Microbiologie Medical vol.

1 (2010) curs

o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o

Microbiologie Medical vol. 1 (2010) - curs 1. Date istorice privind microbiologia (MI Popa) - 3 2. Structura celulei bacteriene (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 17 3. Fiziologia bacterian (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 31 4. Aciunea factorilor fizici, chimici i biologici asupra bacteriilor (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 47 5. Genetica bacterian (Gabriela Loredana Popa) - 63 6. Antibiotice i Chimioterapice (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 76 7. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice 100 8. Relaiile microorganism - gazd (Mara Mdlina Oanea, Gabriela Loredana Popa) - 112 9. Patogenitate i Virulen (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 124 Noiuni de imunologie - 138 10. Organele cu rol n imunitate (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Roxana Micu) - 142 11. Celulele imunitii (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 151 12. Complexul major de histocompatibilitate (MHC); Sistemul HLA (MI Popa) - 165 13. Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi (A Muntean, MI Popa) - 172 14. Imunoglobulinele (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 185 15. Sistemul complement (MI Popa, Roxana Micu) - 196 16. Antigenele (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 207 17. Rspunsul imun umoral i celular (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) -221 18. Reaciile de hipersensibilitate (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 233 19. Reacii antigen - anticorp utilizate n microbiologie (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) -254 20. Reacii de precipitare i reacii de aglutinare (Gabriela Loredana, MI Popa) - 260 21. Reacii care utilizeaz sistemul complement (MI Popa) - 268 22. Reacia de seroneutralizare (MI Popa) - 271 23. Reacii Ag-Ac cu reactivi marcai (MI Popa) - 273 24. Inflamaia i procesul infecios (MI Popa, Andreea Bara, Milena Tocu) - 274 25. Tolerana imun (A Muntean) - 291 26. Diagnosticul n bolile infecioase prima parte (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 302 27. Diagnosticul n bolile infecioase partea a 2-a (MI Popa, Anca Streinu-Cercel, Oana Streinu-Cercel, Gabriela Loredana Popa) - 305 28. Prezentare general a principalelor microorganisme studiate; necesitatea studierii microbiologiei (MI Popa) - 316 29. Genul Staphylococcus (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Anca Streinu-Cercel, Oana Streinu-Cercel) 318 30. Genul Streptococcus. Streptococcus pyogenes (Gabriela Loredana Popa, Marina Pan, MI Popa, Maria Ghi) - 322 31. Streptococcus pneumoniae (Gabriela Loredana Popa, Marina Pan, MI Popa) - 342 32. Genul Neisseria. Neisseria meningitidis. Neisseria gonorrhoeae (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) 345 33. Familia Enterobacteriaceae. Caractere generale. (Gabriela Loredana Popa) - 354 34. Genul Escherichia. Escherichia coli (Gabriela Loredana Popa, Codrua Usein, MI Popa) - 357 35. Genul Klebsiella. Klebsiella pneumoniae. (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, A Muntean) - 360 36. Genul Proteus (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 364 39. Genul Salmonella (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 366 40. Genul Shigella (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 369 41. Genul Yersinia (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 371 42. Genul Acinetobacter (Alina Negu) - 373 43. Genul Pseudomonas. Pseudomonas aeruginosa (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 373 44. Genul Vibrio (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 375 45. Genul Campylobacter. Genul Helicobacter. Helicobacter pylori (Gabriela Loredana Popa, Mdlina Nodea) - 378

o 46. Bacilii Gram-pozitivi nesporulai. Genul Corynebacterium (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Cristiana Cerasella Dragomirescu) - 383 o 47. Ali bacili Gram-pozitivi nesporulai de importan medical (Gabriela Loredana Popa, Alina Borcan, MI Popa) - 385 o 49. Genul Clostridium. Clostridium tetani (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 386 o 50. Clostridium botulinum (Gabriela Loredana Popa) - 392 o 51. Clostridiile gangrenei gazoase (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 396 o 52. Genul Mycobacterium. Mycobacterium tuberculosis (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Henriette Stavri, D Stavri) - 410 o 53. Germeni spiralai. Genul Treponema. Treponema pallidum (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 422 o 54. Genul Borrelia (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 436 o 55. Genul Leptospira (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 442

1. Date istorice privind microbiologia (MI Popa)

Introducere Exist organisme i microorganisme vii care au dimensiuni att de mici nct nu pot fi observate dect la microscop (optic sau electronic). ntre aceste microorganisme putem discuta despre alge, fungi, bacterii, virusuri i parazii. Relativ de curnd au intrat n discuie i alte structuri numite prioni. Diferitele microorganisme sunt studiate n cadrul disciplinei de microbiologie. Ca un domeniu nrudit cu microbiologia poate fi considerat i imunologia. Se consider c microorganismele sunt dintre cele mai vechi, numeroase i diversificate forme de via. Pot fi identificate n mediul nconjurtor, au rol n descompunerea materiei organice i menin fertilitatea solulului. Majoritatea microorganismelor sunt utile global sau fcnd parte din flora normal a diferitelor gazde; o mai mic parte sunt implicate, n diferite grade, n patologie. n acest caz, bolile infecioase pot s afecteze o persoan, un grup de persoane sau o ntreag comunitate. Pe msur ce bolile infecioase au fost identificate a aprut i disciplina de epidemiologie, nscut din necesitatea studiului izbucnirilor epidemice. Datorit faptului c iniial nu era cunoscut etiologia epidemiilor, acestea au fost considerate drept fenomene ale naturii, invazii asupra poporului (de la cuvintele grecesti epi -pe, peste, demos - popor). Exist o serie de documente istorice care atest existena epidemiologiei ca tiin privind patologia n mas, precum tratatele lui Hipocrate (460-377 nainte de Iisus Christos), cele 7 cri Despre epidemii i Despre aeri, ap i locuri. Microbiologia a avansat continuu, de la nivelul unei tiine relativ simple la un nivel care a determinat progrese nsemnate n diagnosticul, prevenirea i tratamentul bolilor. n bun parte datorit aplicaiilor microbiologiei, sperana de via a crescut semnificativ. La nceputul secolului, se nregistrau frecvent decese datorit unor cauze infecioase (difterie, oreion, pest, poliomielit, rubeol, rujeol, tifos exantematic, tuberculoz, sifilis, varicel, variol, etc). n acest moment variola este eradicat. Pentru poliomielit a fost stabilit inta eradicrii, iniial pentru anul 2000, ulterior pentru 2012. Izbucnirea epidemic din 2010 a mpins aceast int peste ali ani (unica boal infecioas eradicat rmne variola). Pentru alte maladii sunt propuse alte inte de prevenire i control iar evoluia grav, letal, survine numai n anumite situaii (forme clinice avansate, atipice, neglijate). Datorit cunotinelor n domeniul microbiologiei s-au mbuntit condiiile sanitare, s-au descoperit i aplicat noi metode de conservare a hranei etc. Dezvoltarea tehnologiei ADN (n special dup anul 1973), bazat pe cunotinele acumulate pe parcursul ultimelor trei-patru decade de studiu i practic privind genetica microbian, are o nsemntate deosebit. Exist de un numr de ani posibilitatea inserrii de material genetic provenit de la oricare organism viu n bacterii selecionate i adaptate astfel nct s poat realiza sarcini speciale, normale la celula donatoare, ajungndu-se pn la posibilitatea ca tulpini de Escherichia coli modificate genetic s 3

sintetizeze structuri de tipul anticorpilor. Studiul bacteriologic a trecut de la un nivel morfologic, celular la unul biochimic, molecular. Microbiologia ca tiin este strict necesar pentru sntate, pentru meninerea sntii i prevenirea mbolnvirilor. Cunoaterea modului de transmitere a diferitelor microorganisme reduce numrul cazurilor de toxoplasmoz, tuberculoz sau grip. Cunoaterea noiunilor privind sterilizarea-antisepsia-dezinfecia poate permite (n cazul aplicrii corecte n practic a acestor noiuni) evitarea infeciilor de spital sau a altor infecii produse n uniti sanitare cu sau fr paturi. Cunoaterea imunologiei i imunopatologiei permite nelegerea legturilor i interrelaiilor microorganism-gazd, precum i importana procedeelor de imunizare i supravegherea aplicrii acestora. Msurile generale aplicate pentru evitarea apariiei bolilor infecioase sau a transmiterii ulterioare trebuie bazate pe un nivel avansat de cunotine microbiologice. Studiul microbiologiei nu este dificil n cazul n care se nelege faptul c microbiologia este o tiin foarte logic (cele mai multe principii pot fi nvate prin simpla nelegere a acestora). Pe de alt parte, pe msur ce reueti s i descifrezi o parte dintre taine poi realiza c este una dintre cele mai fascinante tiine. Microorganismele au fost descoperite relativ trziu, n 1680, cu toate c primul instrument de mrire asemntor cu dispozitivele actuale a fost realizat n 1590 de ctre Zacharias Janssen. n 1665 Robert Hooke a observat pentru prima oar celulele, el a studiat o seciune dintr-un dop de plut i a descoperit c structura plutei era format din nite cutii micue. Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), dorind s examineze estura hainelor fine (dei era la baz un vnztor de mruniuri), se pare c a fost prima persoan care a vzut i a descris diferite microorganisme. Microscopul realizat de van Leeuwenhoek, instrument pe care l-a construit singur, a constat dintr-o lentil biconvex ntr-un cadru metalic, cu o mrire de pn la 270 de ori. Cu acest microscop a examinat iniial diferite esturi, ns manifestnd o curiozitate deosebit a dorit s studieze ulterior apa din bli, tartrul dentar, materiile fecale provenite de la un pacient cu dizenterie, etc. A fost mirat s observe n toate aceste substane, mici organisme sferice, altele n form de bastona, spirale, unele aflate n micare rapid, pe care le-a numit animalicule. Desenele pe care le-a fcut probeaz c a observat cu adevrat bacterii, protozoare i alte microorganisme. Pornind de la condiia sa iniial, pe parcursul a circa 4 decade, Antony van Leeuwenhoek a redactat 125 de scrisori traduse n englez i predate Societii Regale din Londra. n plus, 27 dintre lucrrile sale au fost publicate n Memoriile Academiei Franceze de tiine. Se pare c unul dintre microscoapele originale ale lui van Leeuwenhoek se afl n muzeul Universitii din Utrecht. n urma descoperirilor lui Leeuwenhoek s-a pus ntrebarea de unde au aprut aceste organisme?. Pn la mijlocul secolului al nousprezecelea cea mai acceptat teorie a fost teoria generaiei spontane. nvaii epocii credeau c bacteriile apreau spontan din materie anorganic. n 1858 Rudolf Virchof a introdus termenul de biogenez. Aceast teorie susinea faptul c un organism viu poate s apar numai din alt organism viu. Controversele ntre cele dou teorii s-au pstrat pn n 1861 cnd Pasteur a infirmat teoria generaiei spontane.

Geniul lui Pasteur a demonstrat c aerul contaminat cu microorganisme poate cotamina o soluie steril, n schimb aerul steril nu poate s determine apariia unor bacterii. Cu mult nainte de a se fi cunoscut faptul c microorganismele sunt cauza bolilor infecioase au fost imaginate o serie de metode de prevenire a bolilor. Spre exemplu, Edward Jenner (1796) a artat c variola ar putea fi prevenit prin vaccinare. Semmelweis a avut contribuii importante privind prevenirea rspndirii bolilor n materniti i spitale utiliznd substane chimice dezinfectante. Regulile principale (unele valabile i astzi) precum i metodele tiinei microbiologice inclusiv principiile imunizrii, utilizarea microbiologiei n medicina preventiv, prevenirea i controlul bolilor infecioase se bazeaz pe activitatea a doi cercettori nzestrai att cu geniu ct i cu tenacitate, probabil avnd i ansa de a fi trit n perioada marilor descoperiri, Louis Pasteur (1822-1895) i Robert Koch (1843-1910). Pe bun dreptate, perioada 1857-1914 e considerat drept epoca de aur a microbiologiei. Louis Pasteur a fost un chimist francez devenit faimos prin descoperirea polarimetriei. Tot el a demonstrat c fermentaia i putrefacia sunt cauzate de organisme vii i a notat o asemnare ntre aceste procese i bolile infecioase lund n discuie degradarea vinurilor i berii ca i boli ale acestor produse. Pasteur a fost cel care a realizat un experiment prin care a artat c, att ct era cunoscut pe baza datelor disponibile, organismele vii au luat natere numai din organisme vii, i nu din materie moart. n 1861 a descoperit fenomenul de anaerobioz i fermentarea butiric (produs de Vibrion butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum). Dup elaborarea procedeului numit pasteurizare, a expus n 1877 teoria pasteurian cu privire la germeni desfiinnd (aa cum am mai menionat) teoria generaiei spontanee. Utiliznd substane simple, de origine natural i gaze, vapori i arcuri electrice sub temperatur i presiune crescut, microbiologii i biochimitii pot sintetiza o serie de compui organici care au fost descoperii iniial doar n celulele vii. Dup studiul fermentrii vinului, Pasteur a investigat o boal transmisibil la viermii de mtase i ca rezultat a formulat teoria legat de implicarea germenilor n producerea unor boli. n ceea ce privete maladiile umane, a insistat ca bandajele s fie curate i instrumentele din spital s fie fierte. Louis Pasteur a demonstrat n anul 1857, la aproape o jumtate de secol dup lucrrile redactate despre vaccinare de ctre Edward Jenner, legtura dintre infecii i microorganismele susceptibile a fi cultivate i studiate. n diferite experimente ingenioase, Pasteur a protejat de antrax diferite ierbivore prin vaccinarea cu un preparat extras din Bacillus anthracis. Tratamentul profilactic al rabiei a fost dezvoltat prin injectarea de material uscat obinut din mduva spinrii de la animalele care au murit de rabie. Joseph Meister, un biat mucat de un cine turbat, a fost primul om a crui via a fost salvat prin aceast metod fiind protejat de injeciile fcute de Louis Pasteur. Tot Pasteur a descoperit bacteriile anaerobe i a studiat septicemia i gangrena. Ca atare, a devenit posibil punerea la punct a tehnicilor de distrugere i de control al diferiilor germeni (stafilococi, streptococi, pneumococi etc). n 1880, Louis Pasteur a demonstrat c putem fi protejai contra bolilor infecioase prin injectarea unor germeni atenuai. Primul medic care a observat transmiterea infeciilor n instituii sanitare a fost Ignaz Semmelweis. Femeile ce nteau acas sufereau mai puine infecii comparativ cu cele ce 5

nteau la spital. A impus splarea riguroas i dezinfectarea cu clor a minilor personalului nainte de a aplica intra n sala de natere sau de a consulta o femeie nsrcinat. Chirurgul englez Joseph Lister (1827-1912) a aplicat descoperirile lui Pasteur n chirurgie chiar nainte ca bacteriile care determin infeciiile chirurgicale (nosocomiale) s fi fost descoperite. Lucrrile lui Lister reprezint baza tehnicii chirurgicale aseptice din ziua de astzi. Ferdinand Cohn (1828-1898) a fost unul dintre cei mai renumii microbiologi germani. El a extins cercetrile lui Pasteur lucrnd cu bacterii, alge i fungi. Fiind foarte interesat de bacteriologie, a scris una dintre primele cri referitoare la bacterii, realiznd una dintre primele clasificri bacteriene n genuri i specii. Cohn a reprezentat un mare sprijin pentru Robert Koch, ncurajndu-l s i publice lucrrile cu privire la antrax. Cu dou secole nainte de apariia bacteriologiei, Robert Boyle a sugerat c anumite boli sunt provocate de organisme vii. Anatomistul Henle a sugerat c bolile infecioase ar putea fi determinate direct de ctre microorganisme. Robert Koch i-a fost student lui Henle; a asigurat toate datele necesare pentru a demonstra teoria microbian a bolii. Dezvoltarea metodelor pentru izolarea bacteriilor n cultura pur a fost printre cele mai importante descoperiri ale tehnicilor microbiologice i a fost n mare parte opera lui Robert Koch. O cultur pur de microorganisme se dezvolt atunci cnd pornim de la un singur tip de microorganism care se dezvolt n eprubetele test sau n plcile cu mediu de cultur (n colonii izolate). n condiii naturale, mai multe microorganisme din specii diferite pot coexista n acelai mediu. Spre exemplu, n materiile fecale ale unui pacient cu febr tifoid, Salmonella typhi se afl amestecat cu un numr extrem de mare de celule din alte specii bacteriene (aerobe i anaerobe) sau chiar i alte forme de microorganisme. n cadrul diagnosticului medical microbiologic este important izolarea n cultur pur a germenilor patogeni. n exemplul menionat, pentru diagnostic este necesar folosirea metodelor care permit izolarea S. typhi n cultur pur, singura care permite identificarea i stabilirea sensibilitii / rezistenei la antibiotice i chimioterapice. n 1876 Koch a izolat n cultur pur bacteria care determin antraxul. Pornind de la splina recoltat de la vite infectate i procesat pentru a permite obinerea unui produs patologic; a fost capabil s infecteze oareci de laborator utiliznd aceast cultur. Implicat n cercetarea etiologiei exacte a bolilor infecioase, Robert Koch a rezumat ceea ce a considerat c reprezint datele eseniale pentru a demonstra c un anume germen este cauza unei infecii. Aceste date sunt cuprinse n patru postulate, denumite Postulatele lui Koch, respectiv: 1. Microorganismele care determin boala trebuie s poat fi identificate n toate cazurile de boal, n relaie patogenic direct cu simptomele i leziunile pe care le determin; 2. Microorganismul trebuie s poat fi izolat de la victimele bolii, n cultur pur, pentru studiul n laborator; 3. Cnd cultura este inoculat la un animal susceptibil, trebuie s reproduc boala (sau, cum s -a stabilit ulterior, s induc apariia anticorpilor specifici la noua gazd); 4. Microorganismul trebuie s poat fi izolat din nou n cultura pur din infecia produs experimental. 6

Utiliznd aceste reguli precum i diferitele tehnici microbiologice, Koch a descoperit bacilul tuberculos (bacilul Koch), bacilul holeric, etc., precum i modul de transmitere pentru numeroase alte boli infecioase (Babessia, Trypanosoma, Plasmodium etc.). Descoperirile menionate au reprezentat debutul bacteriologiei, micologiei, virusologiei, parazitologiei i imunologiei ca tiine. n doar aproximativ 15 ani (dup 1880) au fost descoperite i izolate n cultur pur microorganisme implicate n multe dintre bolile infecioase importante. Aceste descoperiri au fcut posibil stabilirea ca entiti bine definite a medicinei preventive i respectiv a terapiei specifice (etiologice). Ilia Mecinikov a evideniat modul natural de aprare a organismului fa de agenii infecioi prin anumite celule care au proprieti fagocitare i a scris n 1901 primul tratat de imunologie. n coala german apar o serie de nume celebre, cum ar fi Behring, care a studiat toxinele bacteriene, imunitatea umoral i seroterapia precum i Paul Ehrlich (1854-1915). Cercetrile lui Ehrlich stau la baza chimioterapiei antimicrobiene. Prin utilizarea derivailor arsenicali n tratamentul sifilisului ipotezele sale au fost confirmate. Mai mult dect att, n anul 1878 Ehrlich realizeaz c exist diferene de afinitate tinctorial fa de coloranii pe baz de anilin. Aceast descoperire l ajut s studieze efectul diferitelor substane chimice, dar st i la baza apariiei coloraiilor n microbiologie. Ehrlich arat c mycobacteriile au proprietatea de acido-rezisten iar doi ani mai trziu (1884), cercettorul danez Christian Gram pune bazele coloraiei care i poart numele i care are o remarcabil utilitate dup aproape 125 ani de la aceast descoperire. Dei asistena medical ntr-o anumit form a existat nc de la debutul vieii umane pe pmnt, nceputurile nursing-ului profesional au fost realizate de ctre Florence Nightingale (1820-1910), care a nceput munca sa cu mai bine de 140 de ani n urm, n cursul rzboiului din Crimeea (1854-1856). Descoperirile ulterioare, privind relaia dintre microorganisme i boal, au necesitat dezvoltarea unor proceduri de nursing mai complexe i mai rafinate dect cele utilizate de ngerii din Crimeea. Descoperirea msurilor profilactice precum administrarea de vaccin variolic (1796), de toxoizi i antitoxine (n difterie i tetanos), a serurilor imune (von Behring, Frnkel i Kitasato, 1890), a vaccinurilor polio i rujeolos (Enders, Weller i Robins 1949; Salk 1954; Sabin i alii, 1954 -1967), precum i utilizarea de gama globuline pentru prevenirea pojarului, rabiei, tusei convulsive etc., au fcut necesar dezvoltarea de noi concepte i educaie n prepararea i administrarea acestor substane. Identificarea cilor de transmitere a infeciilor a condus la dezvoltarea de metode eficace de prevenire a rspndirii bolilor. n 1895, sir Ronald Ross (1857-1932), medic militar n India, a demonstrat transmiterea agentului etiologic al malariei prin intermediul narilor. Parazitul a fost vizualizat n eritrocitele umane n 1881 de ctre Laveran, chirurg al armatei franceze n Algeria. n 1900 a fost demonstrat transmiterea virusului febrei galbene de ctre o specie particular de nari (Aedes aegypti), n Cuba. Descoperirea unor teste de diagnostic n domeniul microbiologiei a necesitat o pregtire microbiologic mai avansat a medicilor, asistentelor i a altor profesioniti ai sntii n 7

metode pentru colectarea produselor i raportarea specific de laborator, astfel nct terapia s demareze ct mai precoce. Descoperirea de substane chimice specifice (de exemplu sulfonamidele, Domagk 1935) i substane antibiotice (de exemplu penicilina, streptomicina, tetraciclina i cloramfenicolul) a contribuit la mbuntirea modului de abordare medical a problematicii bolilor infecioase. Primul medicament anti-tuberculos este descoperit n anul 1944 (streptomicina - Scharty, Bugie, Waksman). Procedurile chirurgicale moderne ar fi imposibile fr dezinfecie i sterilizare. Industria laptelui, a conservelor, a hranei ambalate i congelate sunt dependente de microbiologie. Sanitaia sistemelor de ap i tratarea apelor poluate sunt posibile numai datorit cunotinelor acumulate prin microbiologie n cursul ultimului secol. n multe moduri profesiunea medical i fiecare latur a ei este dependent de cunoaterea, nelegerea i utilizarea informaiilor din microbiologie. La coala romn de microbiologie nfiinat de profesorii Victor Babe (1854-1926) i Ion Cantacuzino (1863-1934) s-au pregtit multe generaii de microbiologi, viitori cercettori i profesori, care au contribuit la dezvoltarea microbiologiei din ara noastr. Victor Babe s-a nscut la Viena n anul 1854, a studiat la Facultatea de medicin din Budapesta, apoi n Viena unde a fost numit preparator la catedra de Anatomie condus de profesorul Lauder. Ulterior este recomandat pentru a deveni asistent la catedra de Anatomie patologic la Facultatea de medicin din Budapesta. A fost n acelai timp anatomopatolog i microbiolog. A fost att elevul lui Robert Koch, ct i al lui Louis Pasteur. A fost numit docent i profesor la Facultatea de medicin din Budapesta la o vrst foarte tnr (27 ani). Cu patru ani mai trziu, n anul 1885, public mpreun cu A.V. Cornil primul tratat de bacteriologie medical din lume (n 1891 apare a treia ediie a tratatului). A doua ediie a acestui tratat se afl n Biblioteca Institutului Naional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie i Imunologie Cantacuzino. Victor Babe a demonstrat importana introducerii tehnicilor microbiologice n anatomopatologie. Ar putea fi menionat i faptul c pe parcursul celor 10 ani de activitate la Facultatea din Budapesta, a dat indicaiile necesare pentru construirea unui nou Institut de anatomie patologic iar n cadrul acestuia a unei secii dedicate bacteriologiei. A evideniat proprietile neutralizante ale serurilor imune, a descoperit corpusculii metacromatici ai bacilului difteric (Babe-Ernst), o nou metod de preparare a serului antidifteric etc. n 1886 a fost numit profesor de anatomie patologic i bacteriologie la Facultatea de Medicin din Bucureti. Este fondatorul Institutului de Bacteriologie pe baza cruia s-a dezvoltat actualul Institut Victor Babe. n 1889 a preparat vaccin antirabic, ara noastr fiind a treia ar din lume care a reuit s prepare acest vaccin. A condus institutul creat pn aproape de sfritul zilelor sale, care a fost la puin timp dup pensionarea sa. Din pcate, n ciuda monumentalitii sale, nu a fost posibil s fie gsit un spaiu n care s-i poat continua cercetrile i dup pensionare, lucru din pcate mult prea des ntlnit n istoria medicinei noastre. Cu privire la poziia acestui mare cercettor precum i la situaii care par a fi foarte asemntoare peste ani, n ciuda trecerii timpului i a speranei c evoluia societii noastre este ntr-o direcie pozitiv, vom prezenta n continuare un fragment din discursul profesorului Victor Babe, inut la Universitatea din Cluj n anul 1919. Astzi lumea civilizat ateapt deci 8

lucruri mari din partea noastr; nu mbogirea oligarhiei politice n afaceri, certuri politice, persecuiuni i denunuri infame pentru interese egoiste i nguste, ci pstrarea i sporirea celor mai valoroase achiziiuni ale omenirii: sntatea, prosperitatea, fora, justiia, instruciunea i tiina, spre a asigura pacea i progresul i prin ele fora i fericirea poporului romn, servind de exemplu popoarelor din Orient. Dar politica noastr de pn acum n-a fcut dect s ne duc n cea mai mare desorganizare, desbinare i dezastru economic, permind prin egoism i nepsare ca rnimea s fie azi degenerat, analfabet, lipsit i ndatorat peste msur; politicienii notri au reuit s oprime toate valorile, nlocuindu-le prin clientela lor politic; au adus funcionarismul, birocratismul, nepotismul la culme; politicienii notri n nepsarea lor pentru interesele rii au lsat armata la nceputul rzboiului aproape nepregtit n clipele cele mai periculoase prin care a trecut ara i din care nu ne-a scpat dect vitejia fr pereche a soldatului romn. Trebue s ne ntrebm dac nu acest politicianism este cauza tuturor relelor i dac nu este o datorie patriotic s ntrebuinm toate mijloacele necesare ca s-l nimicim i s-l nlocuim cu o alt putere care s ne garanteze regenerarea i progresul. n adevr trebue s fim profund ngrijai i s ne ntrebm nainte de toate cum vom putea s eim din acest dezastru i cum vom putea face fa creanei mari pe care am contractat-o fa de lumea civilizat. Publicul care, pn deunzi, a observat la guvernanii notri aceleai viiuri politice, aceeai nepsare pentru interesele reale ale rii, acelai nepotism, aceeai venalitate, acelai egoism care ne-a condus la degenerare ca i nainte rzboiului, ateapt cu nerbdare o schimbare radical a moravurilor politice care s ne pun n poziiunea de a ndeplini mreaa noastr misiune. Fa de aceste adevruri ar fi trebuit s ne ateptm ca Romnia nou s pun piciorul n prag i s rup odat pentru totdeauna cu vechiul politicianism. ns ce vedem spre profunda noastr descurajare; c aceeai principii dezastruoase, egoiste, aceeai fraze goale domin i politica de astzi i c mergem orbi nainte spre un dezastru sigur. n loc ca ntinderea i bogia acestei ri binecuvntate s ne asigure un loc de frunte i stare economic briliant, ne gsim astzi n deplin faliment, expui ruinei i foametei i mai mult dect oricnd sub dependena i exploatarea nemiloas a naiunilor mari. Ion Cantacuzino a avut o personalitate cu totul deosebit, imposibil de cuprins ntr-o trecere att de sumar prin istoricul microbiologiei. A studiat la Paris Filozofia i Literele, tiinele naturale i Medicina. Pregtirea n microbiologie a desvrit-o pe parcursul a 9 ani, n laboratorul lui Ilia Mecinikov, la Paris. A cunoscut mai multe limbi strine, inclusiv latina i greaca. A studiat la Paris i a revenit n ar pentru satisfacerea stagiului militar (geniti, Jilava). A continuat studiile n Frana (tiine naturale 1886, medicin 1887). Lucreaz n Institutul Pasteur ncepnd cu 1892, devine doctor n medicin n 1894 i este numit profesor suplinitor de Morfologie animal la Facultatea de tiine din Iai (1894). A fost numit profesor la Facultatea de Medicin din Bucureti n anul 1901 i a grupat n jurul su un mare numr de tineri medici, care au devenit la rndul lor ndrumtori i creatori de coal (Al. Sltineanu, C.

