Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mureş
LP3 TD

Medii de cultură
Medii de cultură: complexe de substanţe care permit creşterea şi multiplicarea bacteriilor
(conţin substanţe nutritive, au pH corespunzător, umiditate corespunzătoare, sunt sterile,
atmosferă corespunzătoare - aero/anaerobioza)
Clasificare
După consistenţă:
- lichide (repartizate în eprubete)
- solide (geloza dreaptă, înclinată, în placă)
- semisolide (în eprubete)
După conţinutul de substanţe nutritive:
1. Medii naturale: conţin substanţe nutritive în forma lor naturală, fără a fi prelucrate în
prealabil: mediul cu bilă, mediul cu lapte, mediul cu ouă, ser de bou coagulat
2. Medii artificiale:
A) Medii de bază – pentru germeni nepretenţioşi
1) bulion simplu
2) geloza simplă – bulion + agar-agar (un extract de alge care asigură consistenţa
solidă, nu are proprietăţi nutritive)
B) Medii compuse
1) Medii complexe: mediu de bază + substanţe organice (sânge, ser, glucoză), sunt
folosite pentru cultivarea germenilor pretenţioşi (geloza sânge)
2) Medii de îmbogăţire: conţin agenţi selectivi, care inhibă dezvoltarea unor bacterii
şi permit creşterea altora
3) Medii speciale
- mediul Löwenstein-Jensen – pt. cultivarea micobacteriilor
- mediul Sabouraud – pt. cultivarea levurilor (Candida)
- mediul chocolat – neisserii, hemofili
4) Medii diferenţiale şi selectiv-diferenţiale: indicator de culoare, +/- substanţe
selective (inhibă creşterea unor bacterii) + zaharuri/polialcooli ; sunt folosite
pentru izolare şi identificare (geloza lactozată, TSI, SIM, Leifson, Chapman)

-1-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP3 TD

Caractere de cultură
- se studiază aspectul macroscopic al coloniilor bacteriene izolate

1. Coloniile de tip S (smooth)

➢ colonii rotunde
➢ margini regulate, bombate
➢ suprafaţa netedă, translucidă
➢ uşor detaşabile de pe mediu
➢ suspensionate în sol. saline produc suspensii omogene (ser fiziol.)
➢ reprezintă forma normală pentru majoritatea bacteriilor patogene, fiind dotată cu
calităţi optime de structură antigenică şi de patogenitate.
2. Coloniile de tip R (rough)

➢ colonii neregulate
➢ plate, uscate
➢ suprafaţa zbârcită
➢ aderente la mediu
➢ în soluţii saline produc suspensii neomogene (fenomenul de aglutinare spontană)
➢ este caracteristică, în general, bacteriilor nepatogene, cu 3 excepţii: Bacillus anthracis,
Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae
3. Forme intermediare: S-R , R-S
4. Coloniile de tip M

➢ aspect mucos
➢ foarte mari
➢ foarte bombate
➢ foarte lucioase
➢ cu tendinţă de curgere şi de confluare
➢ caracteristice bacteriilor care posedă capsulă (de ex. Klebsiella)
5. Coloniile pufoase
➢ mucegaiuri
6. Fenomen de căţărare

➢ Proteus: pe medii simple creşte sub forma unui văl care acoperă toată suprafaţa
mediului (nu apar colonii)

-2-
Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP3 TD

Caracterele biochimice şi de metabolism ale germenilor

- studiază metabolismul bacterian şi prezenţa diferitelor enzime specifice
- studierea acestor caractere permit încadrarea bacteriilor în specie
1. Metabolismul glucidic
- se studiază pe medii de cultură diferenţiale sau selectiv-diferenţiale
- urmăreşte descompunerea diferitelor zaharuri de către bacterii (glucoză, lactoză,
zaharoză, manitol)
- prin descompunerea zaharului de către bacterii mediul se acidifică, iar indicatorul
de culoare schimbă culoarea mediului de cultură
2. Metabolismul proteic
- se studiază pe medii de cultură diferenţiale
- prin descompunerea proteinelor de către bacterii se eliberează metaboliţi precum
indol, H2S sau amoniac
- indolul şi H2S se evidenţiază cu ajutorul unor hârtii de filtru îmbibate în reactiv
specific (reactiv Kovacs pentru indol şi săruri de Pb pentru H2S)
- prezenţa amoniacului se evidenţiază cu ajutorul unui indicator de culoare
3. Enzimele bacteriene
• hemolizinele
- enzime care lizează hematiile (alterează hemoglobina)
- prezenţa acestei enzime se evidenţiază pe mediu geloză-sânge
- principalele tipuri de hemoliză:
o alfa (α) - apare ca o zonă verzuie în jurul coloniei
o beta (β) - sângele este descompus total, în jurul coloniei este o zonă
clară, transparentă
• catalaza
- descompune apa oxigenată în apă şi oxigen
- oxigenul eliberat se evidenţiază prin formarea bulelor de gaz
• coagulaza
- determină coagularea plasmei recoltate pe anticoagulant
• oxidaza
- enzime oxidative
- acţionează asupra unor substanţe producând compuşi coloraţi

-3-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP3 TD

4. Alte teste
• Mobilitatea
- bacteriile flagelate sunt mobile şi migrează într-un mediu de cultură
semisolid, deviază de la locul de inoculare (traiectul de înţepătură)
• Mirosul
- la multe specii, coloniile au miros caracteristic
• Producerea de pigment
- Pigmenţi nedifuzibili – nu difuzează în mediu, vor colora doar colonia (ex.
Staphylococcus aureus – pigment auriu)
- Pigmenţi difuzibili – difuzează în mediu, colorează şi mediul (ex.
Pseudomonas – pigment verde).

