LP7: Determinarea diversitatii genetice cu markeri

moleculari
 Scurt istoric

Selected ‘loci’ in the history of genetics

1842 First observation of chromosomes
1865 Mendel’s theory of inheritance
1900 Rediscovery of Mendel
1905 First coining of the term ‘genetics’ by Bateson
1900s Discovery of linkage by Bateson and Punnett
1913 First linkage map (of Drosophila by Morgan)

1935 First linkage maps of plant species (maize & tomato)

1953 Discovery of the structure of DNA

1986 First molecular marker linkage map of crop species

2000 Arabidopsis thaliana genome sequenced

2002 First crop genome sequenced (rice)
2004 First livestock genome sequenced (chicken)

2
 Markeri genetici - Definitie

Ce este un marker genetic ?

Markerii genetici sunt secvente ADN cu locații fizice cunoscute pe

cromozomi.

Reprezintă puncte de variație care pot fi folosite pentru a identifica

indivizi/specii sau pot fi utilizate pentru a asocia o caracteristică fenotipică
moștenită cu o genă prin legătura genetică cu genele din apropiere.

Exemple:
• izoenzime
• RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphisms),
• RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),
• AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms),
• STS (Sequence Tagged Site)
• SSR (Simple Sequence Repeat)
• SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
• KASP (KompetitiveAllele Specific PCR)
etc. 3
 Markeri genetici - Definitie

Ce este un marker genetic ?

Markerii genetici sunt secvente ADN cu locații fizice cunoscute pe

cromozomi.

Reprezintă puncte de variație care pot fi folosite pentru a identifica

indivizi/specii sau pot fi utilizate pentru a asocia o caracteristică fenotipică
moștenită cu un locus prin legătura genetică cu genele din apropiere.

Exemple:
• izoenzime
• RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphisms),
• RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),
• AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms),
• STS (Sequence Tagged Site)
• SSR (Simple Sequence Repeat)
• SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
• KASP (KompetitiveAllele Specific PCR)
etc. 4
 Markeri genetici - Definitie

Ce este un marker genetic ?

Markerii genetici sunt secvente ADN cu locații fizice cunoscute pe

cromozomi.

Reprezintă puncte de variație care pot fi folosite pentru a identifica

indivizi/specii sau pot fi utilizate pentru a asocia o caracteristică fenotipică
moștenită cu un locus prin legătura genetică cu genele din apropiere.

Exemple:
• izoenzime
• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms),
• RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),
• AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms),
• STS (Sequence Tagged Site),
• SSR (Simple Sequence Repeat),
• SNP (Single Nucleotide Polymorphisms),
• KASP (Kompetitive Allele Specific PCR),
etc. 5
Markeri genetici - Istoric

6
Markeri genetici - Istoric

7
Markeri genetici - Istoric

8
Markeri genetici - Istoric

9
 Markeri genetici - Istoric

Primii markeri?

10
 Markeri genetici - Istoric

Primii markeri? Fenotipul

Cum poate fenotipul fi un marker molecular?

11
 Markeri genetici - Istoric

Primii markeri? Fenotipul

Cum poate fenotipul fi un marker molecular?

12
 Markeri genetici - Istoric

Primii markeri? Fenotipul

Cum poate fenotipul fi un marker molecular?

Gena
GenaY/y
Y/y(culoare)
(culoare)
Marker
Markermolecular
molecular

Gena R/r (forma)

13
 Markeri genetici - Exemple

Izoenzimele
• bazate pe variația de pliere a proteinelor
• număr limitat de markeri și polimorfism

14
 Markeri genetici - Exemple

Izoenzimele
• bazate pe variația de pliere a proteinelor
• număr limitat de markeri și polimorfism

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

15
 Markeri genetici - Exemple

Markeri genetici

1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

• o enzimă taie ADN-ul la o locatie specifica pentru recunoașterea
enzimei (de exemplu AATTCC)

• polimorfismul este determinat de numărul de astfel de site-uri din

genom, care modifică numărul de benzi ADN

(Nelson and Lydiate, 2005) 16

 Markeri genetici - Exemple

Metode bazate pe utilizarea PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacţie de Polimerizare în Lanţ)

RAPD, AFLP, SSR, SNP şi KASP sunt cateva metode ce

utilizează PCR, în scopul determinării diversităţii genetice a
genotipurilor vegetale.

• RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),

• AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms),
• SSR (Simple Sequence Repeat),
• SNP (Single Nucleotide Polymorphisms),
• KASP (Kompetitive Allele Specific PCR),

17
 Markeri genetici - PCR

Utilizări:

• Detectarea ADN-ului specific patogen

• Detectarea genelor de rezistență și selectarea variantelor rezistente

• Diferențierea organismelor și a individului

• Detectarea polimorfismelor ADN legate de factori biotici

• Clonarea genelor și caracteristica funcțiilor genei

18
 Markeri genetici – PCR

Termocicler Sistem pentru preluarea imaginilor

Sistem de electroforeză în Sistem de electroforeză în Fluorospectrometru

gel orizontal gel vertical

19
Markeri genetici - Tipuri de PCR

20
Markeri genetici - PCR

1. denaturare, 1 minut, la 94 oC;

2. ataşarea primerilor, 1 minut, la 36 oC

(cu o creştere de 5 oC/minut);

3. extensie, 2 minute, la 72 oC.

21
Markeri genetici - PCR

22
 Markeri genetici – Real-time PCR

Mix intre PCR si detectarea fluorescenței

23
Markeri genetici – Real-time PCR (principiul metodei)

24
 Markeri genetici – Real-time PCR (principiul metodei)

http://www.bio-rad.com/de-de/applications-technologies/what-real-time-pcr-qpcr?ID=LUSO4W8UU

25
Markeri genetici – RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)

• Amplificarea unor fragmente aleatorii de ADN

• Reproductibilitate slabă

26
Markeri genetici – SSR (Simple sequence repeat - microsatellites)

Genotipul 1

Genotipul 2

• "motivul" de mai sus este "G"; repetarea unei nucleotide

• Poate fi orice motiv <10 bp lung

• de exemplu: "AT": dinucleotidă; "GCAC": tetranucleotidă

• SSR-uri "complexe" = mai mult de un tip de motiv

27
 Markeri genetici – SSR (Simple sequence repeat - microsatellites)

Vizualizarea unui marker co-dominant cu ajutorul unei electroforezei într-un gel de agaroză

28
Markeri genetici – SSR (Simple sequence repeat - microsatellites)

Vizualizarea unui marker SSR cu ajutorul unei elecroforeze capilare

29
 Markeri genetici – Tipuri

Markeri dominant obtinuti printr-un mix intre PCR si enzime de digestie.

• CAPS: amplificare apoi digestie enzimatică

• AFLP: digerarea enzimelor, apoi amplificarea

30
 Markeri genetici – SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

• Modificarea unei nucleotide într-o secvență ADN

• Cea mai obișnuită formă de polimorfism in ADN

(în medie un SNP la 100 la 1000 bp)

Genotipul 1

Genotipul 2

31
 Markeri genetici – SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

• Modificarea unei nucleotide într-o secvență ADN

• Cea mai obișnuită formă de polimorfism in ADN (în medie un SNP la 100 la 1000 bp)

Genotipul 1

Genotipul 2

32
Markeri genetici – SNP Haplotypes

33
Markeri genetici – SNP: Tehnologii

34
Markeri genetici – SNP: Tehnologii

35
Markeri genetici – SNP: Tehnologii

Randament mare:
• număr mare de markeri ADN (1-1.5Mil.)
• număr mic de genotipuri (<100)

36
 Markeri genetici – KASP

Randament mediu:
• număr mic de markeri ADN (<100)
• număr mare de genotipuri (>1000)

37
? 38