TUBERCULOZA

DEFINITIE. ETIOLOGE

CLASIFICARE M.T - NOMENCLATURA

Ordinul ACTINOMYCETALES: structura citologica si citochimica similara bacteriilor tipice; au analogii

cu micetele filamentoase,

4 genuri: actinomycetaceae,

streptomycetaceae,

actinoplanaceae,

mycobacteriaceae,

Genul Mycobateriaceae: acidoacoolerezistenta, aspectul de bastonas ( myces=ciuperca, mucegai

bacterion=bastonas).

CLASIFICARE M.T - NOMENCLATURA

CLASIFICARE:

1. dupa patogenitate:

-patogene exclusiv pt om: M leprae

-patogene ptr.om, animale si pasari: Complexul M.t.( hominis, bovis,africanum),

-oportuniste majore: kansasii, avium,

-oportuniste minore: ranae, chelonei, terrae,

-saprofite: gordonae, flavescens, phei,

CLASIFICARE M.T - NOMENCLATURA

2. dupa viteza de crestere (dezvoltare de colonii):

-cu crestere lenta: strict patogene-compl.M.t,

xenopi, scrofulaceum,

smegmatis.

-M.leprae,

grupul fotocromogene-

kansasii, marinum, simiae, africanum,

grupul scotocromogene-scrofulaceum, szulgai, gordonae,

grupul necromogene-comp.avium intracelulcerans, xenopi,

-cu crestere rapida: grI-necromogene (fortuitum, chelonei),

gr.II-termofile ( smegmatis, phei),

gr.III-scotocromogene ( flavescens),

gr. IV-aletele ( vacae).

MORFOLOGIA MICROSCOPICA

MICROSCOPUL OPTIC:

-acido-alcoolorezistenta

- bastonase drepte sau incurbate cu capete rotunjite,

- lungime: 1-5,

- grosime: 0,2-0,4,

- necapsulate, nesporulate,imobili

- dispozitia in gramezi( un plus de rezistenta) sau filamente

MICROSCOPUL ELECTRONIC:

Perete celular tristratificat

Dublat pe fata interna de m.celulara,

Membranainvaginatii citoplasmatice cu rol de mitocondrii ( mezosomi),

Citoplasma: structura nucleara: AND, granulatii, vacuole, incluzii citoplasmatice.

DEZVOLTAREA PE MEDII DE CULTURA

PARAZITISM OBLIGATORIU: indiv.Genului M,

Cultivarea M. se face pe medii artificiale speciale: Lwenstein Jensen,

Compozitie: saruri minerale, glicerina (sursa de C), asparagina, clorura de amoniu ( sursa de N), ou,
amidon ( fecula de cartof), verde malachit ( indicator de pH),

Medii sintetice: Youmans, Sula, Dubos,

Conditii de dezvoltare: T=37,5-38C, pH=7-7,5, aerobioza obligatoriu,

DEZVOLTAREA PE MEDII DE CULTURA

Cresterea: lenta ( durata de viata a unei generatii=18-24 h),

Primele microcolonii punctiforme: 10-15 zile, maturarea dupa 3-4 saptamani (tipul bovin dupa 2 luni),

Aspectul coloniilor: IDENTIFICAREA MYCOBACTERIEI,

M.t.hominis: colonii, proeminete, verucoase, uscate, rugoase ( tip R= rough), culoare galbuie, dezvoltarea
este eugonica pe toata suprafata mediului ,

DEZVOLTAREA PE MEDII DE CULTURA

M.t.bovis: coloniile sunt netede, plate, culoare albicioasa, aspect cremos ( tip S- smouth), cresterea mai
putin luxurianta ( caracter disgonic), lent in 2 luni.

M.t.hominis sub actiunea medicamentelor antituberculoase: aspect disgonic,

Din cultura maturafortiu ( col. Z-N): prezenta cord factor asigura dispunerea in forma de benzi
serpuitoare ( substratul virulentei)

Absenta cord factor: M.t.bovis, hominis ( tratat cu medic) dispunere in gramezi compacte

STRUCTURA BIOCHIMICA

80-85%: apa, 15-20% reziduu uscat,

Saruri minerale, substante organice: lipide ( 30-40%), proteine, glucide,

Lipide: -caracterul .hidrofob al peretelui celular,

-fixeaza colorantii greu colorantii( fuxina fenicata, fluorcromii),

-acidoalcoolorezistenta la acizi, eteri, acetona, (in special prin ac micolic),

-etc.

