Activitate experimental Spectrometrie Melodele colorimetrice se bazeaza pe masurarea absorbtiei din domeniul vizibil al luminii. La trecerea unui fascicul de lumin& monocromatica de intensitate To printr-o soluyie omogena, intensitatea luminii transmise I, este mai mica, deoarece 0 parte din intensitatea fasciculului este reflectata (I,) si absorbité (I,) de solutie. Iy= Ty = (I, + ly) Legea lui Lambert-Beer I= drumut optic (grosimea stratului strabatut) c= concentratia mediului strabatut Se definese notiunile de transmisie si absorban{a Transmisia (T)-Reprezinta procentul de radiatie din radiajia incidenta eare trece prin mediu. THI, T%=100 1, 4 procentul de radiatie absorbitai de mediu. A= ( A+ T= 1 sau procentual A+ Absorbanta repr Relatia dintre absorbanta si transmisie: log (Io/1) din relajia P% = (WI) x 100 E> Utilizarea masuratorilor spectrofotomettice: LPentru trasarea spectrului de absorbyie al unei anumite substanie aflate in solutie. in aceste determinari variaza lungimea de und . Ia care se citeste extinetia. Se traseazai spectre de absorbyic. Extineia sau densitatea optic’ I 2-log T% don) 2. Pentru stabilirea concentratiei unei anumite substante aflate in soluie: a) Se reprezint& grafic extinetia in functie de concentiatile diferite ale substangei aflate in solute, Se determing extinctia probei (Fp). Prin extrapolare se afl concentratia necunoscuté (C})Activitate experimentala b) Se utilizeata o solufie standard de concentrafie cunoscuti (Cs). Cp este concentratia necunoscuta Conform legii Lambert-Beer_ Cp/Cs=Ep/Es => Cp Proteine plasmatice ind proteincle serice si fibrinogenul. Principalele functii ale Proteinele plasmatice cup proteinelor plasmatice sunt: * participa la procesul de coagulare; * ——contribuie la menfinerea pH-ului fiziologic, avand proprietai de soluii tampon, datorita faptului cd au caracter amfoter; + participa la mentinerea presiunii coloid-osmotice a plasmei; albumina are cea mai mare contribujie la aceasta functie datorité caracterului stu hidrofil gi concentratiei mari; * rol in imunitate datorits prezenfei imunoglobulinelor; * rol in transportul a numeroase substan(e; principala functi transporta: lipide, vitamine, hormoni, ioni metalici, acid uric, medicamente, bili revine albuminei care nd, ete. Proteine serice Concentrajia normala: 6 - 8g/100m!. Concentrajia scade in: © afectiuni renale (datorita pierderii urinare de proteine); © afectiuni hepatice (cu: excepjia anticorpilor, celelalte proteine plasmatice sunt sintetizate in ficat, capacitatea de sintez a acestuia fiind redusa in cazul unor afectiuni). Dozarea proteinelor totale serice Principiul_ metodei: Metoda de dozare se bazeazi pe reacjia biuretului. Proteinele din ser reactioneaz& cu sirurile de cupru (CuSO,) in mediu alcalin, forméand un complex colorat albasteu violet a cirui intensitate este proporfionalit cu concentra(ia proteinelor din proba, Activitate practi An trei eprubete proba, standard si blane se pipeteazéi Reactiv Probi__| Standard Blane Reaciiv biuret 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml Solupie NaCl 0,9% (ser fiziologic) | : = 0,1 ml | ‘Ser 7 — 0,1 ml = = Standard (Cs = 8 g/dl) i 0,1 ml : Se amestecd si se lasd 10 min in repaus. Se masoard extineyiile probei si a standardului fay de lane la 0 lungime de undé de 546 nm. Calcul: Cp = Cs x Ep/Es Cp se exprima tn grame La 100 mt1. ENZIME Enzimele (biocatalizatori), ele catalizeaza reactiile din sistemele biologice. Prezenta Jor este necesara pentru ca aproape toate reacfiile din organism si se desfigoare. Majoritatea enzimelor au structurd proteied cu exceptia ribozimelor (molecule de ARN cu activitate cataliticd cu specificitate inaltt pentru substrat care joacd un rol important in conversia preARNmesager in ARNmesager matur prin indepartarea intronilor). W.1.GENERALITATI © Proprictati ‘ catalizeaza numai reaefii termodinamic posible; librul reacfici: + miirese viteza de reacfie prin sedderea energici de activare (energia neces ‘© sunt sensibile Ia acfiunea inhibitorilor, # specificitate inalta; * cinetica caracteristica; © cficien{é remarcabild (viteza creste de 10°-10'' ori comparativ cu reactia neeatalizata); * manifesta fenomenul de saturare, Moleculcle asupra cérora acjioncazi enzimele se numese subst moleculele rezultate din reactie se numese produsi de reaetic mele poseda un situs catalitic activ care reprezi i din enzima, Este locul unde se leagd substratul gi unde au loc reactiile care due in final Ja produsii de reacjie, Legarea substratului in centrul catalitic activ este consecinga complementaritajii structurale ale acestora si se realizeaza prin legituri slabe necovalente. In centrul activ se gAsesc grupari reactive provenite de laresturi de Ser, Thr, Cys, Lys, Glu, implicate in activitatea catalitiea si resturi de aminoacizi, in special hidrofobi, cu rol in dbstratulu Unele enzime posed si un situs alosterie in care se leagit moleculele reglatoare ale imei numite efector’ alosterici, care in urma legéirii modifica conformatia si activitatea enzimei, Efectorii alosterici se clasifica in fancjie de modul in care influenea7 mei in efectori alosteriei poziti catalizate) si efectori alosterici negativi (micsoreaza viteza reactiei catalizate), O enzima poate avea mai multe situsuri alosterice gi acestea pot fi de un singur fel sau diferite (pozitive sau negative). cle. legar © Clasificare: Din punet de vedere structural: # Proteine simple care sunt formate numai din resturi ale aminoaeizilor: tripsina, chimotripsina, elastaza * Protcine complexe care con{in si o component neproteica (cofactorul) Partea proteicd este denumita apoenzimd si este inactiva functional, activitatea manifestndu-se numai la nivelul holocnzimei: Holoenzima ——> apoenzima + cofactor. Coftctorii pot fi joni metalici : Zn’” pentru anhidraza carbonic’ si citocromoxidaza, Se™* pentru glutation peroxidaza, etc. Cofactorii legati puternic de apoenzima se numese 12Leonor Michaelis si Maude Menten au elaborate 0 ecuajie care le poarta numele considerdind urmatoarele: -concenttafia substratului este mult mai mare deeat concentr afl in intregime sub form de complex ES; -reactia de transformare a complexului in produsi de reacfie si enzimi liber’ este practic ireversibilas -reversibiliatea reacfiei de formare a complexului (K\=K,) va determina 0 concentraie constanta a complexului ES. enzimei care se Ecuatia Mich ‘Menten Vinax X [S] Vinay = Viteza maxima ve ~ Kn constanta Michaelis-Menten Ky +[S] [S] = concentrajia substratului Proprietajiile catalitice ale unei enzime fafa de un anumit substrat sunt caracterizate de paramettii: Ky(eficien{a) si Vmax (puterea cataliticd), specific pentru o enzima data i un anumit substrat cand = Vmax v= atunci Ky= [S$] 2 Kr reprezint& concentrafia substratului la care viteza de reacjie este egal cu Vimax/2. Valoatea Kn pentru diferite enzime are valori de ordinul 10'-10 M. Valoarea Kmeste in general apropiati de concentratia fiziologicd a substratului, Ecuajia Lineweaver-Burk. Aceastat ecuatie a fost introdusa deoarece era dificil de determinat valoarea Ky $i Vmax din reprezentatea sub forma de hiperbol’, Se considera reciproca ecuatiei Michaelis-Menten 1 1 Ku 1 an + oe vy Vmax Vmax [S] Ww y =axtb b=1/Vmax Vmax, “1K Vs} 11.3. INHIBITIA ACTIVITATH ENZIMATICE Studiul inhibijie’ activita,ii enzimatice este important pentru a infelege reglarea activitajii enzimatice si a modului de acfiune al unor medicamente. in functie de modul de actiune, inhibitorii se clasificd in ireversibili si reversibili, iar mecanismmul de inhibisie este ireversibil, respectiv reversibil 4bil se leagi la centrul activ al enzimei formand o legatura covalent