Planul cursului

- Teoria talerelor
- Izoterme de distributie
- Ecuatia Van Deemter
- Dispersia zonelor
- Tehnici de elutie

- Cromatografia planara (pe coloana deschisa)

- Cromatografia pe hartie

- Cromatografia pe strat subtire

1
  TEORIA TALERELOR TEORETICE
(Teoria platourilor teoretice)

 În teoria talerelor se presupune că, în timpul trecerii prin

coloană, solutul este întotdeauna în echilibru cu fazele mobilă şi
staţionară.

 Totuşi, între faze niciodată nu se atinge echilibrul.

 Pentru a lua în consideraţie această condiţie de non-echilibru, se

consideră coloana divizată într-un număr de talere, fiecare având o
anumită mărime, astfel că solutul va sta un anumit timp în fiecare.

 Mărimea talerelor este stabilită astfel încât să furnizeze un

anumit timp de rezidenţă a solutului, pentru a se stabili un
echilibru între cele 2 faze.

2
 Exemplu: fiecare taler conţine
- o masă m de fază staţionară,
- faza mobilă este adusă în fracţiuni de volume
vi.

 După stabilirea echilibrului, fiecare porţiune

de fază mobilă este transferată pe talerul imediat
inferior. Astfel, faza mobilă a talerului r, în
echilibru cu faza stationara a aceluiaşi taler, se
deplasează în talerul următor r + 1 unde vine în
contact cu o nouă fracţiune de fază staţionară
cu care se va pune în echilibru. In acelaşi timp
faza staţionară care a rămas pe talerul r se va
pune în echilibru cu faza mobilă provenită din
talerul r - 1.

 In coloana cu talere, funcţionarea este

discontinuă; are loc o suită de operaţii de
punere în echilibru şi de transferări alternative,
faza mobilă deplasându-se cu un volum
corespunzător unui taler ( vi) la fiecare transfer.

3
 Numărul de talere teoretice (N) conţinute de coloană este strâns
legat de capacitatea de echilibru, determinând eficienţa coloanei.
în care:
2
 R
t
N  a 
W
- t = timp de retentie  
R
- w = latimea picului
- a = constantă ce depinde de înălţimea picului măsurat

Pentru a compara 2 coloane ce au lungimi diferite sau aceeaşi

coloană în condiţii diferite, se foloseşte HETP (Height Equivalent to a
Theoretical Plate):

în care :
- L = lungimea coloanei (cm).

 Un număr mare de talere teoretice (N) sau o valoare HETP mică

determină o eficienţă bună a coloanei.

4
 ECUAŢIA VAN DEEMTER

 Ecuaţia van Deemter:

- arată legătura între înăltimea talerelor teoretice şi viteza
procesului.
- descrie procesele de transport-difuzie, ce determinǎ deformarea
picului.
- indică modalitatea de obţinere a unei eficienţe maxime
respectiv o valoare HETP minimă în funcţie de viteza fazei
mobile.

5

Reprezentarea ecuaţiei lui van Deemter
H = A + B/v + Cv
 A, B, C sunt constante pentru o
coloana, un analit si conditii
experimentale date:
- A = difuziune turbulentă, determinata
de curgerea neuniforma a fazei mobile
prin coloana/faza stationara (structura
neuniformă a umpluturii)
- B = difuziunea longitudinală a
moleculelor fazei mobile
- C = coeficientul de rezistenţa la
transferul de masă în faza staţionară
- v = viteza de deplasare a fazei mobile
(cm.s-1).
6
Difuzia turbulenta:

- este data de particule solide mici, acoperite sau nu cu un film

subtire, cu forma si traiecte diferite de deplasare
- inaintarea neuniforma a analitilor ce trebuie separati
cromatografic produce turbulente care determina largirea zonei
in care se afla fiecare analit
- depinde de:
■ debitul fazei mobile
■ caracteristicile particulelor
■ calitatea materialului de umplutura

7
Difuzia longitudinala

- exprima influenta difuziunii moleculelor in directia de curgere a fazei

mobile
- depinde de:
■ capacitatea de curgere a fazei mobile
■ coeficientul de difuzie al analitului in faza mobila
■ vascozitatea fazei mobile
■ temperatura
■ masa moleculara a analitului.

8
Coeficientul de rezistenta

- corespunde rezistentei la transferul de masa

a) nu toate moleculele din faza mobila sunt antrenate cu aceiasi
viteza, conditiile de repartitie sunt diferite
b) contactul dintre faza mobila si stationara nu este identic peste tot
c) elutia nu se face cu aceiasi viteza pentru toate moleculele

9
 Dispersia zonelor
“cromatografia ideală” “cromatografia neideală”

zonele de concentraţie sunt echilibrul de distribuţie al solutului între faze

compacte şi se caracterizează prin:
solutul este întotdeauna
echilibru între cele două faze
echilibrul de distribuţie
instalează instantaneu
procesul de sorbţie
termodinamic reversibil
coloana cromatografică
uniformă
viteza fazei mobile este constantă
raportul dintre cele două faze
este acelaşi în toate punctele
coloanei
nu au loc fenomene de difuzie.
nu se atinge în mod instantaneu în toate
punctele coloanei, ci zona solutului suferă o
dispersare ca urmare a difuziei în faza mobilă
şi în faza staţionară
în
 faza mobilă curge întâmplător prin canale de
se lungimi diferite antrenând molecule de solut
cu viteze variabile;
este  asocierea la faza staţionară solidă
constituită din particule poroase a unei părţi
din faza mobilă lichidă care rămâne în
este micropori fixată poate participa la procesul de
separare mărind complexitatea sistemului;
 distribuţia fazei staţionare lichide sub formă
de film neuniform în jurul granulelor de suport
solid inert, conduce la acumulări de cantit ǎţi
variabile între granulele sau canalele capilare
ale suportului solid inert.

10
 Admiţând că dispersia respect ǎ legile de distribuţie întâmplătoare, curba de
distribuţie în coloană a speciei eluate sau curba de eluţie prezintă forma unei curbe
Gauss, simetrică în raport cu poziţia medie.

 Când curba este gaussiană

(simetrică):

- aria triunghiului este:

4Cmaxe-1/2 = 2,4265 Cmax

- aria curbei este:

 Difuzia are loc liber datorită

gradientului de concentraţie din
regiunea corespunzătoare unei
concentraţii mari (centrul zonei)
către regiunile de concentraţii
mici (zone periferice) conform legii
lui Fick.
Curba de distribuţie Gauss 11
 IZOTERME DE DISTRIBUŢIE

 Caracterul liniar şi neliniar al izotermelor de distribuţie se reflectă

în aspectul zonelor de concentraţie ale componenţilor separaţi pe
coloană sub forma curbelor de eluţie.

