TUBERCULOZA - NOTIUNI INTRODUCTIVE

24 martie 1882, bacteriologul german Robert Koch a prezentat la Societatea de Medicina din
Berlin o comunicare despre bacilul tuberculozei (Koch).
El a propus primele metode de identificare si de cultivare in laborator a bacilului.
Pentru aceasta descoperire, Koch a primit Premiul Nobel in 1905.
1891, Robert Koch a incercat un tratament cu tuberculina - ineficient, agravează simptomele
bolii.
1907, vienezul Clemens von Pirquet a descoperit intradermoreactia la tuberculina (IDR).
Testul evidentiaza prezenta bacilului Koch in organism si are in continuare un rol important in
combaterea tuberculozei.

Tuberculoza
▪ Este o boală infecto-contagioasă specifică, produsă de bacterii din genul
Mycobacterium tuberculosis
▪ Particularități ale infecției bacilare
─ Date istorice – dg de tuberculoză 6000 de ani ,
─ Răspândire largă,
─ Caracter endemic,
─ Afectează toate grupele de vârstă,
─ Diagnostic dificil prin afectarea pluriorganică

Etiopatogeneza - Agent Patogen – GENUL Mycobacterium

Genul Mycobacterium cuprinde peste 70 de specii care au în comun:
▪ Forma bacilară,
▪ Imobilitatea,
▪ Acidoalcoolorezistența,
▪ Multiplicarea lentă,
▪ Aerobioza obligatorie,

Clasificare
1. Mycobacterii tuberculoase patogene
2. Mycobacterii netuberculoase patogene
3. Mycobacterii netuberculoase nepatogene

Clasificare genul Mycobacterium

1. Mycobacterii tuberculoase patogene
▪ M. Tuberculosis
▪ M. Bovis
▪ M. Africanum
2. Mycobacterii netuberculoase patogene
▪ cu crestere lentă –M .Avium, M.Kansasii,
▪ Cu creștere rapidă – M.Fortuitum, M. Chelonei
▪ M. Leprae ( nu se cultivă)
3. Mycobacterii netuberculoase nepatogene
▪ Cu creștere lentă – M. Gastri
▪ Cu crestere rapidă – M. Smegmatis

Morfologia microscopică a bacililor tuberculoși

▪ Au aspect de bastonașe drepte sau încurbate, cu capete rotunjite,
▪ Lungime 1-5 micrometri,
▪ Groase 0,2-0,5 micrometri,
1
 ▪ Dispuse : izolat sau în gramezi
▪ Evidentierea lor se face pe baza proprietatii lor de acidoalcoolorezistență
1. Coloratia Ziehl – Neelsen – fond albastru de metil pe care micobacteriile apar ca
bastonașe roșii pe fond albastru,
2. Coloratia florescentă – la examinarea in raze ultraviolete micobacteriile apar ca
bastonșe fluorescente pe fond întunecat

Rezultate semicantitative examen microscopic

Numar BAAR Rezultat
absenti negativ
1-9 BAAR / 100 campuri nr. exact BAAR
10-99 BAAR / 100 campuri +
1-9 BAAR / 1 camp ++
≥ 10 BAAR / 1 camp +++
Marire 1000x (obiectiv cu imersie)

Mediile de cultură
1. Mediile solide - temperatură 35-37C, pH-7-7,5, creștere lentă, noncromogene (alb-
crem), aerobioză obligatorie, timp de creștere M.t. 3-8 săptămâni,
a) Loewenstei-Jensen -mediu de cultura in vitro, contine elemente nutritive
esentiale, saruri minerale, ou, amidon din cartof, verde malachit (indicator de
pH) si substanțe reprezentând surse de carbon și azot,
b) Tebeglut – sursa de azot- acidul glutamic
c) Middle -brook 7H10 sau 7H11
2. Mediile lichide - timp de creștere 1-2 săptamâni
▪ Aparate BACTECTB460, BACTEC MGIT 960, ( se monitorizează producerea
de CO2)
▪ Versa TREK, ( se monitorizează consumul de oxigen)
▪ Cantitatea produsa/ consumată este direct proportională cu rata de multiplicare,
evaluare se face prin vizualizarea precipitinelor sau prin semnal optic si/sau
acustic de aparat