STRUCTURA ANTIGENICA

ANTIGENE PASIVE incapabile sa produca Ac, dar actioneaza specific cu Ac

Proteinele: reprezentantul tuberculina,

IDR: dg. Infectiei tuberculoase,

Este netoxica ptr. Org. animal neinfectat,

Produce hipersensibilitate de tip intarziat la org. alergizate sp. Prin M.bacilare,

Glucidele: legate de prot, lipide, ac.nucleici,

Enzime: amilaze, transaminaze, ureaze, fosfolipaze, lipaze, catalaze.

ANTIGENE ADEVARATE produc Ac in vivo si reproduc leziuni anatomopatologice

REZISTENTA LA AG.FIZICI, CHIMICI

Rezistenta deosebita: lipide ( hidrofobia), gruparea in gramezi, invelis organic ( saliva),

Rezistenta la frig: - 180C, rezistenta la uscaciune,

DISTRUGERE:

1. UV: componenta UV a luminii albe mor in 10 min

2. caldura umeda: fierbere, autoclavare ( timp raportat la gradul de infectare), 2 min prin fierbere,

3. substante antiseptice: formol la 50 grade, cloramina 5-10%, lizol, detergenti cationici, clorura de
var20%,

4. medicamente antituberculoase ( bactericide ).

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

PRODUSUL PATOLOGIC:

1. EXPECTORATIA( sputa, saliva):

A. Recoltarea corecta: recipiente speciale, identitate,

Dimineata, a jeun, inainte de mancare, toaleta, inainte de inceperea tratamentului

Spontan: tuse
provocare a tusei: aerosoli, spalatura bronsica,

iritatia faringe, ef.fizic cu glota

inchisa,

Dirijat: endoscopie bronsica, sondaj gastric matinal,

Se recolteaza cel putin 3 esantioane din produsul patologic ( 10-12), in zile consecutiv,

Produsul patologic

2.Urina de dimineata

3.Sperma sau sange menstrual sau sange bioptic dupa chiuretaj

4.Lichid pleural

5.LCR

6. Aspirat de maduva osoasa

7. Lichid ascitic, pericardic

8. Fragmente de peritoneu, intestin , ganglioni

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

2. Transportul si prelucrarea: cat mai rapid ( pastrare la +4C, max.5 zile, transport in cutii spaciale-lemn,
metal) in laboratoare dotate in acest sens,

Decontaminare cu fosfat trisodic15%, antibiotice cu spectru larg

EVIDENTIEREA M.T. SE FACE PRIN: metode clasice (ex.M direct, dezvoltarea pe mediile de cultura,
inocularea la animalul de laborator), metode moderne de evidentiere a M.t.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

EXAMENUL MICROSCOPIC DIRECT:

Metoda simpla, rapida, ieftina, usor repetabila,fara aparatura sofisticata si personal superspecializat

DESCOPARA RAPID MARII ELIMINATORI DE B: criterii ptr. Inceperea traatmentului, izolarea

bolnavului,

Controlul sterilitatiiexpectoratiei

Metode: coloratia Ziehln Neelsen ( fuxina fenicata la cald, flurocromi la rece),

Sensibilitatea metodei creste prin: concentrarea produsului patologic ( centrifugare, flotatie), omogenizare
( fluidificare cu NaOH),

Limite: sensibilitate (nr. mare de bacili 5.000-10.000pe ml ),

Nu ofera inf. asupra viabilitatii bacililor, identitatii, sensibiltatii la medic.antitub, Interpretarea rezultatelor.

