BIOCHIMIE LP.

ANALIZA LIPIDELOR

Lipidele reprezintă o clasă heterogenă de biomolecule, cu proprietăţi fizico-

chimice şi biologice bine definite şi care au în comun proprietatea de a fi insolubile în apă.
Se găsesc în cantităţi mai mici în regnul vegetal comparative cu cel animal. În
ambele regnuri însă, lipidele cu rol de rezervă predomină cantitativ.
Clasificarea lipidelor se poate realiza după mai multe criterii. În figura 1 se
prezintă o schemă de clasificare a lipidelor, pe baza cumulării a trei criterii de comparaţie.
După cum se observă din această figură, indiferent de complexitatea lor
structurală, toate lipidele au drept componente comune un alcool şi unul sau mai
mulţi acizi graşi:
 acizii graşi din lipide sunt acizi organici monocarboxilici, de regulă cu număr par
de atomi de carbon (termenul “graşi”provine de la faptul că intră în constituţia
lipidelor). În regnul vegetal predomină acizii graşi alifatici cu catene aciclice
liniare, cu număr par de atomi de carbon nesaturaţi – tabelul 1.
 alcoolii din lipide sunt diferiţi ca structură, deşi nu sunt numeroşi ca număr.
Clasificarea alcoolilor din lipide se poate realiza după mai multe criterii. In figura
2 este redată clasificarea alcoolilor prin cumularea a trei criterii de
comparaţie.

Lipidele simple se mai numesc şi lipide neutre (deoarece fiind hidrofobe, nu au

sarcină electrică). Reprezintă esteri simpli ai acizilor graşi cu diferiţi alcooli (figura 1).

Lipidele complexe se mai numesc lipide polare (deoarece molecula lor conţine o
regiune cu caracter polar).
Clasificarea lipidelor complexe se poate realiza:
 după tipul alcoolului component (figura 1):
- lipide complexe cu glicerol drept alcool;
- lipide complexe cu sfingozină sau fitosfingozină drept alcool;
 după prezenţa fosforului în moleculă (figura 1):
- lipide complexe cu fosfor - glicerofosfolipide (acizi fosfatidici, lecitine, cefaline,
serinfosfatide, fosfatidilinozitil, ext);
- sfingolipide cu fosfor (sfingomieline);
- lipide complexe fără fosfor (ceramide, cerebrozide, gangliozide, sulfatide).

1
2
Tabelul 1 Exemple de acizi graşi vegetali cu catenă liniară
Acidul gras Denumire Simbolul
Butiric 4:0
Capronic 6:0
Caprilic 8:0
Pelargonic 9:0
Caprilic 10 : 0
Lauric 12 : 0
S Miristic 14 : 0
A Cu Palmitic 16 : 0
T Catenă Stearic 18 : 0
U liniară Arachic 20 : 0
R Behenic 22 : 0
A Lignoceric 24 : 0
T Cerotic 26 : 0
Montanic 28 : 0
Melisic 30 : 0
Cu catenă Izobutiric 4:0
ramificată Izovalerianic 5:0
Izomiristic 14 : 0
N Miristoleic 14 : 1 (9c)
E Palmitoleic 16 : 1 (9c)
S Oleic 18 : 1 (9c)
A Elaidic 18 : 1 (9t)
T Petroselinic 18 : 1 (6c)
U Linoleic (linolic) 18 : 2 (9,12c)
R Elacostearic 18 : 3 (9,11,13c)
A Linolenic 18 : 3 (9,12,15c)
T Arahidonic 20 : 4 (5,8,11,14c)

Clasificarea alcoolilor din lipide

3
 IDENTIFICAREA ŞI DIFERENŢIEREA LIPIDELOR

IDENTIFICAREA ACIZILOR GRAŞI

Acizii graşi reprezintă o componentă constantă a lipidelor.

Ei se găsesc fie liberi, fie legaţi esteric (în lipide neutre, glicerofosfolipide) sau
amidic (în sfingolipide).
Referitor la identificarea acizilor graşi, se utilizează două tipuri de teste:
 - teste generale de identificare a acizilor graşi – bazate pe saponificare sau pe
reacţia cu fosfovanilina;
 - teste de identificare a acizilor graşi nesaturaţi – testul cu iod.

IDENTIFICAREA ACIZILOR GRAŞI PRIN

REACŢIA CU FOSFOVANILINA

Principiu
Acizii graşi sunt trataţi cu H2SO4 şi apoi cu fosfovanilina, rezultând compuşi
coloraţi în roşu-violet.

O PO3H2
O CH3

CH=O
Fosfovanilina

Reactivi şi materiale
- reactiv fosfovanilinic – în balon cotat de 250 mL se trec cantitativ 0,495 g vanilină. Se
adaugă 50 mL H2O şi se agită până la dizolvare completă. Se adaugă 170 mL H3PO4
(=1,70). Se completează la semn cu apă distilată.
- eprubete, pipete.

