Sunteți pe pagina 1din 62

Universitatea de Medicină şi Farmacie

“Gr. T. Popa” Iaşi


FACULTATEA DE MEDICINA
Domeniul: MEDICINA - MICROBIOLOGIE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Infectii asimptomatice cu
transmitere sexuală. Utilitatea
clinică a determinării cantitative
prin Real Time PCR a genotipurilor
cu risc înalt de HPV

Conducător doctorat
Prof. Univ. Dr. Luminiţa Smaranda Iancu

Doctorand
Ramona Gabriela Ursu

IAŞI, 2011
Membrii – referenți specialiști ai comisiei de doctorat au fost numiți
prin decizia nr. 15007 din 3.08.2011:

Ø Prof. Univ. Dr. Mircea Onofriescu – UMF „Grigore T. Popa”, Iași

Ø Prof. Univ. Dr. Simona Ruță – UMF „Carol Davila”, București

Ø Prof. Univ. Dr. Roxana Moldovan – UMF „Victor Babeș”, Timișoara

Susținerea publică a tezei de doctorat va avea loc în data de 10.11.2011, ora


9.00, în sala SOCIETĂȚII DE MEDICI ȘI NATURALIȘTI, IAȘI.

2
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa” Iaşi
FACULTATEA DE MEDICINA
Domeniul: MEDICINA - MICROBIOLOGIE

TEZĂ DE DOCTORAT
REZUMAT

Infecţii asimptomatice cu transmitere sexuală.


Utilitatea clinică a determinării cantitative prin Real Time PCR a
genotipurilor cu risc înalt de HPV

Conducător doctorat
Prof. Univ. Dr. Luminiţa Smaranda Iancu

Doctorand
Ramona Gabriela Ursu

IAŞI
2011

3
CUPRINS

PARTEA GENERALĂ
1. Introducere
2. Stadiul actual al cunoașterii
2.1. Structura papillomavirusurilor
2.1.1.Componente virale și proprietăți fizice
2.1.2.Genomul HPV și ciclul replicării virale
2.2. Clasificarea papillomavirusurilor
2.3. Istoria naturală a infecției HPV
2.3.1. Caracteristicile epiteliului cervical
2.3.2. Transmiterea infecției HPV
2.3.3. Progresia leziunilor
2.4. Mecanisme carcinogenetice
2.4.1. Capacitatea transformantă a HPV
2.4.2. Interacțiunea HPV cu factorii de mediu
2.5. Metode de diagnostic ale cancerului cervical și a leziunilor precanceroase
2.5.1. Metode de inspecție vizuală
2.5.2. Metode citologice și histologice
2.5.3. Metode de biologie moleculară
2.6. Alternative terapeutice ale leziunilor precanceroase și ale cancerului
cervical
2.7. Prevalența, incidența, persistența și clearance-ul infecției HPV
2.8. Profilaxia cancerului cervical și a leziunilor precanceroase
Bibliografie

PARTEA PERSONALĂ
3. Obiectivele studiului
4. Epidemiologia infecției cu HPV
5. Optimizarea metodei de detecție a 37 genotipuri HPV
6. Optimizarea tehnicii Real Time PCR pentru cuantificarea HPV 16 și a HPV 18
7. Validarea tehnicii de genotipare prin participarea la HPV Proficiency Testing,
WHO
8. Prevalența și distribuția genotipurilor HPV în rândul femeilor din zona Moldovei
9. Corelații ale încărcăturii virale a HPV 16 și HPV 18 cu gradul displaziei cervicale
și cu factorii de risc ai neoplaziei cervicale
10. Testarea ADN/HPV post intervenție chirurgicală excisională
11. Evaluarea riscului de evoluție către neoplazia cervicală pentru pacientelor HIV +
12. Infecții asimptomatice cu transmitere sexuală
13. Concluzii generale
14. Originalitatea contribuțiilor proprii
15. Perspectivele pe care le deschide teza
Bibliografie

4
1. Introducere
Cei mai frecvenți agenți etiologici ai infecțiilor cu transmitere sexuală (ITS)
sunt Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Haemoplilus ducreyi,
Chlamydia trachomatis, virusul herpes simplex 2, virusul papilloma uman,
Trichomonas vaginalis. Este binecunoscut faptul că cele mai multe ITS sunt
simptomatice, dar nu se cunoaște frecvența și importanţa infecţiilor asimptomatice
în transmiterea ITS. Pe baza prezenței simptomelor, indivizii pot fi divizaţi în mai
multe categorii: indivizi “simptomatici” (simptomele sunt prezente); indivizi cu
infecţie “inaparentă” (individul prezintă simptome dar nu sunt recunoscute ca fiind
produse de o ITS); persoane “asimptomatice”- aceasta categorie este importantă,
deoarece numai pacienţii “simptomatici” vor solicita tratament specific. Dintre
infecțile produse de agenți etiologici amintiți, numai în cazul şancrului moale,
majoritatea indivizilor sunt simptomatici, cu un număr considerabil de infecţii
inaparente. Studiile de istorie naturală care analizează infecţiile cu HPV, Neisseria
gonorrhoeae şi Chlamydia trachomatis indică faptul că aceşti indivizi rămân în
mod caracteristic asimptomatici, pe când indivizii cu herpes genital prezintă în mod
tipic infecţie inaparentă şi nu asimptomatică.
Dintre toți acești agenți care produc infecții genitale, studiul din cadrul tezei
de doctorat a analizat doar infecțiile produse de HPV.
Cancerul cervical este al treilea cancer diagnosticat ca frecvenţă şi a patra
cauza de deces prin cancer în rândul femeilor din întreaga lume, însumând, pentru
anul 2008, 9% (530.000) din totalul neoplaziilor noi şi 8% (275.000) din totalul
deceselor prin cancer. Peste 85% din decesele înregistate au fost semnalate în țările
în curs de dezvoltare, incidenţa cea mai ridicată la nivel mondial pentru cancerul
cervical fiind regasită în Africa, Asia și America de Sud, iar cele mai scăzute valori
au fost semnalate în Asia de Est, Australia și America de Nord (1). În lipsa aplicării
unor măsuri preventive susţinute, se preconizează că decesele datorate cancerului
de col uterin ar putea creşte cu aproape 25% în următorii 10 ani (2). Pe de altă
parte, majoritatea femeilor din ţările în curs de dezvoltare nu au acces la programele
de profilaxie a cancerului de col uterin, ceea ce explică diagnosticarea acestei forme
de cancer în stadii care depăşesc prin severitate, capacităţile terapeutice actuale (3).
România, cu o populaţie de 9.44 milioane femei cu riscul de a dezvolta
cancer de col uterin, se situează pe primul loc în Europa în ceea ce priveşte
incidenţa (23.9 0/0000) şi mortalitatea (11.6%) prin cancerul de col (iunie 2010)
(4). Estimările actuale indică faptul că în fiecare an aproximativ 3450 de femei sunt
diagnosticate cu cancer de col uterin şi aproape 2100 mor din cauza bolii. Deşi după
formularea relaţiei de cauzalitate dintre HPV şi cancerul de col uterin, în
majoritatea ţărilor au fost iniţiate studii extinse în vederea cunoaşterii prevalenţei şi
distribuţiei infecţiei cu HPV (Human Papilloma Virus), în România, studii similare
au fost întreprinse sporadic, pe loturi nesemnificative, iar datele rezultate nu au fost
5
sistematic raportate, motiv pentru care, despre România se afirmă că „nu sunt date
disponibile” despre aceşti indicatori (Raport OMS, 2009). În acest context, se
justifică necesitatea studiilor privind răspândirea acestei infecţii, ca argument
ştiinţific pentru eficienţa vaccinării pe scară largă, şi nu în ultimul rând, pentru
instituirea programelor naţionale de supraveghere şi screening pentru populaţia la
risc (5).
Harald zur Hausen a formulat, în 1976, ipoteza că HPV joacă un rol
important în etiologia cancerului de col uterin, identificând împreună cu echipa sa,
în perioada 1983-1984, genotipurile HPV 16 şi HPV 18 în tumori ale cervixului;
descoperirea a fost răsplătită cu Premiul Nobel pentru Medicină şi Fiziologie (2008)
(6).
Rolul HPV în oncogeneză este demonstrat cu certitudine nu numai pentru
cancerul de col uterin ci şi în etiologia altor tipuri de cancere anogenitale (anus,
vulvă, vagin, penis) sau cancere ale capului şi gâtului. Genotipurile HPV 16 şi 18
sunt responsabile pentru aproximativ 70% din toate de cazurile de cancer de col
uterin din întreaga lume, fiind recunoscute ca înalt oncogene, împreună cu alte
serotipuri (e.g. 31, 35, 52 sau 58) (7).
Spre deosebire de alte neoplazii, cancerul de col uterin poate fi prevenit
prin programe de screening concepute pentru a identifica şi trata leziunile
precanceroase. Acestea presupun: metode de inspecție vizuală, metode bazate pe
analiza histologică și citologică a ţesuturilor infectate şi nu în ultimul rând, prin
metode de testare a ADN/HPV. Terapia leziunilor precanceroase poate fi
chirurgicală, prin tehnici distructive (e.g. crioterapie, electrocauterizare,
termocoagulare), sau prin tehnici de excizie, de îndepărtare chirurgicală (LEEP –
loop electrosurgical excision procedure – procedura de excizie prin
diatermocauterizare şi LLETZ –loop electrosurgical excision of the transformation
zone – excizia chirurgicală a zonei de transformare). Urmărirea pacientelor după
aceste proceduri chirurgicale, presupune colposcopie, eventual, testarea ADN /
HPV (8).
Perspectiva studiilor epidemiologice privind incidenţa şi prevalenţa
infecţiilor cu HPV se va răsfrânge în trecerea de la profilaxia de tip secundar
(screening), la profilaxia primară (prin vaccinare), în paralel cu eficientizarea
programelor de promovare a sănătăţii (9).
În prezent sunt comercializate pe scară largă, la nivel mondial, două
vaccinuri HPV. Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) recunoaşte importanţa
cancerului de col uterin ca problemă globală de sănătate publică şi recomandă
vaccinarea HPV, ca vaccinare de rutină (10).

6
3. Obiectivele studiului

Lipsa datelor într-o țară aflată pe primul loc în Europa în ceea ce


privește incidenta si mortalitatea prin cancer cervical, necesitatea
acumulării de date științifice utile decidenților politici pentru stabilirea
strategiei de prevenire și control a BTS (boli cu transmitere sexuală),
inclusiv infecțiile HPV, au condus la stabilirea următoarelor obiective
științifice ale acestei teze de doctorat:
1. optimizarea și validarea metodelor de genotipare utilizate pentru
diagnosticul infecţiilor determinate de HPV și pentru determinarea
încărcăturii virale;
2. evaluarea prevalenței și distribuției infecției HPV în lotul de studiu,
ca argument util strategiilor de vaccinare;
3. evaluarea corelațiilor între nivelul încărcăturii virale a ADN HPV 16
& 18 și gradul displaziei cervicale, în vederea intervenţiei terapeutice
în stadii incipiente;
4. evaluarea prin teste ADN HPV a pacientelor post intervenție
excisională, pentru aprecierea statusului eradicării /persistenţei
infecţiei;
5. evaluarea prevalenței infecției HPV în rândul pacientelor HIV
pozitive;
6. evaluarea prevalenței infecției HPV în rândul persoanelor
asimptomatice;
7. aprecirea contribuţiei co-factorilor implicaţi în oncogeneza cervicală.

4. Epidemiologia infecţiei cu HPV

La începutul anilor ’90 studii epidemiologice bazate pe tehnici de


biologie moleculară şi cercetări privind istoria naturală a infecţiei cu Human
Papilloma Virus (HPV) localizată la nivelul tractului genital, au adus dovezi
suficient de puternice pentru a atribui un rol cauzal determinant al HPV în
inducerea cancerului cervical.
Această asociere a fost evaluată pe baza criteriilor de cauzalitate
elaborate de experţi din colectivitaţi de cercetare, de la institute internaţionale de
renume. Modelul propus de această relaţie de cauzalitate este valabil la nivel
mondial şi nu există alte dovezi alternative care să explice etiologia cancerului
cervical. HPV a fost astfel propus drept “cauză necesară” a cancerului cervical.
Concret, conceptul de cauză necesară implică faptul că neoplazia cervicală nu se
poate dezvolta în absenţa persistenţei AND/HPV. Stabilirea acestei relaţii de
cauzalitate a condus la dezvoltarea sistemelor de detecţie ADN/HPV, cu
7
importante consecinţe practice pentru diagnosticul precoce al displaziilor
cervicale şi pentru monitorizarea încărcăturii virale a ADN-ului genotipurilor
oncogene. De asemenea, această descoperire a dus la iniţierea programelor de
prevenţie primară a infecţiei determinate de HPV, prin descoperirea formulei
vaccinale.
Dovada etiologică a implicării HPV în producerea cancerului cervical a
fost demonstrată de studii populaţionale în întreaga lume.
Studii de prevalenţă au demonstrat că, în condiţii optime de testare
(probe de ţesut adecvate şi tehnici sensibile de diagnostic), ADN/HPV poate fi
identificat în toate probele de cancer cervical. Fac excepţie doar forme rare de
limfoame cervicale, sarcoame şi alte tipuri histologice rare.
Studiile caz-control au demonstrat în mod constant riscul pentru femeile
pozitive cu genotipuri înalt oncogene (genotipuri HR HPV – High Risk HPV). De
a dezvolta cancer cervical pentru femeile HR HPV pozitive, în comparaţie cu
loturile martor. Studiile comparative au presupus testarea femeilor care aveau
caracteristici similare cu cele ale pacientele din lotul de studiu: vârstă, status
educaţional, expunerea la factori de risc adiţionali. Pacientele HPV pozitive
pentru 16 sau 18 se consideră a avea un risc mult mai crescut decât pacientele
infectate cu alte serotipuri. Din acest motiv, serotipurile 16 şi 18 fac parte din
categoria HR HPV, împreună cu genotipurile 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,
59, 68.
Sudiile de cohortă (femei care au fost urmărite în timp prin repetarea
testării ADN/HPV şi a examenelor citologice Papanicolau) au demonstrat că
riscul absolut de progresie a leziunilor induse de HPV 16 sau 18 către neoplazia
cervicală intraepitelială de grad 3 (CIN – Cervical Intraepithelial Neoplasia) este
foarte mare în comparaţie cu infecţia cu celelalte genotipuri înalt oncogene (1).
Programele de prevenţie primară (prin vaccinare) şi secundară (prin
screening) au demonstrat că prin reducerea expunerii la HPV este posibilă
reducerea incidenţei CIN 2 / 3 şi, prin extensie, este posibilă reducerea incidenţei
cancerului cervical.
În ţările în curs de dezvoltare sunt înregistrate 80% din cazurile de
cancer cervical; pentru anumite colectivitaţi riscul cumulativ este cuprins între
1,5 – 3 %, în timp ce în ţările dezvoltate se situează în jurul valorii de 3,6% din
totalul de cazuri noi, cu un risc cumulativ de 0,8% în rândul femeilor până la
vârsta de 65 ani. În general, cele mai scăzute rate (< 15/100.000) sunt înregistrate
în Europa (cu excepţia ţărilor din Europa de Est), America de Nord şi Japonia.
Incidenţa este crescută mod deosebit în America Latină (33,5/100.000),
Africa Subsahariană (31,0) şi în Asia de Sud Est (18.3). Numitorul comun pentru
ţările în curs de dezvoltare este reprezentat de status-ul socieoeconomic scăzut şi

8
de lipsa programelor de screening indispensabile în detectarea precoce a
leziunilor canceroase şi precanceroase.
La nivel global modalităţile de diagnostic şi tratament duc de multe ori la
stoparea evoluţiei leziunilor, rata de mortalitate fiind substanţial mai scăzută
decât incidenţa, situându-se în jurul valorii de 55%. Pe de altă parte, cancerul
cervical afectează femei relativ tinere, ceea ce duce automat la scăderea speranţei
de viaţă. O estimare recentă concluzionează că neoplazia cervicală este cea mai
importantă cauză de “pierdere de ani de viata” pentru ţările în curs de dezvoltare.
În America Latină, Caraibe şi Europa Centrală, cancerul cervical aduce o
contribuţie mai mare la pierderea anilor de viaţă, în comparaţie cu boli ca
tuberculoza sau SIDA.
HPV este considerat în prezent al doilea factor de risc neoplazic
(după fumat), fiind implicat în inducerea a 5% dintre cancerele umane în
total, a 10% din neoplaziile la femei şi înregistrând 15% dintre cancerele
femeilor din ţările în curs de dezvoltare (2).
Proiectul GLOBOCAN (bază de date a Agenţiei Internaţionale
pentru Studiul Cancerului ; IARC – International Agency for Research on
Cancer) are ca scop furnizarea estimărilor actualizate ale incidenţei şi
mortalităţii principalelor categorii de cancer, la nivel naţional, pentru toate
ţările din lume. Estimările GLOBOCAN sunt publicate pentru anul 2008
(42), pe sexe şi pe grupe de vârstă, bazându-se pe datele recente furnizate de
IARC; la acestea se adaugă informaţiile oficiale disponibile pe site-urile
instituţiilor de sănătate publică şi datele provenite din “surse locale”.
Dificultăţile în interpretarea acestor date sunt explicate măcar în parte de
faptul că sursele de date sunt în continuă creştere şi ele nu pot fi
sistematizate şi comparate deoarece înregistrarea acestora nu se face după o
metodologie unitară şi deci, există inegalităţi în ceea ce priveşte colectarea
de date atât calitativ cât şi cantitativ. În ultimii ani există mai ales pentru
ţările din S-E Europei preocuparea de a crea o bază de date unică în care
datele sa fie culese unitar, după aceeaşi metodologie, în vederea creeării
registrului naţional de cancere.
În România există această preocupare pentru formarea a 8 registre
de cancer, deoarece recomăndările experţilor presupun creearea unui
registru de cancer pentru populaţii cuprinse între 4 – 5 milioane de
locuitori. Aceste precizări privind calitatea datelor înregistrate (incidenţă,
mortalitate, morbiditate) sunt utile atunci când tentăm să comparăm valori
ale diferitelor forme de cancer înregistrate, în diferite ţări de pe glob. De
multe ori, diferenţele observate pot fi rezultatul utilizării unei metodologii
diferite, sau care se modifică în timp, pentru aceeaşi ţară, ceea ce poate
9
duce la valori total diferite ale incidenţei pentru aceeaşi ţară. Utilizând
informaţiile online furnizate de proiectul GLOBOCAN, identificăm pentru
România o incidenţă de 23.9/0000 pentru neoplazia cervicală şi 3402
cazuri de cancer cervical.
Pe baza acestor date putem observa incidenţa extrem de scăzută a
cazurilor de cancer de col uterin în ţările din Europa de vest şi în Ţările Nordice,
în America de Nord şi Australia. La pol opus se remarcă valorile îngrijorătoare
întâlnite în ţările din Africa, America de Sud (50 – 56.3), India şi Romania. Lipsa
programelor eficiente de screening precum şi gradul scăzut de informare al
populaţiei feminine cu risc, sunt probabil principalele cauze ce au dus la creşterea
incidenţei cancerului de col uterin în aceste zone ale globului. Date recente (iunie
2010) situează România pe primul loc în Europa în ceea ce priveşte incidenţa
(23.9) şi mortalitatea (11.6) prin cancerul de col, din totalul celor 20 de ţări
europene analizate (4).