Ionescu-Mihieti, M. Ciuc, Al. Ciuc, D. Danielopolu, D. Combiescu, N. Gh. Lupu, I. Blteanu, I. Nicolau, Lidia i I. Mesrobeanu i muli alii). n perioada 1908-1910, profesorul Cantacuzino este numit Director General al Serviciului Sanitar, face Legea de organizare a acestui serviciu, nfiineaz sanatoriile Bisericani, Brnova, Nifon, Crbuneti, Filaret precum i primele laboratoare regionale de bacteriologie i igien (Craiova, Galai, Constana, Iai, Sulina). ncepe n 1912 prepararea vaccinului contra febrei tifoide i a holerei asiatice, ulterior ncepe prepararea serului antidifteric. Este numit n 1917 Director al Directoratului Sntii Publice civile i militare, calitate n care coordoneaz combaterea epidemiilor de holer, tifos exantematic, febr recurent. n 1920 ncepe prepararea serurilor antimeningococic i anti gangrenos (n Laboratorul de Medicin experimental) iar n data de 4 iunie semneaz n calitate de prim delegat, Tratatul de la Trianon. Un an mai trziu se nfiineaz Institutul de Seruri i Vaccinuri, n 1926 ncepe vaccinarea BCG n Romnia iar n 1928 nfiineaz Archives Roumaines de Pathologie Exprimentale et de Microbiologie. Din pcate, n momentul de fa Romanian Archives of Microbiology and Immunology (numele actual al revistei, care a ajuns la volumul cu numrul 69) nu apare listat ntre publicaiile recunoscute oficial n ara noastr, cu toate c ncepnd cu anul 2005 a existat un reviriment, comitetul editorial strduindu-se s refac prestigiul revistei, ca o datorie moral fa de naintai. n perioada 1931-1932 face parte din Guvernul prezidat de Nicolae Iorga, n calitate de ministru al sntii publice. Lucreaz la elaborarea unei noi legi sanitare. Cu numai nou zile nainte de a nceta din via prezideaz Congresul de Tuberculoz i propune nfiinarea Ligii contra Tuberculozei. Pe lng coala pe care a format-o, una dintre cele mai mari realizri ale Profesorului Cantacuzino a fost nfiinarea n anul 1921 a Institutului de Seruri i Vaccinuri, numit astzi INCDMI Cantacuzino (Institutul Naional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie i Imunologie), centru de cercetare tiinific fundamental i aplicativ, centru de nvmnt de specialitate, instituie care a preparat i prepar seruri, vaccinuri i alte produse biologice utile n diagnosticul bolilor transmisibile. Alexandru Sltineanu (1873-1939) a organizat nvmntul universitar de microbiologie la Iai (cercetri n domeniul febrei tifoide, tuberculozei, tifosului exantematic, etc.). Constantin Ionescu-Mihieti (1883-1962) a abordat teme importante n domeniul virusologiei, bacteriologiei, parazitologiei, imunologiei, hematologiei, anatomiei patologice i epidemiologiei. A avut contribuii deosebite n studierea mycobacteriilor i enterovirusurilor. A muncit intens pentru dezvoltarea Institutului Cantacuzino a crui director a fost ncepnd cu anul 1934. A continuat activitatea tinific i administrativ promovat de Ion Cantacuzino. Mihai Ciuc (1883-1969) a dezvoltat o bogat activitate tiinific n domeniul bacteriologiei i epidemiologiei, experimental, terapeutic i clinic. A studiat mpreun cu Jules Bordet fenomenul lizogeniei (1921); a avut contribuii deosebite n domeniul malariei fiind numit secretar al Comisiei de Malarie de pe lng Liga Naiunilor. A fost profesor de microbiologie nti la Iai i din 1934 n Bucureti fiind al treilea profesor de bacteriologie din Bucureti dup Victor Babe i Ion Cantacuzino. 10

Alexandru Ciuc (1880-1872) a absolvit facultatea de medicin veterinar din Bucureti. Activitatea lui s-a ndreptat mai ales spre organizarea produciei de seruri hiperimune pentru tratamentul tetanosului, difteriei etc. A fost al treilea director al Institutului Cantacuzino. Dumitru Combiescu (1887-1961) a cercetat capitole majore ale patologiei infecioase (febra tifoid, febra recurent, dizenteria, tetanosul, antraxul, gangrena gazoas etc). A avut contribuii deosebite n domeniul rickettsiozelor i leptospirozelor. n timpul primului rzboi mondial a organizat msuri de prevenire a tifosului exantematic. Matei Bal (1905-1989) a fost cea mai proeminent personalitate a secolului XX, n Romnia, n domeniul bolilor infecioase. A fcut un stagiu de microbiologie la Institutul Pasteur din Paris i ulterior a intrat ntre personalitile cu formaie cantacuzinist, lucrnd alturi de Ion Cantacuzino, Mihai Ciuc, I. Blteanu. Dei era un foarte bun clinician a devenit i ntemeietorul colii moderne de bacteriologie clinic. Tehnicile i metodele de diagnostic imaginate i-au adus numeroase brevete i inovaii care i poart numele att n ar ct i n strintate. coala astfel ntemeiat a avut o activitate cu rezultate excepionale pentru tiina romneasc, pentru microbiologie i pentru sntatea public. Dup 1989, Institutul Cantacuzino a reintrat n Reeaua Internaional a Institutelor Pasteur i a Institutelor Asociate ceea ce a permis obinerea unor rezultate, importante. INCDMI Cantacuzino trebuie s continue tradiia naintailor i s i menin poziia important n cadrul instituiilor care se ocup de sntatea public la nivel naional i internaional. Eforturile de la nivel central din perioada 1997-2000 i respectiv eforturile depuse n perioada 2005-2007 au reprezentat un sprijin important n acest sens. George Emil Palade (1912-2008) Absolvent al facultii de medicin din Bucureti, a desfurat o prodigioas activitate tinific, n Statele Unite. A fost unul dintre pionierii microscopiei electronice i a fracionrii celulelor (separarea organitelor celulare). A fost iniial cercettor i ulterior profesor de biologie celular al Institutului Rockefeller din New York iar din 1973 al universitii Yale din New Haven. Ultimul loc n care George Emil Palade a fost profesor a fost facultatea din San Diego, California. A pus bazele unor noi departamente pentru studiul celular. Cercetrile lui au cuprins descrierea rolului i structurii mai multor organite (mitocondria n detaliu cu structura membranei i a cristelor, a definit rolul reticulului endoplasmic, sistem tubular ce este prezent in orice celula animal sau vegetal). ntr-un articol publicat n 1955, Palade a prezentat o fotografie de microscopie electronic ce reprezenta reticulul endoplasmic rugos i a explicat legtura ntre cele 2 structuri i rolul lor n eliberarea produilor de secreie). Cea mai important a fost descoperirea rolului corpusculilor citoplasmatici, denumii iniial corpusculii lui Palade. A precizat compoziia lor esenial (acizi ribonucleici) rezultnd altfel denumirea de ribozomi. n 1974 realizrile sale sunt ncununate cu premiul Nobel pentru Medicin i Fiziologie.

11

Datorit eforturilor depuse, incidena i prevalena anumitor boli infecioase a sczut. Trebuie avut ns n vedere emergena i re-emergena diferitelor maladii. Microbiologul, medicul clinician i asistenta medical trebuie s aplice cunotinele de microbiologie n practica de zi cu zi. Dei anumite tehnici pot fi nvate din rutin, persoana cu adevrat profesionist nelege faptele tiinifice precum i principiile aflate la baza acestor tehnici. Profesionistul tie de asemenea n ce mod ar trebui adaptate aceste tehnici n cazul anumitor tipuri de pacieni (ex. pentru cei supui chirurgiei cardiace, pacienilor care au suferit arsuri pe suprafee ntinse), ce tehnici trebuie utilizate n slile de operaie, de ateptare i n instituiile unde sunt ngrijii copii mici sau foarte mici, cum pot fi modificate acestea n condiii de urgen (de exemplu n caz de rzboi sau alte calamiti produse de om sau calamiti naturale) i cum trebuie fcut informarea pacienilor, populaiei, de exemplu referitor la imunizri. Un membru antrenat al echipei medicale poate s diferenieze adevrul de interpretarea greit i / sau dezinformarea din aa-zisa literatur medical scris pentru publicul larg i poate recunoate erorile aprute n mass media, dac are noiunile necesare de microbiologie. Persoanele care lucreaz n domeniul sanitar dar i orice alt persoan realmente interesat, constat sau pot constata c n aproape orice activitate cotidian exist o aplicabilitate a cunotinelor microbiologice.

Povestiri Adevarate 1.1.1. Girolamo Fracastoro (1478-1553) S-a nscut ntr-o veche familie de medici. A fost coleg la Facultatea de Medicin cu Nicolaus Copernicus (astronom i medic). S-a ocupat att de medicin ct i de astronomie, matematic, poezie, geografie, muzic etc. Poate fi considerat un bun diagnostician; este primul medic care a fcut diferena ntre cium i tifosul exantematic (au existat 2 izbucniri epidemice de tifos, analizate de aceast minte luminat, n 1505 i n 1528). Se poate spune c a descris corect din punct de vedere epidemiologic, n lumina datelor cunoscute la acea vreme, ciuma, variola, febra tifoid i tifosul exantematic. A scris mai multe lucrri n domeniul medical, care cuprind informaii incredibil de corecte, dintre care unele au fost confirmate ulterior aproape n totalitate. Prima dintre aceste lucrri a fost scris n versuri i se pare c a fost publicat la Veneia [Syphilis sive morbus Gallicus (Sifilisul sau boala galic), 1530, trei volume; numele se datoreaz faptului c se presupune c sifilisul ar fi fost rspndit n Italia de trupe franceze asediatoare]. n primele dou volume, Fracastoro descrie cu bune amnunte sifilisul; a descris i luesul ca entitate n cadrul acestei patologii, a discutat modalitile de debut i chiar diferenele ntre cele trei stadii ale bolii. Apar menionate i informaii despre modaliti de diagnostic i tratament (vapori de mercur, mixturi din sulf, mercur i extracte vegetale etc). n aceast scriere sunt discutate chiar i metode de prevenie. n al treilea volum, Girolamo Fracastoro prezint date 12

privind cltoriile lui Columb n Indiile de Vest (se pare c boala era foarte rspndit printre btinai) dar i o poveste din mitologie, povestea pstorului Syphil (numele sifilisului are, se pare, o vechime foarte mare) care a fost pedepsit de zeul Apollo, tocmai prin aceast boal. Lucrarea De contagione, contagionis morbis et eorum curratione (Despre contagiune, boli contagioase i tratamentul lor), publicat tot la Veneia, la vrsta de 68 de ani, include toate cunotinele i teoriile lui Fracastoro referitor la bolile contagioase ale acelor vremuri. n mod uimitor, cu sute de ani nainte ca aceste aspecte s fie studiate i parial demonstrate tiinific de ctre Louis Pasteur, ntr-o vreme cnd bolile erau considerate drept pedeapsa zeilor, teoria miasmelor morbigene a lui Hipocrate este combtut iar Fracastoro emite ipoteza conform creia bolile contagioase sunt transmise prin intermediul unor fiine invizibile [Seminaria morborum (seminele bolilor)]. Dup mai mult de 130 de ani, Antony van Leeuwenhoeck utilizeaz microscopul pentru a studia cteva dintre microorganisme. n plus, Girolamo Fracastoro discut cile de intrare a seminelor bolii n organism: a. pe gur, b. prin respiraie, c. prin rni, d. direct prin piele. Mai mult dect att, clasific contagiul drept fiind de trei feluri: a. prin contact direct (ex. n tuberculoz, lepr, sifilis); b. prin contact indirect, prin fomites (haine, aternuturi, farfurii) i c. la distan (seminele morbigene fiind purtate la distan de ctre vnt, ploaie, apa rurilor etc., ca n cazul ciumei). Cu toate c a oferit incredibil de multe explicaii, cu toate c teoriile sale au fost n bun parte confirmate ulterior, la acea vreme nu au fost acceptate iar teoria miasmelor morbigene a fost pentru nc mult timp considerat ca fiind valabil. Cu toate acestea, se poate spune c Girolamo Fracastoro poate fi recunoscut n istoria medicinei ca printele patologiei infecioase. revenire sus

1.1.2. Robert Koch (1843-1910) Alturi de Louis Pasteur poate fi considerat printele bacteriologiei. n 1905 meritele sale au fost recunoscute, primind premiul Nobel, acordat pentru cercetrile n domeniul tuberculozei. S-a nscut n 1843 n Clausthal. A studiat medicina la universitatea din Gottingen i Hanovra iar n 1866 a absolvit facultatea i a fost numit medic de circumscripie. A practicat medicina n mai multe localiti germane. n 1868 s-a stabilit n Wolstein (astzi aceast localitate se afl n Polonia). n timpul ederii la Wolstein a studiat Bacillus anthracis ntr-un laborator improvizat n propria locuina. Aici a creat celebrele postulate. Bacillus anthracis a fost descoperit de Pollender, Reyer i Davaine dar Robert Koch a fost cel ce a demonstrat c aceast bacterie e cauza mbolnvirilor cu antrax crbune (nume dat datorit culorii nchise a leziunilor din aceast boal). Prin studiile amnunite a descoperit fenomenul de sporulare i a fost primul cercettor care a folosit tehnica fotografiei n microbiologie, el fotografiind cmpurile microscopice. n 1880 a fost angajat n ministerul sntii unde i-a continuat cercetrile avndu-l colaborator printre alii pe Lofler. n 1891 s-a nfiinat Institutul pentru Studierea i Combaterea Bolilor 13

Infecioase din Berlin, instituie care la 30 de ani de la descoperirea bacilului tuberculozei a primit numele marelui savant. Infecia cu Mycobacterium era o mare problem n secolul 19. Unul din 7 oameni suferea de aceast boal, multe dintre mbolnviri evolund nefast, spre deces. n 1881 Robert Koch a izolat bacilul cauzator i a reuit s l cultive pe medii artificiale. n 1901 la congresul britanic despre tuberculoz, savantul a druit organizatorilor 5 eprubete n care se aflau colonii provenite din cultivarea succesiva de 435 de ori a bacililor pe care i identificase cu 20 de ani n urm (n 1891 Heinrich Gunther, un muncitor de 32 de ani, a fost internat i dup cteva zile a murit, se pare, datorit unei tuberculoze miliare; la necropsie Robert Koch a prelevat material bioptic, a inoculat iniial pe animale de laborator bacteriile provenite din acest material, ulterior reuind s le cultive i n vitro; n 24 martie 1882, Robert Koch a fcut publice descoperirile sale privind izolarea i identificarea agentului patogen al tuberculozei). Cercetrile nu s-au oprit aici, Robert Koch continund s aprofundeze studiul mycobacteriilor dar abordnd i alte microorganisme. Dup succesul identificrii bacilului tuberculos a urmat o perioada mai puin fast, el ncercnd s foloseasc iniial Alt-Tuberkulin ulterior NeuTuberkulin (un filtrat de cultur bacterian) ca i tratament. Insuccesul i-a adus numeroase critici dar experimentul a avut i o parte bun, aceste ncercri reprezentnd momentul de pionierat pentru evidenierea hipersensibilitii de tip IV, tuberculinic, iar tuberculina va fi ulterior utilizat n diagnostic i studii epidemiologice. revenire sus

1.1.3. Institutul Ion Cantacuzino Institutul Cantacuzino a existat cu muli ani nainte de a fi primit prin legea din 1921 o confirmare pe trm administrativ. nc din anul 1904, doi ani dup chemarea profesorului Cantacuzino la Catedra de Medicin Experimental de la Facultatea de Medicin, laboratorul su, destinat iniial exclusiv nvmntului i cercetrilor pur experimentale, instalat n cteva ncperi din institutul de Patologie i Bacteriologie condus de profesorul Victor Babe, a fost nsrcinat de ctre Direcia Sanitar s studieze metodele de preparare i valoarea practic a dou seruri curative de mare interes pentru medicin, serul antistreptococic i serul antidizenteric. Primele ncercri de aplicare la bolnavi s-au artat foarte ncurajatoare; ca atare s-a trecut de la faza experimental la prepararea pe o scar mai ntins i la utilizarea lor n practic. n perioada 1910-1913 a nceput experimentarea i prepararea vaccinurilor contra febrei tifoide i holerei asiatice. Rezultatele obinute convingeau i pe cei mai sceptici. Consiliul sanitar a adoptat ntrebuinarea acestor metode n combaterea epidemiilor de febra tifoida i holer, iar Serviciul Sanitar al armatei a decis aplicarea consecvent a vaccinrii antitifoidice la recrui realiznd prin aceasta dispariia aproape complet a cazurilor de febra tifoid din armat.

14

Toate aceste fapte au fost realizate cu mijloace improvizate, ntr-un modest laborator de nvmnt, n care ncperea cea mai impuntoare - sala de lucrri practice pentru studeni nu putea primi deodat mai mult de 25-30 de persoane. Conducerea profesorului crea o atmosfer de munca entuziast i dezinteresat, o motivaie admirabil printre colaboratori. Personalul tehnic se ntrea, numrul asistenilor benevoli de asemenea. Prin activitatea practic, laboratorul putea pune la ndemna studenilor mijloace de lucru care nu puteau fi gsite ntr-un simplu laborator universitar. Institutul Cantacuzino, exista de fapt. Rzboiul din 1916-1918 a demonstrat imperios promovarea unei legi dedicate nfiinrii, aa cum am menionat. De altfel, istoria nu se schimb; n ultimii 20 de ani aproape fiecare pas realizat n dezvoltarea sistemului de sntate public din Romnia a beneficiat de cte o problem de sntate care a demonstrat autoritilor (cel puin pentru o perioad de timp) c este necesar o intervenie concret. Mijloacele improvizate nu mai puteau fi suficiente pentru o ara ntregita, cu o populaie de trei ori mai mare i care suferise pe timpul i din cauza ocupaiei strine. n reorganizarea sanitar a rii, s-a impus, ca o msur de prim necesitate, organizarea unui Institut central de seruri i vaccinuri, echipat n aa fel nct s corespund nevoilor considerabil crescute ale Romniei Mari, institut de producie, de cercetare dar i de nvmnt. Prin Legea din 1921, graie guvernului de atunci, s-a creat o instituie avnd urmtoarele scopuri: - s prepare toate serurile, vaccinurile, precum i alte produse similare, necesare n profilaxia i tratamentul specific al maladiilor infecioase din ar; - s fac toate lucrrile necesare pentru cercetarea tiinific a acestor maladii i s stabileasc metodele tip pentru serologie i de microbiologie; - s serveasc drept organ de control pentru toate analizele bacteriologice i s-i dea avizul n ce privete introducerea n ar a serurilor i vaccinurilor preparate aiurea; - s pregteasc medici specialiti n microbiologie; - s tipreasc publicaii periodice n legtur cu activitatea tiinifica a acestui Institut, precum i cu activitatea medical i biologic din ntreaga ar. Institutul prepara i da spre ntrebuinare numai serurile i vaccinurile care fceau dovada eficacitii lor. n acelai timp, n laboratoarele institutului se cerceta i se ncercau metodele noi de diagnostic microbiologic i serologic, sau de tratament. Una dintre remarcabilele realizri ale cercetrilor din institut a fost realizarea vaccinului BCG i nceperea vaccinrii tuturor copiilor. La acea vreme vaccinul BCG se mai producea numai n cadrul Institutului Pasteur din Paris. Astzi n cadrul institutului exist laboratoare naionale de referin (multe dintre acestea fiind certificate internaional, de ctre Organizaia Mondial a Sntii), inclusiv un laborator foarte performant de biologie molecular. Producia nc mai continu, chiar dac preparatele pentru uz uman includ n principal (doar) vaccinul gripal sezonier. Anul trecut, INCDMI Cantacuzino a 15

fost una dintre puinele instituii la nivel mondial care a reuit s produc n timp util vaccinul gripal pandemic. n cldirea principal se gsete sala de curs i lucrri practice n care se pred bacteriologie, noiuni de imunologie i micologie, pentru studenii de anul doi ai facultii de medicin. La parter exist sala de curs i seminarii pentru studenii din anul cinci, epidemiologie. Institutul Cantacuzino rmne cel mai important centru de cercetare din Romnia. n ceea ce privete capacitatea de producie, existena acestuia este indispensabil (oricrei ri). Avem sperana c n ciuda anumitor evenimente din ultimii ani, nu vom vorbi niciodat despre Acest Institut la timpul trecut, ci doar la prezent i viitor.

16

2. Structura celulei bacteriene (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

2. 1. Caracteristici Bacteriile se pot clasifica dup mai multe criterii, ns o variant util de clasificare este clasificarea n funcie de structur i aspectul peretelui bacterian, bacteriile putnd fi: - rigide, cu perete dens, imobile sau mobile; unele dintre aceste bacterii pot forma micelii (ex. bacterii din genurile Mycobacterium, Actinomyces, Streptomyces, Nocardia); dac majoritatea bacteriilor studiate sunt cultivabile pe medii artificiale exist i bacterii care pot fi denumite ca parazii strict intracelulari (ex. genurile Rickettsia, Chlamydia); - flexibile, cu perete celular subire (ex. spirochetele, Treponema spp, Leptospira spp.); - lipsite de perete celular (ex. bacteriile din genul Mycoplasma). Celula bacterian este o celul procariot i are caracteristici structurale diferite n comparaie cu celula eucariot

Tabelul nr. 1. Caracteristici comparative (celula eucariot / celula procariot)

2. 2. Forma i dimensiunile bacteriilor

Forma 2. 2. 1. n funcie de form, bacteriile se pot grupa n mai multe categorii i pot avea: a). form cocoidal, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat. Majoritarea steptococilor i stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt lanceolai, gonococii i meningococii pot fi reniformi. Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultur n care se dezvolt, de vrsta culturii bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum i de modul n care are loc diviziunea n cursul procesului de cretere i multiplicare (planul de diviziune). Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele genuri de bacterii, de ex.: - stafilococii sunt coci sferici dispui n grmezi (ciorchine); - pneumococii sunt coci lanceolai dispui doi cte doi, eventual nconjurai de o capsul comun (n diplo); - streptococii sunt coci dispui n lanuri etc.;

17

b). form de bastona (bacili, rods), drepi cu capetele uor rotunjite (enterobacterii), drepi cu capetele tiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuite (Fusobacterium nucleatum), dispui uneori ntr-un mod caracteristic (de exemplu n palisade, ca i scndurile dintr-un gard - bacilii pseudodifterici); c). aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus); d). actinomicete, care n culturi tinere formeaz filamente lungi, ramificate (asemntor mucegaiurilor); aceste filamente se fragmenteaz i rezult aspecte bacilare (ex. Actinomyces israelli); e). forma spiralat (bacili curbi - V. cholerae, spirili i spirochete - T. pallidum). Unele bacterii, chiar i atunci cnd rezult prin multiplicarea unei singure celule mam prezint un pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.). n culturi vechi sau sub influena unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu antibiotice etc., pot aprea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care pot crea confuzii de diagnostic pentru examinatorul fr experien sau care nu face o examinare innd cont de context. Dac are loc repicarea acestora pe mediu de cultur proaspt iar examinarea ulterioar se face la timpul potrivit (avnd n vedere durata optim de multiplicare) vor rezulta forme tipice pentru specia respectiv.