Mod de lucru
Într-o eprubetă (notată cu nr.1) se pipetează 0,25 mL ulei de floarea soarelui, 1
mL H2SO4 concentrat (=1,84).
Într-o altă eprubetă (notată cu nr.2), se pipetează 0,5 mL reactiv fosfovanilinic. Se
adaugă 3 picături din eprubeta nr.1. Se observă apariţia culorii roşu-violet.

4
 IDENTIFICAREA ACIZILOR GRAŞI NESATURAŢIDENTIFICAREA
ACIZILOR GRAŞI NESATURAŢI PRIN REACŢIA CU IOD

Principiu
Acizii graşi nesaturaţi din lipide adiţionează iod la dublele legături:

R HC CH R` + I2 R HC CH R`
I I

Principiul metodei se bazează pe tratarea probei cu I2 şi apoi cu amidon. Se

adaugă întâi o cantitate mică de iod molecular. Amestecul de reacţie se va colora în roşu-
brun (culoarea iodului molecular). Prin încălzirea amestecului:
- dacă proba conţine lipide cu acizi graşi nesaturaţi, amestecul se va decolora
(deoarece I2 roşu-brun este consumat în adiţie şi deci soluţia se decolorează). Apoi,
adăugând amidon, amestecul nu se va colora in albastru (deoarece amidonul nu are I2
la dispoziţie şi deci nu se formează compuşi de incluziune);
- dacă proba nu conţine acizi graşi nesaturaţi, amestecul nu se va decolora la
încălzire (va rămâne roşu-brun). La adaos de amidon, apare coloraţia albastră
(deoarece I2 formează compuşi de incluziune albaştri cu amidonul).

Reactivi şi materiale
- ulei de floarea soarelui;
- reactiv Lugol 0,01N – în balon cotat de 1L se trec cantitativ 1,269 g I 2 şi 3 g KI şi
se dizolvă în puţină apă distilată. Se aduce la semn cu apă distilată.
- amidon 1% (proaspăt preparat);
- eprubete, pipete.

Mod de lucru
Într-o eprubetă se pipetează 2 mL ulei floarea soarelui şi 0,5 mL reactiv Lugol
0,01N. Agitare energică. Încălzire uşoară la flacăra unui bec de gaz. Amestecul roşu-brun
se decolorează (deoarece I2 se consumă în adiţie şi culoarea roşie-brună, caracteristică
pentru I2 dispare). Se adaugă o picătură de amidon 1%. Amestecul nu-şi schimbă
culoarea (deoarece nu există I2 în mediu, întrucât a fost consumat pentru adiţie).
Se mai adaugă 0,5 mL soluţie Lugol şi se încălzeşte din nou. Dacă amestecul nu
se decolorează (rămâne roşiatic), înseamnă că I2 a rămas în exces. Se adaugă din nou o
picătură de amidon. Amestecul se va colora în albastru.
Observaţie: dacă amestcul se decolorează, se repetă operaţia de adăugare 0,5 mL
reactiv Lugol 0,01N urmată de încălzire, până când amestecul nu se mai decolorează la
încălzire; numai în acest moment se adaugă amidonul 1%.

5
 IDENTIFICAREA STEROLILOR
PRIN REACŢIA LIEBERMANN-BURCHARD

Sub acţiunea acizilor minerali tari, are loc deshidratarea sterolului, urmată de
dimerizarea produsului de deshidratare şi sulfonarea dimerului. Dimerii sulfonaţi astfel
obţinuţi au culori diferite, funcţie de gradul de substituţie cu grupe –SO3H.
Exemplu: reacţia de formare a dimerului disulfonat al colesterolului este

+ 2H2SO4
- 4H2O

HO HO3S SO3H

Colesterol Dimer disulfonat

Observaţie: în cazul steridelor, aciodul mineral tare realizează şi hidroliza steridului

(cu formare de sterol şi acid gras); apoi, sterolul este deshidratat, dimerizat şi sulfonat.

Reactia sterolilor cu H2SO4 în prezenţa anhidridei acetice este denumită reacţia

Liebermann-Burchard şi constă în formarea de combinaţii între anhidrida acetică şi dimerii
sulfonaţi. Reacţia Liebermann-Burchard are grad mare de sensibilitate, motiv pentru care
este utilizată la determinarea cantitativă a sterolilor din probe biologice (exemplu: a
colesterolului din sânge).

Reactivi şi materiale
- colesterol 1% (în cloroform);
- anhidridă acetică;
- eprubete, pipete.

Mod de lucru
Într-o eprubetă se pipetează 1 mL colesterol 1% şi 0,5 mL anhidridă acetică. Se
adaugă încet pe pereţii eprubetei 0,5 mL H2SO4 concentrat (=1,84). Agitare. Amestecul
se va colora în roşu, cu viraj în albastru care în timp trece în verde.