Mediu Loewenstein Jensen

▪ Coloniile de M.tuberculosis au aspect alb-gabui conopidiform
▪ Coloniile de M.bovis sunt netede, plate, albicioase

Teste biochimice de identificare genică

▪ Au rolul de a diferenția tipurile de mycobacterii
▪ Testul se efectuează în primele 24-48 de ore după pozitivarea culturii pe mediu solid
sau lichid,
▪ Este un test obigatoriu pentru pentru a putea evita falsele reacţ ii negative.
▪ Sensibilitatea testului este de 98,6%, iar specificitatea de 97,7%
▪ In prezent se foloseste testul
Ag MPT 64 - test imunocromatografic ce poate detecta tulpinile de micobacterii aparţinând
MTC î n mai puţ in de 15 minute. Acest test pune î n evidenţ ă antigenul specific pentru
M.tuberculosis
Reacţia de polimerizare în lanţ şi analiza enzimelor de restricţ ie pentru identificarea
micobacteriilor din cultură
Este o metodă dezvoltată în 1993 de Telenţi şi colaboratorii, ce se bazează pe amplificarea
secven- ţei 441-bp a genei hsp65 prin tehnica de PCR, urmată de restricţ ia produsului de
amplificare cu ajutorul a două enzime de restricţ ie BstEll ş i Haell.
2
Fragmentele rezultate î n urma digestiei cu enzime restrictive sunt apoi analizate prin
electrofereza î n gel de agaroza ş i comparate cu un algoritm preexis- tent.
Testul poate fi finalizat î ntr-o singură zi

Metode moleculare de diagnostic

▪ Detecţ ia directă a micobacteriilor din prelevalul clinic,
▪ Identificarea speciilor ş i testarea rapidă a sensibilităţii la medicamentele anti-
tuberculoase pentru M. tuberculosis din culturi bacteriene, metode ce au făcut posibilă
scurtarea timpului de diagnostic (3,4).
▪ Totodată, metodele de tipare moleculară au făcut posibilă descrierea unor variaţ ii ale
fenotipurilor de M. tuberculosis cum ar fi
1. Virulenţ a,
2. Caracterele de creş tere,
3. Imunogenicitatea
4. Transmisibilitatea

Metode de detecție
1. Metoda de amplificare a acizilor nucleici - evidențiază ADN sau ARN micobacterian
- acuratețe dediagnostic- 100% pentru M.Tuberculosis
2. Sistemul de hibridizare pe bandă - ex. Geno type mycobacterium - - detectează
polimorfismul unei singure nucleotide din gena gyrB si se bazează pe prezența sau
absența regiunilor de diferențiere;testele sunt relativ uşor de efectuat, uşor de interpretat
ş i sunt rapide. Sensibilitatea acestor teste, comparativ cu sec- venţa 16S din gena ARNr
este de 97,9-99,3%, iar specificitatea de 92,4-99,4%
3. Tehnica de secvenţ iere a ADN-ului. Ea constă în efectuarea unei amplificări a ADN-
ului micobac- terian extras din cultura cu primeri genus-specifici, urmată de o
secvenţiere a ampliconilor într-un sis- tem automat. Identificarea ulterioară a tulpinii
mi- cobacteriene se face prin compararea secvenţei de nucleotide cu o bază cunoscută
de secvenţ iere.

