Recoltarea embrionilor

Embrionii sunt colectai atunci cnd se gsesc n cornul uterin, dup ieirea lor din oviduct (ntre
zilele 4-5). Din motive sanitare i de congelare se prefer colectarea embrionilor nc inclui n
zona lor pelucid (ies n a 9-a zi).Cel mai frecvent, colectarea se realizeaz ntre zilele 6-8 dup
fecundaie, de regul n ziua a 7-a.
Recoltarea embrionilor se face chirurgicali nechirurgical. Mult timp, metoda
chirurgical a fost singura utilizat. Tehnica operatorie presupunea parcurgerea a dou etape:
laparotomia, cu exteriorizarea aparatului genital n plag i recoltarea propriu-zis a embrionilor
prin splarea cu un lichid cu o compoziie special , a oviductelor (dup un interval de timp mai
mic de 3 zile dup nsmnare) sau a coarnelor uterine (dup un interval de timp mai mare de 4
zile de la nsmnare). n prezent, metoda chirurgical de recuperare a embrionilor la vac este
abandonat, datorit inconvenientelor pe care le prezint. Astzi, este generalizat metoda
nechirurgical de prelevare a embrionilor, a crei principiu const n splarea coarnelor uterine
cu un mediu special preparat, splare care se realizeaz n condi ii de asepsie n a 7-a zi de la
nsmnare. Tehnica nechirurgical de colectare a embrionilor s-a perfecionat continuu, firme
specializate produc pe scar industrial mediul de recoltare, congelare, decongelare i ntreaga
aparatur necesar recoltrii i transferului embrionilor.
Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor presupun mai multeoperaii: contenia
femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta vulvei i a regiunii perivulvare, identificarea
prezenei corpilor galbeni pe ovar, introducerea lichidului de splare n lumenul coarnelor
uterine, splarea acestora, recuperarea lichidului mpreun cu embrionii, identificarea i
recuperarea embrionilor din lichidul recuperat i supus decantrii i aprecierea morfologic a
acestora.
n condiii de ferm, recoltarea embrionilor se face la locul unde se gsete femela
donatoare,dupa contentia adecvata. Pentru a suprima durerea, se practic anestezia epidural cu
4-6 ml procain 2% sau cu 10 ml ludocain 1%, care blocheaz nervii coccidieni i ultimele
perechi de nervi sacrali (S3 , S4, S5). Acul se introduce ntre prima i a doua vertebr coccigian
sau ntre ultima vertebr sacral i prima vertebr coccigian, anestezia instalndu-se dup circa
10-15 minute i dureaz n jur de 90 de minute, zonele insensibilizate fiind: coada, anusul, rectul,
vulva, vaginul i uterul.
Se introduce, cu precauiile de rigoare, mna n rect, acesta se videaz de coninut, apoi
se apreciaz rspunsul femelei la tratamentul poliovulator, palpndu-se cu atenie ambele ovare
i numrdu-se corpii galbeni (foto 19). n cazul n care r spunsul la tratamentul de superovulare
este pozitiv, se procedeaz cu precauie la introducerea cateterului de tip Folley cu dou sau trei
ci, prin conductul cervical pn n cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se introduce pe
lumenul acestuia un mandren (tij metalic), care se menine pn se ajunge n lumenul cornului
uterin, apoi se retrage. Cateterul este introdus circa 5-8 cm de la bifurcaia coarnelor uterine, pe
unul dintre acestea, apoi se introduce de la exterior, cu seringa, 8-15 ml de aer n scopul fixrii
cateterului i pentru a mpiedica refularea din cervix a lichidului de splare. Vasul din sticl , ce
conine lichidul de splare se suspend la 1,5 m de la sol i, prin cdere, acesta ajunge prin calea
de admisie a cateterului n coarnele uterine. Irigarea acestora se face continuu, calea de evacuare
a lichidului este conectat, printr-un tub de plastic, la vasul de colectare a mediului recuperat (de
splare).
Recuperarea lichidului de splare se face prin calea de admisie (n cazul cateterului cu
dou ci la care s-a adaptat o pies n forma literei y) prevzut cu canal de admisie i evacuare al
lichidului, ramura de evacuare a lichidului fiind conectat la un filtru de colectare a crui orificii
au un diametru de 75 m, care are rolul de reinere a embrionilor, lichidul ce traverseaz filtrul
fiind colectat ntr-un recipient situat sub filtru.
Mediul folosit la splarea unui corn
uterin se folosete la splarea, n
acelai mod, a celui de-al doilea corn
uterin. Cantitatea de mediu care se
folosete pentru splarea unui corn
uterin este de 300-500 ml, efectundu-
se irigri repetate i un masaj
transrectal permanent al cornului
uterin perfuzat. Exist diverse sonde
de recuperare a embrionilor,
imaginate de diveri cercettori, care
se bazeaz pe acelai principiu
constructiv .
ntre momentul recuperrii
embrionilor i cel al inoculri lor n
uterul receptoarelor, zigoii trebuie s
fie meninui n via n condiii
speciale i s fie manipulai n cele
mai bune condiii tehnice i igienice.
n ultimii ani s-a generalizat folosirea
unei soluii tampon fosfat - PBS
(Fosfat bufferet salin) pentru splarea
coarnelor uterine i pentru pstrarea
embrionilor recuperai.
Acest lichid are un pH de 7,2, o presiune osmotic de 290 miliosmoli i conine multe
sruri minerale, glucoz i protein (albumin bovin seric, 2-4 g/l, sau ser de viel fetal
decomplementat 10%.
Toate mediile, soluiile, serurile, enzimele i substanele crioprotectoare care vin n
contact cu embrionii trebuie s fie sterile. Tot materialul care nu se arunc (sonde colectoare,
filtre, recipieni din sticl, sonde de transfer, etc.) care necesit a fi sterilizate, se spal cu o solu
ie de detergent netoxic, se cltete n ap distilat, se usuc i se nvelete n hrtie n vederea
sterilizrii. Alegerea metodei de sterilizare depinde de natura materialului (cldur uscat,
cldur umed, substane antiseptice, vapori de formol etc.).Rezultatele recuperrii embrionilor
depind n cea mai mare msur de abilitatea i antrenamentul operatorului.Proporia embrionilor
recuperai, oscileaz n medie, ntre 60-70% comparativ cu numrul de corpi galbeni identificai
pe ambele ovare. Dup colectarea embrionilor se injecteaz donatoarei o doz de PGF 2, care are
rolul de a liza corpii galbeni, evitndu-se astfel gestaia multipl.