Fig. 1: Incidenţa şi mortalitatea estimată pentru cancerul de col uterin, pentru 20


de ţări din Europa (4) (http://globocan.iarc.fr)

10
Din ianurie 2010, Centrul de Informare pentru HPV şi cancerul
cervical (WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer) a
dat publicităţii date oficiale privind incidenţa cancerului cervical. (2) În
acest raport, pentru România se menţionează că “nu sunt date disponibile
referitoare pentru primele 10 genotipuri HPV, în rândul femeilor cu şi fără
leziuni cervicale”, în comparaţie cu datele disponibile pentru Europa sau
cele de la nivel mondial.
Lipsa acestor date pentru România poate fi explicată, macar în
parte, prin dificultatea centralizării unor date după o metodologie unică şi
prin absenţa unui soft-ware dedicat, pentru înregistrarea corectă, completă
şi unitară a datelor privind cancerele înregistrate la nivel regional, respectiv
naţional. O a doua explicaţie este lipsa fondurilor necesare testării prin
tehnici de biologie moleculară, în vederea stabilirii prevalenţei şi
distribuţiei genotipurilor HPV în rândul populaţiei feminine.
În acest context, studiul propus, are ca prim obiectiv estimarea
prevalenţei infecţiei cu HPV în rândul femeilor din zona de Nord Est a
Moldovei, precum şi distribuţia genotipurilor HPV în raport cu gradul
displaziei cervicale, prin utilizarea unei metode sensibile de detecţie a
genotipurilor de HPV. Al doilea obiectiv este acela de a stabili rolul
încărcăturii virale ca biomarker în diagnosticarea leziunilor displazice,
obiectiv care presupune selectarea pacientelor HPV 16 şi HPV 18 pozitive,
monitorizarea încărcăturii virale, astfel încât să putem stabili acea valoare
prag a încărcăturii virale utilă diagnosticului precoce, în vederea instituirii
măsurilor terapeutice în timp util.

Tranziţia de la cercetare la implementarea de rutină


Multiple studii transversale au demonstrat faptul că testarea ADN/HPV
este mult mai sensibilă pentru CIN2 decât citologia, dar mai puţin specifică
(14).
Tabel I: Comparație între sensibilitate, specificitate pentru citologie vs testare
ADN/HPV
Sensibilitate Specificitate
HPV 96 (94 – 97) 91 (90 – 91)
Citologie 53 (49 – 57) 96 (96 – 97)

Rezultatele prezentate în Tabelul II au fost obţinute prin analiza


rezultatelor a mai multor triale randomizate (NTCC – Italia, Public Health
Trial – Finlanda, Swedescreen, POBASCAN – Olanda, ARTISTIC –
Anglia), realizate între anii 2006 – 2008.

11
Fig. 2: Cele mai frecvente tipuri de HPV în rândul femeilor cu / fără leziuni
cervicale, în ţări din Europa de Est şi la nivel mondial
(http://www.who.int/hpvcentre/en) (2)

Tranziţia de la cercetarea la implementarea rezultatelor cercetării


necesită un timp îndelungat şi este în mod particular dificilă atunci când
este deja stabilit un program de screening. Toate acestea reprezintă o
provocare pentru noile modalităţi de testare, pentru că implementarea de
noi metode de screening naţional presupune şi consideraţii politice. O
asemenea problemă s-a pus în Anglia, şi anume, un proiect multicentric
randomizat şi-a propus să evalueze dacă testarea HPV poate reduce
incidenţa cancerului cervical într-o manieră cost – eficientă.
12
Discrepanţa între cercetare şi implementare poate fi diminuată prin
proiecte randomizate, cum ar fi programe naţionale de screening. Prin
asemenea tipuri de proiecte se poate demonstra că utilizând o singură rundă
de testare HPV se poate cheltui mai puţin decât realizând 2 runde de
citologie în mediu lichid. Un asemenea proiect poate fi indeplinit în ţări
unde există un program de screning al cancerului cervical foarte bine
organizat şi sistematizat. Implementarea presupune de asemenea ca femeile
testate să primească mai multe informaţii despre testarea ce urmează a li se
realiza, precum şi o infrastructură adecvată pentru urmărirea pe termen
îndelungat (programe de screening organizate şi iniţiative ale guvernelor de
a participa la aceste acţiuni) (15).

Suntem pregătiţi pentru implementarea testării AND HPV ca metodă


de screening primar ?
Una din cele mai importante descoperiri medicale în ultimii 50 de
ani a fost indentificarea HPV drept cauză primară a cancerului cervical.
Este cunoscut faptul că, virtual, toate cazurile de cancer cervical sunt
produse de HPV, iar această informaţie a fost utilizată pentru a obţine
vaccinuri împotriva a două tipuri majore de HPV (16 şi 18), care cauzează
aproximativ 70% din toate neoplaziile cervicale la nivel mondial. De
asemenea, aceaaşi informaţie a condus la dezvoltarea de teste screening
care identifică virusul direct în celulele cervicale, în opoziţie cu abordarea
convenţională de a observa anomaliile citologice cauzate de virus. Rolul
screening-ului pentru tipurile HR HPV se regăseşte în 3 situaţii:
a. managementul leziunilor cu risc scăzut, în care prezenţa
unui HR HPV sugerează o leziune CIN;
b. “test of cure” în cazul femeilor tratate pentru leziunile CIN
cu grad înalt;
c. test de screening primar: sensibilitatea crescută a testării
HPV indică faptul că testele ADN pot fi folosite ca test
unic de screening primar, iar citologia poate fi utilizată ca
test de triaj pentru femeile HPV pozitive.
Specialişti în domeniu au revizuit o multitudine de teste care au
evidenţiat că testarea HPV este mult mai sensibilă decât citologia şi poate
fi, în mod sigur realizată la intervale mai mari de timp. Studii viitoare vor
propune un nou algoritm pentru utilizarea testării HPV ca unic test de
screening pentru femeile cu vârsta peste 30 de ani (15).

13
5. Optimizarea metodei de detecţie a 37 tipuri HPV
cu ajutorul kitului Linear Array HPV Genotyping Test

Principiul procedurii – testul Linear Array HPV Genotyping test se


bazează pe 4 etape majore:
1. prelucrarea probelor recoltate de la paciente;
2. amplificarea PCR a ţintelor ADN, utilizând primeri HPV;
3. hibridizarea ampliconilor;
4. detecţia prin determinare colorimetrică a produselor amplificate.

1. Recoltarea produselor patologice de la nivelul colului uterin se


realizează cu ajutorul periuţelor Cervex Brush care se descarcă în
recipientele pentru transportul probei (ThinPrep PreservCyt Solution). După
descărcarea periuţei în soluţia ThinPrep, aceasta se aruncă.
2. Amplificarea ţintelor:
Amplificarea ţintelor ADN HPV este realizată cu ajutorul polimerazei
AmpliTaq Gold care facilitează amplificarea “hot start”, precum şi cu ajutorul
beta globinei ca şi control. Iniţial, mixul reacţiei PCR este încălzit pentru a
activa polimeraza AmpliTaq Gold, ceea ce favorizează denaturarea ADN-ului
viral şi a celui genomic, precum şi punerea în contact cu secvenţele primerilor
ţintă. Pe masură ce amestecul se răceşte, primerii (upstream şi downstream) se
fixează pe ţinta ADN. Polimeraza, în prezenţa Mg2+ şi a excesului de dNTPs,
extinde fixarea primerilor până la formarea unui ADN dublu catenar de 450
perechi de baze, sau 268 perechi de baze pentru ampliconul de beta globină.
Acest process este repetat pentru un anumit număr de cicluri (40), în fiecare
ciclu având loc dublarea cantităţii de amplicon. Amplificarea are loc numai în
regiunea genomului HPV sau a beta globinei, între cele mai apropiate perechi
de primeri; nu are loc amplificarea întregului genom.
Amplificarea selectivă:
Amplificarea selectivă a ţintelor de acid nucleic este obţinută prin utilizarea
enzimei AmpErase (uracil-N-glicozilaza) şi a deoxiuridin trifosfat. Enzima
AmpErase recunoaşte şi catalizează denaturarea lanţurilor ADN care conţin
deoxyuridina, dar nu şi pe acele lanţuri ADN care conţin deoxitimidină.
Deoxiuridina nu este prezentă în ADN-ul natural, dar este prezentă întotdeauna
în ampliconi, datorită faptului că Mastermix-ul conţine deoxiuridină – trifosfat;
prin urmare, numai ampliconii conţin deoxiuridină. Enzima AmpErase, care
este inclusă în Mastermix, catalizează desfacerea deoxiuridenei care conţine
ADN, în reziduuri de deoxiuridină, prin deschiderea lanţului de deoxiriboză la
nivelul C1. În timpul primului ciclu termic, la pH-ul alcalin al Mastermixului,
lanţurile de ADN ale ampliconilor se rup la poziţia deoxiuridinei. Enzima

14
AmpErasa este inactivă la temperaturi peste 55 ºC, şi, prin urmare nu va
distruge ampliconii ţintă. După amplificare, orice rest enzimatic este denaturat
prin adaugarea soluţiei de denaturare, ceea ce previne degradarea ampliconilor.
3. Reacţia de hibridizare:
După amplificarea PCR, ampliconii HPV şi de beta globină sunt chimic
denaturaţi şi formează un singur lanţ de ADN, prin adăugarea soluţiei de
denaturare. Ampliconii denaturaţi sunt trasferaţi în godeurile corespunzatoare
din taviţa de hibridizare, godeuri care conţin lichidul de hibridizare şi un
singur strip din kit (strip care conţine probe de HPV şi beta globină).
Ampliconii fixaţi de biotină vor hibridiza acele probe oligonucleotidice care
conţin secvenţa corespunzătoare probei complementare. În plus, stripurile
kitului sunt sensibilizate şi pentru o probă oligonucleotidică cross-reactivă care
hibridizează cu genotipurile HPV 33, 35, 52 58. Ampliconul care conţine
secvenţe apropiate (1 până la 3 neconcordanţe), complementare probei, vor
hibridiza cu această bandă.
4. Reacţia de detecţie:
După reacţia de hibridizare, stripurile sunt spălate pentru a îndepărta materialul
nefixat. Se adaugă în tăviţa de hibridizare un conjugat: peroxidaza de hrean –
streptavidina. Aceasta se va fixa pe ampliconii hibridizaţi cu oligonucleotidele
de pe strip. Stripul este supus unor etape de spălare pentru a îndeparta excesul
de streptavidina. Se adaugă un substrat – soluţie care conţine peroxid de
hidrogen şi 3, 3’, 5, 5’ tetrametilbenzidină (TMB). În prezenţa peroxidului de
hidrogen, streptavidina fixată catalizează oxidarea TMB către formarea unui
complex albastru, care precipită la poziţia probei unde a fost relizată
hibridizarea. Stripul este citit vizual prin compararea benzilor de pe strip cu
şablonul din kitul Linear Array HPV Genotyping Test (16).

Interpretare rezultate Linear Array HPV Genotyping test:

Ø test calitativ in vitro ce detectează prezenţa a 37 genotipuri HPV:


• 13 genotipuri cu risc înalt oncogen: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 56, 58, 59, 68;
• 24 genotipuri cu risc intermediar şi scăzut oncogen: 6, 11, 26, 40,
42, 45, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82,
83, IS39, CP6108;
• beta globina – martor de recoltare, purificare, amplificare corecte
a ADN / HPV.

15
Fig. 3: Şablon de interpretare, martor pozitiv şi negativ, stripul pacientei 24,
pozitiv pentru HPV 16 – infecţie unică

Fig. 4: Şablon de interpretare, martor pozitiv şi negativ, stripul pacientei 14,


pozitiv pentru HPV 16 şi HPV 18– infecţie multiplă
Concluzii:

1. Îndeplinirea criteriilor de validare impuse de protocoalele de lucru


ale producătorilor ne-au permis confirmarea rezultatelor şi
optimizarea tehnicii de lucru pentru genotiparea HPV.
2. Validarea în cazul testului de genotipare a fost posibilă prin
îndeplinirea criteriilor de calitate pentru martorul pozitiv şi negativ,
cat şi prin prezenţa benzilor de beta globină (cu cele două valori,
“high”, respectiv “low”).

16
6. Optimizarea tehnicii Real Time PCR pentru cuantificarea
ADN/HPV 16 și a ADN/HPV 18

În anul 1996, compania Applied Biosystems (ABI) a realizat primul


instrument Real Time PCR (PCR în timp real) comercial – instrumentul
denumit ABI 7700. De atunci, RT qPCR (RT CPCR – PCR cantitativ în
timp real) a devenit cea mai exactă şi sensibilă metodă pentru detecţia şi
cuantificarea acizilor nucleici. Principiul RTPCR: intensitatea fluorescenţei
din sistemul de reaţie este direct proporţională cu cantitatea iniţială a
produsului de amplificat; vizualizarea este posibilă prin utilizarea unei
molecule fluorescente (26).
Comparaţie PCR versus RT PCR :
o fluorescenţa este măsurată în timpul fiecărui ciclu de amplificare
(semnalul este direct propoţional cu cantitatea produsului PCR) ;
o curbele de amplificare cresc după un număr de cicluri care este
proporţional cu cantitatea iniţială de matriţă (template) ADN;
o raportarea la valorile curbei standard va oferi date legate de
cuantificarea produsului dorit (27).
o momentul în care se vizualizează produsul reacţiei de amplificare:
§ în reacţia PCR clasică, rezultatele se evidenţiază în gelul de
electroforeză, după ce amplificarea s-a finalizat şi când pot apare
inhibitori ai reacţiei;
§ în RT PCR, măsurarea fluorescenţei se realizează în timpul
fiecărui ciclu de amplificare. Aceasta permite cuantificarea ţintei
înainte de acumularea inhibitorilor, inactivarea polimerazei.
Evaluarea datelor qPCR
Odată ce experimentul a fost finalizat, se realizează analiza datelor
obţinute. Această analiză presupune anumiţi paşi:
o Analiza preliminară a datelor:
§ corectia baseline;
§ setarea threshold cycle;
§ verificarea controalelor negative / pozitive;
§ verificarea probelor necunoscute;
§ realizarea analizei specifice a experimentului:
· curba standard - cuantificarea absolută / parametri;
· quantificarea relativă;
· “curba de melting” / topire (doar pentru SYBR Green).
Baseline – este ciclul iniţial în RTPCR când se poate observa o mică
schimbare în semnalul fluorescent, de obicei regăsindu-se la ciclurile 3-15.

17
Threshold cycle / Ct – primul ciclul PCR la care fluorescenţa măsurată de
instrument este determinată peste nivelul semnalului de fond (back-ground)
(fig 24).
Cuantificarea absolută:
• presupune construirea unei curbe standard pentru fiecare ţintă;
• curba standard este realizată dintr-o serie de diluţii ale unei probe
cu o concentraţie cunosctă;
• Ct-ul fiecărui standard se situează pe axa orizontală, iar pe axa
verticală sunt notate valorile logaritmice ale concentraţiilor
cunoscute;
• curba standard este utilizată pentru a estima concentraţia probelor
necunoscute.
Parametrii unei curbe standard corect realizată:
o eficienţă înaltă: 90% - 110%;
o precizie bună: 0,985 – 1,00;
o variabilitate scăzută între standarde.
Etapele de lucru:
Ø recoltare produse patologice;
Ø purificare ADN – HPV;
Ø cuantificare AND/HPV 16 şi HPV 18 prin Real Time PCR.
1. Recoltarea produselor patologice şi purificarea ADN HPV se
realizează similar testului de genotipare, anterior detaliat. Singura
deosebire este faptul că protocolul nu presupune concentrarea probei
prin centrifugare, tehnica Real Time PCR fiind mult mai sensibilă
decât PCR –ul clasic.
2. Quantificarea HPV 16 şi 18 utilizând kiturile Path-HPV16 Real-time
PCR detection kit for Human Papillomavirus, Path-HPV18 Real-time
PCR detection kit for Human Papillomavirus, 2 x Precision TM
Mastermix, PrimerDesign, cu ajutorul instrumentului qPCR –
STRATAGENE, MX3000P:

Fig. 5: Termocyclerul Stratagene MX3005P


18
v Kitul 2 x Precision TM Mastermix conţine: buffer, 0,025 U/ µl
Taq Polimerază, 5 mM MgCl2, dNTP Mix (200 µM pentru
fiecare dNTP) (29).
v Kiturile Path-HPV16 Real-time PCR detection kit for Human
Papillomavirus şi Path-HPV18 Real-time PCR detection kit for
Human Papillomavirus conţin:
Probe lucrate şi optimizate:
a. Pacienta H. L., 29 ani, cu următorul istoric:
- 6.04.09: HSIL;
- 12.04.09: HPV 16 pozitivă.
Parametrii generaţi de soft-ul instrumentului pe baza celor 5 standarde s-a
încadrat in limitele normale (fig. 8):
o eficienţă înaltă: 99,2 % (90% - 110%);
o precizie bună: 0,999 (0,985 – 1,00);

Fig 6: Curba standard optimizată realizată pentru 5 standarde

b. Pacienta V. D, 23 ani, pozitivă pentru HPV 18, 53, 54.