Dimensiunile 2. 2. 2. Dimensiunile variaz n funcie de gen, specie, condiiile de mediu, vrsta i stadiul de dezvoltare al culturii. n general bacteriile au dimensiuni de ordinul micrometrilor, de exemplu, pentru coci 0,5-2 m, iar pentru bacili 0,3-2/0,5-10 m. Dintre bacteriile vizibile la microscopul optic, Francisella tularensis (discutat astzi n legtur cu posibile atacuri teroriste) poate avea dimensiuni mici, de circa 0,3-0,6 m / 0,2 m. Rickettsiile, chlamydiile i mycoplasmele nu sunt vizibile la microscopul optic datorit dimensiunilor foarte mici. Flagelii pot atinge dimensiuni de pn la 10m. Formele filamentoase rezultate dup tratamentul cu antibiotice pot depi aceast dimensiune. Bacteriile din genul Proteus pot prezenta n mod natural forme filamentoase, de dimensiuni mari. Dac n 1993 a fost pus n eviden Epulopiscium fishelsoni (60-800 m / 200-500 m), cea mai mare bacterie cunoscut astzi este Thiomargarita namibiensis, o proteobacterie Gram negativ, potenial vizibil cu ochiul liber (dimensiuni ntre 100300 m i pn la 750 m). (1999) Datorit dimensiunilor mici, bacteriile pot fi vizualizate numai cu ajutorul microscopului, fie clasic, cu lumina transmis direct, atunci cnd utiliznd un ocular cu o mrire de 10 i un obiectiv (de imersie) cu o mrire de 90-100 X, se realizeaz o amplificare a dimensiunilor bacteriene de circa 900-1.000 X, fie utiliznd alte tipuri de microscoape. Spre exemplu, utilizarea preparatelor colorate prin metode n care marcajul se face cu subtane fluorescente va crete puterea de rezoluie iar numrul de cmpuri investigate poate fi mai redus n 18

comparaie cu investigarea unui preparat colorat clasic (a se vedea capitolul referitor la genul Mycobacterium). Iluminarea n cmp obscur permite examinarea preparatelor proaspete i evidenierea agentului etiologic al sifilisului (T. pallidum), agentul etiologic al leptospirozei (Leptospira spp.), inclusiv mobilitatea acestora. Informaii privind preparatele microscopice, executarea i colorarea frotiurilor, tehnica examenului microscopic n diagnosticul microbiologic sunt prezentate n anexa nr. 1.

2. 3. Componentele structurale ale celulei bacteriene

Att din punct de vedere structural ct i funcional, exist o serie de asemnri ntre celula procariot i celula eucariot. Bacteriile prezint att elemente structurale interne ct i structuri externe care pot i merit a fi studiate avnd implicaii n relaiile dintre celula bacterian i organismul gazd. Exist dou tipuri de elemente structurale, unele dintre acestea fiind ntlnite la toate speciile de bacterii (constante), altele fiind ntlnite numai n anumite condiii i doar la anumite specii sau tulpini bacteriene (facultative).

2. 3. 1. Structuri constante ale celulei bacteriene

Structurile constante ale celulei bacteriene sunt reprezentate de: - perete, - membran citoplasmatic, - citoplasm (cu ribozomi i facultativ cu incluzii, vacuole, plasmide) i de - nucleu. 2. 3. 1. 1. Peretele bacterian Peretele bacterian nconjoar membrana citoplasmatic. Lipsete la bacteriile din genul Mycoplasma. Are o grosime de circa 15-30 nm. Bacteriile Gram-pozitive conin aproximativ 80-90% murein (peptidoglican, glicopeptid parietal). Mureina este un heteropolimer al crui schelet este format din lanuri polizaharidice. Aceste lanuri sunt formate prin polimerizarea, alternant, a 2 structuri zaharidice: - acidul N-acetil-muramic (NAM) i - N-acetil-glucozamina (NAG). 19

Fiecare molecul de NAM are substituit un tetrapeptid alctuit din D i L-aminoacizi. Se consider c aminoacizii n form D confer un grad de protecie fa de enzimele proteolitice. ntre tetrapeptidele substituite, la lanurile polizaharidice alturate, se stabilesc legturi peptidice prin gruparea terminal COOH a unui tetrapeptid i grupri terminale libere ale tetrapeptidului vecin. Astfel se formeaz structuri bidimensionale, destul de complicate, sub forma unor straturi care nconjoar ntreaga celul bacterian. Bacteriile Gram-pozitive rein violetul de metil (violet de genian n coloraia clasic) i au culoare violet pe frotiul colorat Gram. La unele bacterii, reeaua de baz este acoperit de reele suplimentare cu specificitate antigenic, alctuite de exemplu din acid teichoic (polimer de ribitol fosfat i glicerol fosfat), legat de regul covalent la peptidoglican. n cazul n care structurile fosfat se gsesc n cantiti limitate sau nu pot fi sintetizate, la nivelul peretelui bacterian putem ntlni acidul teichuronic. Dintre bacteriile Gram-pozitive se pot aminti stafilococul, streptococul, enterococul, bacilul difteric, bacilul listeriozei, actinomicetele, bacilul antraxului, clostridiile etc. n cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular n general mai subire dar mult mai complex. Peretele este alctuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-20% din structura peretelui) care este acoperit de o membran extern. Spaiul dintre membrana citoplasmatic i membrana extern (include peptidoglicanul) reprezint spaiul periplasmic. Din punct de vedere chimic, membrana extern este alctuit din fosfolipide, proteine i cantiti variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se afl la acest nivel sunt porinele. Lipopolizaharidul (endotoxina) are n componen dou structuri eseniale: lipidul A i polizaharidul O. Bacteriile Gram-negative se decoloreaz cu alcool-aceton i se recoloreaz cu fucsin diluat (au culoare roie la coloraia Gram). Dintre bacteriile Gram-negative am putea aminti meningococul, gonococul, enterobacteriile, vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii Gram-negativi (ex. Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella abortus) etc. Bacteriile acid-alcool rezistente (de exemplu, mycobacteriile sau nocardiile) conin o cantitate substanial de lipide la nivel parietal. Rezist decolorrii cu acid-alcool (au culoare roie pe fond albastru la coloraia Ziehl-Neelsen); aceast coloraie continu s reprezinte o etap esenial n diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, indiferent de cele mai recente descoperiri privind tehnicile moderne de laborator (inclusiv utilizarea sondelor nucleotidice sau amplificarea genetic). n afar de mycobacterii (n special M. tuberculosis, dar i numeroase mycobacterii atipice (non-tuberculous mycobacteria, NTM), ex. M. avium, M. intracellulare, M. kansasii), exist i alte specii bacteriene care pot aprea colorate asemntor dup utilizarea metodei Ziehl-Neelsen, spre exemplu bacilul difteric (C. diphteriae). Rolurile peretelui bacterian: - prin rigiditate asigur forma caracteristic bacteriei (coci, bacili etc); - asigur rezistena bacteriei (de exemplu la variaii ale presiunii osmotice i la presiuni interioare care pot ajunge pn la 20 atm.); - flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicat att prin flexibilitatea membranei ct i prin grosimea redus a peptidoglicanului; 20

- are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic, n cazul bacteriilor Gram-negative etc); - prezint receptori, de exemplu pentru bacteriofagi; - are rol n diviziunea bacterian participnd la formarea septului transversal; - la nivelul lui pot aciona unele antibiotice (exemplu beta-lactaminele, vancomicina, Dcicloserina); - la bacteriile Gram-negative este asociat cu numeroase enzime (situate n spaiul periplasmic i la nivelul membranei externe). Protoplastul (form rotund nconjurat de membrana citoplasmatic) reprezint bacteria Gram-pozitiv dup ndeprtarea complet a peretelui, de exemplu sub aciunea lizozimului care lizeaz mureina. n medii hipotone protoplastul se lizeaz. Este o structur care nu se poate multiplica. Sferoplastul reprezint bacteria Gram-negativ dup degradarea parial a peretelui (conine o cantitate mai mic de murein). Lizozimul poate aciona asupra peptidoglicanului numai dup alterarea membranei externe (ex. dup tratare cu EDTA). n medii hipotone sferoplastul se lizeaz. Spre deosebire de protoplast, se poate multiplica. Anumite bacterii produc autolizine (enzime hidrolitice care degradeaz peptidoglicanul, spre exemplu glicozidaze, amidaze, peptidaze). Este probabil ca aceste substane s aib un rol n creterea i multiplicarea bacterian. Formele L n 1935 s-a observat prezena unor germeni modificai structural. Au fost numite forme L, dup numele Institutului Dr. Lister unde au fost descoperite. Nu sunt microorganisme noi, ci variante ale unor microorganisme cu peretele bacterian modificat. Utilizndu-se lizozim sau penicilin ca ageni inductori s-au putut obine forme L de la majoritatea bacteriilor. Este posibil ca aceste forme L s explice, prin prezena lor n organism, anumite infecii cronice (de exemplu infecii ale aparatului urinar). 2. 3. 1. 2. Membrana citoplasmatic ntre perete i citoplasm exist membrana citoplasmatic avnd grosimea de 7-10nm; poate reprezenta circa o zecime din greutatea uscat a peretelui bacterian. Electronomicrografic apare format din 2 straturi ntunecoase separate de un strat mai clar. Este considerat un mozaic fluid, compus dintr-un film fosfolipidic n care floteaz proteine globulare cu extremitile polare hidrofile expuse spre spaiul intracelular, extracelular sau ambele. Aproape 10% din proteinele celulei bacteriene, peste 200 de feluri de proteine, sunt localizate la nivelul membranei citoplasmatice. Fosfolipidele, dispuse n dublu strat, au extremitile polare, hidrofile, expuse contactului cu apa pe ambele fee ale membranei i extremitile nepolare, hidrofobe, orientate spre stratul mijlociu al membranei. Nu conine steroli (excepie Mycoplasma spp).

21

Rolurile membranei citoplasmatice sunt de: - filtru selectiv, datorit permeazelor (rol n permeabilitate i transport); - barier osmotic; - a conine enzime ale metabolismului respirator (de exemplu citocromi); - a fi sediul majoritii activitilor enzimatice ale celulei bacteriene (de exemplu intervine activ n procesele de biosintez); - excreie a unor enzime hidrolitice; - a interveni activ n procese de biosintez; - a contribui la formarea septului transversal (rol n diviziunea celular); - a participa la procesul de chemotaxie prin receptorii de pe suprafaa sa. Asupra membranei pot aciona anumite antibiotice (de exemplu polimixinele). 2. 3. 1. 3. Mezozomii Mezozomii sunt structuri care se formeaz prin invaginarea membranei citoplasmatice de care rmn legai. Sunt prezeni n special la bacteriile Gram-pozitive. Au structura chimic a membranei citoplasmatice i aceleai funcii n permeabilitate i respiraie. Cu un capt se pot fixa de materialul nuclear, favoriznd distribuirea n mod egal a genomului ntre cele dou celule fiice. Au rol i n formarea septului transversal. 2. 3. 1. 4. Citoplasma La microscopul optic, pe preparatele colorate uzual, observm numai citoplasma bacterian, intens bazofil. Detaliile structurale (nucleoplasm, ribozomi, incluzii) se pot observa numai cu ajutorul microscopului electronic. Are o structur mai simpl fa de citoplasma eucariotelor. Este constituit dintr-un sistem coloidal format din proteine, enzime, lipide, pigmeni, hidrai de carbon, sruri minerale i ap. Conine n mod caracteristic 80% ap, menine ntr-un sistem coloidal proteine, carbohidrai, lipide, sruri etc, conine o mare cantitate de ARN (ex. ARNm, ARNt). Particulele citoplasmatice studiate sunt: ribozomii, incluziile, vacuolele; n citoplasm pot exista i elemente facultative, plasmidele (formate din ADN extracromozomial). La celula tnr citoplasma este intens colorat, omogen, conine ARN n cantitate mare, este clar n timp ce la celula btrn citoplasma are aspect granular. 2. 3. 1. 5. Ribozomii: structur, rol Ribozomii au form aproximativ sferic, pot fi vzui la microscopul electronic. Mrimea lor (circa 10-20 nm) depinde de concentraia ionilor Mg2+ i K+. Unii ribozomi sunt liberi n citoplasm, n timp ce alii apar legai de faa intern a membranei citoplasmatice. Din punct de vedere chimic conin circa 65% ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de 70 uniti 22

Swedberg dar sunt constituii din dou subuniti de cte 30S i respectiv 50S. n subunitatea mic intr o singur molecul de ARNr, 16S i 21 de tipuri de proteine ribozomale. n subunitatea mare intr mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S). ntre cele dou subuniti se formeaz canalul prin care trec moleculele de ARNm (mesager) n cursul sintezei proteice. Se apreciaz c ntr-o bacterie cu dimensiuni medii, aflat n faza de cretere activ, se sintetizeaz circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens. Ribozomii au rol esenial n procesul de biosintez proteic. Au tendina de a se grupa n polisomi (poliribozomi) cu eficien sporit n biosinteza proteic. n aceste condiii, la un moment dat pe aceeai molecul de ARNm se afl n scopul traducerii mesajului genetic mai muli ribozomi, care constituie un ansamblu care poart numele de polisom. Biosinteza proteic Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor. Cu toate c secvena de aminoacizi din structurile proteice este dictat de secvena de baze azotate din ADN, pentru c nu exist afinitate i posibilitate de cuplare ntre ADN i aminoacizi este necesar ca o alt structur s permit poziionarea aminoacizilor n lanul viitoarei proteine. Iniial are loc transcrierea informaiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta aceast informaie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este segmentul de ADN care deine informaia genetic pentru sinteza unei proteine. Segmentul de ADN care controleaz sinteza unui polipeptid poart numele de cistron. ARNm care deine informaia genetic pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poart numele de ARNm monocistronic. La bacterii, de obicei, o molecul de ARNm trebuie s poarte informaia necesar pentru sinteza mai multor catene diferite i n acest caz ARNm poart numele de ARNm policistronic. Aceast situaia particular este datorat dimensiunii mici a acestor procariote precum i metabolismului intens care are loc n cursul procesului de cretere i multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenial 3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se afl deinut de o singur molecul de ARNm policistronic. De regul, numai o caten de ADN este folosit drept matri pentru ARNm. Transcrierea mesajului genetic este selectiv (se desfoar ntre promotor i semnalul de terminare) i este controlat de ARN polimeraza ADN-dependent. Pentru traducerea mesajului genetic este necesar intervenia la nivel ribozomal a moleculelor de ARNt (de transfer). Acestea au o dubl specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi exist una sau mai multe molecule de ARNt; n acelai timp exist enzime specifice fiecrui tip de aminoacid care controleaz legarea corect a aminoacizilor activai pe ARNt corespunztor). La nivelul fiecrui ARNt exist trei nucleotide (anticodon) complementar codonului care corespunde aminoacidului.

23

ARNt nu are niciodat la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU i n aceste condiii ne putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG i UGA sunt codoni stop. Succesiunea specific a nucleotidelor este transpus ntr-o secven specific de aminoacizi care intr n constituia lanului polipeptidic din proteina n curs de formare. 2. 3. 1. 6. Incluziile Incluziile sunt formaiuni care apar n citoplasm la sfritul perioadei de cretere activ. Dimensiunea i forma incluziilor citoplasmatice pot varia n funcie de condiiile externe. Pot conine polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai genului Corynebacterium, la a cror descoperire a avut un rol important Profesorul Victor Babe), substane anorganice simple, polimeri organici (rezervor energetic mai ales la germenii sporulai aerobi), lipide, cristale, granulaii de sulf etc. 2. 3. 1. 7. Vacuolele Vacuolele sunt formaiuni sferice care conin diferite substane n soluie apoas. Au o membran lipoproteic numit tonoplast. Au fost descrise n mai ales la bacteriile acvatice i ar putea avea un rol n plutirea acestora. 2. 3. 1. 8. Nucleul Masa nuclear vine n contact direct cu citoplasma. Este localizat n partea central a celulei. Conine ADN, nu are nucleoli. Are afinitate pentru coloranii bazici, dar pe preparatele colorate uzual este mascat de bazofilia intens a citoplasmei bogat n ARN. Unicul cromozom bacterian este alctuit dintr-o singur molecul de ADN dublu catenar, cu aspectul unui fir lung (1.000-2.000 m), nchis ntr-un inel i replicat pe el nsui, superspiralat. Mrimea cromozomului poate s difere n funcie de specia bacterian (i respectiv numrul de perechi de baze); cea mai mic celul bacterian ar fi cea de Mycoplasma spp., la care dimensiunea este de 4.700 kpb, n timp ce cromozomul de E. coli poate avea o dimensiune de circa 3 ori mai mare. Avnd n vedere c dimensiunea bacteriilor este de circa 1-2 mm n cazul cocilor i de cteva ori mai mare n cazul bacililor, pentru ca materialul genetic s poat fi coninut n acest spaiu redus, acesta trebuie s fie compactat ntr-un mod remarcabil i astfel, rezult nucleoidul bacterian care poate fi difereniat microscopic. Nucleoidul este format din molecula de ADN asociat cu proteine i o cantitate variabil de ARN. Relativ recent (1989) s-a descoperit c exist i bacterii care dein cromozomi lineari (ex. Borrelia burgdorferi). Toate speciile din genul Borrelia dein i plasmide lineare. Replicarea cromozomului bacterian se face printr-un mecanism semiconservativ. Aa cum am menionat, cromozomul este unic, ns n celula care se dezvolt rapid exist posibilitatea ca nainte ca prima replicare s se fi ncheiat s se iniieze nc o replicare i n acest caz celula bacterian va putea fi meroploid (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori) sau chiar poliploid (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori). Dac replicarea cromozomial nu este succedat de diviunea celulei (aa cum se ntmpl n mod obinuit), putem remarca n celula bacterian existena mai multor cromozomi. Cromozomii suplimentari 24

(n total 2 sau 4) nu aduc o informaie genetic diferit pentru c ei sunt copii ale cromozomului iniial (identici cu acesta). Nucleul deine informaia genetic necesar proceselor vitale de cretere i multiplicare. Codonul Din punct de vedere funcional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN formeaz un codon. Codonii dein informaia genetic pentru a plasa ntr-o anumit secven un anumit aminoacid, n lanul polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul ribozomilor. Cistronul Cistronul reprezint o subunitate funcional a genei, capabil s determine independent sinteza unui lan polipeptidic. Gena Gena structural reprezint o poriune a genomului, respectiv o anumit secven de nucleotide dispuse liniar. Genele structurale reprezint circa 90% din ansamblul informaiei genetice. Poart nscris n structura sa informaia genetic necesar pentru sinteza unei proteine specifice, structurale sau funcionale (enzime).

2. 3. 2. Structuri facultative

Structurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsul, cili (flagelii), fimbrii (pili) i spori (forme de rezisten). 2. 3. 2. 1. Capsula: structur, rol, evideniere Numeroase bacterii sintetizeaz polimeri organici (de obicei polizaharide) care formeaz n jurul celulei o matrice fibroas, numit glicocalix. La unele bacterii glicocalixul ader strns de celula bacterian i reprezint capsula. Exist bacterii care dein o capsul bine definit, cu structur polizaharidic (S. pneumoniae, K. pneumoniae, unele tulpini de E. coli etc) sau cu structur polipeptidic (Bacillus anthracis etc). La alte bacterii, glicocalixul formeaz o reea lax de fibrile care se pierde parial n mediu i poate fi separat de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibil, care nu este vizibil la microscopul optic. Roluri: - factor de virulen, mpiedicnd fagocitarea bacteriei i favoriznd invazivitatea; - rezisten fa de surfactani, anticorpi; - permite aderarea unor bacterii (rol de adezin); 25

- barier protectoare fa de bacteriofagi, protozoare; - conine substane cu specificitate antigenic (de specie sau de tip) - antigenul K. Spre exemplu, n cazul S. pneumoniae exist peste 90 tipuri antigenice capsulare n timp ce la E. coli sau la Klebsiella pneumoniae exist peste 80 tipuri antigenice capsulare. Referitor la modalitile de evideniere ale structurilor capsulare, este de menionat c prin coloraia cu albastru de metilen sau tu de China / India, n jurul bacteriei apare un halou necolorat. Exist i coloraii speciale pentru capsul, de exemplu coloraia Hiss. Structura antigenic a capsulei permite identificarea bacteriilor, spre exemplu prin reacia de umflare a capsulei (Neufeld) atunci cnd se folosesc seruri polivalente sau monovalente anti-capsulare pentru identificarea pneumococilor. 2. 3. 2. 2. Flagelii: structur, rol, localizare Cilii sau flagelii confer mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evideniat n preparatul proaspt (ntre lam i lamel) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU). Mobilitatea germenilor din genul Proteus este observat pe orice mediu de cultur solid pe care acest microorganism foarte mobil se dezvolt (fenomenul de invazie). Flagelii sunt formaiuni fine, alungite, flexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal. Acesta este alctuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate ca dou perechi pe o structur care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este plasat n perete i membrana citoplasmatic. Din punct de vedere chimic flagelul este de natur proteic (flagelina). Roluri: - n mobilitate (cu o vitez de circa 50 m / secund); cilul are o micare de rotaie, asemntoare unei nurubri n mediu i ca atare corpul bacterian este mpins n direcia opus; motorul rotaiei e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obinut din ATP; - antigenic (datorit structurii proteice - antigenul H, specific de tip); - n clasificarea bacteriilor (prin numr i distribuie), bacteriile putnd fi - monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa; - lofotriche (cu un mnunchi de flageli dispus la o extremitate); - peritriche (cu mai muli flageli dispui de-a lungul suprafeei bacteriene), de exemplu E. coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi. 2. 3. 2. 3. Fimbriile (pilii) Sunt formaiuni scurte, fine, nu au rol n mobilitate. De obicei pilii sunt mai subiri dect cilii. Pot fi foarte numeroase pe suprafaa majoritii bacteriilor; pot fi observate numai la microscopul electronic.

26

Exist pili comuni, cu urmtoarele roluri: - n aderena bacterian (adezine); - conin receptori specifici pentru bacteriofagi; - antigenic (la unele bacterii), ex. N. meningitidis i N. gonorrhoeae. Exist pili F (sexuali), determinai genetic de factorul de fertilitate F (episom). Acetia ndeplinesc rolul canalului de conjugare. 2. 3. 2. 4. Sporii: structur, compoziie chimic, rol, localizare Fenomenul de sporogenez este mai des ntlnit la Bacillaceae (genurile Clostridium i Bacillus). Pe sol, n condiii de uscciune, la adpost de lumina solar direct, endosporii persist zeci i poate sute de ani. Materialul genetic este concentrat i, mpreun cu apa legat, lipide, Ca++, Mg++, este nconjurat de un strat protector (membrana sporal, cortexul sporal, nveliurile sporale). Smburele sporal mpreun cu membrana citoplasmatic formeaz protoplastul sporal. Roluri: - form de rezisten i conservare a speciei (n condiii favorabile un spor se poate transforma ntr-o bacterie / forma vegetativ; procesul de formare a sporului ar putea fi considerat una dintre cele mai primitive forme de difereniere, dar nu este un proces de reproducere celular aa cum se ntmpl la fungi sau parazii); - rezist la cldur, uscciune, la anumite substane chimice i antibiotice, raze UV etc. Sporul poate fi localizat: - central sau subterminal, mai mic dect celula (ex. la Bacillus anthracis); - central sau subterminal, mai mare dect celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc); - terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de b de chibrit). Poate fi evideniat prin coloraii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraia Gram (locul sporului rmne necolorat). Este sensibil la formol, propiolacton etc. Este distrus prin autoclavare.