Cutarea i aprecierea calitii embrionilor

 Dup prelevarea embrionilor, vasul cu lichidul recoltat (100-150 ml) este lsat timp de
20-30 minute pentru decantare. Se ndep rteaz supernatantul iar stratul inferior n care se
regsesc i embrionii recoltai, se transfer ntr-o plac Petri cadrilat cu diametrul de 10 cm,
(foto 20) sau se agit n mediu din filtrul colector i se toarn n placa Petri. Recipientele de
recoltare a mediului ca i filtrul folosit la recuperarea embrionilor se cltesc de dou trei ori.
Examenul embrionilor n lichidul recoltat trebuie s se fac n cele mai bune condiii de asepsie,
o o
curenie i la o temperatur constant a laboratorului(20 -25 ). Embrionii bovinelor au un
diametru de 150-190 microni, zona pelucid avnd o grosime de 12-15 m. Pentru identificarea
embrionilor, se examineaz la o stereolup (grosisment 30-60 uneori 80-200) fiecare ptrat de la
nivelul plcii Petri.

O dat identificai, embrionii sunt transferai cu ajutorul unei seringi de aspirare, la care
s-a adaptat, printr-un tub de plastic, o micropipet, n pl ci Petri mai mici, cu diametrul de 5 cm
n care se g sete mediul de splare la care s-a adugat 20% albumin seric bovin (BSA).
Operaiunea se repet de 3-5 ori, embrionii fiind transferai dintr-o plcu n alta, schimbndu-se
de fiecare dat pipeta de aspirare. n cazul n care embrionii sunt destinai exportului, acetia sunt
trecui prin zece astfel de bi de splare. Amestecul crioprotectorului cu mediul de conservare
(PBS 40% BSA sau 10-20% ser de viel fetal) provoac o cretere a presiunii osmotice. Pentru
a reduce ocul osmotic, embrionii sunt trecui succesiv i pe cte o durat de 5 - 10 minute n
dou-trei bi cu mediu de conservare cu o concentraie crescnd n crioprotector: glicerol 0,7 M
i apoi 1,4 M, DMSO sau etilen glicol 0,5 M, 1,0 M apoi 1,5 M. Aceast trecere a embrionilor n
o
mediul de conservare cu adaos de crioprotector se face la o temperatur cuprins ntre+20 C i
o
+30 C.
Dup ultima baie, adic n momentul n care este atins concentraia final n
crioprotector (de exemplu: etilen-glicol 1,5 M), embrionii sunt condiionai pentru congelare, fie
n fiole de sticl de 1,2 ml, fie n paiete de polipropilen de 0,25 ml (de tip paiete fine folosite la
conservarea spermei). Paietele sunt identificate individual. Exist bancuri de identificare ce
permit pe de o parte nchiderea ermetic a paietei i care poart (sunt inscripionate) toate
informaiile necesare.
Pentru fiecare paiet trebuie s se menioneze: identificarea donatoarei, rasa, data
colectrii, numrul de embrioni, centrul de producie.
Procedura de umplere a paietelor comport trei compartimente lichide separate de bulele
de aer. Aceasta limiteaz orice risc de pierdere a embrionilor n momentul manipulrilor
efectuate cu umplerea sau evacuarea coninutului paietelor.
Embrionii sunt ncadrai n mai multe categorii calitative: excelent, bun, acceptabil,
inferior, degenerat, ovocit nefecundat.
n cursul examenului sub stereolup la un grosisment mai mic de 80, embrionul este
ntors cu ajutorul unei micropipete de sticl n vederea aprecierii morfologiei sale din toate
unghiurile, unele imperfeciuni putnd scpa observaiei n anumite poziii ale embrionului.
Zona pelucid garanteaz protecia embrionului, motiv pentru care ea trebuie s fie
perfect integr , fr fisuri i perfect sferic. Gradul de dezvoltare embrionar n raport cu ziua
colectrii este principalul factor luat n considerare.
Embrionii care prezint o ntrziere n dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt eliminai.
Embrionii colecta i n a aptea zi de la debutul estrului trebuie s se gseasc n stadiul de
morul compact/blastocist. Embrionii care conin 16 celule sau mai puin, nu se rein pentru
transfer sau congelare, fiind ntr-o ntrziere mare a dezvoltrii.
n stadiul de morul compact, limitele celulare sunt mai puin distincte ntruct
blastomerele sunt strns legate ntre ele i dau un aspect de mure. Prezena ctorva celule
detaate, n spaiul perivitelin nu constituie un motiv de eliminare ntruct majoritatea
blastomerelor formeaz o mas sferic fr opacitate marcant.
n stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, butonul embrionar, trofoblastul)
trebuie s fie vizibile i s prezinte contururi bine delimitate.
Prezena blastomerelor n spaiul perivitelin i a unor granulaii la suprafaa celulelor pot
fi observate. Aceste anomalii asociate unei ntrzieri n dezvoltare, absenei contururilor celulare
sau unei opaciti marcante ale blastomerelor constituie criteriu de eliminare a embrionilor.
Embrionii a cror aspect este ndoielnic sunt conservai una-dou ore apoi vor fi examinai din
nou.
Excelent este considerat unele degenerri i ntrzierea cu o zi. Embrionul
embrionul perfect ca aspect morfologic inferior prezint diverse degradri considerabile:
i corespunztor vrstei .
celule veziculate, variabilitate mare n ceea ce
Embrionul bun calitativ prezint unele
imperfeciuni: zona pelucid oval, privete dimensiunile celulelor, ntrzierea n
dimensiuni mai mici ale embrionului, dezvoltare cu dou zile, absena compactrii.
ntrziere n dezvoltare cu o zi, puine Embrionul degenerat prezint degenerri evidente,
celule extrudate, mici. Embrionul iar ovocitele nefecundate sunt cele care prezint
acceptabil este cel care este bine structur simpl a gametului femel, fr celulele
conturat, ns prezint unele
rezultate din segmentare (Seidel F.G. i
anormaliti: un numr moderat de
celule excluse, dimensiuni mai mici, colab.,1991).