6
 CONSTANTE ALE LIPIDELOR

Lipidele sunt caracterizate din punct de vedere fizico-chimic prin constante ca:
indice de iod (ce oferă indicaţii despre gradul de nesaturare al probei lipidice); indice de
peroxid (ce oferă indicaţii despre gradul de alterare al probei lipidice); indice de
saponificare (ce oferă indicaţii despre masa moleculară a lipidelor din probă); indice de
aciditate (ce oferă indicaţii despre cantitatea de acizi graşi liberi din probă); densitate,
punct de solidificare, etc.

DETERMINAREA INDICELUI DE PEROXID

Principiu
Sub acţiunea unor radicali liberi, lipidele cu acizi graşi nesaturaţi se oxidează în
poziţie alilică faţă de legăturile , formând radicali liberi
R CH CH CH2 R' + Y R CH CH CH R'
- HY
Acid gras nesaturat Radical liber Radical liber al
initiator acidului gras

care împreună cu O2 atmosferic trec în radicali peroxidici cu acţiune oxidantă

R CH CH CH R' + O2 R CH CH CH R'
Radical liber al O O
acidului gras Radical peroxidic

ce declanşează reacţii în lanţ, care duc în final la formarea de diverşi produşi toxici. Astfel:
 în cazul râncezirii hidrolitice: se vor forma în final epoxizi, aldehide, cetone;
 în cazul râncezirii oxidative:
- din acizii graşi cu mai mult de 12 atomi de carbon în moleculă, se formează în final
alcooli, aldehide, acizi volatili, etc, sau au loc policondensări cu formare de produşi de
polimerizare toxici pentru organism (unii chiar cancerigeni);
- din acizii graşi cu 6 ÷12 atomi de carbon în moleculă, se formează în final compuşi
carbonilici, cu miros neplăcut.

Gradul de râncezire al unei probe lipidice se poate estima prin indicele de peroxid
(numărul de miliechivalenţi peroxid din 1000 g probă).
Deci, valoarea indicelui de peroxid oferă indicaţii privind gradul de alterare al
probelor lipidice (valoarea indicelui de peroxid variază direct proporţional cu gradul de
alterare al probei lipidice).
Observaţie: indicele de peroxid este considerat numai o caracteristică
convenţională a alterării lipidelor (deoarece I2 format reacţionează şi cu aldehidele –
produşi finali ai râncezirii – determinând artefacte). Totuşi, el este curent utilizat în
controlul alimentelor, pentru depistarea probelor aflate în stadii incipiente de
alterare.

Principiul metodei se bazează pe introducerea în mediu a KI şi CH 3COOH,

pentru a se obţine HI

7
 2 KI + 2 CH3COOH 2 CH3COOK + 2 HI (I)
care prin reacţia cu peroxizii din proba lipidică generează I2
R CH CH CH R' + 2 HI R CH CH CH R' + I2 + H2O (II)
O OH OH
Peroxid

ce este titrat iodometric (cu Na2S2O3 în prezenţă de amidon):

I2 + 2 Na2S2O3 2 NaI + Na2S4O6 (III)

Reactivi şi materiale
- probă de analizat;
- amestec acid acetic glacial : cloroform (în raport volumetric 3 : 2);
- KI saturat;
- Na2S2O3 0,1N (sau 0,01N) cu factor calculat;
- amidon 1%;
- 2 pahare iodometrice de 100 mL;
- pipete, biuretă Pellet.

Mod de lucru
Se utilizează două pahare iodometrice de 100 mL şi se lucrează conform modului
de lucru prezentat în tabelul 2.

Tabelul 2. Mod de lucru pentru determinarea indicelui de peroxid

Reactivi Unitate de măsură P M

Probă g * (vezi subsol tabel) -
Acid acetic : cloroform mL 5 5
KI saturat mL 0,5 0,5
Agitare timp de 1 minut
Staţionare 10 minute la întuneric
H2O distilată mL 25 25
Titrare cu Na2S2O3 0,1N (pentru indice de peroxid ≥ 19) sau 0,01N (pentru indice de
peroxid ‹ 19), în prezenţa amidonului ca indicator. Se notează VM (volumul NaS2O3
utilizat la titrare martor) şi VP (volumul Na2S2O3 utilizat la titrare probă).

* Masa de probă luată în lucru este:

- 0,5 ÷ 0,8 g - pentru probe care în mod normal au indice de peroxid mai mare de 50;
- 0,8 ÷ 1,2 g - pentru probe care în mod normal au indice de peroxid cuprins între 31 şi 50 ;
- 1,2 ÷ 2 g - pentru probe care în mod normal au indice de peroxid cuprins între 19 şi 31 ;
- 2 ÷ 5 g - pentru probe care în mod normal au indice de peroxid mai mic decât 19.

Calcule

8
 NNa2S2O3 FNa2S2O3 VP - VM 1000
Ip =
m

în care:

N = concentraţia soluţiei de Na2S2O3 folosită la titrare;

F = factorul de corecţie al Na2S2O3;
VP = volumul de Na2S2O3 folosit la titrarea probei de analizat;
VM = volumul de Na2S2O3 folosit la titrarea probei martor;
m = masa de probă luată în lucru.