Sunteți pe pagina 1din 37

REACIILE

IMUNOLOGICE.
REACIILE AG-AC in vitro

REACIILE ANTIGEN-ANTICORP in vitro


(REACIILE SEROLOGICE)
Reacia Ag-Ac este determinat de interaciunea specific
dintre epitopii Antigenului i paratopii Anticorpilor.
n acest proces intervin patru
tipuri de legturi:
legturi de hidrogen
legturi electrostatice
forele Van der Waals
legturi hidrofobe.
Legtura
Ag-Ac are trei
caracteristici:
exoterm
specific
reversibil.

structura schematic a unui anticorp


PARATOP

lan greu (H)

poriune
variabil

lan uor (L)


poriune
constant

lan uor (L)


puni disulfurice

grupri glucidice

structura schematic a unui complex imun

Epitop 1 al
antigenului 1

Ag 1

paratopulare
areoostructur
structur
paratopul
tridimensionalcoplementar
coplementar
tridimensional
epitopului
epitopului

Ag 1

Afinitatea unui Ac pentru un Ag specific:


caracterizeaz intensitatea forelor de
legtur a complexului Ag-Ac
depinde de complementaritatea steric
dintre paratop i epitop.

Aviditatea unui Ac pentru un Ag specific:


reprezint rapiditatea apariiei manifestrii
reaciei Ag-Ac (precipitare, aglutinare, etc.)
depinde de constanta de asociere, de
valena Ac, de numrul de epitopi, de
temperatur, de pH, de fora ionic a
mediului.
Un paratop se poate combina cu un
singur epitop, numit specific. Astfel, dac
este cunoscut unul din elementele reaciei Ag sau Ac, poate fi identificat cellalt.

Reaciile Ac-Ac (reaciile serologice) au dou


direcii de aplicare practic:
I. Seroidentificare: Detectarea i dozarea Ag
(element necunoscut - tulpini microbiene
izolate din diferite prelevate) cu ajutorul Ac
specifici cunoscui
II. Serodiagnostic: Detectarea i titrarea Ac din
serul bolnavilor (component necunoscut) fa de
un Ag specific cunoscut (coninut n diagnosticuri).

REACIA DE AGLUTINARE
Din latin agglutinatio - ncleiere
Reacia Ag-Ac se poate manifesta prin
aglutinare atunci cnd determinantele antigenice
sunt purtate de particule figurate (Ag insolubile,
corpusculare), iar Ac specifici sunt complei (cel
puin bivaleni).
Aglutinarea este determinat de formarea unei
reele ntre Ag i Ac, ce permite apropierea unui
numr suficient de particule figurate pentru a
constitui aglutinate vizibile.

Clasificarea reaciilor de aglutinare


1. Aglutinare activ sau direct: particula
figurat (Ag corpuscular) este ea ns i
purttor de determinante antigenice specifice
(hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi,
bacterii)
2. Aglutinare pasiv sau indirect: particula
servete doar ca suport pentru un determinant
antigenic solubil fixat artificial pe suprafaa sa.
Frecvent sunt utilizate ca suport:
hematii formolate
particule de latex
microcristale de colesterol.

Reacii de aglutinare activ (direct)


Reacia poate fi efectuat pe lama de sticl
sau n tuburi.
Reacia pe lama
Se amestec o picatur de ser i o picatur
de suspensie bacterian (Ag). Citirea se
face la microscop sau cu ochiul liber. n caz
de reacie pozitiv apar conglomerate, iar
lichidul se clarific;
n caz de reacie negativ,
lichidul ramne tulbure.

Reacia n tuburi
n eprubet se amestec serul i Ag figurate (hematii,
bacterii).
Reacia pozitiv se manifest prin formarea unui
sediment cu aspect de umbrel inversata la fundul
tuburilor i clarificarea lichidului.
Celulele neaglutinate se sedimenteaz la fundul
tuburilor sub forma de buton sau inel (reac ie
negativ).

Reaciile de aglutinare pasiv (indirect)


Aglutinarea pasiv const n fixarea unui Ag
solubil (sau al unui Ac) pe un suport corpuscular
inert, care nu intervine n reactia Ag-Ac.
n calitate de suport inert pot servi:
hematiile
particule de latex
cristale de colesterol
Suspensia de particule sensibilizate cu Ag
sau Ac este pus n contact cu serul (respectiv cu
Ag), ca i n cazul aglutinarii directe.

https://www.youtube.com/watch?v=pC9EtQ8fWbE

Reacia de hemaglutinare indirect


(pasiv) RHAI / RHAP
Unele antigene de origine polizaharidic se
fixeaz practic spontan, dup o scurt incuba ie, pe
suprafaa hematiilor. Antigenele proteice se fixeaz
doar dup o pregatire prealabil a hematiilor (de ex:
tratarea cu tanin, formol).
RHAI se efectueaz n godeurile unei plci din
polistiren. Reacia pozitiv se manifest prin
aglutinarea eritrocitelor sensibilizate (umbrela
inversat de culoare brun la fundul godeurilor).

https://www.youtube.com/watch?v=tUiO6-cuvSQ

Reacia de latex-aglutinare
Ac sau Ag sunt fixai pe particule de latex.
Reacia se efectueaz pe lama de sticl.