Examenul microscopic

Se bazeaza pe proprietatea comuna tuturor speciilor de mycobacterium-acidoalcoolorezistenta

In celula patrund greu coloranti ( se folosesc mordanti sau caldura), dar odata intrati pot fi greu de extra cu
ajutorul acizilor, alcoolului si a altor substante de decolorare

BAAR este o rezistenta la decolorare

persista si la cadavrele de bacili

Poate disparea prin procese enzimatice, tratamente tuberculostatice, UV

METODA ZIEHL-NEELSEN

Colorarea la cald a frotiului cu fuxina fenicata

Decolorare cu solutie alcoolica de acid clorhidric

Recolorare cu sol de albastru de metilen(verde malachit, acid picric)

Bacili rosii, subtiri, incurbati pe fond albastru (verde sau galben)

Tehnica Margineanu coloreaza la rece folosind xilol amestecat cu fuxina fenicata

Tehnica cu auramina-rodamina

Examenul microscopic in lumina fluorescenta

Colorare la rece cu ajutorul fluorocromilor ( auramina sau rodamina)

Decolorare cu solutie alcoolica de acid clorhidric

Recolorare cu permmmanganat de potasiu pentru diminuarea fluorescentei nespecifece

Examinare cu obiectiv uscat, la microscop dotat cu examinare pentru fluorescenta la care se anexeaza sursa
UV, in camera intunecata

Examinarea frotiurilor

La coloratiile obisnuite obiectiv de 100x si un ocular de 10x, in imersie cu ulei de cedru

Rezultatul examinariise exprima cantitativ9Nr de bacili pe 300, 100 sau 25 de campuri microscopice
examinate

BAAR/100 campuri-1-9 BAAR/100 camp

BAAR 1+

-10-99b/100 camp

BAAR2+

-1-10b/100camp

BAAR3+

>10b/100 campuri

Examinarea frotiurilor

In fluorescenta permite evidentierea bacililor cu un obiectiv slab maritor(25), cu obiectiv de 20x si ocular
de 10x, iar campul microscopului acopera o suprafata mai mare de aproape 16x, ceea ce scurteaza timpul
de examinare

Bacili portocalii stralucitori pe fond intunnecat

Examinarea frotiului 1-2 min permite parcurggerea a 30 de campuri, ce coincide cu examinarea a cel putin
300 de camopuri la M cu imersie

Rezultate 0 BAAR/30 camp negativ

1-5 bacili se noteza nr exact

Se imparte nr de BAAR la 10

Cauze de eroare fals pozitive

-particule alimentare, precipitate, zgarieturi

-precipitate de coloranti, granule de polen in sputa

- spori de Bacillus subtilis, nocardia, alte micabacterii saprofite

-transferul de pe o lama pozitiva pe una negativa la colorare, saubacili aderenti in uleiul de cedru

Erori fals negative

Recoltare incorecta a expectoratie ( saliva)

Expunerea directa la soare a produsului patologic sau dupa mai mult de o saptamana

Fixarea necorespunzatoare a frotiului

Supraincalzirea sau contact insuficient cu fuxina

Citirea prea rapida sau superficiala a lamelor( sau daltonismul examinatorului)

Dezvoltarea pe medii de cultura

Mycobacteriile sunt pretentioase, necesitand medii speciale complexe, aerobioza obligatorie, temperatura
optima de 37 grade si au dezvoltare lenta

Sursa de carbon( hidrocarbonate ca glucoza, glicerol)

Sursa de azot ( aminoacizi ca asparaginina, sau acidul glutamic, sau oua ser sau bulion de carne)

Ioni esentiali (Fierul si magneziu)

Verde malachit ca indicator de ph , bactericid si colorare de mediu facand mai vizibile coloniile de M

Mediu solid Lovenstein Jensen

Medii lichide Youmans, dubos, Middlebrook

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

EXAMINAREA PRIN CULTURI.

Insamantarea produsului patologic pe mediul de cultura,

Incubare la 37C,

Citirea tuburilor la 3-7-14 -21-30-45-60

Aspectul coloniilor mature: identificarea tipului ( tipizarea coloniei),

Avantaje: sensibilitate ( produse paucibacilare ce contin 10-100 bacili),

Procedeu selectiv de confirmare al dg. etiologic M.t,

Viabilitatea bacililor, identificarea b, sensibilitatea (ABG),

Dezavantaje: metoda laborioasa, costisitoare, latenta rezultatelor de 2 luni,

Micobacterii atipice

Fotocromogene nu se pigmenteaza la intuneric, la lumina determinand aparitia pigmentului galben

Scotocromogeni au colonii colorate in portocaliu atat la intuneric cat si la lumina

Nefotocromogeni absenta pigmentarii sau pigment gri sau crem neinfluentat de lumina

