Examen practic MICRO

1. Antibiograma difuzimetrica. Principiu, interpretari

2. Exudatul faringian. Mod de recoltare, insamantare, interpretare
3. Urocultura. Mod de lucru, insamantare, interpretare
4. Coprocultura. Mod de lucru, insamantare, interpretare
5. Hemocultura. Mod de lucru, insamantare, interpretare
6. Diagnosticul de laborator in infectiile produse de Staphylococcus aureus
7. Diagnosticul de laborator in faringita streptococica
8. Diagnosticul de laborator in pneumonia streptococica
9. Diagnosticul de laborator in meningita bacteriana
10. Diagosticul de laborator in tuberculoza pulmonara
11. Caracterizati comportamentul biochimic al unei enterobacterii insamantate pe medii diferentiale

1. Antibiograma difuzimetrica
Definitia: Antibiograma = testarea in vitro a sensibilitatii unei tulpini bacteriene izolate dintr-un produs
patologic fata de diverse antibiotice
Principiul: antibiogramei consta in capacitatea antibioticelor de a impiedica multiplicarea bacteriana,
fenomen cunoscut ca efect bacteriostatic. Unele antibiotice au in anumite concentratii proprietatea de a omori
bacteriile: efect bactericid.
Scopul: antibiogramei urmareste urmatoarele 3 directii:
initierea terapiei antimicrobiene;
tintirea terapiei antimicrobiene;
monitorizarea terapiei antimicrobiene.
Terapia antimicrobiana posibila:
necesita diferentierea infectiei bacteriene de infectia virala;
microorganismul infectant a fost stabilit prin rationament clinico-epidemiologic;
depistarea microorganismului infectant prin metode rapide;
necesita izolarea in cultura pura, identificarea microorganismului infectant si testarea sensibilitatii
la antibiotic.
Relatia microb-medicament este definita de:
in vitro
concentratia minina inhibitorie (CMI) = cea mai mica concentratie de antibiotic care inhiba
cresterea bacteriana; este o valoare static;
concentratia minima bactericida (CMB) = cea mai mica concentratie de antibiotic cu efect
bactericid (care omoara 99.9% din populatia bacteriana);
in vivo
concentratia terapeutica = concentratia de medicament antimicrobian activ in focarul de
infectie.
Clasificarea microorganismelor in categorii de sensibilitate
1. sensibil
CMI = de 2-4 ori mai < decat nivelul antibioticului in ser (umori) in conditiile unor doze unice sau repetate
normale;

< 1 => efect terapeutic posibil

2. rezistent : CMI > nivelul antibioticului in ser (umori);

> 1 => efect terapeutic neverosimil

3. intermediar: CMI apropiat de nivelul antibioticului in ser (umori);

= 1=> efect terapeutic imprevizibil

Metode de testare a sensibilitatii la antibiotice:
metoda difuzimetric (metoda calitativa);
determinarea concentraiei minime inhibitorii (metoda cantitativa).
1
 Metoda difuzimetrica (Kirby-Bauer)
Metoda are la baza proprietatea subsantelor antimicrobiene de a difuca intr-un mediu de cultura solid pe
care se insamanteaza cultura bacteriana de testat.
Este obligatoriu ca inoculul sa fie in cultura pura, cu o conc. apropiata de 0,5 pe scala MacFarland.
Antibioticele pt antibiograma se gasesc sub forma de microcomprimate cu diametrul de 6mm, ce contin o
cantitate prestabilita de antibiotic.

Principiu:
- se efectueaza pe medii solide, in placi Petri, utilizand ca mediu de cultura:
pentru organisme aerobe (non-fastidioase) - mediul Muller-Hinton: 30% infuzie de vita, 1.75%
caseina hidrolizata, 0,15% agar; pH ajustat la neutru, la o temperatura de 25 grade C
pt organisme anaerobe (fastidioase) - mediul Wilkins - Chalgren: 5% sange de cal defibrinat, 20
mg/L NAD suplimentat cu acizi isosaccharinici
* suplimentele nutritive influenteaza antibiograma - glucoza creste zonele de inhibitie la penicilina,
ampicilina dar nu modifica CMI; sangele reduce zonele de inhibitie la aminoglicozide, sulfamide,
trimetoprim;
- se prepara inoculul: se suspensioneaza 2-3 colonii, in solutie salina sterila si se etaloneaza (turbiditatea
suspensiei se controleaza si se ajusteaza la 0.5 McFarland)
- se insamanteaza mediul utilizand un tampon steril inmuiat in suspensia bacteriana, sters prin presare pe
peretele interior al tubului si apoi trecut pe toata suprafata mediului din placa Petri
- se asteapta absorbtia inoculului (3-5 min)
- se depun discurile cu substante antibiotice la distanta de min 15 mm de marginea placii Petri si 30 mm
intre centree a doua discuri vecine folosind o pensa, sau mai bine un dispensor automat de disccuri
- se pune la incubat timp de 16-18 h, la o temperatura de 35-37 grade C, intr-o atm a carei parametri difera
in functie de specie
- se va produce: difuzia antibioticului si cresterea bacteriei
- in locul in care antibioticul realizeaza concentratii >CMI, bacteria nu creste; circumferinta zonei de
inhibitie: locul geometric al punctelor in care antibioticul a atins CMI in momentul critic al culturii (faza de
lag + primele 2-4 generatii)
- diametrul zonei de inhibitie variaza invers proportional cu CMI
* Nu permite cuantificarea nivelului de rezistenta, rezultatele fiind exprimate in sensibil, intermediar sau
rezistent.

Interpretare:
- se face in functie de diametrul zonei de inhibitie masurat cu rigla, incluzand si diametrul
microcomprimatului
- valorile citite (in mm) se compara cu diametrele din standarde (EUCAST/CLSI), tulpina bacteriana
apreciindu-se ca sensibila, intermediara sau rezistenta la antibioticul respectiv

2. Exudatul faringian
Exudatul faringian se recolteaz n cazul unei faringite sau faringo-amigdalite.
Recoltare:
1. Identificarea probei nume, prenume
2. Se desface tubul (steril) cu capac rodat i se extrage tamponul
3. Se introduce in caviatea bucala, apoi n buco-faringe, fr s atingem limba sau mucoasa jugal. Se
poate folosi o spatul pentru limb.
4. Se observ o zona eritematoas, cu edem i depozite purulente/pustule.
5. Prin micri de rotaie blnde, se ncarc tamponul de exudat cu o cantitate suficient de produs.
6. Se retrage tamponul de exudat cu grija, din nou fr a atinge limba sau mucoasa jugal (pentru a nu
contamina cu flora rezident).
!!! Dimineata pe nemancate/la 3 ore dupa masa(pt a se reface flora)
! se iau 2 tampoane de exudat
Transport n maxim 2 ore, iar dac se depete acest timp, se folosesc medii de conservare i transport.
Frotiul se face numai in cazul faringitei de tip asociaie fuzo-spirilar.

2
 nsmnare:
Prima dat se va efectua cultura deoarece mediul de cultura este steril. Se va face pe mediu selectiv, care
inhiba alte microorganisme (cristal violet inhiba Staphylococcus i las Streptococcus s se dezvolte pe mediu),
apoi pe mediu de cultur electiv agar snge n pentagon deschis pentru a obine colonii izolate pure.
Temperatura de incubare=35oC cu 5% CO2 (microaerofilie), 18-20h, citire a doua zi.

3. Urocultura
Tractul urinar este in mod normal necontaminat, in schimb uretra distala poate prezenta o flora microbiana
variata, fiind contaminata cu microorganisme provenite din zona geitala/ de la niv colonului.
Dintre aceste microorganisme putem izola de la nivelul uretrei distale stafilococi coagulazonegativi ,E. coli,
Klebsiella spp., Proteus spp., bacili difteromorfi, enterococi, streptococi, neisserii saprofite, Mycoplasma
spp.,Ureplasma spp. sau Fusobacterium spp. La acelai nivel ar putea fi identificate i tulpini de Candida
spp.,Clostridium spp., diferii coci gram pozitivi sau gram negativi anaerobi, lactobabili, mycobacterii
netuberculoase, stafilococi aurii etc. Colonizarea microbian a uretrei distale explic motivul pentru care n
marea majoritate a cazurilor vom realiza urocultura cantitativ.

Ageni etiologici:
Microorganismele mai frecvent implicate n producerea unei infecii a tractului urinar sunt
n ordine descresctoare
E. coli este cel mai frecvent agent etiologic al ITU (peste 80%); cel mai frecvent se izoleaza
serogrupurile O1, O2, O4, O6, O16, O18 si O75
Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca
Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes
Pseudomonas aeruginosa
Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Citrobacter diversus
Enterococcus faecalis
stafilococii coagulazo-negativi
Mai rar, n ordine descresctoare etiologia ITU poate fi reprezentat de Staphylococcus aureus,
Acinetobacter calcoaceticus, streptococi beta-hemolitici din grupele A, B, C sau G, Morganella morgani, Candida
albicans, Salmonella spp., Corynebacterium urealyticum.

