g/100ml ser
- bărbaţi: 13-17 g/100ml ser.

Determinarea bilirubinei

Majoritatea hemului catabolizat provine din hemoglobină. În timp de 24

de ore aproximativ 3 x 109 hematii sunt distruse de către celulele sistemului
reticuloendotelial (localizate mai ales în splină, ficat şi măduva osoasă),
eliberând 6g hemoglobină.
În aceleaşi celule hemul este catabolizat în continuare fiind în prealabil
desprins de pe lanţurile globinelor (hidrolizate de proteaze la aminoacizi).
Un număr mult mai mic de hematii (mai ales din cele îmbătrânite)
hemolizează în torentul circulator al sângelui, proces ce se accentuează în
condiţii patologice. Hemoglobina eliberată în sânge este legată de o
proteină serică din clasa alfa-2-globulinelor, împiedicând eliminarea ei prin
rinichi şi astfel blocajul renal.
Hemul oxidat la hemină este legat de o proteină din ser, hemopexima, din
clasa beta-globulinelor. În cazul depăşirii capacităţii de legare a hemopexinei
intervine albumina serică formând cu hemina methemoglobina.
Celulele sistemului reticulului endotelial captează agregatele ce conţin
hemină, reducând-o enzimatic. Hemul suferă apoi acţiunea unui sistem
enzimatic microzomal inductibil, hemoxigenaza.

36
 Se rupe astfel ciclul ce uneşte pirolii și se eliberează Fe +3. Nucleele
pirolice formează un lanţ unit prin trei punţi metinice – biliverdina.
La rândul ei biliverdina este redusă de către biliverdinreductaza la
bilirubină, o substanţă colorată în galben.
Aceasta este eliberată în sănge şi fiind insolubilă circulă legată de
albumină. În 24 de ore se formează în jur de 300 mg bilirubină care realizează o
concentraţie de: 0,2 – 0,8 mg/dl.
Depăşirea capacităţii de legare a albuminei duce la difuzia bilirubinei în
ţesuturi, pe care le colorează = icter. Hepatocitele captează bilirubina de pe
albumină și apoi o va conjuga cu 1–2 resturi de acid glicuronic, formând mono-
şi diglucuronizi, hidrosolubili = bilirubina conjugată.
Dozarea bilirubinei se face cel mai frecvent cu ajutorul unei reacţii de
cuplare cu un diazoderivat.
Bilirubina se găseşte în ser atât sub formă liberă (BL) cât şi sub formă
glicurono-conjugată (BC).
Bilirubina conjugată este hidrosolubilă şi cu acidul sulfanilic diazotat
formează un complex colorat albastru. Bilirubina liberă (neconjugată) nu este
hidrosolubilă, ea fiind menţinută în soluţie apoasă (ser, plasmă) prin legarea ei
de proteinele circulante (albumine). Deasemeni ea nu reacţionează direct cu
reactivul sulfanilic diazotat. Bilirubina totală (BT) se obține matematic prin
însumarea celor două tipuri de bilirubină:
BT = BL + BC
Valori normale:
- BT = 0,2 - 0,8 mg/dl
- BD = 0,0 - 0,2 mg/dl
- BI = 0,1 - 0,6 mg/dl
Variatii patologice:
Valori crescute:
- bilirubina conjugată (BD) : icter mecanic, ciroze.
- bilirubina liberă (BI): icter hemolitic
- bilirubina liberă şi conjugată: icter hepatocelular.

37