Detectarea SARS-CoV-2 în apele uzate brute și tratate în

Germania - Potențial pentru supravegherea COVID-19 și

riscurile potențiale de transmisie

EVIDENȚE :

Primul studiu care raportează detectarea SARS-CoV-2 în apele uzate din Germania utilizând
RT-qPCR. • Prezența SARS-CoV-2 a fost fi confirmat prin secvențiere, dar și riscul
rezultatelor fals pozitive a fost elucidat.

• În apele uzate brute, în apele uzate brute s-au găsit 3,0 până la 20geni echivalenți / ml.

• Testele potențiale de replicare activ pentru probele de ape uzate.

• Secvențierea Sanger a fost necesară pentru a diferenția clar modelul genetic.

Monitorizarea pe bază de ape uzate a răspândirii noului virus SARS-CoV-2, denumită și

epidemiologie pe bază de ape uzate (WBE), a fost sugerată ca instrument de susținere a
epidemiologiei. O campanie extinsă de eșantionare, care include nouă stații de epurare a
apelor uzate municipale, a fost desfășurată în diferite orașe ale statului federal Renania de
Nord-Westfalia (Germania) în aceeași zi din aprilie 2020, aproape de fi primul vârf al crizei
coroanei. Probele au fost procesate și analizate pentru un set de SARS-CoV-2-speci fi
genele c, precum și secvențele genetice pan-genotipice care acoperă, de asemenea, alte
tipuri de coronavirus, utilizând reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă cantitativă
(RT-qPCR). În plus, a fost analizat un set cuprinzător de parametri chimici de referință și
bioindicatori pentru a caracteriza calitatea și compoziția apelor uzate. Rezultatele analizei
genei bazate pe RT-qPCR indică prezența urmelor genetice SARS-CoV-2 în diferite ape
brute. Mai mult, probele selectate au fost secvențiate folosind tehnologia Sanger pentru a
con fi rm speci fi orașul RT-qPCR și originea coronavirusului.
Introducere:

Actuala pandemie SARS-CoV-2 are consecințe globale de anvergură asupra sănătății

publice, activităților economice și societăților în ansamblu, care sunt fără precedent din
multe puncte de vedere și nu pot fi încă evaluate pe deplin ( OMS, 2020 ). Numărul și
proporția persoanelor infectate cu COVID-19 sunt determinate în principal pe baza
testării individuale și a diagnosticului bio-molecular pe bază de laborator utilizând, de
exemplu, reacția în lanț cu transcripție inversă cantitativă a polimerazei (RT-qPCR).
Cazurile COVID19 sunt raportate de autoritățile regionale de sănătate și sunt agregate la
nivelul, de exemplu, al statelor federale din Germania, precum și la nivel național ( RKI,
2020 ). Este de așteptat ca, pe baza testării individuale, care este adesea declanșată de
simptomele candidaților la test sau de profesioniștii lor de risc respectivi fi le, starea reală
de infecție într-o speci fi regiunea c poate fi estimată doar aproximativ Wurtzer și colab.,
2020 ).
Un studiu realizat de China a indicat, de asemenea, că cazurile nedetectate pot face
semn fi nu poate contribui la dezvoltarea infecției în ansamblu ( Li și colab., 2020 ).
Diversi cercetători au arătat că ARN-ul SARS-CoV-2 este detectabil în fecalele
persoanelor infectate (de exemplu, Amirian, 2020 ). Mai mult, SARS-CoV-2 ARN poate fi
găsit în probele de scaun săptămâni după ce infecția nu mai este detectabilă în probele
de tampon oral ( Y. Wu și colab., 2020 ).

Material și metode:

Nouă stații de epurare municipale operate de șase plăci de apă diferite au fost
selectate pentru analiză în întreaga Renania de Nord Westfalia (Germania). Plantele
au diferit în ceea ce privește capacitatea lor de proiectare, procesele de tratare și
caracteristicile bazinului hidrografic masa 2 ).
Utilizând dispozitive de autosamplare instalate, operatorii WWTP au colectat
24 de ore fl eșantioane compozite dependente de ow pe 8 aprilie 2020, în condiții de
vreme uscată, fie miezul nopții până la miezul nopții sau între dimineața zilei de 8
aprilie și dimineața zilei de 9 aprilie. Pe lângă apele uzate brute (canalizare) din fl
eșantioane colectate după capcana de nisip, canalizarea tratată a fost prelevată în
locații selectate .
Toate probele au fost transportate la laborator în sticlă fl întreabă gheața care
se topește în ziua eșantionării

Pentru controale, probele de canalizare colectate în campaniile anterioare de

prelevare a probelor de vreme uscată înainte de debutul presupus al pandemiilor
COVID-19 în Germania, care au fost ținute congelate - 18 ° C până când au fost
utilizate analize. Controalele au fost eșantionate la stația de epurare Moers-Gerdt
(C1-in fl eșantionat pe 18 iulie 2019) și Aachen-Soers (C2-ef fl a fost prelevat în
 noiembrie 2018, C3-ef fl disponibil în septembrie 2019 și C4-in fl din ianuarie
devreme 2017).