Realizarea uroculturii
1. Recoltarea i transportul produsului patologic
- se foloseste urina matinala, ajeun, din jet mijlociu curat, recoltata in urocultor
- in cazul in care nu se poate recolta prima urina de dimineata trebuie asteptat pt recoltare 3-4 ore dupa
mictiune( urina trebuie sa se acumuleze in vezica urinara pentru a se inmulti bacteriile)
- recoltarea se face dupa spalarea in prealabil cu apa si sapun a zonei genitale.
Dupa recoltare, in cazul in care urina nu este prelucrata imediat, produsul patologic trebuie mentinut la T
frigiderului, iar transportul trebuie realizat la 4 grade C ( 20-50 mL de urina intr-un recipient STERIL-urocultor)

2. Examinarea macroscopica si microscopica a produsului

- produsul patologic poate fi tulbure , opalescent, poate prezenta un miros specific etc
- atunci cand produsul recoltat este reprezentat de sange, urina sau materii fecale de regula NU se realizeaza
frotiuri fixate si colorate
- in cazul unei infectii urinare se va realiza un sediment urinar (dup centrifugarea urinei)=>
hemocitometru; sedimentul se va examina ntre lam i lamel n vederea aprecierii numrului de leucocite pe
cmp microscopic (pt a ne da seama ca nu este vorba de contaminarea probei)

3. Cultivarea pe medii de cultura

Putem utiliza medii diferite:
-Mac Conkey
-geloza sange
-agat lactozat
Pt cultivare se foloseste o ansa calibrata de 1ul cu aj careia prelevam urina prin atingerea suprafetei pp dupa
omogenizare;
3
 nsmnm iniial un striu pe centrul jumtii de plac dup care ntindem p.p. n striuri paralele,
perpendiculare pe primul striu. n final fr sterilizm ansa ntindem p.p n striuri paralele n unghi de 45 fa de
striurile precedente. Dup o incubare de 18-24 ore la 35-37C, nmulind cu 1000 numrul de UFC dezvoltate,
putem aprecia care este numrul de bacterii / ml de urin.
Frecvent este utilizat nsmnarea urinei dup diluare (ex. 1/100) cu ajutorul pipetei gradate.
nsmnm de ex. pe o plac cu mediu MacConkey 0,1 ml de urin diluat 1/100, incubm n condiiile
cunoscute i dup apariia coloniilor calculm numrul de bacterii / ml prin nmulirea numrului de UFC
inversul diluie inversul volumului nsmnat.

4. Interpretarea rezultatelor uroculturii cantitative

Izolarea unei bacterii cu o concentraie de peste 105 UFC / ml de urin confirm ITU la brbat sau la femeie
(cu simptome caracteristice) n cazul c pacienta este asimtomatic, certificarea ITU este dat de izolarea
aceleai bacterii n a doua prob de urin
Izolarea a dou bacterii diferite, fiecare cu o concentraie de peste 105 / ml de urin,
impune repetarea recoltrii i nsmnrii n cazul n care rezultatul este similar i pentru a doua prob de
urin este posibil ITU mixt (n caz contrar este o foarte probabil contaminare)
Izolarea a trei bacterii diferite, chiar i n cazul n care concentraiile pentru fiecare n
parte depesc 105 / ml de urin, impune repetarea analizei extrem de probabil este vorba de o
contaminare sau de un p.p. recoltat cu mai mult timp n urm i meninut la temperatura camerei i nu la frigider
Izolarea unei bacterii cu o concentraie de 104 / ml de urin conduce la recomandarea
repetrii analizei (exist i unele excepii, n care rezultatul este considerat pozitiv, spre ex. Pentru levuri n
concentraie de peste 104 / ml de urin, stafilococii coagulazonegativi n concentraie depeste 5104 / ml de
urin etc)
Lipsa multiplicrii bacteriene sau dezvoltarea de UFC n concentraie de 103 / ml de urin
reprezint o urocultur negativ

4. Identificarea microorganismului
-se face pe baza mai multor caractere:
caractere morfotinctoriale
- Enterobacteriile (E. coli, Klebsiella, Proteus) bacili gram-negativi, scurti, cu capete rotunjite, nesporulati,
aerobi
- stafilococii coagulazo-negativi: coci gram pozitivi, aerobi
caractere de cultura
- dupa incubarea pe mediul lactozat:
lactozo +: bacilii care fermenteaza glucoza ( E. coli, Klebsiella, Enterobacter; formeaza colonii roz-mov
intens pe mediu
lactozo-negativi: Salmonella, Shigella, Yersinia, Proteus; care formeaza colonii transparente
! In cazul cocilor NU se pune vorba de lactozo-pozitiv sau negativ. Pe lactoza, coloniile produse de cocii ce
fermenteaza glucoza sunt galbene, daca nu, sunt de culoarea mediului.
caractere enzimatice
caractere biochimice (vezi mai jos)

5. Antibiograma

4. Coprocultura
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un important numr de genuri de microorganisme semnificative din
punct de vedere medical (28) i numeroase specii (peste 100, n cazul n care nu lum n considerare clasificarea
genului Salmonella n peste 2000 de specii).
Dintre genurile incluse n aceast vast familie, vom aminti urmtoarele: Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Klebsiella. D.p.d.v al patogenitatii, germenii din aceasta familie se impart in:
oportunist/ conditionat patogen: E. Coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus
inalt patogeni: Salmonella, Shigella, Yersinia
Enterobacteriile sunt bacili gram negativi, cu capete rotunjite, care nu se pot diferenia prin microscopie
optic, mobili cu cili peritrichi (ex. Salmonella spp.,Proteus spp.), sau imobili (ex. Shigella, Yersinia, Klebsiella),
nesporulai unele specii prezint capsul (ex.Klebsiella pneumoniae).

4
 Coprocultura - Boala diareica acuta(BDA)
n multe dintre infeciile produse de enterobacterii, care se manifest prin sindrom diareic utilizm
coprocultura.
Sindromul diareic include eliminarea a peste 3 scaune n 24 de ore iar scaunele au consistena diminuat
(pn la emiterea unor scaune apoase, cu pierderea a pn la 2030 litri / zi n holer).

Ageni etiologici
Boala diareic acut poate fi de etiologie infecioas i neinfecioas.
Etiologia bacterian include:
- Salmonella 99,5% din tulpinile de Salmonella implicate in patologia umana apartin speciei S. enterica
subsp. Enterica; exista 3 tipuri clinice de salmoneloze descrise la om:
salmonelozele sistemice/febrele enterice (febra tifoida si paratifoida) sunt determinate de
S. Typhi si mai rar de S. Paratyphi
salmonelozele enterice/toxiinfectiile alimentare (gastroenterite acute) sunt cauzte de S.
Enteritidis si S. Typhimurium
septicemii salmonelozice
- Shigella sunt agentii etiologici ai dizenteriei bacteriene
- Yersinia boala diareica este produsa de specia Y. enterocolitica
- Escherichia coli; infectiile enterale sunt produse de 6 patotipuri implicate in boala diareica acuta
(BDA):
EPEC / enteropatogen
ETEC / enterotoxigen
EHEC /enterohemoragic
EIEC / enteroinvaziv
EAEC / enteroagregant
DAEC / aderent difuz
- Klebsiella spp.
- alte enterobacterii (Yersinia enterocolitica, Citrobacter spp., Proteus spp. etc)
- Vibrio cholerae i ali vibrioni
- Bacillus cereus
- Campylobacter jejuni
- Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum
- Staphylococcus aureus etc
Etiologia fungic include:
- Candida albicans (la pacieni cu SIDA) etc

Indicaiile coproculturii n bacteriologie

atunci cnd este suspicionat o infecie cu Shigella spp., Vibrio cholerae, E. coli (tipurile patogene),
Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica sau Salmonella spp. n special la pacieni cu vrste extreme sau
imunodepresie
dup circa 1 sptmn de la debutul febrei tifoide etc
atunci cnd BDA prezint riscul extinderii la nivelul unei colectiviti (cree, grdinie, tabere, uniti de
alimentaie public, staii de distribuie a apei potabile etc)
atunci cnd BDA apare la pacieni care au fost tratai cu antibiotice iar sindromul diareic persist i dup
ntreruperea antibioticoterapiei
atunci cnd sindromul diareic persist mai mult de o sptmn sau are loc o recdere
n scopul verificrii strii de sntate a persoanelor care lucreaz n uniti de alimentaie public (conform
normativelor stabilite de ctre ministerul sntii)
n scop de cercetare etc.