2. 4. Povestiri adevrate

2. 4. 1. Sporii bacterieni; Izbucnire epidemic de infecii cu Clostridium novyi tipA n rndul utilizatorilor de droguri administrate injectabil, n Scoia

27

n Scoia, n perioada aprilie-august a anului 2000, s-a raportat un numr fr precedent de mbolnviri n rndul utilizatorilor de droguri pe cale injectabil. Au fost identificate 60 de cazuri (23 confirmate i 37 probabile), la subieci cu vrsta medie de 30 de ani, dintre care 31 erau de sex feminin (51,66%). Toi pacienii erau consumatori de droguri administrate prin injecie intramuscular i subcutanat (n acest caz a fost vorba despre un preparat compus din heroin i acid citric). 20 (87%) dintre cazurile confirmate au evoluat ctre deces. Din totalul pacienilor, 15 au prezentat fasciit necrozant, 22 au dezvoltat edem la locul de injectare, iar 13 au prezentat pleurezie. n 20 (54%) dintre cazurile probabile i 14 (61%) dintre cele confirmate au existat legturi familiale sau sociale ntre subieci. Semnele clinice cel mai des nregistrate au fost: durere i edem marcat la nivelul locului de injectare; n cteva dintre cazuri, n afar de aceste semne, pacienii au prezentat insuficien multi-organic. O caracteristic a sindromului de afectare multi-organic a fost reprezentat de reacia leucemoid, cu leucocitoz la valori foarte ridicate, cu deviere la stnga a formulei leucocitare (numeroase leucocite tinere, nesegmentate). Probe din heroina confiscat (pur i n combinaie cu acid citric), probe de snge i fragmente tisulare (recoltate antemortem i postmortem) au fost trimise ctre laboratoarele de referin din Glasgow i Londra, dar i ctre laboratorul Centrului pentru prevenirea i controlul bolilor (CDC, Atlanta, SUA). Supoziia iniial (infirmat prin testele de laborator) a fost cea de contaminare a drogurilor cu spori de Bacillus anthracis. Testele efectuate pe probele recoltate au evideniat contaminarea masiv cu spori de Clostridium novyi, tip A, a drogurilor injectabile recuperate (probabil datorit condiiilor precare de obinere, stocare i transport ale acestora). Autoritile au emis ipoteza c o cantitate mult mai mare de droguri se poate afla n circulaie i aceast situaie ar putea fi considerat ca o adevrat bomb biologic pentru populaia consumatoare de droguri. Microorganismul cel mai frecvent izolat din probele recoltate de la pacieni (n condiii de anaerobioz i transportate corespunztor, la adpost de oxigen) a fost Clostridium novyi. Din probele recoltate s-au izolat, de asemenea, Clostridium perfringens i Clostridium saccharolyticum. n cazul n care autoritile de sntate public nu s-ar fi gndit, n cazul diagnosticului diferenial, i la o ipotez n care germenii anaerobi s fie implicai, izbucnirea epidemic ar fi putut s rmn fr diagnostic etiologic. Pe lng prezena sporilor, demonstrat prin tehnici de laborator, a fost utilizat testarea efectului citopatic asupra culturilor monostrat de linii celulare Vero i astfel s-a demonstrat prezena alfa-toxinei produs de C. novyi,tip A, n probele recoltate. Alfa-toxina este eliberat la nivelul procesului infecios (locul injectrii drogului, unde prin realizarea condiiilor de anaerobioz, sporii trec n form vegetativ se multiplic i bacteriile sintetizeaz exotoxina), n esutul subcutanat, conduce la instalarea unui rspuns inflamator local intens, cu edem marcat. Alfa-toxina are o contribuie patogenic i n situaiile cu evoluie spre insuficien multi-organic, asociat cu hipotensiune arterial, reacie leucemoid i fasciit necrozant. Condiiile de anaerobioz sunt atinse deoarece soluia de heroin tamponat cu acid citric produce necroz tisular la locul injectrii (n cazul n care soluia ar fi fost injectat intravenos, sporii ar fi fost distrui de ctre mecanismele de aprare ale gazdei, la nivel sanguin).

28

n cazul n care ipoteza unei afectri datorit sporilor provenii de la bacterii anaerobe ar fi fost emis de la nceput i dac nu s-ar fi instituit (la o parte dintre cazuri) antibioterapia empiric cu antibiotice / chimioterapice cu spectru larg anterior recoltrii probelor, procentul de infecii cu etiologie confirmat ar fi putut s fie mai mare. S-au emis mai multe comunicate de pres pentru a pune n tem populaia i pentru a alerta comunitatea medical i pe eventualii consumatori de droguri. 2. 4. 2. Capsula bacterian Multe s-au scris despre Neisseria meningitidis, meningococul, rspunztor pentru izbucniri epidemice de meningit, cu urmri ngrijortoare (decese, sechele). Infeciile meningococice rmn nc o problem de sntate la nivel mondial iar nelegerea mecanismelor prin care Neisseria meningitidis eludeaz mecanismele de aprare ale gazdei este foarte important. Meningococul determin boala prin invazivitate i multiplicare, adernd la celulele umane i invadndu-le ns dup aceast etap procesul rmne, n mare parte, un mister. Unul din atributele de patogenitate ale meningococului este reprezentat de capsula polizaharidic, cu un rol clar demonstrat n supravieuirea bacterian n fluidele extracelulare. Studii recente au artat c aceeai structur contribuie i la supravieuirea intracelular. Sistemul complement este unul dintre factorii de aprare foarte importani n protecia subiecilor fa de infecia cu N. meningitidis; totui acest microorganism s-a adaptat i a dezvoltat mecanisme proprii de protecie anti-complement. Structurile bacteriene de genul capsulei polizaharidice precum i cele care imit structurile proprii (self) ale gazdei sau leag molecule proprii organismului salveaz germenul de la liz celular i fagocitoz. Se pare c Neisseria meningitidis i folosete eficient proprietile, att extra- ct i intracelular. Prin inocularea de tulpini capsulate i necapsulate marcate izotopic n culturi celulare de celule fagocitare i nefagocitare umane s-a ncercat monitorizarea invazivitii i multiplicrii intracelulare. Rezultatele au fost surprinztoare deoarece capsula, care diminueaz capacitatea de aderare la membrana celular i de intrare a germenului n celul, este esenial pentru supravieuirea intracelular a microorganismului. Un posibil mecanism prin care se produce aceast supravieuire ar fi cel al rezistenei capsulare la peptidele cationice antimicrobiene (CAMPs cationic antimicrobial peptides), componente ale sistemului imun nnscut. Degradarea intracelular a bacteriilor internalizate poate fi legat de o multitudine de mecanisme, printre care aciunea pH-ului, stresul oxidativ sau aciunea enzimelor litice i a peptidelor antimicrobiene. Teoretic prezena capsulei ar putea interfera, direct sau indirect, cu oricare din aceste mecanisme. n particular s-a evideniat deja medierea rezistenei pentru Klebsiella pneumoniae la CAMPs de ctre capsula sa, polizaharidic. n ceea ce privete capsula N. meningitidis, studii preliminare au artat deja c tulpinile necapsulate sunt mai susceptibile aciunii defensinelor, protegrinelor i polimixinei B, asemntoare CAMPs. Polimixina B, un peptid ciclic de origine microbian, a fost folosit ca model al CAMPs datorit proprietilor ei de permeabilizare a membranei externe a germenilor 29

Gram-negativi. Experimental s-a msurat rata de supravieuire a meningococilor timp de 45 de minute n diferite concentraii de polimixin B. Rezultatele au confirmat c absena capsulei scade viabilitatea microbian n prezena polimixinei B. Acest model pe culturi celulare susine ipoteza conform creia capsula N. meningitidis reprezint un mecanism major pentru supravieuirea intracelular a bacteriei din cursul infeciei. 2. 4. 3. Importana examenului microscopic Examenul bacteriologic direct are o mare importan pentru diagnosticul de etap, dar i pentru cel definitiv; poate schimba radical indicaia de tratament precum i prognosticul pentru respectivul pacient. n cadrul examenului bacteriologic direct, examenul preparatului proaspt ntre lam i lamel a rmas ruda srac, fiind mai rar folosit (prea rar); informaiile obinute pot fi ns foarte utile. La un pacient seropozitiv stadiul C3, cu diaree trenant i sever, examenul citobacteriologic a artat prezena unor formaiuni rotund ovalare interpretate ca levuri, probabil candidozice. n ciuda tratamentului antifungic pentru levuri diareea a rmas la fel de sever i starea grav. La o nou examinare a materiilor fecale, de data aceasta i a preparatului proaspt ntre lam i lamel, colorat cu albastru de metil, s-au vzut (datorit colorantului) aceleai formaiuni rotunde dar cu capsul, ridicndu-se suspiciunea unei infecii cu criptococ, care ulterior s-au identificat dup culturi i repicri repetate pe medii specifice. Dar ce este de subliniat este c schimbarea imediat a tratamentului a condus la remiterea simptomatologiei i mbuntirea strii pacientului.

2. 5. Direcii de cercetare
1. Bader J, Albin A, Stahl U, Spore-forming bacteria and their utilisation as probiotics, Benef Microbes 2012 Mar 1; 3(1):67-75 2. Beceiro A, Toms M, Bou G, [Antimicrobial resistance and virulence: a beneficial relationship for the microbial world?], Enferm Infecc Microbiol Clin. 2012 Mar 1 (to be published) 3. Salman V, Amann R, Girnth AC, Polerecky L, Bailey JV, Hgslund S, Jessen G, Pantoja S, SchulzVogt HN, A single-cell sequencing approach to the classification of large, vacuolated sulfur bacteria, Syst Appl Microbiol. 2011 Jun; 34(4):243-59 4. Segura M., Fisher Scientific Award Lecture - The capsular polysaccharides of Group B Streptococcus and Streptococcus suis differently modulate bacterial interactions with dendritic cells, Can J Microbiol. 2012 Mar; 58(3):249-60

2. 6. Evaluarea cunotinelor
1. Alegei afirmaia fals: a. Bacilii au form rotund i se adun n grmezi b. Haemophilus influenzae este un cocobacil

30

c. Dimensiunile bacteriene sunt de ordinul micrometrilor i din acest motiv bacteriile se pot examina la microscopul optic d. Aspectul in diplo este caracteristic pneumococilor e. Exist bacterii cu dimensiuni foarte mici (ex.: Chlamydia spp. i Mycoplasma spp.) care nu pot fi vizualizate la microscopul optic 2. Despre componentele structurale ale celulei bacteriene este adevrat urmtoarea afirmaie: a. Peretele bacteriilor Gram-negative nu conine murein b. Membrana celular este o structur facultativ c. Nucleul bacterian este nvelit de membran nuclear i conine numeroi nucleoli d. Capsula bacterian reprezint un factor de virulen i favorizeaz invazivitatea e. Bacteriile cu flageli sunt imobile 3. Peretele bacterian: a. Este o component constant a bacteriilor din toate genurile b. Este degradat cu uurin sub aciunea lizozimului (muramidazei) c. Are aceeai grosime att la bacteriile Gram-negative, ct i la cele Gram-pozitive d. Nu este sediu de aciune pentru nici un tip de antibiotic e. Conine antigene capsulare 4. Care dintre enunuri este corect n ceea ce privete structurile facultative bacteriene: a. Sporii bacterieni au rol n replicarea ADN-ului b. Mobilitatea bacteriilor este dat de fimbrii c. Sporul este o form de rezisten bacterian d. Capsula este ubicuitar la toate genurile bacteriene e. O bacterie nu poate avea mai mult de un singur flagel 5. Sporii bacterieni: a. Nu se distrug prin autoclavare b. Sunt forme de rezisten ale bacteriilor i se pot transforma n forme vegetative c. Nu se vizualizeaz microscopic d. Pentru orice tip bacterian, sunt localizai n acelai loc i anume central e. Sunt caracteristici tuturor speciilor bacteriene

31

3. Fiziologia bacterian (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

3. 1. Constituia chimic a bacteriilor 3. 1. 1. Apa: procent, rol Apa reprezint peste 75-85% din greutatea umed a bacteriei. Exist ap liber (mediu de dispersie) i ap legat fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puin ap, n special ap legat. Bacteriile sunt fiine acvatice prin excelen. Vacuolele sunt formaiuni sferice care conin diferite substane n soluie apoas. Au o membran lipoproteic numit tonoplast. Au fost descrise n special la bacteriile acvatice i ar putea avea un rol n plutirea acestora. Dintre rolurile ndeplinite am putea aminti faptul c apa reprezint un mediu de dispersie, este reactiv n reaciile metabolice, reprezint etapa final a unor reacii oxidative etc. Prin deshidratare (desicare) este posibil prezervarea culturilor bacteriene timp ndelungat. O metod des utilizat datorit eficienei sale este liofilizarea (criodesicarea). Studiile tiinifice au artat c, n general, germenii Gram-negativi rezist mai puin timp liofilizrii dect cei Grampozitivi, fenomen care a fost pus pe seama stratului mai subire de peptidoglican. (1) 3. 1. 2. Substanele minerale Substanele minerale reprezint 2-30% din greutatea uscat a bacteriei i variaz n funcie de specie, vrsta culturii, compoziia chimic a mediului. Unele elemente intr n compoziia diferitelor structuri (exemplu sulful intr n structura aminoacizilor, fosforul n structura fosfolipidelor etc). Dintre rolurile ndeplinite am putea aminti urmtoarele: favorizeaz schimburile cu mediul, particip la reglarea presiunii osmotice, pot stimula creterea i funcia bacteriei (de exemplu fierul n cazul bacilului difteric, care condiioneaz i producerea de toxine), activeaz unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului i a potenialului de oxido-reducere. Aa cum am menionat anterior, la nivel ribozomal se gsesc Mg++ i K+. 3. 1. 3. Glucidele n structura bacterian se pot gsi glucide simple cu rol n metabolismul intermediar glucidic, precum i glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urm au o serie de roluri, spre ex. particip la realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor bacterii etc. Exist teste biochimice n care se urmrete utilizarea sau imposibilitatea utilizrii unui anumit zahar de ctre o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei respective (n special n cazul enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc). Testrile biochimice sunt de mare utilitate i n studiul fungilor (auxanogram, zimogram). 3. 1. 4. Proteinele Exist proteine simple (cu rol n metabolismul intermediar protidic) i proteine complexe, cum ar fi: mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul hialuronic din structuri de tip capsular), 32

 cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi), nucleoproteinele (ex. n acizii nucleici). Este de remarcat prezena n structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul diaminopimelic, precum i a aminoacizilor n forma D (ceea ce reprezint o adaptare biochimic a bacteriilor fa de aciunea nociv a enzimelor proteolitice). 3. 1. 5. Lipidele Reprezint mai puin de 10% din greutatea uscat a bacteriilor i variaz cantitativ n funcie de specie, vrsta culturii (cresc n celulele mbtrnite, reprezentnd probabil un semn de degenerescen) i compoziia mediului. La mycobacterii, sunt n cantitate mai mare (circa 2040%), n special la nivel parietal i determin o serie de proprieti specifice, inclusiv afinitatea tinctorial. Lipidele se pot gsi libere n vacuole, combinate sau fcnd parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membran, mezozomi). Dintre lipidele bacteriene putem aminti: acizii grai speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii), cerurile (acizi grai plus alcooli monovaleni superiori), care se gsesc n cantitate mare la bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. n peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc). Dintre acestea, ceara D pare a fi implicat n inducerea hipersensibilitii ntrziate (de tip IV). fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema pallidum (agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor Gramnegative, cu activitate toxic. 3. 1. Constituia chimic a bacteriilor (b) 3. 1. 6. Pigmenii Pigmentogeneza este caracteristic bacteriilor cromogene i este dependent de condiiile de cultivare. Producerea de pigmeni poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. n cazul tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa sau n cazul unor specii din genul Staphylococcus). Trebuie s reinem nc de la nceput faptul c n cazul stafilococilor, pigmentogeneza este doar un caracter orientativ i nu vom clasifica drept patogen o tulpin de stafilococ n funcie de culoarea coloniei. Stafilococii sunt condiionat patogeni. Testul orientativ privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat n mod obligatoriu pentru toate tulpinile izolate de la pacieni. Dup localizarea pigmentului, bacteriile pot fi: cromofore (pigmentul este legat n citoplasm); paracromofore (pigmentul este prezent n perete sau n stratul mucos, de exemplu la S. aureus sau la Staphylococcus epidermidis); cromopare (pigmentul este difuzibil n mediu, de exemplu la Pseudomonas aeruginosa). n afar de faptul c datorit producerii de pigmeni (albastru, galben-verde, maro etc. n cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb n cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul de laborator se poate orienta n alegerea testelor de identificare ntr-un anumit context clinic i microbiologic.

33

Putem aminti i faptul c pigmenii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecie fa de radiaiile UV (pigmeni carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborat de P. aeruginosa fa de B. anthracis) i rol enzimatic. 3. 1. 7. Enzimele n cazul bacteriilor se poate aprecia c metabolismul este foarte intens. Capacitatea de a elabora anumite enzime este determinat genetic (exist peste 2000 de determinani genetici diferii), precum i prin mecanisme de control care pot modifica bagajul enzimatic n funcie de necesiti. Dup locul de aciune, enzimele bacteriene se pot mpri n: enzime extracelulare (exoenzime), de exemplu hidrolazele; enzime ectocelulare (n membrana citoplasmatic, reglnd permeabilitatea selectiv), de exemplu permeazele; enzime intracelulare. n raport cu reacia catalizat, enzimele pot fi: hidrolaze, transferaze, oxidoreductaze, liaze, izomeraze etc. Dup modul de apariie, enzimele pot fi: constitutive (exist totdeauna n celul, indiferent de natura mediului); inductibile (sunt sintetizate de ctre bacterie numai ca rspuns la anumii compui aprui n mediu). Studierea comportamentului enzimatic este foarte util n taxonomie. Fiecare unitate taxonomic bacterian (gen, specie) are un spectru de activitate enzimatic propriu; studierea acestuia poate avea o deosebit importan n identificarea bacteriilor. 3. 1. 8. Substane cu aciune antibiotic: plasmidul Col codific proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu efect asupra altor bacterii receptive nrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli); unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B. licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizeaz gramicidina, iar B. polymyxa sintetizeaz polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astzi, din alte genuri, vezi capitolul nr. 48). 3. 1. 9. Vitaminele bacteriene Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi secretat de exemplu de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care poate fi sintetizat de E. coli, riboflavina sintetizat de B. subtilis, vitaminele B2 i B12 sintetizate de B. megaterium etc. sau vitaminele din grupurile B i K, care pot fi sintetizate sub influena florei bacteriene intestinale umane. 3. 1. 10. Factorii de cretere Factorii de cretere sunt metaboliii eseniali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza substanelor care se gsesc n mediul extern. Factorii de cretere trebuie neaprat inclui n mediul de cultur n cazul n care dorim s izolm microorganismul respectiv, numit microorganism pretenios (ex. factorii X i V trebuie inclui n mediul de izolare pentru Haemophilus influenzae).

34

Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptndu-se la viaa parazitar, devin dependente de o serie de astfel de factori de cretere (unele sunt att de dependente nct nu pot fi cultivate in vitro, de exemplu bacilul leprei - Mycobacterium leprae). 3. 2. Metabolismul bacterian 3. 2. 1. Nutriia bacterian Nutriia bacterian reprezint suma proceselor metabolice care conduc la producerea de materiale convertibile n energie i n diferite componente celulare. Nutrienii sunt substane ale cror soluii pot traversa membrana citoplasmatic pentru a fi antrenai n reaciile metabolice care asigur creterea i multiplicarea celular. n raport cu sursa de energie, bacteriile se mpart n: bacterii care folosesc energie luminoas i triesc la lumin (photobacterii) i bacterii care i procur energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic i triesc la ntuneric (scotobacterii, chimiosintetizante). n raport cu sursele folosite ca material de sintez n ambele diviziuni se difereniaz: bacterii autotrofe, capabile s-i sintetizeze toi compuii organici din materie anorganic i bacterii heterotrofe, dependente de prezena unor compui organici. Nutriia principalelor bacterii studiate Majoritatea bacteriilor comensale, condiionat patogene sau patogene importante pentru om, sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se difereniaz n funcie de tipul respirator. Exist i bacteriile paratrofe, a cror energie trebuie oferit de gazd. Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu microorganismele din genurile Rickettsia i Chlamydia, care depind nutriional de o gazd vie). Creterea microbian necesit polimerizarea unor substane mai simple pentru a forma: proteine, acizi nucleici, polizaharide i lipide. Aceste substane se obin fie din mediul de cultur, fie sunt sintetizate de ctre celulele n cretere (sunt necesare diferite coenzime i legturi macroergice de tipul celor din ATP). Substanele necesare i coenzimele implicate se pot obine dintr-un numr relativ redus de precursori metabolici. Dac o celul bacterian primete substanele necesare, va sintetiza diferite macromolecule, iar secvena aranjrii componentelor n aceste macromolecule este determinat fie dup un model ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidrai i lipide. Dup ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansambleaz, formnd structuri supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor i activitatea cilor metabolice sunt foarte bine reglate (exist o permanent balan a biosintezei). Microorganismele reprezint un grup de celule vii care utilizeaz o mare diversitate de ci metabolice; de exemplu, mai multe ci diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur compus simplu, benzoatul, iar o singur cale metabolic pentru benzoat poate fi reglat de mai multe sisteme de control. Principiul determinant pentru cile metabolice este acela al organizrii unui numr relativ mic de tipuri de reacii biochimice, ntr-o ordine specific. Multe dintre cile biosintetice se pot deduce avnd n vedere structura chimic de la care se pornete, produsul final i eventual unul sau doi metabolii intermediari. Principiul determinant al reglrii 35

metabolismului este acela c enzimele par a fi chemate n joc numai cnd activitatea lor este necesar. Activitatea unei enzime poate fi modificat variind fie cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acioneaz. n unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuat prin cuplarea unor efectori specifici (metabolii care moduleaz activitatea enzimatic). De multe ori, activitatea unei enzime care catalizeaz o etap metabolic iniial este (poate fi) inhibat de produsul final al cii respective. O astfel de inhibiie nu poate depinde de competiia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiia depinde de faptul c enzimele reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzim are att un situs catalitic de legare cu substratul, ct i unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori). Legarea unui efector de situsul su duce la o modificare conformaional a enzimei, astfel nct afinitatea situsului catalitic scade (inhibiie allosteric) sau crete (activare allosteric). Cnd o bacterie peritriche se mic, flagelii se asociaz i se mic mpreun, rezultnd o deplasare liniar. La diferite intervale de timp, bacteria i schimb direcia (flagelii se dau peste cap). Acest comportament face posibil chemotaxia: o celul care se ndeprteaz de sursa atractantului chimic i schimb sensul de micare mult mai frecvent n comparaie cu una care se apropie de atractant i ca o nsumare, bacteria se va deplasa nspre atractant. Spre exemplu, prezena unui zahar sau a unui aminoacid este sesizat de receptori specifici localizai pe membrana celular (de multe ori acelai receptor particip i la transportul membranar al acelei substane). Celula bacterian este prea mic pentru a fi capabil s detecteze existena unui gradient chimic (n spaiu), dar s-a demonstrat experimental c detecteaz gradienii n timp (de exemplu, concentraia unei substane scade n timp ce bacteria se ndeprteaz de surs i crete n timp ce aceasta se apropie de surs). Anumii compui acioneaz ca respingtori (R), iar alii ca atractani (A). Un mecanism care ar explica rspunsul celulei fa de A/R ar implica metilarea i respectiv demetilarea unei proteine specifice din membran, care depinde de GMPc. Atractanii produc o inhibiie tranzitorie a demetilrii acestei proteine. Respingtorii stimuleaz demetilarea. Mecanismul prin care o modificare n comportamentul celular se produce ca rspuns la o modificare de mediu poart numele de transducie senzorial. Aceasta pare s fie responsabil de: chemotaxie; aerotaxie (deplasarea ctre concentraia optim de O2); fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe ctre lumin); deplasarea spre acceptorul de electroni etc. 3. 2. 2. Respiraia bacterian Respiraia reprezint suma reaciilor biochimice aerobe sau anaerobe productoare de energie. Mecanismul de baz este reprezentat de oxido-reducerea biologic (pierderea ionilor de hidrogen sau a electronilor) de ctre o substan chimic (donor) i transportul lor pe molecula unei alte substane numit acceptor (prima se oxideaz, a doua se reduce: AH2 + B <=> A + BH2). n funcie de natura acceptorului final, respiraia poate fi: aerob sau anaerob. Respiraia aerob (oxibiotic) n respiraia aerob, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraia aerob necesit existena membranei celulare. Electronii sunt pasai de la un reductor la un oxidant

36

prin membran cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reductor frecvent utilizat este NADPH-ul. Enzimele catenei respiratorii sunt: - nicotinice (cu coenzima NAD i NADP); - flavinice (cu gruparea proteic FMN sau FAD); - ferice (grupul prostetic conine Fe sub form de derivai ai protohemului, spre exemplu citocromi, citocromoxidaz, peroxidaz etc). NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid). Pentru sinteza ATP-ului se utilizeaz fosforilarea oxidativ (la nivel de catalizator) cuplat cu partea terminal a lanului respirator. Respiraia anaerob (anoxibiotic) n respiraia anaerob acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substan anorganic diferit de oxigen sau de orice substan organic (fermentaia); fosforilarea se face la nivelul substratului. Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezult prin fermentaia zaharidelor i reprezint un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere taxonomic i biochimic. Etapele fermentaiei sunt mai reduse, ctigul energetic fiind mai mic. De exemplu n cazul genului Clostridium, prin fermentaie acetic se obine 1 mol ATP, iar prin fermentaie butiric se obin 0,5 moli ATP. Fermentaia butiric a fost descoperit de Louis Pasteur n anul 1861 (produs de Vibrion butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum). Rolul biologic al fermentaiei este reprezentat de producerea energiei i nu de obinerea unor produi finali. Sinteza ATP-ului Sinteza ATP-ului se realizeaz prin cuplarea reaciilor de oxidoreducere cu reaciile de fosforilare. n respiraia aerob se utilizeaz mai ales fosforilarea oxidativ (la nivel de catalizator) cuplat cu partea terminal a lanului respirator. n respiraia anaerob fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii i acceptorii fiind metabolii anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaia). Energetica respiraiei bacteriene Prin fosforilarea oxidativ se pot obine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoz. Prin fosforilarea substratului se pot obine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoz. Energia este folosit apoi n procese metabolice de asimilaie. Tipul respirator n raport cu utilizarea proceselor pentru obinerea energiei i de relaia cu oxigenul din mediu, bacteriile se pot grupa n 4 tipuri respiratorii principale (vezi i Tabelul nr. 1): - strict aerob, atunci cnd bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvolt numai n prezena unei presiuni crescute a O2, care este folosit ca acceptor final unic. Aceste bacterii posed catalaz, peroxidaz, citocromi (de exemplu catalaza desface H2O2 toxic pentru celula bacterian; vezi Figura nr. 1) i utilizeaz numai procese de respiraie. Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta n medii lipsite de oxigen, dac n mediu sunt prezeni nitratul sau nitritul;

37

- strict anaerob, atunci cnd bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai n absena O2. Nu pot supravieui n prezena O2, care nefiind redus are o aciune bactericid. Nu au catalaz, peroxidaz (care acioneaz asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc pentru obinerea energiei numai procese de fermentaie. Pentru cultivarea lor este necesar utilizarea unui mediu cu potenial redox foarte sczut. - aerob facultativ anaerob, atunci cnd bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc) se dezvolt mai bine n mediile cu oxigen, prin procese de respiraie, dar pot prezenta ambele tipuri respiratorii, n funcie de potenialul redox. Majoritatea au catalaz sau citocromoxidaz, dar nu au peroxidaze flavoproteice. n acest tip se ncadreaz majoritatea bacteriilor studiate. - anaerob microaerofil, atunci cnd bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolereaz mici cantiti de O2. 3. 3. Ci metabolice Metabolismul glucidic Polizaharidele utilizabile de ctre bacterii nu pot ptrunde ca atare n celul. Ele sunt degradate de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindeaz unitile monozaharidice din extremitile lanurilor polizaharidice) i endohidrolaze (care hidrolizeaz unitile interne). Polizaharidele existente n celul ca materiale de rezerv au o degradare diferit, prin fosforoliz, rezultnd hexozo-monofosfai. Principalele ci metabolice (de catabolism) sunt: a). calea hexozo-difosfailor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care n final pentru 1 mol de glucoz se obin 1 mol de acid piruvic i 2 moli ATP; b). calea pentozo-monofosfailor; c). calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas). Metabolismul lipidic Multe bacterii degradeaz trigliceridele prin lipaze exocelulare n glicerol i acizi grai liberi. Activitatea lipazic poate fi cercetat pe medii care conin glicerol-tributirat. Pentru degradarea lipidelor unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posed enzime specifice (lecitinaza D, fosfolipaza C). Prin degradarea fosfolipidelor din membrana hematiilor, fosfolipaza C confer bacteriilor proprietatea de hemoliz. Acizii grai sunt degradai preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii grai reprezint surse de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic genereaz 129 moli de ATP). Bacteriile saprofite au proprieti lipolitice intense, participnd la biodegradarea grsimilor i uleiurilor (mai ales n mediul marin). Metabolismul proteic n lumea bacterian mai rspndii sunt D-aminoacizii. Acetia pot forma diferite polipeptide cu activitate antibiotic (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu capsula bacilului anthraxului. Particip de asemenea i la formarea peretelui celular (de exemplu D-Ala). Cile de degradare sunt reprezentate mai ales de: a). transaminarea i dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au ci proprii de catabolism, utile n identificare); 38

b). decarboxilarea aminoacizilor.

