Raport Tehnic Parazitologie Patologie

Contract nr. 361/8.12.
2006
1
RAPORT TEHNIC ETAPA III
Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia
umana
RAPORT TEHNIC
ETAPA A III-A
Iulie-decembrie 2007
Program sectorial contract 361

P.S. 4.3.1.
METODE MODERNE PENTRU CONTROLUL UNOR BOLI
PARAZITARE ALE ANIMALELOR CU IMPLICATII IN PATOLOGIA
UMANA
Director de Proiect: Dr. Dumitru MILITARU

S.N. Institutul Pasteur
Contract nr. 361/8.12.2006

2
umana
RAPORT TEHNIC
Etapa a III-a iulie-decembrie 2007
Principalii paraziti intalniti la animale si implicati in patologia
parazitara umana prin transmitere de la animale la om, sunt:
- Toxoplasma gondii, parazitul avand gazda definitiva pisica si gazde
intermediare rumegatoarele si porcul, sursa de contaminare a omului fiind
reprezentata atat de pisica (materii fecale), cat si de ovine si porcine (carne
insuficient prelucrata termic)
- Trichinella spiralis, parazitul evoluand frecvent la porc, porcul
mistret si urs, porcul fiind principala sursa de infestare pentru om;
- Echinococcus granulosus care are drept gazda definitiva cainele, iar
gazde intermediare, unde evolueaza sub forma larvara (chist hidatic), sunt
rumegatoarele, porcul, dar si omul;
Toxoplasmoza:
Protozoonoz cu larg rspndire, deseori neglijat din punct de vedere
a etiologiei, n stabilirea unui diagnostic corect, datorit lipsei de
specificitate a manifestrilor clinice, toxoplasmoza la animale se manifest
deseori prin tulburri de reproducie, avorturi i uneori manifestri nervoase.
Totodat, fiind
considerat o important zoonoz, infestaia cu
Toxoplasma gondii pune probleme deosebite n ceea ce privete salubritatea

produselor alimentare de origine animal (de exemplu prezena chisturilor
parazitare n carne sau produse din carne crude).
Contract nr. 361/8.12.2006

3
umana
Toxoplasma gondii este un parazit protozoar obligatoriu intracelular,

capabil sa infecteze pasarile si animalele cu sange cald. Parazitul T. gondii
are un ciclu de viata complicat cu numeroase stadii de evolutie. Pisicile
infectate (gazda definitiva) imprastie oochisturi prin fecale in mediul
inconjurator, oochisturi care ingerate de animale sau oameni elibereaza
sporozoitii in corpul gazdei contaminate. Tachizoitii, derivati din sporozoiti,
invadeaza apoi organismul animalelor sau oamenilor contaminati, ciclul
biologic incheindu-se prin formarea in musculatura si diferite organe de
chisturi de T. gondii ce contin un numar mare de bradizoiti. Organismele
parazitare (cum ar fi Toxoplasma gondii) pot cauza pierderi semnificative in
fermele de porcine si ovine prin avorturi, afectare embrionara sau infertilitate
maternala. Un raport din 2002 al Institutului de Stiinta si Cercetare a
Mediului Inconjurator din Noua Zeelanda, mentioneaza seroprevalenta
anticorpilor anti-T. gondii la animale. Astfel, in Tazmania din 160 miei
testati, 16,9% erau pozitivi; din 145 oi, 61,7% erau pozitive; din 30 vieri,
22,3% erau pozitivi; din 139 porci, 7,2% erau pozitivi. In Australia, din 1159
de oi, 7,4-9,2% erau pozitive. In Canada din 2800 de porci, 8,6% au prezentat
anticorpi anti-T. gondii. In Norvegia, 18% dintre oi, 5,1% din bovine si 2,5%
din porcine aveau anticorpi anti-T. gondii. In SUA, din 3707 porci testati,
32% au fost pozitivi; din 5936 ovine testate, 37% au fost pozitive si din 2449
caprine, 23% erau pozitive. Studiile au aratat ca, la nivel mondial, din 73717
porcine testate, 22% au fost detectate ca pozitive. Acelasi raport mentioneaza
ca in Anglia, din 67 de probe de carne conservata, 1,5% erau pozitive (la
testare prin PCR si pe culturi celulare); in SUA, din 50 probe tesut musular
porc testate prin bioproba pe soricei, 24% au fost pozitive; iar din 86 probe
tesut muscular ovine 9,3 % au fost pozitive. In SUA, intre 1983-1984, din
Contract nr. 361/8.12.2006

4
umana
11229 scroafe testate, 42% au fost pozitive, iar din 613 porci sacrificati pentu
consum, 23% au fost pozitivi la T. gondii; in 1990, din 3479 scroafe testate,
20% erau pozitive; in 1995, din 3236 scroafe testate, 15% au fost pozitive, iar
din 4712 porci, 3,2% au fost pozitivi.
Raportul Institutului National Veterinar din Suedia din 2002 catre
Comisia Europeana mentiona ca in Suedia, in anul 1987, 20% dintre ovine si
17,3% din porcii adulti prezentau anticorpi anti-T.gondii. De asemenea,
supravegherea serologica a ovinelor in Norvegia, in anii 90 a condus la
concluzia ca 18% dintre miei si 2% din porcine prezentau anticorpi antiToxoplasma gondii. In America de Nord, se estimeaza ca intre 16-40% dintre
persoane sunt infectate cu Toxoplasma gondii. Din diferite studii
epidemiologice din Norvegia s-a concluzionat ca intre 7-27% din femeile
insarcinate erau seropozitive la T. gondii. S-a estimat ca aproximativ 30% din
adultii din Marea Britanie si intre 50-80% din adultii din Europa au anticorpi
anti-T. gondii. De asemenea, la nivel mondial, cazurile de toxoplasmoza
congenitala se estimeaza ca fiind cuprinse intre 140900-1127200 (0,1-0,8%)
anual. In SUA, 0,6% din populatie se infecteaza in fiecare an, acest procent
reprezentand aproximativ 1500000
de cazuri. Numarul de cazuri de
toxoplasmoza congenitala in SUA s-a estimat la 400 - 4000 cazuri anual in

2000. In Franta prevalenta toxoplasmozei s-a situat in 1996 intre 42-84%, iar
in SUA a fost de pana la 40%.
Date de la Centrul pentru Controlul Bolilor din Canada au situat infectia
cu Toxoplasma gondii pe locul trei (20,7%), dupa infectiile Salmonella
(30,6%) si Listeria monocytogenes (27,6%). Un studiu european efectuat in
anul 2000, pe 1110 femei insarcinate, a demonstrat prezenta infectiei ca fiind
10% in Marea Britanie si Norvegia, 55% in Franta si Grecia. Din cazurile
Contract nr. 361/8.12.2006

5
umana
depistate pozitive, intre 30-63% din infectii au fost atribuite consumului de

carne infestata.
Controlul infestatiei cu Toxoplasma gondii la animalele de interes
economic, inclusiv la suine
si ovine, reprezinta o preocupare continua
intrucat T. gondii determina o infectie zoonotica importanta, fiind una din

cauzele majore a avorturilor la ovine si porcine.
Datorita faptului ca in marea majoritate a cazurilor, toxoplasmoza
evolueaza
subclinic,
preocuparea
actuala
este
indreptata
catre
perfectionarea metodelor de diagnostic existente si elaborarea de metode

noi de diagnostic care sa le inlocuiasca pe cele conventionale (testul pe
culturi tisulare, biproba pe soricei), care nu sunt foarte sensibile si
necesita consum mare de timp, cu metode moderne cum ar fi testele
imunoenzimatice, testele imunohistochimice si moleculare (PCR).
T. gondii cauzeaza o gama mare de manifestari la gazdele infectate.
Cele mai multe tulpini de T. gondii sunt avirulente pentru soricei producand
infectii cronice asimptomatice, in timp ce cateva sunt inalt virulente pentru
soricei, producand toxoplasmoze acute care omoara soriceii la o concentratie
de mai putin de 10 tachizoiti. La o asa diversitate biologica si epidemiologica
a toxoplasmelor, ne putem astepta la o diversitate genetica mare, determinata
de recombinarea meiotica in acest parazit produsa in timpul ciclului sexual al
parazitului. Marea majoritate a izolatelor de T. gondii de la animale si
oameni, studiate pana in prezent apartin numai originilor clonale 2 si 3,
structurate ca tipurile I, II si III.
Genomul T.gondii, asemenea celui al altor celule eucariote, este
compus din acidul dezoxiribonucleic nuclear si cel al organitelor. T.gondii
contine un genom nuclear de aproximativ 86Mb, un genom mitocondrial de 6
Contract nr. 361/8.12.2006

6
umana
kb si un genom epizomal de 35 kb. Diversitatea alelica identificata pentru cei

mai multi dintre markerii T.gondii a fost foarte mica (2-4 alele). In aceasta
situatie se afla markerii izoenzimatici ce compun 6 sisteme polimorfice
enzimatice
(aspartat
aminotransferaza,
glutation
reductaza,
amilaza,
glucozofosfat izomeraza, acid fosfataza si propionilesteraza) si care prezinta

numai 2-3 izoforme in populatia de izolate de T. gondii testate. O diversitate
genetica foarte mica (2-4 alele) s-a intalnit si la genele care codifica
antigenele majore ale parazitului (antigene de suprafata, antigenele produse
de granulele dense, de organelele secretoare rhoptry sau antigenele matricei
chisturilor), la genele care codifica sintetizarea altor produsi ai T.gondii (tubulina, -tubulina, actina, dihidrofolat reductaza-timidilat sintetaza,
nucleozid trifosfataza, alfa ADN polimeraza) sau genele cu functii
necunoscute. S-a observat ca din 18 tulpini de T.gondii studiate, toate
prezentau una sau alta din cele doua secvente in genele care codifica atat
antigenele de suprafata cat si cele ale organitelor, fara a exista o variatie
intratipica. Un polimorfism usor mai inalt (3-4 alele) a fost detectat la cativa
microsateliti localizati in intronul genelor cunoscute (TUB 2 pentru tubulina, TgM-A pentru miozina A) sau in secventele tag expresate
(ESTW35487). De asemenea, au putut fi detectati ca avand un inalt
polimorfism, copii multiple ale locilor, cu functii necunoscute. S-au descris
pentru T. gondii mai mult de 50 de markeri: markeri genetici si fenotipici cu
polimorfism scazut (2-4 alele) si markeri genetici cu polimorfism inalt.
Markerii genetici si fenotipici cu polimorfism scazut (2-4 alele) sunt compusi
din izoenzime (aspartat aminotransferaza, amilaza, propionilesteraza,
glucozofosfat izomeraza, glutation reductaza, acid fosfataza), gene ce
codifica antigenele majore (antigene de suprafata: SAG1, SAG2, SAG3,
Contract nr. 361/8.12.2006

7
umana
SAG4, MAG1, BSR4, SRS1, SRS2, SRS3; antigene ale organitelor: GRA1,
GRA2, GRA3, GRA4, GRA6, ROP1 si nucleozidtrifosfataza NTP; gene cu
functii cunoscute: actina ACT1, -tubulina (TUB1), -tubulina (TUB2), B10,
dihidrofolat reductaza (FOL1), ADN polimeraza alfa (POL1); gene cu functii
necunoscute: 850, L328, 62B, 226, C19, B1 si microsateliti: -tubulina
(TUB2), miozina A (TgM-A), EST W35487. Markerii genetici cu
polimorfism inalt sunt formati din secvente repetate in genom (BS, TGR,
REP) si din microsateliti (EST: N60608, N82375, N83021, N61191,
AA519150 si loci: M6, M33, M48, M95, M102, M163). Inalta putere
discriminatorie a 8 markeri ai microsatelitilor poate avea o utilitate foarte
mare in studiile epidemiologice ale Toxoplasmei gondii, dar si pentru
genotipizarea
tulpinilor
si
detectarea
infectiilor
mixte.
Tipizarea
microsatelitilor este considerata a fi superioara celei a multilocusurilor care

nu poate distinge infectiile mixte din probe.
Concluzionand, au fost stabilite trei genotipuri principale ale
Toxoplasmei gondii, in functie de cateva dintre caracteristicile sale biologice:
tipul I (izolate rar aproximativ 10% din tulpinile de colectie din Europa si
SUA, sunt in principal de origine umana; tulpini inalt virulente pentru soricei
determinand moartea soriceilor inoculati cu mai putin de 10 tachizoiti; in
vitro prezinta o rata inalta de multiplicare si o interconversie tachizoitbradizoit redusa); tipul II (izolate foarte des aproximativ 80% din tulpinile
de colectie din Europa si SUA, sunt de origine umana sau izolate de la
porcine, ovine; sunt tulpini nevirulente pentru soricei determinand infectii
cronice cu persistenta in tesuturi a chisturilor; in vitro prezinta o rata scazuta
de multiplicare si interconversie tachizoit-bradizoit usoara, cu formare de
chisturi) si tipul III in care sunt cuprinse tulpinile de T. gondii cu genotipuri
Contract nr. 361/8.12.2006

8
umana
recombinate si genotipuri neobisnuite cu alele atipice (au fost intalnite foarte

rar in izolatele din Europa si SUA, sunt mult mai des intalnite in izolatele de
la animalele salbatice din regiuni geografice indepartate si de la bolnavi
atipici; aceste tulpini sunt de obicei mai virulente decat cele de tip II).
Descoperirea acestor markeri s-a realizat prin dezvoltarea unor proiecte
de cercetare a genomului parazitului. Rezultatele cercetarilor (mai mult de
73000 de gene ale T. gondii si secventele tag expresate (EST)) sunt
disponibile acum in GeneBank si pot fi analizate prin paginile web ale
genomului T. gondii.
Scopul general al proiectului este reprezentat de dezvoltarea unor

instrumente de diagnostic, profilactice si terapeutice destinate controlului
bolilor parazitere cu caracter zoonotic.
Directiile majore pe care se vor desfasura cercetarile constau in:
- studii epidemiologice privind emergenta si distributia parazitilor
zoonotici, luati in studiu, circulanti in efectivele de animale in
Romania, comparativ cu cei intalniti in cazuistica din medicina umana;
- studiul modalitatilor de transmitere a parazitilor de la gazda definitiva
la om;
- dezvoltarea instrumentelor de diagnostic prin crearea unor metodologii
bazate pe utilizarea tehnicilor imunologice (teste imunoenzimaticeELISA,
imunohistochimice,
nanotehnologice)
si
de
biologie
moleculara (PCR/tehnologia ADN recombinant) pentru stabilirea

diagnosticului la gazdele definitive, respectiv la gazdele intermediare;
Contract nr. 361/8.12.2006

9
umana
- dezvoltarea unor produse de interventie: vaccinuri si produse

antiparazitare utilizabile in profilaxia si tratamentul parazitozoonozelor
luate in studiu;
- derularea de actiuni suport pentru diseminarea rezultatelor cercetarilor.
Obiectivul pricipal al etapei a III-a a constat in: Stabilirea

metodologiilor de diagnostic precoce si discriminatoriu privind
infestatiile cu Toxoplasma gondii la animale.
Obiective operaionale:
stabilirea
conditiilor
de
lucru
in
tehnicile
de
diagnostic
imunoenzimatice si imunohistochimice;
validarea metodelor elaborate pe probe cunoscute si pe probe din teren;
elaborarea metodelor moleculare de detectie a Toxoplasma gondii
(teste PCR elective si metodologii de obtinere a matritelor ADN din
probe cunoscute);
validarea metodelor moleculare pe probe cunoscute si pe probe din
teren.
diseminarea rezultatelor obinute n publicaii de specialitate i cu
ocazia comunicrilor tiinifice.
Contract nr. 361/8.12.2006

10
umana
1.1.
Stabilirea conditiilor de lucru in tehnicile de diagnostic

imunoenzimatice si imunohistochimice. Validarea metodelor
elaborate pe probe cunoscute si pe probe din teren.
1.1.1. Reagentii preparati in etapa anterioara au fost utilizati pentru
stabilirea conditiilor de reactie in tehnicile imunoenzimatice de detectie a

anticorpilor anti-Toxoplasma gondii din seruri provenite de la ovine si
porcine.
ELI-Tox-O: Set de diagnostic al toxoplasmozei la ovine
Ansamblu de componente pentru detectia anticorpilor de tip IgG antiToxoplasma
gondii
din
serul
sanguin
de
la
ovine prin
tehnica
imunoenzimatica (ELISA varianta indirecta).

Scopul utilizarii: Diagnosticul toxoplasmozei (detectarea anticorpilor
de tip IgG) pe seruri provenite de la ovine prin tehnica ELISA-varianta
indirecta.
Forma de prezentare: Trusa cu componente necesare pentru 90 probe,
180 probe sau 450 probe.
Componentele
produsului:
Trusa
ELI-Tox-O
cuprinde
urmatoarele
componente, ambalate individual, in cantitati corespunzatoare necesarului de

lucru:
Nr.
Component
U/M
Cantitate
Cantitate
Cantitate
pentru 90
pentru 180
pentru 450
probe
probe
probe
buc.
crt.
1.
Microplaca ELISA peliculizata cu antigen

Toxoplasma gondii
2.
Martor pozitiv 10X
ml
0,1
0,2
0.5
3.
Martor negativ 10X
ml
0,1
0,2
0.5
4.
Conjugat anti-IgG oaie marcat cu peroxidaza
ml
0,125
0,250
0.600
Contract nr. 361/8.12.2006

11
umana
5.
Substrat de perhidrol in tampon citrat
ml
11
25
60
6.
Cromogen (solutie ABTS)
ml
0,6
1,2
7.
Diluant pentru seruri si conjugat
ml
100
120
240
8.
Solutie de spalare 10 X
ml
50
60
150
9.
Reactiv de stopare NaF
0,09
0,18
0.45
10.
Instructiuni de folosire a trusei
buc.
a) Microplaca ELISA este peliculizata (captusita) cu antigen purificat

stabilizat de Toxoplasma gondii, spalata si uscata, ambalata in folie
de plastic sau metalizata, gata de utilizare.
b) Martorul pozitiv este obtinut de la oi imunizate cu antigen
Toxoplasma gondii purificat. Se prezinta ca un lichid clar, albgalbui si contine stabilizator. Se dilueaza 1/10 pentru lucru.
c) Martorul negativ este recoltat de la oi libere de toxoplasmoza. Se
prezinta ca un lichid clar, alb-galbui si contine stabilizator. Se
dilueaza 1/10 pentru lucru.
d) Conjugatul anti-IgG oaie este reprezentat de IgG iepure anti-IgG de
oaie, cuplata cu peroxidaza. Se prezinta ca un lichid clar, de culoare
brun-roscata, concentrat de 100 de ori. Contine stabilizator. Se
dilueaza pentru lucru.
e) Substratul este o solutie de perhidrol (H2O2) in tampon citrat. Se
prezinta ca un lichid clar, incolor.
f) Cromogenul este o solutie concentrata de ABTS. Se prezinta ca un
lichid clar, de culoare verde si este gata de utilizare.
g) Diluantul pentru seruri si conjugat este reprezentat de un tampon
fosfat cu adaos de albumina serica bovina si conservant. Se prezinta
ca un lichid clar de nuanta verzuie si este gata de utilizare. Prin
agitare produce spuma.
Contract nr. 361/8.12.2006