1. Recoltarea i transportul materiilor fecale

- recoltarea p.p. trebuie s se realizeze nainte de administrarea de medicamente antimicrobiene. Se pot
recolta i examina:
scaunul emis spontan reprezint produsul patologic utilizat cel mai frecvent.
Defecaia are loc ntr-un recipient de carton sau ntr-un container din material plastic de unic
ntrebuinare(care poate fi apoi decontaminat i eliminat fr probleme). n acelai timp efectum i examinarea

5
macroscopic a p.p. din punctul de vedere al mirosului, culorii sau aspectului. Utilizm pentru prelevare linguria
recoltorului alegnd poriuni care permit cu o mai mare ans izolarea agentului patogen (fragmente
mucopurulente, poriuni cu snge, flocoane riziforme etc) sau poriuni diferite dintr-un scaun n care nu se
remarc aspectele menionate anterior. Prelevm o cantitate de aproximativ 1 gram pe care o suspensionm n
mediul de transport (minim 2 ml n cazul scaunelor apoase).
tamponul rectal este recomandat n cazul unei infecii cronice cu Shigella spp., atunci cnd
suspicionm portajul de Shigella spp. sau Salmonella spp. Tamponul steril se introduce cu blndee i
se preleveaz secreiile de la nivelul mucoasei rectale, prin rotire, pentru a recolta material din
criptele rectale. Apoi introducem tamponul n mediul de transport.
n cazul n care p.p. nu poate fi prelucrat imediat sau n maxim 1 or, utilizm un mediu de
transport, transportul la rece (+4 C) sau transportul n mediu de transport meninut la 4 C. Cel maifrecvent
utilizm mediul CaryBlair. Acest mediu asigur supravieuirea enterobacteriilor patogene timp de 24-48 de ore,
inhibnd n acelai timp multiplicarea florei de asociaie. Atunci cnd este suspicionat infecia cu V. cholerae,
apa peptonat alcalin servete n acelai timp drept mediu de transport i mediu de mbogire.

2. Examinarea macroscopica si microscopica a produsului

- atunci cand produsul recoltat este reprezentat de sange, urina sau materii fecale de regula NU se realizeaza
frotiuri fixate si colorate
- n cazul materiilor fecale, se va face o coprocitogram, un preparat proaspt (nativ) ntre lam i lamel,
cutndu-se n special prezena leucocitelor;

3. Cultivarea pe medii de cultura

- enterobacteriile sunt aerobe, facultativ aerobe, nepretentioase nutritiv; se dezvolta cu usurinta atat pe
meiile uzuale (bulion, geloza, geloza-sange), cat si pe mediile selective lactozate (Mac Conkey, Hektoen agar,
ADCL, XDL)
- pentru produsele provenite din sedii contaminate (materiile fecale, sputa), in vederea diferentierii lactozo-
pozitivilor de lactozo-negativi, se folosesc mediile selective => agar Mac Conkey - indicator rosu:
lactozo-pozitivi: E. coli, Klebsiella, Enterobacter; formeaza colonii roz-mov intens pe mediu
lactozo-negativi: Salmonella, Shigella, Yersinia, Proteus; care formeaza colonii transparente
! In cazul cocilor NU se pune vorba de lactozo-pozitiv sau negativ. Pe lactoza, coloniile produse de cocii ce
fermenteaza glucoza sunt galbene, daca nu, sunt de culoarea mediului.
a) In cazul EPEC (E. coli enteropatogen)
- se folseste mediul diferential selectiv lactozat
-incubare aeroba => colonii S lactozo-pozitive (mov intens cu halou de precipitat)
- se repica 10 colonii suspecte pt a forma subcultura pe mediu lactozat; din fiecare colonie suspecta se
repica in pentagon deschis => se obtine cultura pura pt a face identificarea pe mediul lactozat
b) In cazul Salmonella
- se foloseste mediul de imbogatire: bulion cu selenit acid de Na; dupa 6-8 h incubare => turbiditate
crescuta
- in acelasi timp se insamnateaza si un mediu moderat selectiv diferential : Hektoen (pe el poate creste si
E.coli nepatogen lactozo+)
- Hektoen este un mediu lactozat ce contine ca indicator albastru de bromtiol si contine tiosulfat de Na
- pe mediul de bulion selenit => doar Salmonella cu colonii de culoare roz-mov
- pe mediul Hektoen => colonii lactozo negative, cu centrul coloniei nergu datorita producerii de H2S
-se va repiza pe lactoza pt a obtine cultura pura de identificat
c) In cazul Shigella
- se insamanteaza pe agar moderat selectiv diferential Hektoen => colonii lactozo-neg de culoare
mediului; colonii S
- se repica pe mediu lactozat
d) Yersinia
- se insamanteaza pe mediul CIN(cefsulodin-irgasan-novoniocina) => colonii semi-transparente, cu
marginile clare si centrul rosu

4. Identificarea microorganismului
- pe baza mai multor caractere:
caractere morfotinctoriale
caractere de cultura

6
 caractere enzimatice
Testul catalazei: pozitiv pentru toate enterobacteriile
Testul oxidazei: negativi (testul oxidazei permite diferentierea enterobacteriilor de alti bacili gram-neg)
- toate enterobacteriile fermenteaza glucoza si reduc nitratii la nitriti
caractere biochimice permit incadrarea in gen si specie
a) EPEC:
TSI - glucozo +, putin gaz, fara H2S, panta lactozo + (din 100 de tulpini E. coli, 95 fermenteaza lactoza,
iar 5 nu)
MIU - M+, uree -, indol +
Citrat negativ
b) Salmonella:
TSI - glucozo +, putin gaz, coloana cu mult H2S, panta lactozo -
MIU - M+, uree -, indol -
Citrat pozitiv
c)Shigella:
TSI: glucozo +, nu produc gaz, nu produc H2S, lactozo
MIU: M-, I-, U-
Citrat
b) Yersinia:
TSI: glucozo +, lactozo -
MIU: M+, uree+
Ureaza +
caractere antigenice
a) EPEC
Identificarea serologica - reactia de aglutinare directa pe lama
- 1 pic de ser fiziologic
- 1 pic de reactiv de lucru cu Ac anti-grup O
- se preleva cu ansa dispozabila o cantitate mica de subcultura
- se frotiaza, se omogenizeaza => suspenise tulbure
=> aparitia grunjilor, suspenisa devine clara, complexe Ag-Ac TEST POZITIV
- trebuie sa existe si un test de control, martor negativ, pt ca exista riscul ca o cultura sa autoaglutineze
b) Salmonella
- pe lama curata punem o picatura de ser fiziologic
- punem si ser polivalent : ABDEL
- daca imi aglutineaza cu ABDEL facem si cu ser monovalent: BO, DO + Vi (Ag de suprafata capsular K la S.
Typhy, S. Paratyphy C si S. Dublin se numeste AgVi), CO

5. Antibiograma
- EUCAST discuri

5. Hemocultura
- sangele este in mod normal steril
- bacteriemia reprezinta prezenta bacteriilor in torentul circulator si poate fi:
tranzitorie
intermitenta (ex: exista o infectie de la care din cand in cand se descarca bacterii in sange)
permanenta = septicemie ( infectia se raspandeste si se afla bacterii permanent in sange)
- dintre agenii etiologici cu semnificaie clinic izolai mai frecvent prin hemocultur, n ordine
descrescnd a frecvenei putem aminti: Staphylococcus aureus, diferite enterobacterii, Pseudomonas
aeruginosa, streptococi hemolitici (inclusiv pneumococul), enterococi, Haemophilus influenzae (tip b), Neisseria
meningitidis, germeni anaerobi (Bacteroides fragilis, Fusobacterium spp., Peptostreptococcus spp., Clostridium
perfringens etc), stafilococi coagulazo-negativi, Listeria monocytogenes, Leptospira spp., Brucella spp., Candida
spp., Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Aspergillus spp. etc

1. Recoltarea si trasportul produsului patologic

- este foarte importanta respectarea cu strictee a regulilor de prelevare aseptic i respectiv a recoltrii
sngelui nainte de administrarea oricrui tratament antimicrobian