 Se consideră două concentraţii C1 şi C2 în faza mobilă. Valorile

corespunzătoare din faza staţionară adsorbantă sunt q1 şi q2

Izoterme de distribuţie
q - cantitate adsorbită pe unitate
de masă de adsorbant ;
c - concentraţie în faza mobilă

12
 Izoterma de sorbţie liniarǎ (izoterma I):
- pentru C2=2C1 cantităţile adsorbite vor
fi q2=2q1
- proporţionalitate între cantitatea de
substanţă sorbită şi concentraţia sa în
soluţie
- străbaterea coloanei cromatografice se
face cu o viteză independentă de
concentraţie.

13
 Izoterma de sorbţie convexă (izoterma II):
- pentru C2=2C1 cantităţile adsorbite vor fi
q2 < 2q1
- la concentraţii mai mari (C2), în soluţie
rămâne o proporţie mai mare de substanţă,
comparativ cu cantitatea corespunzătoare
concentraţiei mai mici (C1)
- substanţa va parcurge coloana cu viteză
mai mare la concentraţie mare şi cu viteză
mai mică la concentraţie mică.

14
 Pentru izoterma concavă (izoterma III):
- pentru C2=2C1 cantităţile adsorbite vor
fi q2 > 2q1
- viteza mare va corespunde
concentraţiei mici, deoarece la această
concentraţie există o proporţie mai mare
de substanţă în soluţie.

15
Dacă izoterma de distribuţie este:

● liniară, aspectul zonei de concentraţie se menţine neschimbat în

timpul deplasării de-alungul coloanei cromatografice.
● curba, zona de concentraţie îşi
schimbă aspectul în timpul deplasării
devenind nesimetrică, porţiunea
maximului de concentraţie a zonelor
deplasându-se mai :
- repede (izotermă convexă)
- încet (izotermă concavă) zona
primind un front abrupt sau prelungit.

 Izotermele de distribuţie liniare se

întâlnesc mai ales în cromatografia de
repartiţie şi în domeniul concentraţiilor
mici în cromatografia de adsorbţie. Cel
mai frecvent tip de izotermă este cel
convex, iar cel mai rar cel concav.
16
 TEHNICI DE ELUŢIE

 Separarea prin eluţie este unul dintre procesele de adsorbţie-

extracţie ce are loc continuu din momentul injectării probei în
sistemul de distribuţie până la ieşirea din coloană.

 Reprezentarea grafică a concentraţiei solutului atât în faza mobilă

cât şi în cea staţionară este de tip Gaussian.
 Echilibrul între cele 2 faze
se stabileşte când
probabilitatea unei molecule
de solut de a pătrunde în
faza stationara este aceeaşi
cu probabilitatea moleculei
de solut de a avea suficientă
energie cinetică pentru a
părăsi faza staţionară şi a
intra în faza mobila.

Eluţie izocratică
Eluţie în gradient
Eluţia solutului într-un sistem cromatografic Procedeul frontal
Procedeul deplasǎrii
17
1.Eluţia izocratică
 Condiţiile cromatografice se menţin constante pe parcursul
experimentului.

 Această tehnică este posibilă numai în cazul unui amestec cu număr

redus de componenţi.

 Fiecare component al probei trece prin coloană cu o viteză constantă

specifică şi determinată de concentraţia solventului organic al eluentului.

Efectul unor
concentraţii
diferite de
solvent
organic

18
 Cu cât coloana este mai lungă şi distanţa dintre picuri este mai
mare si picurile probei se lărgesc în acelaşi timp.

 O coloană mai lungă, întotdeauna va determina o rezoluţie mai

bună. Este necesar să se mărească lungimea coloanei de 4 ori
pentru a dubla rezoluţia.

 Eluţia izocratică este necorespunzătoare pentru separarea

probelor care conţin mulţi componenţi cu coeficienţi de distribuţie
cu valori încadrate pe un interval larg.

 Pentru realizarea unei separări bune în aceste condiţii trebuie

ales un eluant cu putere de eluţie corespunzătoare pentru toţi
componenţii.

19
 Schema de eluţie a unui amestec de 6 compuşi
 Când se foloseşte un solvent cu putere de eluţie slabă (E1) se
separă bine componenţii 1 şi 2, cu un volum prea mare componenţii
3 şi 4 şi nu se desprind de pe coloană compuşii 5 şi 6.
 Dacă se foloseşte un solvent puternic (E2) cu putere de eluţie prea
mare, componenţii 1 - 4 nu se separă, dar compuşii 5 şi 6 sunt bine
separaţi.
20
• Când se foloseşte amestecul
E1 + E2 cu putere de eluţie
medie se obţin separări
intermediare bune dar nu se
separă componenţii 1 şi 2 şi se
eluează componenţii 5 şi 6 într-
un volum prea mare.
• Rezolvarea se face prin aşa-
numita “eluţie în etape“ când se
adaugă eluenţi diferiţi în mod
discontinuu cu o putere de
eluţie crescătoare (E1 urmat de
E1 + E2 şi apoi E2).
• Se recomandă aplicarea acestei
metode numai în cazul probelor
cu izoterme liniare şi de
compoziţie cunoscută pentru a
decide uşor când trebuie
schimbat solventul.

21
2. Eluţia în gradient

 Puterea de eluţie a solventului care intră în coloană se schimbă

mereu.

 Se realizează cu doi solvenţi, unul slab şi altul puternic. Aceştia

sunt amestecaţi în proporţii treptate astfel încât primul solvent
care părăseşte dispozitivul să fie cel slab E1, în timpul separării
eluentul devine în mod progresiv mai bogat în E2, iar la sfârşitul
separării solventul care părăseşte dispozitivul să fie numai E2 pur.

 Metoda are următoarele avantaje:

 este posibil să se separe componenţii cu proprietăţi sorbtive
foarte diferite într-o singură operaţie
 se obţin picuri de eluţie strâmte şi înalte datorită linearizării
izotermelor de distribuţie sub efectul gradientului
picurile de eluţie sunt mai apropiate datorită aplatizării
izotermelor de distribuţie
 se evită pierderea vreunui component
 diagrama de eluţie este uşor interpretabilă deoarece un
component apare într-un singur pic.

22
 Prezentarea comparativă a separării unui amestec de 16 aminoacizi

 Alte procedee de eluţie:

o eluţia cu debit programat (se modifică debitul în timpul separării);
o eluţia cu temperatură programată;
o eluţia în gradient de fază staţionară sau având coloane umplute
cu faze staţionare cu polarităţi diferite.

23
 3.Procedeul frontal
 Acest procedeu constă în trecerea soluţiei de analizat prin coloana
cromatografică, nefiind necesar un solvent de developare. Se
determină concentraţia de solut în eluent, se reprezintă această
mărime în funcţie de volumul de eluent şi se obţine o curbă în
trepte.