3. 4. Ci biosintetice particulare 3. 4. 1. Formarea structurilor precursorilor biosintetici glutamat, aspartat etc. se realizeaz utiliznd inclusiv structuri chimice care n lumea vie sunt utilizate numai de ctre bacterii, de exemplu acidul diaminopimelic sau acidul dipicolinic. 3. 4. 2. Sinteza peptidoglicanului Sinteza peptidoglicanului se desfoar pe parcursul mai multor etape (vezi Figura nr. 3). ncepe prin sinteza n citoplasm a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM). Aceast structur se ataeaz de bactoprenol (un lipid din membrana celular), dup care urmeaz un lan de reacii biochimice. Legarea ncruciat final se realizeaz printr-o reacie de transpeptidare n care terminaiile amino libere ale pentaglicinei nlocuiesc reziduurile terminale ale D-Ala de la peptidul nvecinat. Reacia este catalizat de transpeptidaze, un set de enzime numite i PBPs (penicillin binding proteins) care au att activitate de transpeptidaze i carboxipeptidaze, dar controleaz i gradul de legare a peptidoglicanului (aspect foarte important n diviziunea celular). La nivelul lor se pot lega penicilinele i alte medicamente beta-lactamice (Figura nr. 4). Aceast cale de biosintez are o importan particular n medicin, oferind i baza aciunii selective a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracin, vancomicin, cicloserin etc). Spre deosebire de celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu fluidele organismului. n interiorul lor presiunea osmotic este foarte mare i viabilitatea lor depinde de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular. Orice compus care inhib o etap n biosinteza peptidoglicanului la o bacterie n cretere va putea produce liza bacterian (efect bactericid). 3. 4. 3. Sinteza LPZ Sinteza este asemntoare cu cea a peptidoglicanului; n ambele situaii, o serie de subuniti se asambleaz pe un lipid transportor la nivelul membranei i apoi sunt transferate n fabrica polimerului n cretere pentru realizarea peretelui celular. Toate componentele LPZ sunt sintetizate i ansamblate la nivelul membranei citoplasmatice. 3. 4. 4. Sinteza capsulei extracelulare Capsula se sintetizeaz enzimatic din subuniti activate. n sinteza capsulei extracelulare (poate avea structur polizaharidic sau peptidic) nu sunt implicate lipide transportoare de provenien membranar. Prezena capsulei este adesea determinat de condiiile de mediu. De exemplu, dextranii se pot sintetiza pornind de la sucroz i acest lucru se va realiza doar dac exist sucroz n mediu. 3. 4. 5. Sinteza substanelor de rezerv Cnd nutrienii sunt n exces, bacteria poate converti o parte din ei n granule de rezerv (vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutin, care difer de la o bacterie la alta. 3. 5. Cultivarea bacteriilor 39

3. 5. 1. Definiii utile Populaia reprezint o multitudine de indivizi ai unei specii care convieuiesc ntr-un anumit biotop. Clona este populaia care rezult dintr-o singur celul prin nmulire vegetativ (diviziune binar). Tulpina reprezint populaia microbian alctuit din descendenii unei singure izolri n cultur pur. Temperatura de dezvoltare n funcie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi: - mezofile, cu temperatura optim de 30-37C; - psichrofile, cu temperatura optim n jur de 20C (unele acceptnd temperaturi apropiate de 0C; Listeria spp. poate supravieui sau se poate chiar i multiplica la temperatura din frigider). Ele sunt adaptate la acest mediu prin numrul mare de acizi grai nesaturai coninui de membrana plasmatic. Gradul de nesaturare al unui acid gras se coreleaz cu timpul de solidificare sau stadiul de tranziie termic (temperatura la care se topete sau se solidific lipidul). Acizii grai nesaturai rmn n faz lichid la temperaturi joase, dar sunt denaturai la temperaturi moderate. Fie c acizii grai din membran se afl n faz lichid sau solid, ei afecteaz fluiditatea membranei, care afecteaz n mod direct capacitatea de a funciona. - termofile, cu temperatura optim de 50-60C (unele putnd s se multiplice i la temperaturi apropiate de 95C, ca de ex. Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt adaptate s reziste la temperaturi de peste 60C printr-o varietate de modaliti. Acizii grai din membrana bacteriilor termofile sunt acizi grai saturai, permind membranelor s rmn stabile i funcionale la temperaturi ridicate. - extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optim de 80C sau mai mare i o temperatur de dezvoltare maxim de 115C. (2) Nu sunt patogene. Bacteriile studiate de microbiologia medical sunt n marea lor majoritate mezofile. 3. 5. 2. Noiuni de cretere i multiplicare bacterian Creterea oricrui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creterea volumului celular raportat la creterea suprafeei este mai mare, n cursul creterii se ajunge la un punct critic. Multiplicarea celular este o consecin a creterii. Se restabilete raportul optim dintre volumul i suprafaa celulei. Multiplicarea majoritii bacteriilor se face prin diviziune simpl (binar). Sporii nu reprezint forme de multiplicare (aa cum se ntmpl n cazul fungilor sau paraziilor). 3. 5. 3. Cultivarea bacteriilor Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecii, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient s obinem mai nti respectivul microorganism n cultur pur, pentru ca ulterior s i putem studia diferitele caractere n vederea identificrii. Metodele de cultivare a bacteriilor urmresc mai multe obiective: obinerea unei populaii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaiile propuse, prevenirea contaminrii produsului cercetat cu un microorganism strin i izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui produs plurimicrobian n culturi monomicrobiene denumite culturi pure. 40

Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrei bacterii. Termenul nsmnare definete operaia de introducere a unei cantitai de germeni ntr-un mediu de cultur artificial, n timp ce pentru culturile celulare, ou embrionate i mai ales animale de experien folosim termenul inoculare. Cultivarea se realizeaz prin nsmnarea bacteriilor pe medii de cultur. Mediile solide sau lichide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare creterii i multiplicrii bacteriene se numesc medii de cultur. Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea ntr-un mediu de cultur poart numele de cultur bacterian. Mediile de cultur Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii i pe medii artificiale. Exist anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi cultivate dect pe gazde vii, aa cum se ntmpl n cazul virusurilor, respectiv: animale de laborator, ou de gin embrionate sau culturi de celule. Majoritatea bacteriilor, fungii i unele protozoare se pot cultiva i pe medii artificiale. Mediile de cultur artificiale trebuie s fie nutritive (s conin factorii de cretere necesari), s fie sterile, s aib un anumit pH (de obicei ntre 7,2-7,6), s aib o anumit presiune osmotic, s aib umiditatea favorabil multiplicrii germenilor etc. Factorii de cretere reprezint substane eseniale pe care microorganismele nu sunt capabile s le sintetizeze din nutrienii de care pot s dispun. Ei sunt necesari n cantitai mici. ndeplinesc anumite roluri n biosintez. Factorii de cretere pot fi grupai n: 1. Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN i ARN); 2. Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor; 3. Vitamine: necesare n calitate de coenzime i grupri funcionale pentru enzime. Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesit factori de cretere. Aceste bacterii pot sintetiza purinele eseniale, pirimidinele, aminoacizii i vitaminele pornind de la o surs de carbon. Alte bacterii necesit purine, pirimidine, vitamine i anumii aminoacizi pentru a crete. Aceti compui trebuie adugai n prealabil n mediile de cultur. Factorii de cretere nu sunt metabolizai direct ci sunt asimilai de ctre bacterii pentru a-i ndeplini rolul n metabolism. Tulpinile mutante care necesit anumii factori de cretere ce nu sunt necesari tulpinii din care au provenit sunt numite auxotrofe. Spre exemplu, o tulpina de E. coli care necesit triptofan pentru dezvortare se va numi auxotrof-triptofan i va fi desemnat E. coli trp- (2). Clasificarea mediilor de cultur artificiale Aceste medii se pot clasifica dup starea de agregare, dup natura ingredientelor, dup complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), dup scopul urmrit (de transport, de izolare, de identificare etc.), dup coninutul n ap, etc. Exist medii de cultur simple (agar, ap peptonat, bulion simplu etc) i medii de cultur mai complexe (agar-snge, bulion glucozat, agar Muller-Hinton etc). (vezi anexa nr. 2) Medii speciale Mediul electiv conine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltrii unei anumite bacterii (de exemplu mediul Lffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric) (Figura nr. 5).

41

Prin coninutul su n substane antimicrobiene, mediul selectiv inhib dezvoltarea altor bacterii dect cea a crei izolare se urmrete. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii n care includem antibiotice (fa de care bacteria care se dorete a fi izolat este rezistent) (Figura nr. 6) Mediul de mbogire favorizeaz nmulirea anumitor bacterii patogene, inhibnd dezvoltarea florei de asociaie dintr-un produs patologic. Funcioneaz concomitent ca mediu selectiv i ca mediu electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de mbogire utilizate pentru izolarea Salmonella typhi). Mediul diferenial conine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate fi sau nu metabolizat, determinnd modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care difereniaz bacteriile lactoz-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoz-negative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoz), TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree). (Figurile nr. 7-10). Colonia izolat Pe medii solide, germenii nsmnai n suprafa produc colonii. Colonia este totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clon bacterian. Coloniile izolate se pot obine de exemplu prin tehnica nsmnrii prin dispersie (cu ansa bacteriologic sau cu tamponul). Dup prelevarea cu ansa a unei poriuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizeaz ansa; se verific temperatura, prin atingerea mediului ntr-o zon nensmnat, ct mai periferic; cu ansa steril se traseaz a doua latur a poligonului; se resterizeaz ansa i se repet procedeul descris pn la realizarea a 4-5 laturi, fr a atinge prima latur. n acest mod, pe ultimele laturi ale poligonului se vor putea observa dup trecerea timpului necesar multiplicrii bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1) Incubarea const n meninerea mediilor de cultur nsmnate, n condiiile necesare pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvolt i duc la apariia unei culturi n circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optim de dezvoltare (asigurat n termostat) pentru c timpul de generaie este de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaie de 12-27 ore i n acest caz cultura devine pozitiv n 2-8 sptmni. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesar incubarea n anaerobioz (ex. n medii la care s-au adugat ingrediente cu activitate reductoare sau n anaerostat); dorim s subliniem c dac transportul nu se face n condiii de anaerobioz, nu vom mai obine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate (Figura nr. 11). Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi Culturile bacteriene sunt discontinue cnd se realizeaz n volum limitat de mediu, care nu este rennoit i continue atunci cnd mediul de cultur este continuu rennoit. O populaie bacterian poate fi meninut indefinit n faza de multiplicare exponenial dac se adaug continuu mediu de cultur proaspt, cu omogenizare prin curent de aer steril i evacuare a unei cantiti corespunztoare de cultur (de exemplu n dispozitivul numit chemostat sau turbidostat). Chemostatul utilizeaz un mediu de cultur n care unul dintre nutrieni, aflat n concentraie mai redus dect ceilali, funcioneaz ca factor limitant al creterii. Mediul de cultur proaspt 42

este admis n vasul de cultur n ritmul n care este consumat factorul limitant, iar cultura este evacuat cu acelai ritm. Cultura este meninut astfel la o valoare constant i submaximal ratei de cretere, reglat prin factorul limitant. Chemostatele sunt foarte utile pentru obinerea de tulpini mutante pentru c dup ce rata de multiplicare a fost determinat ansa de selectare a acestor tulpini este mai mare (Figura nr. 12). n laboratorul de microbiologie clinic, de regul se utilizeaz culturile discontinue. Timpul de generaie Populaia care rezult prin diviziunea unei bacterii crete n progresie geometric cu raia 2. Timpul necesar pentru dublarea populaiei se numete timp de dublare sau timp de generaie. Timpul de generaie n faza exponenial i n condiii optime de cultivare este determinat genetic. De exemplu, pentru E. coli este de circa 20 minute (ca i pentru majoritatea bacteriilor studiate). Pentru Mycobacterium tuberculosis timpul de generaie poate avea o valoare ntre 12-27 ore. Fazele dezvoltrii unei culturi bacteriene Teoretic, dinamica unei populaii bacteriene ar trebui s evolueze exponenial. Dinamica real a populaiei bacteriene n cultur discontinu are ns o evoluie caracterizat printr-o curb la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmic; faza staionar i faza de declin (Figura nr. 13). Faza de lag Numrul bacteriilor nsmnate rmne staionar sau scade; germenii se adapteaz la condiiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, i consum pn la dispariie incluziile, cresc mult n dimensiuni, sintetizeaz enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag dureaz aproximativ 2 ore. Aceast faz este aparent dependent de o varietate de factori incluznd dimensiunea inoculului, timpul necesar pentru a-i reveni din ocul fizic datorat transportului, timpul necesar pentru sinteza coenzimelor eseniale sau a factorilor de diviziune i timpul necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent n mediu. (2) Faza de multiplicare logaritmic (exponenial) Celulele bacteriene prezint caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt ns ceva mai mari), citoplasma este intens bazofil i omogen, lipsit de incluzii. Bacteriile sunt foarte sensibile la antibiotice. Aceast faz este adecvat pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor n vederea preparrii de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenial dureaz aproximativ 2-3 ore. Faza staionar Multiplicarea este realizat n progresie aritmetic, dar pentru c numrul bacteriilor care sunt distruse este aproximativ egal cu numrul bacteriilor nou aprute rata de cretere devine nul. Germenii au morfologia caracteristic speciei; n aceast faz realizm identificarea germenilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene ncepe formarea sporilor. Faza staionar dureaz aproximativ 2-3 zile. Faza de declin Substratul nutritiv srcete, apar metabolii toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc i enzime autolitice, rezervele de hran din incluzii (ex. acidul poli--hidroxi butiric sau glicogenul) se consum, pentru un timp sursa de energie rmne doar ARN-ul celular. Unele 43

bacterii pot persista 2-3 luni. n acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare i se exprim o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru o durat limitat de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogenez devine foarte intens. Aspectul culturilor pe medii solide Condiiile de cultivare i aspectul culturii sunt caractere cheie n identificarea bacteriilor. Aspectul coloniilor variaz ntre diferitele bacterii, fr a permite diferenieri definitive de specie (dar au utilitate n contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene i n contextul general al diagnosticului de laborator, care la rndul su trebuie s aib loc ntr-un context n care punem n balan i alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea ntre medicii de diferite specialiti este esenial). Se examineaz: dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm i mici, sub 1 mm), conturul (circular, lobat, zimat), relieful (plat, bombat, acuminat, papilat), suprafaa (lucioas, granular, rugoas), culoarea (pigmentate, nepigmentate), opacitatea (transparente, opace), consistena, aderena la mediu, prezena sau absena hemolizei (pe medii de tipul geloz-snge). (Figura nr. 14) Colonia S (smooth) are suprafa bombat i neted, margini circulare i adesea aspect strlucitor. Germenii pstreaz structura antigenic i nu aglutineaz spontan cu soluie salin fiziologic. Germenii capsulai i pstreaz capsula. Virulena este conservat. Majoritatea bacteriilor studiate formeaz colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli etc). (Figura nr. 15) Colonia R (rough) este plat, suprafaa ei prezint rugoziti, marginile sunt crenelate. Structura antigenic nu este caracteristic. Nu pstreaz capsula. Virulena nu este conservat (excepii Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae). O bacterie care n mod caracteristic duce la apariia unei colonii de tip S (ex. o enterobacterie), n cazul n care testele de identificare prin reacii antigen-anticorp (ex. aglutinare pe lam, folosind anticorpi cunoscui) nu se efectueaz la timpul potrivit ci mai trziu, prin nbtrnire va suferi anumite modificri, coloniile vor deveni de tip R iar identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibil. (Figura nr. 16) Colonia M (mucoid) este mare, strlucitoare, mucoas. Este dat de exemplu de bacteriile care prezint capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). (Figura nr. 17) Coloniile de Streptococcus pneumoniae pot fi i de tip S i de tip M. n cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obinuite nu vom putea obine colonii izolate (a fost descris fenomenul de invazie). (Figura nr. 18) Cultura se ntinde pe toat suprafaa plcii n strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate fi inhibat prin incorporarea n mediu de acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc. Aspectul culturilor pe medii lichide Bacteriile i fungii facultativ anaerobi se dezvolt n toat masa de lichid, tulburndu-l. Bacteriile strict aerobe se dezvolt preponderent la suprafaa mediului. Ca un aspect particular, n apa peptonat Vibrio cholerae se poate dezvolta i formeaz un vl la suprafaa mediului. n acest caz, pH-ul mediului este 9-9,5. 44

Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbur omogen mediul (majoritatea bacteriilor). (Figura nr. 19) Variantele R realizeaz o tulburare mai puin omogen. Pot lsa mediul limpede, formnd flocoane care se depun sau un strat (vl) la suprafaa mediului (de exemplu bacilul difteric sau bacilul tuberculos). (Figura nr. 20) Alte informaii privind mediile de cultur, diferitele tehnici de cultivare, examinarea culturilor bacteriene i diferitele tehnici de identificare fenotipice utile n diagnosticul microbiologic sunt prezentate n anexa nr. 2. 3. 6. Povestiri adevrate 3.6.1. Penicilina, o mare descoperire ... nscut dintr-o mic neglijen Era prin anul 1928 cnd Alexander Fleming, investignd caracteristicile stafilococilor, a descoperit n mod accidental penicilina printr-o eroare de cultivare. Fleming era deja cunoscut drept un cercettor de excepie prin activitatea deja desfurat, de ex. datorit descoperirii lizozimului (1922); pe de alt parte, omul de tiin demonstra un grad de neglijen n activitatea de laborator. ntors din concediu n septembrie 1928, a gsit cteva dintre plcile cultivate anterior, contaminate cu un fung din genul Penicillium i a decis s le arunce ntr-o soluie de dezinfectat. Puin mai trziu, vrnd s arate unui coleg cteva dintre rezultatele activitii sale, a gsit cteva plci care nu fuseser nc dezinfectate iar de aceast dat a observat o mic zon, la contactul dintre cultura fungic i cultura bacterian, zon n care bacteriile nu s-au dezvoltat. Pornind de la aceast observaie, Fleming a obinut un extract din cultura fungic, cu proprieti bactericide. Pentru c fungul fcea parte din genul Penicillium a denumit acest extras penicilin. A publicat rezultatele acestei descoperiri n anul 1929. Au mai trecut aproape 16 ani, timp n care s-a reuit izolarea i stabilizarea acestui extract, i n anul 1945 s-a nregistrat producerea antibioticului revoluionar numit penicilin. Pentru descoperirea sa, Fleming mpreun cu biochimistul Ernst Chain i farmacologul Howard Florey au fost laureai cu Premiul Nobel pentru Fiziologie i Medicin n anul 1945. 3.6.2. O fost rickettsie rescrie vechile clasificri n 2009, o echip de cercettori i-a oferit Coxiellei burnetii mijloacele de a evada din mediul intracelular. Pn la aceast dat, agentul etiologic al febrei Q era unul dintre exemplele stereotipe de bacterie strict parazit, imposibil de cultivat pe medii artificiale. Nu a fost una dintre acele descoperiri rapide, neateptate, ci a ncununat o munc minuioas de studiere a necesitilor metabolice ale acestor bacterii. Cercetrile au evoluat progresiv: ntro prim etap, a fost obinut un mediu de cultur artificial, care reproducea condiiile de pH acid din interiorul vacuolelor asemntoare lizozomilor, n care Coxiella spp. se multiplic n celulele gazdei. Pe acest mediu, denumit ulterior Complex Coxiella Medium (CCM), Coxiella burnetii i-a putut desfura activitatea metabolic timp de aproximativ 24 de ore. ntr-o a doua etap, cercettorii au reuit s dovedeasc faptul c bacteria este microaerofil. Au adaptat mediul n consecin i l-au numit ACCM (Acidified Citrate Cysteine Medium). Cultivarea Coxiella burnetii pe medii de cultur artificiale ar putea permite studierea factorilor de patogenitate, studierea structurii genetice i poate i realizarea unui model de abordare pentru ali germeni strict intracelulari. (3-4) 45

3. 7. Direcii de cercetare Vom prezenta mai jos cteva dintre direciile de cercetare actual. Cititorul le poate evalua deschiznd urmtoarele link-uri: - Economical Evolution: Microbes Reduce the Synthetic Cost of Extracellular Proteins, http://mbio.asm.org/content/1/3/e00131-10 - The genome sequence of Rickettsia prowazekii and the origin of mitochondria, http://www.nature.com/nature/journal/v396/n6707/full/396133a0.html - Engineering of Lactobacillus jensenii To Secrete RANTES and a CCR5 Antagonist Analogue as Live HIV-1 Blockers, http://www.asm.org/images/Communications/hiv-aac.pdf 3. 8. Evaluarea cunotinelor La urmtoarele ntrebri alegei un singur rspuns corect: 1. Care dintre urmtoarele bacterii este cromopar? A. Staphylococcus aureus B. Staphylococcus epidermidis C. Pseudomonas aeruginosa D. Escherichia coli E. Bacillus anthracis 2. Unul dintre urmtoarele este un microorganism strict aerob: A. Clostridium tetani B. Clostridium botulinum C. Bordetella pertussis D. Escherichia coli E. Staphylococcus aureus 3. Penicilina se leag la nivelul: A. hidrolazelor B. oxidoreductazelor C. izomerazelor D. permeazelor E. transpeptidazelor 4. Se cultiv numai pe gazde vii: A. Staphylococcus aureus B. Chlamydia trachomatis C. Streptococcus pyogenes D. Streptococcus pneumoniae E. Haemophilus influenzae 5. Pe ce mediu se produce modificarea culorii sau aspectului culturii datorit prezenei unui substrat? 46

A. Mediu electiv B. Mediu selectiv C. Mediu diferenial D. Mediu Lffler E. Mediu de mbogire Bibliografie recent 1. Miyamoto-Shinohara Y, Sukenobe J, Imaizumi T, Nakahara T, 2008, Survival of freezedried bacteria, J. Gen. Appl. Microbiol., 54, 9-24 2. Todar Kenneth, 2008, The Growth of Bacterial Populations, Todars Online Textbook of Bacteriology, disponibil pe internet la adresa: http://textbookofbacteriology.net 3. Omsland A, Cockrell DC, Fischer ER, Heinzen RA, 2008, Sustained axenic metabolic activity by the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii, J. Bacteriol., 190, 3203-12 4. Omsland A, Cockrell DC, Howe D et al., 2009, Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 4430-4

47

4. Aciunea factorilor fizici, chimici i biologici asupra bacteriilor (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)
4. 1. Definiii de baz Septic nseamn contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecia unei plgi). Aseptic nseamn lipsit de microbi, indiferent dac microbii sunt patogeni sau nepatogeni. Asepsia reprezint ansamblul de metode prin care evitm contaminarea mediului ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menine sterilitatea esuturilor, mediilor de cultur, medicamentelor injectabile etc. Antisepsia reprezint nlturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente, mucoase sau din plgi. Se realizeaz cu ajutorul substanelor antiseptice, netoxice pentru tegument (ex. alcool etilic 70, tinctur de iod 5%, KMnO4 0,1%, detergeni cationici etc). Contaminare, este un termen utilizat n instituiile sanitare (deosebit de contaminarea radioactiv) care se refer, n general, la contactul cu microorganisme condiionat patogene sau patogene (capabile s produc infecii sauboli infecioase ). Decontaminarea reprezint utilizarea agenilor fizici / chimici pentru a ndeprta, a inactiva sau a distruge unele sau toate microorganismele condiionat patogene sau patogene de pe suprafee sau obiecte, astfel nct acestea s nu mai poat reprezenta o surs de infecie sau de transmitere a infeciei, iar obiectele sau suprafeele s poat fi manipulate i / sau utilizate n siguran. Sanitizarea reprezint totalitatea msurilor pentru asigurarea sntii publice. Prezervarea presupune prevenirea multiplicrii unor microorganisme n produse farmaceutice, vaccinuri, alimente etc. Curarea reprezint utilizarea agenilor fizici i / sau chimici pentru a ndeprta murdria (materie organic i anorganic) de pe suprafee (inclusiv tegument) sau obiecte, prin procedee mecanice sau manuale, pregtind astfel suprafeele sau obiectele pentru utilizare n siguran sau, pentru trecerea la o alt etap de decontaminare. Detergentul este un produs sintetic pentru curare. Detergenii pot fi anionici, cationici, amfoterici i neionici. Nu prezint aciune antimicrobian. Detergentul enzimatic este un produs sintetic pentru curare care conine o enzim. Echipamentul de protecie este un echipament special (mbrcminte, mnui, ochelari etc) purtat de personalul care manipuleaz produse dezinfectante i realizeaz dezinfecia. Enzima este o protein care descompune murdria ntr-o form care poate fi uor ndeprtat de produsul de curare. Are rol de catalizator pentru reacie, mrind puterea de curare a produsului. De exemplu: amilaza acioneaz asupra urmelor de amidon; lipaza acioneaz asupra urmelor de grsimi i uleiuri; proteaza acioneaz asupra materiei proteice.