Fig 7: Curba standard (pacienta V.D.)

o eficienţă înaltă: 93,5% (90% - 110%);


o precizie bună: 0,997 (0,985 – 1,00).
Concluzie: În această etapă a cercetării a fost optimizată cuantificarea
încărcăturii virale prin RT PCR, pentru genotipurile înalt oncogene de
HPV, respectiv tipurile 16 şi 18.

19
7. Validarea tehnicii de genotipare prin participarea la HPV
Proficiency Testing
(WHO HPV LabNet Report on HPV DNA Proficiency Panel 2010)

Evaluarea vaccinării HPV, implementarea efectivă și monitorizarea


programului de vaccinare HPV necesită utilizarea de metode corecte de
detecție și de tipare a ADN HPV, care pot fi comparate la nivel
internațional.
WHO Global HPV LabNet este o inițiativă a OMS (Organizația
Mondială a Sănătații) al cărei scop este sprijinirea implementării vaccinării
HPV la nivel mondial, prin standardizarea laboratoarelor și asigurarea
calității testării HPV și a metodelor de genotipare utilizate pentru evaluarea
vaccinării anti HPV și pentru supravegherea și monitorizarea programelor
de vaccinare. (http://www.who.int/biologicals/vaccines/hpv/en/index.html ).
O strategie importantă pentru atingerea acestui demers este
dezvoltarea, pregătirea și validarea unui panel de proficiență pentru a
califica metodele de genotipare și laboratoarele în care se utilizează aceste
metode.
Apelul pentru participarea la acest studiu de competenţă a fost
publicat pe site-ul OMS și trimis apoi birourilor regionale ale OMS în data
de 10 aprilie 2010, pentru publicul larg.
Scopurile acestui panel au fost:
a. Evaluarea competenţei metodelor de tipare a HPV utilizate în mod
curent în laboratoare la nivel mondial;
b. Evaluarea sensibilității detecției tipurilor specifice de HPV, prin
diferite metode de lucru;
c. Identificarea problemelor fiecărei metode utilizate de rutină.
Metoda de realizare a testului de proficiență
Compoziția panelului: în laboratorul de referință LabNet Global Reference
Laboratory (GRL) al University Hospital in Malmö, Suedia, au fost primite
genóme complete ale HPV clonate în plasmide, însoțite de apobarea scrisă
a aparținătorilor de a fi utilizate în acest panel de proficiență OMS.
Toate probele au fost plasmide diluate în ADN uman placentar
(Sigma-Aldrich no 7011), până la o concentrație de 10 ng/l. Tipurile de
HPV incluse au fost: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,
66, 68a (HPV 68 prototip) și 68b (ME 180 izolat prin microscopie
electronică). Trei probe suplimentare, A, B și C au fost linii celulare
utilizate ca și control pentru purificarea ADN, primul pas al genotipării
HPV. Compoziția panelului este redată în tabelul XV.

20
Distribuirea PP: după validare, PP a fost distribuit în perioada iunie –
august, 2010, către 105 laboratoare din 6 regiuni OMS, în urma apelului de
participare și urmare a solicitărilor primite din partea laboratoarelor. Nu a
fost solicitată nici o taxă de participare din partea laboratoarelor.
Distribuirea PP a fost de asemenea plătita de către WHO HPV LabNet.
Numărul laboratoarelor incluse în PP, în funcție de regiune OMS a fost
(fig. 39):
o 1 (AFRO – Regional Office for Africa);
o 5 (EMRO – Regional Office for the Eastern Mediterranean);
o 49 (EURO – Regional Office for Europe);
o 9 (SEARO – Regional Office for South East Asia);
o 18 (WPRO – Regional Office for Western Pacific);
o 23 (Regional Office for the Americas – AMRO, sau Pan American
Health Organization – PAHO).

Fig 8: Distribuirea la nivel mondial a laboratoarelor care au trimis rezultatele


pentru panelul de proficiență ADN/ HPV

Au fost returnate către GRL 132 seturi de date cu rezultatele


genotipării HPV, înainte de dead-line, de la 98 de laboratoare. 73 de
laboratoare au trimis datele obținute utilizând o singură metodă de
genotipare, 17 laboratoare au utilizat câte 2 metode de genotipare HPV, 7

21
laboratoare au utilizat 3 metode, iar un laborator a genotipat probele
utilizând 4 metode diferite.
În anul 2008, panelul HPV – OMS a fost pregătit, administrat și
distribuit de laboratorul de referință din Suedia. Datorită resurselor limitate
ale laboratorului de referință, în 2010, acesta doar a pregătit materialele, iar
subcontractarea, administrarea și distribuția probelor a fost realizată de
compania non-profit EQUALIS (External Quality Assurance in Laboratory
Medicine In Sweden), activă în domeniul asigurării controlului extern.
Modelul utilizat pentru testarea din 2010 a decurs bine și este considerat un
model de organizare pe termen îndelungat, în ceea ce privește distribuirea
panelurilor de proficiență HPV în fiecare an.
Analiza datelor: datele analizate în acest raport includ toate rezultatele
care au fost trimise înainte de data de 1 noiembrie 2010. Datele au fost
compilate de către EQUALIS și transferate apoi GRL pentru analiza
rezultatelor. Fiecare set de date a primit un număr cuprins între 1 și 132.
Aceste date au fost analizate în funcție de regiunea laboratorului și de
metoda utilizată pentru genotipare.
Din datele trimise, s-a remarcat faptul că laboratoarele participante
au utilizat metode comerciale precum și metode „in-house” (Tabelul 2).
Proporția rezultatelor corecte pentru genotiparea HPV, raportate de fiecare
laborator în parte, a fost analizată în funcție de metoda utilizată. Un set de
date analizat a fost considerat proficient / competent dacă a detectat cel
puțin 50 unități internaționale (UI) de HPV 16 și HPV 18 în 5 µl proba și
500 genóme echivalent (GE) în 50 µl pentru alte tipuri HPV, fie în infecții
unice, fie in infecții multiple. Pentru stabilirea proficienței/competenței, a
fost de asemenea stabilită condiția de a nu se fi raportat mai mult de un
genotip ca reacție fals pozitivă. Aceasta corespunde unei specificități de 97
%.
Rezultate: 98/105 laboratoare au raportat 132 seturi de date. 4 seturi de
date au fost obținute utilizând metode care nu au diferențiat genotipurile
HPV sau rezultatele au fost raportate ca HPV 16, 18 „și alte genotipuri HR
HPV”. Aceste seturi de date nu au fost incluse în analiza genotip –
specifică din acest raport. Fiecare set de date trimis de fiecare laborator în
parte a fost analizat, iar participanții au primit o scrisoare de feed back în
noiembrie 2010.
Fig. 41 include numai datele care au fost obținute prin testarea a
mai mult de două genotipuri HPV (118 seturi de date). Rezultatele
laboratoarelor care au au genotipat numai HPV 16 și 18 au fost excluse din
această figură.

22
Fig. 9: Proficiența testării ADN/HPV în funcție de regiunea OMS

Fig. 10: Imaginea celor 48 de stripuri obţinute prin prelucrarea probelor


ADN/HPV – OMS

Rezultatele obținute în laboratorul de Virusologie Moleculară al


UMF „Grigore T. Popa”, Iași, pentru care am fost evaluați ca fiind
proficienți pentru genotiparea HPV, sunt redate în tabelul XVIII (42).

23
Tabel II: Rezultatele obținute la HPV Proficiency Testing 2010, OMS

Panel ID HPV type(s) in the panel Content Your results


(IU or GE per 5 µl) Linear Array
50 µl input volume
1 59 50 HPV 59
2 31 500 HPV 31
3 6, 16, 18, 51 500 HPV 6, 16, 18, 51
4 45 500 HPV 45
5 16 50 HPV 16
6 35, 59, 66, 68ME 500 HPV 35, 59, 66, 68; *
7 56 500 HPV 56
8 18 50 NEGATIVE
9 35 500 HPV 35;*
10 68ME 500 HPV 68
11 HPV 11, 16, 31, 33,
11, 16, 31, 33, 58 50 58;*.
12 51 50 HPV 51
13 6 500 HPV 6
14 58 500 HPV 58; *
15 66 50 HPV 66
16 39, 45, 52, 56, 68 a
500 HPV 39, 45, 56, 52.
17 33 500 HPV 33
18 39 50 HPV 39
19 52 500 HPV 52.
20 68 50 NEGATIVE
21 11 500 HPV 11
22 HPV 11, 16, 31, 33,
11, 16, 31, 33, 58 500 58;*
23 16 5 HPV 16
24 56 50 HPV 56
25 33 50 HPV 33
26 6, 16, 18, 51 50 HPV 6, 16, 18, 51.
27 Negative 0 NEGATIVE
28 35 50 HPV 35; *
29 18 5 HPV 18
30 58 50 HPV 58; *
31 68ME 50 HPV 68
32 39, 45, 52, 56, 68 50 HPV 39, 45, 52, 56; *
33 6 50 HPV 6
34 45 50 HPV 45
35 68 500 NEGATIVE

24
36 66 500 HPV 66
37 11 50 HPV 11
38 59 500 HPV 59
39 52 50 HPV 52
40 35, 59, 66, 68ME 50 HPV 35, 59, 66, 68;*
41 31 50 HPV 31
42 39 500 HPV 39
43 51 500 HPV 51
A 16 25 NEGATIVE;
B none 0 NEGATIVE;
C 16 2500 HPV 16 LOW;

* menționăm că toate datele prezentate în acest raport au fost traduse cu


permisiunea organizatorilor panenului de proficiență (53).

8. Prevalenţa şi distribuţia genotipurilor HPV în rândul femeilor


din zona Moldovei

Obiective: Estimarea prevalenţei şi distribuţiei genotipurilor HPV


în zona de Nord a Moldovei. Corelarea infecţiei HPV cu factorii de risc ai
displaziei cervicale.
Material şi metode: în perioada septembrie 2009 – mai 2011 am
genotipat 353 de probe ADN purificat din celule cervicale, recoltate de la
pacientele invitate să participe la studiu. Participantele au semnat
formularul de consimţământ informat aprobat de Comisia de Etică a
Universităţii de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa”, Iaşi.
Înainte de recoltarea de celule cervicale, medicii ginecologi au
completat, împreună cu pacientele, date personale ale acestora. În acest
formular de solicitare a analizei de genotipare HPV am încercat sa aflăm
care sunt co-factorii displaziei cervicale: numărul de naşteri, utilizarea de
contraceptive orale, fumatul, numărul de parteneri sexuali, alte infecţii
genitale (Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Candida
albicans, virusul herpes simplex), rezultatul examenului citologic Babeş
Papanicolau. De asemenea, am solicitat în acest formular date despre
utilizarea tratamentului antiinflamator în antecedente, dacă a existat
suspiciune macroscopică sau simptomatologie sugestivă (fig. 46).

25
Datele anamnestice ale pacientelor precum şi rezultatul testărilor au
fost prelucrate cu ajutorul programului de prelucrare statistică a datelor -
SPSS 16.0.

infectii multiple
11%

infectii unice
25%

negative
64%

Fig. 11: Prevalența infecțiilor HPV

Fig. 12: Formularul de solicitare a analizei de genotipare HPV


26
În tabelul IV este redată prevalența genotipurilor HPV în toate
infecțiile detectate, iar în fig. 15 sunt redate frecvențele genotipurilor HPV
în cazul pacientelor cu citologie normală și patologică.
Tabel III: Prevalenta genotipurilor HPV pentru toate tipurile de infecții: unice și
multiple
Tip HPV Frecventa Procent
negativ 226 64,0
16 35 9,91

53 20 5,66

51 18 5,09
18, 31 11 3,11

52 10 2,83

6, 42 8 2,26

58, CP6108 7 1,98

45 6 1,69

33, 66, 70 5 1,41


68, 73, 84 4 1,13

56, 82 2 0,65

40 1 0,28

Fig. 13: Cele mai frecvente genotipuri HPV identificate in rândul femeilor din
Nordul Moldovei, cu citologie normală şi patologică

27
Concluzii:

• genotiparea prin testarea ADN /HPV este cea mai indicată metodă
de screening pentru cancerul cervical, datorită sensibilităţii,
criteriilor de validare şi obiectivităţii cu care se fac interpretările;
• identificarea tipului de HPV oferă posibilitatea evaluării displaziei
cervicale post conizaţie;
• prevalenţa genotipurilor HPV 16 şi HPV 18 în rândul pacientelor
testate a fost de 9.91 %, respectiv 3.11, ceea ce justifică necesitatea
vaccinării anti – HPV în zona noastră, mai ales pentru HPV16;
• studiul de faţă permite selectarea pacientelor HPV 16 şi HPV 18
pozitive, care vor fi urmărite în dinamică, prin tehnica Real Time
PCR, în vederea stabilirii “valorii prag” a încărcăturii virale, cât
mai precoce, ideal, anterior evoluţiei către neoplazia cervicală, în
vederea instituirii terapiei chirurgicale;
• deoarece genotiparea HPV permite evaluarea fenomenului de
persistenţă a infecţiilor cu HR HPV, se impune, pe viitor, repetarea
testării la 6, respectiv 12 luni, pentru a departaja obiectiv, infecţiile
tranzitorii, de cele permanente;

9. Corelaţii ale încărcăturii virale a HPV16 și HPV 18 cu gradul


displaziei cervicale și cu factorii de risc ai neoplaziei cervicale

Material şi metodă:
Am cuantificat prin Real Time PCR probele ADN HPV detectate
pozitive pentru HPV 16 (34 paciente) şi HPV 18 (8 paciente) prin tehnica
de genotipare Linear Array HPV Genotyping Test.
Determinarea încărcăturii virale a fost realizată cu ajutorul kiturilor
Precision 2X qPCR mastermix, Path-HPV16 Real-time PCR detection of
Human Papillomavirus 16 Advanced kit şi Path-HPV18 Real-time PCR
detection of Human Papillomavirus 18 Advanced kit. Amplificarea în timp
real a utilizat termocyclerul MX 3005P, Stratagene.
Determinările prin Real Time PCR au fost realizate în 4 sesiuni de
lucru.

28
A. Setarea godeurilor: standarde in dublu, controale, probe paciente

Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III Sesiunea IV

Fig. 14: Imaginea plăcuțelor RT PCR setate

B. Profilul termic al experimentului a presupus 1 ciclu de 10’ la 95° C şi


50 de cicluri formate din două segmente: primul segment a presupus 15 sec
la 95 ° C şi al doilea 1 min la 60 ° C.

Fig. 15: Profilul termic al experimentului

29
C. “RUN”: odată setate godeurile şi profilul termic, s-a selectat opţiunea
“RUN” a soft-ului Stratagene. Întregul experiment a avut o durată de 72,5
minute.

D. Evaluarea rezultatelor s-a putut realiza şi în timpul amplificării PCR,


“în timp real”, iar în lucrarea de faţă am redat doar rezultatele finale ale
experimentului.

Evaluarea calităţii unei determinări prin Real Time PCR trebuie să urmeze
paşii următori de analiză preliminară:
- examinarea curbelor de amplificare;
- verificarea / ajustarea liniei de background;
- verificarea / ajustarea “threshold’;
- verificarea controalelor (negative, pozitive);
- verificarea probelor testate;
- analiza specifică a experimentului.

Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III Sesiunea IV


Fig. 16: Curbele de amplificare

30
Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III Sesiunea IV


Fig. 17: Verificarea controalelor

Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III Sesiunea IV

Sesiunea IV

Sesiunea IV Sesiunea IV
Fig. 18: Curbele standard ale celor 4 sesiuni

31
Sesiunea I Sesiunea II

Sesiunea III Sesiunea IV

Fig. 19: Numărul de cópii virale detectate

Analiza spectrofotometrică a acizilor nucleici, proteinelor și a


culturilor celulare face parte din rutina zilnică a unui laborator modern.
NanoPhotometrulTM universal combină masurătorile probelor, începând de
la 0,7 µl până la volumele standard ale probelor – 3500 µl. Măsurătorile
probelor în volume mai mici de 1 µl sunt realizate fără a fi necesare
prezența cuvetelor, cu ajutorul celulei integrate LabelGuardTM Microliter.
Etapele de măsurare a ADN-ului purificat cu ajutorul nanodropului
NanoPhotometerTM Pearl sunt:
- pipetarea probei de ADN în centrul ferestrei de măsurare;
- atașarea capacului;
- curățarea ferestrei de măsurare cu un șervețel fără praf;
- îndepărtarea surplusului de probă din oglinda capacului cu un
șervețel.
Proba de măsurat este pipetată direct pe fereastra de măsurare.
Închiderea capacului favorizează formarea unei picături de lichid la
o grosime a stratului optic exact definită (fig. 24). Tehnologia de compresie
a probei ADN elimină riscul evaporării probei și de asemenea evită
costurile unor calibrări repetate.

32
Fig. 20: Utilizarea nanodropului în laboratorul de biologie moleculară

Sesiunea a IV-a de RT PCR a beneficiat de avantajele utilizării


nanodropului NanoPhotometerTM Pearl (achiziționat în cadrul grantului
ID_1642). În tabelul V s-a facut corespondența între numărul de cópii
virale detectate prin RT PCR, numărul CT-urilor și valoarea ADN
cuantificată prin nanodrop.

