Efectul antimicrobian i antioxidant in vitro

al tincturii de propolis

Propolisul este unul dintre produsele apicole cele

mai importante, provenind de la rinile pomilor din care
albinele recolteaz polenul. Din punct de vedere chimic,
este o rin pe care albinele o utilizeaz n scopul
meninerii structurii stupului i eliminrii anumitor
invadatori. Datorit coninutului complex n compui
bioactivi pstreaz steril interiorul stupului, avnt un
puternic efect antimicrobian. Este un produs
biofarmaceutic deoarece este considerat un puternic
antibiotic natural, fr efecte secundare. De aceea, este
unul dintre puinele produse naturale care au capacitatea
de a iniba tulpinile de Candida albicans. De asemenea,
manifest, sub form de tinctur, proprieti cicatrizante.
Deine o semnificativ activitate antioxidant i
atitumoral, fiind folosit cu succes ca i supliment n
tratamentele clasice. Valoarea biologic a produsului
depinde de zona geografic, planta de la care se
recolteaz rina sau modul de prelucrare.
 Are o consisten cleioas i are o culoare maro
nchis, cu un miros i gust caracteristic. Rinile
reprezint aproximativ 50% din ntreaga compoziie,
urmate de cear (maxim 30%), uleiuri volatile
(aproximativ 10%) i ali compui (acizi grai, polen
etc.).
Se utilizeaz sub forma de tincturi alcoolice, cu o
concentraie de etanol de 50 70%. Se administreaz
sub form de picturi sau poate face parte din diferite
creme, siropuri sau sucuri naturale.
Material biologic. Se utilizeaz tinctura de
propolis cu un coninut de 50% alcool, procurat de la
stupina Vasile Stan, Bucureti. n funcie de metod se
pot realiza diluii pentru a putea realiza citirile
spectrofotometrice.

Determinarea compuilor bioactivi.

1. Determinarea coninutului fenolic total.

S-a utilizat metoda prezentat de Kubiliene i
colab, 2015 (Creative Commons Attribution License), cu
mici modificri:
 - 0.1 mL tinctur;
- 2.5 mL ap distilat;
- 0.1 mL reactiv Folin-Ciocalteu;
- 0.5 mL carbonat de Na 20%;
- Amestecul de reacie se pstreaz 2 ore la
temperatura camerei;
- Se citete absorbana la 760 nm cu un
spectrofotometru Helios ;
- Rezultatele se interpreteaz prin interpolare n
curba etalon a acidului galic 0.1 1 mg/mL;
- Coninutul fenolic total se exprim ca mg
echivalent acid galic/mL tinctur.

2. Determinarea coninutului total de flavonoide.

S-a utilizat metoda prezentat de Ulloa i colab,
2015 (Creative Commons Attribution License), cu mici
modificri:
- 2 mL tinctur;
- 2 mL AlCl3 2%;
- Amestecul se pstreaz la ntuneric 10 minute;
- Se citete absorbana la 415 nm cu un
spectrofotometru Helios ;
 - Rezultatele se interpreteaz prin interpolare n
curba etalon a quercitinei 10 100 g/mL;
- Coninutul fenolic total se exprim ca mg
echivalent quercitin/mL tinctur.

3. Determinarea coninutului total de flavonoli.

S-a utilizat metoda prezentat de Moukette i
colab, 2015 (Creative Commons Attribution License), cu
mici modificri:
- 2 mL tinctur;
- 2 mL AlCl3 2%;
- 3 mL acetat de Na 5%;
- Amestecul se pstreaz la ntuneric 2.5 ore la
200C;
- Se citete absorbana la 440 nm cu un
spectrofotometru Helios ;
- Rezultatele se interpreteaz prin interpolare n
curba etalon a quercitinei 10 100 g/mL;
- Coninutul fenolic total se exprim ca mg
echivalent quercitin/mL tinctur.
4. Determinarea coninutului de tanin.
S-a utilizat metoda prezentat de Arya i colab,
2012 (Creative Commons Attribution License), cu mici
modificri:
- 3 mL prob;
- 3 mL vanilin 4% n metanol;
- 1.5 mL HCl concentrat;
- Eprubeta se pstreaz 10 minute la ntuneric;
- Rezultatele se interpreteaz prin interpolare n
curba etalon a quercitinei 10 100 g/mL;
- Coninutul fenolic total se exprim ca mg
echivalent catechin/mL tinctur.

Determinare activitate antioxidant.