12
umana
h) Solutia de spalare se prezinta ca un lichid clar care prin agitare

produce spuma. Este concentrat de 10 ori. Se dilueaza pentru lucru.
i) Reactivul de stopare (NaF) este o pulbere cristalina de culoare alba.
Se dizolva in apa distilata pentru lucru.
Conditii de pastrare : Trusa ELI-Tox-O se pastreaza la 2 - 8 oC, in
ambalajul original.
Valabilitate : 6 luni de la data fabricatiei, in conditiile mentionate mai
sus.
Informatii generale despre boala : Toxoplasmoza este o zoonoza care
afecteaza omul si numeroase specii de animale homeoterme si pasari, fiind
raspandita pe tot globul. Rezervorul de infestare are doua componente si
anume: abiotica- unde se dezvolta oochisturile si biotica- reprezentata de
toate speciile de mamifere din genul Felix si Lynx- gazde definitive ale
parazitului Toxoplasma gondii. Gazdele intermediare sunt reprezentate de
om si alte homeoterme care se pot manifesta si pot fi si surse de infestare
cu Toxoplasma gondii. Toxoplasmoza poate fi considerata ca fiind una
dintre cele mai importante zoonoze, prin impactul social deosebit pe care-l
are, contaminarea femeii gravide soldandu-se cu avortul sau moartea
fatului.
Prin detectarea serologica a toxoplasmozei la ovine se reduc prevalenta
infestatiei parazitare la acestea, pierderile economice reprezentate de
avorturi, fatari de produsi neviabili, dar scad si sursele de infestare pentru
om.
Principiul metodei : Anticorpii anti Toxoplasma gondii, de tip IgG
din ser, sunt detectati prin testul ELISA varianta indirecta. In test,
anticorpii reactioneaza specific cu antigenul Toxoplasma gondii fixat pe
Contract nr. 361/8.12.2006

13
umana
imunosorbent (microplaca) si apoi cu conjugatul anti IgG de oaie marcat

cu peroxidaza. Complexul antigen-anticorp specific- anti IgG oaie
peroxidaza format, este evidentiat prin actiunea enzimei asupra substratului
specific (H2O2), cu modificarea culorii unui cromogen (ABTS) care se
oxideaza, intensitatea culorii fiind determinata fotometric la 405 nm si
exprimata in unitati densitate optica (DO). Reactia se interpreteaza in
raport cu valorile DO ale martorilor pozitiv si negativ. Pentru detectia
anticorpilor din ser anti- Toxoplasma gondii, trusa ELI-ToxO utilizeaza
un antigen solubil total.
Instructiuni de folosire:
Principiul metodei : Anticorpii anti-Toxoplasma gondii, de tip IgG, din ser,
sunt detectati prin tehnica ELISA, varianta indirecta. In test, anticorpii
reactioneaza
specific
cu
antigenul
Toxoplasma
gondii
fixat
pe
imunosorbent (microplaca) siapoi cu conjugatul anti-IgG oaie marcat cu

peroxidaza. Complexul antigen-anticorp specific- anti-anticorp-peroxidaza
format, este evidentiat prin actiunea enzimei asupra substratului specific
(H2O2), cu modificarea culorii unui cromogen (ABTS) care se oxideaza,
intensitatea culorii fiind determinata fotometric la 405 nm. Reactia se
interpreteaza in raport cu valorile densitatilor optice ale martorilor pozitiv
si negativ.
Probe de examinat : Probe de seruri prelevate dupa coagularea sangelui
recoltat de la ovine. Tuburile cu probe de testat trebuie sa fie inchise
ermetic pentru a se evita impurificarile de orice fel. Pana la utilizare in test,
probele se pastreaza la congelator la 20oC.
Modul de lucru :
Contract nr. 361/8.12.2006

14
umana
Materiale necesare in dotarea laboratorului:
- apa distilata/ deionizata; pipete mono- si multicanal, reglabile si fixe, 2-1000 l;
- pipete sticla 10 ml; eprubete/ tuburi polietilena 1-2 ml si sticla 10-20 ml;
- hartie absorbanta (filtru/sugativa); alcool sanitar;
- incubator prevazut cu agitare pentru placi ELISA;
- aparat de spalare automata pentru placi ELISA;
- fotometru multicanal (uv/vis) cu cititor de placi ELISA la 405 nm si imprimanta.
Prepararea reagentilor
Echilibrarea termica a reagentilor:
Componentele trusei, cu exceptia conjugatului 100X se aduc la temperatura
camerei cu cel putin 30 minute inainte de lucru. Dupa echilibrare termica se
agita usor pentru omogenizare. Se vor efectua dilutii conform celor de mai
jos pentru fiecare placa din trusele ELI-Tox-O.
Diluarea martorilor de reactie:
Martorii de reactie, pozitiv si negativ se dilueaza 1/10 in diluantul pentru ser
si conjugat in modul urmator:
25 l martor pozitiv 10X + 225 l diluant
25 l martor negativ 10X + 225 l diluant
Diluarea probelor de testat:
Probele de testat (seruri prelevate dupa coagularea sangelui recoltat de la oi)
se dilueaza 1/100 in diluant pentru ser si conjugat in doua etape in modul
urmator:
dilutie 1/10: 10 l proba + 90 l diluant pentru ser si conjugat,
dilutie 1/10: 20 l proba diluata 1/10 + 180 l diluant pentru ser si conjugat.
Diluarea conjugatului anti - IgG oaie marcat cu peroxidaza:
Conjugatul anti IgG de oaie marcat cu peroxidaza se dilueaza 1/100 in
diluant pentru ser si conjugat in modul urmator:
100 l conjugat + 9,9 ml diluant pentru ser si conjugat.
Contract nr. 361/8.12.2006

15
umana
Diluarea solutiei de spalare 10X:

Solutia de spalare se dilueaza 1/10 cu apa distilata in modul urmator:
30 ml solutie de spalare 10X + 270 ml apa distilata.
Modul de executare a testului:
Reactia cu serul:
Martorul de reactivi: se pipeteaza 100 l diluant pentru ser si conjugat in
godeul A1.
Martorii de reactie (pozitiv si negativ) diluati se distribuie in dublet, cate 100
l/godeu. Probele de testat (diluate conform instructiunilor de mai sus) se
distribuie fiecare in cate un godeu, cate 100 l/godeu (90 probe/placa). Se
incubeaza placa 60 minute la 37 oC, cu agitare.Se spala placa de trei ori cu
250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita usor. Dupa ultima spalare,
placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de filtru.
Reactia cu conjugatul imunoenzimatic:
Se adauga in toate godeurile cate 100 l conjugat diluat (1/100 in diluant
pentru ser si conjugat). Se incubeaza 60 minute la 37 oC, cu agitare.
Se spala placa de trei ori cu 250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita
usor. Dupa ultima spalare, placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de
filtru.
Reactia cu substratul specific enzimei:
Se prepara substratul: peste 11 ml substrat de perhidrol in tampon citrat se
adauga 0,45 ml solutie ABTS si se agita usor pentru omogenizare. Se
distribuie in fiecare godeu cate 100 l. Placa se lasa la intuneric, la
temperatura camerei. Intre timp, se prepara reactivul de stopare: se dilueaza
agentul de stopare (NaF) in 6 ml apa distilata.
Contract nr. 361/8.12.2006

16
umana
Dupa 30 minute placa se citeste la fotometru multicanal, fata de martorul de

reactivi, la 405 nm si:
- daca parametrii de validare sunt indepliniti, reactia se stopeaza imediat cu
50 l/godeu din solutia de stopare
- daca parametrii de validare nu sunt indepliniti, se lasa placa pana la 60
minute dupa care se stopeaza ca mai sus si se citesc valorile finale ale DO
fata de martorul de reactivi.
Criterii de validare :
- Valoarea DO (media) martorului negativ: mai mica de 0,200;
- Valoarea DO (media) martorului pozitiv: mai mare de 0,800.
Interpretarea rezultatelor :
Se calculeaza valoarea S/P pentru fiecare proba conform formulei:
S/P = (DOproba - DO martor negativ)/ (DOmartor pozitiv - DO martor negativ)
a)
probele pentru care valorile S/P 0,25 sunt considerate pozitive;
b)
probele pentru care valorile S/P < 0,15 sunt considerate negative;
c)
probele pentru care 0,15< S/P 0,25 sunt considerate dubioase si

animalele de la care provin trebuie retestate dupa 30 zile.
Norme de preparare a setului de diagnostic ELISA Eli-Tox-O :

Prepararea componentelor setului :
Microplaci ELISA peliculizate/captusite cu antigen
Microplaci ELISA cu 96 godeuri captusite cu antigen Toxoplasma gondii
care recunoaste si fixeaza anticorpii specifici din probe de seruri prelevate
dupa coagularea sangelui recoltat de la oi.
Modul de preparare:
Contract nr. 361/8.12.2006

17
umana
Prepararea antigenului somatic total de Toxoplasma gondii: Antigenul

somatic total este utilizat pentru captusirea microplacilor de reactie care intra
in componenta trusei ELI-Tox O.
Pentru prepararea antigenului Toxoplasma gondii utilizat in tenica ELISA,
varianta indireacta s-au utilizat paraziti recoltati din exsudatul peritoneal de la
soareci infestati cu tulpina RH de Toxoplasma gondii.
Prepararea antigenului se realizeaza in mai multe etape:
- recoltarea exsudatului peritoneal, cu parazitul sub forma de trofozoid de la
soarecii inoculati anterior cu tulpina RH de Toxoplasma gondii; recoltarea
efectuandu-se la 4-5 zile de la inocularea intraperitoneala a soarecilor;
- reluarea exsudatului peritoneal recoltat de la soareci, pe tampon fosfat salin
0,01M (PBS) steril, pH=7,4;
- filtrarea suspensiei parazitare obtinute printr-un filtru de 3mm;
- prelucrarea suspensiei parazitare filtrate prin 3 cicluri de inghetare dezghetare, urmate de ultrasonicare de 10 ori, 35W/30 sec./ciclu;
- ultracentrifugarea suspensiei obtinute anterior la 10000 rpm, 40 min la 4 oC;
- supernatantul reprezinta antigenul solubil total utilizat in tehnica ELISA.
Continutul de proteina (determinat prin metoda Lowry) al antigenului
Toxoplasma gondii trebuie sa fie mai mare de 1 mg/ml.
Antigenul Toxoplasma gondii se depoziteaza la congelator la 20 oC pana ce
este utilizat la captusirea placilor ELISA.
Captusirea/peliculizarea placilor cu antigen:
Antigenul Toxoplasma gondii se dilueaza in hidroxid de sodiu 0,1M si se
distribuie cate 100 l in godeurile microplacii. Se incubeaza placa timp de 60
minute la 37 oC, cu agitare. Dupa incubare, placile se spala, se trateaza cu
solutie stabilizatoare si se usuca la 30 oC in curent de aer.
Contract nr. 361/8.12.2006

18
umana
Controlul peliculizarii cu antigen:

Se efectueaza prin sondaj, de catre producator, prin tehnica ELISA.
Modul de ambalare a placilor peliculizate cu antigen:
Microplacile captusite / peliculizate cu antigen se ambaleaza individual, in
folie de plastic sau metalizata, etichetata/inscriptionata cu: denumirea
producatorului;
denumirea produsului; seria; valabilitatea.
Conservarea placilor peliculizate cu antigen: La 2 8 oC, in ambalajul
original.
Valabilitatea placilor peliculizate cu antigen: 6 luni de la data prepararii, in
conditiile mentionate mai sus.
Martor pozitiv anti - Toxoplasma gondii.
Martorul pozitiv este ser sanguin de oaie obtinut prin imunizarea acesteia cu
antigen Toxoplasma gondii.
Modul de preparare:
Oi adulte sunt imunizate prin inoculare cu trofozoiti de Toxoplasma gondii,
intraperitoneal, cu 400 000 trofozoiti/ml de inocul.
Controlul martorului pozitiv:
Martorul pozitiv trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, de culoare albgalbuie sau slab rosiatica.
Stabilirea titrului anticorpilor anti Toxoplasma gondii se realizeaza prin
tehnica ELISA . Densitatea optica a martorului pozitiv trebuie sa fie mai
mare de 0,800.
Ambalare si etichetare:
Contract nr. 361/8.12.2006

19
umana
In trusa ELI-Tox-O, martorul pozitiv se livreaza prediluat, ambalat in

flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand cantitatea necesara
pentru lucru.
Fiecare flacon va purta o eticheta pe care sunt inscriptionate: numele
producatorului; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.
Conditii de pastrare:Martorul pozitiv se pastreaza la 28oC, in ambalajul
original.
Valabilitate: Martorul pozitiv este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in
conditiile de pastrare mentionate mai sus.
Martorul negativ de oaie utilizat in Eli-Tox-O :
Martorul negativ este ser sanguin provenit de la ovine libere de
toxoplasmoza, oi provenite dintr-un efectiv in care nu s-au inregistrat avorturi
de origine parazitara.
Controlul martorului :
Martorul negativ trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, de culoare albgalbuie sau slab rosiatica.
Stabilirea titrului anticorpilor anti Toxoplasma gondii se realizeaza prin
tehnica ELISA. Densitatea optica a martorului negativ trebuie sa fie mai mica
de 0,200.
Ambalare si etichetare:
In trusa ELI-Tox-O, martorul negativ se livreaza prediluat, ambalat in
flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand cantitatea necesara
pentru lucru.
Contract nr. 361/8.12.2006

20
umana
Conditii de pastrare: Martorul negativ se pastreaza la 2 8 oC, in ambalajul

original.
Valabilitate: Martorul negativ este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in
Conjugatul imunoenzimatic anti-IgG oaie 100X
Definitia produsului:
Conjugatul imunoenzimatic anti IgG oaie este o imunoglobulina de iepure
anti IgG oaie, cuplata cu peroxidaza, utilizata la determinarea concentratiei
de anticorpi specifici fata de un antigen patogen, prin testul ELISA, varianta
indirecta. Produsul se prezinta sub forma unei solutii clare sau usor
opalescente, de culoare brun-roscata, fara miros.
Modul de preparare: reagent preparat in S.N. Institutul Pasteur S.A.
Peroxidaza (produs comercial) se dizolva in solutie de bicarbonat de sodiu si
se trateaza cu o solutie alcoolica de 2,4-dinitrofluorbenzen 1N la temperatura
camerei. In continuare, se adauga o solutie de periodat de sodiu si, dupa 3060 minute, etilenglicol 0,16M. Amestecul se dializeaza fata de tampon
carbonat pH= 9,5. Se adauga imunoglobulina de iepure anti IgG oaie si
amestecul se tine 2 ore la 20 oC. Conjugatul se stabilizeaza cu borohidrura de
sodiu, apoi se dializeaza fata de tampon fosfat. Produsul se utilizeaza
nepurificat. In final, conjugatul obtinut se amesteca cu o solutie
stabilizatoare.
Controlul conjugatului:
Control organoleptic: Produsul trebuie sa fie clar, brun-roscat, fara miros.
Identificare: Se adauga o picatura de conjugat peste 1 ml solutie de substrat
(perhidrol in tampon citrat cu cromogen ABTS). Apare imediat o culoare
intensa, verde, de cromogen oxidat.
Contract nr. 361/8.12.2006

21
umana
Controlul calitatii conjugatelor s-a efectuat prin determinarea urmatoarelor

criterii de calitate: raportul absorbantelor proteinei marcate la 403 nm si 280
nm, specificitatea de specie si capacitatea de anticorp.
Raportul absorbantelor proteinei marcate reflecta gradul de marcare al
anticorpului cu enzima (peroxidaza). Acest raport este limitat de capacitatea
maxima de legare a peroxidazei (sase molecule de peroxidaza la o molecula
de anticorp), avand valori intre 0,3 0,5.
Dupa prepararea conjugatelor, acestea sunt diluate 1/10 in tampon fosfat
0,1M. Citirea absorbantelor se face la un spectrofotometru la lungimile de
unda de 403 si 280 nm.
Determinarea specificitatii de specie si a capacitatii de anticorp a
conjugatului:
Reactivi: tampon carbonat 0,1 M, pH 9,6; albumina serica bovina (BSA);
lichid de diluare; ser normal de pasare; ser normal de cal; ser normal de bou;
ser normal de oaie; ser normal de porc; ser normal de iepure; substrat:
perhidrol in tampon citrat; cromogen: solutie ABTS; lichid de spalare; solutie
de stopare.
Efectuarea determinarii: Se peliculizeaza obisnuit o placa ELISA cu ser
normal de
pasare, de cal, de bou, de oaie, de porc, de iepure, in dilutii 1/100
in tampon carbonat (cel putin un rand de godeuri pentru fiecare ser de

specie).
Dupa spalare, se adauga conjugatul IgG de iepure anti IgG oaie, diluat la
dilutia de lucru in PBS cu tween si 1% BSA si se incubeaza o ora la 37 oC.
Dupa spalare, se adauga substratul si cromogenul in conformitate cu
instructiunile de folosire a trusei.
Contract nr. 361/8.12.2006

22
umana
Conjugatul se considera specific si cu capacitate de anticorp satisfacatoare

pentru Ig din specia recomandata omologa daca are DO de cel putin 10 ori
mai mare decat DO corespunzatoare serurilor heterologe.
Alegerea dilutiei de conjugat pentru varianta indirecta a testului se face prin
analiza rezultatelor ELISA obtinute pe placi peliculizate cu antigen
Toxoplasma gondii si seruri martor de reactie, in sistem analitic complet,
similar cu cel de diagnostic. S-a ales dilutia de 1/100 pentru conjugat in
diluantul pentru ser si conjugat.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-O, conjugatul se ambaleaza in
flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, in cantitate corespunzatoare pentru
lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii
producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.
Conditii de conservare: La 2 8 oC, ferit de lumina, in ambalajul original.
Valabilitate: 12 luni de la data prepararii, in conditiile de conservare
mentionate mai sus.
Prepararea substratului (solutie perhidrol in tampon citrat): Substratul este o
solutie de peroxid de hidrogen in tampon citrat 2,3%, pH 4. Se utilizeaza
conform instructiunilor din trusa ELI-Tox-O.
Caracteristici: Substratul se prezinta ca un lichid clar, incolor, cu pH 4.
Modul de preparare: Se cantaresc 6,9 g acid citric (C6H8O7 x H2O) si se
dizolva in 2,5 l apa distilata. Se ajusteaza pH-ul la 4 cu o solutie de NaOH
30%. Se completeaza cu apa distilata pana la un volum final de 3 l. Se
controleaza pH-ul final care trebuie sa fie 4. Se adauga cantitatea necesara de
perhidrol si se sterilizeaza prin filtrare.
Conditionare: Solutia se conditioneaza in flacoane brune la volume de 11 ml,
25 ml si 60 ml.
Contract nr. 361/8.12.2006

23
umana
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-O, substratul, ambalat in flacoane

inchise ermetic, se afla in cantitatea necesara pentru lucru. Fiecare flacon va
purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea
produsului; numarul seriei; termenul de valabilitate.
Conditii de pastrare: Substratul se pastreaza la 2 8 oC, ferit de lumina.
Valabilitate : Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile
de pastrare mentionate mai sus.
Prepararea si controlul cromogenului (solutie de ABTS) : Cromogenul este o
solutie apoasa de ABTS (2,2Azinodi(3-etil) benztiazolin sulfat) 1,5%. Se
utilizeaza conform instructiunilor din trusa.
Caracteristicile produsului: Solutie limpede de culoare verde.
Modul de preparare: Se cantaresc 2,25 g ABTS si se dizolva in 0,15 l apa
distilata.
Se sterilizeaza prin filtrare.
Controlul cromogenului: Solutia de cromogen trebuie sa fie limpede, de
culoare verde.
Conditionare: Solutia de cromogen se fioleaza in flacoane, in volume de 0,6
ml, 1,2 ml sau 3 ml.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-O, cromogenul se ambaleaza in
cantitatile necesare pentru lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta
inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea produsului;
numarul seriei; termenul de valabilitate.
Conditii de pastrare: Solutia de cromogen se pastreaza la 2 8 oC, ferita de
lumina, in ambalajul original.
Valabilitate: Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile
de conservare mentionate mai sus.
Contract nr. 361/8.12.2006

24
umana
Prepararea diluantului pentru ser si conjugat : Diluantul pentru ser si conjugat

este reprezentat de tampon fosfat salin 0,01M cu 1% albumina serica bovina,
0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si pH 7,2 7,4. Se utilizeaza conform
instructiunilor din trusa.
Caracteristicile produsului: Lichid clar cu nuanta verzuie si pH 7,27,4. La
Modul de preparare:
Solutia A: 12,78 g Na2HPO4 anh.
76,5 g NaCl
ad. 9000 ml apa distilata.
Solutia B: 1,38 g NaH2PO4 x H2O
8,5 g NaCl
Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 7,2 7,4.
Se adauga 1% albumina serica bovina, 0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si
colorantul. Se sterilizeaza prin filtrare si se conditioneaza in flacoane de
sticla/plastic inchise ermetic la volume de 60 ml, 100 ml, 120 ml.
Control pe flux: Diluantul pentru ser si conjugat trebuie sa se prezinte ca o
solutie limpede de nuanta verzuie, cu pH 7,2 7,4.
Ambalare si etichetare: In trusa, produsul se ambaleaza in cantitate
corespunzatoare necesarului de lucru.
Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii
producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; termenul de valabilitate.
Conditii de pastrare: Diluantul pentru ser si conjugat se pastreaza la 28 oC,
in ambalajul original.
Contract nr. 361/8.12.2006

25
umana

Prepararea solutiei de spalare 10X: Solutia de spalare 10X este reprezentata
de tampon fosfat salin 0,1M, pH 6,86,9 cu 0,5% tween 20 si 0,01%
thiomersal. Se utilizeaza la spalarea placilor, conform instructiunilor din
trusa.
Caracteristicile produsului: Se prezinta ca un lichid clar care prin agitare
produce spuma. Daca solutia de spalare 10X prezinta un depozit cristalin, se
aduce la temperatura camerei si se agita ca toate cristalele sa se dizolve, iar
apoi se dilueaza conform instructiunilor din trusa.
Mod de preparare:
85 g NaCl
85 g NaCl
Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 6,8 6,9. Se adauga
0,5% tween 20 si 0,01% thiomersal. Solutia se sterilizeaza prin filtrare si se
conditioneaza in flacoane de 50 ml si 60 ml.
Control pe flux: Solutia de spalare trebuie sa se prezinte ca un lichid clar cu
pH- ul cuprins intre 6,86,9. Dupa diluare 1/10 in apa distilata, pH-ul devine
7,2 7,4.
corespunzatoare necesarului de lucru.
Contract nr. 361/8.12.2006

26
umana

Conditii de pastrare: Solutia de spalare 10X se pastreaza la 28 oC, in
ambalajul original.
Reactivul de stopare : Reactivul de stopare este NaF care se utilizeaza in trusa
ca solutie 1,5%.
Se cantaresc 0,09 g/flacon, 0,18 g/flacon sau 0,45 g/flacon.
Produsul
este
ambalat
in
flacoane
de
sticla/plastic,
in
cantitate
corespunzatoare pentru lucru.