Antibiograma

Antibiograma: testarea sensibilităţii in vitro a microorganismelor faţă de antibiotice

Antibiotice
• substanţe cu efect antibacterian produse de diferite microorganisme
• substanţe semisintetice, sintetice (chimioterapeutice)

Indicaţiile efectuării antibiogramei:

Necesitatea efectuării antibiogramei se decide de către medicul microbiolog în funcţie de:
- felul produsului din care s-a izolat germenul,
- specia bacteriană

Metode:
• metode calitative
o metoda difuzimetrică
• metode cantitative
o determinarea CMI (concentraţia minimă inhibitorie)

-4-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP3 TD

A. Metode calitative
Metoda difuzimetrică Kirby-Bauer
Se testează sensibilitatea unei tulpini bacteriene izolate în cultură pură şi identificate.
Este metoda utilizată de rutină pentru testarea susceptibilităţii izolatelor clinice.
Fiind o metodă calitativă, nu permite cuantificarea nivelului de rezistenţă, rezultatele fiind
exprimate în sensibil, intermediar sau rezistent:

În efectuarea şi interpretarea antibiogramelor calitative se urmăresc standarde internaţionale.

În prezent standardul acceptat în cele mai multe ţări (inclusiv România) este cel american,
elaborat de CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). La sfârşitul anului 2009 s-a
finalizat standardul european de către EUCAST (European Committee on Antibiotic
Susceptibility Testing), care are în vedere caracterisiticile tulpinilor circulante şi al infecţiilor
mai importante în Europa. Adoptarea acestui nou standard este în curs în România.

Realizarea antibiogramei conform standardului CLSI

1. Prepararea inoculului:
- se suspensionează 2-3 colonii izolate în ser fiziologic
- turbiditatea suspensiei se controlează nefelometric sau comparând cu tuburi etalon (conţin
suspensii de particule latex/sulfat de Ba având turbiditate determinată);
- se ajustează la 0.5 McFarland (1,5x108 CFU/ml).
2. Însămânţare:
- se alege un mediu corespunzător speciei bacteriene testate
- Mueller-Hinton pentru majoritatea bacteriilor
- Mueller-Hinton cu sânge pentru pretenţioşi (de ex. streptococi)
- medii speciale (pentru Haemophilus spp . neisserii)
- se introduce un tampon în suspensia bacteriană, se stoarce pentru îndepărtarea excesului
de lichid
- se şterge uniform toată suprafaţa mediului de 3x
3. Depunerea microcomprimatelor de antibiotice
- se aleg antibioticele care trebuie testate in funcţie de specia bacteriană testată si în funcţie
de localizarea infecţiei (anexa 1)
- se depun discurile de antibiotic la l .5 cm distanţă de marginea cutiei Petri si la 3 cm
distanţă unul faţă de celălalt (pot fi depuse max. 12 discuri)

-5-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP3 TD

- 15 min. temperatura camerei

4. Incubare
- în funcţie de specia bacteriană: în atmosfera obişnuită sau in atmosferă de CO2 (de ex.
streptococi, neisserii.)
- 35°C
- 16-18 ore (în cazul germenilor pretenţioşi până la 20-24 de ore)
- 24 de ore în cazul testării vancomicinei
5. Citire
- apare o cultură bacteriană confluentă, în jurul microcomprimatelor apar zone de inhibiţie
(lipsa creşterii bacteriene)
- se citesc diametrele zonelor de inhibiţie
- se compară diametrele citite cu diametre standard in funcţie de antibiotic, cantitatea de
antibiotic din comprimat, specia bacteriană testată

6. Interpretarea antibiogramelor:
- rezultatul se raportează: sensibil (S), intermediar sensibil (IS) sau rezistent (R) la
antibioticul testat
- fiecare rezultat de antibiogramă se interpretează!

-6-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP3 TD

B. Metode cantitative
- permit stabilirea concentraţiei minime inhibitorii (CMI) a unui antibiotic
CMI: cantitatea cea mai mică de antibiotic care inhibă complet multiplicarea unei bacterii
Este recomandată testarea cantitativă în următoarele situaţii:
cazuri clinice grave (septicemii, endocardite, meningite)
- rezultate incerte cu metoda difuzimetrică / sensibilitate nedeterminată
- situaţii speciale (de ex. testarea sensibilităţii pneumococului la penicilină printr-o
metodă cantitativă când diametrul zonei de inhibiţie la oxacilină este sub 20 mm)

-7-