Structura şi metabolismul macromoleculelor

informaţionale

17.12. 2020
Metabolismul ADN-ului 3
Degradarea ADN-ului și a nucleotidelor
Catabolismul ADN-ului

Structura şi mecanismele de reparaţie fac ca molecula de ADN să fie una deosebit de stabilă
comparativ cu alte macromolecule molecule biologice. ADN-ul genomic al unei celule nu este
degradat în procesele metabolice normale pe parcursul vieţii celulare. Nu se poate vorbi despre un
timp de înjumătăţire al moleculei (sau moleculelor) de ADN din genomul unei celule.
Procesele catabolice prin care sunt degradate molecule de ADN apar în pentru:
1. molecule de ADN străin ajuns prin deiverse mecanisme în interiorul celulei (Cum?)
2. fragmente rezultate din mecanismele de reparaţie, cu predilecţie NER
Enzimele implicate în degradarea acizilor nucleici se numesc nucleaze – fosfodiesteraze ce pot
acţiona asupra ADN-ului - Deoxiribonucleaze (DN-aze) sau asupra ARN-ului - Ribonucleaze (RN-
aze).

Funcţie de modul de acţiune şi produşii rezultaţi, nucleazele se clasifică în:

1. exonucleaze – hidrolizeză căte o bază azotată din unul din capetele moleculei de ADN;
- pot funcţiona într-o singură direcţie, fie 3’→ 5’ fie 5’→ 3’ ;
- produsul de reacţie este reprezentat de nucleotide libere;
2. endonucleaze – hidrolizează o legătură fosfodiesterică din interiorul moleculei de ADN.
- pot hidroliza o singura catena sau simultan ambele catene;
- produsul de reacţie este reprezentat din 2 molecule de ADN
rezultate prin clivarea substratului
Endonucleazele de restricţie

O clasă specifică de nucleaze este reprezentată de endonuclezele de restrictie (sau restrictaze).

Restrictazele clivează specific moleculele de ADN dublu catenar după
recunoaşterea unei scurte secvenţe (4-8 nucleotide) de nucleotide
palidromice. Secvenţa specifică se numeşte situs de restricţie, iar enzima
clivează 2 legături fosfodiesterice, una de pe o catenă, alta de pe cealaltă
catenă.
Restrictazele se clasifică în:
1. restrictaze de de tip I – clivează în mod aleatoriu molecula de ADN şi
produc fragmente cu fosfat în 5’ şi OH în 3’;
2. restrictaze de de tip II – clivează molecula de ADN dublucatenar în mod
specific, în situsuri foarte clar definite. Clivarea se poate realiza la nivelul
axei de simetrie a situsul de restricţie, fragmentele rezultate având
extremităţile drepte, sau decalat fată de axa de simetrie, fragmentele
rezultate avănd capetele monocatenare şi complementare (capete
coezive);
3. restrictaze de de tip III – recunosc specific situsuri foarte clar definite
din molecula de ADN pe care o clivează la o distanţă dată de situs;
capetele formate sunt coezive;
3. restrictaze de de tip IV – acţioneză asupra ADN-ului modificat chimic;
Cu numere romane se indică

Iniţiala numelui genului

EcoRV a căta restrictază este
identificată în tulpina dată
urmată de primele 2 litere Tulpina specifică din care a
ale denumirii speciei fost izolată
Palidrom ( palin -inapoi, dromos – drum) – cuvinte, fraze sau secvenţe ce au aceeaşi semnificaţie indiferent de sensul în care sunt citite.
Editarea genetică se bazează pe endonucleazele de restricție
Degradarea nucleotidelor
Sinteza de-novo a nucleotidelor este un proces complex si costisitor din
punct de vedere energetic. De accea, bazele şi nucleotidele libere rezultate
din liza ADN-ului nu sunt degradate, ci sunt re-ultilizate. În organismul
uman, 90% din bazele purinice libere (adenină şi guanină) sunt
reconvertite în nucleotid monofosfat prin cuplarea cu fosforibozil- Adenozină
pirofosfat. Bazele pirimidinice sunt mai putin reutilizate.

a. Degradarea nucleotidelor purinice –

se iniţiază prin clivarea restului ribozo-
fosfat şi modificarea bazei azotate cu
obţinerea acidului uric. Acesta poate fi Xantină
excretat ca atare sau convertit la
alantoină. Xantin-oxidază