Conservarea i deconservarea embrionilor

o
Embrionii pot fi conserva i cteva ore in vitro la 20 C ntr-un mediu de conservare:
PBS adiionat cu 4 g/l albumin seric bovin, sau cu 10% ser de viel fetal decomplementat. n
acest mediu, embrionii sunt meninui pn cnd sunt transfera i la receptoare. n cazul n care
transferul nu se realizeaz n 6-8 ore de la recoltare, se recomand congelarea prin refrigerarea
o o
embrionilor, la o temperatur de 0 -4 C ntr-un mediu de conservare identic. n acest fel
embrionii pot fi conservai una-dou zile fr ca viabilitatea s fie afectat.
Conservarea de lung durat a embrionilor congelarea - rmne cea mai avantajoas metod de
meninere pentru un interval de timp practic nelimitat a viabilitii embrionilor. Pentru aceasta,
o
embrionii, trebuie s fie meninui n stare solid, n azot lichid, la temperatura de circa -196 C.
o
La temperaturi mai sczute de -100 C, metabolismul celular este complet blocat, singura
problem mai dificil constnd n atingerea acestor temperaturi fr a omor embrionii. n timpul
congelrii, intervin doi factori letali pentru embrioni: formarea gheii intracelulare i concentraia
salin ridicat. Pentru a prentmpina efectul negativ al acestor doi factori, metoda de rcire const n
deshidratarea parial a celulelor i evitarea ocului produs de concentraiile ridicate n sruri prin
utilizarea unui Crioprotector,n general glicerol cu o concentraie de 1,5 M (sau 10% n volum) n
mediul de congelare. Ca ageni criopro-tectori se mai pot folosi: dimetilsulfoxid (DMSO), etilen-
glicol, glicerol, propilen-glicol. n prezent sunt numeroase aparate programabile (freezere) care
permit realizarea unei curbe optimale de rcire (foto23). Substanele crioprotectoare (ngeneral
polialcooli) sunt capabile s ptrund uor n celule printr-o simpl difuziune (osmoz), ntrziind
formarea cristalelor deghea prin coborrea punctului de nghe. Totodat, substanele
crioprotectoare limiteaz efectele negative ale concentraiei saline ridicate, nlocuind o parte din
apa intracelular atras prin creterea presiunii osmotice extracelulare. Ali compui pot avea un
rol protector fa de membranele celulare (hidrai de carbon, polivinilpirolidon), (Barili colab.,
1993).

Viteza de coborre a temperaturii are importan mare n protejarea viabilitii

embrionilor. Mediul care conine embrionii (extracelular) este mai bogat n ap dect mediul
celular. Prin coborrea temperaturii, primele cristale de ghea se produc mai nti n mediul
extracelular, ceea ce va antrena o ridicare a concentraiei n soluie a fraciunii necristalizate.
Aceast concentraie salin ridicat va provoca ieirea unei pri din apa celular , reducnd n
acest fel formarea gheii intracelulare. Dac ritmul de rcire este prea rapid, apa intracelular nu
poate iei n cantitate suficient, cristalele de ghea se formeaz n cantitate mare n interiorul
celulelor i aceste cristale i mresc talia lor n timpul congelrii i decongelrii distrugnd
structurile celulare. n cazul n care ritmul de rcire este lent, deshidratarea progresiv a celulelor