Antibiograma
▪ Compara cresterea bacteriana de pe tuburile test, continand medicamente cu cea de pe
tuburile martor, dupa insamantarea unui esantion reprezentativ din populatia bacilara de
testat
Metode de diagnostic:
1. Metoda proportiilor (Canetti) – masoara proportia de bacili rezistenti din totalul
bacililor cultivati, la o concentratie data de antibiotic
2. Metoda concentratiilor absolute (Meissner) – se ia in considerare cea mai mica de
concentratie de substanta antituberculoasa care inhiba cresterea sau permite o crestere a
mai putin de 1% inoculul standardizat
3. Metoda raportului rezistentei (Mitchinson) – se compara pentru fiecare tulpina si
substanta antituberculoasa CMI cu CMI a tulpinii H37Rv
4. Metoda BACTEC - radiometrica

Teste pentru detectarea rapidă a rezisteței la medicația antituberculoasă

TB-MDR constituie actualmente o serioasă ameninţ are prin medicația deficitară si durata lungă
de tratament
M. tuberculosis devine rezistent la medicamentele antituberculoase î n urma mutaţ iilor ce apar
la nivelul locilor cromozomali. Mutaţiile punctiforme determină apariţia rezistenţei la un singur
medicament, iar acumularea mai multor astfel de mutaţii punctiforme duce la apariţ ia MDR-
TB ş i XDR-TB.

3
Apariţ ia metodelor moleculare este cea care a făcut posibilă scurtarea perioadei de detectare a
rezistenţ ei.
Mutaţ ia cea mai bine studiată este cea care determină rezistenţ a M. tuberculosis la rifampicina
(RIF). RIF este un antibiotic antimicobacterian ce face parte din terapia standard a TB. În 96%
din cazurile de rezistenţ ă la RIF, aceasta se datorează mutaţ iilor î n segmentul 81-pb al genei
rpoB ce codează subunitatea β a ARN polimerazei (9,20,21).
Rezistenţ a la izoniazidă (INH) este determinată de alterări în mai multe gene, dar mutaţ iile în
genele katG ş i inhA s-au găsit î n proporţ ie de 75-85% la tulpinile de M. tuberculosis rezistente
la INH.

GeneXpert MTB/RIF (Cepheid GeneXpert System, Sunnyvale) este un sistem î nchis, complet
automatizat, cu card, pentru detecţia MTC ş i a rezistenţ ei la RIF. Metoda constă î ntr-o reacţ ie
de PCR în timp real şi analiza fragmentelor genetice de amplificare. Rezultatul se obţine în
decurs de două ore ş i riscul de contaminare este foarte mic. Dezavantajul este dat de costul
ridicat al echipamentului ş i al cardurilor de unică folosinţ ă.
Prin comparaţie cu antibiograma fenotipică pentru detecţia rezistenţei la RIF, sensibilitatea
metodei este de 99,2%, până la 100% pentru prelevatele clinice pozitive la examinarea
microscopică şi de 72,5% până la 84,6% pentru prelevatele clinice negative la examinarea
microscopică, dar pozitive la cultură
OMS recomandă încă din anul 2010 utilizarea acestui sistem î n ţ ările cu endemie TB crescută
î n diagnosticul iniţ ial al suspecţilor de MDR-TB şi al celor cu asociere HIV/TB, ş tiut fiind că
î n 85% dintre cazuri rezistenţ a la RIF se asociază rezistenţ ei la INH.

Rezistența M.tuberculosis
▪ Sunt rezistenți față de acțiunea agenților fizici și chimici, datorită hidrofobiei peretelui
bacilar, bogat în lipide, precum și datorită grupării germenilor în gramezi
▪ Rezistența crește prin înglobarea germenilor în înveliș organic protector- sputa
▪ Sunt insensibili la frig - până la -180 c
▪ Foarte rezistenți la uscăciune,
▪ Pot fi omorâți prin expunere la lumină, căldură și substanțe antiseptice (15 min-24 ore)
▪ Agenți folosiți pentru sterilizare
1. Lumina solară și razele ultraviolete,
2. Caldura umedă - fierbere, autoclavare
3. Substanțe antiseptice - cloramina 5-10%, clorura de var 20%, hipoclorit de
sodiu 0,5%, fenol 0,5%,