Norme tehnice de control :
Determinarea intensitatii raspunsului probelor martor
Intensitatea raspunsului probelor martor se executa prin tehnica ELISA,
varianta indirecta. Titrurile martorilor de reactie (la dilutia mentionata in
instuctiunile de folosire a trusei) trebuie sa corespunda normelor tehnice:
DOn < 0,200
DOp > 0,800
Aceste valori reprezinta criteriile de validare ale trusei.
Variabilitate inter-godeuri:
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, cate 4 godeuri/ser,
in patru zone ale placii.
conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.
Contract nr. 361/8.12.2006

27
umana
Coeficientul de variabilitate (deviatia standard a replicatelor/media

replicatelor) trebuie sa fie sub 0,2.
Variabilitate inter-placii:
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, 5 placi, cate 4
godeuri/ser/placa, in patru zone ale placilor.
Detectabilitatea : Curba de titrare a serului martor pozitiv, aplicat in 9 dilutii
(1/10; 1/15; 1/20; 1/25; 1/30; 1/35; 1/40; 1/45; 1/50) trebuie sa releve
proportionalitatea dintre titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si
valoarea DO. Valoarea limitei de pozitivare (cut-off pozitiv) trebuie sa fie
mai mica decat valoarea DO a serului martor pozitiv la dilutia 1/20.
Specificitatea: Determinarea specificitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor
testa 10 seruri prelevate de la oi confirmate ca fiind negative printr-un alt test
(testul de imunofluorescenta indirecta).
Cele 10 seruri trebuie sa fie negative si prin testare cu trusa ELI-Tox-O.
Sensibilitatea : Determinarea sensibilitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor
testa 10 seruri negative si 10 seruri pozitive confirmate printr-un alt test
(testul de imunofluorescenta indirecta).
Cele 10 seruri negative trebuie sa fie intotdeauna negative si cele 10 seruri
pozitive sa fie intotdeauna pozitive prin testare cu trusa ELI-Tox-O.
Reproductibilitatea
Controlul reproductibilitatii intraplaca:
Contract nr. 361/8.12.2006

28
umana
Se vor testa in duplicat 10 seruri negative si 10 seruri pozitive confirmate

printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).
Coeficientii de variatie ai densitatilor optice trebuie sa se situeze sub 20%.
Controlul reproductibilitatii interplaci:
Se vor testa, pe cate doua placi, 10 seruri negative si 10 seruri pozitive
confirmate printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).
Valabilitate
Toti parametrii calitativi trebuie sa se reproduca in perioada de valabilitate, in
conditiile de conservare specificate in normele tehnice.
Performantele produsului
Limita de detectie:
Serurilor martor (pozitiv si negativ) au fost titrate, stabilindu-se limita de
detectie a testului.
Curba de titrare a martorului pozitiv, aplicat in 9 dilutii (1/10; 1/15; 1/20;
1/25; 1/30; 1/35; 1/40; 1/45; 1/50) trebuie sa releve proportionalitatea dintre
titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si valoarea DO.
Rezultate:
30 min
Mp
Mn
dilutie
60 min
Mp
Mn
dilutie
1/10
1.443
0.075
1/10
2.217
0.108
1/15
1.257
0.057
1/15
1.996
0.078
1/20
1.068
0.047
1/20
1.690
0.065
1/25
1.013
0.043
1/25
1.629
0.055
1/30
0.980
0.038
1/30
1.526
0.048
1/35
0.924
0.036
1/35
1.447
0.046
1/40
0.825
0.031
1/40
1.287
0.043
1/45
0.802
0.029
1/45
1.252
0.041
1/50
0.759
0.024
1/50
1.168
0.039
Contract nr. 361/8.12.2006

29
umana
Controlul valorii de diagnostic al testului ELISA s-a realizat prin efectuarea

de teste comparative cu alte teste, pe probe din teren (probe de seruri
provenite de la oi). Astfel, au fost testate 69 probe, iar ca teste comparative
s-a utilizat testul de imunofluorescenta indirecta (IFI).
Rezultate: Probele pozitive testate prin IFI au fost pozitive la ELISA, iar cele
negative s-au prezentat la ELISA ca fiind negative .
Sensibilitate: (10 probe de la oi, IFI pozitive)
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutii:
- pentru martorii de reactie: 1/10 in diluant pentru ser si conjugat
- pentru probele de testat: 1/100 in diluant pentru ser si conjugat.
Conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.
REZULTATE:
DO: 1,621 S/P = (1,621 0,075)/(1,443-0,075) = 1,546/1,368 = 1,13
1,257
S/P = (1,257 0,075)/(1,443-0,075) = 1,182/1,368 = 0,864
1,033
S/P = (1,033 0,075)/(1,443-0,075)= 0,958/1,368 = 0,700
0,602
S/P = (0,602 0,075)/(1,443-0,075)= 0,527/1,368 = 0,385
1,526
S/P = (1,526 0,075)/(1,443-0,075)= 1,451/1,368 = 1,060
0,454
S/P = (0,454 0,075)/(1,443-0,075)= 0,379/1,368 = 0,277
1,822
S/P = (1,822 0,075)/(1,443-0,075)= 1,747/1,368 = 1,277
1,610
S/P = (1,610 0,075)/(1,443-0,075) = 1,535/1,368 = 1,122
0,509
S/P = (0,509 0,075)/(1,443-0,075)= 0,434/1,368 = 0,317
0,770
S/P = (0,770 0,075)/(1,443-0,075)= 0,695/1,368 = 0,508
Mp: 1,443
Mn: 0,075
Contract nr. 361/8.12.2006

30
umana
Valorile S/P seruri testate > 0,25

Concluzie: toate probele testate sunt pozitive.
Specificitate: (10 probe de la oi, IFI negative)
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutii:
Rezultate:
DO: 0,143
S/P = (0,143 0,075)/(1,443-0,075)= 0,068/1,368 = 0,049
0,254
S/P = (0,254 0,075)/(1,443-0,075)= 0,179/1,368 = 0,130
0,146
S/P = (0,146 0,075)/(1,443-0,075)= 0,071/1,368 = 0,052
0,171
S/P = (0,171 0,075)/(1,443-0,075)= 0,096/1,368 = 0,070
0,155
S/P = (0,155 0,075)/(1,443-0,075)= 0,080/1,368 = 0,058
0,154
S/P = (0,154 0,075)/(1,443-0,075)= 0,079/1,368 = 0,057
0,193
S/P = (0,193 0,075)/(1,443-0,075)= 0,118/1,368 = 0,086
0,271
S/P = (0,271 0,075)/(1,443-0,075)= 0,196/1,368 = 0,143
0,134
S/P = (0,134 0,075)/(1,443-0,075)= 0,059/1,368 = 0,043
0,239
S/P = (0,239 0,075)/(1,443-0,075)= 0,164/1,368 = 0,119
Mp: 1,443
Mn: 0,075
Valorile S/P seruri testate < 0,25
Concluzie: toate probele testate sunt negative.
Repetabilitate:
Contract nr. 361/8.12.2006

31
umana
Au fost testate, din punct de vedere al repetabilitatii, serurile martor si s-au

obtinut urmatoarele valori ale coeficientilor de variabilitate inter-godeuri:
Placa 1:
citire 30 min.
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
godeu 1
1.485
0.075
1.449
0.074
1.410
0.078
1.428
0.073
godeu 2
1.452
0.075
1.438
0.071
1.436
0.075
1.461
0.072
godeu 3
1.432
0.072
1.463
0.069
1.428
0.075
1.435
0.077
godeu 4
1.459
0.072
1.458
0.075
1.432
0.077
1.451
0.075
Coef. variab. (%)

1.502
2.356
0.756
3.811
0.804
1.967
1.038
2.986
godeu 1
1.465
0.076
1.436
0.078
1.399
0.079
1.413
0.075
godeu 2
1.466
0.079
1.455
0.074
1.421
0.076
1.432
0.074
godeu 3
1.450
0.078
1.463
0.072
1.419
0.076
1.436
0.071
godeu 4
1.458
0.077
1.463
0.079
1.430
0.081
1.445
0.075
Coef. variab. (%)

0.507
1.665
0.875
4.361
0.922
3.140
0.941
2.566
Placa 2:
citire 7 min.
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
Au fost testate, din punct de vedere al repetabilitatii, serurile martor si

s-au obtinut urmatoarele valori ale coeficientilor de variabilitate inter-placi:
Rezultate: citire 30 minute
Placa 1
1.448
1.450
1.443
0.0735
0.0775
0.07625
Placa 2
1.470
1.440
1.396
0.07225
0.07575
0.078
Placa 3
1.459
1.452
1.397
0.07625
0.078
0.078
Placa 4
1.456
1.439
1.399
0.07425
0.07375
0.07625
Coef. variab. (%)

0.624
0.463
1.623
2.262
2.525
1.604
Valoarea de diagnostic a testului ELISA, comparativ cu alte teste :

Valoarea de diagnostic a testului ELISA cu trusa ELI-Tox-O a fost stabilita
comparativ cu IFI (testul de imunofluorescenta indirecta).
Au fost testare un numar de probe 69, seruri prelevate de la oi si s-au
obtinut urmatoarele rezultate:
Contract nr. 361/8.12.2006

32
umana
ELI-Tox O
IFI
Probe testate
69
69
Probe pozitive
43
45
Probe negative
23
24
Probe dubioase
ELI-Tox-P: Set de diagnostic al toxoplasmozei la porcine

ELI-Tox P: Ansamblu de componente pentru detectia anticorpilor de tip
IgG anti-Toxoplasma gondii din serul sanguin de la porcine prin tehnica
imunoenzimatica (ELISA varianta indirecta).
Scopul utilizarii : Diagnosticul toxoplasmozei (detectarea anticorpilor de
tip IgG) pe seruri provenite de la porcine prin tehnica ELISA-varianta
indirecta.
Forma de prezentare : Trusa cu componente necesare pentru 92 probe, 184
probe sau 460 probe.
Componentele produsului : Trusa ELI-Tox-P cuprinde urmatoarele
componente, ambalate individual, in cantitati corespunzatoare necesarului
de lucru:
Nr.
Component
U/M
Cantitate
Cantitate
Cantitate
pentru 92
pentru 184
pentru 460
probe
probe
probe
buc.
crt.
1.
Microplaca ELISA peliculizata cu

antigen Toxoplasma gondii
2.
Martor pozitiv 10X
ml
0,1
0,2
0.5
3.
Martor negativ 10X
ml
0,1
0,2
0.5
4.
Conjugat anti-IgG porc marcat cu
ml
0,125
0,250
0.600
peroxidaza
5.
Substrat de perhidrol in tampon citrat
ml
11
22
55
6.
Cromogen (solutie ABTS)
ml
0,6
1,2
7.
Diluant pentru seruri si conjugat
ml
100
120
240
Contract nr. 361/8.12.2006

33
umana
8.
Solutie de spalare 10 X
ml
50
60
120
9.
Reactiv de stopare NaF
0,09
0,18
0.45
10.
Instructiuni de folosire a trusei
buc.
a) Microplaca ELISA este peliculizata (captusita) cu antigen purificat

stabilizat de Toxoplasma gondii, spalata si uscata, ambalata in folie de
plastic sau metalizata, gata de utilizare.
b) Martorul pozitiv este obtinut de la porci imunizati cu antigen
Toxoplasma gondii purificat. Se prezinta ca un lichid clar, alb-galbui si
contine stabilizator. Se dilueaza 1/10 pentru lucru.
c) Martorul negativ este recoltat de la porci liberi de toxoplasmoza. Se
prezinta ca un lichid clar, alb-galbui si contine stabilizator. Se dilueaza
1/10 pentru lucru.
d) Conjugatul anti-IgG porc este reprezentat de IgG capra anti-IgG de
porc, cuplata cu peroxidaza. Se prezinta ca un lichid clar, de culoare brunroscata, concentrat de 100 de ori. Contine stabilizator. Se dilueaza pentru
lucru.
e) Substratul este o solutie de perhidrol (H2O2) in tampon citrat. Se prezinta
ca un lichid clar, incolor.
f) Cromogenul este o solutie concentrata de ABTS. Se prezinta ca un lichid
clar, de culoare verde si este gata de utilizare.
g) Diluantul pentru seruri si conjugat este reprezentat de un tampon fosfat
cu adaos de albumina serica bovina si conservant. Se prezinta ca un lichid
clar de nuanta verzuie si este gata de utilizare. Prin agitare produce spuma.
h) Solutia de spalare se prezinta ca un lichid clar care prin agitare produce
spuma. Este concentrat de 10 ori. Se dilueaza pentru lucru.
i) Reactivul de stopare (NaF) este o pulbere cristalina de culoare alba. Se
dizolva in apa distilata pentru lucru.
Contract nr. 361/8.12.2006

34
umana
Conditii de conservare : Trusa ELI-Tox-P se pastreaza la 2-8 oC, in

ambalajul original.
Valabilitate : 12 luni de la data fabricatiei, in conditiile mentionate mai sus.
Informatii generale despre boala : Toxoplasmoza este o zoonoza care
afecteaza omul si numeroase specii de animale homeoterme si pasari, fiind
raspandita pe tot globul. Rezervorul de infestare are doua componente si
anume: abiotica- unde se dezvolta oochisturile si biotica- reprezentata de
toate speciile de mamifere din genul Felix si Lynx- gazde definitive ale
parazitului Toxoplasma gondii. Gazdele intermediare sunt reprezentate de
om si alte homeoterme care se pot manifesta si pot fi si surse de infestare
cu Toxoplasma gondii. Toxoplasmoza poate fi considerata ca fiind una
dintre cele mai importante zoonoze, prin impactul social deosebit pe care-l
are, contaminarea femeii gravide soldandu-se cu avortul sau moartea
fatului.
Prin detectarea serologica a toxoplasmozei la porcine se reduc prevalenta
infestatiei parazitare la acestea, pierderile economice reprezentate de
avorturi, fatari de produsi neviabili, dar scad si sursele de infestare pentru
om.
Principiul metodei :
Anticorpii anti Toxoplasma gondii, de tip IgG din ser, sunt detectati prin
testul ELISA varianta indirecta. In test, anticorpii reactioneaza specific cu
antigenul Toxoplasma gondii fixat pe imunosorbent (microplaca) si apoi
cu conjugatul anti IgG de porc marcat cu peroxidaza. Complexul antigenanticorp specific- anti IgG porc peroxidaza format, este evidentiat prin
actiunea enzimei asupra substratului specific (H2O2), cu modificarea culorii
unui cromogen (ABTS) care se oxideaza, intensitatea culorii fiind
Contract nr. 361/8.12.2006

35
umana
determinata fotometric la 405 nm si exprimata in unitati densitate optica

(DO). Reactia se interpreteaza in raport cu valorile DO ale martorilor
pozitiv si negativ.
Pentru detectia anticorpilor din ser anti- Toxoplasma gondii, trusa ELIToxoP utilizeaza un antigen solubil total.
Instructiuni
de
folosire
trusa
Eli-Tox-P
pentru
diagnosticul
imunoenzimatic al toxoplasmozei la porcine:

Scopul utilizarii : Eli-Tox-P este o trusa de diagnostic, bazata pe tehnica
ELISA, varianta indirecta, utilizata in detectarea anticorpilor de tip IgG
anti-Toxoplasma gondii din seruri de porcine.
Anticorpii specifici anti-Toxoplasma gondii din serurilerecoltate de la
porcine recunosc antigenul T. gondii utilizat la captusirea microplacilor.
Principiul metodei : Anticorpii anti-Toxoplasma gondii, de tip IgG, din ser,
sunt detectati prin tehnica ELISA, varianta indirecta. In test, anticorpii
reactioneaza
specific
cu
antigenul
Toxoplasma
gondii
fixat
pe
imunosorbent (microplaca) si apoi cu conjugatul anti-IgG de porc marcat

cu
peroxidaza.
Complexul
antigen-anticorp
specific-anti-anticorp-
peroxidaza format este evidentiat prin actiunea enzimei asupra substratului

specific (H2O2), cu modificarea culorii unui cromogen (ABTS) care se
oxideaza, intensitatea culorii fiind determinata fotometric la 405 nm.
Reactia se interpreteaza in raport cu valorile densitatilor optice ale
martorilor pozitiv si negativ.
Probe de examinat: Probe de seruri prelevate dupa coagularea sangelui
recoltat de la porcine. Tuburile cu probe de testat trebuie sa fie inchise
ermetic pentru a se evita impurificarile de orice fel. Pana la utilizare in test,
probele se pastreaza la congelator la 20oC.
Contract nr. 361/8.12.2006

36
umana
Modul de lucru :
Materiale necesare in dotarea laboratorului: apa distilata/ deionizata;
pipete mono- si multicanal, reglabile si fixe, 2-1000 l; pipete sticla 10 ml;
eprubete/ tuburi polietilena 1-2 ml si sticla 10-20 ml; hartie absorbanta
(filtru/sugativa); alcool sanitar; incubator prevazut cu agitare pentru placi
ELISA; aparat de spalare automata pentru placi ELISA; fotometru
multicanal (uv/vis) cu cititor de placi ELISA la 405 nm si imprimanta.
Prepararea reagentilor
Echilibrarea termica a reagentilor:
Componentele trusei, cu exceptia conjugatului 100X se aduc la temperatura
camerei cu cel putin 30 minute inainte de lucru. Dupa echilibrare termica
se agita usor pentru omogenizare. Se vor efectua dilutii conform celor de
mai jos pentru fiecare placa din trusele ELI-Tox-P.
Diluarea martorilor de reactie:
Martorii de reactie, pozitiv si negativ se dilueaza 1/10 in diluantul pentru
ser si conjugat in modul urmator:
25 l martor pozitiv 10X + 225 l diluant
25 l martor negativ 10X + 225 l diluant
Diluarea probelor de testat:
Probele de testat (seruri prelevate dupa coagularea sangelui recoltat de la
porci) se dilueaza 1/400 in diluant pentru ser si conjugat in doua etape in
modul urmator:
dilutie 1/20: 10 l proba + 190 l diluant pentru ser si conjugat,
dilutie 1/20: 10 l proba diluata 1/20 + 190 l diluant pentru ser si
conjugat.
Diluarea conjugatului anti - IgG porc marcat cu peroxidaza:
Contract nr. 361/8.12.2006