1. Inhibarea radicalului ABTS.

Reprezint o metod ce poate fi utilizat n cazul
compuilor lipofili i hidrofili, rezultnd o
susceptibilitate mare la valoarea biologic a unui produs.
Este o metod dependent de concentraia extractului
analizat. Radicalii exist deja n amestecul de reacie, iar
soluia se decoloreaz n funcie de prezena compuilor
cu efect antioxidant. S-a utilizat metoda prezentat de
Esmaeili i colab., 2015 (Creative Commons Attribution
License), cu mici modificri. Iniial se prepar o soluie
stoc pentru generarea radicalilor ABTS prin amestecarea
reactivului ABTS 7 mM cu persulfat de K 2.45 mM timp
de 24 de ore, n sticl brun. Reactivul de lucru se
prepar prin amestecarea soluiei stoc cu etanol 50%
pn la o densitate optic de aproximativ 0.7 la 745 nm.
Amestecul de reacie conine:
- 3 mL reactiv de lucru ABTS;
- 0.3 mL prob;
- n paralel se realizeaz un martor, n care se
adaug etanol 50% drept prob;
- Se raporteaz rezultatele fa de un standard, de
exemplu acid ascorbic 1 mg/mL;
- Se citete absorbana la 450 nm cu un
spectrofotometru Helios dup 6 minute;
AM AP
- Se calculeaz inhibarea ABTS (%) =
AM

100.
2. Inhibarea radicalului anion superoxid.
Anionul superoxid are o toxicitate mare i este
generat n organismul uman ca msur defensiv
mpotriva tulpinilor patogene. Este duntor atunci cnd
rezult n urma activitii mitocondriale. S-a utilizat
metoda prezentat de Bhatt i colab., 2013 (Creative
Commons Attribution License), cu mici modificri:
- 0.5 mL nitro tetrazoliu albastru (NBT) 0.3 mM;
- 0.5 mL nicotinamid adenin dinucleotid
(NADH) 0.936 mM;
- 1 mL prob;
- 1 mL tampon Tris-HCl 16 mM, pH 8;
- 0.5 mL fenazin metosulfat (PMS) 0.12 mM;
- n paralel se realizeaz un martor, n care nu se
adaug prob;
- Se raporteaz rezultatele fa de un standard, de
exemplu acid ascorbic 1 mg/mL;
- Eprubetele se pstreaz 5 minute la 250C;
- Se citete absorbana la 560 nm cu un
spectrofotometru Helios ;
AM AP
- Se calculeaz inhibarea SO (%) = 100.
AM
3. Determinarea puterii de reducere.
n aceast metod compuii bioactivi ce pot dona
un electron determin reducerea Fe3+ n Fe2+. Rezultatele
obinute reprezint un indicator direct al capacitii
antioxidante a unui produs. S-a utilizat metoda
prezentat de Bhatti i colab., 2015 (Creative Commons
Attribution License), cu mici modificri:
- 0.2 mL prob;
- 0.5 mL tampon fosfat 0.2M, pH 6.6;
- 0.5 mL fericianur de K 1%;
- Incubare 20 minute la 500C ntr-un termostat
Memmert;
- 0.5 mL acid tricloracetic 10%;
- n alte eprubete se pun urmtoarele:
o 0.5 mL amestec iniial fr sediment;
o 0.5 mL ap distilat;
o 0.1 mL FeCl3 0.1%;
o Se raporteaz rezultatele fa de un
standard, de exemplu acid ascorbic 1
mg/mL;
o Se citete absorbana la 700 nm cu un
spectrofotometru Helios ;
 o Rezultatele se interpreteaz n funcie de
valoarea citit la spectrofotometru.

4. Determinarea capacitii de chelare.

Demonstrarea acestei proprieti este important
deoarece anumite metale favorizeaz formarea
radicalilor liberi n organismul uman. S-a utilizat metoda
prezentat de Koncic i colab., 2011 (Creative Commons
Attribution License), cu mici modificri:
- 0.60 mL prob;
- 0.2 mL FeCl2 0.25 mM;
- 0.4 mL ferozin 1 mM;
- Se raporteaz rezultatele fa de un standard, de
exemplu acid ascorbic 1 mg/mL;
- Se citete absorbana la 545 nm cu un
spectrofotometru Helios dup 10 minute;
- n paralel se realizeaz un martor, n care se
adaug etanol 50% drept prob;
AM AP
- Se calculeaz Capacitate chelare (%) =
AM