• Prima treaptă conţine

Diagrama analizei frontale
componentul 1, treapta a doua
conţine componentul 1 şi 2 şi
astfel până la n componenţi.
• Se obţine o separare individuală
doar a componentului cu
afinitatea cea mai slabă pentru
faza staţionară. După acesta,
fiecare treaptă corespunde unui
amestec binar, ternar, până la
soluţia iniţială.
• Metoda nu prezintă un interes
deosebit, informaţiile obţinute
referindu-se mai mult la numărul
componenţilor din probă 24
 4. Procedeul deplasării
 Metoda este eficientă doar când faza staţionară este solidă şi soluţii
sunt adsorbiţi la suprafaţa ei, în funcţie de afinitate.

 În coloană este introdusă o moleculă numită deplasant (“displacer”) ce

deplasează soluţii de faza staţionară. În această situaţie, molecula
deplasant determinǎ zone de concentraţii mari în solut, adiacente
frontului deplasant.
 Se numeşte agent de deplasare ideal acea substanţă care introdusă în
orice concentraţie CD determină o linie de viteză care intersectează
izoterma solutului. În caz contrar, deplasantul este neideal şi se constată
impurificarea treptei următoare sub forma unui pic de eluţie.

 În zonele concentrate, soluţii intră în competiţie pentru locurile de la

suprafaţa fazei staţionare. Componenţii cu afinitate mare pentru
suprafaţa fazei staţionare se ataşează în locul celor cu afinitate mică. Pe
măsură ce frontul deplasant traversează coloana, împinge soluţii, iar
competiţia între aceştia este continuă.

 In final componenţii se separă în zone adiacente şi distincte.

25
 Substanţele cu izoterme liniare nu pot
fi separate prin această metodă deoarece
nici o linie de viteză nu le intersectează.

 Ipotezele care stau la baza metodei

conduc la concluzia că, fiecare treaptă
cuprinde numai component pur.

 Totuşi, s-a constatat uneori că un

solut se află parţial şi în treapta
următoare. Această contaminare rezultă
din influenţa reciprocă dintre deplasant
şi solutul considerat.
 Pentru a evita contaminarea zonelor
componenţilor separaţi se recomandă
folosirea unor substanţe intermediare,
care să aibă în condiţiile precizate
izotermele de distribuţie intercalate între
cele corespunzătoare componenţilor
amestecului de analizat.
 Aceste substanţe se aleg astfel încât
să poată fi eliminate ulterior prin metode
simple, ca volatilizarea. Ex: la separarea
aminoacizilor s-au folosit ca intermediari
alcoolii. 26
CROMATOGRAFIA PLANARĂ (pe coloana deschisa):
- Cromatografia pe hârtie
- Cromatografia pe strat subţire
- Cromatografia pe strat suprapresurizat
- Cromatografia planarǎ multidimensionalǎ

CROMATOGRAFIA PE COLOANA (pe coloana inchisa):

- Cromatografia de lichide de inalta performanta
- Cromatografia prin schimb ionic
- Cromatografia de excludere
- Gaz-cromatografia
- Cromatografia cu fluide supercritice

27
 CROMATOGRAFIA PLANARA (CP)
PLANAR CHROMATOGRAPHY (PC)

 Cromatografia planară (CP, cromatografia pe pat/coloană deschis ǎ) – include:

 cromatografia pe hârtie
cromatografia pe strat subţire.
 Este probabil cea mai accesibilă metodă cromatografică, ce necesită pentru
funcţionarea de bază doar suportul, solventul şi un recipient adaptat să conţină cele
două elemente precedente pentru a realiza developarea.
 Este o metoda simplǎ, robustǎ, rapidǎ şi necesită doar mijloace modeste de
echipament, de resurse şi de personal calificat.
 Este utilizata pentru analiza calitativă şi semi-cantitativă.
 Într-o manieră contradictorie, având în vedere că poate fi pusă în lucru atât de uşor,
CP a câştigat stigmatul unei metode de rezoluţie, si sensibilitate scazuta şi incapabilă
de a răspunde la problema punerii la punct a metodelor precise, exacte şi specifice.
 Un astfel de punct de vedere este incorect şi poate fi comparat cu imposibilitatea
obţinerii de rezultate sensibile şi cantitative în HPLC, bazându-ne doar pe experienţa
câştigată prin cromatografia pe coloană.
 Mai clar, se poate spune că, atunci când este prost utilizată, CP instrumental ǎ dă
rezultate proaste şi acesta este singurul motiv pentru care dezvoltarea tehnicilor
specifice pentru CP a început cu întârziere, în raport cu alte tehnici cromatografice.

28
 CROMATOGRAFIA PE HÂRTIE
PAPER CHROMATOGRAPHY (PC)
 
 Cromatografia pe hârtie este o metodă fizico-chimică de separare şi identificare a
unor amestecuri de substanţe, bazată pe repartiţia lor diferită între:
 faza staţionară - hârtia cromatograficǎ şi lichidul fixat pe ea
 fază mobilă - un solvent sau amestec de solvenţi organici şi anorganici.

 O separare cromatografică depinde în mare măsură de modul cum s-au ales cele
două faze.

 In hârtia cromatografică, datorită structurii fibroase, există goluri, iar celuloza care
formează faza staţionară prezintă suprafeţe de ordinul 600 m 2/g.

 Datorită structurii poroase este posibilă ascensiunea capilară a solventului şi

separarea componenţilor.
29
 Hârtia cromatografică obişnuită nu se poate folosi la separările de
substanţe grase, alcaloizi, proteine, etc. Pentru aceste scopuri se foloseşte
hârtia cromatograficǎ hidrofobizată sau celuloza modificată chimic.

30
 Caracteristicile unor sorturi comerciale de celuloză schimbătoare de ioni

 Prin grefarea pe lanţul macromolecular al celulozei de grupări ionizabile

s-a obţinut celuloza schimbătoare de ioni, caracterizată printr-o mare
capacitate de schimb. Grupările ionizabile se găsesc pe suprafaţa reţelei
macromoleculare şi din acest motiv asigură o adsorbţie mărită faţă de
proteine, acizi nucleici etc.
 Pentru separarea în bune condiţii a unor clase de substanţe se aplică
impregnarea hârtiei cu soluţii tampon, acizi, baze, lichide polare sau
nepolare, agenţi de complexare, săruri ale metalelor grele (Ag +, Cu2+, Pb2),
agenţi de precipitare, acid silicic (pentru separările lipidelor polare, hidraţilor
de carbon şi a fosfolipidelor), o altă fază staţionară (lărgeşte posibilităţile de
separare a substanţelor anorganice şi organice).
31
 In separările cromatografice, ca faze mobile se folosesc serii de solvenţi
organici şi compuşi anorganici.