37
umana
Conjugatul anti IgG de porc marcat cu peroxidaza se dilueaza 1/100 in

diluant pentru ser si conjugat in modul urmator:
100 l conjugat + 9,9 ml diluant pentru ser si conjugat.
Diluarea solutiei de spalare 10X:
Solutia de spalare se dilueaza 1/10 cu apa distilata in modul urmator:
30 ml solutie de spalare 10X + 270 ml apa distilata.
Modul de executare a testului:
Reactia cu serul:
Martorii de reactie (pozitiv si negativ) diluati se distribuie in dublet, cate
100 l/godeu. Probele de testat (diluate conform instructiunilor de mai sus)
se distribuie fiecare in cate un godeu, cate 100 l/godeu (92 probe/placa).
Se incubeaza placa 60 minute la 37 oC, cu agitare.Se spala placa de trei ori
cu 250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita usor. Dupa ultima spalare,
placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de filtru.
Reactia cu conjugatul imunoenzimatic:
Se adauga in toate godeurile cate 100 l conjugat diluat (1/100 in diluant
pentru ser si conjugat). Se incubeaza 60 minute la 37 oC, cu agitare.
Se spala placa de trei ori cu 250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita
usor. Dupa ultima spalare, placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de
filtru.
Reactia cu substratul specific enzimei:
Se prepara substratul: peste 11 ml substrat de perhidrol in tampon citrat se
adauga 0,45 ml solutie ABTS si se agita usor pentru omogenizare. Se
distribuie in fiecare godeu cate 100 l. Placa se lasa la intuneric, la
temperatura camerei. Intre timp, se prepara reactivul de stopare: se dilueaza
agentul de stopare (NaF) in 6 ml apa distilata. Dupa 30 minute reactia se
Contract nr. 361/8.12.2006

38
umana
stopeaza imediat cu 50 l/godeu din solutia de stopare si placa se citeste la

fotometru multicanal la 405 nm.
Criterii de validare :
- Valoarea DO (media) martorului negativ: mai mica de 0,300;
- Valoarea DO (media) martorului pozitiv: mai mare de 0,800.
Interpretarea rezultatelor :
Se calculeaza valoarea S/P pentru fiecare proba conform formulei:

S/P = (DOproba - DO martor negativ)/ (DOmartor pozitiv - DO martor negativ)
- probele pentru care valorile S/P 0,25 sunt considerate pozitive;
- probele pentru care valorile S/P < 0,15 sunt considerate negative;
- probele pentru care 0,15< S/P 0,25 sunt considerate dubioase si
animalele de la care provin trebuie retestate dupa 30 zile.
Norme tehnice de preparare :
Microplaci ELISA peliculizate/captusite cu antigen
Definitia produsului: Microplaci ELISA cu 96 godeuri captusite cu antigen
Toxoplasma gondii care recunoaste si fixeaza anticorpii specifici din
probe de seruri prelevate dupa coagularea sangelui recoltat de la porci.
Modul de preparare: Prepararea antigenului somatic total de Toxoplasma
gondii: Antigenul somatic total este utilizat pentru captusirea microplacilor
de reactie care intra in componenta trusei ELI-Tox P. Pentru prepararea
antigenului Toxoplasma godii utilizat in tenica ELISA, varianta indireacta
s-au utilizat paraziti recoltati din exsudatul peritoneal de la soareci infestati
cu tulpina RH de Toxoplasma gondii.
Prepararea antigenului se realizeaza in mai multe etape:
Contract nr. 361/8.12.2006

39
umana
- recoltarea exsudatului peritoneal, cu parazitul sub forma de trofozoid de la

soarecii inoculati anterior cu tulpina RH de Toxoplasma gondii; recoltarea
efectuandu-se la 4-5 zile de la inocularea intraperitoneala a soarecilor;
- reluarea exsudatului peritoneal recoltat de la soareci, pe tampon fosfat salin
0,01M (PBS) steril, pH=7,4;
- filtrarea suspensiei parazitare obtinute printr-un filtru de 3 mm;
- prelucrarea suspensiei parazitare filtrate prin 3 cicluri de inghetare dezghetare, urmate de ultrasonicare de 10 ori, 35W/30 sec./ciclu;
- ultracentrifugarea suspensiei obtinute anterior la 10000 rpm, 40 min. la 4
o
C;
- supernatantul reprezinta antigenul solubil total utilizat in tehnica ELISA.

Continutul de proteina (determinat prin metoda Lowry) al antigenului
Toxoplasma gondii trebuie sa fie mai mare de 1 mg/ml.
Antigenul Toxoplasma gondii se depoziteaza la congelator la 20 oC pana ce
este utilizat la captusirea placilor ELISA.
Captusirea/peliculizarea placilor cu antigen: Antigenul Toxoplasma gondii
se dilueaza in hidroxid de sodiu 0,1M si se distribuie cate 100 l in godeurile
microplacii. Se incubeaza placa timp de 60 minute la 37 oC, cu agitare. Dupa
incubare, placile se spala, se trateaza cu solutie stabilizatoare si se usuca la 30
o
C in curent de aer.
Controlul peliculizarii cu antigen: Se efectueaza prin sondaj, de catre

producator, prin tehnica ELISA.
Modul de ambalare a placilor peliculizate cu antigen: Microplacile captusite
/ peliculizate cu antigen se ambaleaza individual, in folie de plastic sau
metalizata, etichetata/inscriptionata cu: denumirea producatorului; denumirea
produsului; seria; valabilitatea.
Contract nr. 361/8.12.2006

40
umana
Conservarea placilor peliculizate cu antigen: La 28 oC, in ambalajul

original.
Valabilitatea placilor peliculizate cu antigen: 12 luni de la data prepararii, in
conditiile mentionate mai sus.
Martor pozitiv anti-Toxoplasma gondii: Martorul pozitiv este ser sanguin
de porc obtinut prin imunizarea acestuia cu antigen Toxoplasma gondii.
Modul de preparare:
Porci adulti sunt imunizati prin inoculare cu trofozoiti de Toxoplasma gondii,
intraperitoneal, cu 400 000 trofozoiti/ml de inocul.
Controlul martorului pozitiv: Martorul pozitiv trebuie sa se prezinte ca un
lichid clar, de culoare alb-galbuie sau slab rosiatica.
Stabilirea titrului anticorpilor antiToxoplasma gondii se realizeaza prin
tehnica ELISA. Densitatea optica a martorului pozitiv trebuie sa fie mai mare
de 0,800.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, martorul pozitiv se livreaza
prediluat, ambalat in flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand
cantitatea necesara pentru lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta pe care
sunt inscriptionate: numele producatorului; denumirea produsului; numarul
seriei; valabilitatea.
Conditii de pastrare: Martorul pozitiv se pastreaza la 28 oC, in ambalajul
original.
Valabilitate: Martorul pozitiv este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in
Martor negativ de porc : Martorul negativ este ser sanguin provenit de la
porcine libere de toxoplasmoza, porci proveniti dintr-un efectiv in care nu sau inregistrat avorturi de origine parazitara.
Contract nr. 361/8.12.2006

41
umana
Controlul martorului :
Martorul negativ trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, de culoare albgalbuie sau slab rosiatica.
Stabilirea titrului anticorpilor antiT. gondii se realizeaza prin tehnica
ELISA. Densitatea optica a martorului negativ trebuie sa fie mai mica de
0,300.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, martorul negativ se livreaza
prediluat, ambalat in flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand
cantitatea necesara pentru lucru.
Conditii de pastrare:Martorul negativ se pastreaza la 28 oC, in ambalajul
original.
Valabilitate: Martorul negativ este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in
Conjugatul imunoenzimatic anti-IgG porc 100X : Conjugatul imunoenzimatic
anti IgG porc este o imunoglobulina de caprare anti IgG porc, cuplata cu
peroxidaza, utilizata la determinarea concentratiei de anticorpi specifici fata
de un antigen patogen, prin testul ELISA, varianta indirecta. Produsul se
prezinta sub forma unei solutii clare sau usor opalescente, de culoare brunroscata, fara miros.
Modul de preparare: Peroxidaza (produs comercial) se dizolva in solutie de
bicarbonat de sodiu si se trateaza cu o solutie alcoolica de 2,4dinitrofluorbenzen 1N la temperatura camerei. In continuare, se adauga o
solutie de periodat de sodiu si, dupa 30-60 minute, etilenglicol 0,16M.
Amestecul se dializeaza fata de tampon carbonat pH= 9,5. Se adauga
Contract nr. 361/8.12.2006

42
umana
imunoglobulina de capra anti IgG porc si amestecul se tine 2 ore la 20 oC.

Conjugatul se stabilizeaza cu borohidrura de sodiu, apoi se dializeaza fata de
tampon fosfat. Produsul se utilizeaza nepurificat. In final, conjugatul obtinut
se amesteca cu o solutie stabilizatoare.
Controlul conjugatului:
Control organoleptic: Produsul trebuie sa fie clar, de culoare brun-roscata,
fara miros.
Identificare: Se adauga o picatura de conjugat peste 1 ml solutie de substrat
(perhidrol in tampon citrat cu cromogenABTS). Apare imediat o culoare
intensa, verde, de cromogen oxidat.
Controlul calitatii conjugatelor s-a efectuat prin determinarea urmatoarelor
criterii de calitate: raportul absorbantelor proteinei marcate la 403 nm si 280
nm, specificitatea de specie si capacitatea de anticorp.
Raportul absorbantelor proteinei marcate reflecta gradul de marcare al
anticorpului cu enzima (peroxidaza). Acest raport este limitat de capacitatea
maxima de legare a peroxidazei (sase molecule de peroxidaza la o molecula
de anticorp), avand valori intre 0,3 0,5.
Dupa prepararea conjugatelor, acestea sunt diluate 1/10 in tampon fosfat
0,1M. Citirea absorbantelor se face la un spectrofotometru la lungimile de
unda de 403 si 280 nm.
Determinarea specificitatii de specie si a capacitatii de anticorp a
conjugatului:
Reactivi: tampon carbonat 0,1 M, pH 9,6; albumina serica bovina (BSA);
lichid de diluare; ser normal de pasare; ser normal de cal; ser normal de bou;
ser normal de oaie; ser normal de porc; ser normal de iepure; substrat:
Contract nr. 361/8.12.2006

43
umana
perhidrol in tampon citrat; cromogen: solutie ABTS; lichid de spalare; solutie

de stopare.
Efectuarea determinarii: Se peliculizeaza obisnuit o placa ELISA cu ser
normal de pasare, de cal, de bou, de oaie, de porc, de iepure, in dilutii 1/100
in tampon carbonat (cel putin un rand de godeuri pentru fiecare ser de
specie).
Dupa spalare, se adauga conjugatul IgG de capra anti IgG porc, diluat la
dilutia de lucru in PBS cu tween si 1% BSA si se incubeaza o ora la 37 oC.
Dupa spalare, se adauga substratul si cromogenul in conformitate cu
instructiunile de folosire a trusei.
Conjugatul se considera specific si cu capacitate de anticorp satisfacatoare
pentru Ig din specia recomandata omologa daca are DO de cel putin 10 ori
mai mare decat DO corespunzatoare serurilor heterologe.
Alegerea dilutiei de conjugat pentru varianta indirecta a testului se face prin
analiza rezultatelor ELISA obtinute pe placi peliculizate cu antigen
Toxoplasma gondii si seruri martor de reactie, in sistem analitic complet,
similar cu cel de diagnostic. S-a ales dilutia de 1/100 pentru conjugat in
diluantul pentru ser si conjugat.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, conjugatul se ambaleaza in
flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, in cantitate corespunzatoare pentru
lucru.
Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu:
denumirea unitatii
producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.

Conditii de conservare: La 2 8 oC, ferit de lumina, in ambalajul original.
Valabilitate: 12 luni de la data prepararii, in conditiile de conservare
mentionate mai sus.
Contract nr. 361/8.12.2006

44
umana
Prepararea substratului (solutie perhidrol in tampon citrat) : Substratul este

o solutie de peroxid de hidrogen in tampon citrat 2,3%, pH 4. Se utilizeaza
conform instructiunilor din trusa ELI-Tox-P.
Caracteristicile produsului: Substratul se prezinta ca un lichid clar, incolor,
cu pH 4.
Modul de preparare: Se cantaresc 6,9 g acid citric (C6H8O7 x H2O) si se
dizolva in 2,5 l apa distilata. Se ajusteaza pH-ul la 4 cu o solutie de NaOH
30%. Se completeaza cu apa distilata pana la un volum final de 3 l. Se
controleaza pH-ul final care trebuie sa fie 4. Se adauga cantitatea necesara de
perhidrol si se sterilizeaza prin filtrare.
Contro: Produsul trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, incolor, cu pH 4.
Conditionare: Solutia se conditioneaza in flacoane brune la volume de 11 ml,
22 ml si 55 ml.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, substratul, ambalat in flacoane
inchise ermetic, se afla in cantitatea necesara pentru lucru.
Conditii de pastrare: Substratul se pastreaza la 2 8 oC, ferit de lumina, in
ambalajul original.
Valabilitate : Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile
de pastrare mentionate mai sus.
Prepararea si controlul cromogenului (solutie de ABTS) : Cromogenul este o
solutie apoasa de ABTS (2,2 Azino di (3-etil) benztiazolin sulfat) 1,5%.
Se utilizeaza conform instructiunilor din trusa.
Caracteristicile produsului: Solutie limpede de culoare verde.
Contract nr. 361/8.12.2006

45
umana
Modul de preparare: Se cantaresc 2,25 g ABTS si se dizolva in 0,15 l apa

distilata. Se sterilizeaza prin filtrare.
Controlul cromogenului: Solutia de cromogen trebuie sa fie limpede, de
culoare verde.
Conditionare: Solutia de cromogen se fioleaza in flacoane, in volume de 0,6
ml, 1,2 ml sau 3 ml.
Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, cromogenul se ambaleaza in
cantitatile necesare pentru lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta
Conditii de pastrare: Solutia de cromogen se pastreaza la 2 8 oC, ferita de
lumina, in ambalajul original.
Prepararea diluantului pentru ser si conjugat : Diluantul pentru ser si conjugat
este reprezentat de tampon fosfat salin 0,01M cu 1% albumina serica bovina,
0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si pH 7,2 7,4. Se utilizeaza conform
instructiunilor din trusa.
Caracteristicile produsului: Lichid clar cu nuanta verzuie si pH 7,2 7,4. La
Modul de preparare:
76,5 g NaCl
8,5 g NaCl
Contract nr. 361/8.12.2006

46
umana

Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 7,2 7,4. Se adauga 1%
albumina serica bovina, 0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si colorantul. Se
sterilizeaza prin filtrare si se conditioneaza in flacoane de sticla/plastic
inchise ermetic la volume de 60 ml, 100 ml, 120 ml.
Control pe flux: Diluantul pentru ser si conjugat trebuie sa se prezinte ca o
solutie limpede de nuanta verzuie, cu pH 7,2 7,4.
corespunzatoare necesarului de lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta
Conditii de pastrare: Diluantul pentru ser si conjugat se pastreaza la 2 8
o
C, in ambalajul original.

Prepararea solutiei de spalare 10X : Solutia de spalare 10X este reprezentata
de tampon fosfat salin 0,1M, pH 6,8 6,9 cu 0,5% tween 20 si 0,01%
thiomersal. Se utilizeaza la spalarea placilor, conform instructiunilor din
trusa.
Caracteristicile produsului: Se prezinta ca un lichid clar care prin agitare
produce spuma. Daca solutia de spalare 10X prezinta un depozit cristalin, se
aduce la temperatura camerei si se agita ca toate cristalele sa se dizolve, iar
apoi se dilueaza conform instructiunilor din trusa.
Mod de preparare:
85 g NaCl
Contract nr. 361/8.12.2006

47
umana

85 g NaCl
Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 6,8 6,9. Se adauga
0,5% tween 20 si 0,01% thiomersal. Solutia se sterilizeaza prin filtrare si se
conditioneaza in flacoane de 50 ml si 60 ml.
Control: Solutia de spalare trebuie sa se prezinte ca un lichid clar cu pH- ul
cuprins intre 6,86,9. Dupa diluare 1/10 in apa distilata, pH-ul devine 7,2
7,4.
corespunzatoare necesarului de lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta
Conditii de pastrare: Solutia de spalare 10X se pastreaza la 28 oC, in
ambalajul original.
Valabilitate:Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile de
conservare mentionate mai sus.
Prepararea reactivului de stopare : Reactivul de stopare este NaF care se
utilizeaza in trusa ca solutie 1,5%.
Mod de preparare: Se cantaresc 0,09 g/flacon, 0,18 g/flacon sau 0,45
g/flacon. Produsul este ambalat in flacoane de sticla/plastic, in cantitate
corespunzatoare pentru lucru.
Norme tehnice de control :
Determinarea
intensitatii
raspunsului
probelor
martor :
Intensitatea
raspunsului probelor martor se executa prin tehnica ELISA, varianta
Contract nr. 361/8.12.2006

48
umana
indirecta. Titrurile martorilor de reactie (la dilutia mentionata in instuctiunile

de folosire a trusei) trebuie sa corespunda normelor tehnice:
DOn < 0,300
DOp > 0,800
Aceste valori reprezinta criteriile de validare ale trusei.
Variabilitate inter-godeuri:
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, cate 4 godeuri/ser,
in patru zone ale placii.
Variabilitate inter-placi:
Martor pozitiv (MP)

Martor negativ (MN)
dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, 5 placi, cate 4
godeuri/ser/placa, in patru zone ale placilor.
Detectabilitatea
Curba de titrare a serului martor pozitiv, aplicat in 9 dilutii (1/10; 1/15; 1/20;
titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si valoarea DO. Valoarea limitei
Contract nr. 361/8.12.2006

49
umana
de pozitivare (cut-off pozitiv) trebuie sa fie mai mica decat valoarea DO a

serului martor pozitiv la dilutia 1/20.
Specificitatea
Determinarea specificitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor testa 10 seruri
prelevate de la porci confirmati ca fiind negativi printr-un alt test (testul de
imunofluorescenta indirecta).
Cele 10 seruri trebuie sa fie negative si prin testare cu trusa ELI-Tox-P.
Sensibilitatea
Determinarea sensibilitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor testa 10 seruri
negative si 10 seruri pozitive confirmate printr-un alt test (testul de
imunofluorescenta indirecta).
Cele 10 seruri negative trebuie sa fie intotdeauna negative si cele 10 seruri
pozitive sa fie intotdeauna pozitive prin testare cu trusa ELI-Tox-P.
Reproductibilitatea
Controlul reproductibilitatii intraplaca:
Se vor testa in duplicat 10 seruri negative si 10 seruri pozitive confirmate
printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).
Controlul reproductibilitatii interplaci :
Se vor testa, pe cate doua placi, 10 seruri negative si 10 seruri pozitive
confirmate printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).
Performantele produsului :
Limita de detectie:
Serurilor martor (pozitiv si negativ) au fost titrate, stabilindu-se limita de
detectie a testului.
Contract nr. 361/8.12.2006