48

Produsul de curare este un agent chimic care ndeprteaz murdria (materie organic i/sau anorganic) de pe suprafee sau obiecte, dar nu prezint activitate antimicrobian (bactericid, virucid, fungicid sau sporicid) i care nu reduce nivelul de contaminare microbian. Splarea minilor este procedura prin care se elimin murdria i se reduce flora tranzitorie prin aciune mecanic, utiliznd ap i spun (Figura nr. 1, Film nr. 1). Factori care influeneaz eficacitatea metodelor de control: - mrimea populaiei bacteriene; - timpul de expunere la agentul decontaminant (creterea timpului de expunere crete rata distrugerii); - efectul concentraiei, a temperaturii i a pH-ului (o concentraie mai mare crete rata distrugerii); - stabilitatea agentului; - structura microorganismului etc. Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori i a sporilor) din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafee. Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici sau cu ajutorul substanelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative asupra esuturilor gazdei). mpiedic rspndirea bolilor infecioase. Dezinfecia igienic a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune direct asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fr a aciona asupra florei rezidente. Dezinfecia chirurgical a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune direct asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia i cu aciune asupra florei rezidente. Produsul pentru dezinfecie de nivel sczut este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate i virusurile mari necapsulate. Produsul pentru dezinfecie de nivel intermediar este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate i mycobacteriile. Produsul pentru dezinfecie de nivel nalt este un agent chimic care, n condiii bine definite de timp i temperatur, distruge microorganismele, are aciune sporicid i reprezint un potenial sterilizant chimic (Figura nr. 2). Sterilizantul chimic este un agent chimic (nu n form gazoas), utilizat pentru sterilizarea dispozitivelor medicale critice, care nu se pot steriliza prin metode fizice. Un sterilizant chimic distruge toate categoriile i formele viabile de microorganisme, nivelul de supravieuire al acestora fiind mai mic sau egal cu 10-6 (probabilitatea prezenei unui singur microorganism viu pe un dispozitiv medical sterilizat este egal sau mai mic cu 1/1.000.000). Termenul de valabilitate reprezint perioada de timp n care un produs dezinfectant este eficient, din punct de vedere al concentraiei substanei active i eficacitii antimicrobiene. Timpul de contact (timp de aciune) reprezint perioada de timp n care produsul dezinfectant este n contact direct cu suprafaa sau obiectul care trebuie dezinfectat. Perioada de timp n care produsul antiseptic este n contact direct cu esuturile vii. Sterilizarea reprezint distrugerea sau ndeprtarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafa sau dintr-un mediu (lichid sau 49

solid). Toate materialele utilizate n laboratorul de microbiologie trebuie s fie sterile nainte de utilizare. Exist o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel nct i metodele de sterilizare sunt destul de variate, dup cum urmeaz: - Metode de sterilizare prin cldur (cldura uscat sau cldura umed); - Metode de sterilizare prin filtrare; - Metode de sterilizare utiliznd radiaiile, dar i - Metode chimice de sterilizare. Metodele de sterilizare care utilizeaz radiaiile (cu excepia radiaiilor ultraviolete) i metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilen) sunt utilizate rareori n laboratorul de microbiologie. Sterilizarea va fi ntotdeauna precedat de pregtirea materialului care urmeaz s fie sterilizat, respectiv: splare, uscare, ambalare (n cazul materialelor curate, necontaminate) urmat de autoclavare, splare, uscare, ambalare (n cazul materialelor contaminate refolosibile). Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc. trebuie curate perfect, de ex. prin splare cu ajutorul unor detergeni. Dac aceste materiale au fost contaminate cu snge, nainte de splare se vor dezinfecta. Sticlria de laborator este colectat n recipiente speciale i se sterilizeaz prin autoclavare; pipetele vor fi meninute n amestec dezinfectant pn a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile i acele (dei este necesar utilizarea pe scar larg a seringilor i acelor de unic ntrebuinare) contaminate se vor introduce n baie de amoniac 1-2% timp de 15-30 minute, se vor peria n soluie de 1-2% detergent cationic i se vor spla cu jet de ap pentru ndeprtarea substanelor chimice (Figura nr. 3). Instrumentele de unic utilizare sunt, n general, destinate chirurgiei moderne. Pot fi izolate (aparate de sutur mecanic toracic, abdominal, vascular etc) sau pot fi furnizate n seturi de instrumente de unic utilizare. Sterilizarea acestor instrumente se face industrial prin iradiere cu raze gamma sau etilenoxid. Utilizarea instrumentelor de unic utilizare (disposable) confer un plus de siguran, n pofida unui pre relativ ridicat. Exist o serie de metode pentru a controla eficiena sterilizrii, prin indicatorii fizici (ex. termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verificarea eficacitii sterilizrii cu ajutorul radiaiilor, pot fi utilizai spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus) (Figura nr. 4).

4. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici se pot traduce n principiu prin: distrugerea microorganismelor (efect bactericid) i respectiv inhibarea reversibil a multiplicrii microorganismelor (efect bacteriostatic). 4. 2. 1. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici 4. 2. 1. 1. Influena temperaturii ridicate asupra microorganismelor n funcie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi: mezofile (temperatur optim 30-37C), psichrofile (temperatur optim n jur de 20C) i termofile (temperatur optim 50-60C). 50

Prin aciunea cldurii procesele chimice i fizice sunt mult accelerate; distrugerea se produce dup atingerea temperaturii de 50-60C prin ruperea legturilor intramoleculare, mai ales a punilor de hidrogen care menin proteinele i alte macromolecule n stare nativ. Ca urmare protoplasma se denatureaz. Celulele bogate n ap sunt mult mai sensibile la aciunea cldurii dect microorganismele care conin puin ap sau sunt liofilizate. Apa din compoziia microorganismelor absoarbe cldura proporional cu volumul su. Sterilizarea prin cldura are loc n dou variante principale: prin cldur uscat i umed. Sterilizarea prin cldur: a). Sterilizarea prin cldur uscat are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene. Amintim cteva dintre variantele tehnice: a1. Sterilizarea prin nclzire la incandescen (la rou) reprezint introducerea i meninerea n flacra becului Bunsen pn la nroire, pe toat lungimea, a obiectului care urmeaz a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologic (cu bucl sau fir) sau pentru spatul (Figura nr. 5, Film nr. 2). Flambarea reprezint trecerea prin flacr (de cteva ori) a unui obiect, fr a se atinge temperatura de incandescen. Flambarea se aplic pentru portans, gtul unui recipient de sticl (tub, eprubet, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur i nu reprezint sterilizare. a2. Sterilizarea cu aer cald se realizeaz n etuv (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr. 6). Etuva este o cutie metalic cu perei dubli. Cu ajutorul unor rezistene electrice i a unui termostat se obine i menine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii n interiorul aparatului este realizat cu ajutorul unui sistem de ventilaie (Schema nr. 1). Pentru majoritatea materialelor care urmeaz a fi sterilizate, temperatura din etuv trebuie s ating 180C, pentru o durat de 1 or sau 160C pentru o durat de 2 ore. Pot exista i alte variante, de exemplu n funcie de dimensiunea obiectelor de sterilizat. Sterilizarea cu aer cald este indicat pentru obiecte de sticl, obiecte de porelan, pulberi inerte i termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menionat faptul c repetarea sterilizrii, n timp, conduce la declirea oelului) etc. Nu se vor steriliza n etuv soluiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vat, bumbac, fibr sintetic, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator. a3. Incinerarea reprezint arderea pn la obinerea de cenu (Figura nr. 7). Exist anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. n cazul spitalelor, n Romnia au existat astfel de incineratoare n structura unitii sanitare respective. Odat cu procesul de aderare la Uniunea European i respectiv necesitatea aplicrii unor reguli impuse pentru toate rile membre, majoritatea incineratoarelor de spital au fost nchise. Modul n care s-a realizat n perioada 2003-2004 negocierea privind stoparea activitii acestor incineratoare nu a inut cont de situaia real din ara noastr. n lipsa unui incinerator propriu, unitatea sanitar trebuie s ncheie un contract de prestri servicii cu o firm de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerrii materiale de unic folosin din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experien etc. 51

b). Sterilizarea prin cldur umed este cea mai eficient metod de sterilizare i are ca mecanism coagularea proteinelor i degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite substane n soluie, sticlrie (cu excepia pipetelor i lamelor), instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultur, aparate de filtrat etc. b1. Autoclavarea este esenial att pentru laboratoarele de microbiologie ct i pentru unitile sanitare n general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de ap realizeaz la 0,5 atmosfere o temperatur de 115C, la 1 atmosfer o temperatur de 121C i respectiv 134C la 2 atmosfere. Autoclavul are ca pies principal un cazan cu perei metalici, care se nchide etan cu un capac prevzut cu un sistem special de nchidere i n interiorul cruia, vaporii de ap sunt comprimai la presiunea necesar n vederea sterilizrii (Schema nr. 2). Exist mai multe tipuri de autoclave: - autoclave cu perete simplu verticale orizontale - autoclave cu manta de aburi verticale orizontale. n continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la care vaporii provin din apa aflat n cazanul de presiune i ajung n camera de sterilizare de jos n sus (Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este nregistrat de un manometru. Pentru punerea n funciune a autoclavului, n dotare exist 2 robinete: unul superior (robinetul de aer i vapori, care permite legtura ntre cazan i mediul exterior) i unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele exist o supap de siguran care se deschide i permite evacuarea vaporilor atunci cnd, accidental, presiunea vaporilor depete limita de siguran. n momentul de fa pentru evitarea riscului de a veni n contact cu vapori de ap fierbini aflai sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului pn cnd presiunea din interior nu o egalizeaz pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus ntr-un perete exterior solid care la partea inferioar are un spaiu n care se afl sursa de cldur. n partea inferioar a cazanului de presiune se afl un suport pe care se aeaz o plac de metal perforat (Figura nr. 9). Pe suport se aeaz materialele care trebuie sterilizate iar faptul c placa este perforat permite trecerea vaporilor de ap produi dup nclzirea apei. n vederea sterilizrii se procedeaz astfel: verificm nivelul apei din partea inferioar a cazanului, care trebuie s fie pn la o distan de 2-3 centimetri de suport; dac nivelul a sczut, se completeaz (recomandabil se va utiliza ap distilat); aezm pe suport obiectele i materialele de sterilizat, ambalate corespunztor; nchidem etan capacul, folosind sistemul special de etaneizare cu care este dotat autoclavul pe care l avem la dispoziie; conectm sursa de cldur;

52

 deschidem robinetul pentru evacuarea aerului i vaporilor (dac rmne aer n cazanul cu presiune eficiena sterilizrii va scdea considerabil; vaporii de ap fiind mai uori, vor nclzi n special partea superioar a cazanului n timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rmne n partea inferioar a cazanului) ; nchidem robinetul dup evacuarea aerului i apariia unui jet continuu de vapori; presiunea din cazan ncepe s creasc i este urmrit cu ajutorul manometrului; atunci cnd presiunea atinge valoarea dorit (de ex. 1 atmosfer), reglm sursa de cldur n aa fel nct aceast presiune s fie meninut pentru toat durata sterilizrii (de ex. 30 minute) ; dup trecerea celor 30 minute ntrerupem sursa de cldur i lsm autoclavul s se rceasc pn cnd presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice; deschidem lent robinetul de vapori; deschidem sistemul de etaneizare i capacul autoclavului; lsm obiectele i materialele s se rceasc n autoclavul deschis; atunci cnd temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele sterilizate. b2. Tindalizarea (sterilizarea fracionat) este o metod de sterilizare prin cldur umed care evit depirea unei temperaturi de 100C. Substanele de sterilizat se menin la 56-100C timp de 30-60 minute, 3 pn la 8 zile succesiv. Astfel, utiliznd medii care permit germinarea, dup prima nclzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar dup rcire are loc germinarea sporilor. n ziua urmtoare sunt distruse prin nclzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar dup rcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat n prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va menine permanent deschis robinetul de vapori (i astfel nu se va depi n interior temperatura de 100C), bi de ap sau bi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultur etc. b3-4. Pasteurizarea i fierberea nu reprezint metode de sterilizare, dar sunt utilizate n anumite situaii. Pasteurizarea folosete cldura umed i are aplicaii n conservarea pentru scurt durat a unor alimente (lapte, bere etc). Exist o pasteurizare joas (30 minute la 56-65C), o pasteurizare medie (15 minute la 65-75C) i o pasteurizare nalt (2-5 minute la 85-90C). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile n form vegetativ dar nu i sporii. Fierberea poate fi utilizat atunci cnd nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare, iar mecanismul de aciune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30 minute la 100oC, distruge bacteriile n form vegetativ, fungii i virusurile, dar nu i sporii bacterieni. Timpul se nregistreaz dup ce apa a nceput s fiarb. Eficiena acestei metode poate fi crescut prin adugarea de carbonat de sodiu 1-2%. 4. 2. 1. 2. Influena temperaturii sczute asupra microorganismelor Temperaturile joase (n jur de 0-4C) au n general un efect bacteriostatic. La temperaturi sczute, reaciile biochimice ncetinesc, multiplicarea poate fi stopat. Majoritatea produselor biologice/patologice pot fi transportate (meninnd viabilitatea germenilor i ncetinind n acelai timp multiplicarea acestora) la o temperatur de circa 4C. O serie de culturi pot fi de

53

asemenea meninute la temperatura frigiderului pentru o durat limitat de timp n vederea prezervrii i posibilitii de a repeta anumite teste de identificare etc. n funcie de viteza cu care are loc rcirea, ntlnim situaii diferite, cu urmtoarele posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene. a). Congelarea lent, la temperaturi mai mici -21,3C are efecte bactericide prin formarea de cristale de ghea i prin hiperconcentrarea salin cu denaturarea proteinelor; b). Congelarea brusc la -70C are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea n mas a apei fr apariia cristalelor de ghea; c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezint congelarea brusc concomitent cu desicaia (deshidratarea n vid). O suspensie microbian n mediu protector, liofilizat, poate fi pstrat n fiole nchise timp ndelungat (de exemplu vaccinul BCG). 4. 2. 1. 3. Filtrarea Microorganismele pot fi reinute mecanic i electrostatic n porii unui filtru. Trecerea unui lichid printr-o substan prevzut cu pori care va reine microorganismele din lichidul respectiv poart numele de sterilizare prin filtrare. De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porelan, sticl poroas, azbest impregnat cu caolin, pmnt de infuzori) (Figura nr. 10). Actualmente se folosesc din ce n ce mai frecvent membrane filtrante din acetat de celuloz cu poroziti ntre 8 i 0,025 mm (Figura nr. 11). n vederea filtrrii sunt necesare o serie de piese precum: un recipient n care se introduce lichidul care urmeaz a fi filtrat, un recipient n care se va colecta lichidul sterilizat, o plnie care se monteaz etan ntre cele 2 recipiente, o pomp de vid care va aspira lichidul din primul n al doilea recipient, prin membrana filtrant. Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare nainte de nceperea filtrrii. Exist i alte variante tehnice. Cu o importan practic particular ar fi de menionat filtrele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguran biologic (clasa II i clasa III), filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters) (Figura nr. 12). Sterilizarea prin filtrare este utilizat pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultur (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse n cazul sterilizrii prin cldur etc. 4. 2. 1. 4. Radiaiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide prin ruperea legturilor de hidrogen, oxidarea legturilor duble etc. Radiaiile UV sunt utile n sterilizarea suprafeelor de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultur, alte manevre aseptice etc) n cazul n care nu exist cabinete de siguran biologic cu flux laminar dar i atunci cnd avem la dispoziie astfel de cabinete de siguran biologic i dorim s sterilizm incinta n care am prelucrat spre ex. produse n care exist Mycobacterium tuberculosis. Lmpile cu UV sunt numite lmpi germicide. Astfel de lmpi sunt plasate de ex. i n instituiile sanitare n care sunt internai pacieni cu tuberculoz (Figura nr. 13). Radiaiile ionizante se pot utiliza n sterilizri industriale (pentru alimente, medicamente, seringi de unic ntrebuinare etc). 4. 2. 1. 5. Ultrasunetele au efecte bactericide prin aciune mecanic, micare activ a coninutului celular, formare n mediul extern de bule mici de gaze dizolvate care se mic energic i se izbesc de membran (fenomenul de cavitaie) i creterea temperaturii la 50-80C. Sporii rezist acestor efecte. 54

4. 2. 1. 6. Presiunea osmotic Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) n medii hipertone are efecte letale asupra unor bacterii. n medii hipotone are loc acumularea de ap n celula bacterian; aceasta devine turgescent i peretele bacterian cedeaz.

4. 2. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor chimici Exist o serie de substane chimice necesare creterii i multiplicrii bacteriene. Alte substane chimice (antibioticele i chimioterapicele) au efect bactericid sau bacteriostatic selectiv. Antisepticele i dezinfectantele sunt substane cu aciune antimicrobian neselectiv, alterndstructuri i funcii comune microorganismelor i organismelor superioare. Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente i mucoase. Dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafee i structuri care nu sunt vii. O parte dintre dezinfectante au efect sterilizant. Aa cum am menionat anterior, trebuie s existe o etap de pregtire a materialelor n vederea sterilizrii. Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc, trebuie curate perfect, de ex. prin splare cu ajutorul unor detergeni. Dac aceste materiale au fost contaminate cu snge, nainte de splare se vor dezinfecta. Substanele antiseptice i dezinfectante se pot clasifica n funcie de mecanismul de aciune, dup cum urmeaz: a). Substane care denatureaz proteinele (au n general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii i derivaii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor). b). Substane care oxideaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de potasiu, KMnO7 1, util n antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, H2O2, soluie 3% n ap, utilizat n antiseptizarea plgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) i derivaii lor (hipoclorii, cloramine, soluii iodurate etc. Exist i diferite clase de compui halogenai cu poten mai mare, cum ar fi cei care au n componena lor radicalul benzil -C6H5. Indiferent de substana folosit este necesar realizarea concentraiei corespunztoare. c). Substane care blocheaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele [srurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ), srurile de argint, compui de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide], gruprile alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O) etc. d). Substane care lezeaz membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizri limitate datorit proprietilor caustice i toxicitii sale; este etalonul fa de care se msoar activitatea antimicrobian a antisepticelor i dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc], detergenii [anionici (spunuri, perlan etc),

55

cationici (sruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)]. e). Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet de genian, albastru de metilen, fucsin bazic etc), derivaii de acridin, de exemplu rivanolul. Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70, diferii derivai halogenai, hipermanganatul de potasiu 1, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substane antiseptice. Dorim s menionm i s subliniem c att n cazul antisepticelor ct i n cazul dezinfectantelor este important ca substana utilizat s aib concentraia corespunztoare, s fie aplicat pentru o durat de timp corespunztoare, s se afle n termenul de garanie. Aceeai substan chimic (de ex. cloramina) poate intra n categoria antisepticelor sau n categoria dezinfectantelor, n funcie de concentraie (concentraia este mai mare n al doilea caz). n continuare vom prezenta pe scurt cteva exemple de substane dezinfectante. Dorim s menionm faptul c, pn n prezent, nu exist nici un dezinfectant ideal. Exist numeroase substane i numeroi productori de antiseptice i dezinfectante. Hipocloriii: soluiile de hipoclorit se prepar periodic (se inactiveaz dup mai mult de 24 ore), concentraia n clor activ este diferit n funcie de scopul urmrit (ex. 2.500 ppm clor activ pentru dezinfectarea pipetelor contaminate); au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, sporilor bacterieni, fungilor (100 ppm n o or), virusurilor (200 ppm n 10 minute); efectul este diminuat considerabil n prezena substanelor organice (n special proteine), maselor plastice, detergenilor. Derivaii fenolici: din cauza toxicitii, potenialului carcinogenetic i corozivitii, fenolii nu se folosesc ca atare, ci sub forma derivailor fenolici; soluiile fenolice se prepar periodic (dup cel mult 24 ore); concentraia poate fi diferit n funcie de scopul urmrit (de obicei este de 2-5%); au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, fungilor, unor virusuri (ex. HIV este inactivat de soluia 0,5%); efectul este diminuat pe suprafeele de cauciuc, lemn sau material plastic. Glutaraldehida: cel mai frecvent este utilizat concentraia de 2%, la un pH alcalin; are efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ (n cazul mycobacteriilor este necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor; datorit faptului c nu corodeaz metalele (aa cum se ntmpl n cazul substanelor prezentate mai sus) se poate folosi i la dezinfectarea suprafeelor metalice;

56

nu poate fi folosit pentru suprafee, datorit vaporilor iritani i timpului mare de expunere; ideal pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai mare de timp n containere meninute nchise. Iodoforii: sunt substane care complexeaz iodul pe care l elibereaz n soluii apoase; au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu nveli lipidic); sunt inactivai de substane organice (n special proteice), mase plastice, detergeni; pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor, dezinfecia pipetelor contaminate. Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O): exercit activiti bactericide prin alkilarea acizilor nucleici i prin nlocuirea hidrogenului labil printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH); sporii de Bacillus subtilis nu sunt distrui; acest tip de sterilizare se utilizeaz pentru materiale care nu rezist atunci cnd sunt supuse aciunii temperaturii sau radiaiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc.); fiind o substan exploziv, etilenoxidul este utilizat n camere speciale n care se menine o presiune negativ, iar pentru a preveni o explozie dioxidul de carbon poate fi combinat cu aceast substan n ncperi de oel speciale; o alt variant de protecie ar fi combinarea cu hidrocarburi fluorinate. indiferent de varianta folosit trebuie respectate toate recomandrile productorului; exist o serie de inconveniente n ceea ce privete acest tip de sterilizare (pot s apar efecte carcinogenetice i afectarea sistemului nervos etc., dar e posibil afectarea ntregului organism); sterilizarea este n principiu influenat de: concentraia etilenoxidului, temperatur, umiditatea relativ i timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraiei va reduce la jumtate timpul necesar pentru sterilizare).

4. 2. 3. Produsele biocide Directiva 98/8/CE definete produsele biocide dup cum urmeaz: Substane active i preparatele coninnd una sau mai multe substane active, condiionate ntr-o form n care sunt furnizate utilizatorului, avnd scopul s distrug, s mpiedice, s fac inofensiv i s previn aciunea, sau s exercite un alt efect de control asupra oricrui organism duntor, prin mijloace chimice sau biologice (vezi directiva CE). Din categoria produselor biocide sunt excluse produsele de curenie, detergenii sub form de pulbere sau lichid i alte produse similare, ce nu sunt destinate a avea efect biocid. 57

Produsele biocide includ: produsele utilizate pentru dezinfecia suprafeelor mari inerte, a aerului, a echipamentului medical, a mobilierului, sau pentru dezinfecia i curarea acestora; produsele pentru dezinfecia / sterilizarea instrumentarului, endoscoapelor, .a., prin imersie; produsele dezinfectante / antiseptice pentru tegumente, spunurile dezinfectante, spunurile antiseptice, spunurile antibacteriene / antimicrobiene, gelurile de curare antibacteriene / antimicrobiene, soluiile de curare antibacteriene / antimicrobiene (dup cum sunt denumite de productor); produsele dezinfectante/antiseptice pentru mucoase, ex. pentru igiena oral, .a.; erveele umede dezinfectante, detergenii i produsele de curare care au activitate biocid dovedit (distrug sau inhib multiplicarea bacteriilor, fungilor sau a altor microorganisme). n aceast categorie ar putea intra i substanele sintetizate de Bacillus thuringiensis din genul Bacillus, cu efect biopesticid. 4. 2. 4. Efectele antimicrobiene ale factorilor biologici 4. 2. 4. 1. Interrelaiile microbiene n cadrul nielor ecologice proprii n natur microorganismele nu se dezvolt izolat. Relaiile pot fi de comensualism, simbioz sau antagonism, noiuni care vor fi prezentate ulterior. n cadrul relaiilor de antagonism, acesta se poate datora vitalitii mai mari a speciilor antagoniste sau elaborrii de ctre specia antagonist a unor substane nocive pentru speciile concurente. Aceste substane pot avea (ex. antibioticele i bacteriocinele) sau nu (ex. acidifierea mediului) aciune selectiv. 4. 2. 4. 2. Bacteriofagul Bacteriofagii sunt virusuri care paraziteaz bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7 cu specificitate pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperii n 1915. Prof. Mihai Ciuc obine n anul 1921 primele tulpini lizogene. n 1949 se nfiineaz n Romnia un Centru naional pentru bacteriofagi. Fagii au o structur mai complex dect cea a virusurilor obinuite. Se descriu (Figura nr. 14): 1. capul fagului are form de prism hexagonal bipiramidal. Conine ADN dublu catenar helicoidal sau ARN nconjurat de capsida format din capsomere (nveli proteic); fagii ARN pot avea un numr mic de gene (ex. 3) n timp ce fagii ADN pot avea pn la 150 gene; 2. coada fagului are structur proteic, simetrie helicoidal; are rol de adsorbie, ajutnd fagul s penetreze bacteria. Se descriu urmtoarele formaiuni: - cilindrul axial; - teaca cozii; - placa bazal (cu croetele de fixare); - fibrele cozii (formnd un strat n jurul tecii cozii).

