​DIAGNOSTIC DE LABORATOR IN INFECTIA CU HPV

Romania ocupa primul loc printre tarile UE, in ceea ce priveste incidenta si
mortalitatea prin cancer de col uterin.
Recomandarile OMS pentru preventia cancerului de col uterin cuprind : ​screening
citologic, screening virusologic, ​vaccinare anti HPV, educatie sexuala, renuntare la fumat.

Screeningul citologic ​se realizeaza prin ​testul Babes-Papanicolau (citologie

exfoliativa sau citologie cervico-vaginala).
Tehnicile moderne recomanda recoltare în mediu lichid, îmbogăţirea masei celulare
cu eliminarea detrisurilor şi a altor elemente ce pot interfera cu rezultatul, colorare automată,
analiză computerizată. ​Prin recoltarea in mediu lichid, întreaga probă recoltată este trimisă la
laborator pentru procesare, fără pierderea sau deteriorarea celulelor recoltate. Procesul de
prelucrare realizează separarea, reducerea detritusurilor (sânge, mucus) şi a celulelor
inflamatorii, cu conservarea caracteristicilor necesare pentru interpretare, permiţând o
vizualizare mai rapidă şi mai calitativă a celulelor relevante clinic. Procesarea şi colorarea
lamelor se realizează în sistem automat pentru asigurarea unei calităţi ridicate şi a unor
rezultate standardizate. Sistemul de analiză computerizată scanează toate frotiurile în mediu
lichid sau convenţionale şi ajută la îmbunătăţirea calităţii interpretării lor prin direcţionarea
atenţiei patologului asupra câmpurilor microscopice care cel mai probabil conţin anomalii,
prin clasificarea frotiurilor conform unui sistem de cuantificare a riscului bazat pe măsurarea a
sute de parametri celulari. Prin acest sistem se realizează o detecţie crescută a cazurilor
HSIL-pozitive atât pe frotiurile in mediu lichid, cât si pe preparatul convenţional, precum şi
îmbunataţirea detecţiei LSIL pe cele convenţionale.

Pregătire pacientă ​– cu 24-48 ore înainte de recoltarea probei trebuie să fie evitate:
raporturile sexuale, lavajul vaginal, alte tratamente intravaginale (geluri, creme, contraceptive,
dezinfectante, lubrifianţi) sau alte manevre intravaginale (tampoane intravaginale, explorare
vaginală). Se recomandată recoltarea în afara perioadei menstruale, în perioada de mijloc a
ciclului menstrual, iar în cazul infecţiilor, după tratarea acestora. În cazul procedurilor
medico-chirurgicale, se recomandă recoltarea înainte de examinarea manuală, înainte sau la
minim 24 ore postcolposcopie cu aplicaţie de acid acetic, la 3 luni de la recoltări anterioare,
iar în cazul electrorezecţiilor, polipectomiilor ca şi postpartum ar trebui să existe un interval
de 1.5-3 luni.

1
Produs recoltat ​– celule ale zonei exocervicale​, ​endocervicale şi de tranziţie dintre acestea
(​zona de transformare​). Zona de transformare reprezintă sediul cel mai frecvent al leziunilor
preneoplazice (turn-over crescut, expusă microtraumatismelor, susceptibilitate crescută la
HPV), acolo unde epiteliul scuamos al exocolului se continuă cu cel de tip glandular de la
nivel endocervical prin intermediul unei zone de metaplazie scuamoasă.

Recoltare –​ s​ e efectuează cu ajutorul periuţei cervicale cu cap detaşabil. Pentru recoltarea în

mediu lichid sunt recomandate dispozitivele din plastic. După recoltare, partea detaşabilă a
instrumentului este introdusă în flaconul cu mediu lichid, fără a se efectua alte manevre
asupra suprafeţei care conţine materialul celular.

Fig. 1. :​ Periuţa Cervex-Brush ​Fig. 2. :​ Flacon fixare şi transport

Instrucţiuni de recoltare – D​ upă vizualizarea colului uterin se inseră partea centrală a periuţei
în canalul endocervical astfel încât marginile mai scurte să vină în contact cu exocervixul. Cu
partea centrală fixă, se roteşte complet periuţa ​în sensul acelor de ceasornic de cinci ori
.Proba astfel recoltată trebuie imediat fixată pentru a se evita deteriorarea probei. În acest scop
se detaşează capătul periuţei care conţine materialul recoltat şi se introduce în recipientul cu
mediu lichid.

