Diagnostic clinic de laborator

Biochimia clinic

Diagnosticul clinic biochmic de laborator este o disciplin medicotiinific, care :

studiaz interdependena ntre starea

fiziologic (patologic) a organismului i modificarea n compoziia celulelor i lichidelor biologice; elaboreaz metode de cercetare obiectiv a componenei celulare i chimice a esuturilor i lichidelor biologice;

Diagnosticul clinic biochimic de laborator utilizeaz datele obinute

pentru :

determinarea devierilor de la norm, determinarea diagnozei, prognozei

maladiilor, estimarea eficacitii tratamentului, efectuarea controlului asupra terapiei medicamentoase, profilaxia patologiilor.

Diagnosticul clinic de laborator

include mai multe direcii :
Biochimie clinic, hematologie clinic, citologie, imunologie, microbiologie, micologie, parazitologie, toxicologie clinic.

75% din toate investigaiile clinice n prezent se

efectueaz cu aplicarea metodelor de biochimie clinic, deoarece a fost demonstrat, c la baza patogeniei majoritii maladiilor stau dereglri primare sau secundare ale metabolismului.

Metodele biochimice i fizico-chimice sunt mult mai

diverse, iar deseori i semnificativ mai informative dect cele microscopice.

Obiectele de cercetare clinicobiochimic sunt:

Lichidele biologice: sngele,

lichidul cefalorahidian, transudatele, exudatele, urina, saliva; esuturile.

Etapele investigaiilor de laborator

Preanalitic

Analitic

Postanalitic

Etapele investigaiilor de laborator

Etapa preanalitic include:

Selectarea i solicitarea investigaiei de
laborator;

Alegerea termenilor optimali pentru

efectuarea investigaiei; probei biologice;

Pregtirea pacientului ctre recoltarea Recoltarea adecvat a probei biologice; Prelucrarea primar a probei, transportul i
pstrarea ei.

Etapa preanalitic :
Indicarea testelor

Obinerea biomaterialului

1. Faza preanalitica n exteriorul laboratorului 20%

Transportarea

nregistrarea i pstrarea

2. Faza preanalitic n interiorul laboratorului 37%

Pregtirea probelor

Centrifugarea

Repartizarea pe aparate

Etapa analitic const n:

Prelucrarea preliminar special a
probei biologice;

Efectuarea testului de
laborator;

Controlul calitii investigaiilor.

Etapa postanalitic include:

Primirea rezultatelor investigaiei
de ctre medicul-clinician; Interpretarea rezultatelor obinute; Luarea deciziei referitor la necesitatea testrilor suplimentare; Prescrierea tratamentului

Etapa preanalitic:
- pentru a selecta i a solicita investigaiile de laborator este necesar:

A efectua o analiz clinic complex a strii

pacientului

A determina care investigaii de laborator sunt

necesare de a fi efectuate n scopul obinerii unei informaii maximal utile.

A completa corect buletinul de trimitere

Profilul Biochimia sngelui"

Teste biochimice standard. Permit de a depista la timp devierile n starea organismului, de a pune diagnoza i de a elabora programul tratamentului. Se recomand de efectuat o dat la jumtate de an.
l (Alanin aminotransferaza) s ( Aspartat aminotransferaza) Proteina total Fraciile proteice (Serum Protein Electrophoresis) Bilirubina total Bilirubina direct Gamma-glutamil transferaza (GGT) Fosfataza alcalin +( Potassium), Na+(Sodium), l(Cloride) Creatinina Urea Glucoza Colesterol total

Profil Cardiorisc"
Teste biochimice, ce permit de a aprecia afectarea recent a miocardiocitelor, precum i riscul dezvoltrii patologiilor cardio-vasculare n viitor.

LDH (Lactat dehydrogenaza) LDH-1 l (Alanin aminotransferaza) s ( Aspartat aminotransferaza) +( Potassium), Na+(Sodium), l-(Cloride) Creatin kinaza Creatin Kinaza-MB Protrombina Proteina C-reactiv (CRP) Trigliceride Fibrinogen Colesterol total HDL Colesterol LDL Colesterol

Profil Lipidic"

Teste biochimice, utilizate n diagnosticul aterosclerozei i aprecierea riscului complicaiilor (boala ischemic a cordului, infarct miocardic, patologii vasculare ale encefalului).