Surse de infecție tuberculoasă

1. Bolnavii de tuberculoză pulmonară
2. Bolnavii de tuberculoză extrapulmonară activi cu leziuni deschise sau fistulizate -
urogenitale, osteo-articulare, ganglionare
3. Animale bolnave de tuberculoză - raspândesc infecția prin:
▪ Produsele lor naturale și patologice ( lapte, urină, fecale)
▪ Animale domestice bolnave -pisici, caini
▪ Animale de laborator

Mecanismele contaminării
1. Contaminarea prin inhalare
▪ Inhalare de particule bacilifere - sub 5 micrometri
▪ Picaturile Flugge - picaturi bacilifere - produse de tuse sau strănut, au diametru
mare, devin contaminante abia după deshidratare , fiecare picătura conținând 1-
2 bacili

4
 ▪ Picăturile bacilifere de spută se transformă prin uscare în praf bacilifer cu
însușiri contaminante, chiar la distanțe mari
2. Contaminarea digestivă - rară, este nevoie de un număr de 3.000 de ori mai mare de
germeni decât în infecția aeriană,
3. Contaminarea cutanată - la nivelul unorleziuni cutanate preexistente, sau
transplacentaă de la mama cu tuberculoză

Infecția tuberculosă în organism

▪ FEnomenul Koch
▪ Descris in 1891 - secvență de reacții produse de o nouă inoculare subcutanată de bacili
virulenți efectuată în alt punct al organismului, după constituirea leziunilor locale a
inoculării inițiale.
▪ Reacția secundară - apare rapid 24-48 ore, nodulul necrotic care a apare se elimină
rapid, infecția nu se propagă dincolo de locul inoculării inițiale, bacilii sunt distruși,
eliminați pe loc, ulcerația se vindecă spontan
▪ Concluzii - un organism infectat va induce o stare de imunitate față de bacilii
tubercuoși, cu limitarea unei infecții secundare celei inițiale

Mecanismul răspunsului imun

1. Răspunsul mediat celular în tuberculoză este rezultatul interacțiunii dintre macrofage și
subpopulația limfocitară T
1. Macrofagele au capacitatea de a fagocita și digera parțial germenii, transformându-i în
macromolecule antigenice - epitopi - care împreună cu complexul major de
histocompatibilitate sunt proiectate la supafața membranei celulare și “prezentate “
limfocitelor T
─ bacilii tuberculoși virulenți pot paraliza sau atenua mec antibacteriene celulare,
putând persista timp îndelungat în bacterioliză sau se pot multiplica distrugând
macrofagul.
2. Limfocitele T recunosc Ag prezentați
Reacția Ag- Receptor, este urmată de activarea celulelor implicate
─ Limfocitele T-CD4 -
0 Intervin in hipersensibilitatea întârzâiată - au rol în recrutarea
chemotactică de celule cu infiltrare celulară, se denumește “întârzâiată”
pentru că procesul atinge punctul maxim în 24 - 72 ore (ex. reacția la
tuberculina)
0 Induc imunitatea protectoare - prin elib de limfokine potențând
activitatea macrofagelor
0 Rod de memorie - supravegherea epidemiologică a gazdei
0 Induc răspuns imun umoral, prin activarea limfocitelor B, diferențierea
lor în plasmocite producătoare de Ag specifici
─ limfocitele T-CD8 - rol citotoxic - recunosc Ag și-l distrug prin eliberare de
limfotoxine
3. PMN - sunt atrase în focar și activate de macrofage, intervenția lor directă este
nesemnificativă
4. Raspunsul umoral
─ Cresc Ig M,G,A
─ Rol în serodiagnosticul infecției tuberculoase