Tabel IV: Asociere valoarea ADN cuantificată prin nanodrop ,


număr copii virale și valoarea CT-urilor
Nr. Cuantificare Număr cópii Valoarea Ct
Probă testată ADN detectate în corespunzătoare
nanodrop proba inițială fiecărei probe
(µg/ml)
1 3,493 No Ct No Ct
2 12,5 1,593 x 103 29,73
3 3,493 No Ct No Ct
4 24,5 No Ct No Ct
5 18,5 4, 072 x 102 31,66
6 31,4 7, 915 x 105 20,97
7 18 3, 341 x 105 22,19
8 26,9 3, 722 x 10 35,04
9 15,5 1,321 x 103 30,00
10 9,481 No Ct No Ct

33
Cu ajutorul programului SPSS versiunea 16.0 am analizat statistic,
descriptiv, prin crostabulare, relațiile dintre încărcăturile virale și
diagnosticul citologic. Așa cum se poate vedea în figura 22, cele mai mari
încărcături virale (105 și 106 cópii ADN / HPV 16, respectiv) au fost
detectate în 40% din cazurile de LGSIL și în 60% în cazurile cu HGSIL.
Totusi, am detectat o încărcare virală de 105 cópii și în cazul unei paciente
cu citologie normală, și în cazul uneia cu celule atipice, ceea ce sugerează
că încărcătura virală nu poate fi un marker eficient de detecție a femeilor cu
risc crescut de evoluție către neoplazia cervicală.
De asemenea, am evaluat relația dintre încărcăturile virale și
factorii de risc (fumat, contraceptive orale, grupul de vârstă, tipul infecției
HPV unică versus multiplă).
Cele mai mari valori ale încărcăturilor virale ale ADN/HPV 16 au
fost detectate la grupurile de vârstă 20 – 30 și 40 – 50 ani. De asemenea,
cópii virale de ordinul a 106 au fost identificate și la paciente cu vârsta
cuprinsă între 50 – 60 ani.
Pentru lotul nostru studiat, fumatul nu a fost un factor de risc care
să fie corelat cu valori ridicate ale cópiilor virale de ADN/HPV 16. Cele
mai ridicate valori ale cópiilor virale au fost detectate în lotul nostru pentru
pacientele care au declarat că nu au utilizat contraceptive orale. Cele mai
ridicate valori ale cópiilor virale de HPV 16 au fost detectate în cazul
infecțiilor unice cu HPV 16, rezultat comparabil cu cele găsite și de alți
autori.

Fig. 21: Corelații între încărcăturile virale ale ADN/HPV 16 și rezultatele


examenului citologic

34
Grupa de vârsta Fumat

Tipul infecției HPV


Contraceptive
Fig. 22: Corelații între numărul de cópii virale și factorii de risc ai neoplaziei
cervicale

Concluzii:

· Diversitatea valorilor încărcăturii virale detectate in raport cu gradul


displaziei cervicale (am detectat încărcături virale mari, de 105 – 106
cópii virale, atât in situaţiile în care pacientele aveau HSIL, cum era de
aşteptat, dar şi in cazurile cu LSIL, ASCUS si chiar cu citologie
normala), a făcut imposibilă stabilirea unei valori limită, care să indice
intervenţia chirurgicală terapeutică.
· Pentru 7 dintre pacientele testate am realizat monitorizarea lor, la 6, 12
si 18 luni, prin genotipare şi prin cuantificarea ADN HPV 16 &18 prin
Real Time PCR.
· Lipsa de aderenţă a pacientelor la monitorizarea la care au fost invitate
să participe, conform formularului de consimţământ informat, se poate
explica prin neînţelegerea necesităţii urmăririi pacientelor în vederea
precizării evoluţiei bolii.
· Se impune informarea populaţiei cu privire la relaţia dintre infecţiile
determinate de HPV şi cancerul cervical ca şi la utilitatea participării la
programele de monitorizare.

35
10. Testarea ADN/HPV post-intervenție chirurgicală excisională

Strategiile terapeutice în cazul bolii bolii confirmate colposcopic


pot fi distructive sau excizionale. Nu există nici un avantaj demonstrat
pentru nici una din tehnicile chirurgicale conservatoare pentru tratarea și
eradicarea neoplaziei cervicale intraepiteliale. Superioritatea chirurgiei
excizionale este dată însă de rata de succes a terapiei. Terapiile excisionale
sunt preferate în majoritatea circumstanțelor, deoarece ele sunt în mod clar
superioare metodelor distructive, având avantajul posibilității evaluării
histologice a zonei de transformare. Examinarea histologică a țesutului
excizat permite anatomopatologului să recunoască sau să elimine existența
unui cancer microinvaziv, a unei boli glandulare sau a implicării marginilor
zonei de transformare (90).
Monitorizarea după terapia CIN utilizând examenul citologic a fost
cea mai frecventă procedură de urmărire, dar eficiența ei a fost discutată
datorită sensibilității scăzute pentru detecția CIN prin această metodă.
Deoarece infecția HPV este esențială pentru dezvoltarea și menținerea CIN,
detecția ADN/HPV poate detecta leziunile CIN reziduale sau recurente mai
rapid și cu o sensibilitate mai ridicată. Unele studii au identificat că
ADN/HPV este de obicei eliminat dupa terapia eficientă a CIN, iar
persistența ADN/HPV este predictivă pentru recurență. Studiile întreprinse
până în prezent au analizat câteva metode diferite de terapie, care au fost
identificate a avea rate de succes diferite în clearance-ul ADN/HPV,
sugerând că testarea ADN/HPV este utilă pentru evaluarea diferitelor
tehnici de terapie (92).
Unul din obiectivele tezei de doctorat a fost evaluarea tipului de
infecție HPV, tranzitorie versus infecţie persistentă, la 6 luni de la
intervenția chirurgicală, evaluată cu un test sensibil de identificare a
ADN/HPV: Linear Array HPV genotyping test. Pentru atingerea acestui
obiectiv, au fost analizate cazurile selectate din rândul pacientelor
genotipate HPV.
21 paciente (22 – 46 ani) au fost testate post intervenție chirurgicală
excizională. Au fost incluse în acest studiu toate pacientele care împreună
cu ginecologul au completat formularul de consimțământ informat pentru
participarea la studiu, precum și formularul de solicitare a genotipării HPV
(fig. 46); în acest formular se cere menționarea motivului solicitării
genotipării HPV (screening, testare post intervenție chirurgicală, suspiciune
macroscopică, control după tratament radio-chirurgical, simptomatologie
sugestivă sau investigațiii preoperatorii).

36
Metoda de lucru și kiturile utilizate au fost aceleași ca cele descrise în
capitolul 4.
Rezultatele acestui studiu pot fi sumarizate astfel:
• anterior intervenției chirurgicale:
– 14,2% (3/21) dintre paciente au fost pozitive pentru HPV
16;
– 4,7% au fost pozitive cu HPV 31 (1/21) și respectiv HPV
53 (1/21);
– o pacientă a prezentat infecție multiplă cu tipurile HPV 31,
51, 54;
• genotiparea post-intervenție terapeutică a identificat trei infecții
persistente:
– două infecții unice (HPV 18 și respectiv HPV 51);
– o infecţie cu tipuri HPV multiple (6, 39);
• 3 paciente negative pentru ADN/HPV post – conizație au prezentat
aceleași rezultate citologice patologice pe toată durata
monitorizării, nefiind influiențate de terapia excisională.
Utilizând tehnica Linear Array HPV Genotyping Test am identificat o
persistență a infecției HPV, atât cu HR cât și cu LR în 14,28% din cazurile
testate.
Din lotul pacientelor testate post – conizatie am selectat 3 cazuri
particulare:
Prezentări de caz: 1
• Pacienta N.L, 30 ani – displazie severă
– examene citologice repetate: HGSIL
– examene colposcopice repetate: sugestive pentru infecția
HPV
• 2 intervenții excizionale
– 2 testări ADN/HPV la 6 luni: ambele negative pentru
oricare din cele 37 genotipuri HPV testate
– ultimul examen citologic: normal
Observație: posibilă afectare a celulelor cervicale produsă de tratamentul
hormonal urmat de pacientă. Acesta este un exemplu de caz care a suferit
multiple intervenții chirurgicale, marcante afectiv pentru pacientă, din
cauza subiectivității testelor citologice și colposcopice.
Prezentări de caz: 2
• N. M., 32 ani
– examen citologic periodic: ASCUS, LGSIL, HGSIL
– test ADN/HPV pozitiv pentru HPV 16, persitent la 6 luni
– conizaţie

37
– retestare prin genotipare la 6 luni: HPV negativ
Observaţie: eficienţa conizaţiei, certificată prin testarea ADN/HPV. Infecție
persistentă tratată eficient prin conizație, confirmată prin testul ADN.
Pacienta este menținută în programul de urmărire.
Prezentări de caz: 3
• D.C., 45 ani
– examen citologic: ASCUS
• testare ADN/HPV prin metoda HC II: negativ
– examen citologic: HGSIL
– genotipare HPV LA: HPV 18
– biopsie la 6 luni: HPV 18
– examen citologic: ASCUS
– genotipare la 6 luni dupa biopsie: HPV 18
– se menține hemoragia intermenstruală
– histerectomie totală (mai 2011): CIN 2
Observaţie: lipsa concordanței între examenle citologice și cele de biologie
moleculară. Examenul citologic nu a fost concordant cu persistența ADN
HPV 18.
Concluzii:
Numărul redus de paciente urmărite post-conizaţie impune
revizuirea consimţământului informat, astfel încât pacientele să înţeleagă
avantajele participării la studii similare, ca modalitate de monitorizare a
reactivării infecţiei persistente, ce impune strategii terapeutice diferite
Există evidențe științifice despre faptul că testarea HPV după
terapie poate prezice eșecul tratamentului cu o sensibilitate semnificativ
mai mare și cu specificitate similară, în comparație cu citologia repetată și
cu statusul histologic al marginilor. Dat fiind acest risc al recurenței
infecției HPV, se impune realizarea unor protocoale de urmărire a
pacientelor, în funcție de statusul ADN/HPV și cel al citologiei. În cazul
pacientelor ADN/HPV pozitive dar cu citologie normală, se impune
repetarea testării ADN/HPV la 5 ani, dar trebuie avut grija la impactul unui
rezultat HPV pozitiv asupra pacientei.
Sunt încă discuții legate de perioada de realizare a unui test HPV
după terapie. Timpul optim de a efectua o testare ADN/HPV a fost analizat
doar în câteva studii: o proporție substanțială de femei a eliminat virusul la
3 luni, dar semnificativă este perioada de 3 – 6 luni post terapie. După 6
luni, eliminarea virusului este rar posibilă (119, 120).
Utilizarea testării HPV post terapie ar trebui explorată pentru
realizarea de noi protocoale pentru monitorizarea după terapia CIN.
Evidențele științifice sugerează de asemenea că urmărirea consecutivă a

38
femeilor negative atât pentru HPV cât și pentru citologie ar trebui să fie mai
puțin intensă. Se recomandă implementarea și monitorizarea cu grijă a
pacientelor, prin diferite protocoale de urmarire. Se impun studii de analiză
a protecției pe termen îndelungat a unui rezultat HPV negativ, precum și
realizarea de ghiduri naționale și europene pentru management și urmarire.
În figura 98 este prezentat un posibil algoritm de urmărire a femeilor după
terapia leziunilor CIN:

Colposcopie Colposcopie
Acceptabilă inaceptabilă (CIN 2, 3 recurenta)

Proceduri de urmarire propuse pentru monitorizarea post terapie

Excizie / ablația Procedura


zonei de transformare diagnostică excisională

Citologie Testare ADN/HPV


Citologie și/sau colposcopie

Negativ ≥ ASC HPV pozitiv HPV


negativ

Screening Colpscopie
Screening
de rutină de rutină

Fig. 23: Algoritm de monitorizare după terapia leziunilor CIN (adaptat după 90)
39
11. Evaluarea riscului de evoluție către neoplazia cervicală în cazul
pacientelor HIV pozitive

HPV ca factor de risc pentru HIV


Numeroase studii au detectat o prevalență și o incidență mai mare,
precum si o persistență a infecției HPV și a displaziilor anogenitale în cazul
femeilor și bărbaților HIV pozitivi, în comparație cu subiecții negativi
pentru HIV.
Studiul HERS (HIV Epidemiology Research Study) a identificat că
aproape toate tipurile HPV se pare că persistă în rândul femeilor HIV
pozitive, în comparație cu cele HIV negative (OR = 2,5). Fenomenul de
persistență a fost de 1,9 ori mai mare, cu nivele CD4 < 200 celule / µl, în
comparație cu femeile cu nivele CD4 > 500 celule / µl (123). Prevalența
infecției HPV crește odată cu scăderea imunității. Astfel, în cazul
pacientelor HIV negative, prevalența HPV a fost de 29,8% și apoi a crescut
după cum urmează: 51,7% pentru cazurile cu CD4 > 200 și cu ARN/HIV <
20.000 copii, 66% pentru cazurile cu CD4 > 200 dar cu ARN/HIV > 20.000
și a crescut apoi la 76% în cazul în care CD4 < 200 celule / µl (124).
Există evidențe consistente despre faptul că displazia cervicală este
mult mai prevalentă în rândul femeilor HIV infectate, în comparație cu
femeile seronegative. 15 – 40% dintre femeile HIV pozitive prezintă
displazie evidentă, acest procentaj fiind de 10 – 11 ori mai mare decât în
cazul femeilor negative (125). Frecvența și severitatea frotiurilor citologice
precum și displaziile confirmate histologic crește odată cu scăderea CD4. În
aceste cazuri, displazia este asociată cu o implicare extensivă la nivelul
cervixului și deseori implică și alte situsuri (vagin, vulvă, regiunea
perianală) (126).
Lot de studiu, metoda, rezultate
În perioada februarie – iunie 2011 am testat ADN/HPV din celule cervicale
recoltate de la paciente cunoscute HIV/AIDS pozitive, monitorizate de o
echipa de medici ginecologi a Spitalul Clinic de Obstetrica si Ginecologie
„Cuza Voda”, Iași.
Lotul testat a inclus 20 de paciente cu media vârstei de 21 de ani
(limite 19 – 30 ani). 10 / 20 (50%) dintre femeile testate au fost detectate
pozitive pentru HPV, dintre care doar 3 au fost infecții unice HPV (52, 68
și respectiv 84). 35% (7/20) paciente au prezentat infecții cu multiple tipuri
HPV, fiind detectate între 2 și 7 genotipuri HPV pe strip (fig. 24).

40
infectii multiple
35%

negative
50%

infectii unice
15%

negative infectii unice infectii multiple

Fig. 24: Rezultatele genotipării lotului de paciente HIV pozitive

Infecțiile cu multiple tipuri HPV detectate au fost:


- pacienta C. A.: HPV 51, 52, 55, 68, CP 6108;
- pacienta D.I.: HPV 6, 16, 51, 52, 66, 73, 83;
- pacienta S. E: HPV 6, 16, 73, 82;
- pacienta A. A.: HPV 39, 42, 51, 73;
- pacienta P. C.: HPV 31, CP 6108;
- pacienta B. C.: HPV 6, 11, 52, 58;
- pacienta T. A-M.: HPV 42, 53, 82, CP 6108.
În fig. 27 am redat imaginea câtorva din aceste stripuri cu multiple
benzi albastre care corespund infecțiilor cu multiple tipuri HPV.

Fig. 25: Imaginea unor stripuri cu multiple benzi detectate corespunzătoare


infecțiilor cu multiple tipuri HPV

41
Pentru pacientele care au fost pozitive și pentru HPV 16, am
cuantificat ADN/HPV 16 prin Real Time PCR. Prezentarea principiului RT
PCR și validarea experimentului a fost prezentată în capitolul 3.7. În tabelul
VI am prezentat rezultatele obținute pentru aceste două paciente:
cuantificarea ADN cu ajutorul nanodropului, valorile Ct-urilor și numărul
de cópii virale detectate prin Real Time PCR.

Tabel V: Rezultatele cuantificării ADN/HPV 16 pentru două paciente HIV +

Paciente Rezultat genotipare Valoare Număr Număr cópii


LA ADN citită Ct / RTPCR ADN/HPV
la 16
nanodrop
D.I. HPV 6, 16, 51, 52, 18,5 31,66 4,072 x 102
66, 73, 83
S.E. HPV 39, 42, 51, 73 26,9 35,04 3,722 x 10

Discuții: lotul nostru, deși mic ca dimensiune, prezintă aceleași


caracteristici ca și loturile mari din studiile citate anterior. În primul rând
prevalența ADN/HPV în rândul femeilor HIV pozitive este de 50%, versus
32,1% din lotul nostru prezentat în capitolul 3.4. Dintre infecțiile HPV
detectate în cazul femeilor HIV pozitive, doar 30% au fost infecții unice,
restul fiind infecții cu multiple tipuri HPV. HPV 16 a fost detectat doar în
două din infecțiile mutiple, cele mai frecvente HR HPV detectate în aceste
cazuri fiind 51 (3 paciente), 52 (3 paciente), 73 și CP6108 (câte 2
paciente).Ca și în cazul altor infecții cu multiple tipuri HPV, încărcatura
virală a ADN/HPV 16 a fost mai mică decât în cazul infecțiilor unice.
Concluzii: se impune monitorizarea atentă a acestor paciente, mai frecvent
decît în cazul femeilor HIV negative, chiar dacă media lor de vârstă este de
doar 21 ani, din cauza riscului mai mare de persistență a infecțiilor HPV în
cazul femeilor HIV pozitve. Pentru țara noastră se recomandă de asemenea
protocolul „scren – and – treat” pentru monitorizarea acestor paciente
(135).