Trigliceride Colesterol total HDL Colesterol LDL Colesterol

Profilul Investigaii hepatice : screening"

l (Alanin aminotransferaza) s ( Aspartat aminotransferaza) Bilirubina total Bilirubina direct Gamma-glutamil transferaza (GGT) Fosfataza alcalin

Profilul Investigaii hepatice : complet"

Teste biochimice, ce permit de a depista i de a caracteriza gradul de afectare a celulelor hepatice, de a aprecia starea funcional a ficatului, de a elucida cauzele posibile ale patologiei.

l (Alanin aminotransferaza) s ( Aspartat aminotransferaza) Proteina total Fraciile proteice (Serum Protein Electrophoresis) Bilirubina total Bilirubina direct Gamma-glutamil transferaza (GGT) Fosfataza alcalin Protrombina Colinesteraza

Profilul Investigaii renale"

Teste biochimice pentru aprecierea strii funcionale a rinichilor i depistarea patologiilor renale.

Creatinina Urea +( Potassium), Na+(Sodium), l-(Cloride) Ca (Calcium total) g (Magnesium) P (Fosfor neorganic) Analiza general a urinei (cu microscopia sedimentului)

Profil diabetic"
Testul de baz pentru diagnosticul diabetului zaharat. Testul este important n alegerea terapiei i monitoringul tratamentului. n monitoringul diabetului se utilizeaz i teste, ce dau o informaie retrospectiv despre starea metabolismului glucidic.

Glucoza Hemoglobina glicozilat (HbA1, Glycated

Hemoglobin) C-Peptidul Fructozamina

Profilul Diagnostilul osteoporozei"

Teste biochimice destinate pentru aprecierea general a metabolismului mineral, reglrii lui, precum i pentru aprecierea coninutului markerilor metabolismului osos.

Ca (Calcium total) P (Fosfor neorganic) Hormonul paratiroid (Parathyroid hormone, PTH) Creatinina N-steocalcina Dezoxipiridinolina (n urin)

Reguli importante n alegerea termenilor optimali pentru efectuarea investigaiei de laborator :

Recoltarea probelor biologice se

efectueaz de obicei ntre orele 7 i 9 dimineaa. dup 8-12 ore de inaniie (n stare bazal).

Recoltarea probelor se efectueaz

 Recoltarea probelor se efectueaz nainte de

procedurile diagnostice i terapeutice, capabile s influeneze rezultatele testelor.

n cazul administrrii medicamentelor este

necesar de a lua n consideraie posibilele efecte ale preparatului asupra parametrului testat i de a alege perioada de timp cnd aceste efecte sunt minime.

Obligatoriu se indic timpul exact de

recoltare a probei n documentele corespunztoare.

Etapa preanalitic:

la alegerea termenilor optimali pentru efectuarea investigaiei de laborator este necesar de a lua n consideraie c: coninutul diferitor compui n snge variaz n dependen de:

- ritmul circadian (diurn, sezonier) - fazele ciclului menstrual (la femei)

Parametrii sanguini, nivelul crora variaz esenial n decursul zilei:

Hormoni:
Adrenalina Aldosterona Testosterona ACTH Somatotropina Cortozolul Prolactina Tiroxina Noradrenalina

Electroliii: Elemente figurate:

Fe
Na

Eritrocite Eozinofile

K
Fosfaii

Parametrii sanguini, nivelul crora variaz esenial n dependen de fazele ciclului menstrual :
Hormonul foliculostimulator Hormonul luteinizant

aldosterona

Sporesc nainte de ovulaie

Parametrii sanguini, nivelul crora variaz esenial n dependen de fazele ciclului menstrual :
Estrogenii Progesterona

Parametrii sanguini, nivelul crora variaz esenial n dependen de fazele ciclului menstrual :
colesterolul Fosfaii fierul

Scade la ovulaie

Scad la menstruaie

Factorii, ce influeneaz asupra rezultatelor investigaiilor de laborator:

Variabile intrinseci

Particularitile individuale ale pacientului:

vrsta
sexul

rasa

N PARAMETRU 1. 2.

