Cursul 4 - 5

Proteine, Enzime
 Fibrinogenul
• concentraţia plasmatică 200-400mg/100ml

• proteină plasmatică solubilă formată din trei tipuri de lanţuri

polipeptidice diferite: (A B )2 legate prin punţi disulfidice

• A şi B - fibrinopeptide

trombina
(A B    
fibrină monomer
4H2O -2A -2B
agregare spontană

fibrină polimer
• Trombina se formează din protrombină (precursor inactiv),
sub acţiunea factorilor Xa şi V în prezenţa Ca 2+

• Trombina activează şi factorul XIII transformându-l în XIIIa,

care are activitate transamidazică.

Fibrină CH2 CH2 CH2 CH2 N+H3 + NH2 CO CH2 CH2 fibrină
lizil glutaminil

-NH3 fibrină CH2 CH2 CH2 CH2 NH CO CH2 CH2 fibrină

Activarea factorului X - locul unde se întâlnesc
căile coagulării:
• calea intrinsecă
• calea scurtă extrinsecă (tromboplastină)

Anticoagulanţi:
• antitrombină III activată de heparină,
• proteina C

Concentrația fibrinogenului– crescută

în inflamație
 Colagenul
• principala componentă a ţesutului conjunctiv
• 1/3 din masa proteică totală a organismului
• sintetizat de diferite celule mezenchimale ca: fibroblaşti,
• osteoblaşti, condroblaşti şi odontoblaşti
• proteina majoră din ţesuturi ca: vase sanguine, oase,
cornee,
• ligamente, piele, tendoane, dentină şi cementul dinţilor.
• 12 tipuri de colagen
• unitatea structurală a fibrelor de colagen este
tropocolagenul:
– proteină oligomeră alcătuită
– din trei lanţuri polipeptidice
– ce formează o triplă elice;
– formă de bastonaş
– (L=300nm, D=1,5nm)
Structura primară:
• secvenţa de aminoacizi a colagenului este (Gly-X-Y)n ,
• prolina se găseşte în concentraţie mare.
• conţine aminoacizii necodificaţi: hidroxiprolină şi
hidroxilizină.

Structura secundară:
• structură helicoidală specifică (lanţul  răsucit la stînga)

Colagenopatiile - sunt boli de origine genetică:

• osteogeneza imperfectă (4 tipuri)
• Sindromul Ehlers-Danlos (10 variante)
 Sinteza colagenului: intracelular + extracelular
Intracelular
• hidroxilarea resturilor prolil şi lizil (O2, -cetoglutarat, acid ascorbic, Fe2+)
• glicozilarea unui număr mic de resturi de hidroxilizină
• asocierea a 3 lanţuri  ale procolagenului prin legături disulfidice din
regiunea carboxi teminală într-un triplul helix de la capătul carboxi-
terminal spre cel amino-terminal.
• secreţia extracelulară a procolagenului

Extracelular
• îndepărtarea fragmentelor polipeptidice carboxi- şi amino-terminale

tropocolagenul
(unitatea structurală matură a colagenului)

formează spontan straturi paralele

stabilizate prin reacţii încrucişate

colagenul matur insolubil

 Elastina
• predomină în ţesuturile conjunctive elastice:
• pereţii arterelor mari
• ligamente .

• elastina matură este insolubilă şi foarte stabilă

• se deosebeşte de colagen prin: nu conţine hidroxilixină

• are un conţinut mic de hidroxiprolină

• are un conţinut mare de aminoacizi nepolari

• sintetizată în fibroblaşti ca monomer solubil, proelastină

• sub acţiunea liziloxidazei se formează grupări aldehidice care participă

la reacţii în care se formează desmozina şi izodesmozina, markerii
elastinei.