Micobacterii cu crestere rapida se dezvolta in 2-5 zile

Testul catalazei pozitive

si testul Konno negativ

Interpretarea rezultatelor la culturi

Absenta coloniilor - negativ

Mai putin de 30 de col -Nr exact/tub

30-100 coloni- cultura 1+

>100 colonii izolate -2+

Colonii confluente- 3+

Colonii de suprainfectie - cultura suprainfectata

Testarea sensibilitatii la tuberculostatice

Metode directe- insamantarea produselor patologice pe medii de cultura ce contin diferite concentratii de
tuberculostatice,

Metode indirecte-Din cultura pura izolata se inoculeaza pe tuburi cu tuberculostatice,

Avantajele si dezavantajele insamantarii prin culturi

AVANTAJE

Mult mai sensibila decat microscopi 10 bacili/ml sputa)

depisteaza asimptomatici

diferentierea de cadavrele de bacili

identificarea tipului de mycobacterii

prin inglobbarea tuberculostaticelor testarea sensibilitatii

DEZAVANNTAJEccostisitoare

rezultate finale peste 60 de zile (pentru medii solide).

DIAGNOSTIC POZITIV

METODE MODERNE DE DETECTIE A M.T.

1. Detectia rapida a diviziunii (BACTEC):

Principiu: masurarea CO2 marcat cu carbon radioactiv (14 C), eliberat in timpul multiplicarii in
cultura lichida ( sursa de C este ac. Palmitic marcat cu 14 ),

Metoda este sensibila ( detectarea unor cant. Minime de 14C, in timp scurt 10-21-28 zile.

MB Bact Utilizeaza mediile lichide si un sistem computerizat de citire pe principii colorimetrice, ceea ce
permite obbtinerea mai rapida a rezultatelor

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

INOCULAREA LA ANIM. DE LABORATOR:

Metoda sensibila, inocularea prod.patol. la animale de experienta ( cobai, iepure),

Metoda laborioasa, costisitoare,

Metoda de alternativa: nesigura la bolnavii tratati, utilizata in situatii de exceptie ( Tub. extrapulmonara)

Pentru cercetare

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

2. NAP-test.

Principiu: NAP: nitro acetil amino hidroxipropiofenon) inhiba dezvcltarea M.t. h. si b. dar nu si pe cele
atipice,

Dg.# cu M.atipice ( in 5 zile).

3. Cromatografia ac. Micolici.

Principiu: determinarea. profilului ac.micolici ( sunt specifici cant. Si calit. fiecarei specii ai g. My),

Identificarea in 24 h, doar M.t. in cultura pura.

4. Sonde genetice.

Principiu: separarea lant de AND sub act. Caldurii,

Fiecare lant, la temp. se reasociaza ( hibrideaza) specific cu lantul specific, fiecare secventa nucleotidica
cu secventa nucleotidica complementara,

Sonde genetice: secvente nucleotidice artificialese hibrideaza cu secv. Complementara,

Sondele permit in cateva ore identificarea col. M.t,

Un singur produs patologic.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

5. Detectarea ac. tuberculostearic.

Pricinpiu:prin cromatografie gazoasa ( spectrofotometrie de masa),

Ac. Micolic este prezent la toate M.t,

Evidentierea ac. Tuberculostearic indica o infectie tuberculoasa,

Metoda este sensibila, dar necesita un volum mare de munca si costisitoare.

6. Serodiagnosticul in detectarea antigenelor M.t.

Principiu: RFC, hemaglutinarea, hemagregarea, precipitarea si difuziunea in gel, imunofluorescenta,

ELISA,

Antic. Monoclonali si antig.recombinate,

Se apreciaza gradul de activitate a tuberculozei.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

7. amplificarea genomica prin reactia de polimerizare in lant ( PCR).

Principiu: AND polimeraza respons. de replicarea AND e capabila sa copieze in vitro secv. Sp. Ale AND cu
cond. De a dispune de tipare, ele insele specifice,

Utilizarea AND polimeraza sp-Taq polimeraza a carei termoresistenta ii confera rezistenta la temperaturi
inalte se poate amplifica pana la 1.000.000 X secventa de AND pe care dorim sa-l detectam,

Metoda: este laborioasa, costisitoare, prea sensibila ( uneori se inregistreaza o amplificare nespecifica sau
contaminarea prod. Patol. De catre AND exogen).