 Pentru toate tipurile de cromatografie s-a încercat să se facă o clasificare

a solvenţilor, dupa:
 tăria relativă - grupându-i în ordinea puterii de eluţie
 tensiunea superficială dintre solvent şi faza staţionară.

Exemple de solvenţi utilizati în cromatografia pe hârtie:

 alcooli: amilic (n- şi izo-), butilic (n-, izo-, terţ-), etilic, metilic, propilic
(n-, izo-)
 cetone: acetona, acetilacetona, etilizopropilcetona, metiletilcetona
 esteri: acetat de etil, formiat de etil
 eteri: eter etilic, dioxan
 acizi organici: acid butiric, acid formic, acid propionic, acid acetic
 baze organice: dietilamină, nicotină, piridină
 alţi solvenţi: tetrahidrofuran, benzen, toluen, xilen (o, m, p), ciclohexan.
 
32
 CLASIFICARE

 După sensul de migrare al fazei mobile:

 radială, circulară sau pe discuri
 orizontală
 ascendentă
 descendentă

 După direcţia de migrare a sistemelor:

 unidimensională
 bidimensională

33
34
Cromatografie unidimensionala (ascendentă)

Cromatografie bidimensională (foloseşte unul sau doi solvenţi)

35
Cromatografie circulară

http://www.youtube.com/watch?v=EnSW3Ywg7gc

Cromatografie anticirculară

36
Detectia
Detectia dupa migrare poate fi:
Vizuala
Instrumentala

Detectia vizuala:
o Detectie chimica:
- directa pentru compusii colorati
- dupa pulverizarea unui reactiv capabil sa reactioneze cu moleculele
separate pentru a da substante colorate
Exemple de reactivi:
● iodură de platină
● verde de bromcrezol
● brom - amidon - iodură de potasiu
● diazotare şi cuplare cu -naftol
● p-nitroanilină diazotată (în mediu bazic)
● p-dimetil-aminobenzaldehida
● reactivul Dragendorff
● vapori de iod
● reactivul Marquis
● reactivul Millon
● ninhidrină
● permanganat de potasiu
37
o Detectie fizica:
- examinare in lumina UV

 Detectia instrumentala
o Detectie densitometrica
o Banda de hârtie se decupează, se extrage cu un solvent adecvat şi
se analizează printr-o metodă adecvată: refractometric,
spectrofotometric etc.

38
 APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI PE HARTIE

 Separarea si identificarea substanţelor medicamentoase. Ex:

 Separarea si identificarea fenobarbitalului si difenilhidantoinei
din tablete (FS: Whatman 1, FM: amoniac 10 %: apa:butanol –
70:30:100, Detectie: sulfat de mercur (II))

 Identificarea si determinarea puritatii substanţelor

medicamentoase. Ex:
 Identificarea si determinarea puritatii ergometrinei maleat (FS:
hartie Schleicher-Schull 2043/b impreganata cu dimetil-
ftalat:cloroform - 1:9, FM: formamida: hidroxid de potasiu 0.1 N
impregnat cu demetilftalat (2:8), Detectie: imersare in
paradimetilaminobenzaldehida 0.5 % in cloroform:ciclohexan –
1:19)

 Alte exemple:
- Identificarea gentamicinei sulfat
- Identificarea vancomicinei clorhidrat
  39
 CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBŢIRE (CSS)
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC)
 
Principii generale
 În procesul cromatografic intervin legături intermoleculare de energie slabă :
 forţe van der Waals
 legăturile de hidrogen

Mecanismul adsorbţiei
 Dacă se pune în contact un lichid cu o suprafaţă solidă, la interfaţă se formează
un strat monomolecular, care rezultă ca urmare a adsorbţiei moleculelor de solvenţi
sau de soluţi: interacţiunile intermoleculare solid-lichid sunt mult mai intense decât
interacţiunile intermoleculare lichid-lichid pentru o moleculă, aceasta se adsoarbe,
stabilizând sistemul. Acest proces continuă până la stabilirea unui echilibru.
 O moleculă de solut poate fi adsorbită de un adsorbant prin intermediul forţelor
descrise anterior. În cursul cromatografierii, solutul fixat pe adsorbant este deplasat
de către solvent.
Modelul de deplasare se scrie astfel:

nMsolv + Xads ↔ Xsolv + nMads

 Constanta k a acestui echilibru este evident analogă constantei k ads a solutului pe
adsorbant, în prezenţa aceluiaşi solvent.
 După cum se ştie, distribuţia solutului între cele două faze conduce procesul
cromatografic şi se va putea prevedea retenţia, plecând de la valoarea lui K ads.
40
 Migrarea prin capilaritate a eluantului cu traversarea adsorbantului
antrenează selectiv soluţii. În funcţie de natura chimică:
 solutii care au energie de adsorbţie mare sunt puternic fixaţi si sunt
puţin antrenaţi de către eluant → migrează puţin.
 soluţii care au energie de adsorbţie mică - fenomenul invers.

 Principiul CSS - probele sunt separate prin migrarea eluantului prin

faza stationara.

 Faza staţionară sau adsorbantul este în general ales un gel de silice.

Legăturile care se stabilesc se datorează grupărilor silanol libere. Alti
adsorbanţi: alumina, celuloza, kieselgur, poliamida, silicat de magneziu,
etc

 Faza mobilă sau eluantul este un solvent uzual (sau un amestec de

solvenţi), caracterizat prin forţa eluantă, εo.

 Dacă adsorbantul rămâne acelaşi, migrarea unui compus depinde

exclusiv de natura eluantului (forţa sa eluantă), ceea ce induce
posibilitatea unei reproductibilităţi a rezultatelor pentru un eluant dat.

41
 MĂRIMI FUNDAMENTALE

 Fenomenul de adsorbţie în strat subţire poate fi considerat ca o

tehnică de separare a compuşilor dintr-un amestec.
 Fiecare cromatogramă obţinută cu acelaşi adsorbant, acelaşi eluant şi
în condiţii experimentale identice prezintă acelaşi aspect: fiecare compus
migrează în acelaşi mod.

 Astfel, este posibil pentru un sistem cromatografic dat, să se

caracterizeze un solut (substanţa dizolvată) prin distanţa pe care o
parcurge în raport cu frontul de solvent.

 Factorul de retentie:
 variaza invers proportional cu raportul de distributie si este cuprins
intre 0 si 1.