VRSTA BRBAI FEMEI

0-10 11-100 3. -Glutamiltransferaza 0-100

4.

AlAT, U/l AsAT, U/l

0-100

0-41 15-60 0-37 12-64

0-31 15-60 0-31 9-36 8-53

alfa-Amilaza, U/l 0-100

5.
6

7.

Lipaza, U/l Fosfataza alcalina, U/l LDH, U/l

0-100
0-17 18-100 0-1 2-100

0-60
0-448 0-258 0-500 0-480

N 8.

PARAMETRU Creatinfosfokinaza

VRSTA 0-1 2-100

BRBAI FEMEI 24-229 24-170 24-195

9.

Proteina total g/l

10.

11.

Acidul uric, mol/l Creatinina, mol/l

0-1 1-2 3-14 15-60 61-100 0-14 15-100

0-1 2-5 6-17 18-60 61-90 91-100

51-73 56-75 60-80 64-83 62-81 190-440 190-363 214-448 137-363

98-156 27-62 44-88 80-115 71-115 88-150 18-35 27-62 44-88 53-97 53-106 53-115

N 12.

PARAMETRU Trigliceridele, mmol/l

VRSTA 0-5 6-11 12-15 16-19 20-29 30-39 40-49 50-100

BRBAI 0,34-0,97 0,35-1,22 0,41-1,56 0,45-1,84 0,5-2,09 0,55-3,21 0,63-3,37 0,7-3,25

FEMEI 0,36-1,12 0,4-1,29 0,46-1,56 0,45-1,45 0,45-1,45 0,43-1,81 0,5-2,1 0,62-2,79

13.

Colesterol total, mmol/l

0-4 5-15 15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-70

2,9-5,1 3,1-5,2 3,1-5,4 3,2-5,6 3,4-6,3 3,6-6,6 3,8-6,9 3,9-7,0 4,1-7,2

3,1-5,2 3,2-5,2 3,2-5,6 3,3-5,8 3,4-6,0 3,6-6,3 3,8-6,5 3,9-6,7 4,2-7,4

N
15.

PARAMETRU
Glucoza, mmol/l

VRSTA BRBAI FEMEI

0-6 7-19 20-60 61-100 0-14 15-18 19-60 61-90 4,1-7,0 3,9-5,9 3,9-6,4 4,6-6,4 38-54 32-45 38-51 32-46

16.

Albumina, g/l

PARAMETRU VRSTA
0-14 15-100 0-1 2-3 4-6 7-9 10 - 12 13 - 15 16 - 18 19 - 100 0-1 2 - 12 13 - 25 26 - 40 41 - 100

BRBAI FEMEI
1,76-3,52 2,15-2,57 1,15 - 2,15 1,00 - 1,95 1,05 - 1,8 0,95 - 1,75 1,05 - 1,85 0,95 - 1,65 0,85 - 1,60 0,84 - 1,45 6 - 28 6 - 28 4 - 24 4 - 24 7 - 28 7 - 30 6 - 30 4 - 24 7 - 22 7 - 28

17. Calciu, mmol/l 18. Fosfor, mmol/l

19. Fier, mol/l

PARAMETRU VRSTA BRBAI FEMEI 0-1 2 - 17 18 - 100 0-1 1-5 6-9 10-13 14-19 20-100 0,48 - 1,05 0,60 - 0,95 0,73 - 1,06 10-20 10-18 12-16 12-15 12-18 10-18 9-15 7-23

20. Magneziu, mmol/l

21. Zn, mol/l

Influena rasei asupra rezultatelor investigaiilor de laborator:

Creatinkinaza
Negri

Europeni

Amilaza
Indieni

Factorii, ce influeneaz asupra rezultatelor investigaiilor de laborator:

Particularitil e alimentaiei Efort fizic i stres emoional

Variabile extrinseci Fumatul, alcoolul, cofeina, drogurile Medicamentel e

Proceduri diagnostice i terapeutice (roentgenografia, colonoscopia, proceduri fizioterapeutice)

Influena inaniiei asupra parametrilor biochimici sanguini:

Parametrul
Inaniie 48 ore Inaniie 72 ore
Bilirubina Glucoza Trigliceride Acizi grai liberi

Tipul efectului
Sporire Scdere Sporire

Influena alimentaiei asupra parametrilor biochimici sanguini :

Parametrul Produse bogate n lipide
Produse bogate n proteine i purine (carnea) + Trigliceride Fosfataza alcalin Acid uric Ureea

Tipul efectului
Sporire

Sporire

Influena alimentaiei asupra parametrilor biochimici sanguini :

Parametrul
Produse bogate n acizi grai nesturai Produse bogate n serotonin (banane, tomate, etc.) Colesterol

Tipul efectului
Scdere

Acid 5-oxiindolilacetic

Sporire

Influena alimentaiei asupra parametrilor biochimici sanguini :

Parametrul
Produse bogate n pigmeni (rodii, portocale) Cofeina Bilirubina

Tipul efectului
Sporire

Glucoza Acizi grai liberi

Sporire

Influena asupra parametrilor biochimici sanguini :

Parametrul
Alcool Lactat Acid uric Trigliceride

Tipul efectului
Sporire

-glutamiltransferaza
Glutamatdehidrogenaza Transaminazele Morfina

-amilaza
Lipaza

Sporire

Influena asupra parametrilor biochimici sanguini :

Parametrul
Efort fizic Lactat Glucoza Acizi grai liberi Transaminaze (ALAT, S) Creatinkinaza Lactatdehidrogenaza (LDH) Aldolaza Acizi grai liberi Lipoproteine LDL

Tipul efectului
Sporire

Fumatul

Sporire

Influena asupra parametrilor biochimici sanguini :

Parametrul
Stresul Lactat Glucoza Acizi grai liberi Fierul Enzime Proteina total i fraciile proteice Bilirubina Colesterol Trigliceride

Tipul efectului
Sporire

Schimbarea brusc a poziiei corpului

Sporire

Medicamente ce influeneaz rezultatele testelor biochimice de laborator

Parametrul
-amilaza

Medicamentul
Preparate colinergice

Tipul efectului
Sporire

Bilirubina
Calciu

fenobarbital
Contraceptive hormonale Androgeni Corticosteroizi

Scdere
Sporire

Scdere

Medicamente ce influeneaz rezultatele testelor biochimice de laborator

Parametrul Colesterol Medicamentul
ACTH
Heparina Tiroxina

Tipul efectului
Sporire
Scdere Sporire

Creatinkinaza

Dexametazona Digoxina Fenobarbital Antibiotice

Creatinina

Sporire

Medicamente ce influeneaz rezultatele testelor biochimice de laborator

Parametrul
Glucoza Proteina total L S

Medicamentul
Furosemid ACTH Adrenalina Corticosteroizi Steroizii anabolici Ampicilana Gentamicina Oxacilina Opiaii

Tipul efectului
Sporire Sporire Sporire

Pregtirea pacientului ctre recoltarea probei biologice

Instruirea pacientului cu privire la diet, regim i procedurile de recoltare

Recoltarea materialului biologic primar pentru investigare

n calitate de material biologic pentru investigaiile clinice de laborator cel mai frecvent este utilizat sngele. Recoltarea sngelui se efectueaz prin:

Venepuncie; Recoltarea sngelui capilar.

Sngele venos constituie materialul biologic preferenial pentru investigaiile biochimice, hormonale, serologice, imunologice, precum i pentru investigaiile hematologice.