50
umana
Curba de titrare a martorului pozitiv, aplicat in 9 dilutii (1/10; 1/15; 1/20;

titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si valoarea DO.
Rezultate:
30 min
dilutie
1/10
1/15
1/20
1/25
1/30
1/35
1/40
1/45
1/50
Mp
Mn
1.443
1.257
1.068
1.013
0.980
0.924
0.825
0.802
0.759
0.175
0.157
0.147
0.143
0.138
0.136
0.131
0.129
0.124
Controlul valorii de diagnostic al testului ELISA s-a realizat prin efectuarea

de teste comparative cu alte teste, pe probe din teren (probe de seruri
provenite de la porci).
Astfel, au fost testate 204 probe, iar ca teste comparative s-a utilizat testul
de imunofluorescenta indirecta (IFI).
Rezultate: Probele pozitive testate prin IFI au fost pozitive la ELISA, iar cele
negative s-au prezentat la ELISA ca fiind negative .
Sensibilitate: (10 probe de la porci, IFI pozitive)
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutii:
REZULTATE:
Contract nr. 361/8.12.2006

51
umana
DO: 1,621
S/P = (1,621 0,075)/(1,443-0,075) = 1,546/1,368 = 1,13
1,257
S/P = (1,257 0,075)/(1,443-0,075) = 1,182/1,368 = 0,864
1,033
S/P = (1,033 0,075)/(1,443-0,075)= 0,958/1,368 = 0,700
0,602
S/P = (0,602 0,075)/(1,443-0,075)= 0,527/1,368 = 0,385
1,526
S/P = (1,526 0,075)/(1,443-0,075)= 1,451/1,368 = 1,060
0,454
S/P = (0,454 0,075)/(1,443-0,075)= 0,379/1,368 = 0,277
1,822
S/P = (1,822 0,075)/(1,443-0,075)= 1,747/1,368 = 1,277
1,610
S/P = (1,610 0,075)/(1,443-0,075) = 1,535/1,368 = 1,122
0,509
S/P = (0,509 0,075)/(1,443-0,075)= 0,434/1,368 = 0,317
0,770
S/P = (0,770 0,075)/(1,443-0,075)= 0,695/1,368 = 0,508
Mp: 1,443
Mn: 0,075
Valorile S/P seruri testate > 0,25
Concluzie: toate probele testate sunt pozitive.
Specificitate: (10 probe de la porci, IFI negative)
Martor pozitiv (MP)
Martor negativ (MN)
dilutii:
REZULTATE:
DO: 0,143 S/P = (0,143 0,075)/(1,443-0,075)= 0,068/1,368 = 0,049
0,254
S/P = (0,254 0,075)/(1,443-0,075)= 0,179/1,368 = 0,130
0,146
S/P = (0,146 0,075)/(1,443-0,075)= 0,071/1,368 = 0,052
0,171
S/P = (0,171 0,075)/(1,443-0,075)= 0,096/1,368 = 0,070
0,155
S/P = (0,155 0,075)/(1,443-0,075)= 0,080/1,368 = 0,058
Contract nr. 361/8.12.2006

52
umana
0,154
S/P = (0,154 0,075)/(1,443-0,075)= 0,079/1,368 = 0,057
0,193
S/P = (0,193 0,075)/(1,443-0,075)= 0,118/1,368 = 0,086
0,271
S/P = (0,271 0,075)/(1,443-0,075)= 0,196/1,368 = 0,143
0,134
S/P = (0,134 0,075)/(1,443-0,075)= 0,059/1,368 = 0,043
0,239
S/P = (0,239 0,075)/(1,443-0,075)= 0,164/1,368 = 0,119
Mp: 1,443
Mn: 0,075
Valorile S/P seruri testate < 0,25
Concluzie: toate probele testate sunt negative.
Repetabilitate: Au fost testate, din punct de vedere al repetabilitatii, serurile
martor si s-au obtinut urmatoarele valori ale coeficientilor de variabilitate
inter-godeuri:
Placa 1:
citire 30 min.
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
Placa 2:
godeu 1
1.485
0.075
1.449
0.074
1.410
0.078
1.428
0.073
godeu 2
1.452
0.075
1.438
0.071
1.436
0.075
1.461
0.072
godeu 3
1.432
0.072
1.463
0.069
1.428
0.075
1.435
0.077
godeu 4
1.459
0.072
1.458
0.075
1.432
0.077
1.451
0.075
Coef. variab. (%)

1.502
2.356
0.756
3.811
0.804
1.967
1.038
2.986
citire 7 min.
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
godeu 1
1.465
0.076
1.436
0.078
1.399
0.079
1.413
0.075
godeu 2
1.466
0.079
1.455
0.074
1.421
0.076
1.432
0.074
godeu 3
1.450
0.078
1.463
0.072
1.419
0.076
1.436
0.071
godeu 4
1.458
0.077
1.463
0.079
1.430
0.081
1.445
0.075
Coef. variab. (%)

0.507
1.665
0.875
4.361
0.922
3.140
0.941
2.566
Au fost testate, din punct de vedere al repetabilitatii, serurile martor si s-au

obtinut urmatoarele valori ale coeficientilor de variabilitate inter-placi:
Contract nr. 361/8.12.2006

53
umana
Rezultate: citire 30 minute

Placa 1
1.448
1.450
1.443
0.0735
0.0775
0.07625
Placa 2
1.470
1.440
1.396
0.07225
0.07575
0.078
Placa 3
1.459
1.452
1.397
0.07625
0.078
0.078
Placa 4
1.456
1.439
1.399
0.07425
0.07375
0.07625
Coef. variab. (%)

0.624
0.463
1.623
2.262
2.525
1.604
Valoarea de diagnostic a testului ELISA, comparativ cu alte teste :

Valoarea de diagnostic a testului ELISA cu trusa ELI-Tox-P a fost stabilita
comparativ cu IFI (testul de imunofluorescenta indirecta).
Au fost testare un numar de probe 204, seruri prelevate de la porci si s-au
obtinut urmatoarele rezultate:
Probe testate
Probe pozitive
Probe negative
ELI-Tox P
204
165
39
IFI
204
160
24
IFI
ELISA
+
+
158
7
2
37
Total
160
44
SENSIBILITATE = 98,75%
SPECIFICITATE = 84,09%
CORELATIA GLOBALA = 95,58%
Total
165
39
204
Trusele Eli-Tox-O si Eli-Tox-P de detectie a anticorpilor de tip IgG din

seruri provenite de la ovine, respectiv porcine, prin tehnica imunoenzimatica,
varianta indirecta, au fost inregistrate pe piata romaneasca.
Contract nr. 361/8.12.2006

54
umana
1.1.2. Tehnica de imunofluorescenta indirecta de detectie a

parazitului Toxoplasma gondii din probe biologice
Principiul reaciei: decelarea parazitului Toxoplasma gondii, prin punerea
n contact a probelor biologice de cercetat cu serul martor pozitiv i
vizualizarea
complexului
antigen-anticorp
cu
ajutorul
unei
anti-
imunoglobuline de specie cuplata cu FITC.

Aparatura, materiale:
-
microscop cu lumina uv, echipat pentru microscopia cu fluorescenta; termostat;

agitator magnetic; pipete gradate; tampon fosfat salin 0,1M pH 7,2-7,4 cu Evans
blau ;
martor de reactie pozitiv : lame cu lichid peritoneal de la oricei infestati cu

Toxoplasma gondii;
ser martor pozitiv de porc ; conjugat imunofluorescent anti-IgG porc;
creier, intestin, ficat si splina provenite de la soricei inoculati cu Toxoplasma

gondii ;
glicerin neutr; lamele; tampon fosfat salin 0,01M pH 7,2 7,4.
Mod de lucru:
Soriceii pe care se paseaza tulpina de Toxoplasma gondii in laborator,
au fost sacrificati la 72 de ore post inoculare si s-au recoltat creierul, splina,
intestin si ficat care au fost prelucrate pentru a se obtine preparate
histologice, in modul urmator : Organele (intestin subtire, splina, ficat si
creier) au fost fixate in solutia Baker timp de 2-3 zile, apoi au fost
deshidratate de trei ori, in bai succesive, timp de 2 ore fiecare, de alcool
etilic 50%, 70% si 96% cu ajutorul aparatului Automat Citadel 1000,
Shandon. Probele au fost apoi clarificate in trei bai succesive, timp de 2 ore
fiecare si au fost supuse parafinarii, in doua bai de parafina (Paraplast Plus)
la temperatura de 56oC, timp de 2-4 ore fiecare. Blocurile de parafina in
Contract nr. 361/8.12.2006

55
umana
faza lichida ce contineau fragmentele tisulare au fost depuse rapid pe o

plita refrigeratoare la 5oC. Fragmentele de tesut astfel obtinute s-au
solidificat formand un bloc ce a pastrat contururile recipientului.
Blocurile de parafina au fost montate pe portobiecte si sectionate la
microtomul pentru parafina, la o grosime de 5 micrometri (Microtome AS
325, Shandon). Sectiunile obtinute au fost aplicate pe lame de sticla perfect
degresate si tratate cu poli L-lizina (Sigma).
Pentru a putea fi utilizate in tehnica de imunofluorescenta, sectiunile
tisulare au fost supuse deparafinarii : trei bai succesive de toluen, timp de
30 minute fiecare si apoi hidratarii : trei bai succesive de alcool etilic de
96%, 70% si 50%, timp de 2 minute fiecare, dupa care o baie de apa
distilata care a fost urmata de fixarea sectiunilor in acetona timp de 30
minute la 4oC.
Tehnica de imunofluorescenta indirecta :
Lamele martor : Lichid ascitic prelevat de la soricei inoculati cu parazitul
Toxoplasma gondii, a fost etalat pe lame de microscop, in prealabil spalate
si degresate, s-a lasat sa se usuce si apoi lamele au fost fixate in acetona.
Pe lamele cu antigen Toxoplasma gondii, fixate n acetona, s-au repartizat
serurile de porc, pozitiv si negativ, diluate 1/16, s-au incubat 30 minute la
37oC, n camera umed.
Pe lamele cu sectiuni tisulare s-a repartizat numai ser de porc, pozitiv la
Toxoplasma gondii, diluat 1/16 si s-au incubat s-au incubat 30 minute la
37oC, n camera umed.
S-au splat lamele 10 minute n PBS 0,01M i s-a adugat conjugatul
fluorescent anti-IgG porc diluat 1/50 n tampon fosfat salin 0,1M cu Evans
blau.
Contract nr. 361/8.12.2006

56
umana
Preparatele s-au introdus n termostat timp de 30 minute, n camera umed,

apoi s-au introdus ntr-o baie cu tampon fosfat salin 0,01M i s-au splat
timp de 10 minute pentru ndeprtarea conjugatului n exces.
S-au lsat s se usuce, s-au montat preparatele n glicerin neutr, s-au
acoperit cu lamele i s-au citit la microscopul cu fluorescen.
Rezultat: Reacia s-a considerat pozitiv atunci cnd s-a remarcat prezenta
elementelor parazitare cu un halou luminos galben verzui n jurul celulei
parazitare. Intensitatea reaciei pozitive s-a apreciat dup intensitatea
fluorescenei, dar i dup numrul de parazii care au prezentat
fluorescen. Reacia s-a considerat negativ atunci cnd nu s-au remarcat
elemente parazitare fluorescente.
Martor pozitiv. Imunofluorescenta indirecta din

lichid peritoneal, cu numeroase elemente parazitare
(x40)
Contract nr. 361/8.12.2006

57
umana
Martor negativ. Imunofluorescenta indirecta din

lichid peritoneal (x40)
Martor negativ. Imunofluorescenta indirecta din lichid peritoneal (x40)
Contract nr. 361/8.12.2006

58
umana
Martor pozitiv. Imunofluorescenta indirecta din lichid

peritoneal, cu numeroase elemente parazitare (x40)

Contract nr. 361/8.12.2006

59
umana


Contract nr. 361/8.12.2006

60
umana

Sectiune creier. Imunofluorescenta indirecta, negativ

(x40), fara elemente parazitare
Contract nr. 361/8.12.2006

61
umana
Sectiune creier. Imunofluorescenta indirecta,

negativ (x40), fara elemente parazitare
Sectiune
ficat.
Imunofluorescenta
indirecta,
Contract nr. 361/8.12.2006

62
umana
Sectiune intestin. Imunofluorescenta indirecta,


Contract nr. 361/8.12.2006

63
umana
Sectiune splina. Imunofluorescenta indirecta,

Sectiune ficat. Imunofluorescenta indirecta,

Contract nr. 361/8.12.2006

64
umana
Sectiune intestin. Imunofluorescenta indirecta

(x40), cu elemente parazitare fluorescente

Contract nr. 361/8.12.2006

65
umana


Contract nr. 361/8.12.2006

66
umana


Contract nr. 361/8.12.2006

67
umana

Sectiune splina. Imunofluorescenta indirecta,

Contract nr. 361/8.12.2006

68
umana
Tehnica imunoperoxidazei, varianta indirecta :

Sectiunile tisulare preparate au fost utilizate ca probe biologice pentru
detectia parazitului Toxoplasma gondii, prin tehnica imunoperoxidazei,
varianta indirecta.
Principiul metodei: Evidenierea cuplului antigen-anticorp cu ajutorul
anticorpilor anti-specie marcai cu peroxidaz HRP (conjugat enzimatic) i
evidenierea reaciei la microscopul optic cu lumin n vizibil.
Reactivi i aparatur:
-
Preparate citologice/histologice obinute de la animalele moarte sau sacrificate;
Ser policlonal/monospecific antivirus preparat pe purcei gnotobiotici;
Conjugat cu peroxidaz specific (IgG anti-IgG porc cuplat cu HRP);
Tampon borat salin sau PBS pH 7,2-7,4;
Ap oxigenat soluie 3% n alcool metilic p.a.; Ap distilat; Aceton anhidr;
Colorant: Hematoxilin Meyer sau echivalent pentru contracolorre;
Cromogen DAB (3,3` - Diamininobenzidine- Sigma) utilizat conform instruciunilor;
Toluen p.a.; Alcool etilic absolu; Baie Marie la 370C;
Supori lame/lamele i cuv de splare;
Lame Poli-PrepTM (Sigma) cu cmp electrostatic i tratate cu poly L-lisine;
Microscop optic cu lumin n spectru vizibil.
Tehnica de lucru:
preparatele citologice/histologice fixate s-au acoperit cu ser martor
(pozitiv sau negativ), diluat 1/16 n tampon fosfat salin cu 4%
albumin seric bovin i s-au incubat n camer umed, la +37o C,
timp de 60 de minute, apoi s-au splat n tampon fosfat salin pH 7,27,4, timp de 15 minute, cu agitare;
Contract nr. 361/8.12.2006

69
umana
s-a aplicat conjugat anti-IgG porc marcat cu HRP diluat 1/50 n PBS i
preparatele s-au incubat 60 de minute, la +370 C, n camera umed;
s-au splat n tampon fosfat salin, timp de 15 minute, cu agitare, apoi sa aplicat cromogenul DAB (Sigma) i s-a incubat la +370 C n camera
umed, sub control microscopic, s-au splat i contracolorat cu
hematoxilin Meyer;
Dup splarea n ap distilat, preparatele s-au deshidratat prin bi
succesive de alcool etilic i toluen i s-au montat i examinat la
microscopul optic cu lumin n vizibil .
Rezultate: Reacia imunocitohistochimic pozitiv s-a exprimat prin
precipitate brun-maronii, intens exprimate la nivelul situsurilor de localizare
a antigenului, restul preparatului avnd culoare albastru-violet. S-a considerat
reacie negativ atunci cnd pe ntreg preparatul histologic au predominat
culorile albastru-violet.
Sectiune creier (soarece). Imunoperoxidaza. Chisturi T. gondii
Contract nr. 361/8.12.2006

70
umana
Amprenta maduva osoasa (soarece). Imunoperoxidaza.

Chisturi Toxoplasma gondii.
Sectiune creier (soarece). Imunoperoxidaza.

Chist Toxoplasma gondii
Contract nr. 361/8.12.2006

71
umana

Chist Toxoplasma gondii; proces inflamator.

Contract nr. 361/8.12.2006

72
umana

1.2.
Elaborarea metodelor moleculare de detectie a Toxoplasma gondii

(teste PCR elective si metodologii de obtinere a matritelor ADN
din probe cunoscute); Validarea metodelor moleculare pe probe
cunoscute si pe probe din teren;
Toxoplasmoza este o zoonoz a crei evoluie clinic poate fi latent,
chiar asimptomatic, la indivizii imunocompeteni, sau poate mbrca forme

grave, cu localizri multiple, ce pot duce chiar la exitus, n cazul indivizilor
imunocompromii.
Diagnosticul infeciilor, clinice sau subclinice, cu Toxoplasma gondii
este destul de dificil, att la om ct i la animale.
Rezultatele examenelor de evideniere direct, prin microscopie optic, a
toxoplasmelor din probele biologice sunt adesea aleatoare, paraziii fiind
foarte rari. Mai mult dect att, toxoplasmele evideniate microscopic
Contract nr. 361/8.12.2006

73
umana
trebuiesc difereniate de: Leishmania spp, Sarcocystis spp, Besnoitia spp,

Encephalitozoon
cuniculi,
Histoplasma
capsulatum,
Cryptococcus
neoformans, Ehrlichia canis, Hepatozoon canis, fapt care ngreuneaz, de

asemenea, diagnosticul.
Rezultate cu o sensibilitate i specificitate ridicat se pot obine printr-o
seam de metode moderne, serologice sau moleculare.
Examenele serologice urmresc, n general, punerea n eviden a
anticorpilor IgG, anticorpi protectori a cror prezen atest imunitatea
purttorului i/sau a anticorpilor IgM care, cel mai adesea, dovedesc
achiziionarea recent a infeciei la un subiect care, pn atunci, nu a mai fost
infectat. Diagnosticul serologic poate da rezultate foarte slabe la indivizii
imunosupresai, la care se poate produce reactivarea chitilor.
Metodele moderne de biologie molecular, bazate pe amplificarea
genic, permit detectarea cu o specificitate de peste 97% a unor cantiti
foarte mici parazii, de ordinul a 10 tahizoii. Sensibilitatea i specificitatea
testelor PCR poate fi ns influenat de caracteristicile secvenelor de ADN
amplificate, de protocolul utilizat pentru extracia ADN, precum i de
condiiile de reacie, mai precis de programul de amplificare adoptat. Se
impune astfel o standardizare a protocoalelor de diagnostic prin PCR a
infeciei cu Toxoplasma gondii.
Dintre secvenele de ADN care alctuiesc genomul protozoarelor din
specia Toxoplasma gondii, principalele inte ale testelor PCR sunt
reprezentate de genele B1, SAG1, SAG2, SAG3, GRA4, GRA6, hsp70, ACT
1, TUB1, TUB2, B10, FOL1, dintre care, n cadrul acestui studiu au fost
vizate: B1, SAG3, GRA6 i hsp70.
Contract nr. 361/8.12.2006

74
umana
Gena B1, identificat n 1998 de BURG i col., este constituit din 2214
pb, secven care se regsete n genomul T. gondii ntr-un numr de 35 de
copii. Funciile acestei gene sunt nc necunoscute, dar nalta sa specificitate
este bine demonstrat.
Gena SAG3 este prezent ntr-o singur copie n genomul T. gondii. Ea
este prezent att la tachizoii, ct i bradizoii i codific un antigen proteic
de membran, care mediaz recunoaterea i aderena toxoplasmelor la
suprafaa celulelor gazdei.
Gena Gra6 se regsete ntr-o singur copie n genomul de Toxoplasma
i codific un antigen proteic, granular, implicat n supravieuirea
intracelular a parazitului i n mecanismele de schimb molecular cu celula
gazd.
Gena hsp70 este prezent ntr-o singur copie n genomul de
Toxoplasma. Ea codific o protein citoplasmatic de 68 78 Kda,
aparinnd familiei proteinelor de stres termic. Inducia expresiei este
asociat cu dezvoltarea i diferenierea bradizoiilor.
Proteinele hsp 70 protejaz tachizoiii contra lizei la care ei sunt expui
n celulele parazitate. Astfel, contrar tulpinilor avirulente, tachizoiii viruleni
pot persista fr s treac n starea de bradizoii imobilizai n chiti.
Expresia genei hsp70 este semnificativ mai mare la tulpinile virulente
comparativ cu cele nevirulente de T. gondii.
n prezentul studiu s-a urmrit implementarea unei tehnici PCR clasic
electiv de diagnostic a infeciei cu Toxoplasma gondii, pe probe cunoscute.
Studiul s-a axat pe identificarea prezenei celor 4 gene amintite anterior,
utiliznd n acest scop un set de 5 cupluri de amorse, ale caror secvente sunt
Contract nr. 361/8.12.2006