58

Toate proteinele fagice pot conduce la apariia de anticorpi, descoperire utilizat n studierea nrudirii dintre diferii bacteriofagi. Relaii bacteriofag-bacterie ntre bacteriofag i bacteria gazd se pot stabili dou tipuri de relaii: - de tip litic sau productiv (Figura nr. 15); - de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16). Relaiile sunt strict specifice i sunt mediate de receptori. Ciclul litic are mai multe etape i anume: 1. Adsorbia: Ataarea este specific. Exist receptori strict specifici la nivelul bacteriofagului, ce recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este iniial reversibil (prin fibrele cozii), apoi ireversibil (prin croetele plcii bazale). Adsorbia fagic modific permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene. 2. Penetrarea: Fagul elibereaz muramidaza care lizeaz mureina din peretele bacterian. Teaca cozii se contract i antreneaz cilindrul axial prin peretele bacterian, ducnd apoi la injectarea ADN-ului fagic n citoplasma bacterian; 3. Multiplicarea: Dup aproximativ 4-5 minute, funcia ADN-ului bacterian este blocat i preluat de ADN-ul fagic ce coordoneaz sinteza componentelor proprii. Se sintetizeaz un numr nsemnat de proteine virale. 4. Maturarea (ansamblarea) fagului 5. Liza bacteriei (ex. datorit sintezei unor enzime asemntoare lizozimului) i eliberarea bacteriofagului matur, virulent. Bacteriile lizosensibile permit adsorbia, penetrarea i multiplicarea fagilor viruleni pn la realizarea lizei celulei bacteriene. Evidenierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene n mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunztor duce dup cteva zeci de minute (uneori chiar i cteva zile) la limpezirea mediului; pe mediu solid, nsmnat uniform, inocularea fagului litic duce la apariia unei zone de liz, clar, bine circumscris (spotul de bacteriofagie), metod utilizat n lizotipie; dac se amestec o suspensie de fagi cu o pictur de cultur (pur) bacterian, iar tulpina respectiv are receptori potrivii bacteriofagilor i aceast suspensie se amestec cu geloz nclzit putem transfera suspensia ntr-o plac Petri; bacteriofagii infecteaz bacteriile; dup circa 30 minute bacteriile sunt lizate i elibereaz fagii; acetia difuzeaz prin geloz i infecteaz bacteriile situate n apropiere i ciclul se reia; o parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potrivii) nu sunt infectate i n timp se multiplic iar cultura bacterian opacizeaz mediul; dup circa 18-24 de ore putem observa arii cu celule lizate (transparente) pe un fond produs de cultura bacterian (bacterii nelizate), aceste 59

arii numindu-se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii viruleni sunt clare, n comparaie cu plajele mai puin clare produse de bacteriofagii temperai (fagii viruleni sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua dect n ciclul litic) Ciclul reductiv (de lizogenizare) are aceleai etape, iniial. Dup adsorbie i penetrare, ADN-ul fagic: fie se integreaz liniar n cromozomul bacteriei gazd i se replic sincron cu aceasta, fie se circularizeaz i ataat de membrana citoplasmatic se replic sincron cu diviziunea bacteriei. Bacteria a devenit lizogen, se reproduce i transmite descendenilor fagul latent (profag, fag temperat). n anumite condiii profagul poate deveni fag virulent. Fagul temperat cel mai bine studiat este bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat (K12). Proprietile bacteriei lizogene: 1. este imun fa de un fag omolog profagului; 2. pot aprea fenomene importante din punct de vedere genetic: transducia; conversia genetic (cu producerea de exotoxine de ctre unele bacterii lizogenizate, cum ar fi toxina difteric, toxina scarlatinoas, toxina botulinic de tip C etc); recombinarea genetic (atunci cnd o bacterie parazitat de doi fagi diferii, dar nrudii, elibereaz la sfritul ciclului litic pe lng tipurile parentale i tipuri de fagi care nsumeaz unele din proprietile celor doi fagi parentali) etc.; inducia fagic (sub influena unor ageni inductori, de ex. raze UV, sau spontan, profagul i rectig virulena, devine fag virulent, i produce liza bacteriei respective). Bacteriile lizorezistente nu permit infecia cu un fag fie datorit lipsei receptorilor specifici, fie datorit unei stri de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii viruleni omologi profagului gzduit. Fagul defectiv reprezint profagul care persist indefinit n stare latent (nu se reactiveaz). Aplicaii practice ale fenomenului de bacteriofagie: fagii viruleni sunt un element de echilibru ecologic n mediul natural de via al bacteriilor (n nia ecologic respectiv); fagii temperai pot avea un rol deosebit n reasortarea materialului genetic al bacteriilor, ntruct atunci cnd se detaeaz (inducie) de cromozomul bacterian pot antrena poriuni din ADN-ul bacterian; fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorit specificitii relaiei fag-bacterie); anumite mutante ale fagilor se folosesc n ingineria genetic drept vectori ai ADN recombinant (ex. fagii Charon Lambda); fagii reprezint un model pentru studii teoretice i practice privind virusurile i oncogeneza, precum i alte aspecte ale biologiei moleculare; s-au evideniat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic i antigenic par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilitii la un anumit tip fagic) este una dintre cele mai fine

60

metode de diagnostic bacteriologic i epidemiologic, pentru identificarea lanurilor de transmisie a germenilor i pentru determinarea originii unei epidemii. 4. 3. Povestiri adevrate 4. 3. 1. Epidemia de holer din Peru - Legend urban n 1991, n Peru, a izbucnit o epidemie de holer. Boala nu este foarte frecvent pe continentul american, motiv pentru care iniial a fost dificil stabilirea cauzelor. Situaia a aprut oarecum n paralel cu o dezbatere public ce avea loc n SUA cu privire la raportul risc / beneficii adus de clorinarea apei. Dintre istoriile adevrate aceasta ca i istoria epidemiei de difterie n fostele state sovietice arat ct de mult poate fi influenat sntatea public de ctre dezbateri, de ctre mass-media etc (de multe ori n mod negativ). Este cunoscut faptul c prin clorinarea apei, pe lng efectul de distrugere a unor microorganisme ar putea s apar i fenomene nedorite, datorit apariiei unor produi de tipul trihalometanului. n USA se discut foarte mult despre efectul cancerigen al acestei substane. Diveri oficiali americani, avnd se pare relaii n industria chimic, i care doreau ca metoda clorinrii s rmn cea mai important metod de antiseptizare a apei, au folosit mult vreme exemplul acestei epidemii pentru a demonstra ce se poate petrece dac clorinarea apei va fi stopat. Pornind de la date reale (epidemia de holer) dezbaterile au ajuns s prezinte o situaie foarte diferit (numeric) ajungndu-se s se discute de 1,3 milioane de cazuri de holer soldate cu peste 11.000 de decese. n aceste dezbateri s-a afirmat c pentru a preveni apariia unui numr foarte mic de cancere (ipotetice) s-a precipitat apariia unui numr extrem de mare de cazuri de holer i respectiv a unui enorm numr de decese datorate infeciei cu Vibrio cholerae. A fost criticat i aa-zisa Teorie a precauiei, principial corect, bazat pe urmtoarele idei generice: a. stabilete un el n cadrul unui proces decizional deschis, care s se adreseze tuturor celor implicai; b. analizeaz toate modalitile de a realiza ceea ce i propui i alege varianta care va conduce la cele mai puine efecte nedorite; c. dac nu eti sigur de calea pe care vrei s o urmezi, asigur-te c o alegi pe aceea care creeaz cele mai mici probleme mediului, sntii publice, comunitii n general; d. monitorizeaz rezultatele i asigur-te c iei msuri rapide de remediere, n cazul n care ar aprea o problem i e. consult-te n permanen cu cei asupra crora vor avea un efect msurile pe care le-ai stabilit. Totui, nu aplicarea greit a teoriei a fost cea care a provocat epidemia de holer. n final, reprezentani oficiali din Peru au afirmat c au decis s aplice clorinarea intermitent i nu continuu din motive economice (pre prea mare pentru clorinarea continu) i nu au fost influenai de teoria precauiei; nu au luat n calcul riscul apariiei cancerului. Investigaia epidemiologic realizat mpreun cu colegii de la CDC a demonstrat c epidemia de holer a avut o cauzalitate multipl, factorii cei mai importani fiind reprezentai de: a. clorinarea intermitent a apei; b. diferite branamente ilegale sau amatoristic fcute la linia de aprovizionare cu ap a oraului; c. conectarea instalaiilor ilegale de irigaie la liniile de aprovizionare cu ap potabil; d. perioade lungi n care apa a avut o presiune sczut sau nu a existat presiune deloc, situaii n care colonizarea i multiplicarea bacterian este favorizat; e. depozitarea apei potabile n butoaie, n condiii neigienice sau la limit i f. lipsa unor

61

canalizri construite corespunztor, care au permis refularea apei din zonele poluate n reeaua de ap potabil etc. Cu toate c la baza acestei epidemii au stat mai muli factori, cel mai important dintre acetia a fost lipsa clorinrii (antiseptizrii) corespunztoare a apei potabile. Datele reale cu privire la aceast epidemie sunt prezentate succint la punctul 44. 8. 2. 4. 3. 2. Epidemia de holer din Dhaka - bacteriofagii Holera se transmite cel mai frecvent prin consumul de ap contaminat cu tulpini de Vibrio cholerae, n special n zonele cu educaie sanitar precar. Datele epidemiologice i de mediu obinute n urma unei izbucnirii epidemice (outbreak) de holer n Bangladesh, au sugerat rolul bacteriofagului litic specific pentru V. cholerae, care ar putea limita gradul de severitate al epidemiei prin efectul de distrugere a bacteriilor prezente n sursele de ap contaminat, sau chiar i n cazul unor persoane infectate. Au fost emise dou ipoteze privind rolul potenial al bacteriofagilor specifici: a. n cadrul relaiei bacterie-bacteriofag, bacteriofagii lizeaz un numr mare de bacterii, ulterior densitatea bacteriofagilor scade i la un moment dat bacteriile se pot multiplica exponenial i densitatea bacterian atinge nivelul la care pot determina o izbucnire epidemic (severitatea izbucnirii epidemice va fi cu att mai mare cu ct densitatea bacteriofagilor rmai n sursele de ap contaminate este mai mic); b. dac izbucnirea epidemic este datorat multiplicrii bacteriene, necorelat cu diminuarea densitii fagice, introducerea bacteriofagilor n sursele de ap ar putea reduce amploarea izbucnirii epidemice i ar putea duce chiar i la declinul acesteia. n ambele situaii amploarea efectului bacteriofagilor depinde de balana care se stabilete ntre rata de multiplicare a vibrionilor i de rata de distrugere a fagilor. n timpul izbucnirii epidemice din Dhaka, Bangladesh, au fost cuantificate: a. incidena infeciilor, b. densitile tulpinilor de V. cholerae implicate (serotipul O1, rezistent la streptomicin) i c. concentraiile bacteriofagilor litici specifici pentru aceast tulpin (JSF4), att n scaunul pacienilor spitalizai ct i n rezervoarele de ap potabil. Studiul a fost posibil pentru c implica o singur tulpin, a crei densitate a putut fi uor monitorizat prin susceptibilitatea/rezistena la streptomicin. Pe baza observaiilor n dinamic, studiul a sugerat c infeciile sunt cauzate de consumul de ap dintr-un rezervor comun, n care bacteria i fagul se reproduc i interacioneaz independent de populaia uman. Iniial, schimbrile temporare climaterice au creat condiiile unei descreteri a concentraiei fagice, cu o multiplicare exponenial a vibrionilor n sursele de ap. Populaia a nceput s se infecteze consumnd apa respectiv, s-a creat un cerc vicios de multiplicare bacterian n rezervor prin recontaminarea rezervorului datorit igienei precare i astfel epidemia s-a amplificat. Dup un timp producia de fagi a nceput s creasc, datorit concentraiei mari de vibrioni din rezervor i n persoanele infectate. Amplificarea densitii fagice a dus la un declin al densitii bacteriene i respectiv la scderea numrului de persoane infectate, pn la dispariia cazurilor. Studiul (a fost realizat i un model matematic foarte interesant) a sugerat i posibilitatea ca fagul s se dezvolte iniial n gazdele infectate cu V. cholerae, i abia apoi s ajung n rezervor (datorit lipsei de igien). Aceast amplificare (numeric i funcional) a bacteriofagilor ar putea reprezenta o important component n prevenirea / controlul epidemiilor de holer. 62

5. Genetica bacterian (Gabriela Loredana Popa)

5. 1. Suportul ereditii Genetica bacterian studiaz ereditatea i variabilitatea la bacterii. Suportul material al ereditii este reprezentat de ADN (acidul dezoxiribonucleic). Molecula de ADN conine codificat informaia ereditar, care se exprim prin sinteza unor proteine i se transmite prin replicare i diviziune la descendeni. Gena reprezint unitatea funcional a ereditii iar noiunea de gen este cunoscut nc din anul 1909. Dac nu au loc modificri genetice, toi descendenii unei bacterii vor fi identici cu bacteria mam i identici ntre ei. O celul bacterian inoculat pe un mediu de cultur (avnd la dispoziie nutrienii necesari) va produce prin multiplicare n condiii prielnice (de pH, temperatur, umiditate etc.) o colonie bacterian, o clon. Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin incorporarea unui fragment de material genetic exogen (prin procesul de recombinare genetic), fie prin apariia spontan sau indus a unei mutaii care poate consta n adugarea, pierderea, substituirea sau inversarea ordinii unor baze n secvena ADN-ului. Structura acidului dezoxiribonucleic ADN-ul este un macropolimer de dezoxirbonucleotide. Unitatea structural este format dintr-o baz azotat purinic (adenina, A; guanina, G) sau pirimidinic (timina, T; citozina, C), o pentoz (dezoxiriboza) i acid fosforic. Legturi fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboz cu carbonul 3 al moleculei adiacente, formnd o caten lung polinucleotidic. Prin analiza compoziiei n baze azotate a ADNului (provenit din surse diferite) s-a demonstrat c exist o anumit compoziie care difer la diversele specii. Compoziia de nucleotide a ADN-ului este surprinztor de variabil. Suma procentual a citozinei i guaninei variaz la bacterii de la 22% pn la 74%, n timp ce la organismele eucariote intervalul este ceva mai restrns (28 - 58%). La om variaz ntre 39-40% n funcie de tipul de esut (timus 39%; ficat 39,4%). Acest fapt se explic prin evoluia n decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ cu a eucariotelor n general i a omului n particular. Comparaiile coninutului de C+G ale diferitelor organisme i microorganisme au fost folosite drept fundament n vederea stabilirii relaionrii/legturii genetice. Timina fiind susceptibil la alterri fotochimice (lumin UV), bacteriile cu un coninut bogat de C+G este posibil s fi evoluat n medii supuse unei lumini solare foarte puternice sau unor temperaturi nalte, iar cele cu coninut redus de C+G s-ar fi dezvoltat n locuri mai protejate. Aadar, compoziia n baze azotate, numit i procentul de C+G, este diferit n funcie de specie, dar se pstreaz constant n cadrul unei anumite specii. Procentul de C+G se calculeaz dup formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest raport difer la diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium perfringens, 40% la Streptococcus pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris, 51,7% la Escherichia coli, 53% la Proteus

63

morgani i67% la Pseudomonas aeruginosa. Aa cum a fost precizat de ctre diveri autori, compoziia de baze azotate este un index taxonomic. (1) La celulele procariote ADN-ul este inelar, mpachetat n nucleoidul din citoplasm. La bacteria intestinal E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alctuiesc o macromolecul de 1,4 milimetri lungime, dar numai 2 nanometri lime. Aceasta conine 4.400 de gene deja secveniate. n ciuda lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este extrem de bine nfurat n nucleoid, n aproximativ jumtate din diametrul celular. ADN-ul apare ca o macromolecul format din dou catene polinucleotidice antiparalele i complementare rsucite n dublu helix. Cele dou catene sunt unite prin puni de hidrogen formate ntre bazele azotate opuse (A=T i GC). Modelul structural al ADN-ului a fost propus de ctre Watson i Crick n anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea mai important proprietate a acizilor nucleici i condiioneaz toate proprietile ADN-ului, mai ales cea de autoreplicare i cea de transfer al informaiei genetice. Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experiene succesive, iniial prin cercetrile lui W. Griffith (1928) privind fenomenul de transformare bacterian, ulterior prin experiene care au confirmat rezultatele obinute de Griffith, dar abia n 1944 Avery, MacLeod i Mc Carthy demonstreaz faptul c ADN-ul este substratul chimic al ereditii i reprezint materialul genetic al oricrei celule (funcie ndeplinit aa cum tim astzi de ARN, la ribovirusuri). La temperatura camerei ADN-ul este o structur stabil n condiii fiziologice normale, datorit legturilor intercatenare (2 ntre A i T i 3 ntre C i G). Dac temperatura depete 65C, stabilitatea punilor de hidrogen ncepe s cedeze, dublul helix ncepe s se desfac i rezult dou catene complementare (proces numit denaturare termic). Denaturarea devine complet la temperaturi care depesc valoarea de 90C. Renaturarea (reannealing) reprezint refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar prin acest proces se poate stabili relaia filogenetic ntre dou specii (n funcie de procentul de renaturare). De exemplu dac se utilizeaz ADN denaturat provenit de la E. coli i ADN denaturat provenit de la Salmonella spp., fiecare marcat cu acelai izotop (ex. C14), fraciunea de ADN marcat i evaluat prin diferite tehnici va fi fraciunea din ADN care este complementar pentru cele dou specii (aceste experiene au stat la baza brevetrii tehnicilor de hibridare molecular). Renaturarea este un proces mai lent dect denaturarea. Denaturarea i renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite fie n tehnologia ADN-ului recombinant, fie n studierea relaiilor filogenetice ntre diferite specii. Cu ct speciile sunt mai nrudite, cu att secvenele de baze azotate au un mai mare grad de similitudine (lanurile lor monocatenare renatureaz mai rapid). Genom. Genotip. Fenotip Genomul reprezint suma genelor unui organism. Totalitatea informaiei genetice a unui organism se numete genotip. Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip n interaciune cu mediul ambiant se numete fenotip. Funciile ADN-ului ca material genetic sunt: - conservarea informaiei genetice; 64

- replicarea; - transcrierea i traducerea materialului genetic; - protejarea materialului genetic propriu (self); - reglarea i controlul activitii celulare. Transmiterea mesajului genetic la bacteriile descendente Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantitii de material genetic urmat de diviziune. Replicarea ADN const n sinteza unor noi molecule de ADN, identice cu molecula parental i identice ntre ele, pe baz de complementaritate (replicare semiconservativ). Dup ruperea legturilor de hidrogen i separarea celor 2 catene, fiecare caten servete drept matri pentru sinteza unei noi catene. Replicarea ADN este una dintre cele mai importante reacii din lumea vie. Watson i Crick au fost primii care au propus modelul semiconservativ de replicare a ADN. n celula care se dezvolt rapid, exist posibilitatea ca nainte de terminarea primei replicri s se iniieze nc o replicare. n acest caz celula bacterian va putea fi merodiploid (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori dect n mod normal) sau chiar poliploid (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori dect n mod normal). n general, dac replicarea cromozomial nu este succedat de diviunea celulei (aa cum se ntmpl n mod obinuit), putem remarca n celula bacterian existena cromozomilor supranumerari. Cromozomii suplimentari (n total 2 sau 4) nu aduc o informaie genetic diferit, pentru c ei reprezint copii ale cromozomului iniial (deci sunt identici cu acesta). Repliconul (Jacob, Brenner, Cuzin) In vivo se pot replica numai moleculele de ADN constituite ntr-o unitate de replicare independent numit replicon. Indiferent dac celula are mai muli cromozomi (celula eucariot este diploid) sau un singur cromozom (celula procariot), tot genomul trebuie s fie replicat. Repliconul bacterian este bicatenar i circular, caracterizat prin: - o secven nucleotidic specific marcnd nceperea replicrii; - gene care codific sinteza unor proteine specifice numite iniiatori; - o secven nucleotidic semnal pentru terminarea replicrii. Exemple de repliconi: - cromozomul i plasmidele bacteriene; - genomul bacteriofagilor. Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de repliconi. O gen structural din cromozom are toat informaia necesar sintezei iniiatorului replicrii (o protein complex). Dup ce replicarea a nceput, nu mai poate fi oprit pn n momentul cnd se ajunge la dedublarea cromozomului. Cromozomul bacterian funcioneaz ca un replicon, fapt dovedit de experiena n care fragmentele de ADN introduse ntr-o celul bacterian (de ex. prin conjugare) nu se pot replica dac rmn libere n citoplasm, dar vor putea fi replicate odat cu ntregul cromozom n cazul n care sunt integrate n cromozomul bacterian. 65

Replicarea corect este controlat de un mecanism foarte precis care identific apariia de nucleotide libere, mperecheate eronat i n momentul apariiei unui astfel de eveniment nucleotidul este tiat iar polimerizarea se oprete (corectitudinea citirii este realizat cu ajutorul ADN-polimerazei I). 5. 2. Hibridizarea acizilor nucleici Reacia de hibridizare a acizilor nucleici se poate realiza datorit complementaritii nucleotidelor (structura primar). Prin aceast tehnic se poate demonstra nrudirea sau eventual identitatea a dou microorganisme, pe baza gradului (procentului) de omologie a secvenelor nucleotidice. Din punct de vedere tehnic, cultivm o bacterie de referin (cunoscut) n aa fel nct s putem marca ADN-ul cromozomial (ns uneori aceste experiene se fac prin marcarea ADN-ului plasmidic). Spre exemplu, o variant poate fi reprezentat de cultivarea n mediu cu timidin tritiat, astfel nct rezult marcarea radioactiv a ADN-ului cu tritiu. ADN-ul extras din fiecare microorganism este tratat pentru a obine fragmente monocatenare. ADN-ul dublu catenar se reface, dac fragmentele de ADN (int) ale bacteriei testate au secvene nucleotidice complementare cu fragmentele ADN (sond molecular) de referin. Cu ct gradul de complementaritate dintre sonda molecular i int este mai mare, cu att structura hibrid format va fi mai stabil i mai greu de disociat. Actualmente sondele moleculare sunt sintetizate chimic sau enzimatic. Utilitatea hibridizrii acizilor nucleici Aceast tehnic se utilizeaz n taxonomia microbian i st la baza funcionrii sondelor nucleotidice, care depisteaz rapid i cu foarte mare sensibilitate microorganisme sau numai unii determinani genetici ai acestora. Un alt aspect important este reprezentat de specificitatea sondei utilizate. Se apreciaz, c pentru a elimina riscul unei hibridizri ntmpltoare, sonda nucleotidic ar trebui s aib cel puin 20 nucleotide.