antreneaz o cretere important a concentraiei n electrolii, n mediul celular, modificnd
proprietile fizico-chimice (efectul soluiei), consecina fiind totdeauna pierderea viabilitii
celulelor.
Astfel, integritatea celulelor vii dup congelare este strns legat de dinamica apei
intracelulare n timpul rcirii i deci de viteza de congelare. n cazul embrionilor, ritmul de rcire
trebuie s corespund pentru toate tipurile de celule care-l compun. Rezultatele cercetrilor
ntreprinse pentru clarificarea aspectelor referitoare la ritmul de congelare confirm faptul c
acesta trebuie s se desfoare n dou etape diferite: o congelare lent, n dou trepte: la nceput
o o o o o
4 C/min pn la 6 7 C i 0,3-0,6 C/min ntre 7 C i 30 35 C, apoi o congelare rapid
o o
(brusc) de la -35 C pn la temperatura de pstrare -196 C.
Timpul de ateptare al embrionilor din momentul recoltrii i pn la nceperea
congelrii, nu trebuie s depeasc dou-trei ore.
Protocolul de congelare a embrionilor bovini prevede urmtoarele:
- alegerea embrionilor - calitate excelent sau bun;
- timp de la recoltare pn la nceperea congelrii: dou-trei ore;
o
- introducerea embrionilor n mediul de congelare la temperatura laboratorului (20 C);
- introducerea embrionilor n paiete identificate (mediu, bul de aer, embrioni +mediu,
bul de aer, mediu);
o o o
- rcirea pn la -6 C sau -7 C cu o vitez de 4 C/minut;
- inducerea cristalizrii (palier 5-10 minute);
o o o
- rcirea pn la 30 C sau 35 C cu o vitez de 0,3 - 0,6 C/minut;
- introducerea paietelor ce conin embrionii, direct n azot lichid i
o
stocarea lor (-196 C).
Paietele se vor pstra n permanen n azot lichid pn n momentul transferului la femelele
receptoare. Durata stocrii embrionilor n azot lichid nu influeneaz supravieuirea ulterioar a
acestora.
Decongelarea embrionilor i nlturarea crioprotectorului
o
Embrionii congelai la -35 C nu sunt dect parial deshidratai, o anumit cantitate de
o
ghea se formeaz inevitabil n celule, n momentul imersiei n azot lichid (-196 C). Pentru a se
evita ca prin decongelare s se produc o cretere a acestor mici cristale de ghea care s
distrug celulele, decongelarea trebuie s se fac n timp, ct mai repede posibil (circa
o
2000 C/minut). Pentru aceasta, paietele se scot repede din containerul cu azot lichid i se
o
introduc direct ntr-o baie de ap la 37 C, unde se menin circa 30 de secunde. Imediat dup
decongelare, nlturarea rapid a crioprotectorului este indispensabil supravieuirii embrionilor.
Totui, celulele care conin o concentraie ridicat de crioprotector nu trebuie s fie introduse
direct ntr-un mediu izotonic, ntruct diferena mare de presiune osmotic va provoca
ptrunderea prea rapid a apei n celul, ceea ce va risca s explodeze. De aceea, este necesar o
ndeprtare progresiv a crioprotectorului astfel nct ieirea acestuia i ptrunderea apei n
celul s fie compatibile cu permeabilitatea membranei celulare.
Pentru aceasta sunt mai multe metode care realizeaz o rehidratare lent a celulelor
embrionare.