75
umana
prezentate n tabelul 2, iar aspecte din constructia si controlul virtual al

specificitatii acestora sunt prezentate in figurile din anexa 3.
Determinrile au fost efectuate pe probe de lichid peritoneal de oarece,
probe cunoscute ca fiind infectate cu Toxoplasma gondii.
Pentru extracia esantioanelor de ADN din probele respective s-au
tatonat diverse tehnici descrise n literatura de specialitate, dou dintre
acestea fiind prezentate la anexa 1 si in figurile 21-25 din anexa 3. ntr-un
final, extracia s-a realizat utiliznd trusa Wizard Genomic DNA Purification
Kit (Promega), prin tehnica descris in anexa 1, tehnic care, cu excepia
unor modificri minore aduse pentru a o adapta la condiiile noastre de lucru,
respect recomandrile productorului.
Amplificarea genic s-a realizat cu ajutorul sistemului Perkin Elmer
(Gene Amp PCR System 9600), prin tehnica descris in anexa 1.
Rezultatele obtinute la amplificarile PCR clasic electiv realizate pe
probe de ADN extrase din probe de lichid peritoneal de soarece infectat cu
tulpina Toxoplasma gondii RH sunt prezentate in figura 26, anexa 3. Au fost
obtinuti toti ampliconii estimati pentru toate secventele alese; in cazul a 4
dintre cele 5 cupluri de amorse in reactiile de amplificare au fost obtinuti si
ampliconi nespecifici, cu talii diferite, fapt care necesita afinari ale
programelor de amplificare. In principiu, cuplurile de amorse care genereaza
ampliconi de talie mica vor face obiectul reactiilor de amplificare de tip RealTime PCR, pentru detectii in timp real si mai ales pentru detectii combinate
cu reactii de cuantificare in vederea evaluarii gradului de virulenta al
tulpinilor decelate, spre deosebire de cuplurile de amorse care genereaza
ampliconi de talie mai mare, care vor fi utili in lucrarile de clonare
moleculara ulterioare.
Contract nr. 361/8.12.2006

76
umana
Testarile sunt in curs de evaluare / validare pe mai multe tipuri de

amplificatoare, iar specificitatea amorselor designate este in curs de testare pe
probe de ADN obtinute din diverse specii de Eimeria.
Bibliografie:
1.
AJIOKA, J. W., FITZPATRICK, JENNIFER, M., REITTER, C. P. (2001) - Toxoplasma
gondii genomics: shedding light on pathogenesis and chemotherapy, Exp. Rev. Mol. Med.,
http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/01002204h.htm.
2.
BARTOVA, E., SEDLAK, E., LITERAK, I. (2003) - Low virulence of oocysts of czech
Toxoplasma gondii isolates on the bases of biological and genetic characteristics, J. Parazitol, 89,
4, 777 781.
3.
BLACK , M. W., BOOTHROYD, J. C. (2000) - Lytic Cycle of Toxoplasma gondii,
Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64, 3, 607 623.

4.
CONRATHS, F. G., SCHARES, G., LOEFFLER, F. (2006) - Validation of Molecular
Diagnostic Techniques in the Parasitological Laboratory, Veterinary Parasitology, 136, 91 - 98.
5.
COSOROAB, I. (2005) - Zoonoze parazitare, Ed. First, Timioara
6.
DELIBAS, S. B., BAKLAR, HATICE, ERTA., ERTUG, SEMA (2006) - Evaluation of
Antigenic Variations Between Two Virulent Toxoplasma Strains, Journal of Medical
Microbiology, 55, 1333 - 1335.
7.
DUBEY, J. P. (2006) - Comparative Infectivity of Oocysts and Bradyzoites of Toxoplasma
gondii for Intermediate (mice) and definitive (cats) hosts, Veterinary Parasitology 140, 69 75.
8.
DUBEY, J. P., GENNARI, S. M., SUNDAR, N., VIANNA, M. C. B., BANDINI, L. M.,
YAI, L. E. O., KWOK, O. C. H., SU, C. (2007) - Diverse and Atypical Genotypes Identified in
Toxoplasma gondii from Dogs in Sao Paulo, Brazil, J. Parasitol, 93,1, 60 - 64.
9.
DUBEY, J. P., HUONG, L. T. T., SUNDAR, N., SU, C. (2007) - Genetic
Characterization of Toxoplasma gondii Isolates in Dogs from Vietnam Suggests Their SouthAmerican Origin; Veterinary Parasitology,146, 347 - 351.
10.
DUBEY, J. P., RAJAPAKSE, R. P. V. J., WISJESUNDERA, R. R. M. K. K. , SUNDAR,
N., VELMURUGAN, G. V., KWOK, O. C. H. , SU, C. (2007) - Prevalence of Toxoplasma
gondii in Dogs from Sri Lanka and Genetic Characterization of the Parasite Isolates, Veterinary
Parasitology, 146, 341 - 346.
11.
DUBEY, J. P., VIANNA, M. C. B., SOUSA, S., CANADA, N., MEIRELES, S.,
CORREIA DA COSTA, J. M., MARCET, P.L., LEHMAN, T., DARDES, M. L., THULLIEZ, P.
(2006) - Characterization of Toxoplasma gondii Isolates in Free- Range Chickens from Portugal,
J. Parasitol. 92, 1, 184 - 186.
12. ELLIS, J.T., (1998) - Polymerase Chain Reaction Approaches For the Detection of Neospora
caninum and Toxoplasma gondii, International Journal for Parasitology 28, 1053 - 1060.
13. HAFID, J., FLORI, P., RABERIN, H., SUNG, R. TRAN, MANH. (2001) - Comparison of
PCR, Capture ELISA and Immunoblotting for Detection of Toxoplasma gondii in Infected Mice; J.
Med. Microbiol., 50, 1100 - 1104.
14. JACQUET, A., COULON, L., DE NVE, JOL., DAMINET, VRONIQUE., HAUMONT,
MICHLE., GARCIA, LIDA., BOLLEN, A., JURADO, MARGARITA., BIEMANS, R. (2001) The surface antigen SAG3 mediates the attachment of Toxoplasma gondii to cell-surface
proteoglycans, Molecular and Biochemical Parasitology,116, 1, 35 44.
Contract nr. 361/8.12.2006

77
umana
15. JAUREGUI, L. H., HIGGINS, J., ZARLENGUI, D., DUBEY, J. P., LUNNEY, J. K. (2001) Development of a Real-Time PCR Assay for Detection of Toxoplasma gondii, in Pig and Mouse
Tissues, Journal of Clinical Microbiology, 39, 6, 2065 - 2071.
16. LEHMAN, T., BLACKSTON, C. R., PARMLEY, S. F., REMINGTON, J. S., DUBEY, J.P.
(2000) - Strain Typing of Toxoplasma gondii: Comparison of antigen-coding and housekeeping
genes, J. Parasitol 86, 5, 960 - 971.
17. MURPHY, T. M., WALOCHNIK, J., HASSE, A., MORIARTY,J., MOONEY, J., TOOLAN,
D., SANCHEZ- MIGUEL, C., LOUGHLIN, A. O., MC AULIFFE, A. (2007) - Study on the
Prevalence of Toxoplasma gondii
and Neospora caninum and molecular evidence of
Encephalitozoon cuniculi and Encephalitozoon (septata) intestinalis in red foxes (Vulpes vulpes)
in rural Ireland, Veterinary Parasitology, 146, 227 - 234.
18.
REITT, K., HILBE, M., VOEGTLIN, A., CORBOZ, I., HAESSIG, M., POSPICHIL, A.
(2007) - Aethiology of Bovine Abortion in Switzerland from 1986 to 1995- A Retrospective Study
with Emphasis on Detection of Neospora caninum and Toxoplasma gondii by PCR, J. Vet. Med.
54, 15 - 22.
19. SALANT, H., MARKOVICI, A., SPIRA, D. T., HAMBURGER, J. (2007) - The Development
of a Molecular Approach for Coprodiagnosis of Toxoplasma gondii, Veterinary Parasitology, 146,
214 - 220.
20. SCHWAB, K. J., MC DEVITT, J. J. (2003) - Development of PCR- Enzyme Immunoassay
Oligoprobe Detection Method for Toxoplasma gondii Oocysts, Incorporating PCR Controls,
Applied and Environmental Microbiology, 5819 - 5825.
21. SWITAJ, K., MASTER, A., SKRZYPCZAK, M., ZABOROWSKI, P. (2005) - Recent trends
in molecular diagnostics for Toxoplasma gondii infections, Clin Microbiol Infect, 11, 170 -176.
22. VAN, T.T., ROONEY, PEGGY, J. KNOLL., LAURA, J. (2006) - Nurseothricin
Acetyltransfereaze: A Positive Selectable Marker for Toxoplasma gondii, The Journal of
Parasitology, 92, 3.
23. WEISS, L. M., MA, Y. F., TAKVORIAN, P. M., TANOWITZ, H. B., WITTNER, M. (1998) Bradyzoite Development in Toxoplasma gondii and the hsp70 Stress Response, Infection and
Immunity, 66, 7, 3295 - 3302.
24. ZAKIMI, S., KYAN, H., OSHIRO, M., SUGIMOTO, C., XUENAN, X., FUJISAKI, K. (2006)
- Genetic Characterization of GRA6 Genes from Toxoplasma gondii from pigs in Okinawa, Japan,
J. Vet. Med. Sci. 68, 10, 1105 - 1107.
1.3.
Diseminarea rezultatelor obinute n publicaii de specialitate i cu

ocazia comunicrilor tiinifice
Rezultatele
obtinute
au
fost
comunicate
la
Simpozionul
Toxoplasmoza, mereu in actualitate de la Constanta, 2007 si la

Conferinta Nationala de Parazitologie de la Constanta, 2007 si au fost
publicate in Revista Romana de Parazitologie, precum si in suplimentul
revistei, dedicat Conferintei Nationale de Parazitologie.
Contract nr. 361/8.12.2006

78
umana
1.3.1. Articolul 1: Revista Romana de Parazitologie, vol. XVII, Nr

1, 2007, 27-32, ISSN 1221-1796
CUANTIFICAREA ANTICORPILOR DE TIP IgG ANTITOXOPLASMA GONDII DIN SERURI DE LA PORCINE
IgG ANTIBODIES AGAINST TOXOPLASMA GONDII
CUANTIFICATION IN PIG SERA
BEATRICE STIRBU-TEOFANESCU*, D. MILITARU*,
MANUELLA MILITARU**, EMILIA CIOBOTARU**, c. CIOCIOI***
*- Institutul Pasteur, Bucureti
** FMV Bucuresti
*** ICPBMUV Bucuresti
Abstract
A variant of the immunoenzymatic test (ELISA) was applied in sheep
toxoplasmosis serodiagnosis in comparison with indirect immunofluorescence test (IIF).
To capture and quantify specific antibodies an proteic antigen of Toxoplasma gondii, was
used. In the analytical system, use was made of a peroxidase linked IgG anti-pig IgG
immunoenzymatic conjugate, an enzyme-specific substrate (H2O2) and a chromogen
evidencing the antigen-antibody reaction (ABTS). 204 samples of pig sera were tested by
these two techniques. The sensivity and specificity of the ELISA test were 98.75% and
84.09%. The ELISA- and IIF-obtained diagnostic global correlation was 95.58%.
key words: Toxoplasma gondii antigen, antibodies, ELISA, IIF.
Introducere
Cresterea preciziei metodelor de diagnostic si de supraveghere a bolilor la animale,
inclusiv a toxoplasmozei porcine, constituie un deziderat al practicii veterinare actuale
in tara noastra. Metoda imunoenzimatica, datorita sensibilitatii si specificitatii sistemului
Contract nr. 361/8.12.2006

79
umana
analitic ca si avantajelor legate de costuri, durata de executie si simplitatea tehnicii (1)

raspunde acestui deziderat.
In aceasta lucrare sunt prezentate rezultatele cercetarilor vizand obtinerea
reagentilor (antigen, seruri martor, conjugat) si stabilirea parametrilor de executie a
testului imunoenzimatic pentru identificarea si cuantificarea anticorpilor antiToxoplasma gondii din seruri de la porcine.
MATERIAL SI METODA
Tulpina RH de Toxoplasma gondii (Institutul Cantacuzino, Bucuresti) s-a folosit
la infestarea soarecilor, dupa care s-a recoltat lichidul peritoneal cu elemente parazitare
care a fost utilizat atat in tehnica de imunofluorecenta indirecta (IFI), cat si pentru
prepararea antigenului din testul imunoenzimatic.
Tehnica IFI s-a bazat pe evidentierea anticorpilor anti-Toxoplasma gondii din
seruri de la porcine prin utilizarea unui conjugat fluorescent antispecie (IgG capra antiIgG porc marcat cu izotiocianat de fluoresceina Institutul Pasteur, Bucuresti) (2).
Tehnica imunoenzimatica
Antigen: pentru captarea si cuantificarea anticorpilor specifici (de tip IgG) s-a
utilizat un antigen solubil total obtinut din exsudatul peritoneal, cu parazitul sub forma
de trofozoid, recoltat de la soricei inoculati anterior cu tulpina RH de Toxoplasma
gondii. Exsudatul peritoneal, reluat in tampon fosfat salin (PBS) 0,01M steril, pH 7,4 a
fost filtrat, iar suspensia parazitara obtinuta a fost prelucrata prin 3 cicluri de inghetaredezghetare, urmate de ultrasonicare de 10 ori, 30sec./ciclu. Ultrasonicatul a fost
centrifugat la 10 000 rpm, 40 minute la 4oC si s-a recoltat supernatantul (antigenul
solubil total)(4). Pentru antigenul obtinut s-a determinat continutul in proteina prin
metoda Lowry.
Electroforeza SDS-PAGE s-a realizat dup metoda lui Laemmli (3), cu un gel de
separare cu T=7,5% pe aparatul Mini Protean II (Bio-Rad). Standardul de mase
moleculare a fost reprezentat de un amestec de patru proteine: albumin seric bovin
67 kDa, catalaz (din ficat bovin) 60 kDa, ovalbumin 45 kDa i aldolaz (din muchi
de iepure) 40 kDa.
Pentru evidenierea fraciunilor proteice separate s-a realizat coloraia gelurilor prin
imersarea lor ntr-o soluie Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB R-250) 0,1% n
Contract nr. 361/8.12.2006

80
umana
amestec metanol:acid acetic:ap n raport de 4:1:5, urmat de o decolorare n acelai

amestec de solveni.
In etapa de peliculizare au fost utilizate microplaci de polistiren (Nunc, Maxisorp).
Antigenul a fost diluat 10 g/ml in NaOH 0,1N si adaugat cate 100 l/godeu. Dupa
incubare o ora la 37 oC, placile au fost spalate de trei ori cu PBS 0,01M cu 0,05%
Tween 20 (PBS/Tween).
Seruri de referinta:
-
serurile de referinta pozitive cu calitati de reagenti ELISA au fost obtinute de la

porcine diagnosticate prin IFI ca fiind positive si confirmate prin examen
histopatologic;
serurile de referinta negative au fost obtinute de la porcine negative serologic

fata de Toxoplasma gondii (IFI).
Probele de ser au fost diluate 1/400 in PBS/Tween cu 1% albumina serica bovina

(BSA), adaugate pe placa (cate 100 l/godeu) si incubate 60 minute la 37 oC. Dupa
incubare, placa s-a spalat de 3 ori ca mai sus.
Conjugat: a fost utilizat un conjugat
IgG capra anti-IgG porc marcat cu
peroxidaza (prin metoda periodat) preparat in Institutul Pasteur. Conjugatul a fost

diluat in PBS/Tween cu 1% BSA si adaugat cate 100 l/godeu. Dupa incubare timp de
60 minute la 37 oC, placile au fost spalate de trei ori cu PBS/Tween.
Substrat: contine 0,05% perhidrol (H2O2) si 0,6 mg/ml 2,2 azino-di-(3-etilbenztiazolin-sulfat) (ABTS) in tampon citrat 2,3%, pH 4,5. Se pipeteaza cate 100 l
substrat/godeu, iar dupa 30 minute reactia a fost stopata cu 50 l/godeu fluorura de
sodiu 1,5%.
Citirea densitatii optice s-a realizat la un spectrofotometru pentru placi, Multiskan
(Labsystem).
Interpretarea reactiei: s-a realizat in raport cu serurile martor de reactie (pozitiv
si negativ), prin calcularea, pentru fiecare proba de ser testata, a raportului S/P (DOprobaDO N)/ (DO P DO N).
Contract nr. 361/8.12.2006

81
umana
REZULTATE SI DISCUTII
Au fost preparate si caracterizate prin electroforeza 2 serii de antigene Toxoplasma
gondii. Ambele antigene au prezentat o concentratie proteica (determinata prin metoda
Lowry) mai mare de 1 mg proteina/ml.
Rezultatele benzilor proteice evidentiate prin electroforeza sunt prezentate in
tabelul nr. 1, masele moleculare variind intre 27 123 kDa.
La titrarea antigenelor Toxoplasma gondii cu seruri pozitive si negative (tabla de
sah) prin ELISA, varianta indirecta, s-au obtinut valori (tabelul nr. 2) care au relevat
proportionalitatea dintre titrul de anticorpi anti-Toxoplasma gondii si valoarea DO si
care au permis sa se selecteze concentratia optima de antigen de 10 g proteina/ml.
Aplicand criteriul diferentei si al raportului valorilor medii ale DO corespunzatoare
serurilor de referinta a fost aleasa dilutia optima de lucru pentru ser de 1/100. Aceasta
dilutie asigura obtinerea unei discriminari maxime intre serurile pozitive si negative.
Au fost testate, din punct de vedere al repetabilitatii, serurile martor si s-au obtinut
valori ale coeficientilor de variabilitate inter-godeuri sub 5% (tabelul nr. 3), iar pentru
variabilitatea inter-placi de sub 3% (tabelul nr. 4), la placile captusite cu antigen solubil
total de Toxoplasma gondii, valorile mici ale coeficientilor de variabilitate (sub 20%)
demonstrand omogenitatea antigenelor preparate si repetabilitatea rezultatelor testului
ELISA.
Valoarea de diagnostic a testului ELISA, de detectare si cuantificare a anticorpilor
anti-Toxoplasma gondii din seruri de la porcine a fost stabilita pe un numar de 204 de
seruri prelevate de la porcine, comparativ cu testul de imunofluorescenta indirecta
(tabelul nr. 5).
Rezultatele au demonstrat o foarte buna concordanta (corelatia globalaa 95,58%)
intre cele doua teste conform tabelului nr. 6.
Concluzii
1. S-au obtinut reagentii necesari testelor ELISA (antigen, seruri martor, conjugat
imunoenzimatic) si IFI (antigen, conjugat fluorescent) pentru toxoplasmoza
porcina.
2. A fost calibrat testul ELISA cu reagentii obtinuti.
Contract nr. 361/8.12.2006

82
umana
3. Testul ELISA a fost utilizat pentru evaluarea nivelului de anticorpi antiToxoplasma gondii in 204 de seruri de la porci din teren.
4. Sensibilitatea si specificitatea testului ELISA, comparativ cu IFI, au fost 98,75%
si respectiv 84,09%, iar corelatia globala intre cele doua teste a fost de 95,58%.
Tabel nr.1: Rezultatele evaluarii prin SDS-PAGE a structurii
proteice a antigenelor de Toxoplasma gondii (kDa)
Ag 1
Ag 2
123,1
120,9
120,9
118,7
116,6
110,6
110,6
78,9
78,9
66,0
73,5
5,3
66,0
46,3
55,3
43,1
Tabelul nr. 2: Curbele de titrare ale serurilor martor pozitiv