Fig. 3 :​ Detaşare capăt

recoltare

2
Se acoperă flaconul cu capacul, se înşurubează pentru a nu se varsa lichidul, se etichetează
imediat (sau înaintea recoltării probei) şi se transportă la laborator împreună cu fişa de însoţire
a pacientei în vederea prelucrării. La laborator este trimis flaconul în care se găsesc: lichidul
fixator şi capătul detaşabil al periuţei. După recoltare, proba cu materialul celular se poate
păstra 6 luni la 2-10°C sau 4 săptămâni la temperatura camerei (15-30°C).

Prelucrarea şi colorarea frotiurilor in mediu lichid se realizează în mod automat. Lamele sunt
scanate şi analizate prin sistemul computerizat care asistă medicul în elaborarea rezultatului.

Rezultate: ​În urma prelucrării şi examinării probei, rezultatul se elaborează conform

Sistemului de raportare a citologiei colului uterin Bethesda 2001 :

– modificări non-neoplazice – NILM;

– anomalii ale celulelor epiteliale scuamoase: ASC-US, ASC-H, LSIL, HSIL, SCC;

– anomalii ale celulelor glandulare-AGC, AIS, adenocarcinom.

Tehnica descrie anomalii ale celulelor epiteliale scuamoase si glandulare. In contextual

infectiei HPV sunt importante ​anomaliile scuamoase​, deoarece HPV are tropism pentru
celula epiteliala scuamoasa.

Celulele epiteliale scuamoase au un nucleu mic, citoplasma abundenta, avand un raport

nucleo-citoplasmatic subunitar.

Fig. 4. Aspect normal al celulelor scuamoase epiteliale

Anomalii scuamoase:

● Celule scuamoase atipice: –​ cu semnificaţie nedeterminată ​(ASC-US)​; nu se poate

exclude HSIL​ (​ ASC-H);

● Leziuni scuamoase intraepiteliale de grad scăzut (LSIL) ​– includ modificări induse de

HPV; displazia uşoară; CIN1 ;

3
 ● Leziuni scuamoase intraepiteliale de grad înalt (HSIL) ​– includ leziunile: CIN2
(displazia moderată) şi CIN3 ( displazia severă şi carcinomul in situ).
● Carcinom cu celule scuamoase

Rezultatul Pap testului trebuie interpretat prin corelarea cu datele clinice ale
pacientelor precum şi cu alte investigaţii efectuate. Astfel, în funcţie de suspiciunea ridicată în
urma Pap testului, prin integrarea în contextul clinic de către medicul curant, se pot formula
recomandările privitoare la conduita terapeutică şi diagnostică ce trebuie urmată.

In ceea ce priveste leziunile premaligne ​LSIL ​si ​HSIL ​interpretarile sunt urmatoarele:

LSIL: ​– sugerează modificări ale celulelor epiteliale scuamoase compatibile cu o leziune

intraepitelială de grad scăzut. Termenul de leziune intraepitelială se referă la faptul că
modificările celulare sunt strict localizate la nivelul epiteliului de acoperire al colului uterin,
fără a depăşi membrana bazală, deci fără potenţial invaziv. Într-o leziune de grad scăzut
modificările atipice sunt prezente doar la unele dintre celulele scuamoase.

– în această categorie sunt încadrate modificările celulare induse de infectia productive cu

HPV (celule cu nuclei picnotici si cu halou perinuclear – ​koilocite​) şi CIN1 (displazia
uşoară);

– reprezintă indicaţie pentru colposcopie cu biopsia leziunilor suspecte.

HSIL: ​– sugerează prezenţa unei leziuni intraepiteliale de grad înalt în care atipiile celulare
sunt mai mari şi afectează o proporţie mai mare din celulele epiteliale (celule mici, ratatinate,
anormale, cu nucleu dezvoltatat, citoplasma putina, raport nucleo-citoplasmatic supraunitar),
dar sunt încă limitate la epiteliul de acoperire al colului uterin fără a depăşi membrana bazală.

– apare ca urmare a persistenţei şi evoluţiei unei leziuni de etiologie HPV.

​– include modificări CIN2 (displazia moderată) şi CIN3 (displazia severă şi CIS).

– conform recomandărilor, necesită confirmare imediată prin ​colposcopie şi biopsie.​

Asociaţiile profesionale medicale din domeniu au elaborat o serie de recomandări

asupra atitudinii de urmat în funcţie de rezultatele Pap testului ​(Fig. 5 si Fig. 6).