12. Infecții asimptomatice cu transmitere sexuală

În legatură cu amploarea şi importanţa infecţiilor


asimptomatice transmise pe cale sexuală, este binecunoscut faptul că cele
mai multe infecţii transmise pe cale sexuală (ITS) sunt simptomatice, dar
nu este definit exact conceptul ITS asimptomatice, si nu se cunoaște
frecvenţa lor sau importanţa infecţiilor asimptomatice în transmiterea ITS.
42
În acest sens se impune alcătuirea unui cadru conceptual pentru
categorizarea ITS în funcţie de simptomatologie, determinarea proporţiei
indivizilor cu infecţie asimptomatică si de asemenea, se impune estimarea
proporţiei transmiterii ITS datorită infecţiilor asimptomatice.
Conceptul poate fi construit pe baza prezenței simptomelor,
indivizii fiind divizaţi în mai multe categorii: indivizi “simptomatici”
(simptomele sunt prezente); indivizi cu infecţie “inaparentă” (individul
prezintă simptome dar nu sunt recunoscute ca fiind produse de o ITS);
persoane “asimptomatice”- această categorie este importantă, deoarece,
numai pacienţii “simptomatici” vor solicita tratament specific. Analizând
studii de transmitere care au evaluat pacienţi simptomatici, pacienţi
asimptomatici sau cu infecţii inaparente, s-a observat că aceştia au un rol
important în transmiterea ITS, iar partenerii sexuali ai indivizilor cu ITS,
simptomatici sau nu, sunt în mod caracteristic asimptomatici.
Atât publicul larg cât şi cadrele medicale trebuie să aprecieze
importanţa naturii asimptomatice a ITS. Mesaje de sănătate publică
concentrate pe simptomele ITS se vor finaliza cu un impact semnificativ
asupra transmiterii acestor infecţii. În acelaşi scop, cadrele medicale trebuie
să intensifice evaluarea riscului pacienţilor, screening-ul acestora pentru
ITS, precum şi acordarea de informaţii corecte.
Este important de discutat potențialul impact al unui test HPV
pozitiv asupra unei femei, precum și mesajul transmis acestei femei, atât ei
cât și partenerului ei în timpul consilierii. Se impune explicarea
semnificației unui test ADN HPV pozitv și se indică literatura adecvată
acestor paciente. Pacientele vor fi sfătuite ce măsuri să ia în legătură cu
partenerul lor și de asemenea, partenerul va trebui informat. Se va verifica
necesitatea unei monitorizări ulterioare psihologice și de asemenea
pacientele vor fi consiliate din punct de vedere sexual.
Viitorul prevenției cancerului cervical presupune utilizarea testării
ADN HPV ca test primar de screening, precum și prevenția secundară într-
o populație complet vaccinată. Principiile unui program de screening
populațional presupun testarea unui grup mare al populației aparent
sanatoase, pentru a detecta semnele precoce ale bolii. Screening-ul este
intenționat a ținti / viza în special acele persoane care vor beneficia cel mai
mult din urma acestui screening, iar scopul unui screening este obținerea
unui beneficiu maxim de sănătate pentru populație. Clinicienii au un rol
important în transferul de informație către paciente, pentru a favoriza
scăderea anxietății pacientelor detectate HPV pozitiv. În cazul detectării
unui test HPV pozitiv este necesară concentrarea pe elementele cheie ale
mesajului pentru a scădea anxietatea pacientelor. Mesajul ar trebui să

43
conțină cunoștinte despre faptul că tipurile HPV sunt heterogene, având
riscuri diferite pentru dezvoltarea cancerului cervical; de asemenea, mesajul
ar trebui să conțină informații despre prevalența crescută a infecției HPV și
de asemenea, ar trebui avută în vedere componenta motivațională a
prevenției cancerului cervical (136).
Monitorizarea și consilierea femeilor HPV pozitive, cu citologie normală
Din lotul pacientelor testate prin genotipare în rândul femeilor care
nu și-au realizat niciodată un test Papanicolau, am detectat 33,3% paciente
ADN/HPV pozitive, iar în cazul femeilor cu un test Papanicolau normal am
identificat 19,2% pozitive. În ambele situații, cazurile ADN HPV pozitive
au presupus infecții cu tipuri HRHPV, LRHPV, pHRHPV, precum și
infectii cu multiple genotipuri HPV. Putem afirma că în cazul femeilor fără
testarea citologică am identificat 33,3% infecții HPV asimptomatice, iar
cazul pacientelor cu Papanicolu normal am identificat 19,2% infecții
asimptomatice și inaparente (fig. 26: 1-fără citologie efectuată, 2-citologie
normală).

90
80
70 HR-HPV
60 pHR-HPV
50
LR-HP V
40
NEGA TIV E MULTIPLE INFE CTIONS
30
NEGA TIV E
20 LR-HP V
10
0 HR-HP V
1
2

Fig. 26: Rezultatele testării ADN/HPV în cazul femeilor fără examen


citologic sau cu rezultat normal al examenului Papanicolau

În momentul în care am comunicat rezultatul testării ADN/HPV în


cazul acestor două categorii de paciente, am identificat situații delicate, de
neacceptare, în momentul inițial, al rezultatului genotipării HPV.
Neacceptarea se datorează faptului ca pacientele erau în momentul testării,
asimptomatice, și nu voiau sa accepte faptul că au fost detectate pozitive
pentru un virus care poate produce cancer.
Având în vedere ritmul rapid al inovaţiei în prevenirea și controlul
cancerului de col uterin, au fost realizate puține eforturi concentrate pentru
diseminarea informației către publicul larg, într-un mod adecvat și
semnificativ. Cele mai multe femei au aflat de HPV în momentul primirii
unui rezultat anormal pentru frotiul Papanicolau. Puține persoane înteleg
legatura dintre HPV și cancerul cervical. Infecția HPV este o infecție
44
transmisă pe cale sexuală foarte frecventă, care însă rareori evoluează către
cancer.
Se impun eforturi pentru optimizarea programelor educaționale de
sănătate publică, care să presupună informarea pacientelor care urmează să
fie monitorizate, informarea pacientelor pentru înțelegerea relației dintre un
test citologic anormal și un test ADN HPV pozitiv și cum plasează aceste
rezultate o pacientă la risc pentru cancerul cervical. Este importantă
facilitatea luării unei decizii importante de către pacienta cu privire la
status-ul infecției HPV (62).
Literatura de specialitate sugerează că detecția unui HR HPV la o
femeie este un indicator important pentru evoluția către CIN 2 sau chiar
grade mai avansate ale displaziei cervicale. În rândul femeilor cu vârsta
peste 30 ani, cu citologie negativă, CIN 3 a fost identificat pe parcursul a
10 ani de monitorizare în 21% din cazurile HPV 16 pozitive și în 18% în
cazul pacientelor HPV 18 pozitive. În cazul femeilor pozitive pentru alte
HR HPV, riscul pentru CIN 3 a fost doar de 1,5% (62).
Probe recoltate de la femei HPV pozitive dar cu citologie negativă
trebuie testate prin genotipare HPV, iar femeile detectate pozitive pentru
genotipuri specifice HR HPV, cum ar fi HPV 16 și 18 trebuie evaluate și
colposcopic. Femeile pozitive pentru alte HR HPV trebuie retestate la 12
luni prin citologie și prin testare ADN HPV. Acest algoritm de urmărire va
permite femeilor cu risc de a avea un rezultat fals negativ citologic să fie
evaluate colposcopic (63).
Multe femei testate în screening-uri populaționale care au fost
detectate HPV pozitive au avut un rezultat citologic negativ. Într-un studiu
care a înrolat mai mult de 213.000 femei cu vârsta de 30 ani, prevalența
HPV a fost de 6,5% și doar 58% dintre femei au avut un rezultat
concordant între rezultatul testării HPV și rezultatul evaluării citologice
(136). Femeile HPV pozitive necesită consilierea cu privire la riscul de
evoluție către CIN 2, cu privire la sursa infecției și la gradul lor de
infectivitate. Riscul de a avea o leziune CIN 2 nedetectată în cazul femeilor
HPV pozitve cu citologie negativă a fost detectat a fi între 2,4 – 5,1% (137
– 142). Este important de menționat că în cazul femeilor cu vârsta peste 30
ani, majoritatea femeilor HPV pozitive devin HPV negative după
monitorizare. Un studiu din Franța a detectat, după o perioadă de 6 luni de
urmărire, că 60% din pacientele monitorizate au devenit negative (143).
Pe baza acestor considerente, cel mai adecvat management al
acestor paciente este monitorizarea prin citologie și testarea ADN HPV la
12 luni. Pacientele care la testări repetate sunt în mod persistent HPV

45
pozitive, ar trebui evaluate colposcopic, în timp ce femeile care devin
negative la ambele teste ar trebui retestate după 3 ani (algoritm fig. 27)
(62).

Citologie negativă

HPV (-) HPV (+)

Screening de rutină Repetarea ambelor teste la 12 luni


(nu mai devreme de 3 ani)

Ambele negative Citologie (-), HPV (+) Citologie


anormală, HPV (+)

Screening de rutină Colposcopie Management conform


(3 ani) ghid ASCCP

Fig. 27: Utilizarea testelor ADN HPV în screening-ul cancerului cervical pentru
femeile cu vârsta peste 30 ani, cu citologie negativă (adaptat după 62)

13. Concluzii generale

România se situează pe primul loc în Europa în ceea ce privește


incidența (23,9/100,000) și mortalitatea (11.6/100,000) prin cancerul de col
uterin. În pofida acestor date, rapoartele OMS menționează că nu sunt date
disponibile pentru țara noastră referitor la prevalența genotipurilor HPV în
rândul femeilor cu diferite diagnostice citologice.
Introducerea testării prin RT PCR a infecţiilor simptomatice şi
asimptomatice, induse de HPV, reprezintă pentru zona noastră o noutate,
deoarece este primul studiu care abordează la nivel molecular, relaţia dintre

46
aceste infecţii şi cancerul cervical, utilizând infrastructura Laboratorului de
Microbiologie din cadrul Facultăţii de Medicină a UMF „Gr. T. Popa” Iaşi. Au
fost optimizate metodele de biologie moleculară ce au fost utilizate în
realizarea obiectivelor știintifice ale tezei (metoda de detecție a 37 genotipuri
HPV prin tehnica Linear Array HPV Genotyping Test si tehnicia Real Time
PCR pentru cuantificarea HPV 16 și a HPV 18).
Pe parcusul celor 3 ani destinaţi cercetării ştiinţifice în cadrul
doctoranturii, am realizat genotiparea probelor pentru un lot reprezentativ de
paciente (353), iar rezultatele privind prevalența genotipurilor cu risc înalt
oncogen detectate (9,91% pentru HPV 16 și 3,11% HPV 18), susțin
introducerea vaccinării anti HPV în zona noastră. Genotiparea prin tehnica
Linear Array HPV Genotyping test a fost validată prin participarea la un panel
internațional de testare a proficienței, organizat de către OMS.
Pacientele pozitive pentru HPV 16 și 18 au fost testate prin tehnica
Real Time PCR, în vederea stabilirii unei valori prag a încărcăturii virale, utile
pentru identificarea precoce a riscului de evoluție către cancerul cervical.
Diversitatea valorilor încărcăturii virale detectate în raport cu gradul displaziei
cervicale (mai exact, am detectat încărcături virale mari, de 105 – 106 cópii
virale, atât în situațiile în care pacientele aveau HSIL, cum era de așteptat, dar
și în cazurile cu LSIL, ASCUS și chiar cu citologie normală), a facut
imposibilă stabilirea unei valori limită, care să indice intervenţia chirurgicală
terapeutică. Cuantificarea prin RT PCR este utilă în cazul în care se poate
realiza testarea în dinamică a încărcăturii virale, pentru a evalua istoria
naturală a infecției cu genotipurile înalt oncogene.
Pentru şapte dintre pacientele testate am realizat monitorizarea lor la
6, 12 și18 luni, prin genotipare și prin cuantificarea ADN HPV 16 și 18 prin
Real Time PCR. Lipsa de aderență a pacientelor la monitorizarea la care au
fost invitate să participe, conform formularului de consimțământ informat, se
poate explica prin neînțelegerea necesității urmăririi pacientelor în vederea
precizării evoluției bolii. Se impune educarea populației cu privire la
conexiunea dintre HPV și cancerul cervical și la utilitatea participării la
programele de monitorizare.
Necesitatea monitorizării prin testarea ADN HPV se impune și în
cazul pacientelor tratate excizional, pentru displazii cervicale de grad înalt. Am
evaluat prin testarea ADN HPV, 21 paciente, la 6 luni după intervenția
chirurgicală și am detectat o persisteță a infecţiei HPV, atât cu HR cât şi cu LR
în 14,28% din cazurile testate (două infecții unice: HPV 18 și respectiv HPV
51, și o infecţie cu tipuri HPV multiple - 6, 39). Se impune revizuirea
consimţământului informat, astfel încât pacientele să înţeleagă avantajele
participării la astfel de studii, ca modalitate de monitorizare a reactivării

47
infecţiei persistente, ce impune strategii terapeutice diferite. În unele ţări,
colposcopia, cu o sensibilitate ce variază în limite foarte largi (24 – 96 %) este
o tehnică abandonată, în favoarea tehnicilor de biologie moleculară. Testarea
pentru genotipurile HPV înalt oncogene, după terapia excizională, este cea mai
sensibilă metodă (96%) pentru stabilirea leziunilor CIN reziduale sau
recurente.
O altă categorie de femei care necesită monitorizare prin testare ADN
HPV o reprezintă femeile cu vârsta peste 30 ani, asimptomatice, ADN HPV
pozitive dar cu citologie negativă. În cazul femeilor cu Papanicolu normal am
identificat 19,2% infecţii HPV asimptomatice (4 paciente pozitive pentru HPV
16 și alte 4 paciente din această categorie, pozitive cu HPV 18). Categoria
persoanelor “asimptomatice” este importantă, deoarece, numai pacienţii
“simptomatici” vor solicita tratament specific. Ghidurile europene recomandă
monitorizarea atentă a acestor paciente prin testarea ADN HPV.
În contextul transmiterii simultane a mai multor agenţi infecţioşi, o
atenție particulară trebuie acordata pacientelor HIV – HR HPV pozitive. Am
testat 20 de paciente HIV pozitive, cu media vârstei de 21 de ani: 50% au fost
pozitive pentru HPV, dintre care 70% au prezentat infecţii cu tipuri HPV
multiple, fiind detectate concomitent între 2 şi 7 genotipuri HPV. Prevalența
ADN/HPV în rândul femeilor HIV pozitive a fost de 50%, versus 32,1%. HPV
16 a fost detectat doar în două dintre infecțiile multiple, cele mai frecvente HR
HPV detectate în aceste cazuri fiind 51 (3 paciente), 52 (3 paciente), 73 și
CP6108 (câte 2 paciente). Ca şi în cazul altor infecții cu tipuri HPV multiple,
încărcătura virală a ADN/HPV 16 a fost mai mică decât în cazul infecțiilor
unice. Se impune monitorizarea atentă a acestor paciente, mai frecvent decât în
cazul femeilor HIV negative, chiar dacă media lor de vârstă este de doar 21
ani, deoarece prevalența infecției HPV creşte odată cu scăderea imunității, iar
cancerul cervical în rândul femeilor HIV pozitive nu pare să fi scăzut în era
HAART.
Cele mai multe infecţii transmise pe cale sexuală (ITS) sunt
simptomatice, dar nu se cunoaște frecvenţa lor sau importanţa infecţiilor
asimptomatice în transmiterea ITS.
Din lotul pacientelor testate prin genotipare în rândul femeilor care nu
și-au realizat niciodată un test Papanicolau, am detectat 33,3% paciente
ADN/HPV pozitive, iar în cazul femeilor cu un test Papanicolau normal am
identificat 19,2% pozitive. În ambele situații, cazurile ADN HPV pozitive au
presupus infecții cu tipuri HRHPV, LRHPV, pHRHPV, precum și infectii cu
multiple genotipuri HPV. Putem afirma că în cazul femeilor fără testarea
citologică am identificat 33,3% infecții HPV asimptomatice, iar cazul

48
pacientelor cu Papanicolu normal am identificat 19,2% infecții asimptomatice
și inaparente.
Până în prezent țările dezvoltate au ajuns la stadiul în care se
preconizează posibilitatea eradicării cancerului cervical (teoretic sunt
îndeplinite toate condițiile eradicării unei infecții HPV) şi ar fi de dorit ca și în
țara noastră să se realizeze un screening organizat pentru detectarea cancerului
cervical în stadii incipiente, prin introducerea la nivel național a genotipării
HPV. Vaccinarea anti HPV, în asociere cu testarea ADN HPV, ar putea
conduce la scăderea incidenței și mortalității cancerului cervical pentru țara
noastră.
Studiul de faţă a fost posibil prin utilizarea fondurilor aferente
proiectului de cercetare câştigat prin competiţie naţională: „Tehnica Real Time
PCR ca instrument practic în diagnosticul şi monitorizarea infecţiilor HPV”,
grant CNCSIS, IDEI_1642.

14. Originalitatea contribuţiilor proprii

Ø Introducerea pentru prima dată a două metode de biologie


moleculară (PCR clasic urmat de hibridizare și Real Time PCR) în
activitatea de rutină a Laboratorul de Virusologie, din cadrul
Disciplinei de Studiu Microbiologie, a Facultăţii de Medicină, ca
etapă preliminară iniţierii studiului infecţiei HPV şi a relaţiei
acesteia cu cancerul de col.
Ø Evaluarea prevalenței genotipurilor HPVcirculante în zona de
Nord a Moldovei pe un lot reprezentativ, cu obținerea unor
rezultate care susțin implementarea vaccinării anti HPV în zona
noastră.
Ø Obținerea proficienței pentru genotiparea HPV din partea experţilor
OMS, prin participarea la un panel, la nivel mondial.
Ø Evaluarea încărcăturii virale pentru ADN HPV 16 si 18, evaluată
prin RT PCR, în raport cu gradul displaziei cervicale;
Ø Studiul a fost axat şi pe atingerea altor obiective ale tezei de
doctorat, cum au fost testarea ADN/HPV post intervenție
excizională și evaluarea riscului de evoluție către neoplazia
cervicală pentru pacientele HIV – HPV pozitive;
Ø Diagnosticul infecţiei HPV, inclusiv pentru pacientele încadrate ca
HR HPV, urmat de terapia adecvată stadiului, cu scopul reducerii
riscului de evoluţie nefavorabilă.