(Mp) si negativ (Mn)
30 min
dilutie
1/200
1/300
1/400
1/450
1/500
1/550
1/600
1/650
1/700
1/750
Mp
Mn
1.810
1.443
1.257
1.068
1.013
0.980
0.924
0.825
0.802
0.759
0.205
0.175
0.147
0.143
0.138
0.136
0.131
0.129
0.124
0.101
Tabelul nr. 3: Coeficientii de variabilitate inter-godeuri

pentru 2 placi captusite cu antigen Toxoplasma gondii
(Mp-ser martor pozitiv, Mn-ser martor negativ)
Placa 1
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
Placa 2
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
Mp
Mn
godeu 1
1.485
0.075
1.449
0.074
1.410
0.078
1.428
0.073
godeu 1
1.465
0.076
1.436
0.078
1.399
0.079
1.413
0.075
godeu 2
1.452
0.075
1.438
0.071
1.436
0.075
1.461
0.072
godeu 2
1.466
0.079
1.455
0.074
1.421
0.076
1.432
0.074
godeu 3
1.432
0.072
1.463
0.069
1.428
0.075
1.435
0.077
godeu 3
1.450
0.078
1.463
0.072
1.419
0.076
1.436
0.071
godeu 4
1.459
0.072
1.458
0.075
1.432
0.077
1.451
0.075
godeu 4
1.458
0.077
1.463
0.079
1.430
0.081
1.445
0.075
Coef. variab. (%)

1.502
2.356
0.756
3.811
0.804
1.967
1.038
2.986
Coef. variab. (%)
0.507
1.665
0.875
4.361
0.922
3.140
0.941
2.566
46,3
27,6
43,1
27,6
Contract nr. 361/8.12.2006

83
umana
Tabelul nr. 4: Coeficientii de variabilitate inter-placi pentru 4 placi

captusite cu antigen Toxoplasma gondii (Mp-ser martor pozitiv,
Mn-ser martor negativ)
Placa 1
1.448
1.450
1.443
0.0735
0.0775
0.07625
Placa 2
1.470
1.440
1.396
0.07225
0.07575
0.078
Placa 3
1.459
1.452
1.397
0.07625
0.078
0.078
Placa 4
1.456
1.439
1.399
0.07425
0.07375
0.07625
Coef. variab. (%)

0.624
0.463
1.623
2.262
2.525
1.604
Tabelul nr. 5: Rezultatele testarii a 204 seruri de la porcine prin

ELISA si IFI
ELISA
204
165
39
Probe testate
Probe pozitive
Probe negative
IFI
204
160
24
Tabelul nr. 6: Calculul sensibilitatii, specificitatii si concordantei

testului ELISA
+
Total
SENSIBILITATE = 98,75%
ELISA
+
158
2
160
IFI
7
37
44
Total
165
39
204
SPECIFICITATE = 84,09%
CORELATIA GLOBALA = 95,58%
Fig. nr.1: Electroforeza (SDS-PAGE) antigenelor Toxoplasma gondii
St.
1
2
3
4
5
6
7
8 St.
1, 2, 3, 4 = Ag Toxoplasma gondii Seria 1 dilutii 1/3, 1/6, 1/12, 1/24
5, 6, 7, 8 = Ag Toxoplasma gondii Seria 2 dilutii 1/3, 1/6, 1/12, 1/24
St. = standard de mase moleculare
Contract nr. 361/8.12.2006

84
umana
Fig. nr. 2: IFI ser pozitiv anti-Toxoplasma gondii, microscop cu fluorescenta, 40X
1.
2.
3.
4.
Bibliografie selectiva
Acha, P.N., Szyfres, B., Zoonoses et maladies transmissibles communes a
lhomme et aux animaux, Office International des Epizooties, 1989, 677-691.
Feteanu, A., Anticorpi marcati in biologie si medicina, Editura Ceres,
Bucuresti, 1973.
Laemmli, U,K., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of
the head of bacteriofage T4, Nature, 227: 680-685.
Lin,D.-S., Su, W.-L., Comparison of four diagnostic techniques for detecting
Toxoplasma gondii infection in cats, dogs and humans, Acta Zoologica
Taiwanica, 1997, vol. 8, nr. 1, 3-13.
Contract nr. 361/8.12.2006

85
umana
1.3.2. Articolul 2: Revista Romana de Parazitologie, vol. XVII, Nr

1, 2007, 15-18, ISSN 1221-1796
DIAGNOSTICUL PARACLINIC COMPARATIV AL
TOXOPLASMOZEI LA FELINE
THE PARACLINICAL DIAGNOSIS OF
TOXOPLASMOSIS IN CATS
SILVIA ANTONIU*, BEATRICE STIRBU-TEOFANESCU**, D. MILITARU**
*IDSA Bucuresti
** S.N. Institutul Pasteur S.A., Bucuresti
Summary
Toxoplasmosis is a parasitic disease produced by Toxoplasma gondii-a protozoan
with strictly intracellular status, which have an intermediate host: various species of
animals, inclusive human and a definitive host: felines that carry and shed the parasitic
elements (oocysts) by faeces. In order to study the incidence of infection with
Toxoplasma gondii in cats, there were tested 42 serum samples from cats with two
quality tests: indirect immunofluorescence reaction (IFI) and Immune Comb (IC) test.
The results showed: using IFI : 20 samples were positives (47.61%), 4 (9.52%) dubious
and 18 (42.85%) were negatives; using ELISA/IC: 23 samples were positives (54.76%),
2 (4.76%) dubious and 17 (40.47%) were negatives. The results had comparable values.
The differences that have been observed were probable of the double antigenic structure
of the immune Comb test (Toxoplasma gondii and Chlamydia spp.). The higher
percentage of the positive samples make necessary of certain feline toxoplasmosis
diagnosis because of the zoonotic aspect of this disease.
Key words: Toxoplasma gondii, feline, zoonosis, Immune Comb, Indirect
immunofluorescence.
Rezumat
Toxoplasmoza este o boala parazitara, produsa de Toxoplasma gondii-protozoar cu
localizare strict intracelulara, cu o gazda intermediara reprezentata de o gama variata de
Contract nr. 361/8.12.2006

86
umana
specii de animale, printre care si omul si o gazda definitiva reprezentata de feline,

considerate purtatoare si eliminatoare de elemente parazitare. Pentru a studia incidenta
infectiei toxoplasmice la pisici au fost testate un numar de 42 de seruri, prin doua
metode serologice calitative: reactia de iunofluorescenta indirecta (IFI) si testul Imuno
Comb (IC). Rezultatele testelor au fost urmatoarele: prin IFI s-au identificat pozitive 20
probe (47.61%), dubioase 4 (9.52%) si negative 18 (42.85%); prin IC s-au identificat
pozitive 23 probe (54.76%), dubioase 2 (4.76%) si negative 17 (40.47%). Rezultatele
obtinute au fost comparabile, diferentele constatate datorandu-se probabil dublei
componente antigenice din testul IC (Toxoplasma gondii si Chlamydia spp.). Procentul
ridicat de probe pozitive creaza necesitatea unui diagnostic cert al toxoplasmozei la
feline, avand in vedere aspectul zoonotic al acestei boli.
Cuvinte cheie: Toxoplasma gondii, Imunocomb, Imunofluorescenta
Introducere:
Toxoplasmoza este o boala parazitara, produsa de Toxoplasma gondii- protozoar
cu localizare strict intracelulara, care din punct de vedere evolutiv prezinta doua gazde:
- o gazda intermediara reprezentata de o gama variata de specii de mamifere si
pasari;
- o gazda definitiva reprezentata de feline, considerate purtatoare si eliminatoare de
elemente parazitare (2;3;5). In unele situatii, felinele pot deveni chiar si gazde
intermediare si mai mult decat atat, pot manifesta boala (4).
Obiective
Intrucat toxoplasmoza este o zoonoza grava, prin dimensiunea impactului sau
asupra sanatatii oamenilor si in special asupra femeilor gravide, prin aparitia de
avorturi, mortinatalitate si malformatii congenitale, a aparut necesitatea monitorizarii
clinice si paraclinice (prin teste serologice, coproparazitologice si hematologice) a
pisicilor care coabiteaza cu femei gravide sau cu cele care si-au programat o sarcina in
viitorul apropiat (1;6).
Material si metoda
A fost testat un numar de 42 de seruri provenite de la pisici din diverse categorii de
rasa, varsta si sex, prin doua metode serologice calitative: reactia de imunofluorescenta
indirecta (IFI) si ELISA, varianta Imunocomb (IC) si s-au comparat rezultatele obtinute.
Contract nr. 361/8.12.2006

87
umana
Reactia de imunofluorescenta indirecta consta in decelarea anticorpilor antiToxoplasma gondii prin vizualizarea complexelor antigen-anticorp, cu ajutorul unei
antiimunoglobuline de specie cuplata cu o substanta fluorescenta (izotiocianat de
fluoresceina-FITC), atunci cand serul de cercetat este pus in contact cu antigenul
toxoplasmic.
ELISA consta in decelarea anticorpilor anti-Toxoplasma gondii prin vizualizarea
unei modificari de culoare la nivelul unui substrat, asupra caruia actioneaza enzima
cuplatacu antiimunoglobulina de specie ce se ataseaza complexelor antigen-anticorp,
atunci cand in serul de cercetat exista anticorpi anti-Toxoplasma gondii. Immuno comb
este un card de plastic de forma unui pieptene, alcatuit din 12 dinti, pe care sunt atasate
antigene purificate de Toxoplasma si Chlamydia, fiecare dinte corespunzand unei
singure probe. Acesta se introduce succesiv in cuvele unei placi multicompartimentate,
care contin: ser de cercetat, solutie de spalare, anticorpi anti-IgG cuplati cu enzima si
substrat.
Rezultate si discutii
Rezultatele examenelor serologice sunt redate in Tabel 1.
Proportia raselor de pisici examinate a fost: Europeana (54,76%), Birmana
(26,19%), Persana (4,76%), Albastra de Rusia (2,38%), Angora (2,38%) si cu origine
necunoscuta (9,53%). Din acestea, 33,33% au fost masculi si 57,14% - femele.
Varsta medie a lotului de pisici examinate a fost de 4 ani si 3 luni, intervalul de
varsta fiind cuprins intre 2 luni si 16 ani.
Reactia de imunoflurescenta s-a considerat pozitiva la remarcarea unui halou
luminos galben-verzui in jurul parazitului Toxoplasma gondii, intensitatea reactiei
pozitive apreciindu-se in functie de intensitatea fluorescentei si numarul de paraziti
fluorescenti. Reactia negativa este corelata cu lipsa fluorescentei din jurul parazitilor,
acestia fiind intunecati sau foarte slab luminati uniform.
In cazul ELISA-Immunocomb, intensitatea culorii godeului inferior pentru
Toxoplasma si a
celui mijlociu pentru Chlamydia se compara cu cea a godeului
superior corespunzator martorului pozitiv pentru Toxoplasma si Chlamydia. Godeul cu

o intensitate a culorii mai mare sau egala cu cea a martorului pozitiv este pozitiv, iar cel
cu o intensitate a culorii mai mica decat a martorului pozitiv este considerat negativ.
Contract nr. 361/8.12.2006

88
umana
Rezultatele testelor au fost urmatoarele:

-
prin IFI s-au identificat pozitive 20 probe (47.61%), dubioase 4 (9.52%) si

negative 18 (42.85%);
prin IC s-au identificat pozitive 23 probe (54.76%), dubioase 2 (4.76%) si

negative 17 (40.47%).
Rezultatele celor 2 teste au coincis in 35 de cazuri (83,33%): 19 fiind pozitive

(45,24%), 14 negative (33,33%) si 2 dubioase (4,76%).
Tabel 1:
Nr probei de
Pisica (rasa, sex, varsta)
Rezultat IFI
ser
Rezultat
Immunocomb
Europeana, mascul, 1 an
Pozitiv (Intens)
Pozitiv
Birmana, femela, 2 ani
Negativ
Negativ
Europeana, femela, 3 ani
Negativ
Negativ
Europeana, femela, 1 an
Negativ
Negativ
Pozitiv (intens)
Pozitiv
Birmana, femela 2 ani
Dubios
Negativ
Dubios
Dubios
Europeana, femela, 2 luni
Negativ
Negativ
Pozitiv (intens)
Pozitiv
10
Negativ
Negativ
11
Birmana, mascul, 3 ani
Negativ
Negativ
12
Europeana, mascul, 5 ani
Pozitiv (intens)
Pozitiv
13
Pozitiv (intens)
Pozitiv
14
Slab pozitiv
Pozitiv
15
Dubios
Negativ
16
Negativ
Negativ
17
Negativ
Negativ
18
Pozitiv
Pozitiv
19
Negativ
Negativ
20
Persana, femela, 6 ani
Dubios
Dubios
21
Pozitiv (intens)
Pozitiv
22
Negativ
Pozitiv
23
Pozitiv
Pozitiv
24
Pozitiv (intens)
Pozitiv
Contract nr. 361/8.12.2006

89
umana
25
Europeana, femela, 1 an
Negativ
Negativ
26
Angora, mascul, 1 an
Pozitiv
Pozitiv
27
Pozitiv (intens)
Pozitiv
28
Pozitiv
Pozitiv
29
Albastra de Rusia, mascul, 4 ani
Negativ
Negativ
30
Pozitiv
Pozitiv
31
Negativ
Negativ
32
Pozitiv
Negativ
33
Persana, mascul, 2 ani
Negativ
Pozitiv
34
Negativ
Pozitiv
35
Pozitiv
Pozitiv
36
Pozitiv
Pozitiv
37
Birmana, femela
Pozitiv
Pozitiv
38
Negativ
Negativ
39
Negativ
Negativ
40
Negativ
Pozitiv
41
Pozitiv
Pozitiv
42
Pozitiv
Pozitiv
Rezultatele celor doua teste n-au coincis in 7 cazuri (16,67%): 1 fiind pozitiv la IFI
si negativ la IC (2,38%), 4 negative la IFI si pozitive la IC (9,53%) si 2 dubioase la IFI si
negative la IC (4,76%). Diferentele constatate se datoreaza fie dublei componente
antigenice din testul IC (Toxoplasma gondii si Chlamydia spp.), fie reactiei incrucisate
intre Toxoplasma gondii si alte microorganisme, ambele generatoare de reactii falspozitive.
Concluzii
Un numar de 42 de seruri provenite de la pisici din diverse categorii de rasa, varsta
si sex a fost testat prin doua metode serologice calitative: reactia de imunofluorescenta
indirecta (IFI) si ELISA, varianta ImmunoComb (IC).
Prin IFI s-au identificat pozitive 20 probe (47.61%), dubioase 4 (9.52%)
si
negative 18 (42.85%)
Prin IC s-au identificat pozitive 23 probe (54.76%), dubioase 2 (4.76%) si negative
17 (40.47%).
Rezultatele celor doua teste au coincis in 35 de cazuri (83,33%).
Contract nr. 361/8.12.2006

90
umana
Neconcordanta dintre rezultatele celor doua teste s-a constatat in 7 cazuri (16,67%)
si aceasta impune necesitatea stabilirii unui diagnostic cert al toxoplasmozei la feline,
avand in vedere aspectul zoonotic al acestei boli.
Bibliografie
1.
Cosoroaba I., 2005. Zoonoze parazitare, 40-71. First Art Press;
2.
Dubey J.P., 1995. Toxoplasmosis. Zoonosis Updates, 144-149, American Veterinary Medical
Association.
3.
Dubey J.P., Beattie C.P., 1988. Toxoplasmosis of Animals and Man, CRC Press, Boca Raton,
F1.
4.
Lappin M.R., 1999. Feline toxoplasmosis, Waltham Focus, 4, 4, 2-8.
5.
Niculescu Al., Dida I., 1996. Parazitologie veterinara, 17-177, Ed. Ceres, Bucuresti.
6.
Palmer S.R., Soulsby Lord, Simson D.I.H., 2005. Zoonoze, 528-542, Ed. Stiintelor Medicale,
Bucuresti.
1.4.3.
Comunicare
stiintifica:
Conferinta
Nationala
de
Parazitologie, Mamaia 8-10 noiembrie 2007, Revista Romana de

Parazitologie, vol. XVII, supliment, ISSN 1221-1796
DETECTIA PARAZITULUI TOXOPLASMA GONDII IN
PROBE BIOLOGICE PRIN IMUNOFLUORESCENTA
BEATRICE-MARIA STIRBU-TEOFANESCU*, DUMITRU MILITARU*,
IOANA DIACONU*, EUGEN BUCUR*
*S.N.Institutul Pasteur SA
S-a preparat conjugatul fluorescent anti-specie porc prin marcarea IgG (capra) antiIgG porc cu izotiocianat de fluoresceina in mediu alcalin. Conjugatul a fost purificat
prin dializa si gel filtrare pe Sephadex G25 medium si a fost calibrat si utilizat in tehnici
imunologice (imunofluorescenta, varianta indirecta) pentru punerea in evidenta a
parazitului Toxoplasma gondii in lichid peritoneal recoltat de la soricei si in sectiuni
histologice din intestin, ficat, splina si creier, provenite de la soricei infestati
experimental pe cale intraperitoneala si sacrificati la 72 de ore post-infestare.
Contract nr. 361/8.12.2006

91
umana
Pentru punerea in evidenta a parazitului s-a utilizat ser pozitiv de porc (dilutie
1/16), iar dilutia de lucru a conjugatului fluorescent, de 1/50, a fost stabilita anterior prin
titrare pe probe martor cunoscute, pozitive si negative.
Tehnica de imunofluorescenta a prezentat un nivel inalt de specificitate in
infestatia cu Toxoplasma gondii, permitand vizualizarea parazitului atat in lichidul
peritoneal, cat si in sectiunile histologice de la nivel intestinal.
THE DETECTION OF THE PARASITE TOXOPLASMA GONDII IN

BIOLOGICAL SAMPLES BY IMMUNOFLUORESCENCE
BEATRICE-MARIA STIRBU-TEOFANESCU*, DUMITRU MILITARU*,
IOANA DIACONU*, EUGEN BUCUR*
*S.N.Institutul Pasteur SA
It was prepared the fluorescent conjugate anti-pig by coupling IgG (goat) anti-IgG
pig with fluoresceine isothiocyanate in alkaline medium. The conjugate was purified
through dialysis and gel-filtration on Sephadex G25 medium and it was calibrated and
used in immunological techniques (immunofluorescence, the indirect variant) to detect
the parasite Toxoplasma gondii in peritoneal liquid sampled from mice and in
histological sections
from intestine, liver, splin and brain, resulted from mice
experimental infested by intraperitoneal injection and killed after 72 hours postinfestation.