Venepuncie VACUETTE

Dezinfectm locul punciei i aplicm garoul

Efectum venepuncia

Scoatem garoul i colectm sngele n eprubetele necesare

Cu atenie amestecm sngele

Scoatem acul

Cauzele ntreruperii getului de snge n timpul venepunciei

Colapsul venei Vrful acului este lipit de peretele venei Acul a strpuns vena

Optimal

Recoltarea materialului biologic primar pentru investigare

Recoltarea sngelui venos se efectueaz cu ajutorul unor sisteme speciale cu vacuum, care:

exclud complet contactul cu materialul biologic i

asigur securitatea att a pacientului, ct i a personalului medical, exclud contactul sngelui cu mediul extern, prentmpin destrucia celulelor sanguine, asigur un raport optim snge/stabilizator,

- aceasta permite de a evita defecte ale materialului biologic, contribuie la stabilitatea analiilor i obinerea unui rezultat corect al testului de laborator.

Sistemul VACUTAINER const din trei componente :

1. Ac special bidirecionat cu o supap protectoare

2. holder VACUTAINER

3. Eprubet steril cu coninut dozat de vacuum.

Prioritile fa de sistemele deschise:

durata recoltrii sngelui se reduce cu
30-40%, constituind doar 7-10 sec. la 2%) datorit evitrii destruciei mecanice a eritrocitelor .

se reduc cazurile de hemoliz (de la 5-8

Se minimizeaz formarea micro-

cheagurilor, deoarece sngele contacteaz imediat cu anticoagulantul.

Prioritile fa de sistemele deschise:

Perioada de timp ntre recoltarea sngelui i
contactului su cu anticoagulantul este ntotdeauna constant;

Este constant i raportul

snge/anticoagulant deoarece:

- volumul anticoagulantului este dozat exact n procesul de producere a eprubetei;

- volumul sngelui recoltat este determinat de volumul dozat de vacuum din eprubet

Prioritile fa de sistemele deschise:

Reducerea timpului de aplicare a

garoului, deoarece la recoltarea n eprubete cu vacuum garoul se poate scoate foarte rapid.

Sterilitate.

Influena duratei de aplicare a garoului la venepuncie asupra rezultatelor testelor de laborator CO2

Parametrul

Durata aplicrii garoului, min.

0
Calciu, mmol/l Proteina total, g/l Albumina, g/l 2,38 72 39

2
2,45 74 40

4
2,52 77 42

6
2,58 80 43

Capacele i etichetele eprubetelor sunt colorate n diferite culori n dependen de tipul eprubetei.

Succesiunea de recoltare a sngelui n diferite tipuri de eprubete:

Eprubeta
Eprubet fr aditivi, cu aditivi sau cu activatori ai coagulrii Eprubet cu citrat de Na Eprubet cu Li-heparin sau heparin Eprubet cu EDTA Eprubet cu inhibitor al glicolizei

Material biologic
Ser

Investigaiile
biochimice, serologice coagulograma imunologice, electrolii, EAB Hematologice, PCR glucoza, lactat

Culoarea

1.

Roie Albastr Verde Violet Sur

2.

Plasma Snge integru /plasma Snge integru /plasma Plasma

3.

4.

5.

Aditivi polimeri pentru eprubete cu vacuum (pentru separarea serului):

Granule de polisterol pentru
Gel polietesteric pentru
separarea elementelor figurate ale sngelui i serului la centrifugare coagularea rapid a sngelui i formarea unui cheag compact

Aditivii polimeri (granulele de polisterol i gelul poliesteric) uureaz separarea serului/plasmei

Durata i condiiile de pstrare a sngelui recoltat:

Se permite doar un singur ciclu de congelare-decongelare a serului Se interzice congelarea sngelui integru Materialul biologic se pstreaz cu att mai bine cu ct este mai joas
temperatura de pstrare

Cele mai frecvente cauze ale alterrii materialului biologic dup recoltare:
Hemoliza Metabolismul celulelor sanguine Reaciile chimice din ser/plasm Aciunea microorganismelor Evaporarea apei/sublimarea Procese osmotice Aciunea luminii Difuzia gazelor

Metode n biochimia clinic

Metodele principale sunt metode fizicochimice de analiz:

Metode optice Metode cromatografice Electroforeza

Metode n biochimia clinic

Metodele optice se bazeaza pe

Metode fotometrice sunt:

refractometria; polarimetria; fotometria.

masurarea proprietatilor optice ale substantei i sunt bazate pe nregistrarea modificrilor razei de lumin la trecerea ei prin soluia examinat.