42
 DESFÃŞURAREA PROCESULUI CROMATOGRAFIC

Placa, faza staţionară

 În CSS, plăcile sunt constituite dintr-un suport inert rigid sau flexibil
(placă de sticlă, foiţa de aluminiu, etc.), pe care faza staţionară este depusă
sub forma unui strat subţire (grosimea între 200 şi 250 m).
 Stratul subţire depus se amestecă cu lianţi minerali sau organici pentru
a asigura adeziunea pe placa cromatografică.
 Dimensiunile obişnuite ale suprafeţei stratului sunt:
- 10 x 5 cm
- 10 x 10 cm
- 10 x 20 cm
- 20 x 20 cm.

43
Plăcile flexibile
sunt constituite din 90 ± 2 % de fază (silice, C 18...) inclusă într-o matrice
de poli[tetra]fluoretilena care îi conferă o mare plasticitate şi posibilitatea
decupării normale (cu un foarfece)
 mărimea porilor de silice: 60 Å
 grosimea stratului: 0,2 mm
 diametrul particulelor: 8 m
 au o capacitate de adsorbţie mult mai mare decât plăcile clasice (utilizare
în mod analitic şi preparativ).
 In afara plăcilor clasice ale cromatografiei pe strat subţire se folosesc plăci
HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography):
 dimensiuni: 10 x 10 cm sau de 10 x 5 cm
 diametrul particulelor: este mult mai mic
 grosimea stratului adsorbant: 100 m (200-250 m în cromatografia
clasică)
 suportul: silicagel ca în cazul cromatografierii cu faze normale sau cu Si-
C8 sau Si-C18 în cromatografia cu faze inverse
 distanţa de migrare: 3-5 cm
 spotarea: automat
 timpul necesar unei analize: scurt
 scanarea: UV-VIS sau prin fluorescenţă cu ajutorul densitometrelor. 44
Depunerea eşantionului (spotarea)

 În CSS clasică:
 capilar sau seringa, la o distanţă mică (în general 1 cm) de extremitatea
stratului
 volumul depus este foarte mic şi trebuie de avut grijă ca stratul de fază
staţionară să nu se deterioreze cu extremitatea seringii sau a capilarului.

-capilare mici 10 - 500 nl

-seringi 10 nl - 100 l.

 Depunerea ideală: 0,5-5 l în CSS, 50 - 500 nl în HPTLC (monoplăci).

 capilare cu vârf confecţionat din siliciu – 10 nl.

 Spotarea se face în soluţia unui solvent, a cărui forţă

eluantă să fie mai slaba decât cea a solventului de
developare.

45
 Din punct de vedere comercial sunt disponibile aparatele semi- sau
automate de spotare a probei:

 Nanomat; pipeta este coborâtă spre stratul fazei staţionare prin acţiunea
unui magnet. Volumele depuse sunt de 100-200 nl şi repetabilitatea
depunerii este de ordinul 1 %.

 Linomat(Camag); metodă semi-automatǎ de spotare prin pulverizare pe

benzi înguste.

 În cazul unei serii mai mari, operaţia poate fi automatizată total cu

ajutorul unui depunător automat de eşantionare, capabil să spoteze de la
100 nl până la mai mulţi l, cu o precizie de 1 %.
46
Developarea plăcilor
Placa este plasată într-o cuvă (bac) de developare, conţinând solventul (sau
amestecul de solvenţi) ce constituie faza mobilă.

47
Ascensiunea capilară

 Stratul poros poate fi asimilat cu o multitudine de mici capilare

interconectate şi lichidul urcă pe strat umplând capilarele cele mai
mici.

 Se constată experimental că, relaţia între distanţa parcursă de

către frontul de solvent şi timp este direct proportionala.

48
 Influenţa fazei gazoase asupra vitezei ascensiunii în capilare

 Legea de mai sus nu este respectată, când cuva de developare are dimensiuni
mult mai mari decât cele ale plăcii. Aceasta se datorează faptului că, o parte a
fazei este în contact cu atmosfera cuvei.

 Influenţa fazei gazoase se manifestă in mai multe moduri:

 evaporarea solventului
 adsorbţia vaporilor solventului de către stratul uscat

 Aceste 2 fenomene au loc concomitent. Atenuarea unuia din aceste efecte nu

se poate controla mai ales când e vorba de amestecuri de solvenţi.

 O placă de silicagel uscată absoarbe 10 % apã din greutatea sa (când este

situată în atmosfera ambiantă).

 Singura soluţie constă în a reproduce exact toate operaţiunile efectuate în

timpul unei cromatografieri.

 Pentru evitarea influenţei vaporilor solvenţilor, se utilizeazã cuve

„sandwich”: O placă de suport inert (sticlă etc.) este aşezată paralel la o
distanţă de câţiva mm faţă de placa cu solutul de analizat; ca urmare a
căldurii de adsorbţie se evită transformarea solvenţilor volatili în picături.
49
 METODE DE DEVELOPARE ÎN CROMATOGRAFIA PLANARA

 Unele metode de developare în cromatografia pe strat subţire sunt

identice cu cele descrise la cromatografia pe hârtie.

 Developarea liniară
 ascendenta
 descendenta
 orizontala - solventul ajunge din 2 părţi opuse ale plăcii printr-o fantă
capilară. Procesul de developare se opreşte când cele 2 fronturi se întâlnesc.
Avantajul acestui sistem este că, permite ocuparea totală a stratului de
adsorbant şi dublarea numărului de eşantioane pe care le putem analiza.

Developarea circulară
faza staţionară este dispusă orizontal, faza mobilă ajunge până la centrul
plăcii şi se distribuie uniform prin capilaritate, ceea ce produce un spot
circular care creşte dacă se continuă alimentarea solventului.

Developarea anticirculară
faza mobila migreazǎ de la periferie spre centrul plăcii. Practic, un canal
foarte strâmt înconjurǎ placa, este umplut de faza mobil ǎ şi transferul 50pe
strat este realizat prin capilaritate.
Sisteme cu flux forţat (la presiune)
Sistemul caută să împrospăteze capilaritatea şi în acest fel sã domine
faza mobilă. Scopul imediat este câştigarea de timp şi de a ajunge la un
sistem de cvasicoloană.

Utilizarea forţei centrifuge

 Migrarea solventului este în funcţie de viteza de alimentare a fazei
staţionare.
 Viteza maximă permisã este definită de cantitatea de lichid ce poate
alimenta stratul fără a inunda suprafaţa.

51
Faze polare negrefate
 În mod tradiţional, CSS era pusă în lucru cu ajutorul unei
game limitate de faze staţionare (gel de silice, alumină, celuloză,
poliamidă, fixate pe plăci de sticlă sau foi de aluminiu sau de
plastic).

52
Faze polare grefate

 Curent, sunt utilizate 3 tipuri de faze: amino, cian şi diol.