• extensibilitate şi elasticitate
 Keratinele

Proteine fibrilare insolubile caracteristice ţesuturilor

de acoperire:
• smalţul dinţilor,
• piele,
• păr
• unghii

• conţinut mare de cisteină  rezistenţă mecanică

mare

• inactivitate chimică
 Citocromii
• componente ale lanţului transportor de electroni
mitocondrial

• hemoproteine

• au fost clasificaţi în 3 clase: a, b, c;

• funcţia de transportor de electroni a citocromilor este

posibilă datorită reacţiei de oxido-reducere fiziologică
dintre ionul Fe2+ şi Fe3+

Fe2+  Fe3+

• citocromul c este o proteină solubilă

 Enzimele
– biocatalizatori
– majoritatea enzimelor au stuctură proteică

Proprietăţi comune ale enzimelor şi catalizatorilor reacţiilor

chimice:
– catalizează numai reacţii termodinamic posibile
– nu modifică echilibrul reacţiei
– măresc viteza de reacţie prin scăderea energiei de activare (energia
necesară pentru a se forma starea de tranziţie)
– nu se consumă în timpul reacţiei
– sunt sensibile la acţiunea inhibitorilor

Proprietăţi specifice enzimelor:

– specificitate înaltă
– cinetică caracteristică
– eficienţă remarcabilă (viteza creşte de 103-1011 ori, comparativ cu
reacţia necatalizată)
– manifestă fenomen de saturare
 Energia de activare
a reacţiei necatalizate
Energia liberă

Energia de activare
a reacţiei catalizate

starea iniţială
Variaţia energiei
libere de reacţie

desfăşurarea reacţiei
Figura 2.1. Energia de activare în reacţii catalizate şi necatalizate
 Clasificare
• Din punct de vedere structural
– Proteine simple: tripsina, chimotripsina, elastaza
– Proteine complexe care conţin şi o componentă neproteică (cofactorul)

Holoenzimã apoenzimã + cofactor

• Cofactorii: ioni metalici: (Zn2+- carbonicanhidraza şi citocromoxidază;
Se2+- glutation peroxidază)

grupări prostetice: pidoxalfosfatul.

coenzima
• loc activ sau un situs catalitic
gr.reactive: Ser, Thr, Cys, Lys, Glu
gr. care leagă substratul (hidrofile)
complementeritate substrat - situs catalitic (legături slabe necovalente)

• loc alosteric sau situs alosteric efectori alosterici pozitivi şi negativi

• Modelul Fischer (Lacăt-cheie)

• Modelul Koshland (centrului indus)

• Specificitatea enzimelor absolută

de grup
largă
 Clasificare:
• 1.Oxidoreductaze-(r. cu transfer de e- şi H+)
• Dehidrogenaze
• Oxidaze
• Peroxidaze
• Dioxigenaze
• Monooxigenaze
• Transelectronaze

• 2.Transferaze (r. de transfer a unei gr-. de pe donor pe acceptor)

• Aminotransferaze Transmetilaze Glicoziltransferaze
• Aciltransferaze Transhidroximetilaze

• 3.Hidrolaze (r.de hidroliză)

• Esteraze Glicozidaze
• Peptidaze Kinaze

• 4. Liaze (r. de scindare a unei legături covalente nehidrolitice)

• 5. Izomeraze (r. de izomerizare)

• Racemaze
• Epimeraze
• Mutaze

• 6. Ligaze (r. in care se formează noi legături covalente în prezenţa ATP)

 CINETICA ENZIMATICÃ

k1 k3
E + S  ES  E + P
k2
vit (v)

• Variaţia vitezei în funcţie

de concentraţia vmax

substratului este o
hiperbolă. 1/2vmax

Km [S]
Figura 2.2. Variaţia vitezei de reacţie în funcţie de concentraţia substratului
 Ecuaţia Michaelis-Menten
Premize:

• concentraţia substratului este mult mai mare decât concentraţia enzimei care
se află în întregime sub formă de complex ES.
• reacţia de transformare a complexului în P şi E liberă este practic ireversibilă
• reversibiliatea reacţiei de formare a ES (k1=k2) determină [ES] constantă

vmax x [S] vmax = viteza maximă

v = KM = constanta Michaelis-Menten
KM + [S] [S] = concentraţia substratului

• Proprietăţiile catalitice sunt caracterizate de KM (eficienţa) şi vmax (puterea

catalitică)
• Când vmax = v/2 atunci KM = [ S ]

• Hexokinaza - KM = 30M, funcţionează cu vmax la concentraţiile

corespunzătoare glucozei în sânge în diferite etape ale ciclului alimentar.