49
15. Perspectivele pe care le deschide teza

Ø realizarea screening-ul cancerului cervical prin determinarea:


· markerilor corelaţi cu prezenţa virusului:
§ ADN /HPV;
§ HPV E6/E7 mARN / Real Time PCR;
§ genotiparea HPV.
· markerilor leziunilor cervicale:
§ p16INK4a CINTEC;
§ markerii de metilare (CADM1) / Real Time PCR;
Ø tranziţia de la cercetare, la implementarea ca diagnostic de rutină a
genotipării HPV;
Ø diagnosticul infecțiilor asiptomatice cu ajutorul tehnicii Real Time
PCR, pentru a surprinde boala cervicală în stadii incipiente, în
vederea unei intervenţii terapeutice eficiente.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA:

1. Pagliusi S, Aguado MT. Efficacy and other milestones for human papillomavirus vaccine introduction, Vaccine
2004 23(5):569-578.
2. WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer (HPV Information Centre). Human Papillomavirus
and Related Cancers in World. Summary Report 2009.
3. F. Xavier Bosch, Global Burden & Epidemiology of HPV & associated diseases, HPV Today, July 2010.
4. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C and Parkin DM.
GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10
Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010. Available from: http://globocan.iarc.fr
5. Doorbar J., The natural history of papillomavirus disease; from silent and productive infections to neoplasia and
latency, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops.
6. Harald zur Hausen et al, Classification of papillomaviruses, Virology 324 (2004) 17– 27
7. Margaret Stanley, Mechanisms of HPV infection and immunity - A state of the Art ,
HPV Immunity online WEBMINAR, Elselvier, 16 / 06 / 2010.
8. Mark Schiffman, HPV: Natural History of the infection from the epidemiologic and clinical perspective, The
26th International Papillomavirus Conference and Workshops.
9. Mark Schiffman et al. Classification of weakly carcinogenic human papillomavirus types: addressing the limits
of epidemiology at the borderline, Infectious Agents and Cancer 2009 4:8 doi:10.1186/1750-9378-4-8
10. Anna Barbara Moscicki, Natural history of infection in younger women: implication for screening, follow-up
and treatment, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops.
11. Margaret Stanley, How do HPV vaccines protect? , The 26th International Papillomavirus Conference and
Workshops.
12. Anthony B. Miller, Cervical cancer screening: the principles and evaluation parameters of the programme, The
26th International Papillomavirus Conference and Workshops.
13. Chris J.L.M. Meijer, Biological markers in cervical cancer screening, The 26th International Papillomavirus
Conference and Workshops.
14. Jack Cuyick, Rational transition from research studies to implementation in programmes, The 26th International
Papillomavirus Conference and Workshops.
15. Jack Cuyick et al., Overview of the European and North American studies on HPV testing in primary cervical
cancer screening Int. J. Cancer: 119, 1095–1101 (2006).
16. *** Linear Array HPV Genotyping Test, Roche Diagnostic handbook.
17. *** High Pure PCR Template Preparation Kit for genomic DNA (ROCHE Diagnostics) handbook
18. S Brismar-Wendel, M Froberg, A Hjerpe, S Andersson, B Johansson, Age-specific prevalence of HPV
genotypes in cervical cytology samples with equivocal or low-grade lesions, British Journal of Cancer (2009), 1
–7.

50
19. J. Jamison, R. T. Wilson and J. Carson , The evaluation of human papillomavirus genotyping in cervical liquid-
based cytology specimens; using the Roche Linear Array HPV genotyping assay, Cytopathology 2009, 20, 242–
248.
20. Christoph Koidl, MD; Michael Bozic; Ita Hadzisejdic, Comparison of molecular assays for detection and
typing of human papillomavirus, Am J Obstet Gynecol, 2008;199:144.e1-144.e6.
21. Philip E. Castle, Carolina Porras, Wim G. Quint , Comparison of Two PCR-Based Human Papillomavirus
Genotyping Methods, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Oct. 2008, p. 3437–3445.
22. J. Jeronimo, N. Wentzensen, R. Long, M. Schiffman, Evaluation of Linear Array Human Papillomavirus
Genotyping Using Automatic Optical Imaging Software, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug.
2008, p. 2759–2765.
23. Matthew P. Stevens, Suzanne M. Garland, Jeffrey H. Tan, HPV Genotype Prevalence in Women With
Abnormal Pap Smears in Melbourne, Australia, J. Med.Virol.81:1283–1291,2009.
24. Marinko Dobec, Fridolin Bannwart, Franz Kaeppeli, Pascal Cassinotti, Automation of the linear array HPV
genotyping test and its application for routine typing of human papillomaviruses in cervical specimens of
women without cytological abnormalities in Switzerland, Journal of Clinical Virology 45 (2009) 23–27.
25. Muñoz N, Bosch FX, de Sanjosé S, Herrero R, Epidemiologic classification of human papillomavirus types
associated with cervical cancer, N. Engl. J Med., 2003, Feb 6; 348 (6); 518 – 27.
26. *** Introduction to Quantitative PCR, Stratagene, Methods and Application Guide;
27. Tevfik Dorak M., (editor) Real – Time PCR, BIOS Advanced Methods;
28. *** qPCR course - Freising, Germany, TATAA BIOEPS COURSE;
29. *** PrecisionTM 2X qPCR Mastermix handbook, Primer Design LTD, handbook.
30. *** Quantification of Human Papilloma Virus 16 (HPV 16) genomes, Primer Design handbook;
31. *** Quantification of Human Papilloma Virus 18 (HPV 16) genomes, Primer Design handbook;
32. *** Mx300XP_Demo_mature, Azra Dedic Biomedica Medizinprodukte GmbH.
33. WHO & IARC, IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenetic Risks to Humans, Human
Papillomaviruses, volume 90, Lyon, France, 2007.
34. van Duin, Snijders PJ, Meijer CJ, Human Papillomavirus 16 load in normal and abnormal cervical scrapes; an
indicator of CIN II/III and viral celearance, Int J Cancer, 2002, Apr 1; 98 (4); 590 – 5.
35. Peter J.F. Snijders, Albertus T. Hesselink, Chris J.L.M. Meijer, Determination of viral load thresholds in
cervical scrapings to rule out CIN 3 in HPV 16, 18, 31 and 33-positive women with normal cytology, Int. J.
Cancer: 119, 1102–1107 (2006).
36. Albertus T. Hesselink, Chris J.L.M. Meijer, Peter J.F. Snijders1, High-risk human papillomavirus DNA load in
a population-based cervical screening cohort in relation to the detection of high-grade cervical intraepithelial
neoplasia and cervical cancer, Int. J. Cancer: 124, 381–386 (2009).
37. Inger Gustavssona, Ivana Juko-Pecirepa, Ingrid Backlund, Comparison between the Hybrid Capture 2 and the
hpVIR real-time PCR for detection of human papillomavirus in women with ASCUS or low grade dysplasia,
Journal of Clinical Virology 45 (2009) 85–89.
38. Karin Biedermann, Nadia Dandachi, Maria Trattner, Comparison of Real-Time PCR Signal-Amplified In Situ
Hybridization and Conventional PCR for Detection and Quantification of Human Papillomavirus in Archival
Cervical Cancer Tissue, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2004, p. 3758–3765.
39. Ming Guo, Nour Sneige, Elvio G Silva, Distribution and viral load of eight oncogenic types of human
papillomavirus (HPV) and HPV 16 integration status in cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma,
Modern Pathology (2007) 20, 256–266.
40. Long Fu Xi, Nancy B. Kiviat, Denise A. Galloway, Effect of Cervical Cytologic Status on the Association
between Human Papillomavirus Type 16 DNA Load and the Risk of Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade 3,
The Journal of Infectious Diseases 2008; 198:324 –31.
41. Nelba Tábora, Annabelle Ferrera, Judith M. J. E. Bakkers, High HPV 16 Viral Load is Associated with
Increased Cervical Dysplasia in Honduran Women, Am. J. Trop. Med. Hyg., 78(5), 2008, pp. 843–846.
42. Jean-Luc Prétet, Véronique Dalstein, Sylvain Monnier-Benoit, High risk HPV load estimated by Hybrid
Capture II® correlates with HPV16 load measured by real-time PCR in cervical smears of HPV16-infected
women, Journal of Clinical Virology 31 (2004) 140–147.
43. Elisa Leo, Simona Venturoli , Monica Cricca, High-throughput two-step LNA real time PCR assay for the
quantitative detection and genotyping of HPV prognostic-risk groups, Journal of Clinical Virology 45 (2009)
304–310.
44. Tibor Takacs, Csaba Jeney, Laura Kovacs, Molecular beacon-based real-time PCR method for detection of 15
high-risk and 5 low-risk HPV types, Journal of Virological Methods 149 (2008) 153–162.
45. Roger A. Hubbard, Human Papillomavirus Testing Methods, Arch Pathol Lab Med—Vol 127, August 2003.
46. Francois Coutlée,, Helen Trottier, Simon Gagnon, Low-risk human papillomavirus type 6 DNA load and
integration in cervical samples from women with squamous intraepithelial lesions, Journal of Clinical Virology
45 (2009) 96–99.
47. Roberto Flores-Munguia, Erin Siegel, Walter T. Klimecki, and Anna R. Giuliano, Performance Assessment of
Eight High-Throughput PCR Assays for Viral Load Quantitation of Oncogenic HPV Types, Journal of
Molecular Diagnostics, Vol. 6, No. 2, May 2004.

51
48. Francesco Broccolo, Stefania Chiari, Andrea Piana, Prevalence and Viral Load of Oncogenic Human
Papillomavirus Types Associated With Cervical Carcinoma in a Population of North Italy, Journal of Medical
Virology 81:278–287 (2009).
49. Martina Schmitza, Cornelia Scheungraber, Jörg Herrmann, Quantitative multiplex PCR assay for the detection
of the seven clinically most relevant high-risk HPV types, Journal of Clinical Virology 44 (2009) 302–307.
50. Merja P. Ruutu, Satu-Maria Kulmala, Panu Peitsaro, The performance of the HPV16 real-time PCR integration
assay, Clinical Biochemistry 41 (2008) 423–428
51. Christopher Payan, Alexandra Ducancelle, Mohamed H. Aboubaker, Human Papillomavirus Quantification in
Urine and Cervical Samples by Using the Mx4000 and LightCycler General Real-Time PCR Systems,
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Mar. 2007, p. 897–901.
52. Ramona Gabriela Ursu, Luminiţa Smaranda Iancu, HR-HPV viral load, p16INK4a: predictive of persistence
infection, 25th International Papillomavirus Conference. Malmo, May, 2009.
53. Carina Eklund, Keng-Ling Wallin, Ola Forslund, Joakim Dillner, WHO HPV LabNet Report on HPV DNA
Proficiency Panel, 2010
54. De Sanjose et al. Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in
women with normal cytology: a meta-analysis. Lancet Infect Dis 2001 7(7): 453 – 459.
55. K S Cuschieri et al., Multiple high risk HPV infections are common in cervical neoplasia and young women in
a cervical screening population, J Clin Pathol 2004;57:68–72
56. Silvia Franceschi, Oral contraceptives and cervical cancer, HPVToday, 17.
57. Stuart Collinsa et al., Cigarette smoking is an independent risk factor for cervical intraepithelial neoplasia in
young women: A longitudinal study, Eur J Cancer. 2010 January ; 46(2): 405–411.
58. Ann Nielsen Acquisition of high-risk human papillomavirus infection in a population-based cohort of Danish
women, Sex Transm Dis. 2009 October ; 36(10): 609–615
59. Giancarlo Ripabelli et al., Prevalence and genotype identification of human papillomavirus in women
undergoing voluntary cervical cancer screening in Molise, Central Italy, Cancer Epidemiology 34 (2010) 162–
167
60. Ameli Trope et al., Performance of Human Papillomavirus DNA and mRNA Testing Strategies for Women
with and without Cervical Neoplasia, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2009, p. 2458–2464
61. *** NanoPhotometerTM Pearl hand book
62. Carcopino X, Henry M, Benmoura D, Fallabregues AS, Richet H, Boubli L, Tamalet C., Determination of HPV
type 16 and 18 viral load in cervical smears of women referred to colposcopy., J Med Virol. 2006
Aug;78(8):1131-40.
63. Snijders PJ, Hogewoning CJ, Hesselink AT, Berkhof J, Voorhorst FJ, Bleeker MC, Meijer CJ., Determination
of viral load thresholds in cervical scrapings to rule out CIN 3 in HPV 16, 18, 31 and 33-positive women with
normal cytology., Int J Cancer. 2006 Sep 1;119(5):1102-7
64. Yoshida T, Sano T, Kanuma T, Owada N, Sakurai S, Fukuda T, Nakajima T., Quantitative real-time polymerase
chain reaction analysis of the type distribution, viral load, and physical status of human papillomavirus in
liquid-based cytology samples from cervical lesions., Int J Gynecol Cancer. 2008 Jan-Feb;18(1):121-7.
65. Syrjänen K, Kulmala SM, Shabalova I, Petrovichev N, Kozachenko V, Zakharova T, Pajanidi J, Podistov
J, Chemeris G, Sozaeva L, Lipova E, Tsidaeva I, Ivanchenko O,Pshepurko A, Zakharenko S, Nerovjna
R, Kljukina L, Erokhina O, Branovskaja M, Nikitina M, Grunjberga V, Grunjberg A, Juschenko A, Santopietro
R, Cintorino M, Tosi P, Syrjänen S., Epidemiological, clinical and viral determinants of the increased
prevalence of high-risk human papillomavirus (HPV) infections in elderly women., Eur J Gynaecol
Oncol. 2008;29(2):114-22.
66. Hesselink AT, Berkhof J, Heideman DA, Bulkmans NW, van Tellingen JE, Meijer CJ, Snijders PJ., High-risk
human papillomavirus DNA load in a population-based cervical screening cohort in relation to the detection of
high-grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer., Int J Cancer. 2009 Jan 15;124(2):381-6.
67. Broccolo F, Chiari S, Piana A, Castiglia P, Dell'Anna T, Garcia-Parra R, Maneo A, Villa A, Leone EB, Perego
P, Maida A, Mangioni C, Cocuzza CE., Prevalence and viral load of oncogenic human papillomavirus types
associated with cervical carcinoma in a population of North Italy., J Med Virol. 2009 Feb;81(2):278-87.
68. Winer RL, Harris TG, Xi LF, Jansen KU, Hughes JP, Feng Q, Welebob C, Ho J, Lee SK, Carter JJ, Galloway
DA, Kiviat NB, Koutsky LA., Quantitative human papillomavirus 16 and 18 levels in incident infections and
cervical lesion development., J Med Virol. 2009 Apr;81(4):713-21.
69. Xi LF, Edelstein ZR, Meyers C, Ho J, Cherne SL, Schiffman M., Human papillomavirus types 16 and 18 DNA
load in relation to coexistence of other types, particularly those in the same species., Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev. 2009 Sep;18(9):2507-12.
70. Damay A, Didelot-Rousseau MN, Costes V, Konate I, Ouedraogo A, Nagot N, Foulongne V, Van de Perre
P, Mayaud P, Segondy M., Viral load and physical status of human papillomavirus (HPV) 18 in cervical
samples from female sex workers infected with HPV 18 in Burkina Faso., J Med Virol. 2009 Oct;81(10):1786-
91.
71. Yoshida T, Sano T, Oyama T, Kanuma T, Fukuda T., Prevalence, viral load, and physical status of HPV
16 and 18 in cervical adenosquamous carcinoma., Virchows Arch. 2009 Sep;455(3):253-9.