Excretat la Inozină Guanozină

primate,
păsări şi
reptile

Acid uric
Uricază Excretată la
Acidul uric are o solubilitate redusă în majoritatea
Hipoxantină Guanină
mamiferelor
apă. Acumularea lui în exces datorită
unor disfuncţionalităţi metabolice duce la
depunerea sub formă de cristale în Alantoină
articulaţii – gută.
Acid alantoic Xantină
Degradarea nucleotidelor Citozină

b. Degradarea nucleotidelor pirimidinice - se iniţiază în

mod similar prin clivarea restului ribozo-fosfat şi
eliberarea bazelor azotate. Acestea sunt apoi degradate
prin clivarea inelului pirimidinic cu obţinerea de
intermediari solubili în apă. Timină
Uracil

Dihidrouracil Dihidrotimină

N-carbamoil- N-carbamoil-β-
β-alanină amino-izobutirat

β-alanină
β-amino-izobutirat
Metabolismul ARN

18.12. 2020
DOGMA CENTRALĂ A BIOLOGIEI MOLECULARE

Transcriere
ADN (transcripție) ARN Traducere
Secvenţă de nucleotide (translație) Proteine
Secvenţă de nucleotide
(A;T;G;C) Informaţie Secvenţă de aminoacizi
Informaţie (A;U;G;C)
Nucleu Ribozomi
(citoplasmă)

Expresia informației genetice stocate în ADN presupune realizarea a 2 procese distincte:

Transcrierea (transcripția, transcription, engl.) informației genetice
● procesul de copiere a informație genetice din molecula de ADN prin sinteza pe baza complementarității bazelor

azotate a unei molecule de ARN. Sinteza este realizată de o ARN-polimerază ADN dependentă.
● informația este simultan copiată și transpusă din limbajul ADN (A;T;G;C) în limbajul ARN (A;U;G;C)

● are ca rezultat sinteza a trei tipuri distincte de ARN:

ARN ribozomal (ARNr) – împreună cu proteinele ribozomale alcătuiesc ribozomii

ARN mesager (ARNm) – copii ale secvenței de ADN ce asigură transportul informației din nucleu spre
ribozom și specifică ce aminoacizi vor fi încorporați în structura catenei peptidice
ARN de transfer (ARNt) – asigură atât transportul aminoacizilor din citosol în ribozomi cât și poziționarea
corectă a acestora în catena polipeptidică

Traducerea (translația, translation, engl.) informației genetice

● procesul de convertire a secvenței de nucleotide din molecula de ARNm într-o secvență de aminoacizi ce va forma

catenă polipeptidică.
● Procesul are loc la nivelul ribosomilor (ARNr) cu participarea activă a ARNt
Sinteza ARN-ului sau transcrierea
Sinteza ARN-ului se realizeză prin copierea secvenţei de nucleotide de pe una
din catenele de ADN în cadrul procesului numit transcriere şi realizat de enzima ARN-
polimerază. Enzima catalizează formarea legăturilor fosfodiesterice între ribonucleotide şi sinteza unei molecule de
ARN pe baza complementarității cu o catenă de ADN matriţă conform reacţiei:
(NMP)n + NTP -> (NMP)n+1 + PPi
Catena matriță se numește catenă antisens (-). Catena de ADN ce nu este folosită ca matriță are aceeaşi secvenţă
cu a copiei ARN (T este înlocuit cu U) şi se numeşte catenă codificatoare (sens sau +) deoarece conține informația
genetică.
La eucariote au fost descrise 3 ARN-polimeraze distincte:
ARN – polimeraza I – transcrie regiunile ce codifică ARNr
ARN - polimeraza II – sintetizează ARNm
ARN – polimeraza III - transcrie regiunile ce codifică ARNt
ARN-polimeraza de la bacterii conţine 5 subunităţi:
● două subunităţi a implicate în mecanismele de reglaj ale transcrierii

● o subunitate b' ce se leagă de catena ADN matriţă

● o subunitat b ce leagă nucleotidele necesare sintezei ARN

● o subunitate s ce recunoaște promotorul şi iniţiază transcrierea propriu-zisă.

Indiferent de tipul de polimerază, iniţierea transcrierii este dependentă de atașarea enzimei de catena ADN matriță la
nivelul unei secvențe promotor amplasată pe catena de ADN în amonte de locul de start al transcrierii.
La procariote, promotorul este alcătuit din 2 secvenţe:
● secvența „– 35” - succesiunea de baze TTGACA amplasată cu 35 de nucleotide înainte de locul de start al

transcrierii;
● secvenţa „– 10” – succesiunea de baze TATAAT amplasată cu 10 de nucleotide înainte de locul de start al

transcrierii.
La eucariote, promotorul conţine secvenţa TATAAA numită TATA box şi amplasată cu 25 de nucleotide înainte
de locul de start al transcrierii.
 Etapele sintezei ARN