• Glucokinaza ( ficat ) - KM = 10mM

 Ecuaţia Lineweaver-Burk
1 1 Km 1
  
v vmax vmax [ S ]

1/v
y = ax + b b = 1/vmax

1/vmax

-1/KM 1/[S]

Figura 2.4. Reprezentarea ecuaţiei Lineweaver-Burk

 Inhibiţia activităţii enzimatice

• Ireversibilă

competitivă
• Inhibiţie reversibilă
necompetitivă

• acompetitivă
 Inhibiţia ireversibilă
Inhibitori ireversibili

• se leagă la centrul activ al enzimei printr-o legătură covalentă cu un rest aminoacid

• Complexul format este stabil, ducând la o inactivare permanentă a enzimei sau în cel
mai bun caz, activitatea se reface lent, necesitând ore şi zile pentru refacerea activităţii
enzimatice
-
OOC C6H4 O C O + ciclooxigenază OH
ACTIVĂ
• Ex: aspirina - inhibitor ireversibil acetilsalicilat CH3
al cicloxigenazei

ciclooxigenază O C O + -OOC C6H4 OH

INHIBATĂ
CH3 salicilat
Inhibitori de sinucidere

• se formează în organism din precursori în timpul unui ciclu catalitic abortiv. Compusul
iniţial nu este activ. Compusul activ, generat printr-una sau mai multe reacţii este
similar structural cu substratul enzimei care comite sinuciderea şi formează cu aceasta
un complex stabil. Se poate considera că prin incapacitatea ei de a discrimina între
adevăratul substrat şi cel fals enzima se sinucide.

• Ex: fluoruracil
 Inhibiţia reversibilă competitivă
• Inhibitorul competitiv:
• analog structural al substratului
• se leagă reversibil la situsul activ al
enzimei

Ex:
• methotrexatul- inhibitor al dihidrofolat reductazei
• captoprilul, enalaprilul - inhibitori ai enzimei de
conversie a angiotensinei
• statinele- inhibitori al hidroximetilglutaril-CoA reductazei
 vit (v)

vmax

fără inhibitor
E+S ES E+P cu inhibitor
1/2vmax

E+I EI

• Vmax nu se modifică Km K'm

1/v
[S]

• KM creşte cu inhibitor

fără inhibitor
1/vmax

-1/KM -1/K'M 1/[S]

Figura 2.3. Reprezentarea grafică a inhibiţiei competitive

 Inhibiţia reversibilă necompetitivă

• Inhibitorul necompetitiv
• se leagă în alt loc decât substratul
• se leagă de enzima liberă şi de
complexul ES
 vit (v)

vmax fără inhibitor

v'max cu inhibitor

• Vmax scade 1/2vmax

1/2v'max

• KM nu se Km [S]

modifică K'm

1/v

cu inhibitor

fără inhibitor
1/v'max

1/vmax

-1/KM 1/[S]

Figura 2.4. Reprezentarea grafică a inhibiţiei necompetitive

 Inhibiţia acompetitivă

Inhibitorul acompetitiv
• se leagă numai la complexul ES
• apare numai la sistemele multienzimatice
 Inhibitia acompetitiva
• Vmax şi KM scad
1/v cu inhibitor
• panta nu se
fără inhibitor
modifică
1/v'max

1/vmax

-1/K'M -1/KM 1/[S]

Figura 2.5. Reprezentarea grafică a inhibiţiei acompetitive

 Factorii care afectează activitatea enzimatică

Temperatura

• Pentru fiecare enzimă există o activitatea

temperatură optimă pentru enzimatică (%)
exercitarea activităţii catalitice.

• Creşterea vitezei de reacţie cu

temperatura se manifestă într-un
domeniu limitat de temperatură,
limita superioară corespunzând
temperaturii optime.