100.
5. Inhibarea peroxidrii lipidelor
Metoda, n toate variantele sale, este recunoscut
ca fiind adevratul indicator al activitii antioxidante a
unui produs. S-a utilizat metoda prezentat de Abdullah
i colab., 2012 (Creative Commons Attribution License),
cu mici modificri:
- 0.1 mL prob;
- 1 mL emulsie din glbenu de ou n tampon
fosfat0.1M pH 7.4;
- 0.1 mL FeCl2 1 mM;
- Eprubeta se introduce o or pe baie de ap la
370C;
- 0.5 mL acid tricloracetic 15%;
- 1 mL acid tiobarbituric n acid acetic;
- Eprubeta se incubeaz 10 minute la 1000C;
- Se raporteaz rezultatele fa de un standard, de
exemplu acid ascorbic 1 mg/mL;
- n paralel se realizeaz un martor n care nu se
pune prob;
- Se citete absorbana la 532 nm cu un
spectrofotometru Helios ;
 - Se calculeaz Capacitatea inhibitorie (%) =
AM AP
100.
AM

Acid
Determinarea Proba Proba Proba
ascorbic
compuilor bioactivi 1 2 n
1 mg/mL
Cantitate total de fenoli
(mg echivalent acid
galic/mL tinctur)
Cantitate total de
flavonoide
(mg echivalent
quercitin/mL tinctur)
Cantitate total de
flavonoli
(mg echivalent
quercitin/mL tinctur)
Cantitate total de tanin
(mg echivalent
catechin/mL tinctur)
Determinare
activitate
antioxidant
Inhibarea radicalului
ABTS (%)
Inhibarea radicalului
anion superoxid (%)
Determinarea puterii de
reducere
(D.O. 700 nm)
Determinarea capacitii
de chelare (%)
Inhibarea peroxidrii
lipidelor (%)
Bibliografie selectiv.

1. https://ro.wikipedia.org/wiki/Propolis.
2. http://www.mieresabadus.ro.
3. M.L. Khalil, 2006, Biological activity of bee propolis
in health and disease, The Asian Pacific Journal of
Cancer Prevention, 7, 1, 22-31.
4. L. Kubiliene, V. Laugaliene, A. Pavilonis, A.
Maruska, D. Majiene, K. Barcauskaite, R. Kubilius, G.
Kasparaviciene, A. Savickas, 2015, Alternative
preparation of propolis extracts:
comparison of their composition and biological
activities, BMC Complementary and Alternative
Medicine, 15, 156.
5. B.M. Moukette, A.C. Pieme, P.C.N. Biapa, J.R.
Njimou, M. Stoller, M. Bravi, J.Y. Ngogang, 2015, In
vitro ion chelating, antioxidative mechanism of extracts
from fruits and barks of Tetrapleura tetraptera and their
protective effects against fenton mediated toxicity of
metal ions on liver homogenates, Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine
Volume, Article ID 423689.
6. R. Re, N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M.
Yang, C. Rice-Evans, 1999, Antioxidant activity
applying an improved ABTS radical cation
decolorization assay, Free Radic Biology & Medicine,
26, 9-10, 1231-1237.
7. A.K. Esmaeili, R.M. Taha, S. Mohajer, B. Banisalam,
2015, Antioxidant activity and total phenolic and
flavonoid content of various solvent extracts from in vivo
and in vitro grown Trifolium pratense L. (Red Clover),
BioMed Research International, Article ID 643285.
8. https://en.wikipedia.org/wiki/Superoxide.
9. P. Bhatt, G.S. Joseph, P.S. Negi, M.C. Varadaraj,
2013, Chemical composition and nutraceutical potential
of indian borage (Plectranthus amboinicus) stem extract,
Journal of Chemistry, Article ID 320329.
10. M.Z. Bhatti, A.Ali, A. Ahmad, A. Saeed, S.A. Malik,
2015, Antioxidant and phytochemical analysis of
Ranunculus arvensis L. extracts, BMC Research Notes,
8, 279.
11. M.Z. Koncic, M. Barbaric, I. Perkovic, B. Zorc,
2011, Antiradical, chelating and antioxidant activities of
hydroxamic acids and hydroxyureas, Molecules, 16,
6232-6242.
12. N. Abdullah, S.M. Ismail, N. Aminudin, A.S. Shuib,
B.F. Lau, 2012, Evaluation of selected culinary-
medicinal mushrooms for antioxidant and ACE
inhibitory activities, Evidence-Based Complementary
and Alternative Medicine, Article ID 464238.