1. Iniţierea – constă în recunoaşterea de către subunitatea s a secvenţei -10 a promotorului (TATA box la eucariote)
şi legarea ARN-polimerazei de promotor. Odată legată, enzima de-spiralizează dublul helix ADN pe o porțiune de
aprox. 17 nucleotide şi expune cele două catene.
2. Elongarea – transcrierea propriu-zisă începe prin ataşarea unei molecule de ATP sau GTP ce oferă un capăt 5'
liber. De aici, pe baza complementarității cu catena anti-sens se sintetizează o catenă ARN în direcția 5'->3'.
Ansamblul alcătuit din ARN-polimerază, porțiunea de ADN despiralizat şi copia ARN alcătuiesc așa numita bulă de
transcriere. În interiorul bulei, primele 8-12 baze ale copiei ARN formează temporar un dublu helix cu catena
antisens. Bula de transcriere se mișcă de-a lungul catenei moleculei ADN cu viteza de 50-90 baze/sec.

Bula de transcriere
Catenă sens

Despiralizare
Respiralizare

Catenă matriţă
(antisens)

ARN-polimeraza
Copie ARN

Complex ADN-ARN
Situs activ
Direcția de deplasare
3. Terminarea – la finalul mesajului de copiat există semnale de terminare a transcrierii sub forma unor zone bogate
în GC. ARN-polimeraza este frânată de aceste zone şi complexul ADN-ARN se desprinde de bula de transcriere.
Etapele sintezei ARN
 Catena sens vs catenă antisens

Catenă sens (+)

ADN 5' ATGGCTAGGGCCGCAAGGGAAATGGAGAGGGAATAA 3'

3' TACCGATCCCGGCGTTCCCTTTACCTCTCCCTTATT 5'
Transcriere
Catenă antisens (-)

ARNm 5' AUGGCUAGGGCCGCAAGGGAAAUGGAGAGGGAAUAA 3'

M A R A A R E M E R E STOP ARNm complementar cu
Traducere START catena antisens, aceeași
secvență cu catena sens
conține informație - are sens
Catenă polipeptidică
MARAAREMERE
5' UUAUUCCCUCUCCAUUUCCCUUGCGGCCCUAGCCAU 3'
L F P L H F P C G P S H
ARNm complementar cu
catena sens (inversata
directia!!!), aceeași secvență cu
catena non-sens
nu conține informație bună–
este non-sens
Modificări post-transcriere ale ARN-ului
Molecula nou sintetizată de ARN reprezintă o copie primară ce este apoi modificată în mod specific
printr-un proces numit procesarea sau maturarea ARN-ului. Modificările au în principal rolul de a
proteja molecula de ARN de RN-azele celulare, dar şi rol funcţional. Principalele tipuri de modificări
post-transcreire ale ARN-ului sunt:

1. Adăugarea la capătul 5’ al ARNm a 7-metil-guanozinei – 5’ - cap;

2. Adăugarea unei cozi poliA la capătul 3’ al ARNm – poli(A) tail;

2. Splicing-ul intronilor şi exonilor în cazul ARNm;

4. modificarea chimică a bazelor azotate în ARNt şi ARNr

Modificările 1-3 sunt în general specifice eucariotelor, iar

4 apare EK și la PK
1. Procesarea la capătul 5’ al ARNm
Majoritatea moleculelor de ARNm la EK au în capătul 5’ un aşa numit
5’-cap alcătuit din:

1. un rest de 7-metil-guanozină legat printr-o legătură 5’5’ trifosfat

7-metil-
de prima nucleotidă a catenei ARNm. Ataşarea nucleotidei modificate
guanozina
se face printr-o reacție de condensare între GTP şi fosfatul de la
capătul 5’ al catenei ARN, urmată de o metilare la N7.

Legătură 5’,5’ trifosfat

2. În mod frecvent, dar nu întodeauna, din grupe metil în poziţiile 2’
pentru primele 2 nucleotide din copia ARN.

Rolul modificărilor din 5’:

- protejarea împotriva RN-azelor; Uneori metilat
- recunoaşterea de către ribozomi a ARNm ce
trebuie tradus

Uneori metilat
2. Procesarea la capătul 3’ al ARNm
La capătul 3’ majoritatea moleculelor de ARNm eucariot au o
secvenţă de 80 – 250 resturi de A ce alcătuiesc aşa numita
coadă poli(A).