Diluia crioprotectorului pe etape constn trecerea succesivaembrionilor prin bi cu

concentraii descrescnde n crioprotector (de ex: etilen glicol 1,5 M, apoi 1,0 M, 0,5 M i 0 M).
Meninerea embrionilor n fiecare baie este de 5-10 minute. n acest caz concentra ia mediului n
crioprotector este invers celei din perioada congelrii. Dup nlturarea lichidului de rcire,
calitatea embrionilor poate fi apreciat printr- un examen morfologic efectuat cu ajutorul unei
stereolupe (grosisment x80). n urma examenului morfologic, de regul sunt eliminai ca
necorespunztori calitativ, 10-30% dintre embrionii decongelai.
Diluia crioprotectorului prin folosirea unui mediu care conine sucroz are la baz accelerarea
ieirii acestuia din celule. Molecula de sucroz avnd o greutate molecular mare (344) nu
ptrunde n celule prin simpl difuziune; prezena sa n mediu creaz o mrire a presiunii
osmotice din mediul extracelular, ceea ce va determina o difuziune accelerat a crioprotectorului
din celule. Pentru aceasta, embrionii decongelai sunt introdui direct ntr-o solu ie de PBS care
conine 0,25-0,5 M sucroz, apoi n dou-trei bi succesive de PBS nainte de examinare i
transfer. Se poate realiza retragerea crioprotectorului prin intermediul sucrozei, direct n
interiorul paietei. Pentru aceasta, n momentul introducerii embrionilor n paiete pentru
congelare, alternana diverselor medii din paiet este: la mijloc embrionul n mediu PBS+
etilenglicol 1,5 M, nconjurat de bule de aer i apoi la exterior PBS+sucroz 0,25 M. Dup
decongelare paieta se scutur n vederea amestecrii mediilor pe baz de etilen glicol i cele pe
baz de manoz , ceea ce va permite difuzia crioprotectorului n afara celulei n cteva minute.
Embrionii sunt transfera i fr selecie prealabil, mpreun cu con inutul paietei direct n uterul
femelelor receptoare. Aceast metod mai necesit unele verificri.

Nivelul supravie uirii embrionilor dup decongelare este condiionat de mai muli
factori: stadiul de dezvoltare a embrionilor, calitatea embrionilor nainte de congelare, femela
donatoare etc.
Embrionii transferai n stadiul de morul realizeaz o proporie de supravieuire in
vitro mai redus (64%), comparativ cu cei transferai n stadiul de blastocist (81%), (Martinezi
colab., 1985).
Congelarea nu trebuie aplicat dect embrionilor de bun calitate, caz n care procentul
de supravieuire dup transfer fiind uor inferior (10%) fa de nivelul supravieuirii obinut dup
transfer direct, fr congelare.
 Originea genetic a donatoarei pare a avea un rol nsemnat asupra aptitudinii embrionului
de a fi congelat. Acelai efect denumit i efectul donatoarei a fost demonstrat prin faptul c
procentul de supravieuire a embrionilor congelai n aceleai condiii poate varia de la 0 la 78%
n raport cu donatoarea.

Bibliografie