52
72. Singh A, Datta P, Jain SK, Bhatla N, Dutta Gupta S, Dey B, Singh N., Human papilloma virus genotyping,
variants and viral load in tumors, squamous intraepithelial lesions, and controls in a north Indian population
subset., Int J Gynecol Cancer. 2009 Dec;19(9):1642-8.
73. Xi LF, Koutsky LA, Castle PE, Edelstein ZR, Meyers C, Ho J, Schiffman M., Relationship between cigarette
smoking and human papilloma virus types 16 and 18 DNA load., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2009
Dec;18(12):3490-6.
74. Dinc B, Rota S, Onan A, Bozdayi G, Taskiran C, Biri A, Güner H., Prevalence of human papillomavirus (HPV)
and HPV-16 genotyping by real-time PCR in patients with several cervical pathologies., Braz J Infect Dis. 2010
Jan-Feb;14(1):19-23.
75. Ramanakumar AV, Goncalves O, Richardson H, Tellier P, Ferenczy A, Coutlée F, Franco EL., Human
papillomavirus (HPV) types 16, 18, 31, 45 DNA loads and HPV-16 integration in persistent and transient
infections in young women., BMC Infect Dis. 2010 Nov 11;10:326.
76. Carcopino X, Bolger N, Henry M, Mancini J, Boubli L, Olive D, Cleary S, Prendiville W, Tamalet C.,
Evaluation of type-specific HPV persistence and high-risk HPV viral load quantitation in HPV positive women
under 30 with normal cervical cytology., J Med Virol. 2011 Apr;83(4):637-43. doi: 10.1002/jmv.22022.
77. Marks M, Gravitt PE, Utaipat U, Gupta SB, Liaw K, Kim E, Tadesse A, Phongnarisorn C, Wootipoom
V, Yuenyao P, Vipupinyo C, Rugpao S, Sriplienchan S, Celentano DD., Kinetics of DNA load predict HPV
16 viral clearance., J Clin Virol. 2011 May;51(1):44-9.
78. Li Y, Xiang Y, Zhang RF, Cai YP, Yang Y, Cheng XM, Zhu BL. , Viral load, genomic integration frequency of
human papillomavirus 16 in cervical cancer and precancerous lesions, Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2011 Apr
5;91(13):906-10.
79. Nielsen A, Kjaer SK, Munk C, Osler M, Iftner T., Persistence of high-risk human papillomavirus infection in a
population-based cohort of Danish women., J Med Virol. 2010 Apr;82(4):616-23.
80. Gunnell AS, Tran TN, Torrång A, Dickman PW, Sparén P, Palmgren J, Ylitalo N., Synergy between
cigarette smoking and human papillomavirus type 16 in cervical cancer in situ development., Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev. 2006 Nov;15(11):2141-7. Epub 2006 Oct 20.
81. Muñoz N, Castellsagué X, de González AB, Gissmann L., Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer.,
Vaccine. 2006 Aug 31;24 Suppl 3:S3/1-10. Epub 2006 Jun 23.
82. Rajeevan MS, Swan DC, Nisenbaum R, Lee DR, Vernon SD, Ruffin MT, Horowitz IR, Flowers LC, Kmak
D, Tadros T, Birdsong G, Husain M, Srivastava S, Unger ER., Epidemiologic and viral factors associated with
cervical neoplasia in HPV-16-positive women., Int J Cancer. 2005 May 20;115(1):114-20.
83. Wang SS, Schiffman M, Herrero R, Carreon J, Hildesheim A, Rodriguez AC, Bratti MC, Sherman ME, Morales
J, Guillen D, Alfaro M, Clayman B, Burk RD, Viscidi RP., Determinants of human papillomavirus
16 serological conversion and persistence in a population-based cohort of 10 000 women in Costa Rica., Br J
Cancer. 2004 Oct 4;91(7):1269-74.
84. Reesink-Peters N, Burger MP, Kleter B, Quint WG, Bossuyt PM, Adriaanse AH., Using a new HPV detection
system in epidemiological research: change of views on cervical dyskaryosis?, Eur J Obstet Gynecol Reprod
Biol. 2001 Oct;98(2):199-204.
85. Ho GY, Kadish AS, Burk RD, Basu J, Palan PR, Mikhail M, Romney SL., HPV 16 and cigarette smoking as
risk factors for high-grade cervical intra-epithelial neoplasia., Int J Cancer. 1998 Oct 29;78(3):281-5.
86. del Amo J, González C, Belda J, Fernández E, Martínez R, Gómez I, Torres M, Saiz AG, Ortiz M., Prevalence
and risk factors of high-risk human papillomavirus in female sex workers in Spain: differences by geographical
origin., J Womens Health (Larchmt). 2009 Dec;18(12):2057-64.
87. Flores R, Papenfuss M, Klimecki WT, Giuliano AR., Cross-sectional analysis of oncogenic HPV viral load and
cervical intraepithelial neoplasia., Int J Cancer. 2006 Mar 1;118(5):1187-93.
88. Ylitalo N, Sørensen P, Josefsson A, Frisch M, Sparén P, Pontén J, Gyllensten U, Melbye M, Adami HO.,
Smoking and oral contraceptives as risk factors for cervical carcinoma in situ., Int J Cancer. 1999 May
5;81(3):357-65.
89. Daling JR, Madeleine MM, McKnight B, Carter JJ, Wipf GC, Ashley R, Schwartz SM, Beckmann AM,
Hagensee ME, Mandelson MT, Galloway DA., The relationship of human papillomavirus-related cervical
tumors to cigarette smoking, oral contraceptive use, and prior herpes simplex virus type 2 infection., Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev. 1996 Jul;5(7):541-8
90. Arbyn M., Anttila A., Jordan J., Ronco G., Schenck U., Segnan N., Wiener H. G., Herbert A., Daniel J., von
Karsa L., European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening, Second Edition, IARC.
91. Wright TC Jr, Massad LS, Dunton CJ, Spitzer M, Wilkinson EJ, Solomon D; 2006 American Society for
Colposcopy and Cervical Pathology-sponsored Consensus Conference., 2006 consensus guidelines for the
management of women with abnormal cervical cancer screening tests., Am J Obstet Gynecol. 2007
Oct;197(4):346-55. Review.
92. Jordan J, Martin-Hirsch P, Arbyn M, Schenck U, Baldauf JJ, Da Silva D, Anttila A, Nieminen P, Prendiville
W., European guidelines for clinical management of abnormal cervical cytology, part 2., Cytopathology. 2009
Feb;20(1):5-16.
93. Strander B, Ryd W, Wallin KL, Wärleby B, Zheng B, Milsom I, Gharizadeh B, Pourmand N, Andersson-
Ellström A., Does HPV-status 6-12 months after treatment of high grade dysplasia in the uterine cervix predict
long term recurrence?, Eur J Cancer. 2007 Aug;43(12):1849-55.

53
94. Distéfano AL, Picconi MA, Alonio LV, Dalbert D, Mural J, Bartt O, Bazán G, Cervantes G, Lizano
M, Carrancá AG, Teyssié A., Persistence of human papillomavirus DNA in cervical lesions after treatment with
diathermic large loop excision., Infect Dis Obstet Gynecol. 1998;6(5):214-9
95. Arbyn M, Paraskevaidis E, Martin-Hirsch P, Prendiville W, Dillner J., Clinical utility of HPV-DNA detection:
triage of minor cervical lesions, follow-up of women treated for high-grade CIN: an update of pooled evidence.,
Gynecol Oncol. 2005 Dec;99(3 Suppl 1):S7-11.
96. Paraskevaidis E, Arbyn M, Sotiriadis A, Diakomanolis E, Martin-Hirsch P, Koliopoulos G, Makrydimas G,
Tofoski J, Roukos DH., The role of HPV DNA testing in the follow-up period after treatment for CIN: a
systematic review of the literature., Cancer Treat Rev. 2004 Apr;30(2):205-11. Review.
97. Zielinski GD, Bais AG, Helmerhorst TJ, Verheijen RH, de Schipper FA, Snijders PJ, Voorhorst FJ, van
Kemenade FJ, Rozendaal L, Meijer CJ., HPV testing and monitoring of women after treatment of CIN 3:
review of the literature and meta-analysis., Obstet Gynecol Surv. 2004 Jul;59(7):543-53.
98. Nobbenhuis MA, Meijer CJ, van den Brule AJ, Rozendaal L, Voorhorst FJ, Risse EK, Verheijen
RH, Helmerhorst TJ., Addition of high-risk HPV testing improves the current guidelines on follow-up after
treatment for cervical intraepithelial neoplasia., Br J Cancer. 2001 Mar 23;84(6):796-801.
99. Bar-Am A, Gamzu R, Levin I, Fainaru O, Niv J, Almog B., Follow-up by combined cytology and human
papillomavirus testing for patients post-cone biopsy: results of a long-term follow-up., Gynecol Oncol. 2003
Oct;91(1):149-53.
100. Almog B, Gamzu R, Kuperminc MJ, Levin I, Fainaru O, Niv J, Bar-Am A., Human papilloma virus testing in
patient follow-up post cone biopsy due to high-grade cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2003
Mar;88(3):345-50.
101. Negri G, Gampenrieder J, Vigl EE, Haitel A, Menia E, Mian C., Human papilloma virus typing at large loop
excision of the transformation zone of the cervix uteri., Anticancer Res. 2003 Sep-Oct;23(5b):4289-92.
102. Hernádi Z, Szoke K, Sápy T, Krasznai ZT, Soós G, Veress G, Gergely L, Kónya J., Role of human
papillomavirus (HPV) testing in the follow-up of patients after treatment for cervical precancerous lesions., Eur
J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2005 Feb 1;118(2):229-34.
103. Denny LA, Wright TC Jr., Human papillomavirus testing and screening., Best Pract Res Clin Obstet
Gynaecol. 2005 Aug;19(4):501-15
104. Coupé VM, Berkhof J, Verheijen RH, Meijer CJ., Cost-effectiveness of human papillomavirus testing after
treatment for cervical intraepithelial neoplasia., BJOG. 2007 Apr;114(4):416-24.
105. Leguevaque P, Motton S, Decharme A, Soulé-Tholy M, Escourrou G, Hoff J., Predictors of recurrence in high-
grade cervical lesions and a plan of management., Eur J Surg Oncol. 2010 Nov;36(11):1073-9.
106. Heymans J, Benoy IH, Poppe W, Depuydt CE., Type-specific HPV geno-typing improves detection of recurrent
high-grade cervical neoplasia after conisation., Int J Cancer. 2010 Nov 9.
107. Liu Y, Li C, Wang J, Zhang W., Repeat low-grade squamous intraepithelial cytology with unsatisfactory
colposcopy treated by the loop electrosurgical excision procedure: a retrospective study., Eur J Gynaecol
Oncol. 2010;31(6):632-5.
108. Fambrini M, Penna C, Pieralli A, Bussani C, Fallani MG, Andersson KL, Scarselli G, Marchionni M., PCR
detection rates of high risk human papillomavirus DNA in paired self-collected urine and cervical scrapes after
laser CO2 conization for high-grade cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2008 Apr;109(1):59-64.
109. Jeong NH, Lee NW, Kim HJ, Kim T, Lee KW., High-risk human papillomavirus testing for monitoring patients
treated for high-grade cervical intraepithelial neoplasia., J Obstet Gynaecol Res. 2009 Aug;35(4):706-11.
110. Ribaldone R, Boldorini R, Capuano A, Arrigoni S, Di Oto A, Surico N., Role of HPV testing in the follow-up
of women treated for cervical dysplasia., Arch Gynecol Obstet. 2010 Aug;282(2):193-7.
111. Ostojić DV, Vrdoljak-Mozetic D, Stemberger-Papić S, Finderle A, Eminović S., Cervical cytology and HPV
test in follow-up after conisation or LLETZ., Coll Antropol. 2010 Mar;34(1):219-24.
112. Ding Z, Jiang C, Shore T, Pather S, Dalrymple C, Atkinson K, Murali R, Yousef Al-Rayyan ES, Luo K, Carter
J., Outcome of cervical intraepithelial neoplasia 2 diagnosed by punch biopsy in 131 women., J Obstet
Gynaecol Res. 2011 Mar 13. doi: 10.1111/j.1447-0756.2010.01427.x.
113. Kucera E, Sliutz G, Czerwenka K, Breitenecker G, Leodolter S, Reinthaller A., Is high-risk human
papillomavirus infection associated with cervical intraepithelial neoplasia eliminated after conization by large-
loop excision of the transformation zone?, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001 Dec 10;100(1):72-6.
114. Kreimer AR, Guido RS, Solomon D, Schiffman M, Wacholder S, Jeronimo J, Wheeler CM, Castle PE., Human
papillomavirus testing following loop electrosurgical excision procedure identifies women at risk for
posttreatment cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 disease., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006
May;15(5):908-14.
115. Gök M, Coupé VM, Berkhof J, Verheijen RH, Helmerhorst TJ, Hogewoning CJ, Snijders PJ, Meijer CJ.,
HPV16 and increased risk of recurrence after treatment for CIN., Gynecol Oncol. 2007 Feb;104(2):273-5.
116. Fallani MG, Penna C, Marchionni M, Bussani C, Pieralli A, Andersson KL, Fambrini M., Prognostic
significance of high-risk HPV persistence after laser CO2 conization for high-grade CIN: a prospective clinical
study., Eur J Gynaecol Oncol. 2008;29(4):378-82.
117. Dyson S, Pitts M, Lyons A, Mullins R., Providing high quality information about human papillomavirus for
women after treatment for high-grade cervical dysplasia., Sex Health. 2010 Mar;7(1):49-54.

54
118. Valasoulis G, Koliopoulos G, Founta C, Kyrgiou M, Tsoumpou I, Valari O, Martin-Hirsch P, Daponte
A, Karakitsos P, Paraskevaidis E., Alterations in human papillomavirus-related biomarkers after treatment of
cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2011 Apr;121(1):43-8.
119. Nobbenhuis MA, Meijer CJ, van den Brule AJ, Rozendaal L, Voorhorst FJ, Risse EK, Verheijen
RH, Helmerhorst TJ., Addition of high-risk HPV testing improves the current guidelines on follow-up after
treatment for cervical intraepithelial neoplasia., Br J Cancer. 2001 Mar 23;84(6):796-801.
120. Elfgren K, Jacobs M, Walboomers JM, Meijer CJ, Dillner J., Rate of human papillomavirus clearance after
treatment of cervical intraepithelial neoplasia., Obstet Gynecol. 2002 Nov;100(5 Pt 1):965-71.
121. Soutter WP, Sasieni P, Panoskaltsis T., Long-term risk of invasive cervical cancer after treatment of squamous
cervical intraepithelial neoplasia., Int J Cancer. 2006 Apr 15;118(8):2048-55.
122. Kalliala I, Dyba T, Nieminen P, Hakulinen T, Anttila A., Mortality in a long-term follow-up after treatment of
CIN., Int J Cancer. 2010 Jan 1;126(1):224-31.
123. Schuman P, Ohmit SE, Klein RS, Duerr A, Cu-Uvin S, Jamieson DJ, Anderson J, Shah KV; HIV Epidemiology
Research Study (HERS) Group., Longitudinal study of cervical squamous intraepithelial lesions in human
immunodeficiency virus (HIV)-seropositive and at-risk HIV-seronegative women., J Infect Dis. 2003 Jul
1;188(1):128-36.
124. Silverberg MJ, Ahdieh L, Munoz A, Anastos K, Burk RD, Cu-Uvin S, Duerr A, Greenblatt RM, Klein RS,
Massad S, Minkoff H, Muderspach L, Palefsky J, Piessens E, Schuman P, Watts H, Shah KV., The impact
of HIV infection and immunodeficiency on human papillomavirus type 6 or 11 infection and on genital warts.,
Sex Transm Dis. 2002 Aug;29(8):427-35.
125. Strickler HD, Palefsky JM, Shah KV, Anastos K, Klein RS, Minkoff H, Duerr A, Massad LS, Celentano DD,
Hall C, Fazzari M, Cu-Uvin S, Bacon M, Schuman P, Levine AM, Durante AJ, Gange S, Melnick S, Burk RD.,
Human papillomavirus type 16 and immune status in human immunodeficiency virus-seropositive women., J
Natl Cancer Inst. 2003 Jul 16;95(14):1062-71.
126. Harris TG, Burk RD, Palefsky JM, Massad LS, Bang JY, Anastos K, Minkoff H, Hall CB, Bacon MC, Levine
AM, Watts DH, Silverberg MJ, Xue X, Melnick SL, Strickler HD., Incidence of cervical squamous
intraepithelial lesions associated with HIV serostatus, CD4 cell counts, and human papillomavirus test results.,
JAMA. 2005 Mar 23;293(12):1471-6.
127. Auvert B, Lissouba P, Cutler E, Zarca K, Puren A, Taljaard D., Association of oncogenic and nononcogenic
human papillomavirus with HIV incidence., J Acquir Immune Defic Syndr. 2010 Jan 1;53(1):111-6.
128. Clarke B, Chetty R., Postmodern cancer: the role of human immunodeficiency virus in uterine cervical cancer.,
Mol Pathol. 2002 Feb;55(1):19-24.99. Gage JR, Sandhu AK, Nihira M, Bonecini-Almeida M da G, Cristoforoni
P, Kishimoto T, Montz FJ, Martínez-Maza O., Effects of human papillomavirus-associated cells on human
immunodeficiency virus gene expression., Obstet Gynecol. 2000 Dec;96(6):879-85.
129. Gray RH, Serwadda D, Kong X, Makumbi F, Kigozi G, Gravitt PE, Watya S, Nalugoda F, Ssempijja V, Tobian
AA, Kiwanuka N, Moulton LH, Sewankambo NK, Reynolds SJ, Quinn TC, Iga B, Laeyendecker O, Oliver AE,
Wawer MJ., Male circumcision decreases acquisition and increases clearance of high-risk human
papillomavirus in HIV-negative men: a randomized trial in Rakai, Uganda., J Infect Dis. 2010 May
15;201(10):1455-62.
130. Cu-Uvin S., HPV as a risk factor for HIV, the 26 th International Papillomavirus Conference, Montreal, Canada,
2010
131. Clifford GM, Gonçalves MA, Franceschi S; HPV and HIV Study Group., Human papillomavirus types among
women infected with HIV: a meta-analysis., AIDS. 2006 Nov 28;20(18):2337-44
132. De Vuyst H, Lillo F, Broutet N, Smith JS., HIV, human papillomavirus, and cervical neoplasia and cancer in
the era of highly active antiretroviral therapy., Eur J Cancer Prev. 2008 Nov;17(6):545-54.
133. Gervaz P, Hahnloser D, Wolff BG, Anderson SA, Cunningham J, Beart RW Jr, Klipfel A, Burgart L,
Thibodeau SN., Molecular biology of squamous cell carcinoma of the anus: a comparison of HIV-positive
and HIV-negative patients., J Gastrointest Surg. 2004 Dec;8(8):1024-30; discussion 1031.
134. Kitchener H, Nelson L, Adams J, Mesher D, Sasieni P, Cubie H, Moore C, Heard I, Agarossi A, Casolati E,
Denny L, Bradbeer C, Lyons F, Beattie G, Niemiec T., Colposcopy is not necessary to assess the risk to the
cervix in HIV-positive women: an international cohort study of cervical pathology in HIV-1 positive women.,
Int J Cancer. 2007 Dec 1;121(11):2484-91.
135. Franceschi S., Epidemiology of HPV infection in HIV infected people, the 26th International Papillomavirus
Conference, Montreal, Canada, 2010
136. Ogilvie G., Follow-up and counseling for HPV positive women with normal smears, the 26th International
Papillomavirus Conference, Montreal, Canada, 2010
137. Kjaer S, Høgdall E, Frederiksen K, Munk C, van den Brule A, Svare E, Meijer C, Lorincz A, Iftner T., The
absolute risk of cervical abnormalities in high-risk human papillomavirus-positive, cytologically normal women
over a 10-year period., Cancer Res. 2006 Nov 1;66(21):10630-6.
138. Khan MJ, Castle PE, Lorincz AT, Wacholder S, Sherman M, Scott DR, Rush BB, Glass AG, Schiffman M.,
The elevated 10-year risk of cervical
precancer and cancer in women with human papillomavirus (HPV) type 16 or 18 and the
possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice., J Natl Cancer Inst. 2005 Jul 20;97(14):1072-9.