7
 - hemocultura este un test calitativ pentru detectarea microorganismelor prezente in sange; sangele,
prelevat in conditii de stricta asepsie, este insamantat in flaconul de hemocultura a carui compozitie favorizeaza
dezvoltarea germenilor aerobi, anaerobi si microaerofili => bulioane inalt nutritive
- cresterea bacteriilor in hemocultura poate fi intarziata sau impiedicata daca nu se utilizeaza un
anticoagulant in mediul de cultura, deoarece microorganismele risca sa fie capturate in cheagul de fibrina; in
acelasi timp, unele anticoagulante pot fi toxice fata de anumiti agenti patogeni la fel ca antibioticele prezente in
sange.
- aceste obstacole pot fi inlaturate daca se utilizeaza polyanetholsulfonat de sodiu (SPS) (un anticoagulant
netoxic care favorizeaza proliferarea bacteriana prin neutralizarea activitatii bactericide a serului uman) n care
realizm recoltarea sngelui i pe care l transmitem imediat ctre laborator pentru nsmnarea pe medii de
cultur.
- dou dintre aspectele importante de care trebuie s se in seama n realizarea unei hemoculturi:
momentul recoltrii sngelui
- se recomand recoltarea a minim 2 probe de snge, ns cel mai frecvent sunt recoltate 3 probe de snge, n
momente diferite, pe parcursul a 24 de ore
- pe de alt parte, n cazul n care presupunem c agentul etiologic poate face parte din flora normal vom
recolta minim 3 probe pentru hemocultur
- in cele ce urmeaz o s listm cteva din exemplele posibile, n ceea ce privete
momentul recoltrii sngelui i numrul de hemoculturi recomandate:
endocardit acut recoltm 3 hemoculturi din 3 sedii diferite, pe parcursul a 12 ore
endocardit subacut recoltm minim 2 hemoculturi din 2 sedii diferite (vezi i mai sus) la un interval
mai mare de 15 minute
sepsis recoltm 3 hemoculturi din sedii diferite, pe parcursul a 10 minute (ideal ar fi, pentru toate cazurile
menionate, s recoltm sngele cu circa 30 minute nainte de vrful febril, acest moment ar coincide cu cea mai
mare concentraie de microorganisme n torentul circulator, dar acest moment este dificil de precizat)
febr de origine necunoscut recoltm 2, 3 hemoculturi, din sedii diferite, la un interval de timp de 45-60
minute etc.
volumul de snge recoltat
- avnd n vedere faptul c de regul n cursul bacteriemiilor numrul de uniti formatoare de colonii / ml
de snge este destul de redus, trebuie s recoltm un volum de snge adecvat (pentru fiecare hemocultur n
parte), astfel, vom recolta circa 20 ml de snge n cazul adulilorin hemocultor:
10 ml in flacon anaerob
10 ml in flacon aerob

2. Examinarea macroscopica si microscopica a produsului, dar atunci cand produsul recoltat este
reprezentat de sange, urina sau materii fecale de regula NU se realizeaza frotiuri fixate si colorate

3. Cultivarea pe medii de cultura

- mediile de cultur sunt medii lichide, mbogite (ex. bulion infuzie de cord, creier pentru aerobi i
respectiv bulion Columbia cu cistein pentru anaerobi) condiionate n flacoane corespunztoare cantitii de
snge pe care trebuie s o recoltm
- pentru bacteriile cu multiplicare lent este recomandat utilizarea mediului bifazic (mediu solidificat n
pant, de ex. geloz-chocolat plus mediul lichid bulion tripticaz din soia)
- examinarea flacoanelor de hemocultur se realizeaz de 2 ori / zi n primele 3 zile, apoi zilnic pentru minim
7 zile (n anumite situaii flacoanele pot fi incubate timp de mai multe sptmni)
- examinarea o facem macroscopic urmrind o serie de aspecte care ar putea s semnifice dezvoltarea
microbian (tulburarea mediului mai mult sau mai puin uniform, apariia unei pelicule la suprafaa mediului
lichid, apariia unui depozit pe stratul de hematii din zona decliv a flaconului, apariia unor bule de gaz, apariia
unor colonii pe mediul solid n cazul n care am utilizat mediul bifazic etc); din punct de vedere microscopic,
manipulnd aseptic flacoanele de hemocultur putem realiza frotiuri pe care le colorm Gram
- in cazul apariiei unor modificri precum cele descrise mai sus dar i atunci cnd acestea nu apar (treceri
oarbe) vom realiza subcultivri pe medii de cultur solide (de ex. geloz chocolat) pt obtinerea unei culturi pure

4. Identificarea microorganismului, pe baza mai multor caractere:

- caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolat, frotiu care se va fixa i colora Gram sau
Ziehl-Neelsen, dup caz, i se va examina microscopic
- caractere de cultura
- caractere biochimice
8
 - caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazndu-ne pe structura i antigenicitatea
microorganismelor i pe specificitatea reaciilor antigen anticorp
- caractere de patogenitate

5. Antibiograma
- in vederea testrii sensibilitii la antibiotice putem utiliza ca inocul bulionul de hemocultur, dar
rezultatele obinute vor fi confirmate prin antibiograma difuzimetric standardizat pornind de la coloniile
izolate (cultura pur)
- in momentul de fa exist numeroase sisteme automate utilizate pentru hemocultur (BacT /
Alert, Isolator, BACTEC, SeptiChek, Vital etc)

Interpretarea rezultatelor hemoculturii:

Avnd n vedere pe de o parte posibilitatea contaminrii unei hemoculturi iar pe de alt parte creterea
incidenei hemoculturilor pozitive cu semnificaie clinic n care sunt implicate microorganisme condiionat
patogene, care fac parte din flora microbian normal, rezultatele trebuie interpretate cu responsabilitate i n
echip. La hemocultura, conditia de recolta (punctia) pune in problema contaminarea probei cu stafilococci
coagulazo-negativi => daca sunt identificati se vor reface analizele ; daca se identifica acelasi stafilococ
coagulazo-neg atunci se declara acesta vinovat de infectie.
Exist argumente bacteriologice (de ex. izolarea aceluiai microorganism din mai multe flacoane de
hemocultur) i clinice care permit medicilor infecioniti n colaborare cu medicii microbiologi s stabileasc
etiologia microbian (uneori polimicrobian) a unei infecii generalizate.

6. Diagnosticul de laborator in infectiile produse de Staphylococcus aureus

- Stafilococii sunt coci gram pozitivi, aerobi i facultativ anaerobi, nesporulai, rotund ovalar, dispui n
grmezi, sub form de ciorchine de strugure, sunt non-fastidiosi si halofili
- Genul Staphylococcus conine mai multe specii microbiene, dintre care de interes medical sunt S. aureus
(specie patogen), S. epidermidis, specie accidental patogen, S. schleiferi, S. lugdunensis, S. haemolyticus, S.
saprophyticus, specie cu potenial patogen redus etc.

Staphylococcus aureus:
- S. aureus, germen condiionat patogen, este stafilococ coagulazo-pozitiv ( are capacitatea de a elabora
coagulaza) si este cauza unor infecii de gravitate variabil, cu diverse localizri, n funcie de poarta de intrare:
cutanate i subcutanate: foliculite, furuncule, impetigo, orgelet;
ale mucoaselor: otite, sinuzite, pneumonii etc.;
ale esutului osos i articular: osteomielite, artrite septice;
ale aparatului urinar: cistite, prostatite, pielonefrite, abcese renale;
ale aparatului cardio-vascular: endocardite, flebite , septicemii;
ale aparatului genital: metrite, anexite;
ale SNC: meningite, abces cerebral;
infecii nosocomiale.
ale aparatului digestiv: toxiinfecii alimentare - provocate de exotoxinele preformate, existente in alimente
in care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni;

1. Recoltarea si transportul produsului patologic

- produsul patologic variaza in functie de localizarea infectiei:
n infeciile cutanate i osteomielit produsul patologic este puroiul, a crui recoltare se efectueaz n
raport cu colecia purulent:
- dintr-o colecie nchis, prelevarea puroiului se face de ctre chirurg, dup deschiderea coleciei
- din coleciile deschise sau fistulizate recoltarea se face cu un tampon de exudat steril, dupa ce zona a fost
aseptizata pentru a nu contamina proba cu flora comensala; la recoltare se apasa cu grija in jur pentru a scoate
puroi din profunzime pentru a fi siguri ca este produsul patologic dorit
n infeciile purulente ale seroaselor, produsele patologice (lichidul pleural, articular, cefalo-rahidian) sunt
prelevate prin puncionarea cavitilor respective cu o sering steril i introduse apoi n eprubete sterile;
n infeciile urinare se practic urocultura;
n septicemii se recolteaz sngele;
n toxiinfecii alimentare se recolteaz materiile fecale, vrsturi, resturi alimentare;
9
 2. Examinarea macroscopica si microscopica a produsului patologic
- pentru examenul microscopic se vor realiza minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i
transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) / Giemsa i respectiv Gram
- frotiurile se examineaza la MO cu obiectivul de imersie pentru a identifica prezenta cocilor gram-pozitivi
dispusi in gramezi (ciorchine), in perechi sau izolat, intra si extracelular si raspunsul imun: prezenta leucocitelor
(eventual fenomenul de fagocitoza) si a fibrinei sub forma de travee, intinsa pe lama
- examenul microscopic initial este un examen orientativ
- atunci cnd produsul recoltat este reprezentat de snge, urin sau materii fecale, de regul NU
se realizeaz frotiuri fixate i colorate; spre exemplu:
n cazul materiilor fecale, se va face o coprocitogram, un preparat proaspt (nativ) ntre lam i lamel,
cutndu-se n special prezena leucocitelor;
in cazul unei infectii urinare se va realiza un sediment urinar (dup centrifugarea urinei), care se va
examina ntre lam i lamel n vederea aprecierii numrului de leucocite pe cmp microscopic;