4
Fig. 5. Recomandari LSIL

Fig. 6. Recomandari HSIL

5
Screening virusologic

Screeningul virusologic ​consta in detectia ADN/HPV si genotipare HPV (metoda de electie -

32 de genotipuri) .
Testele se pot realiza din leziune/raclat (regiunea anogenitală şi orală) sau din saliva :

Produs recoltat​ – pot fi recoltate cu ajutorul unui tampon uscat:

● probe de la nivelul leziunilor (verucilor) din zona anogenitală şi orală, atât la femei cât
şi la bărbaţi;
● probe obţinute prin raclajul tegumentului şi mucoasei care acoperă penisul (gland, şanţ
balano-prepuţial, corpul penisului);
● probe obţinute prin raclajul mucoasei anale;
● probe obţinute prin raclajul mucoasei bucale şi faringelui;
● salivă prin badijonarea cavităţii bucale.

La barbat, raclatul uretral se obţine cu ajutorul periuţei (vezi ​Fig. 7​). Se inserează
blând periuţa în uretră cca 2-4 cm, se roteşte 3-5 secunde, se retrage uşor şi se
introduce în tubul de transport; se va rupe tamponul în dreptul semnului astfel că
numai capătul tamponului va rămâne în tubul de transport ce va fi închis etanş cu
capacul.

Fig.7. Sistemul de recoltare a raclatului uretral

De asemenea pot fi trimise la laborator probe de ţesut proaspăt obţinute prin ​biopsia
leziunilor anogenitale, orale precum şi a papiloamelor laringiene; probele tisulare vor fi
transportate în recipiente cu ser fiziologic.

Detectia ADN/HPV se poate realiza prin ​teste​ ​moleculare de tip PCR.

Genotiparea HPV se poate realiza prin ​metoda LIPA (INNO-LiPA HPV)​, pentru
care exista truse comerciale, prin care sunt detectate 32 de genotipuri HPV (vezi ​Fig.8​).

6
 Fig. 8 Trusa INNO-LiPA HPV

Unele laboratoare folosesc metoda de multiplexare (​multiplex HPV PCR​) prin

tehnologia xMAP​ ​(Luminex), facand detectia mai multor genotipuri HPV. Sunt detectate
următoarele tipuri HPV cu risc crescut: 16, 18, 26*, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53*, 56, 58, 59,
66*, 68, 73, 82 (* riscul oncogen nu este clarificat). De asemenea pot fi determinate şi
următoarele tipuri HPV cu risc scăzut: 6, 11, 42, 43, 54, 57, 70, 72, 90.

Unele studii considera metoda multiplex HPV PCR mai sensibila in detectarea
ADN/HPV fata de genotiparea INNO-LiPA.

DETECTIE CALITATIVA HPV E6/E7 ARNm

Detectia calitativa a produsului de transcriptie E6-E7 pentru tipurile HPV cu risc crescut poate
sa evalueze specific riscul de progresie si de transformare maligna in special la femeile cu
citologie ASC-US sau LSIL, precum si la cele cu citologie normala si ADN-HPV pozitiv.
60-80% din numeroasele infectii HPV sunt tranzitorii, fiind eliminate spontan, in medie, in
decurs de 1 an, ceea ce face ca ​testul ARNm sa fie mai specific​ decat detectia ADN-ului
viral. Scopul este deci depistarea infectiilor active si potential persistente.

Produs recoltat​ – celule cervicale colectate in mediu lichid; recoltarea va fi efectuata

cu ajutorul periutei cervicale Cervex-Brush.

7
 Metoda​ – TMA (amplificare mediata de transcriptie). Testul identifica calitativ
productia oncoproteinelor E6 si E7 (factor primar in carcinogeneza) pentru 14 tipuri HPV cu
risc crescut: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 si 68.

TMA​ este o amplificarea izotermica, ce realizeaza amplificarea acidului nucleic

folosind 2 enzime: reverstranscriptaza si ARN polimeraza. Sub actiunea reverstranscriptazei
se creeaza o copie a ADN (cDNA) a acidului nucleic tinta. ARN polimeraza initiaza
transcrierea, sintetizandu-se ARN. O parte din ARN-ul nou sintetizat reintra in procesul TAM
si serveste ca matrita pentru noi cicluri de amplificare. Bilioane de copii pot fi generate in mai
putin de o ora. Tehnica are avantajul unor rezultate rapide (se produc 100-1000 de copii pe
ciclu de amplificare).