De această coadă se asociază proteine specifice protejează

molecula de ARN împotriva degradării de către RN-aze. Coada
se atașează în timpul transcrierii, într-un situs marcat de:
- secvenţa înalt conservată 5’AAUAAA3’ amplasată 10-30
nucleotide în amonte de situsul de ataşare;
- o zonă bogată în G şi U aplasată 20-40 de nucleotide în aval
de situsul de ataşare

Procesul ataşării cozii poli(A) presupune parcurgerea mai

multor etape:
- transcrierea moleculei de ARNm depăşeşte locul de
ataşare şi se sintetizează astfel ARN în exces;
- o endonuclează se ataşează de ARN polimeraza II şi
secționează excesul de nucleotide;
- se generează astfel un OH 3 liber la care sunt ataşate A de
către o poliadenilat-polimerază după reacţia:

ARN + nATP --- ARN-(AMP)n + nPPi

Procesarea capetelor ARNm
3. Splicing-ul ARNm
La bacterii, genele sunt continuii, în sensul că o porțiune de ADN este
colineară cu catena polipeptidică (proteina) pe care o codifică.
La eucariote însă, genele contin porţiuni ce se regasesc în catena polipeptidică (sunt copiate în
ARNm şi traduse, se numesc exoni) şi zone care nu se re-găsesc în catena polipetidică finală (sunt
copiate în ARNm dar nu sunt traduse în aminoacizi, introni).
Exoni codifică în general 30-60 de aminoacizi şi au deci dimensiuni între 100-200 nucleotide (rar
peste 1000 de nucleotide).
Intronii au între 50 şi 20 000 nucleotide.

ARN-ul mesager primar la eucariote, dar şi la câteva eubacterii şi arheobacterii, este așadar un
mozaic de exoni ce alternează cu introni, aceşia din urmă fiind majoritari. Înainte de a fi tradus în
proteine, intronii sunt eliminaţi prin procesul de splicing ARNm.

Funcţie de mecanismul molecular al procesului de splicing, au fost descrişi 4 clase de introni:

1. grupa I – intronii se elimină autocatalitic, prin reacţii de trans-esterificare în care este implicată o
guanozină;
2. grupa II - intronii se elimină autocatalitic, prin reacţii de trans-esterificare în care este implicat un
rest de A din structura intronului;
3. introni spliceosomali – introni ce sunt eliminaţi prin acţiune catalitică a unui ansamblu molecular
complex numit spliceosom;
4. introni ARNt – intronii sunt eliminați prin acţiunea catalitică a unor endonuclease specifice.
3. 1. Mecanismul molecular al eliminării intronilor din grupa I
Intronii din grupa I se găsesc în gene nucleare, mitocondriale şi cloroplastice ce
codifică ARNm, ARNr sau ARNt şi reprezintă unul din rarele exemple de splicing
la bacterii.
Procesul de splicing:
- necesită un rest de guanozină pentru ca
procesul catalitic să se desfășoare, dar cofactorulCopie primară
nu este folosit ca sursă de energie;
- nu necesită intervenția altor proteine;
OH din 3’ al guanozinei
- este auto-catalitic – moleculele de ARN ce conțin atacă restul fosfat 5’ al
acest tip de introni au fost numite ribozime; intronului;

- restul OH din 3’ al guanozinei are rol nucleofil și

formează o legătură 3’,5’ obişnuită cu capătul 5’ al
intronului; grupa OH formată la capătul 3’ al
exonului joacă acelaşi rol de reactant nucleofil şi
realizeză aceeași recţie cu capătul 3’ al intronului.
3’ OH din exon realizeză
un atac nucleofilic şî
finalizeză reacţia

ARNm procesat

Mecanismul chimic al atacului nucleofil şi

realizarea reacţiei de transesterificare
3. 2. Mecanismul molecular al eliminării intronilor din grupa II
Intronii din grupa II se găsesc în gene nucleare, mitocondriale şi cloroplastice
din fungi, alge, plante şi rar în bacterii. Intron
Procesul de splicing:
- este auto-catalitic şi nu necesită intervenția
altor molecule; Copie ARNm primară
- mecanismul de reacţie este similar cu al
intronilor din grupa I, însă atacul nucleofil este
realizat de OH 2’ al unei A din structura OH 2’ al unei A specifice
intronului atacă în 5’ situsul de
splicing ce desparte exonul Legătură 2’, 5’ fosfodiesterică
- apare un intermediar ARNm circular similar cu de intron
un lasso în care A formează trei legături
fosfodiesterice;
- OH 3’ al exonului funcţionează ca nucleofil şi
atacă capătul 5 al exonului următor. Intronul
este eliminat sub forma unui molecule circulare
ramificate, iar exonii sunt legaţi formând ARNm
Intermediar circular
matur.
Adenozina implicată în
OH 3’ al exonului atacă în reacţie formează 3
situsul de splicing al legături fosfodiesterice
intronului cu exonul următor