3. Cultivarea pe medii de cultura a produsului patologic

-se face diferit in functie de provenienta produsului patologic:
sngele pentru hemocultur se nsmneaz n 100 ml bulion simplu, la care se adaug substane ce
anihileaz aciunea antibioticelor, n situaia n care acestea au fost administrate deja bolnavului; din
bulion se fac treceri pe geloz snge
cele provenite din colecii nchise sau cele care nu sunt puternic contaminate (exudatul faringian, de pild)
sunt nsmnate direct pe geloz-snge de oaie 5%
produsele puternic contaminate (materii fecale) se cultiv iniial pe mediul de mbogire hiperclorurat
Chapman lichid; dup o incubare de 12-18 ore la 37C se face trecerea pe mediul de izolare Chapman solid,
mediu care prin coninutul su n manitol i indicator de pH (rosu fenol) difereniaz coloniile manitol-
pozitive (de culoare galben - S. aureus) de cele manitol-negative (roz - S. coagulazo-negativi);
- se efectueaza subcultura; se repica pe agar-sange pentru a obtine o cultura pura

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic

-se va realiza pe baza mai multor caractere:
caractere morfotinctoriale: coci gram-pozitivi, dispusi in lanturi scurte, perechi, izolati sau in gramezi
neregulate
caractere de cultura: pe geloza-sange S. aureus produce colonii caracteristice usor de recunoscut
- colonii de tip S, mari, cu diametru de 1-3mm, rotunde, cu suprafata lucioasa, bombate, netede, cu margini
regulate, pigmentate;
- colonia este inconjurata de o zona de hemoliza totala (nu a mai ramas nicio hematie in poza in care a
actionat alfa-hemolizina
- coloniile tinere sunt incolore; pigmentarea coloniilor mature se face n prezena oxigenului i la
temperatura camerei; cel mai frecvent pigment este cel auriu (80%), apoi alb i foarte rar citrin; pentru stabilirea
apartenenei la specia S. aureus se fac teste de patogenitate, din care evidenierea coagulazei este obligatorie
caractere biochimice:
- stafilococii au un metabolism glucidic att respirator ct i fermentativ; fermenteaz glucoza, manitolul,
xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid;
- capacitatea de acidifiere a mediului coninnd manit este utilizat ca test de difereniere ntre S. aureus
(manitopozitiv, produc virarea culorii mediului din roz in galben datorita indicatorului de pH) i S. coagulazo-
negativi (manitonegativ)
caractere enzimatice:

1. Testul catalazei
* n cazul n care urmeaz s testm o bacterie care s-a dezvoltat pe geloz snge, deoarece pot aprea reacii
fals pozitive datorit catalazei eritrocitare, urmeaz s prelevm cultura bacterian fr a atinge mediul de
cultur n acest sens urmeaz s utilizm o ans fir i s prelevm cultur din poriunea cea mai bombat a
coloniei de identificat
- pe o lama curata se pune o picatura din solutia de peroxid de hidrogen
- cu o ansa dispozabila colonia este ciupita usor si se suspensioneaza cultura in picatura de H2O2 si se
urmareste timp de 30 s aparitia bulelor de oxigen
- aparitia bulelor de gaz => test catalazo-pozitiv (specific pentru Stafilococcus aureus); Streptococcus este
negativ

10
 2. Testul coagulazei
- S. aureus prezinta doua coagulaze:
->una legata la suprafata peretelui celular- "clumping factor", care transforma fibrinogenul in firbina;
prin intermediul clumping factorului S. aureus se fixeaza de fibrinogenul din tesuturile lezate
- aceasta coagulaza se evidentiaza prin tehnica pe lam - pe o lam se pune o pictur de ap distilat; se
suspensioneaza si omogenizeaza 1-2 colonii in picatura de apa distilata (suspenisa trebuie sa fie tulbure omogen)
- aparitia aglutinarii dupa 1-2 min => test pozitiv
- absenta semnifica test negativ; ! deoarece au fost raportate tulpini de S. aureus neproducatoare de
coagulaza legata (5%) , atunci can testul este fals negativ, trebuie testata producerea de coagulaza libera (care
necesita un test mai laborios)
->una libera, secretata in exteriorul celulei bacteriene - coagulaza libera, specifica speciei de S. aureus
care este markerul de virulenta al S. aureus
- in urma reactiei coagulazei cu un factor globulinic din plasma, se formeaza staphylotrombina si care la
randul ei catalizeaza conversia fibrinogenului in fibrina insolubila;
- ea se evidentiaza prin tehnica n tuburi:
- pipetm aseptic 0,5 ml de plasm ntr-un tub steril
- prelevm o colonie i o descrcm n plasma din tub; incubm tubul timp de 4 ore la 35-37C (pentru unele
tulpini reacia poate fi pozitiv chiar i mai repede de 4 ore). Rezultatul reaciei este examinat prin nclinarea
tubului. Dac reacia este negativ la 4 ore, reincubm pn la 24 ore.
! Atenie, cheagul poate fi lizat destul de rapid dup momentul formrii (unele tulpini de S.
aureus produc fibrinolizin). Din acest motiv, unii autori recomand examinare tubului test din 30 n
30 minute, n primele 4 ore.

caractere antigenice
Aglutinarea indirecta - se foloseste latex-aglutinarea:
- pe o particula de latex se absorb molecule din Ag solubile pt a le transforma in Ag corpusculare; se adauga
fibrinogen + IgG
- se preleva din cultura si se adauga la latex; se omogenizeaza;
- daca in suspensie vor aparea grunji => test pozitiv ( fibrinogenul s-a transformat in fibrina si protenia A a
legat Fc al IgG)
- testul nu arata exact ce fel de Stafilococcus este

5. Antibiograma
- antibiograma se face in mediu lichid pentru determinarea CMI ( E-test)
-sensibilitatea Stafilococilor:
a) Peniciline si Cefalosporine
- rezistena la aceste antibiotice se instaleaz fie prin producerea beta-lactamazelor, fie prin modificarea
unor proteine ale peretelui celular ( duce la scderea permeabilitii nveliurilor bacteriene i modificarea intei
antibioticului n aa fel nct acesta s nu se mai poat lega de structurile bacteriene respective)
- acest tip de rezisten confer tulpinilor de stafilococ, mai ales celor din spital (deci cu mare potenial
nosocomial) rezistena la toate beta-lactaminele (peniciline i cefalosporine)
- depistarea acestor stafilococi se face prin testarea sensibilitii la meticilin, rezistena la acest antibiotic
(MRSA = Methicilin resistent S. aureus) semnificnd rezisten la toate beta-lactaminele.
b) Macrolide - Eritromicina
c) Chinolone
d) Vancomicine

7. Diagnosticul de laborator in faringita streptococica

Familia Streptococcaceae cuprinde genurile Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus etc.

Genul Streptococcus, poate fi clasificat in functie de hemoliza:

streptococi beta hemolitici - produc o hemoliza completa, clara, specifica speciilor patogene; acestia
au fost la randul lor impartiti pe baza structurii antigenice a polizaharidului C din peretele celular, in
grupuri serologice notate de la A la W (fara I si J):
grup A - Streptococcus pyogenes - principalul patogen uman
grup B - Streptococcus agalactiae
11
 grup C, G si F - colonizeaza cateodata nazofaringele fiind cauza unor sinuzite, bacteriemii sau
endocardite;
streptococi alfa hemolitici - produc o hemoliza partiala cu aparitia unei coloratii verzui a mediului (
hemoliza viridans) caracteristica streptococilor viridans si pneumococilor
streptococi alfa' hemolitici - produc o hemoliza incompleta
streptococi gamma (nehemotici)
S. pyogenes - sunt coci gram pozitivi, rotund alungiti, dispusi in lanturi (pt ca se afla un singur plan de
diviziune), aerobi si pot sau nu sa prezinte capsula.
Faringita streptococica este determinata de specia Streptococcus pyogenes ce face parte din grupul A.