Diagnosticul infectiei tuberculoase IDR

▪ Injectarea strict intradermica de antigene din MTB
▪ Denumite PPD = derivat de proteina purificata
0,1 ml=2 ui PPD
5
IGRA - Interferon Gamma Release Assays
▪ A inlocuit testul Mantoux în tarile dezvoltate
▪ Masoară eliberarea de INF-gama din celulele T sensibilizate de antigenele TB, la a
doua expunere
▪ Nu este influentat de vaccinare BCG
▪ NU diferentiaza infectia TB de boala TB
▪ NU ARE VALOARE DIAGNOSTICA LA COPILUL SUB 5 ANI

Imunitatea protectoare
▪ In țările cu endemie crescută imunitatea protectoare este asigurată prin vaccinarea BCG
la naștere
▪ Rezistența la infecție este o caracteristică de specie - ex M. Tuberculosis nu este
patogen pentru cal, capră, păsări domestice.
▪ In interiorul aceeleași specii sunt grade diferite de rezistență la infecție
─ La indivizii infectați, infecția se transformă în boală la mai puțin de 10%,
probabil cei deficitari sub aspectul apărării față de agresiunea microbiană (
capacitate fagocitară și bactericidă redusă a macrofagelor, sinteză redusă a
proteinelor HLA, chimitactism deficitar a macrofagelor, celule mononucleare cu
efect supresor asupra limf T, proporție redusă de limf T circulante)
─ Efectul favorabil al chioprofilaxiei cu HIN, este explicat prin corectarea unor
anomalii la nivelul celulelor T în sângele circulant, induse de excesul de
antigen.

6
Vaccinarea BCG
▪ Se folosesc culturi avirulente ale bacilului Calmette Guerin suspendat în soluţie de
glutamat de Na 1,5% cu o concentraţie de 4-5 milioane germeni (tulpina de
Mycobacterium bovis) vii la un vaccin;
▪ În trusa existentă acelaşi număr de fiole de diluant reprezentat de mediul Souton (aspect
limpede, incolor necesar reconstituirii suspensiei vaccinale); se păstrează la întuneric şi
la 40C
▪ Injectie intradermica în regiunea deltoidiana a bratului DREPT, la nivelul treimii
inferioare, deaspura insertiei muschiului deltoid
▪ Doze:
0,05 ml sub 1 an,
0,10 ml peste 1 an
▪ Se urmareste formarea unei papule

Vaccinarea BCG
In Romania
▪ Doar n.n. Varsta – 3-4 zile
▪ Fara testare tuberculinica
▪ La nou-nascut peste 2500 g o singura data!!! Fara RAPEL!

Exceptii
▪ NU a fost vaccinat in maternitate
▪ Recuperat vaccinal de catre medicul pneumolog pana la varsta de 3 luni, fara testare la
PPD
▪ Dupa 3 luni cu testare la PPD si istoricul de vaccinari,
▪ Recuperarea celor nevaccinati pana la 4 ani

NU se vaccinează
▪ Copilul HIV pozitiv
▪ Copilul nascut din mama HIV pozitiva se testeaza HIV la 2 luni de la nastere si se
vaccineaza daca este HIV negativ
▪ n.n. Sub 2500 g
▪ Imunizarea sa aiba loc o singura data!!!

Contraindicatii
1. Temporare – febra, lez tegumentare
2. Absolute –CSO, Imunosupresie, HIV

RAPI
1. RAPI locale
▪ Reactie la locul inocularii, care dureaza mai mult de 2 luni
▪ Limfadenopatia axilara, peste 1,5 cm, evolutiv ( fistula, abces, supuratie,
adenoflegmon, necroza) ; apare la 1-12 luni de la inoculare – in DREAPTA!!!
2. RAPI sistemice
▪ Infectie BCG diseminata – febra, scadere G, sindrom meningeal,
hepatosplenomegalie – confirmare prin izolare de tulpina cu Mycobacterium
bovis
▪ Osteita/osteomielita –la 8-16 luni dupa vaccinare
▪ Simptome respiratorii – tuse, dispnee, imagine radiologica anormala