FOTOMETRIA
1. Fotometrie de absorbie a) spectrofotometria -metodele bazate pe masurarea
absorbtiei luminii de catre substantele colorate

corpurile necolorate aflate in suspensie se numesc turbidimetrice

b)

nefelometria - msoar absorbtia luminii de catre

c) turbidimetria - msoar dispersia luminii de catre particulele care se precipita, suspendate in solutie, lucrandu-se cu precipitat colorat sau necolorat.

2.Fotometrie de emisie
a) fluorimetria

FOTOMETRIA
de absorbie

Legea Bugher Lambert Beer lege fizic, conform creia are loc micorarea intensitii razei de lumin monocromatic la trecerea ei prin mediul de absorbie.
Pentru cercetri sunt utilizate fotocolorimetrele n care fluxul luminos cu intensitatea I0 este trimis printr-o cuva sau printr-o eprubeta care contine solutia de analizat. Fluxul cu intensitatea I, care a reusit sa treaca prin cuva fara sa fie absorbit, cade pe o celula fotoelectrica. Celula fotoelectrica transforma energia luminoasa in energie electrica, care se masoara cu un galvanometru sensibil.

METODA PCR N DIAGNOSTIC

 Reacia polimerazic n lan

metod a biologiei moleculare, care permite de a obine o amplificare semnificativ a anumitor secvene specifice de ADN.

 Metoda este bazat pe copierea selectiv

multipl a unui anumit fragment specific de ADN (sau ARN) cu ajutorul enzimelor in vitro. Are loc copierea numai a secvenei de ADN, care are o anumit consecutivitate dat a bazelor azotate i numai n cazul, cnt el este prezent n materialul cercetat.

Componentele reaciei
ADN-matricea Praimeri ADN-polimeraza termostabil Substrate dezoxiribonucleotidtrifosfai Ioni Mg2+ Soluie-tampon

Principiul PCR
Denaturarea matricea bicatenar
dublu helix de ADN este nclzit la 9496C pentru ca catenele s se despiralizeze i s se separe. Annealing- unirea complimentar a matricei cu praimerul la aprox. 54C. Elongarea- ADN-polimeraza sintetizeaz catena complimentar, polimeriznd bazele azotate suplimentate n mediul de

Etapele efecturii PCR:

1. prelucrarea materialului biologic.

Centrifugarea materialului biologic

2. Extragerea ADN/ARN
1. La sediment se adaug soluia pentru extragerea ADN;
Centrifuga Vortex Termostat

2.AMESTECARE

3. nclzire a cte min la 55 95

4. Centrifugarepentru obinerea supernatantului cu ADN

3. Pregtirea probelor pentru amplificare: introducerea n eprubet a probelor

biologice, primerilor, polimerazei, substratelor pentru polimerizarea ADN.

Probele pregtite pentru amplificare

4. Amplificarea

Amplificator

Amplificator pentru real-time PCR

5. Electroforeza

- pregtirea gelului pentru camera de electroforez

Camer pentru electroforez cu soluie tampon

Gelul dup electroforez

7. nregistrarea rezultatelor la transiluminator (in lumin ultraviolet)

 Citirea rezultatelor strict la nivelul Prezena unei benzi luminoase PCR

controlului pozitiv n proba de analizat semnific prezena agentului patogen respectiv n proba dat. Lipsa bandei luminoase la nivelul controlului pozitiv n proba de analizat semnific lipsa agentului patogen respectiv n proba dat.

K+ - control pozitiv K- - control negativ 1,2,7,9,10,11 probe clinice cu rezultate pozitive 3,4,5,6,8,12 probe clinice cu rezultate negative