1) Recoltarea si transportul produsului patologic

-produsul patologic este reprezentat de secretia purulenta de la nivelul faringelui
-se efectueaza un exudat faringian
recoltarea se face dimineata pe nemancate/la min 4 ore dupa masa(pt a se reface flora)
cu tampon de exudat prin miscari de rotatie
sa nu atingem mucoasa obrajilor si limba deoarece contaminam exudatul cu flora comensala
! se iau 2 tampoane de exudat
transportul produsului patologic la laborator in < 2h

2) Examenul macroscopic si microscopic -NU
-frotiurile directe din exudatele faringiene sau din alte secretii ale tractului respirator au o importanta
redusa, datorita nr mare de streptococi care fac parte din flora normala a faringelui si care sunt
asemanatori d.p.d.v morfologic cu S. pyogenes ( ex: S. viridans identic la MO)

3) Cultivarea pe medii de cultura a produsului patologic

a. Primul tampon de exudat : este folosit pt caseta de imunocromatografie -> identificare serologica directa
(cotine Ac NAGA: numai pt Strepto A)
b. Al doilea tampon de exudat:
folosit pentru insamantare pe agar-sange
- in cursul nsmnrii, pe cel puin una dintre laturile poligonului descris trebuie s
realizm i o nepare a mediului n aa fel nct inoculul s ajung mai n profunzime; aceast
manevr este necesar pentru a permite activitatea hemolizinei O (aceast streptolizin este
inactivat n prezena oxigenului)
incubare: 18-20h la 35 => primocultura
repicam colonia suspecta pt obtinerea unei culturi pure (colonie S mica, de culoare alb-gri, cu
diametrul<1mm , inconjurata de o zona de hemoliza cu diametrul mai mare decat diametrul
coloniei; pot aparea zone de hemoliza cumulata, cand hemoliza de la mai multe colonii se
uneste)

4) Identificarea microorganismului
- se face pe baza mai multor caractere:

caractere morfotinctoriale - frotiul din cultura, colorat Gram, releva prezenta unor coci gram-pozitivi,
rotund alungiti, dispusi in lanturi scurte
caractere de cultura: produc colonii tip S, cu diametrul <1mm, inconjurate de o zona de beta hemoliza;
speciile care produc material capsular, din acid hialuronic, dau nastere unor colonii mucoide (tip M)
caractere enzimatice

1. Testul catalazei (vezi Staphylo): negativ

2. Testul oxidazei: negativ

12
- unele bacterii produc citocrom oxidaza, enzima care lipseste la bacteriile strict anaerobe; aceasta
hemoproteina actioneaza asupra unei subsante, tetra-metil p-fenilendiamina => indofenol (compus de
culoare purpurie-albastra)
- punem ntr-o cutie Petri un fragment de hrtie de filtru pe care depunem 12 picturi de soluie apoas de
tetrametil pfenilendiamin 1% (donorul artificial)
- dup sterilizarea i rcirea ansei, prelevm dintr-o colonie izolat i descrcm cultura pe hrtia de filtru
prin micri circulare de mic amplitudine - se frotiaza
- urmrim apariia unei reacii de culoare n interval de 10 secunde
Interpretare:
apariia unei zone de culoare purpurie n 10 secunde => test pozitiv
absena culorii purpurie => test negativ

caractere biochimice
Testul de sensibilitate la bacitracina:
- multiplicarea streptococilor de grup A este inhibata de bacitracina (antibiotic produc de Bacillus
licheniformis)
- a fost utilizat mult vreme pentru diferenierea S.pyogenes de alte grupuri de streptococi hemolitici
(fiind singura specie din cadrul genului sensibil la bacitracin); astzi, pentru mbuntirea calitii sale,
acest test se utilizeaz n asociere cu testarea sensibilitii la trimetoprim-sulfametoxazole (SXT),
streptococii de grup A i B , fiind rezisteni la SXT;
- tehnica de lucru:
o colonia suspecta se repica intr-un sector si apoi in poligon deschis
o se aplica discuri cu bacitracina (fiecare disc contine 0,004 unitati bacitracina)
o se apasa discul pt a nu se dezlipi
o incubare: 18-20 h la 35
o citire: test pozitiv => inhibitia cresterii in jurul discului
o pt Strepto A: testul trebuie sa fie pozitiv(in 90-95% din cazuri), insa exista posibilitatea ca testul
sa iasa negativ (in 5-10% din cazuri)

caractere antigenice
Testul serologic de latex-aglutinare ( identificare serologica ):
- este folosit pt detectarea rapida a polizaharidului specific de grup A, C sau G ( A det faringita insa si C si G
pot det sindrom poststreptococcic) => determinarea grupului serologic
- sticlutele cu latex contin:
o particulele de latex incarcate "in vitro" cu anticorpii corespunzatori anti-grup (anticorpi cunoscuti
=> reactie de identificare serologica)
o o enzima pancreatica ce are rolul de a extrage din cultura polizaharidul specific de grup
- sticlutele cu latex sunt tinute la frigider => temperare
Etape:
- se depune pe un slide alb o picatura din solutia cu latex
- se adauga o picatura de extract enzimatic din cultura suspecta
- omogenizare
Citire : test pozitiv= aparitia grunjilor + supernatant clar (se atinge zona de echivalenta)

5) Diagnosticul serologic (Ag cunoscute; Ac de identificat)

- diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA-reumatism
articular acut, GNA- glomerulonefrita acuta post-streptococica)
- cea mai importanta investigatie in cadrul diagnosticului febrei reumatismale este cea serologica; pt a
demonstra cresterea titrului de Ac fata de S. pyogenes trebuiesc recoltate de la bolnav 2 probe de ser;
- titrul Ac (ASLO) devine detectabil din a doua sapt dupa instalarea infectiei, atinge un maxim dupa 6 sapt,
dupa care scade;
Testul ASLO : determina titrul Ac anti streptolizina O (SLO);
diagnosticul serologic al infectiilor streptococice si post-streptococice;
diagnosticul complicatiilor tardive post-streptococice;
urmarirea evolutiei unei infectii streptococice;
urmarirea eficientei tratamentului.

13
 Principiu:
Titrarea Ac antiSLO se bazeaz pe faptul c SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de
berbec. n cazul n care n serul de cercetat exist Ac antiSLO, aciunea hemolitic a SLO este neutralizat.
Combinnd diluii din serul de cercetat cu o cantitate constant de SLO vom putea determina titrul ASLO.
Seroneutralizarea streptolizinei O (SLO) prin existenta in ser a anti-streptolizinei O este vizualizata
prin absenta hemolizei unor eritrocite test care constituie substratul celular indicator. In absenta
anticorpilor anti-streptolizina O, streptolizina O isi exercita efectul litic pe hematii, efect tradus prin
prezenta hemolizei.
Tehnica de lucru:
Prima etapa a reactiei ASLO
Serul de bolnav recoltat in conditii sterile, se inactiveaza 30 min la 56C si se trateaza cu Rivanol 0,4%,
pentru indepartarea inhibitorilor SLO; Se efectueaza dilutiile serului de cercetat si se repartizeaza in tuburile
de reactie ; Se pun in contact cu SLO (cantitate constanta, cate 0,5 mL/ tub); Se agita tuburile si se mentin 15
min la 37C;
A II-a etapa a reactiei ASLO
Se adauga suspensia de hematii (5%), cantitate fixa, 0,5 mL in fiecare tub;
Se agita pentru omogenizare si se incubeaza 45 min la 37C si peste noapte la 4C pentru citire finala a
doua zi.
Interpretare:
- pornind de la o diluie iniial a serului de 1/10, dup adugarea tuturor reactivilor titrul (numrul
de uniti ASLO) va fi 12, 50 n tubul urmtor, 100, 125, 166, 250, 333 etc n tuburile urmtoare.
- titrul este dat de tubul cu dilutia cea mai mare de ser de testat in care lipseste hemoliza
! Titrul > 300 => TEST ASLO +

6) Antibiograma
Strepto A este sensibil la penicilina si eritromicina (apatin clasei macrolidelor). Penicilinele G i V sunt
antibioticele de elecie n infeciile streptococice (atenie la persoanele alergice). Nu s-au semnalat tulpini
rezistente la peniciline
- se efectueaza AB pt a se depista daca pacientul este sensibil la aceasta
- in rest AB largita
- pe mediu Muller-Hinton

8. Diagnosticul de laborator in pneumonia streptococica

Streptococcus pneumoniae (pneumococul) face parte din familia Streptococacceae, genul Streptococcus si
face parte din grupul S. mitis de streptococi orali (viridans). Este un microorganism care face parte din flora
orofaringiana normala la majoritatea populatiei.
- S. pneumoniae sunt coci gram-pozitivi, alungiti, dispusi in diplo sau in lanturi, incapsulati, nesporulati,
aerobi, imobili si determina alfa-hemoliza in mod normal la fel ca S. viridans
- S. pneumoniae poate sa produca: pneumonia pneumococica, sinuzite si otite medii, meningite,
septicemie
- in cazul pneumoniei produsul patologic reprezentativ este sputa