Prelucrarea probelor pentru izolare și cantități fi cation de ARN viral:

Probele de apă uzată congelate au fost decongelate la 4 ° C, iar un total de 45 ml au

fost procesate în continuare. În primul rând, apele uzate au fost centrifugate la 4700 × g timp
de 30 de minute fără pauză și supernatantul limpede a fost recoltat. Puri fi Apele uzate au
fost apoi concentrate folosind ultra centrifugă fi Unități de ltrare (Amicon® Ultra-15
Centrifugal Filter Unit, Sigma). Prin urmare, 15 ml de apă uzată s-au adăugat la fi ulterioară
și centrifugată timp de 15 minute la 3500 × g, iar supernatantul concentrat a fost recoltat.

Acest lucru a fost repetat de două ori până când 45 ml de apă uzată au fost complet
concentrate ( fi volumul nal de supernatant concentrat aproximativ 450 μ L). Pentru faza
solidă a probei de apă uzată, peleta probei de 45 ml a fost fi prima dată spălat cu apă
deionizată pentru a îndepărta resturile apoase din probă și centrifugat la 4700 × g timp de 5
minute înainte de a fi resuspendat în 150 μ L apă deionizată și centrifugată la 4700 × g 5 min
din nou.

Un volum de 150 μ L din supernatant a fost apoi recoltat pentru extragerea ulterioară
a ARN-ului și s-a determinat masa (aproximativ 150 mg în fl uent și 5 - 10 mg în ef fl uent).
Echipamente contaminate (de exemplu, tuburi de reacție, vârfuri, fi unități ulterioare) au fost
colectate și autoclavizate conform programului zilnic de curățare din laborator.

Potențialul infecțios al probelor de canalizare

Deși apele uzate din plantele investigate au fost tratate prin procese diferite, ARN-ul
viral nu este eliminat, așa cum se arată mai sus. Pentru a testa potențialul infecțios al apelor
uzate netratate și tratate, a fost utilizat un model de cultură celulară pentru a analiza acest
impact ( Fig. 6 ). Infecția celulelor Caco-2 diferențiate cu cultură celulară crescută, SARS-
CoV-2 (MOI 0,01) competentă pentru replicare a condus la inducerea unui efect citopatic
(CPE după 48 - 72 h).
 CPE se caracterizează prin celule rotunde și micșorate care se detașează de
suprafața culturii. Observarea CPE după două-trei zile la un MOI scăzut a indicat o replicare
rapidă tomoderată a virusului. Inocularea de celule Caco-2 diferențiate timp de zece zile cu
puri fi Apele reziduale concentrate (P2, P5, P11 și P12) nu au avut ca rezultat producerea de
particule SARS-CoV-2 infecțioase (date neprezentate), ceea ce sugerează că canalizarea
tratată pare a fi neinfecțioasă, chiar dacă fragmente de ARN viral poate fi detectat.

Din cauza lipsei CPE, quanti fi cation și veri fi cation prin RT-qPCR nu a fost
efectuată.

Concluzii

• SARS-CoV-2 ARN a fost detectat în fl Datorită celor 9 WWTP studiate la concentrații

similare cu cele raportate în alte studii. Screeningul nostru asupra diferitelor gene țintă indică
deficiențe în selectivitatea primerilor genetici utilizați în studiile publicate anterior de alți autori
care ar putea detecta, de asemenea, gene nespecifice fi c la virusurile SARS-CoV-2.

• Folosind secvențierea Sanger, con fi SARS-CoV-2 uman confirmat pentru proba

investigată luată în timpul focarului de pandemie SARS-CoV-2. În schimb, semnalele pozitive
din RT-qPCR nu au fost con fi confirmate prin secvențierea eșantioanelor reținute din 2017 și
2018. Aceste rezultate sugerează un nespecific fi semnal c în RT-qPCR, subliniind din nou
necesitatea urgentă a unui con fi rmarea rezultatelor RT-qPCR pozitive prin secvențierea sau
alte tehnici adecvate pentru a evita rezultatele fals pozitive.

• Quanti fi cationarea concentrațiilor genei SARS-CoV-2 și a încărcăturilor din apele uzate

trebuie să ia în considerare atât metodele de detectare SARS-CoV-2 atât în fază apoasă, cât
și în fază solidă și să stabilească protocoale standard robuste pentru curățare și măsurători
RT-qPCR.

• Am observat îndepărtarea slabă a SARS-CoV-2 în toate cele trei stații de epurare

convenționale studiate cu nămol activ. Ozonarea la scară completă la o plantă părea să
reducă fragmentele SARS-CoV-2 din ef fl uent. Stația de epurare pe bază de membrană
planificată să fie inclusă în studiile viitoare.