55
139. Goldie SJ, Kim JJ, Wright TC., Cost effectiveness of human papillomavirus DNA testing for cervical
cancer screening in women aged 30 years or more., Obstet Gynecol. 2004 Apr;103(4):619-31.
140. Ronco G, Segnan N, Giorgi-Rossi P, Zappa M, Casadei GP, Carozzi F, Dalla Palma P, Del Mistro A, Folicaldi
S, Gillio-Tos A, Nardo G, Naldoni C, Schincaglia P, Zorzi M, Confortini M, Cuzick J; New Technologies for
Cervical Cancer Working Group., Human papillomavirus testing and liquid-based cytology: results at
recruitment from the new technologies for cervical cancer randomized controlled trial., J Natl Cancer Inst. 2006
Jun 7;98(11):765-74.
141. Bigras G, de Marval F., The probability for a Pap test to be abnormal is directly proportional to HPV viral
load: results from a Swiss study comparingHPV testing and liquid-based cytology to detect cervical
cancer precursors in 13,842 women., Br J Cancer. 2005 Sep 5;93(5):575-81.
142. Cuzick J, Szarewski A, Cubie H, Hulman G, Kitchener H, Luesley D, McGoogan E, Menon U, Terry
G, Edwards R, Brooks C, Desai M, Gie C, Ho L, Jacobs I, Pickles C, Sasieni P.,
Management of women who test positive for high risk types of human papillomavirus: the HART study.,
Lancet. 2003 Dec 6;362(9399):1871-6.
143. Clavel C, Masure M, Bory JP, Putaud I, Mangeonjean C, Lorenzato M, Nazeyrollas P, Gabriel R, Quereux
C, Birembaut P., Papillomavirus testing in primary screening for the detection of high-grade cervical lesions:
a study of 7932 women., Br J Cancer. 2001 Jun 15;84(12):1616-23.

LISTA ARTICOLE PUBLICATE

I. Ursu RG, Onofriescu M, Nemescu D, Iancu LS., Enhanced


molecular techniques for the diagnosis of human papillomavirus
infections., Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2009 Oct-Dec;
113(4):1205-10.
II. Ramona Gabriela Ursu, Mircea Onofriescu, Dragoş Nemescu,
Roxana Nemescu, Luminiţa Smaranda Iancu, Detection of HPV 16
and HPV 18 viral loads by Real Time PCR in women with cervical
dysplasia, Analele Ştiinţifice Ale Universităţii „Alexandru Ioan
Cuza”, Secţiunea Genetică Şi Biologie Moleculară, Tom XII, fasc. I,
2011, pag 25 – 29.
III. Luminiţa-Smaranda Iancu, Ramona Gabriela Ursu, Ecaterina Mariana
Enache, Mircea Onofriescu, Particularitatile consimtamântului
informat pentru pacientele HPV pozitive, Revista Romana de
Bioetica, ISSN: 1583-5170
IV. RAMONA GABRIELA URSU, MIRCEA ONOFRIESCU,
DRAGOS NEMESCU, LUMINITA SMARANDA IANCU, HPV
prevalence and type distribution in women with or without cervical
lesions in the North - East region of Romania, Virology Journal
(trimis spre publicare).

56
CURRICULUM VITAE

Nume: Ramona Gabriela Ursu


Data naşterii: 9 noiembrie 1977
Tel.: 0744269946
E-mail: ursuramona@yahoo.com

Educatie:
o 2007 - prezent: doctorand în specialitatea Microbiologie, cu teza ”Infecţii cu
transmitere sexuală asimptomatice. Utilitatea clinică a determinării
cantitative prin Real Time PCR a genotipurilor HPV cu risc înalt
oncogen”;
o 2007 – 2008: Şcoala doctorală;
o 2006 – 2007: Masterat de Epidemiologie clinică. Metodologia de studiu
în bolile multicauzale – Disciplina de Asistenţă Primară a Stării de
Sănătate şi Epidemiologie; lucrare de dizertaţie: ”Determinarea
cantitativă a genotipurilor Human Papilloma Virus cu risc înalt
oncogen şi caracterizarea statusului integrării genomului HPV”;
o 1997 – 2003: Universitatea de Medicină şi Farmacie Iaşi, Facultatea de
Medicină;
o 1993 – 1997: Liceul Teoretic "Ştefan cel Mare”, Suceava.
Calificãri:
o 2009: Responsabil Management Calitate Transmed Expert
o 2008: Medic Specialist Medicină de Laborator;
o 2003 – 2008: Rezident Medicina de Laborator;
o 2003: Diploma de Medic.
Experienta profesionalã:
o 2008 – prezent : asistent, Disciplina de Microbiologie, UMF “Grigore T.
Popa” Iaşi;
o 2004 – 2008: preparator, Disciplina de Microbiologie, UMF “Grigore T.
Popa” Iaşi.
Cursuri postuniversitare / burse:
o 2010: Antimicrobial Stewardship: Measuring, Auditing and
Improving, ESCMID Postgraduate Education Course, 8 - 10 April 2010,
Vienna, Austria
o 2009: Curs “Asigurarea calitatii in laboratoarele conform
standardului ISO 15189”;
o 2009: Curs perfectionare tehnica Real Time PCR (PCR cantitativ), prin
participarea la cursul orgnizat de TATAA Biocenter, Freising, Germania;
o 2009: curs postuniversitar ”Efectuarea şi interpretarea testelor de
sensibilitate in vitro
pentru principalele specii de interes medical în raport cu noile fenotipuri
de rezistenţă”, UMF “Grigore T. Popa” Iasi, februarie - martie 2009;

57
o 2008: vizită de o săptămâna la Organizaţia Mondială a Sănătăţii,
Departamentul HIV / AIDS, unde, sub indrumarea Dr. George Schmid am
selectat bibliografia necesară analizei temei “Infecţii asimptomatice
transmise pe cale sexuală”;
o MD (Mobilitate Doctorală) realizată la Institutul de Virusologie “Ştefan
S. Nicolau”, Bucureşti, pentru deprinderea şi aprofundarea tehnicii Real
Time PCR (2008) – grant PNCDI – PNII : Proiecte de mobilitate a
doctoranzilor (2/2008).
o 2008: participare la ”Beating Cervical Cancer Webminar”, Global
Videoconference World Cancer Congress, Geneva, International Union
Against Cancer, August 28, 2008;
o 2008: grant participare la “47th ESCMID Postgraduate Technical
Workshop, Gene Expression during Infection”, March, 2008, Siena, Italia;
o BD (Bursa Doctorală), Infecţii cu transmitere sexuală asimptomatice.
Utilitatea clinică a determinării cantitative prin Real Time PCR a genotipurilor
HPV cu risc înalt oncogen, competiţie CNCSIS (51/2007);
o 2007: grant participare la “A modern approach to the management of
sexually transmitted diseases”, 45th ESCMID Postgraduate Education
Course”, September, 2007, St. Petersburg, Rusia;
o 2007: stagiu de perfecţionare în laboratorul de Virusologie din cadrul
I.N.C.D.M.I. CANTACUZINO, Bucureşti - introducere în tehnicile:
purificare ADN, PCR standard şi genotipare HPV prin metoda INNO LiPA,
februarie 2007;
o 2006: participare la SUMMER SCHOOL OF PUBLIC HEALTH,
Institute of Public Health, Iunie, Iaşi, România;
o 2005 - 2006: mobilitate ERASMUS SOCRATES la University of
Southern Denmark, Institute of Public Health, Esbjerg;
o 2005: participare la “4th ESCMID Summer School” Szeged, Hungary,
June, 2005;
o 2004: Curs Perfectionare Grecia – “Bioetica şi legislaţia sanitară în
România”.
Activitate didacticã :
o Stud. Silvia Salceanu; coordonatori: Ramona Ursu, Luminiţa
Smaranda Iancu, Genotyping HPV in precancerous cervical lesions:
AGC, ASC-US, ASC-H, LGSIL and HGSIL, CONGRESSIS 2011, Al
8-lea Congres Internaţional pentru Studenţi şi Tineri Medici, Iasi
o Stud. Silvia Salceanu, coordonatori Ramona Ursu, Luminiţa
Smaranda Iancu., Human Papillomavirus genotype prevalence in
Paşcani, Romania, 64th International Students' and Young Scientists'
Conference "Actual Problems of Modern Medicine", Kyiv, Ukraine ,
March 3-4th, 2011
o Stud: Ioana Sacară, Silvia Sălceanu; coordonatori: Ramona Gabriela
Ursu, Luminiţa Smaranda Iancu, Optimization of Real Time PCR
technique for HPV 16 viral load absolute quantification,

58
CONGRESSIS 2010, Al 7-lea Congres Internaţional pentru Studenţi şi
Tineri Medici, Iasi
o Stud. Oana Murariu, Olivia Jigăreanu; coordonatori: Ramona
Gabriela Ursu, Luminiţa Smaranda, Breaking boundaries in Human
Papilloma Viruses (HPV) infections diagnosis: from classical
Papanicolau test to HPV DNA /mRNA tests, CONGRESSIS 2010, Al
8-lea Congres Internaţional pentru Studenţi şi Tineri Medici, Iasi
o 2009: Challenges Related to Acceptability of Human Papilloma
Virus Vaccines, Autor: Andreea-Georgiana Aiacoboae, Co-autori:
Alexandru Lacatus, Victor Constantinescu, Coordonator ştiinţific:
Assistant Ramona Ursu M.D., CONGRESSIS 2009, Al 6-lea Congres
Internaţional pentru Studenţi şi Tineri Medici, Iasi
o 2009: Genotyping Human Papillomavirus: Which Assay?,
Autori: Salceanu Silvia Olivia, Coordonator ştiinţific: Assistant Ramona
Ursu M.D., CONGRESSIS 2009, Al 6-lea Congres Internaţional pentru
Studenţi şi Tineri Medici, Iasi
o 2009: participare la conferinţa studenţilor cu prezentarea
”Implementarea vaccinării anti HPV”, în cadrul Săptămânii Europene
de Prevenire a Cancerului de Col Uterin (18-24 ianuarie 2009)
o 2008 : pregătirea practică a whorksop-urilor ”Real Time PCR &
ELISA, as laboratory tool in the diagnosis of infectious diseases”, The
5th International Congress for Medical Students and Young Doctors, Iaşi,
Romania
o 2007: “Advantages of HPV genotyping by INNO – LiPA
method”, studenţi: Ioana Sacară, Andrei Hristov, coordonator ştiinţific
Ramona Ursu, CONGRESSIS 2007, the 4TH International Congress for
Medical Students and Young Doctors, Iaşi
o 2006: “Cauzal relation between HBV – HCC”, studenţi: Ioana
Sacară, Andrei Hristov, coordonator ştiinţific Ramona Ursu, International
Congres of Young Doctor and Students, Bucharest
Membru în proiecte de cercetare :
o Tehnica Real Time PCR ca instrument practic în prognosticul şi
monitorizarea infecţiilor cu virusuri papilloma umane cu risc oncogen
înalt – grant PNCD2 - IDEI (1642/2008), director de proiect prof. dr.
Iancu Luminţa Smaranda;
o Diagnostic prenatal neinvaziv prin analiza moleculară a ADN fetal
din plasma maternă - grant PNCD2 - IDEI (1155/2007), director de
proiect prof. dr. Onofriescu Mircea;
o Cercetări privind sinteza şi activitatea antibacteriană a unor derivate
de acid-4-chinolon-3- carboxilic. Relaţii structură chimică-activitate
biologică, grant CEEX, Faza III, director de proiect prof. dr. Mihai
Nechifor (2007-2008).
Prezentări:
o R. Ursu, M. Onofriescu, D. Nemescu, R. Nemescu, L.S. Iancu, HPV
16&18 viral load and risk factors for cervical cancer, The 27the
59
International Papillomavirus Conference 17-22 September 2011, Berlin,
Germany
o A C Anton, C Cojocaru, G Anton, R Ursu, D Socolov, M Grigore, S
Chelemen, Multiple Electrosurgical Excisions – Treatment For
Precancerous Cervical Lession, The 27the International Papillomavirus
Conference 17-22 September 2011, Berlin, Germany
o Ramona Gabriela Ursu, Cristina Ana Anton, Lavinia Dimitriu, Maria
Carlan, Grigore Alexandru Dimitriu, Luminița Smaranda Iancu,
Importanța testării ADN/HPV prin Linear Array Genotyping Test
post intervenție excisională în neoplaziile intraepiteliale cervicale, 18-
lea Congres al Societăţii Române de Medicină de Laborator, 25 - 28 mai
2011 la Sibiu
o Ramona Ursu, M. Onofriescu, D. Nemescu, Silvia Sălceanu, Roxana
Nemescu,Mioara Matei, Luminiţa Smaranda Iancu, Screeningul
cancerului cervical: tranziţia de la evaluarea citologică, la testarea
ADN/HPV, prin tehnici de biologie moleculară, Conferinta Nationala de
Oncologie, Iasi, noiembrie 2010.
o Ursu Ramona, Onofriescu Mircea, Nemescu Dragoş, Sălceanu Sivia,
Nemescu Roxana, Matei Mioara, Iancu Luminiţa Smaranda, Prevalenţa
şi distribuţia genotipurilor HPV în zona Moldovei; corelaţii între
încărcătura virală de HPV 16 şi gradul displaziei cervicale, Conferinta,
A II-a Conferinta Nationala de Microbiologie, 2010, Sinaia
o Ramona Ursu, Luminiţa Smaranda Iancu, Prevalence of human
papilloma virus types and viral load – Pap test correlation in Romania,
26th International Papillomavirus Conference and Workshops, Montreal,
iulie 2010, poster P – 179.
o Ramona Gabriela Ursu , Luminita Smaranda Iancu, Optimizarea
tehnicii Real time PCR pentru cuantificarea genotipurilor înalt
oncogene de HPV 16 şi 18, Conferinta Nationala de Microbiologie si
Epidemiologie, octombrie 2009, Brasov
O 2009: prezentarea posterului "HR-HPV viral load, p16INK4a -
predictive of persistence infection" la conferinţa "25th International
Papillomavirus Conference" , Malmo, Suedia, mai 2009 (facilitarea
participării la conferinţă s-a datorat grantului oferit de International
Papillomavirus Society, grant obţinut prin competiţie).
o 2007: “HPV: viral load and physical status - clinical utility” în
cadrul cursului “ A modern approach to the management of sexually
transmitted diseases, 45th ESCMID Postgraduate Education Course”, St
Petersburg, Rusia;
o 2005: “Coinfection HBV – HCV” în cadrul şcolii de vară ESCMID,
Szeghed, Ungaria.
Articole :
o RAMONA GABRIELA URSU, MIRCEA ONOFRIESCU, DRAGOS
NEMESCU, LUMINITA SMARANDA IANCU, trimis spre evluare si
publicare la Virology Journal
60
o Ursu RG, Onofriescu M, Nemescu D, Iancu LS., Enhanced molecular
techniques f, HPV prevalence and type distribution in women with or
without cervical lesions in the North - East region of Romania or the
diagnosis of human papillomavirus infections., Rev Med Chir Soc Med
Nat Iasi. 2009 Oct-Dec; 113(4):1205-10.
o Luminiţa-Smaranda Iancu, Ramona Gabriela Ursu, Ecaterina Mariana
Enache, Mircea Onofriescu, Particularitatile consimtamnatului
informat pentru pacientele HPV pozitive, Revista Romana de Bioetica,
ISSN: 1583-5170
o Ramona Gabriela Ursu, M. Onofriescu, D. Nemescu, Luminiţa
Smaranda Iancu Optimizarea unor tehnici de biologie moleculară
pentru diagnosticul infecţiilor cu virusuri papilloma umane, Rev Med
Chir Soc Med Nat Iasi, nr. 4, 113/09.
o Lucia Pintilie, Catalina Negut, C. Oniscu, M.T. Caproiu, M.Nechifor,
Luminita Iancu, Cristina Ghiciuc, Ramona Ursu, Synthesis and
Antibacterial Actyvity of some Novel Quinolones, Romanian
Biotechnology Letters, Vol. 14, No. 5, 2009, pp. 4756 – 4767,
http://ebooks.unibuc.ro/biologie/RBL/rbl5vol14/19.pdf
o Luminita Smaranda Iancu, Medea Berea, Ramona Ursu, M.
Onofriescu, The prevalence of MRSA among the lying – in women
and their new – born infants in two maternities from Iaşi,, Journal of
Preventive Medicine, volume 14, 2006.
Activitate stiintificã:
o membru societăţi ştiinţifice
European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases
International PapillomaVirus Society HPV Global Community
o membru în comitete de organizare
2008: Cursul Epidemiologie şi Sănătate Publică, creditat CMR, cu
participare internaţională - invitat Prof. Gabriel Gulis, University of
Southern Denmark, Institute of Public Health, Esbjerg.
Experientã educationalã:
o participare curs de PSIHOPEDAGOGIE organizat de UMF “Gr. T.
Popa” Iaşi; lucrarea de Dizertaţie “Comunicarea didactică”, coordonator
Conf. Dr. Şerban Turliuc.
Activitatea profesionalã:
o 8 ani practică (laborator de bacteriologie - UMF “Gr. T. Popa”, Iaşi,
laborator de virusologie - ISP Iaşi, laborator privat analize medicale).
Limbi strãine: engleza, franceza.

61