1. Recoltarea produsului patologic si transportul la laborator

ideal trebuie sa se realizeze inainte de administrarea antibioticelor
produsul patologic este sputa
inaintea recoltarii se recomanda clatirea gurii si gargara cu apa/ser fiziologic
se obtine o proba mucopurulenta
spalarea cu ser fiziologic reduce contaminarea orofaringiana fara a dilua semnificativ bacteria patogena

2. Examinarea microscopica a produsului patologic

realizarea de frotiuri (min 2) colorate cu albastru de metilen si respectiv Gram
se urmareste prezenta celulelor imune (leucocite, macrofage) si raportul lor cu microorganismul (intra-,
perileucocitar)
14
 alti markeri ai inflamatiei precum fibrina
se observa diplococi gram pozitivi, alungiti, capsulati (eventual cu capsula comuna), nesporulati; uneori
pot fi dispusi si in lanturi
utilizand anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapida inclusiv direct pe produsul
patologic prin reactia de umflare a capsulei

3. Cultivarea pe medii de cultura

se insamanteaza pe agar sange
multiplicarea lor este favorizata de o atmosfera cu CO2 5%
vor rezulta colonii M inconjurate de o zona de hemoliza (*pot produce si beta hemoliza prin incubare
in anaerobioza)
aceste colonii se autolizeaza cu timpul, deci culturile nu se pot pastra
ele devin crateriforme pana nu ramane decat conturul
coloniile de Pneumococcus trebuie diferentiate de S. viridans care formeaza colonii S, gri inconjurate de
zona de hemoliza
dupa obtinerea primoculturii, se repica o colonie izolata de interes pentru obtinerea unei subculturi pure

4. Identificarea microorganismului
- se poate face pe baza mai multor caractere:
caractere morfotinctoriale: coci gram pozitivi, alungiti, dispusi in diplo, incapsulati
caractere de cultura: pe geloza-sange formeaza colonii de tip S, inconjurate de o alfa-hemoliza;
caractere biochimice:
se poate folosi sensibilitatea la optochin (etil-hidrocupreina), sensibilitatea la aceasta substanta fiind de
asemenea utila in identificarea si diferentierea de S. viridans
o se foloseste un disc cu optochim (5 g / disc ) cu diametrul de 6 mm
o aparitia unei zone de inhibitie cu diametrul >14 mm => test pozitiv (S. pneumoniae)
o absenta inhibitiei => test negativ (S. viridans)
se poate efectua testul bilolizei (pnemococii capsulati sunt lizati in prezenta bilei sau sarurilor biliare
prin activarea unei enzime autolitice) => testul este pozitiv pt S. pneumoniae si negativ pt S. viridans
fermenteaza inulina
o test biochimic util in diferentierea de S. viridans
o se utilizeaza un mediu cu inulina si indicator de pH; in cazul reactiei pozitive are loc o modificare de
pH si respectiv modificarea culorii mediului

caractere antigenice
Identificarea serologica (Ac cunoscuti, Ag de identificat):
prezenta capsulei (antigenul K) si a polizaharidului capsular este specifica fiecarui serotip in parte
se folosesc Ac anticapsulari cunoscuti
complexul antigen-anticorp format n urma cuplrii antigenului capsular pneumococic cu anticorpii
anticapsulari are o refringen superioar mediului nconjurtor i apare, la examinarea cu MO ca un
halou clar dispus n jurul bacteriilor, halou care are dimensiuni mai mari dect haloul in lipsa serului
anticapsular
o pe o lama se depune ser polivalent anti-capsular
o se suspensioneaza cultura
o se acopera cu lamela => aparitia unui halou clar, bine definit inseamna test pozitiv (S. pneumoniae)
o test negativ (S. viridans)
- testul umflarii capsulei se poate realiza si pornind de la produsul patologic
- in acelasi scop se poate utiliza si reactia de aglutinare

5. Antibiograma
se realizeaza tot pe agar sange cu CO2 5%
sensibilitatea la penicilina se face cu discul de oxacilina
in cazul rezistentei la oxacilina, se determina CMI pentru penicilina prin E-test

15
 9. Diagnosticul de laborator in meningita bacteriana
Familia Neisseriaceae include genurile Neisseria, Eikenella, Kingella etc. Genul Neisseria cuprinde 16 specii
dintre care 10 sunt gazduite de om: cele mai importante d.p.d.v medical sunt N. gonorrhoeae si N. meningitidis.
Neisseriile sunt coci gram negativi dispusi in diplo, sub forma de boabe de cafea, care se privesc prin
concavitatile lor, strict aerobi.
N. meningitidis paraziteaza numai omul si poate fi izolat din oro- si nasofaringe a 3-30% dintre persoanele
sanatoase. Meningococul este un microorganism condiionat patogen care poate fi implicat n infecii respiratorii,
dar este semnificativ de reinut faptul c prin invazivitate poate conduce la apariia unei bacteriemii n cursul
creia complicaia principal este meningita meningococic.
Agentii etiologici ai meningitei:
N. meningitidis - coci gram-negativi
Haemophilus influenzae - cocobacili gram-negativi
Streptococcus pneumoniae - coci gram-pozitiv
Streptococcus agalactiae (de grup B) - coci gram-pozitiv

1. Prelevarea produsului patologic si transportul la laborator

produsul patologic in acest caz este LCR obtinut prin punctie realizate de medic in cazul meningitei
meningococice, min 5 mL, LCR - in mod fiziologic un lichid clar devine tulbure, purulent
transportul la laborator trebuie facut in timpul cel mai scurt, meningita fiind o urgenta medicala
(endotoxina determina sdr. Toxico-septic urmat de CID si deces)
! In caz de urgenta: meningococul se poate detecta direct din produsul patologic prin latex aglutinare (prin
fierbere se extrage Ag bacterian din produs pentru identificarea serologica)

2. Examinarea microscopica a produsului patologic

din lichidul ca atare se efectueaza testul PANDY pentru aprecierea albuminorahiei si la laboratorul de
biochimie se poate determina cantitativ prezenta albuminei
apoi LCR se centrifugheaza si din sediment se efectueaza culturi si min 2 frotiuri => frotiuri colorate Gram,
albastru de metil si Giemsa si culturi pe agar-sange, chocolat si lactozat
frotiurile se examineaza la MO cu imersie si se noteaza prezenta celulelor inflamatorii si prezenta
bacteriilor intra sau extra-leucocitar
se poate efectua un preparat direct care se observa la hemocitometru/camera de numarat unde se cuatifica
leucocitele, prezenta hematiilor si albumina

3. Cultivarea pe medii de cultura

o N. meningitidis - sunt coci gram negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur
capsular comun;
- sunt bacterii prententioase care cresc la o atmosfera de CO2 5-8%, si este necesar mediul Mueller-Hinton,
geloza-sange sau geloza-chocolat) => colonii tip S sau M
! Chocolatarea sangelui = incalzirea treptata a sangelui pana la 60 grade C pt a iesi din hematii hemina.
- se identifica izolatul clinic semnificativ si se repica cu obtinerea unei subculturi pure
o Haemophilus influenzae - sunt cocobacili gram-negativi, aerobi, dispusi in perechi sau lanturi scurte
- sunt bacterii f pretentioase si pt cultivare sunt necesari factori de crestere precum hemina (factor X) si
factorul V, care poate fi inlocuit cu NAD, NADP sau alte coenzime
- factorul V este sintetizat i de S. aureus, S. pneumoniae si Neisseria, astfel c pe geloz snge coloniile de
Haemophilus influenzae sunt mai numeroase i de dimensiuni mai mari n apropierea unei linii pe care a
fost nsmnat o tulpin de acest gen(fenomenul de satelitism)
- mediul folosit este agar- chocolat => colonii tip S sau M, cu aspectul unor "picaturi de roua"
o Streptococcus pneumoniae - agar-sange => colonii tip M cu alfa-hemoliza
o Streptococcus agalactiae - agar-sange => colonii tip M, gri deschis, cu beta-hemoliza

4. Identificarea microorganismului
- dupa mai multe caractere:
caractere morfotinctoriale
caractere de cultura
16
 caractere enzimatice:
a) Testul oxidazei :
N. meningitidis - pozitiv
H. influenzae - pozitiv
S. pneumoniae, agalactiae - negativ
b) Testul catalazei:
N. meningitidis - pozitiv
S. pneumoniae, agalactiae - negativ

caractere biochimice:
N. meningitidis:
o fermenteaza glucoza, lactoza (fata de N. gonorrheae care fermenteaza doar glucoza)
o testarea fermentatiei zaharurilor se face prin adaugarea rosu fenol (indicator de pH in mediu, sau in
stripuri sau in tuburi)

caractere antigenice
Identificarea serologica pt N. meningitidis:
o este definitiva in meningita in urma recoltarii LCR
o se utilizeaza reactia de latex aglutinare cu anticorpi anticapsulari
o se identifica serotipurile A, C, Y, W 135
o se identifica si grupul B ( desi nu exista vaccin)

5. Antibiograma - este recomandata

10. Diagosticul de laborator in tuberculoza pulmonara

Bacilii acido-rezistenti sunt reuniti in genul Mycobacterium. Peretele lor celular are un continut bogat in
lipide si ceruri, conferind acestor germeni proprietati particulare, precum acido-alcoolo-rezistenta (BAAR),
rezistenta la o serie de antibiotice, rezistenta intrafagocitara etc.
Prima specie a genului, Mycobacterium tuberculosis, a fost descoperita de R. Koch in 1882, motiv pt care este
cunoscut si sub denumirea de bacilul Koch(BK)
Tuberculoza poate avea localizari variate, dar cea mai frecvent intalnita este tuberculoza pulmonara, in care
pacientii elimina prin sputa BAAR.