cu un rest de aminoacid, Complexul format este stabil ducdnd la o inaetivare permanent a enzimei sau in cel mai bun caz activitatea se reface lent, necesitind ore si zile pentru refacerea aetivitaqii enzimatice. Exemple: ~iodacetamida si ionii metalelor grele (Hg, Ag”) se leagd de gruparile tioliee din centrul activ; -aspiina (acetilsalicilatul) este un un inhibitor ireversibil al ciclooxigenazei. Pe aceasti bazii aspirina este utilizata ca medicament antiinflamator, antipiretic si analgezic. in plus ea este utilizata profilactie pentru inhibarea agregitii trombocitelor gi a trombozei coronariene, Inhi le inhibitor) Modul de actiune este diferit. Ki se formeazi in organism din preeursori in timpul unui ciclu catalitic abortiv. Compusul initial nu este activ. Compusul activ, generat printr- una sau mai multe reacfii este similar structural cu substratul enzimei care comite sinuciderea si formeazi cu aceasta un complex stabil. Se poate considera cA prin incapacitatea ei de a discrimina intre adevaratul substrat si cel fals enzima se sinucide. Exemplu -fluoruracilul, medicament ut tori de sinucidere (sui zat in chemoterapia anticanceroasti © Inhibitori reversibili Inhibitorii reversibili se deseobesc prin mecanismul de actiune si prin influenta pe care o exerciti asupra acfioncazii, i se leagsi de enzima prin legaturi slabe, necovalente si pot fi clasificati in competitivi, necompetitivi si acompetitivi In itori competitivi Inhibitorul competitiv este un analog structural al substratului si se leagd reversibil la situsul activ al enzimei, Deoarece legarea inhibitorului este un proces reversibil prin cresterea coneentratici substratului, efeetul inhibitor poate fi diminuat si chiar inlaturat vit (v) Vmax. fia inhibitor 1/2. Vmax cu inhibitor Ku Kw [s} Din studiul cineticii reactiei se deduce c&: Vmax nu se modified, Ky ereste, Exemple = methotrexatul, chemoterapie anticanceros este un inhibitor competitiv al dihidrofolat-reductazci, enzima care are ca substrat dihidrofolatul. 15- sulfamidele, analogi structurali ai acidului_para-aminobenzoic, inhiba competitiv incorporarea acidului para-aminobenzoie in folat fiind ullizate in tratamentul unor boli infectioase. ~ captoprilul si enalaprilul sunt inhibitori competitivi ai enzimei de conversie angiotensinei. w"atatinele, medicamente utilizate in tratamentul hipercolesterolemict sunt inhibitori ai hidroximetilglutaril-CoA reduetazei. Inhibitori necompetitivi Inibitorul se leaga in alt Joe decdt substatul. El se poate lege att de enzima lbers cat si de complexul ES. fn ambele cazuri viteza de reac este diminuati. Kar nu se modified, dar Vmax scade, vit (v) Vmax fara inhibitor v'max cu inhibitor 1/2 Va 1/2 V'max Ku [s] Kw Inhibitori acompetitivi Inhibitorul se leaga numai la complexul enzimi-substrat. Inhibifia acompetivél apare la sistemele multienzimatice, care leaga substratele si inhibitort!intr-o anumitd aline. Panta nu se modifica, dar Vmax si Ku sead (-1/Kyy devine mai negativ) Ww cu inhibitor fara inhibitor “K-VK aS] 11.4, FACTORII CARE AFECTEAZA ACTIVITATEA ENZIMATICA © Temperatura Pentru fiecare enzima exist 0 temperaturit optima pentru exercitarea activitafii calalitice, Cresterea vitezei de reacfie cu temperatura se manifesta int-un domeni limitat de temperatura, limita superioari corespunzind temperaturi optime. Dincolo de accastt temperatura activitatea enzimei scade, deoarece incepe procesul de denaturare termed a proteinei care se accentueaza cu cresterea temperaturii 16activitatea enzimatica (%) 2 40 © piu Se defineste ca pH optim, pl1-ul la care activitatea enzimaticd este maxima, Pentru majoritatea enzimelor acesta variaza intre 5-9 si pufine enzime se plaseaza in afara acestor limite: pepsina ( 2), fosfataza acida (5-6), fosfataza alcalina (8-9). activitatea enzimatica (%) 6 8 10 pH Aceast variajie