ARNm procesat
3. 3. Procesarea intronilor spliceosomali
În cazul majorităţii intronilor, procesul de splicing nu este auto-catalitic. Aceşti
introni nu sunt denumiţi cu un număr de grupă şi includ intronii din genele
nucleare.
Mecanismul de splicing presupune formarea aceluiași intermediar circular similar cu un lasso, dar
este catalizată de un complex nucleoproteic de dimensiuni mari numit spliceosom ce este alcătuit
din:
- nucleoproteine numite small nuclear ribonucleoproteins – snRNPs
- cinci tipuri de ARN nuclear de 100-200 nucleotide numite small nuclear RNAs (snRNAs) şi notate
U1, U2, U4, U5, U6. Fiecare snRNP conţine câte un tip de snRNA.

Intronii spliceosomali au în general secvenţele dinucleotidice GU şi AG la

capătul 5’ şi respectiv 3’ ce marchează situsul de clivare. snRNA U1 conţine o
secvenţă complementară cu cea din 5’ a intronilor şi se leagă de aceasta, ceea
ce permite apoi legare U2, U4, U5 şi U6 şi formarea spliceosomului propriu-zis.
Procesul de asamblare a complexului molecular necesită energie, dar clivarea
intronului şi ligarea exonilor nu.
Splicingul intronilor spliceosomali
Imagine generală asupra procesării moleculei de ARNm
4. Procesarea ARNr şi ARNt
Atât la PK cât şi la EK, ARNr este produs sub forma unui molecule unice de pre-
ARN ribozomal sintetizate de polimeraza Pol I, moleculă de dimensiuni mari și
care conține toate tipurile de ARNr.
Astfel, la bacterii pre-ARNr are 6500 de nucleotide şi 30S, conţinând ARN-ul 16S, 23S şi 5S. La
eucariote, preARNr are 45S și conține ARNr specific, adică 18S, 28S şi 5.8S. După sinteză, preARNr
este maturat prin metilări specifice şi clivări similare procesului de splicing. Clivările sunt realizate de
RN-aze specifice precum RN-aza P, RN-aza III sau RN-aza E, iar excesul de nucleotide este înlăturat
de nucleaze.

Procesarea pre-ARNr la bacterii Procesarea pre-ARNr la eucariote

4. Procesarea ARNr şi ARNt
ARNt este şi el sintetizat sub forma unui precursor de dimensiuni mult mai mari
decât produsul final.
Maturarea ARNt preuspune:
- clivarea enzimatică dacă ARNt primar conţine mai multe tipururi de ARNt;
- eliminarea excesului de nucleotide din capătul 5 prin acţiunea RN-azei P;
- eliminarea excesului de nucleotide din capătul 3 prin acţiunea RN-azei D;
- atașarea la capătul 3 al trinucleotidei CCA de care se va ataşa aminoacidul specific ARNt.
Ataşarea este realizată de o RNAt-nucleotidil-transferază ce nu are nevoie de ADN pt a sintetiza
secvenţa de 3 nucleotide ARN;
- metilarea, deaminarea sau reducerea specifică a unor baze azotate.
 Catabolismul RNA

Spre deosebire de ADN, moleculele de ARN sunt mult mai puţin stabile. Concentraţia citoplasmatică
a ARN (sau a oricărei molecule de altfel) depinde de 2 factori: - viteza de producere vs. rata de
degradare. În cazul ARNm, echilibrul dintre cele 2 procese face parte integrantă din procesul de reglaj
al activităţii genelor.

Timpul de înjumăţăţire mediu al unei molecule de ARNm la EK este de 3 ore, iar la PK este de 1.5
min. Timpul de înjumătăţire al ARNm variază însă în limite foarte mari:
- căteva secunde dacă produsul unei gene este necesar în cantiţăţi mici (factori de transcriţie);
- căteva generaţii celulare dacă produsul este necesar constant în celulă (proteina tubulină);

ARN- ul este degradat de ribonucleazele celulare.

● În PK, procesul contă în atacul unor endoribonucleaze urmate de atacul 3’→5’ al exoribonucleazelor;

●La EK inferioare, este eliminată coada poliA, apoi capătul 5`, molecula fiind degradată în direcţia 3’→5’

●La EK superioare, ARN-ul este degradată în direcţia 5’→3’ de un complex de 10 exoribonucleaze ce

poartă numele de exozom.

Nucleotidele eliberate sunt fie refolosite pentru sinteza de catene noi de ARN, fie degradate prin căi
similare cu deoxinucleotidele (discutate anterior).