1. Prelevarea produsului patologic si transportul la laborator

Produsele patologice sunt reprezentate de:
- Sput
- Urin
- Materii fecale
- LCR
- Snge bacteriemie - hemocultur
- Biopsii tegumentare etc
Detectarea BAAR (bacili acido-alcoolo-rezisteni) este superioar daca produsele patologice sunt
concentrate prin centrifugare. Sputa este tratat n prealabil cu NaOH 4% pentru a scpa de flora saprofit oro-
faringian, neutralizat cu HCl, indicatorul fiind reprezentat de albastru de bromtimol.
Sputa se recolteaz (expectoraie, nu saliv sau secreii nazale pacientul trebuie instruit) de diminea,
dup curarea gurii cu ser fiziologic steril. Produsul trebuie transportat la laborator n maxim 2 ore, daca nu, se
pstreaz n condiii optime de conservare.

2. Examinarea microscopica a produsului patologic

Examen microscopic:
Frotiu colorat cu Ziehl-Neelson (coloraie special).
Etape:

17
 1. Pe lama de microscop, peste produsul patologic se adaug fuxin bazic (conine fenol facilitare
pentru a trece de peretele celular) se acoper din abunden
2. nclzire la becul de gaz (avem grij s nu ajung la fierbere), pt a topi cerurile, moment n care
fuxina se fixeaz pe proteoglicani.
3. Se adaug acid-acool decolorare unde nu s-a fixat fuxina
4. Splare cu ap de la robinet
5. Se adaug albastru de metilen (recolorare)

=> BAAR apar ca bacili fini, roii, dispui izolat sau n grupuri. Pentru tulpinile virulente se descrie o
dispunere particular sub form de corzi sau panglici cu mai muli bacili (sulfolipid numit cord factor n
peretele celular).
=> Pe fond albastru apar leucocite, fibrin, elemente celulare aferente organului din care provine produsul,
alte bacterii.
Nu se poate da un diagnostic pozitiv deoarece se ia n considerare prezena altor BAAR cu morfologie
asemntoare, de exemplu Nocardia. Prin examenul microscopic, se depisteaz doar prezena BAAR, fr
precizarea speciei.
Coloraia auramin-rhodamin este superioar, dar necesit examinarea la microscopul cu fluorescen.

3. Cultivarea pe medii de cultura a produsului patologic

Izolarea:
nsmnarea poate face:
- n mediu lichid (bulion Wiegelbruch) la suprafa se ntinde pe marginile tubului.
- pe mediu solid Lvenstein-Jensen (conine ou, glicerin, asparagin i verde malahit, are un pH
uor acid, are culoare verzuie, livrat n eprubete, cu suprafaa mediului nclinat). Panta mediului
este lung (are nevoie de mult oxigen). La nivelul dintre coloan i pant este o cantitate mic de
lichid n care se suspensioneaz cu ansa bacteriologic i se inoculeaz toat panta. Temperatura de
incubare: 35oC.

Sunt specii cu cretere lent (se dezvolt dup 2-4 sptmni).

=> M.tuberculosis formeaz colonii de tip R rugoase, uscate, neregulate, conopidiforme, greu emulsionabile.
Coloniile sunt necromogene, au culoare alba, crem, alb-glbui, nu dezvolt pigment nici dup expunerea la
lumin.

4. Identificarea
- se face pe baza mai multor caractere
caractere morfotinctoriale: se evidentiaza BAAR
caractere de cultura: colonii R, uscate, neregulate, de culoare alba
caractere biochimice:
-testul producerii de niacina +
- testul reducerii nitratilor +
- testul catalazei +

5. Antibiograma
Testarea sensibilitii la chimioterapicele antituberculoase:
Se face prin cultivare pe medii cu coninut de chimioterapice antituberculoase, dar din cauza creterii lor
lente, precum i a nmulirii procentului de tulpini multirezistente, se prefer sistemul Bactec, care permite
o citire mult mai rapid a probelor (la 4-5 zile de la inoculare).
Tratamentul dureaz 6-12 luni i este necesar asocierea a cel puin 3 AB.
AB de prim linie sunt:
- izoniazida (HIN)
- rifampicina
- pirazinamida
- etambutolul
- streptomicina

AB din linia a doua, utilizate doar pentru tratamentul tuberculozei rezistente la medicamentele din prima
linie:

18
 - kanamicina
- amikacina
- etionamida
- cicloserina
- acidul paraaminosalicilic (PAS) etc

11. Caracterizati comportamentul biochimic al unei enterobacterii pe medii

diferentiale
Mediile diferentiale= medii de cultura care evidentiaza anumite proprietati fiziologice si caractere
biochimice ale tulpinilor bacteriene pe baza carora acestea pot fi identificate.
1. Mediu TSI( Triple Sugar Iron)
- Compozitie: a) pe coloana :glucoza + o sursa de sulf (pt a se evidentia prorietatea bacteriilor de
a produce sau nu H2S)
b) pe panta : lactoza si sucroza
c) indicator de pH: rosu fenol
Citire:
o Glucozo -: coloana rosie, glocozo +: coloana galbena
o Lactozo- : panta rosie, +: panta galbena
o H2S+ : coloana neagra

2. Mediu MIU( Motility Indol Urease)

Citire:
o M -: bacteriile au crescut doar in jurul locului de intepare/insamantare, +: bacteriile au
tulburat uniform mediul
o Indol -: galben-portocaliu, +: violet
o Ureaza -: galben, +: roz-violet
3. Mediu cu citrat
Indicator: albastru de bromtimol
Citire: citrat -: verde, citrat +: albastru
4. Mediu cu rosu metil
Citire: -: galben , +: rosu
5. Mediu Voges Prostakauer
Citire VP: - : portocaliu, +: rosu
6. Test cu nitrat
Citire: -: galben-portocaliu, +:rosu
!! Toate enterobacteriile transforma nitratii in nitriti => test +

Compotament enterobacterii:
Enterobacterii conditionat patogene

I) E coli
1) TSI a) pe coloana: glucozo, H2S-, putin gaz
b) pe panta: lactozo +
2) MIU:
M+
I+
U-
3) Citrat
4) Test rosu metil +
5) Test nitrat +

19
 II) Klebsiella II) Shigella
1) TSI: la fel ca la E. Coli, doar ca mai mult gaz 1) TSI
2) MIU : glucozo +
M- H2S-
Indol variabil : Lactozo
- => K. Pneumoniae 2) MIU
+=> K. Oxitoca M-
U+ I-
3) Test rosu metil: - U-
4) Test VP + 3) Citrat
5) Test nitrat + 4) Test rosu metil +
5) Test VP -
III) Proteus 6) Test nitrat +
1) TSI
glucozo +
H2S+ III) Yersinia
lactozo 1) TSI
2) MIU: Glucozo +
M+ Lactozo -, sucrozo + => panta va aparea
I variabil : - => P. Mirabilis galbena (rezultat pozitiv)
+=> P. Vulgaris H2S-
U+ 2) MIU
3) Citrat + M: - => Y. Pestis
4) Test nitrat + +=> Y. Pseudotuberculosis, Y.
enterocolitica(mobile la temperatura camerei)
IV) Enterobacter ( sem cu Klebsiella) I ( EXCEPTIE : Y.enterocolitica
1)lactozo + unde producerea de indol este
2) citrat+ variabila)
3) test VP + U - => Y. Pestis
4) restul testelor sunt variabile +=> Y. Enterocolitica
3) In plus
Enterobacterii patogene
Y. Pestis: manito-pozitiva si nu
fermenteaza zaharoza
I) Salmonella
Y. Pseudotuberculosis, Y
1) TSI enterocolitica: reactia rosu metil
glucozo + pozitiva
putin gaz
H2S + Test nitrat +
lactozo
2) MIU:
M+
I-
U-
3) Citrat +
4) Test rosu metil +
5) Test VP -
6) Test nitrat +

20