este determinata de inedrcarea electticd a enzimei si/sau a substratului, la concentrajii diferite ale H" eare antreneazi modificari conformagionale reflectate in geometria centrului activ si a substratului, si duce la pierderea complementaritiii dintre centrul activ gi substrat, II.5, REGLAREA ACTIVITATII ENZIMATICE ‘© Reglarea prin activare proteolitict Aceasti reglare presupune transformarea precursorului inactiv al enzimei in enzima activa gi se realizeaz’ prin ruperea proteolitica a uneia sau mai multor legdturi peptidice sub aefiunea unor proteaze sau autocatalitie gi prin actiunea unor factori din mediu. ma inactiva (zimogen) ——> E activa pepsinogen ——> pepsin’ tripsinogen ——> tripsina chimotripsinogen ——> chimotrpsin& proenzimele factorilor coagulzirii ——» factori activi plasminogen ——> plasm procaspaze——> caspaze "7Pepsinogenul produs in stomac confine legaturi labile in mediu acid, Prin ruperea acestor legituri intr-un numa redus de molecule se formeaza pepsina activi care va acliona asupra restului de molecule de pepsinogen. Tripsinogenul este convertit Ia tripsina prin acfiunea peptidazei_numiti enterokinaza sau enteropeptidaza. Tripsina catalizeazi reactia de transformare a chimotripsinogenului in enzima activa, chimotripsina, Factorii coagulirii: kalikreina, factorii Xia, Xa, [Xa,VIla, Xa, Xllla si trombina sunt sintetizati sub forma de proenzime gi se activeaza in cascada. Plasmina, enzima responsabilt de procesul de fibrinoliza (catalizeazi reactia de hidrolizé a fibrinei) este sintetizati ca plasminogen. Plasminogenul se transform in plasmina sub actiunea serinproteazei denumita activatorultisular al plasminogenului Precursorii inactivi ai caspazelor, procaspazele se transforma in enzime active pri scindare proteoliticd in dreptal a dowd resturi de acid aspartic, reactia find catalizaté de enzime cu activitate similar sau decurgdnd autocatalitie. reae{ii de fosforilare-defosforilare ATP ADP Proteina~-OH Proteina—O—P=O | Protein fostuset_—— 0 — Oo 1,0 | HO—P-0 Oo Prin reactii de fosforilare-defosforilare enzimele care contin in centrul activ -OH provenite din resturi de seril, treonil sau tirozil isi modifica activitatea, Unele enzime sunt active in forma fosforilats, altele in forma defosforilati. Cele doudi forme sunt intereonvertibile. © 2.7.2.2.Reglarea alosterica modificari conformafionale sunt enzime Enzimele a ciror activitate este reglata pri alosterice, Ele au douti caracteristici: -sunt proteine oligomere catalizeazit etape cheie (reglatoare), ireversibile ale cailor metabolice. Enzimele alosterice con{in un centru reglator denumit centru alosteric diferit de 4 efectorii alosterici, compusi chimici care au capacitatea de a modifica activitatea enzime' Legarea lor in centrul alosteric determing 0 transformare conformafionala denumits tranzitie alostericd care va mati eficienja catalitica in cazul efectorilor pozitivi si o va micgora in cazul efectorilor negativi. Un tip special de reglare alosterica este reglarea de tip feedback. 18* — inhibitie feedback - Produsul final al unei c&i metabolice inhiba enzima care catalizeazi prima reactie: A>B-»C->D Acumularea lui D in cantitate mare determina legarea lui in central alosteric al enzimei care catalizeaz8 transformarea substratului A in B. D actioneaza ea un inhi alosteric negativ sau feed-back inhibitor. * — stimulare-feedback Fructozo 1,6 bisfosfatul, este activator alosteric al reaofiei catalizate de fosfofiuetokinaza-1, al carei produs de reacfie este, Alt tip de reglare alostericd, mai rar intalnit este stimularea “feed forword”. Produsul unei reactii (reaofia determinanta de viteza) actioneazA ca un efector alosteric pozitiv asupra unci reacfii situate in aval de reacfia al cArui produs este, De exemplu fructozo-1.6 bisfosfatul este efector alosteric pozitiv al piruvat kinazei. 19