 Migrarea solvenţilor este rapidă şi plăcile nu sunt sensibile la umiditate
(cum sunt suporturile anorganice polare).
 Faza amino posedă proprietăţi de schimbători de ioni.
 În cursul utilizării fazelor hidroorganice cu faze cian, este recomandată
utilizarea unei sări dizolvante în faza mobilă pentru ameliorarea transferului
de masă.

53
Faze slab polare sau nepolare grefate

 Datorită progresului fazelor de silice grefate folosite pentru HPLC, a

apãrut o gamă de plăci cu silice, având grefate structuri chimice de tip C 18,
C12, C8, C2, difenil, agenţi de complexare chiralici, destinate separării
formelor enantiomere de aminoacizi etc.
 Gama fazelor grefate este totdeauna relativ limitată, în comparaţie cu cele
disponibile pentru HPLC, dar este într-un progres continuu. Introducerea
acestor faze de silice grefate a condus la un nou interes pentru CP cu fază
inversă (Reverses Phase Chromatography –RPC).

54
FAZE STAŢIONARE

Silicea/gel de silice/silicagel
(acid ortosilicic polimerizat)

55
Tip silicagel Marimea Suprafata Volumul porilor Marimea pH
porilor nm (Ǻ) specifica (m2/g) (ml/g) particulelor

Silicagel 40 4 (40) ~ 600 0.6 63-200 6.5

Silicagel 60 6 (60) ~ 500 0.8 40-63 7.0
Silicagel 100 10 (100) ~ 360 0.8 63-200 7.0

56
Modificări chimice ale silicei
 Se introduc radicali alifatici C2-C18, grupǎri diolice, CN etc.

57
Alte modificǎri:

Esteri

Legǎturi Si-C
Legǎturi Si-N

58
Siloxani

Monomeri organici (a), polimeri (b)

59
Alumina (oxid de aluminiu, Al2O3)
Proprietăţile adsorbtive au fost atribuite grupelor hidroxil
superficiale.
 Toate substanţele organice (excepţie fac hidrocarburile alifatice)
sunt adsorbite de alumină:
 compuşii neionici care au grupe donoare de protoni sunt adsorbiţi
prin legături de hidrogen
 hidrocarburile aromatice sunt adsorbite pe atomii de aluminiu prin
legăturile .
Alumina acidă şi bazică funcţionează ca schimbători de ioni.

In vederea obţinerii unor rezultate reproductibile a fost necesară o standardizare

a gradului de activare. Brockmann şi Schoder au definit 5 grade de activare în
funcţie de conţinutul de apă adsorbită. S-au ales 5 coloranţi standard (azobenzen,
p-metoxidiazobenzen, galben Sudan, roşu Sudan şi p-aminoazobenzen) şi în funcţie
de ei s-au definit gradele de activare: I, II, III, IV, V corespunzătoare la 0, 3, 6, 10 şi
15% conţinut în apă.
60
 Kieselgur

 reprezintă pământul de infuzorii ce se găseşte în natură sub formă de

zăcăminte provenind din scoici microscopice de diatomee.
 este constituit din dioxid de siliciu cristalizat (kieselsaϋre)
 structura poroasă îi oferă posibilităţi adsorbante
 este folosit în separările cromatografice de repartiţie când este impregnat
cu substanţe hidrofile sau lipofile
 este un adsorbant inactiv deoarece are o suprafaţă specifică foarte mică
(aproximativ 1 m2/g) şi pH neutru.
 Kieselgurul folosit în cromatografia pe strat subţire este de o calitate
specială, de o puritate avansată şi cu mărimea particulelor de 10 m.
 Tipuri de kieselgur folosit în cromatografia pe strat subţire: Kieselgur G-
Merck, Celite 545-John Moville (SUA), Kieselgur G-B.D.H.

61
 Hidroxidul de magneziu

 se aseamănă în proprietăţi cu oxidul de aluminiu, faţă de care prezintă unele avantaje şi

dezavantaje:

 Avantaje:
 capacitate de adsorbţie mai mare
 mai puţin sensibil la activare
 straturile au o bună rezistenţă mecanică chiar fără liant.

 Dezavantaje:
 reacţionează cu iodul împiedicând astfel identificarea unor substanţe
 este mai uşor deshidratat de către solvenţii anhidri
 este solubil în alcool etilic.

 Preparate de hidroxid de magneziu mai des utilizate: Sea Sorb-43- Fischer; Magnesia-
West Vaco; hidroxid de magneziu Fischer.

Silicatul de magneziu

 principalele preparate din silicat de magneziu: silicat de magneziu - Woelm;

adsorbosil-M-1-A.S.L.(A.D.M.-1), adsorbosil M-2-A.S.L. (A.D.M.-2), silicat de magneziu-
M-1-Bio-Rad. Lab. (SUA).
 se utilizează într-o formă alcalină cu pH = 9,8 şi o formă neutră cu pH = 7,5.
62
 
 Pulberea de celuloză

 Celuloza se caracterizează prin:

 un numar foarte redus de grupe OH libere, acestea fiind antrenate în
legături de hidrogen care unesc diferite agregate structurale între ele.
 un numar mare de canale şi goluri în care se pot adsorbi uşor solvenţi
polari capabili de a diminua legăturile de hidrogen sau de a forma la rândul
lor legături de hidrogen cu grupele OH. Are loc o lărgire a canalelor ceea ce
duce la creşterea capacităţii de pătrundere a solvenţilor şi a formării fazelor
staţionare lichide în acest suport.
 calităţi excelente de suport pentru cromatografia de repartiţie lichid -
lichid datorita capacitatii mari de a reţine apa şi solvenţii polari.

 Preparate din celuloză: pulbere de celuloză-D.O.-Camag, pulbere de

celuloză-D.F.O.-Camag, pulbere de celuloză 65-Schleicher-Schull, Celex
D(DEAE)-Bio Rad. Lab. (SUA), Celuloza ECTEOLA 67-Schleicher-Schull,
Selectacel CM 68-Schleicher-Schull, Celuloză-CM-Serva, Celuloza M.N.-
300,300 G, Celuloza M.N.-300-PEI (schimbător anionic), Celuloza M.N-300-
Poly-P (schimbător anionic).
63
 Poliamida (-CO-NH-)

 Este un polimer sintetic obţinut prin polimerizarea lactamelor sau

policondensarea acizilor graşi cu amine alifatice.
 Grupele C=O şi NH ale poliamidei din interiorul polimerului formează
legături de hidrogen prin intermediul cărora lanţurile sunt legate între ele.
Aceleaşi grupe de la suprafaţa polimerului rămân libere şi joacă un rol
important în adsorbţia produşilor care trebuie separaţi.
 O poliamidă folosită în cromatografia planară este Poliamida 6 (6(poli-[-
aminocaprolactama]) cu o granulaţie de 5-20 m.
 Poliamida este folosită cu succes în separarea compuşilor cu structură
fenolică. Aceştia sunt relativ puternic adsorbiţi datorită legăturilor de
hidrogen care se pot forma între fenoli, ca donori de protoni şi grupa C=O
amidică ca grupă acceptoare de protoni. Substanţele care au grupe
acceptoare de protoni pot fi mai slab adsorbite prin formarea de legături de
hidrogen cu grupa NH amidică ce funcţionează ca grupă donoare de protoni.
 Preparate de poliamidă: poliamidă M.N.; poliamidă Merck.

