1.

Experiena 0
2. 1.Cunductivitatea apei distilate, filtrate i de robinet.
3. 2. Conductivitatea apei distilate i de robinet la 25, 40, 50oC.
STUDIUL UREAZEI.

a. Extragerea ureazei din seminele de soia. Determinarea activitii ureazei prin reacia de
colorare. Determinarea cineticii activitii ureazei prin metoda de conductivitate. Influena
temperaturii. Determinarea inhibrii activitii enzimatice a ureazei cu ajutorul ionilor metalelor
grele.
b. Influena concentraiei substratului asupra activitii ureasei. Determinarea inhibrii activitii
enzimatice a ureazei cu ajutorul tioureei.
c. Determinarea (KM) i vitezei maximale (Vmax), constantei de specificitate i de cataliz.
d. Determinarea (KM) i vitezei maximale (Vmax) n prezena tioureei.
EXTRAGEREA UREAZEI
8g de fin de soia se adaug 46 ml ap, 2 ml de 0,1N HCl. Amestecul se agit i se adaug
cteva picturi de toluol i se las 15-20 ore. n aceast perioad ureaz trece n soluie.
Suspensia se filtreaz, iar precipitatul se spal cu ap slab acidificat (cteva 3 picturi de HCl de
10% la 500 ml ap). Filtratul se aduce la 100 ml pentru determinarea activitii enzimatice.
Prepararea soluiilor:
Urea (m=60,06g/mol)
Tiourea (m=76,13g/mol)
Uree 12g/l
Uree i tiouree (12 g/l + 15g/l)
Tiouree 15 g/l
Suspensie ureaz:

Experiena 1

1. Trei colbe cu 100 ml soluii de:

Uree 12g/l 0,2 M (NH2) CO (CH4N2O)
Uree i tiouree (12 g/l + 15g/l)
Tiouree 15 g/l CH4N2S
2. Se adaug cte 5 ml ureaz
3. Se adaug cte 1 ml phenolphtalin de 1
Fixam timpul
Rezultate: Soluia de uree n colba (eprubeta) A devine rou. Culoarea se intensific n cteva
minute. Dup cteva minute mai trziu, amestecul de uree / tiouree n colba B ncepe s
transforme un rou deschis. Soluia apoas de tiouree n colba (eprubeta) C rmne incolor.

Concluzie: n ct timp s-a colorat soluia din cele trei colbe.

Experiena 2 Determinarea inhibrii activitii enzimatice a ureazei cu ajutorul ionilor

metalelor grele.
REACTIVE: uree 12g/l, phenolphtalin de 1%, Pb(CH3COO)2de 0,1 M acetat de plumb, ureaz.
1.n 10 eprubete cu 2 ml uree 12g/l. Adugm
1 - Eprubeta - uree
2 - 20 l Pb(NO3)2de 0,1 M acetat de plumb
3 - 50l Pb(NO3) 2
4 -100l Pb(NO3) 2
2.n toate eprubetele se adaug ureaz 150 l.
3.i 2 picturi phenolphtalin de 1%
Determinm conductivitatea
Concluzii:

Experiena 3 Determinarea cineticii activitii ureazei prin metoda de

conductivitate.

Influena temperaturii asupra activitii ureazei. La 0 C sau sub aceast temperatura

activitatea enzimelor este foarte mic. Este suficient ns s ridicm temperatura peste 0 C,
pentru a constata creterii activitii enzimatice. Din 10 n 10 C activitatea se dubleaz de
fiecare dat. Ea scade ns brusc odat cu depirea temperaturii 65 C, anulndu-se uneori cu
totul la 65-75 C. Noi trebuie s determinm temperatura optim, la care activitatea este
maxim.
Sensibilitatea activitii enzimei n dependen de temperatur.
1. 2 eprubete cu 2ml uree 12g/l i 2 picturi phenolphtalin de 1%
2. 2 eprubete cu 150 l ureaz.
3. Se nclzete ultratermostatul pn la 25C,45C, 55C, 65C,75C, 85C.
4. nclzim 1 eprubete cu uree + phenolphtalin de 1% i 1 eprubet cu ureaz.
5. Amestecm reactivele lsate la t C camerei.
6. Amestecm reactivele nclzite.
C

20

40

60

80

100

120

sec
Temp camerei
20
40
60
80
Concluzii:

Ureaza este enzima care descompune ureea n bioxid de carbon i amoniac.

O
+ H2O
H2N

H2N

COO + NH4

NH2

(NH2)2 CO + H20CO2+2NH3

Influena concentraiei substratului.

2NH3 + CO2

140

160

Schimbarea conductibilitii reaciei enzimatice dintre uree i ureaz n dependen de

concentraia ureei la temperatura 50C.
-2
-2
-2
Se pregtete soluie-stoc de uree 2 10 M / L. Din ea se pregtesc soluii de 1.5 10 , 10 ,
-3
-3
7 10
i 4 10 M.
Uree 4*10-3 -2ml +150l ureaz
Uree 7*10-3 -2ml +150l ureaz
Uree 10-2 -2ml +150l ureaz

Schimbarea conductivitii reaciei enzimatice dintre uree i ureaz la temperatura 50 C

70
f(x) = 0.25x + 37.68

60 R = 0.98
4* 10-3
50

40

mS/m 30

Linear (4* 10-3)

7* 10-3

10-2

f(x) = 0.11x + 27.26

R = 0.96

20
Linear ( 10-2)
10

0
0

20

40

60

80

100

120

sec

Concluzii:
Inhibiia competitiv cu tioureea.
Influena tioureei asupra reaciei enzimatice dintre uree i ureaz.

Ca i n experimentul cu ureea se iau concentraiile 1.5 10 -2, 10 -2, 7 10 -3 i 4 10 -3 M i

se amestec n concentraii echimolare cu tiourea. Se adaug soluia de ureaz.

Uree 4*10-3 -2ml + tiouree-200l + ureaz-150 l

Uree 7*10-3 -2ml + tiouree-200l + ureaz-150 l
Uree 10-2 -2ml + tiouree-200l + ureaz-150 l

Schimbarea conductivitii reaciei enzimatice dintre uree, tiouree i ureaz la temperatura 50 C

60

f(x) = 0.19x + 36.34

50 R = 0.91
4 10-3

Linear ( 4 10-3)

40

mS/m 30

7 10-3

10-2

f(x) = 0.07x + 24.62

R = 0.92

20

10
Linear (

10-2)

0
0

20

40

60

80

100

sec

Determinarea constan ei Michaelis -Menten (Km)

conform metodei Lineweaver-Burk
14
12

f(x) = 0.04x + 1.57

R = 0.94

10
f(x) = 0.03x
8 + 1.77
R = 0.94

6
4
2

-100.00 -50.00

Concluzii:

0
0.00

50.00

100.00 150.00 200.00 250.00 300.00

120