To distinguish the parasite it was used positive pig serum (dilution 1/16), and the
work dilution of the fluorescent conjugate, of 1/50, it was previously settled by titration
on well-known control samples, positive and negative.
The technique of immunofluorescence presented a high level of specificity in
Toxoplasma gondii infestation, allowing the observation of the parasite both in
peritoneal liquid and in histological sections from intestine.
Contract nr. 361/8.12.2006

92
umana
CONCLUZII
Metodele obtinute, ELISA, tehnicile imunohistochimice si moleculare
de detectie a anticorpilor anti-Toxoplasma gondii din seruri provenite de la
ovine si porcine si de detectie a parazitului Toxoplasma gondii, pot fi utilizate
in cadrul unui program de supraveghere si combatere a toxoplasmozei la
animale, in scopul reducerii infestatiei umane.
In etapa urmatoare, vom incepe lucrarile privind prepararea
reagentilor necesari aplicarii unor tehnici moderne si rapide pentru
diagnosticul infestatiei cu Trichinella spiralis, la animale, in scopul
prevenirii transmiterii infestatiei la om.
Director de proiect,
Dr. Dumitru Militaru
Contract nr. 361/8.12.2006

93
umana
Anexa 1
Metodologii de obinere a matrielor ADN din Toxoplasma gondii
Extracia ADN cu ajutorul trusei Wizard Genomic DNA Purification Kit
(Promega)
Etape:
n tuburi de microcentrifug sterile (de 1,5 ml) se introduc 900 l de

reactiv Cell Lysis Solution (aflat n dotarea trusei).
Peste reactivul sus-menionat se adaug 300 l de prob biologic

(snge, lichid peritoneal etc.) infestat cu Toxoplasma, omogenizndu-se apoi,
prin rsturnare de 5 - 6 ori, coninutul tuburilor.
Amestecul obinut se incubeaz la temperatura camerei, timp de 10

minute (pentru a se produce liza celular), dup care se centrifugheaz la 13000
16000 rpm., 1 minut, tot la temperatura camerei.
Supernatantul obinut se decanteaz cu grij, meninnd ns un

volum de 10 - 20 l, pentru a se resuspensiona n el sedimentul celular, prin
agitare energic la vortex.
n tuburile coninnd celulele resuspendate se adaug 300 l de

reactiv Nuclei Lysis Solution (din compoziia trusei), pipetndu-se amestecul de
5 - 6 ori, pentru o ct mai bun liz nuclear. Dac dup omogenizare se
constat prezena unor agregate celulare, tuburile cu amestec se incubeaz la
37C, pn la descompunerea complet a agregatelor respective.
Peste lizatul nuclear se mai pot aduga (n mod opional) 1,5 l de reactiv
RNase (aflat n trus), amestecul astfel obinut fiind supus incubrii la 37C, timp
de 15 minute, dup o prealabil omogenizare prin rsturnare de 2 - 5 ori.
Dup incubare, probele se aduc la temperatura camerei i se pun n
contact cu 100 l de reactiv Protein Precipitation Solution (din compoziia kitului).
Amestecul obinut se omogenizeaz la vortex 10 - 20 de secunde, dup
care se centrifugheaz la 13000 - 16000 rpm, 3 minute, la temperatura camerei.
Supernatantul rezultat se transfer ntr-un tub de microcentrifug n care sau pus n prealabil 300 l de izopropanol adus la temperatura camerei.
Se omogenizeaz amestecul, prin rsturnri uoare, pn cnd filamentele
de ADN formeaz o mas vizibil, dup care se centrifugheaz tuburile, la 13000
- 16000 rpm, 1 minut, la temperatura camerei. ADN-ul se va depune astfel sub
forma unui mic sediment albicios.
Supernatantul obinut se decanteaz, iar peste sedimentul de ADN se
adaug 300 l de alcool etilic 70%. Se spal sedimentul de ADN, prin rsturnri
uoare ale tuburilor, dup care se centrifugheaz suspensia rezultat, la 13000 16000 rpm, timp de 1 minut, la temperatura camerei.
Se decanteaz suspensia de etanol, se rstoarn tuburile pe o hrtie de
filtru curat, iar apoi se usuc sedimentul de ADN, la aer, timp de 10 - 15 minute.
Contract nr. 361/8.12.2006

94
umana
ADN-ul se rehidrateaz cu 10 l de ap ultrapur (Nuclease Free Water),

timp de 1 or, la 37C, cu agitarea periodic a tuburilor.
Suspensia de ADN astfel obinut se utilizeaz pentru amplificare genic
prin PCR.
Extracia ADN cu fenol-cloroform

(dup Schwab, K. J. i McDevitt, J. J. (2003) - Applied and
Environmental Microbiology, 69, 10, 5819 - 5825)
Etape:
O soluie apoas de oochiti se amestec, n proporie de 1:5, cu un

tampon de liz coninnd: proteinaz K (10 mg/ml), NaCl (120 mM), Tris (10 mM,
pH 7,5) i dodecil sulfat de sodiu (0,1%).
Amestecul astfel obinut se incubeaz 1 or la 55C.
Dup incubare probele se aduc la temperatura camerei, se amestec

cu un volum egal de fenol-clorform-alcool izoamilic (25:24:1) i se centrifugheaz
apoi la 16000 x g, 2 minute, la temperatura laboratorului.
Supernatantul rezultat n urma centrifugrii se decanteaz ntr-un tub

curat, unde se pune n contact cu un volum egal de cloroform.
Amestecul supernatant-cloroform se centrifugheaz la 16000 x g, 2

minute, la temperatura camerei.
Supernatantul nou-obinut se transfer ntr-un tub curat, n care se mai

adaug apoi 10 g de glicogen, 10 g de acetat de sodiu (0,3 M) i 2 volume de
alcool etilic (100%) inut la rece;
Coninutul tubului se omogenizeaz prin efectuarea a 10 rsturnri

succesive i se menine la -20C, timp de 60 de minute.
Proba se centrifugheaz apoi la 16000 x g, 30 de minute, la 4C.
Supernatantul obinut se ndeprteaz, iar sedimentul se reia n 750 l

alcool etilic 70% i se centrifugheaz la 16000 x g, timp de 15 minute, la 4 C.
Supernatantul se ndeprteaz din nou, iar sedimentul de ADN se

usuc la aer, timp de 15 minute.
ADN-ul se rehidrateaz cu 50 l de ap ultrapur (Nuclease Free

Water), obinndu-se astfel proba care va fi lucrat ulterior prin PCR.
Protocol de detecie a genelelor SAG3, Gra6, B1 i hsp70 de

Toxoplasma gondii, prin PCR
Pentru detecia genelor SAG3, Gra6, B1, respectiv hsp70, s-au utlizat un
numr total de 10 amorse, i anume: Tg-SAG3-F, Tg-SAG3-R, Tg-GRA6-F1, TgGRA6-R1, Tg-GRA6-F2, Tg-GRA6-R2, Tg-B1-F, Tg-B1-R, Tg-hsp70-F, Tghsp70-R.
Amestecul de reacie PCR a fost n volum total de 25 l.
Concentraia componentelor din reacie a fost urmtoarea: 23l ap ultrapur
(Nuclease Free Water - Promega); 0,5 l (100 pmol/l) din fiecare amors; 1l
suspensie
ADN;
beads
PCR
puReTaq
Ready-To-Go
(GE
Contract nr. 361/8.12.2006

95
umana
Healthcare) cu o compoziie de 2,5 U puReTaq DNA polimeraz, 10

mM Tris-HCl, 50 mM KCL, 1,25 mM MgCl2 i o concentraie de 200
M pentru fiecare dNTP.
Amplificarea s-a realizat cu ajutorul sistemului Perkin Elmer,
utilizndu-se
programul
de
amplificare
81:
94oC,10-1x;
94oC,1+55oC,1.5+ 72oC,2.5-30x; 72oC,10-1x; 4oC - forever.
Controlul ampliconilor s-a realizat prin electroforez standard n gel de
agaroz 1,5%, suplimentat cu bromur de etidiu. Migrarea s-a fcut n TBE 1X, la
120V, 60mA, timp de 1 or;
Identificarea ampliconilor s-a fcut cu ajutorul sistemului Herolab Easy RH
(soft Image2PC), comparndu-se la UV talia ampliconilor obinui, cu martorul de
talie PCR (Sigma).
ANEXA 2
Tabel 1. Resurse on-line / programe logice
Nr.
crt
1.
2.
3.
Program
logic /
Adresa - Url
Rezultat
Web-site
Blast
2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blv Alinierea a 2 secvene
Seq
2seq/bl2.html
genice
GeneBee- http://www.genebee.msu.su/service
Net v.2.0, s/malign_reduced.html
Release
1.1
Blast fasta http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Alinierea multipl
secvenelor
Cercetarea bncii de
gene prin intermediul
unei
perechi
de
amorse
Design de amorse pe
o secven genic
4.
Primer 3
http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3_www.cgi
5.
PubMed
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/q Acces banca de gene,

uery.fcgi
resurse bibliografice
6.
Bioedit
7.
Antigenic
http://www.mbio.ncsu.edu/RnaseP/p Program logic W95rograms/BIOEDIT/bioedit.html

WNT identificare
secvene conservate
etc pe o secven din
banca de gene
http://immunax.dtci.harvard.edu/Too Predicia
situsurilor
Contract nr. 361/8.12.2006

96
umana
Determina
nts
ExPasyTranslate
tool
HMMSTR/
Roseta
Server
8.
9.
ls/antigenic.pl
antigenice
dintr-o
secven proteic
http://www.expasy.org/tools/dna.htm Translaia
unei
l
secvene genice n
secven proteic
http://www.bioinfo.rpi.edu/~bystr/hm Analiza unei proteine
mstr/server.php
vizavi de banca de
secvene proteice
Tabel 2. Amorse testate n cursul acestui studiu

Agent
Gena
SAG
3
Toxoplas
ma gondii
GRA
6
B1
hsp7
0
Amorsa
Secven a 5 - 3
Amplicon
Tm
Tg-SAG3F
Tg-SAG3R
Tg-GRA6F1
Tg-GRA6R1
Tg-GRA6F2
Tg-GRA6R2
Tg-B1-F
ggg ctt tct gag cga

cta ca
tac ccg cag gtc act
ctc tt
tgc cta gca aac gaa
cac ag
tat tgc ctg cat cat ttc
ca
cat cca tct gag gca
gaa gc
gca tag acc ccc tgt
ttt ca
cta ggg cac cct tac
tgc aa
agg agg cag cac
aag aat gt
aac cgt ttg gtg gac
ttc tg
gtc ggg atc gtt gtg ttt
ct
240 bp
62
C
62
C
60
C
56
C
62
C
60
C
62
C
60
C
60
C
60
C
Tg-B1-R
Tg-hsp70F
Tg-hsp70R
240 bp
156 bp
156 bp
700 bp
700 bp
199 bp
199 bp
566 bp
566 bp
Referin e
bibliografice
Popa 2007
Popa 2007
Popa 2007
Popa 2007
Tabel 3. Programe de amplificare utilizate n cursul acestui studiu
Gena
Amorsa
Nr.
program
de
Stage
amplificar
1
e
Program de amplificare
Stage 2
Step
1
Step 2
Step
3
Nr.
cicluri
Stage
3
Stage
4
Contract nr. 361/8.12.2006

97
umana
SAG
3
GRA
6
Tg-SAG3F
Tg-SAG3R
Tg-GRA6F1
Tg-GRA6R1
Tg-GRA6F2
Tg-GRA6R2
81
94C5/ 2x
94C
1
55C
130
72C
230
30X
72C
230
4C
foreve
r
81
94C5/ 2x
94C
1
55C
130
72C
230
30X
72C
230
4C
foreve
r
B1
Tg-B1-F
Tg-B1-R
81
94C5/ 2x
94C
1
55C
130
72C
230
30X
72C
230
4C
foreve
r
hsp7
0
Tg-hsp70F
Tg-hsp70R
81
94C5/ 2x
94C
1
55C
130
72C
230
30X
72C
230
4C
foreve
r
Figura 1. Baza de date on-line. Toxoplasma gondii - secvente genice
Contract nr. 361/8.12.2006

98
umana
Figura 2. Program logic on-line pentru alinierea multipla a secventelor.
Figura 3. Toxoplasma gondii . Rezultat obtinut prin programul GeneBee la alinierea secventelor
genice din GeneBank privind gena hsp70: Seq1 hsp70 DQ997591, Seq2 hsp 70 DQ997590, Seq 3
hsp 70 DQ997589, Seq 4 hsp 70 DQ997588, Seq 5 hsp 70 DQ997587, Seq 6 hsp 70 DQ997586.
Contract nr. 361/8.12.2006

99
umana
Figura 4. Toxoplasma gondii . Rezultat obtinut prin programul GeneBee la alinierea secventelor
genice din GeneBank privind gena hsp70: Seq1 hsp70 DQ997591, Seq2 hsp 70 DQ997590, Seq 3
hsp 70 DQ997589, Seq 4 hsp 70 DQ997588, Seq 5 hsp 70 DQ997587, Seq 6 hsp 70 DQ997586.
Figura 5. Toxoplasma gondii gena B1 (secvente din GeneBank). Alinierea prin programul on
line Blast 2 Sequences.
Contract nr. 361/8.12.2006

100
umana
Figura 6. Toxoplasma gondii gena B1 (secvente din GeneBank). Rezultat privind alinierea prin
programul on line Blast 2 Sequences.
Figura 7. Toxoplasma gondii gena B1(secvente din GeneBank). Rezultat privind alinierea prin
Contract nr. 361/8.12.2006

101
umana
Figura 8. Toxoplasma gondii gena B1 (secvente din GeneBank). Rezultat privind alinierea prin
Figura 9. Primer3 - program logic on-line pentru design de amorse.
Contract nr. 361/8.12.2006

102
umana
Figura 10. Toxoplasma gondii. Amorse designate on-line prin programul Primer3 pentru gena
Sag3 (GeneBank EF445545.1 GI:129593822).
Contract nr. 361/8.12.2006

103
umana
Figura 11. Toxoplasma gondii. Amorse designate on-line prin programul Primer3 pentru gena Gra6
Figura 12. Toxoplasma gondii. Amorse designate on-line prin programul Primer3 pentru gena Gra6
(GeneBank EF512253).
Contract nr. 361/8.12.2006

104
umana
Figura 13. Toxoplasma gondii. Control virtual in baza de date genetica (GeneBank) prin programul
Blast privind specificitatea amorselor pentru gena Sag3 designate virtual.
Blast privind specificitatea amorselor designate virtual pentru gena Sag3; recunoscute 6 tulpini (6
secvente).
Contract nr. 361/8.12.2006

105
umana
Blast privind specificitatea amorselor designate virtual pentru gena Sag3.
Figura 16. Toxoplasma gondii. Control virtual in baza de date genetica prin programul Blast privind
specificitatea amorselor designate virtual pentru gena Gra6; recunoscute 83 de tulpini (secvente
inscrise in GeneBank).
Contract nr. 361/8.12.2006

106
umana
specificitatea amorselor designate virtual pentru gena Gra6
Contract nr. 361/8.12.2006

107
umana
specificitatea amorselor designate virtual pentru gena Gra6 (perechea a 2-a de amorse designate si
utilizate in acest studiu pentru gena Gra6).
specificitatea amorselor designate virtual pentru gena B1; recunoscute 4 secvente inscrise in
GeneBank.
Contract nr. 361/8.12.2006

108
umana
specificitatea amorselor designate virtual pentru gena hsp70; recunoscute 12 secvente inscrise in
GeneBank.
Figura 21. Toxoplasma gondii tulpina RH. Probe de organ de soarece infectat.
Contract nr. 361/8.12.2006

109
umana
Figura 22. Toxoplasma gondii RH. Pregatirea probelor de organ pentru extractia ADN ca matrita in
reactiile de amplificare prin PCR electiv specific.
Contract nr. 361/8.12.2006

110
umana
Contract nr. 361/8.12.2006

111
umana
Contract nr. 361/8.12.2006

112
umana
Figura 25. Toxoplasma gondii RH. Pregatirea gelului de electroforeza pentru controlul post
amplificare prin PCR.
Figura 26. Toxoplasma gondii RH (secventiata integral si depusa in GeneBank la numarul de acces
AAQM00000000 GI:158533968 in 22 octombrie 2007, post design-ul nostru de amorse).- probe
ADN extrase din lichid peritoneal de soarece infectat experimental. PCR electiv pentru genele sag3,
gar6, B1 si hsp70 cu amorse designate in cursul acestui studiu (Popa 2007). PuRe Taq Ready to Go
PCR beads, GE Healthcare 27-9557-01. PE GeneAmp PCR System 9600, Applied Biosystem.
Amorse 50 pmole, Tm 55oC. Gel-electroforeza TBE 1.5x. Digitalizare imagine Easy RH, Herolab
GmbH Laborgerete, si Image2WinPC v5.0.1, Herolab GmbH. Calcul talie ampliconi: UnScanIt v5.1,
Silk Sci Co. Linia 1: PCR pentru gena Sag3 (amplicon 240 bp, conform celui estimat dar si un
amplicon slab, nespecific); linia 2: PCR pentru gena Gar6 (amplicon 156 bp); linia 3: PCR pentru
gena Gar6 (amplicon 700 bp, conform celui estimat dar si alti ampliconi de talie mai mica,
nespecifici); linia 4: PCR pentru gena B1 (amplicon 199 bp, conform celui estimat virtual, dar si alti
ampliconi nespecifici); linia 5: PCR pentru gena Hsp70 (amplicon 566 bp, dar si alti ampliconi de
talie mai mica nespecifici); linia 6: Standard ADN: PCR Marker (Sigma P9577).
Contract nr. 361/8.12.2006

113
umana

Raport Tehnic Parazitologie Patologie

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Raport Tehnic Parazitologie Patologie

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Contract nr. 361/8.12.

Program sectorial contract 361

Director de Proiect: Dr. Dumitru MILITARU

Contract nr. 361/8.12.2006

considerat o important zoonoz, infestaia cu

Toxoplasma gondii pune probleme deosebite n ceea ce privete salubritatea

Contract nr. 361/8.12.2006

Toxoplasma gondii este un parazit protozoar obligatoriu intracelular,

Contract nr. 361/8.12.2006

de cazuri. Numarul de cazuri de

toxoplasmoza congenitala in SUA s-a estimat la 400 - 4000 cazuri anual in

Contract nr. 361/8.12.2006

depistate pozitive, intre 30-63% din infectii au fost atribuite consumului de

si ovine, reprezinta o preocupare continua

intrucat T. gondii determina o infectie zoonotica importanta, fiind una din

perfectionarea metodelor de diagnostic existente si elaborarea de metode

Contract nr. 361/8.12.2006

kb si un genom epizomal de 35 kb. Diversitatea alelica identificata pentru cei

glucozofosfat izomeraza, acid fosfataza si propionilesteraza) si care prezinta

Contract nr. 361/8.12.2006

microsatelitilor este considerata a fi superioara celei a multilocusurilor care

Contract nr. 361/8.12.2006

recombinate si genotipuri neobisnuite cu alele atipice (au fost intalnite foarte

Scopul general al proiectului este reprezentat de dezvoltarea unor

moleculara (PCR/tehnologia ADN recombinant) pentru stabilirea

Contract nr. 361/8.12.2006

- dezvoltarea unor produse de interventie: vaccinuri si produse

Obiectivul pricipal al etapei a III-a a constat in: Stabilirea

Contract nr. 361/8.12.2006

Stabilirea conditiilor de lucru in tehnicile de diagnostic

stabilirea conditiilor de reactie in tehnicile imunoenzimatice de detectie a

imunoenzimatica (ELISA varianta indirecta).

componente, ambalate individual, in cantitati corespunzatoare necesarului de

Microplaca ELISA peliculizata cu antigen

Martor pozitiv 10X

Martor negativ 10X

Conjugat anti-IgG oaie marcat cu peroxidaza

Contract nr. 361/8.12.2006

Substrat de perhidrol in tampon citrat

Cromogen (solutie ABTS)

Diluant pentru seruri si conjugat

Reactiv de stopare NaF

Instructiuni de folosire a trusei

a) Microplaca ELISA este peliculizata (captusita) cu antigen purificat

Contract nr. 361/8.12.2006

h) Solutia de spalare se prezinta ca un lichid clar care prin agitare

Contract nr. 361/8.12.2006

imunosorbent (microplaca) si apoi cu conjugatul anti IgG de oaie marcat

imunosorbent (microplaca) siapoi cu conjugatul anti-IgG oaie marcat cu

Contract nr. 361/8.12.2006

Contract nr. 361/8.12.2006

Diluarea solutiei de spalare 10X:

Contract nr. 361/8.12.2006

Dupa 30 minute placa se citeste la fotometru multicanal, fata de martorul de

probele pentru care valorile S/P 0,25 sunt considerate pozitive;

probele pentru care 0,15< S/P 0,25 sunt considerate dubioase si

Norme de preparare a setului de diagnostic ELISA Eli-Tox-O :

Contract nr. 361/8.12.2006

Prepararea antigenului somatic total de Toxoplasma gondii: Antigenul

Contract nr. 361/8.12.2006

Controlul peliculizarii cu antigen:

Contract nr. 361/8.12.2006

In trusa ELI-Tox-O, martorul pozitiv se livreaza prediluat, ambalat in