64
 Sefadexul

 Este dextran de origine bacteriană caracterizat prin punţile

transversale de 1, 3 - gliceril - ester.
 Se folosesc diferite tipuri de sefadex (mai ales site moleculare), notate
G10, G25, G75, G100, G200, care diferă între ele prin gradul de polimerizare şi
prin numărul punţilor transversale. Numărul mare de legături
transversale duce la obţinerea unor ochiuri cu diametrul mic, ceea ce
conferă proprietăţi selective în separarea substanţelor cu moleculă mare
sau mică. Sefadexul se foloseşte în cromatografia pe strat subţire pentru
încercări preliminare şi orientative pentru transpunerea separărilor pe
coloană.
 Tipuri de sefadex utilizate mai des: Sephadex G-25; Sephadex G-50;
Sephadex G-75; Sephadex G-100; Sephadex G-200.
Se cunosc sefadexuri modificate chimic ce funcţionează pe principiul
schimbătorilor de ioni cu mărimea particulelor cuprinsă între 20-300 .

65
Alţi adsorbanţi utilizaţi în cromatografia pe strat subţire:

 oxidul de magneziu, oxidul de bismut,

 silicaţii de calciu şi aluminiu,
 carbonaţii de calciu, magneziu, zinc,
 fosfaţii de calciu şi magneziu,
 sulfatul de calciu,
 cărbunele activ,
 polietena,
 polivinilpirolidona,
 amidonul,
 schimbătorii de ioni.

66
FAZE MOBILE

 Solvenţii utilizaţi pentru optimizare în cromatografia planară, clasaţi funcţie de forţa eluotropă faţă de n-hexan.

67
 DETECŢIA
ANALIZA CALITATIVA
Detectarea vizuală

 Placa este iluminată printr-o sursă convenabilă:

 lumina albă permite reperarea substanţelor colorate,
 lumina ultravioletă permite vizualizarea substanţelor fluorescente atunci când ele
sunt iluminate la aceste lungimi de undă.

 Pentru facilitarea detectării, se amestecă un indicator fluorescent cu stratul de

adsorbant. Acesta poate fi o sare anorganică ce dă plăcii o culoare galbenă (acetat de
uranil) sau galben verzuie (silicat de zinc). Cea mai utilizată este o sulfură mixtă de
zinc şi cadmiu fluorescent la 254 nm de unde şi denumirea de F 254. Alte săruri sunt
în general fluorescente la 366 nm (sarea de sodiu a 5,8,10-trisulfonat-hidroxi-3-piren).

 Alte substanţe utilizate: rodamina B, dicloro-2,7-fluoresceina şi derivaţi de stilben, o

sare de tungsten şi sodiu.

Compuşii apar sub formă de pete pe fondul luminos prin diminuarea fluorescenţei.

68
 Sursele luminoase

 Pentru a acoperi gama de 200-800 nm sunt utilizate două seturi de

lămpi:
 lampi care emit un spectru continuu:
o lămpi de halogen sau tungsten (VIS - 400-800 nm)
o lămpi cu deuteriu (UV - 200-400 nm)
o lămpile cu xenon - posedă un maximum de energie către 550 nm
 care emit un spectru discontinuu
o lămpi cu vapori de Hg cu presiune scăzută - 254 nm
o lămpi cu vapori de Hg cu presiune înaltă - 313-436 nm

 Selectarea lungimilor de undă dorite se realizează cel mai frecvent cu

ajutorul filtrelor. În fluorescenţă se foloseşte un monocromator. Un filtru
plasat între detector şi placă permite eliminarea lungimilor de unda
nedorite.

69
Formarea de derivaţi pre sau post cromatografic

 Când solutul nu posedă nici o grupare cromoforă susceptibilă de a

permite o detecţie spectrofotometrică, solutul se transforma printr-o
reacţie cu un reactiv specific. (Această etapă poate fi realizată înaintea
cromatografierii).

 Alte tehnici: impregnarea cu un solvent care nu trebuie să altereze

cromatograma. Ex: impregnarea plăcilor cu ulei de parafină permite
exaltarea semnalelor luminoase (până la de 100 ori).

 Derivaţii fluorescenţi sunt obţinuţi prin expunerea la vapori de

amoniac.

 Utilizarea unei soluţii de eluant în care este dizolvat reactivul. Ex:

ninhidrina pentru detectarea acizilor aminaţi, fluorescamina pentru
amine biogenice şi proteine.

 Reactivul poate fi prezent în faza staţionară. Nu trebuie confundat cu

indicatorul de fluorescenţă al plăcilor. Ex: utilizarea unei sǎri de
zirconiu permite detectarea unor estrogeni.
70
Metoda cea mai raspandita este formarea derivaţilor
după cromatografiere. Tehnica cea mai comună
constă în a pulveriza un reactiv pe placa uscată şi
lipsită de solvent.
Expunerea placii la vapori de iod.
Pulverizarea de solutii caustice, urmata de incalzirea
la 110 0C sau de reactivi diversi, formand compusi
colorati

ANALIZA CANTITATIVA
 În scop cantitativ evaluarea conţinutului în substanţa activă de pe
placa cromatografică se face:
• cu ajutorul detectorilor densitometrici (fotodensitometre): scannere care
măsoară intensitatea luminii absorbite sau reflectate de spoturile
cromatografice. Intensitatea acestora se înregistrează sub formă de
curbă care se manifestă sub formă de picuri a căror arie se foloseşte
pentru calcularea concentraţiei.

dupa razuirea spotului de pe cromatoplaca, dizolvarea componentei intr-

un solvent convenabil si masurarea absorbantei spetrofotometric.