Reacia de latex-aglutinare este utilizat n:


identificarea factorului reumatoid la
bolnavi suspeci de poliartrita reumatoid
pentru serodiagnosticul unor infecii.

Reacia de Co-aglutinare
La baza acestei reacii se afl proprietatea
unei bacterii Staphylococcus aureus (tulpina
Cowan), ce are n componena peretelui
celular proteina A s fixeze Ig G.

REACIA COOMBS
Unii Ac (monovaleni) nu sunt aglutinani n condiii
normale, fiind monovalenti (ex. anticorpii anti-Rh,
responsabili de incompatibilitatea materno-fetal n
sistemul Rh). Ei pot fi depistai graie testelor
Coombs.
Sunt posibile 2 tehnici, n funcie de sngele
prelevat:
de la nou-nscut
SAU

de la femeia gravid

REACIILE DE PRECIPITARE
Imunoprecipitarea:
se manifest doar atunci cnd Ag solubil este amestecat
cu Ac corespunzator
poate fi observat:
n mediu lichid,
n mediu solid

Poate fi:
calitativ
cantitativ

Acestea sunt reacii specifice, dar putin sensibile, ce


necesit cantiti importante de anticorpi.

REACIILE DE PRECIPITARE
Precipitarea complexelor moleculare rezultate
din uniunea Ag-Ac este determinat de formarea
unei reele tridimensionale de Ag reunite prin Ac.
Utilizare:
n medicina legal (determinarea apartenenei
de specie a diferitor proteine: snge, sperm,
etc)
n igiena alimentar (depistarea falsificrii
alimentelor)
n diagnosticul maladiilor infectioase, etc

PRECIPITAREA N MEDIU LICHID


Reacia de precipitare inelar
ntr-un tub se introduce serul imun; pipeta se
nclin i pe pereii ei se las s se preling ncet
soluia de Ag, ca s nu se amestece cu serul. Dac
Ac din ser corespund cu Ag, n zona de separare a
celor dou lichide se formeaz un inel alb, ceea ce
semnific precipitarea complexului Ag-Ac.

PRECIPITAREA N MEDIU SOLID (N GEL)


n aceste reacii, Ag i Ac difuzeaz unul spre altul prin
geloz i n zona de concentraie optim a acestor dou
elemente reactive se produce precipitarea sub form de linii
albe-cenuii.
Dac exist mai multe sisteme Ag-Ac, se vor forma linii de
precipitare distincte.

Imunodifuzia simpl radial


Imunodifuzie dubl
Contraimunoelectroforeza

REACII DE CITOLIZ IMUN (cu


participarea complementului)
Activarea fraciilor complementului (C) duce
la liza particulei purttoare de Ag (hematii,
bacterii, diverse celule...)
Activarea complementului
-Calea clasic
-Calea alternativ
-Calea lectinic

Activarea C pe cale clasic


Activatorul l constituie complexe Ag-Ac (IgG, IgM).
Calea alternativ de activare a C
Activatori: endotoxine, celule infectate cu virus,
levuri, parazii, venin de cobr, agregate de IgA
sau IgE.
Calea lectinic
Activatori: lectine

REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI


(RFC)
Este o reacie complex, constituit din 2
sisteme Ag-Ac i cu participarea C.
n RFC particip Ig capabile s fixeze C IgM
i IgG.
RFC se utilizeaz n diagnosticul virozelor,
infeciilor bacteriene, etc

Tehnici serologice cu utilizarea Ac marcai


Marcanii utilizai uzual:
- Fluorocromi (rodamina, fluoresceina), care
emit o lumin rou-oranj sau verde-galben
la tratarea lor cu raze UV (Reacia de
Imunofluorescen)
- Enzime (fosfataza alcalin, peroxidaza),
capabile s modifice culoarea unui substrat
(Reacia Imunoenzimatic)
- Radioizotopi (125I sau 3H), care emit radiaii
gamma i beta (Analiza Radioimun)

positive test for rabies

negative test for rabies

Reacia ImunoEnzimatic (RIE,


ELISA -Enzyme
Linked
Immunosorbent
Assays

Tehnica imunoblot (western blot) permite identificarea Ag sau ai Ac dintr-un


amestec.

Proteinele sunt separate electroforetic n gel poliacrilamid. Sub aciunea


cmpului electric are loc difuzia proteinelor conform greutii moleculare,
aranjndu-se n zone liniare subiri diferite: mai aproape de start se
aranjeaz proteinele cu mas molecular mare (120-150 kDa), la final se
aranjeaz proteinele cu mas molecular mic (5-10kDa).

Apoi lamela de gel este transferat pe o foaie de nitroceluloz amplasat


ntre electrozii unei surse de curent continuu. Sub aciunea cmpului electric
are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloz, unde se fixeaz foarte
bine pe hrtie.

Proteinele fixate sunt marcate cu o enzim (e.g. alkaline phosphatase sau


peroxidase) incolor.

Procedura ulterioar de montare a reaciei este similar tehnicii ELISA.

https://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ6dBOfs