• Dincolo de această temperatură

activitatea enzimei scade, 0 20 40 60 Temp (C)
deoarece începe procesul de Figura 2.6. Variaţia activităţii enzimatice cu temperatura
denaturare termică a proteinei care
se accentuează cu creşterea
temperaturii.
 Factorii care afectează activitatea enzimatică

pH-ul

activitatea
• pH optim, pH-ul la care enzimatică (%)

activitatea enzimatică
este maximă.
• Pentru majoritatea
enzimelor acesta variază
între 5-9
• Exceptii: pepsina (2), 4 6 8 10 pH
fosfataza acidă (5-6), Figura 2.7. Variaţia activităţii enzimatice cu pH-ul

fosfataza alcalină (8-9).

 Izoenzime
• Forme moleculare multiple ale unei enzime care catalizează aceeaşi reacţie
• Au caracteristici cinetice (KM , Vmax) diferite
• Sunt proteine oligomere:

• Lactatdehidrogenaza
• LDH1 - H4 muşchi cardiac
• LDH2 - MH3
• LDH3 - M2H2 muşchi scheletic
• LDH4 - M3H
• LDH5 - M4 ficat
COO- COO-
 Lactat dehidrogenaza 
H - O - C : H + NAD+ ================ O = C + NADH + H+
 
CH3 CH3

• Creatin fosfokinaza (CPK)

• M2- miocard şi muşchi
• MB - în miocard
• B2 în creier şi muşchi
CPK
• Creatină + ATP  Creatinfosfat + ADP
 Reglarea activităţii enzimatice

1.Modificări cantitative:
• Inducţie enzimatică
• Represie enzimatică
controlate hormonal ş nervos

• 2.Modificări ale eficienţei catalitice

– covalente
• prin activare proteolitică
• prin procese de fosforilare -defosforilare
– alosterice:
 Modificări ale eficienţei catalitice covalente prin activare
proteolitică

• Ex: procesul digestiv,coagulare, fibrinoliză, execuţia

apoptozei

E inactivă(zimogen)----------E activă

• pepsinogen---------- pepsină
• tripsinogen ---------- tripsină
• chimotripsinogen ------------ chimotrpsină
• proenzimele factorilor coagulării ----- factori activi
• plasminogen -------- plasmina
• procaspaze ----- caspaze
Modificări ale eficienţei catalitice covalente prin
procese de fosforilare -defosforilare

ATP ADP
protein kinazã

O-
proteina OH proteina O P O
protein fosfatazã O-

O-
HO P O H2O
O-
Modificări ale eficienţei catalitice alosterice
• Enzime alosterice

• sunt proteine oligomere

• activitatea lor - reglată prin modificari conformaţionale

• catalizează etape cheie, ireversibile ale căilor metabolice

• cinetică diferită de cinetica MM-sigmoidă

• conţin centre regalatoare alosterice (+/-)

• Legarea lor în centrul alosteric determină o transformare conformaţională

denumită tranziţie alosterică care va mări eficienţa ctalitică în cazul efectorilor
pozitivi şi o va micşora în cazul efectorilor negativi.
• inhibiţie feedback
– Produsul final al unei căi metabolice inhibă enzima care
catalizează prima reacţie.
ABCD
– Acumularea lui D în cantitate mare determină legarea lui în
centrul alosteric al enzimei care catalizează transformarea
substratului A în B. D acţionează ca un inhibitor alosteric negativ
sau feed-back inhibitor.

• stimulare feedback
– Fructozo 1,6 bisfosfatul, este activator alosteric al reacţiei
catalizate de fosfofructokinaza-1 al cărei produs de reacţie este.

• stimularea „feed forward”.

– Produsul unei reacţii (reacţia determinantă de viteză) acţionează
ca un efector alosteric pozitiv asupra unei reacţii situate în aval
de reacţia al cărui produs este. De exemplu, fructozo 1,6
bisfosfatul este efector alosteric pozitiv al piruvat kinazei.