• http://www.youtube.com/watch?v=rbp_Qc4jMAc
71
 Detecţia prin fotodensitometrie
– permite obţinerea unei fotodensitograme

72
 APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI PE STRAT SUBTIRE

 Separarea si identificarea substanţelor medicamentoase

 Separarea si identificarea acidului acetilsalicilic, paracetamolului si
cafeinei din comprimate
-Faza stationara: Silica gel 60 F254
-Faza mobila: acetat de etil
-Detectie: 254 nm
-Rf aspirina = 0.76, Rf paracetamol = 0.53, Rf cafeina = 0.25, Rf proba 4 =
0.23; 0.52; 0.90

1 – acid acetilsalicilic
2 – paracetamol
3 – cafeina
  4 – amestec

73
Separarea si identificarea ibuprofenului si a cafeinei din comprimate
- Faza stationara: Silica gel 60 F254
- Faza mobila: acetat de etil:etanol:acid acetic (25:1:1)
- Detectie: 254 nm
- Rf ibuprofen = 0.91, Rf cafeina = 0.23, Rfproba = 0.24; 0.93
 

1 – ibuprofen
2 – cafeina
3 - amestec

 Alte exemple: separarea, identificarea si determinarea cantitativa a

principiilor active din forme farmaceutice:
 Fenotizine (FS: kieselgur, FM: eter de petrol+dietilamina amestec saturat in
fenoxietanol, Detectie: UV la 365 nm)
 Dexametazona (FS: silice, FM: metanol/clorura de metilen, Detectie: UV la 254
nm)
 Propranolol (FS: silice, FM: amoniac:metanol, Detectie: revelare cu aldehida
anisica)
 Piroxicam (FS: silice, FM: acid acetic/toluen, Detectie: UV la 254 nm) 74
CROMATOGRAFIA PE STRAT SUPRAPRESURIZAT
OVERPRESSURED LAYER CHROMATOGRAPHY( OPLC)

 Metoda constă în introducerea unei plăci cromatografice într-o incintă

închisă sub presiune. Placa este acoperită de o membrană flexibilă. Odată
închis capacul aparatului, se aplicǎ o presiune asupra membranei de 1,2
Mpa-2,5 MPa.

 Faza mobilă este forţată să traverseze stratul subţire. Omogenitatea şi

liniaritatea scurgerii solventului sunt asigurate pe toată lărgimea plăcii.
Frontul solventului avansează cu o viteză dependentǎ de debitul pompei
aleasǎ de operator.

 Presiunea necesară pentru a păstra constant debitul unei faze mobile

creşte cu distanţa migrării.

75
 Folosirea presiunilor crescute permite utilizarea plăcilor cu microparticule.
Debitul poate fi reglat astfel încât să se obţină o viteză liniară uniformă a
lichidului vector. Astfel, sistemul va permite mai multe tehnici de lucru.
 Eşantioanele pot fi depuse pe o placă uscată, placa poziţionată în aparat,
developarea şi cromatografierea se opresc atunci când se consideră necesar.

 O nouă versiune de OPLC, utilizează 2, 3, sau mai multe plăci

cromatografice în cursul unei singure developări. Această tehnică denumită
Overpressured Multi Layer Cromatography (OPMLC) este foarte atractivă
datorită numărului foarte important de eşantioane (50–100) ce pot fi
separate într-o singură migrare, reproductibilitatea fiind identică pentru
ansamblul plăcilor cromatografice.

Aplicaţiile cromatografiei pe strat suprapresurizat

determinarea trans-veratrolului
determinarea aflatoxinelor B1, B2, G1, G2 prin mǎsurǎri densitometrice
analiza carotenoidelor din piperul roşu
analiza glicozidelor digitalice.

76
 CROMATOGRAFIA PLANARǍ MULTIDIMENSIONALĂ
MULTIDIMENSIONAL PLANAR
CHROMATOGRAPHY(MD-PC)
Metodele moderne ale CP oferă căi noi de separare eficientă,
cum este:
aranjamentul bi-dimensional (2D),
cromatoplăci cu diverse proprietăţi între solvenţi,
variate tehnici de curgere
multiple moduri de developare.
Prin combinarea acestor posibilităţi, cromatografia planară
multidimensională (MD-PC) se realizeazǎ prin diferite moduri.

O asemenea tehnică (Szabolcs Nyiredy, 2003) se referă la

cromatografia planară care cuprinde:
- 2D CP amplă (PCxPC),
- 2D CP ţintă sau selectivă (PCxPC)
- 2D CP modulată (nPC)
- CP cuplare-strat (PCxPC)
77
2D CP amplă (PC-PC)

Ilustrarea schematică a separării 2D

CP ample (CP-CP), unde numărul
“coloanelor secundare” este nelimitat

Ilustrarea schematică a capacităţii picurilor

(n2) din separarea 2D CP (CP-CP), unde
numărul pǎtratelor reprezintă numărul de
compuşi care pot fi separaţi teoretic

78
2D CP ţintă sau selectivă (PC-PC)

Desfăşurarea unei separări ţintă sau selectivă prin 2D-CP (CPxCP).

a) cromatograma şi densitograma după prima developare cu primul solvent
b) delimitarea (răzuirea) spotului ţintă de pe primul strat
c) spotul extras este aplicat pe o a doua fază staţionară pentru analiza compuşilor
transferaţi
d) cromatograma şi densitograma de separare după a doua developare cu al doilea sistem
de solvenţi

79
 Ilustrarea etapelor in-situ ale separării 2D-CP (CPxCP)
a) cromatograma uscată după prima separare este finisată utilizând primul sistem de solventi
b) pe cromatograma preparată pentru prima separare se delimitează zona ţintă
c) cromatograma uscată după a doua separare se prelucrează cu un al doilea sistem de solvenţi
d) pentru separarea unei a doua fracţiuni ţintă se delimitează o nouă fracţiune
e) cromatograma după a treia separare utilizând un al treilea sistem de solvenţi
80
2D CP modulată (nPC)

Ilustrarea schematică a 2D-CP modulată (nCP) bazată pe micşorarea gradientului de

tărie a solventului şi refocalizarea zonei cromatografice
a) aplicarea probei înainte de începerea separării
b) frontul de solvent cu primul sistem ( n=1) pentru refocalizarea zonei de start
c) frontul de solvent pentru al doilea sistem (n=2) când compuşii din zona de start
migrează (ST2<ST1)
d) frontul de solvent pentru al treilea sistem ce constituie etapa a treia (n=3), când o
parte din compuşi se separă în benzi înguste (ST3<ST2)

81
CP cuplare-straturi (PC-PC)

Diagrama selecţionării “în cros” a straturilor cuplate CP

(CP-CP) ce asigură o separare multidimensională pe faze
staţionare prin descreşterea polarităţii
82
Combinare MD-PC

Ilustrarea cuplării de straturi OPLC (OPLC-OPLC) pentru a asigura separarea MD cu trei faze
staţionare cu polaritate descrescătoare.
a) principiul utilizării a trei plăci cromatografice
b) OPLC-OPLC în flux continuu (canal îngust, faza mobilă de intrare şi ieşire, canal gros,
fante pentru a asigura transferul fazei mobile între două plăci)

https://www.youtube.com/watch?v=gTN6fcTrHGM 83