5. 3. Amplificarea genetic conceptul amplificrii cantitii de acizi nucleici a fost introdus n 1983 de ctre Mullis, dar anul 1955, odat cu descoperirea ADN polimerazei I, a reprezentat un moment crucial. Folosind ADN-polimeraza i dou secvene scurte de ADN (oligonucleotide, primeri), s-a pus la punct un test repetitiv de sintetizare a ADN-ului care a fost numit Reacia de polimerizare n lan (Polymerase Chain Reaction, PCR). ADN-polimeraza este capabil s conduc la sinteza unui al doilea lan de ADN, ntotdeauna orientat 5-3, folosind ca substrat patru nucleotide trifosfat, un lan de ADN ca matrice (model) i un fragment scurt de ADN complementar utilizat drept primer (amors). Pentru un lan polinucleotidic, vom utiliza de fapt doi primeri, care sunt complementari pentru dou secvene specifice i diferite ale ADN-ului int. Iniierea sintezei de ADN va putea avea loc numai dup ce ADN-ul dublu catenar este denaturat (termic). Urmeaz o etap de rcire, permind astfel ataarea primerilor (care sunt furnizai n exces) de fragmentele de ADN complementar. Sinteza de ADN mediat de ADN-polimeraz va produce dou molecule dublu catenare. Dac procesul se repet, vor rezulta patru molecule de 66

ADN. ADN-ul se multiplic exponenial (dublndu-se de fiecare dat) ori de cte ori se repet reacia. Teoretic, PCR poate amplifica un fragment scurt de ADN pornind de la o singur molecul la 1.000 de copii, dac procesul se repet de 10 ori i la circa un milion de copii, dac procesul se repet de 20 de ori. Acest proces poate avea loc automat ntr-un aparat numit termociclor; aparatul repet ciclul constnd n denaturarea prin cldur (la 94-96C), ataarea primerilor (la 40-60C) i sinteza ADN-ului (la 65-75C), folosind ADN-polimeraza termostabil (Taq-polimeraza) izolat de la o bacterie, care triete n izvoarele termale din Yellowstone National Park, Thermus aquaticus. Aplicaiile tehnicii de amplificare genetic PCR a nceput s fie aplicat n numeroase domenii ale cercetrii medicale fundamentale. Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum i de metoda de extragere i de recuperare a ADN-ului. Datorit sensibilitii extrem de mari a procesului, contaminarea datorat manipulrii produselor de amplificare PCR obinute anterior n acelai laborator poate reprezenta o problem deosebit de serioas. Contaminarea se poate realiza fie ntre probe, n timpul desfurrii protocolului de lucru, fie datorit diferitelor manipulri. Prima variant este mai uor de evitat, astfel nct sursa major de contaminare n laboratorul de biologie molecular rmne eventuala contaminare a reactivilor. Verificarea acestei posibile erori este obligatorie pentru orice reacie PCR, printr-o reacie de control (control negativ) la care nu se adaug ADN. Aceast problem a contaminrii nu este superpozabil cu cea a rezultatelor fals pozitive. O contaminare ntre probe este mult mai dificil de identificat. Principalele msuri de precauie ar fi reprezentate de: utilizarea unor camere de lucru separate pentru manipularea produselor care conin ADN i respectiv pentru prepararea celorlali reactivi, folosirea micropipetelor (dou seturi de micropipete, pentru produse cu i fr ADN), utilizarea conurilor cu filtru, lucrul ntr-o ni special amenajat i dotat cu hot cu flux laminar de aer. Recent s-a demonstrat faptul c lumina ultraviolet are capacitatea de a inactiva ADN-ul dublu catenar contaminant. Alte modaliti de a elimina (diminua) riscurile contaminrii sunt reprezentate de: includerea unei nucleotide modificate n PCR (nlocuirea deoxiuridinei-P cu deoxitimidin-3P) i respectiv folosirea enzimelor de restricie pentru ndeprtarea ADN-ului contaminat din RT-PCR (transcriere invers). Utilizarea PCR n diagnosticul bolilor infecioase PCR poate fi util n diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau parazitare. n infecia cu HIV, PCR i-a dovedit utilitatea att n diagnostic (secvenele HIV-1 sunt detectabile n 100% din cazuri atunci cnd virusul este cultivabil i n 64% din cazuri n situaia unor culturi negative), ct i n stabilirea prognosticului. n cazul infeciilor cu citomegalovirus (CMV), PCR poate detecta ADN viral n snge cu 7-10 zile mai devreme dect sunt identificate antigenemia sau viremia. n mod asemntor, PCR este util n identificarea altor ageni etiologici (n contextul general epidemiologic, clinic i paraclinic) precum virusurile hepatitei B i C, virusurilor papilloma, herpes virusurilor sau a unor enterovirusuri. Diagnosticul infeciilor bacteriene poate beneficia de asemenea de tehnicile moleculare prin amplificare genic. Actualmente sunt puse la punct protocoalele de lucru utile identificrii 67

agenilor etiologici ai tusei convulsive (Bordetella pertussis), legionellozei (Legionella pneumophila), pneumoniei atipice (Mycoplasma pneumoniae), tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis), proceselor inflamatorii pelviene (Chlamydia trachomatis), gonoreei (Neisseria gonorrhoeae), sifilisului (Treponema pallidum), meningitei (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis), gastritelor i ulcerului (Helicobacter pylori), febrei tifoide (Salmonella typhi), dizenteriei bacteriene (Shigella dysenteriae), septicemiei cu E. coli (enterotoxigen), bolii Lyme (Borrelia burgdorferi), leprei (Mycobacterium leprae) etc. Dac n cazul majoritii bolilor enumerate exist alternative bacteriologice sau imunologice clasice decisive, atunci cnd sunt implicate microorganismele aparinnd genului mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae) se ridic anumite probleme. n tuberculoz, agentul etiologic se izoleaz relativ dificil din produsele patologice, se multiplic lent, coloniile vizibile aprnd pe mediile de cultur dup 2-8 sptmni, iar testele necesare identificrii fenotipice clasice necesit 2 -6 sptmni suplimentare i nu au relevan n 100% din cazuri. Pe de alt parte, Mycobacterium leprae nu se multiplic pe nici un tip de mediu de cultur. Cu alte cuvinte, aplicarea unor metode sensibile i specifice este foarte necesar. Sunt puse la punct protocoalele de lucru PCR utile n scopul diagnosticrii infeciilor grave produse de Candida albicans, pneumoniei la pacieni imunodeprimai (Pneumocystis carinii), meningitei cu Cryptococcus neoformans sau al unor infecii cu Coccidioides immitis (ex. la persoane infectate cu HIV), pentru a enumera cteva din aplicaiile biologiei moleculare n domeniul afeciunilor produse de fungi. n domeniul parazitologiei, exemplele cele mai bine cunoscute sunt legate de diagnosticul dizenteriei amoebiene (Entamoeba histolytica), altor diarei de origine parazitar (de exemplu, cele produse de Giardia lamblia), malariei (Plasmodium falciparum) sau diagnosticul toxoplasmozei (Toxoplasma gondii). Actualmente s-au pus la punct i alte metode de amplificare genetic utile n diagnosticul sau n identificarea agenilor etiologici ai maladiilor transmisibile. n mod suplimentar dorim s menionm faptul c dac iniial tehnicile de baz ale biologiei moleculare (hibridizarea molecular, utilizarea sondelor nucleotidice marcate radioactiv sau neradioactiv, amplificarea genic) erau utilizate individual, majoritatea protocoalelor de lucru actuale cuprind combinaii de tehnici, din ce n ce mai complexe i mai subtile. Pe de o parte, exist i o ntreg serie de variante tehnice ale reaciei de amplificare genic, de ex. Invers-PCR (pentru amplificarea unei regiuni la care nu este cunoscut secvena, dar zonele nvecinate au secvene cunoscute); LCR (ligase chain reaction) n care este necesar s cunoatem integral secvena ADN-ului int; RTPCR (PCR nainte de care are loc o revers-transcriere, pornind de ex. de la ARNm i obinnd ADNc); Nested PCR (n care are loc o amplificare dubl a acidului nucleic folosind 2 perechi de primeri diferii) etc. Pe de alt parte, tehnica PCR este utilizat din ce n ce mai frecvent ca o completare esenial a unei alte tehnici (de exemplu RFLP, restriction fragment length polymorphism; SSCP-PCR; DRE-PCR, double repetitive element PCR; DRV-PCR, direct variable repeat-PCR; UP-PCR, single universal primer-PCR; spoligotyping etc). 5. 4. Organizarea genomului bacterian Plasmidele Genomul bacterian este alctuit din dou categorii de determinani genetici: 68

1. genele eseniale, localizate n structura cromozomului bacterian i 2. genele accesorii extracromozomale prezente n structura: - plasmidelor i - elementelor genetice transpozabile. Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de replicare fizic independent de cromozom (replicon), dar depinznd de factori codificai de nucleul bacterian. Conin informaie genetic neesenial pentru viaa celulei bacteriene. Sunt transmise stabil de-a lungul generaiilor. Dimensiunea plasmidelor variaz ntre 1kb i circa 200 kb. Majoritatea sunt alctuite din molecule de ADN circular, dar exist i plasmide liniare (ex. la Borrelia burgdorferi). Unele plasmide sunt ADN dublu catenar, dar exist i plasmide de ADN monocatenar (se consider c plasmidele de ADN monocatenar reprezint de fapt o situaie intermediar n cursul procesului de replicare; au fost detectate de ex. la Staphylococcus aureus). Unele plasmide (numite i epizomi) pot exista alternativ n stare autonom (libere n citoplasm) sau integrate n cromozomul celulei gazd (de exemplu factorul F, bacteriofagul temperat etc). Celelalte plasmide persist indefinit numai n stare autonom (de exemplu plasmida R, Col, F etc). Clasificarea plasmidelor n raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica n: 1. plasmide care codific rezistena la ageni antibacterieni: - factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpin de Shigella dysenteriae); - plasmidele de rezisten la UV etc. 2. plasmide care codific sinteza unor ageni antimicrobieni: - factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine cu activitate antibiotic) etc. 3. plasmide de patogenitate care codific sinteza de: - hemolizine; - factori de colonizare; - enterotoxine sau alte exotoxine etc. 4. plasmide care codific enzime ale unor ci metabolice particulare: - n anumite condiii, unele bacterii pot utiliza ca surs de C diferite substane cu potenial toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care permit supravieuirea i dezvoltarea n aceste condiii se numesc plasmide degradative; 5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celul care deine respectivul plasmid (F) la alta, putnd fi transmis inclusiv plasmidul (factorul) F; 6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice exprimate. Plasmidele R

69

Plasmidele R (de rezisten la antibiotice) confer celulei purttoare rezistena la unul sau la mai multe antibiotice. Plasmidele R au o structur genetic complex, fiind alctuite din: - gene care asigur proprietatea de rezisten la antibiotice; - gene care formeaz factorul de transfer al rezistenei (RTF). Asigur capacitatea de replicare autonom i de transfer prin conjugare (cele dou tipuri de elemente pot exista independent sau se pot asocia). Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacterian sau prin transducia mediat de bacteriofagi. Plasmidele Col Plasmidele Col codific proprietatea unor bacterii de a elabora substane antibiotice de tip special, numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc). Plasmidele Col sunt transferabile de la tulpinile Col+ la tulpini Col- prin transformare genetic, transducie fagic sau prin conjugare. Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (fa de specia omolog), iar biosinteza lor nu are efect letal pentru specia productoare. Factorul F (factorul de sex, factorul de fertilitate) Factorul F controleaz capacitatea unor bacterii de a aciona ca donoare de material genetic n procesul de conjugare. Factorul F codific structurile (de exemplu pilul F) i enzimele necesare transferului de ADN. n funcie de prezena plasmidelor F, de raportul lor cu cromozomul bacterian i de modul n care faciliteaz transferul de material genetic, bacteriile se pot grupa n patru categorii distincte: bacterii F-; bacterii F+; bacterii Hfr; bacterii F. Bacteriile FBacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule femele care se comport ca receptoare de material genetic. Bacteriile F+ Bacteriile F+ dein factorul F autonom n citoplasm. Sunt echivalente unor celule masculine, donoare de material genetic, capabile s transmit factorul F. Bacteriile Hfr (High frequency of recombination) Bacteriile Hfr (cu mare frecven de recombinare) dein factorul F integrat n cromozomul bacterian. Se comport ca donoare de material genetic, au o mare frecven de conjugare i recombinare. De obicei prezena factorului F integrat determin transferul unui numr variabil de gene cromozomale i mai rar, chiar transferul factorului F. Bacteriile F Bacteriile F dein o structur plasmidic de tip special (factor de fertilitate recombinant) care a fost anterior integrat n structura unui cromozom i s-a desprins din acesta, ncorpornd n structura sa unele gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de mascul i se comport ca donoare de material genetic (factorul F).

70

Elemente genetice transpozabile O anumit secven specific de ADN constituie un element genetic transpozabil dac i menine integritatea fizic, structural i genetic, funcional n cursul translocaiei de la o poziie la alta n acelai genom, replicon (intramolecular) sau n genomuri diferite (intermolecular). De obicei fenomenul de transpoziie poate avea loc la nivelul oricrui replicon, la ntmplare, dar exist i situaii n care un transpozon are anumite zone specifice unde se va insera (zone calde). Pe baza complexitii lor, elementele care ndeplinesc aceast condiie se pot grupa n trei categorii: - secvene de inserie (IS); - transpozoni (Tn); - bacteriofagi. Secvenele de inserie (IS) Secvenele de inserie nu conin nici o gen i nu au nici o alt funcie (cunoscut) n afar de cea de inserie. Sunt cele mai simple elemente transpozabile. Dup inseria lor pot aprea modificri n expresia unor gene sau modificri n rata incidenei deleiilor n regiunile adiacente situsului lor de inserie. Exist anumite secvene de inserie care au intrat n istoria practic medical datorit importanei n diagnosticul anumitor afeciuni. De ex. IS6110 se ntlnete n una sau mai multe copii n genomul Mycobacterium tuberculosis i poate fi pus n eviden prin reacia PCR pornind fie de la cultur, fie chiar i de la produsul patologic, permind un diagnostic mai rapid. Transpozonii (Tn) Transpozonii difer de secvenele de inserie prin complexitate i prin faptul c poart gene care confer bacteriilor funcii noi, detectabile, de exemplu: - rezistena la antibiotice; - capacitatea de sintez a unor enzime; - producerea de enterotoxine; - sinteza antigenelor bacteriene de suprafa (de exemplu K88 la E. coli); - sinteza unor factori de colonizare intestinal etc. Exist transpozoni compui, care pe lng funcia de transpoziie includ i o serie de determinani genetici i transpozoni compleci. Dintre acetia din urm, transpozonul Tn3 a fost identificat la o tulpin de E. coli. El codific 3 elemente: tnpA- cu activitate de transpozaz, rezolvaza tnpR i beta-lactamaza (produsul genic notat bla) cu activitate beta-lactamazic. Bacteriofagii Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezult prin prescurtarea mutator, pentru c a fost identificat ca factor mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kb i o structur linear. Dup infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se inser n cromozom la ntmplare i ulterior n diferite poziii ale cromozomului bacterian apar copii ale acidului nucleic Mu. Atunci cnd structura genetic Mu va prsi genomul bacterian va prelua o parte din structura genetic bacterian (circa 100-150 pb).

71

5. 5. Mecanismele de variabilitate bacterian Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepiile prezentate anterior), au un singur cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesar transferarea de material genetic de la o tulpin (donoare) la tulpina receptor (acceptoare). n mod clasic poate avea loc un transfer pe orizontal ntre tulpini care fie fac parte din aceeai specie fie fac parte din specii foarte nrudite, chiar dac genotipic sunt diferite. Relativ recent a fost demonstrat posibilitatea unor schimburi genetice ntre tulpini din specii diferite (ex. n ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacterian presupune modificarea la un moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenilor ei i pot exista n principiu dou variante: - variabilitatea fenotipic i - variabilitatea genotipic; Variaiile fenotipice reprezint modificri morfologice sau fiziologice de tip adaptativ, care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat. Variaiile genotipice reprezint modificri definitive ale materialului genetic (cromozomial sau extracromozomial) care se transmit descendenilor. Mecanismele variaiei genotipice sunt reprezentate de: - mutaie; - transfer genetic urmat de recombinare genetic. Mutaia Mutaia reprezint o modificare accidental n secvena nucleotidic a unei gene, ducnd la modificri ale mesajului genetic. Mutaiile pot aprea la nivelul materialului genetic prin: - substituii; - inversii; - inserii; - deleii. Mutaia spontan Mutaiile care apar n condiii de mediu obinuite i fr intervenia unui factor decelabil se numesc mutaii spontane. Mutaia indus Mutaiile care se produc sub aciunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaii ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenii alchilani), care acioneaz ca ageni mutageni, se numesc mutaii induse. Rata mutaiilor induse este semnificativ mai mare dect rata mutaiilor spontane. Mutaia punctiform are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur codon. 72

Mutaiile extinse reprezint alterri care depesc limitele unui codon, putnd afecta secvene mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaie poligenic). Mutaiile regresive (retromutaii) afecteaz celule mutante, determinnd revenirea acestora la tipul iniial, restabilind secvena nucleotidic originar. Mutaiile supresoare permit exprimarea funciei anterioare a genei, dei o modificare a secvenei bazelor nucleotidice persist. Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o bacterie receptor sunt: - transformarea; - transferul mediat de bacteriofagi (transducia); - conjugarea. Transformarea Transformarea este un transfer genetic realizat atunci cnd bacteria accept ADN liber provenit de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie s fie competent n a accepta ADN-ul de la bacteria donor. Prima transformare a fost descris n 1928 de ctre Griffith, n experimente referitoare la virulena pneumococilor fa de oarecele alb. Transformarea poate avea loc doar atunci cnd bacteriile intr n faza staionar a ciclului celular. Ptruns n celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate nlocui (prin recombinare genetic) o secven nucleotidic omolog, bacteria receptoare dobndind un caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice). Unele bacterii sunt competente n mod natural. n cazul bacteriilor care nu sunt natural competente, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesar tratarea chimic a acestora, de ex. cu ioni de calciu. Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin: - transducie; - conversie lizogenic. Transducia reprezint transferul unui fragment genetic (cromozomial sau extracromozomial) de la o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un fag temperat). Fagul se numete transductor. Bacteria receptoare se numete transductant. Transducia specializat (restrictiv) este caracteristic fagilor transductori care au proprietatea de a transfera numai un numr restrns de gene bacteriene situate n imediata apropiere a situsului de legare a profagului n cromozomul bacterian. Transducia generalizat (nerestrictiv) presupune c teoretic, oricare din genele cromozomului bacterian, indiferent de poziia lor n genom, pot fi ncorporate n mod accidental n particula viral matur pentru a forma un fag transductor, care le poate transmite unor bacterii

73

receptoare. Transducia generalizat poate fi realizat de un mare numr de fagi neintegrai n cromozomul bacterian atunci cnd acetia intr n ciclul litic. Conversia lizogenic reprezint apariia unui caracter nou la bacteriile care gzduiesc un profag, de exemplu producerea toxinei difterice este realizat numai de ctre C. diphtheriae purttor al fagului temperat (profagul care deine gena tox) iar producerea toxinei scarlatinoase este posibil numai n cazul n care Streptococcus pyogenes de grup A este lizogenizat. Exist i fagi care sunt integrai n regiuni care codific un anumit produs din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integreaz ntr-o gen care codific leucina). Conjugarea bacterian reprezint un proces de transfer de material genetic (cromozomial sau extracromozomial) realizat prin intermediul unei legturi intercelulare directe. Este condiionat de prezena factorului F n celula donoare. Receptorii specifici Pentru realizarea legturii intercelulare este necesar existena unor receptori de suprafa att la celula donoare, ct i la celula receptoare. Acetia vor permite recunoaterea reciproc. Fiziologia conjugrii bacteriene Dup un numr de alipiri ntmpltoare, bacteriile F+ formeaz cu bacteriile F- perechi de recombinare i ntre celulele alturate se formeaz un canal de conjugare. Prin canalul de conjugare se realizeaz transferul unidirecional al materialului genetic. Fragmentul transferat poate fi apoi integrat parial sau total n genomul celulei receptoare, ducnd la apariia unor proprieti noi ale acesteia, manifeste sau nu.

5. 6. Povestire adevrat Folosirea cunotinelor din domeniul geneticii, n munca de detectiv mbinarea examinrii foarte detaliate a secvenelor genomice microbiene cu o cunoatere aprofundat a evoluiei bacteriilor poate fi util att n obinerea unor diagnostice de mare precizie, ct i n aplicarea unor teste de diagnostic relevante n medicina legal. Spre exemplu, dorim s amintim situaia creat n 2001 n urma atentatelor teroriste din SUA, cnd o serie de instituii, dar i persoane particulare, au primit plicuri avnd un praf alb sau maroniu, care n unele cazuri (au existat i alarme false) s-a dovedit a conine spori de Bacillus anthracis. Cteva elemente concrete cu privire la situaia din acea perioad vor fi prezentate n capitolul dedicat genului Bacillus. Dup cartografierea genomului de B. anthracis s-au evideniat ca fiind posibile circa 3.500 de mutaii nucleotidice unice. n funcie de acestea se tie actualmente, c tulpinile cunoscute pot fi mprite n 8 grupe, fiecare grup fiind la rndul su divizat n mai multe subgrupe. Toate aceste grupe studiate sunt foarte stabile privind o posibil variaie genetic (nu exist cross link-uri ntre grupe), ceea ce face ca Bacillus anthracis s reprezinte un candidat ideal pentru studii de biologie molecular folosite n scopul punerii la punct a unor teste, care s identifice cu mare finee o anumit tulpin, inclusiv originea acesteia.

74

Prin metode ale biologiei moleculare s-a demonstrat de exemplu c tulpina de B. anthracis folosit n atacurile teroriste fcea parte din grupul Ames. Aceast ncadrare a putut s fie stabilit prin evidenierea a 6 mutaii specifice grupului Ames (4 la nivel cromozomial, una la nivelul plasmidului pX01 i una la nivelul plasmidului pX02). Aadar, iat cum, pentru o bacterie stabil din punctul de vedere al unei posibile variaii genetice, se poate realiza o adevrat munc de detectiv i prin metode specifice de laborator se poate stabili originea i apartenena sa, pornind de la caracteristicile genetice.

75

6. Antibiotice i Chimioterapice (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)

6. 1. Definiie Antibioticele i chimioterapicele antimicrobiene reprezint un grup de substane medicamentoase capabile s distrug sau s inhibe multiplicarea unor microorganisme implicate etiologic n bolile infecioase. Au o aciune selectiv asupra celulelor microorganismelor, exercitnd aciuni minime asupra celulelor organismului gazd. Aceste substane pot fi: - antibacteriene, - antivirale, - antifungice, - antiparazitare. n mod clasic, n aceast grup de medicamente au fost incluse i antineoplazicele (ex. dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Exist i antibiotice folosite ca: inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini), imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizat de Tolypocladium inflatum), hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus), insecticide, ierbicide etc (1).

6. 2. Date cu privire la descoperirea antibioticelor (Figura nr. 1) Antibioticele au revoluionat lumea n multe aspecte. Nenumrate viei au fost salvate. Din nefericire ns, exist i aspecte mai puin plcute legate n special de apariia i dezvoltarea rezistenei la antibiotice i chimioterapice precum i de nregistrarea diferitelor reacii adverse. O baz de date recent ntocmit arat prezena a mai mult de 20.000 de gene potenial rezistente (2). nc din 1820 chinina a fost folosit drept chimioterapic n tratamentul malariei, antimalaricele de sintez fiind introduse n practic o sut de ani mai trziu, n 1926. n acelai an (1926) Fleming testeaz penicilina pentru efectul ei antimicrobian in vitro, pentru ca n 1946 s se demonstreze n practic utilitatea acestui antibiotic (cu ajutorul penicilinei este vindecat un pacient cu septicemie stafilococic). n 1935 sunt descoperite primele molecule de sulfonamide (Domagk) iar rezistena la aceste molecule a fost raportat spre sfritul anilor 1930. Primul medicament anti-tuberculos este descoperit n anul 1944 (streptomicina, Scharty, Bugie, Waksman). n 1949 se pune n eviden n structura penicilinei nucleul betalactam, iar din acest moment toate substanele antibiotice cu o astfel de particularitate structural au primit numele de betalactamine. n 1950 sunt descrise betalactamazele, eveniment urmat ncepnd cu 1977 de obinerea inhibitorilor de betalactamaze (acid clavulanic, sulbactam, tazobactam). Din 1960 se folosesc deja penicilinele semisintetice antistafilococice, anul 1976 aducnd cu sine utilizarea n clinic a ureidopenicilinelor cu spectru ultralarg. Sulfamidele (sulfonamidele) au fost medicamentele antimicrobiene utilizate aproape exclusiv n perioada 1946-1950 (numit din acest motiv era sulfamidelor). Anul 1948 impune n tratamentul antiinfecios clasa tetraciclinelor, ncepnd cu clortetraciclina i continund cu 76

oxitetraciclina, tetraciclina, rolitetraciclina, minotetraciclina, doxitetraciclina. Primul medicament din clasa macrolidelor, eritromicina, este obinut n 1952. Cotrimoxazolul este introdus pe scar larg n clinic ncepnd cu anul 1969. n 1979 este pus n eviden nucleul carbapenem, descoperire care duce la apariia unei noi clase de substane antibiotice: tienamicinele. Printre reprezentanii acestei clase se numr tienamicina, imipenemul, care este asociat n terapie cu cilastatina. Ulterior s-au realizat structuri chimice rezistente la aciunea dihidropeptidazei 1 renale, respectiv biapenemul i meropenemul. n perioada 1979-1982 sunt descoperite fluorochinolonele (norfloxacina, enoxacina, ofloxacina, pefloxacina, ciprofloxacina etc) iar n 1982 sunt produi monobactamii, cu activitate pe germenii Gram-negativi (ex. aztreonam). La nceputul secolului 21 se utilizau la nivel mondial peste 250 de molecule de antibiotice i chimioterapice antiinfecioase diferite. Avnd n vedere utilizarea mai puin raional a acestor medicamente, Organizaia Mondial a Sntii elaboreaz periodic o list a medicamentelor eseniale, inclusiv antibiotice i chimioterapice. n aceast list apar medicamente betalactamice (penicilin, amoxicilin, cloxacilin, piperacilin etc), medicamente antituberculoase i antileproase (clofazimin, dapson, ethambutol, izoniazid, pirazinamid, rifampicin etc), alte medicamente antiinfecioase (cloramfenicol, co-trimoxazol, doxiciclin, eritromicin, gentamicin, metronidazol, spectinomicin, sulfadiazin etc), medicamente complementare (ciprofloxacin, clindamicin, acid nalidixic etc) dar nu apar pe lista principal nici cefalosporinele i nici chinolonele ceea ce demonstreaz cel puin indirect recomandarea de reducere a utilizrii n exces a medicamentelor antimicrobiene, aceas noiune avnd o legtur direct cu subiectul prezentului capitol. n acelai sens, este recomandat citirea unui document relativ recent (How to improve the use of medicines by consumers, OMS, 2007), adresat att specialitilor n sntate ct i celor care utilizeaz diferitele medicamente, inclusiv antibiotice i chimioterapice. Interesul pentru acest subiect este dovedit i de faptul c editarea acelui manual a fost fcut cu asisten financiar de la Comunitatea European.

6. 3. Clasificarea antibioticelor i chimioterapicelor Clasificarea se poate face dup: a) originea lor; b). efectul bacteriostatic sau bactericid; c). mecanismul de aciune; d). spectrul de aciune i e). structura chimic (Tabelul nr. 1). 6. 3. 1. n funcie de originea lor, agenii antimicrobieni pot fi clasificai n urmtoarele categorii: a). Substane cu origine biologic elaborate de anumite microorganisme (antibioticele), de exemplu penicilina G; bacteriocinele (piocine, colicine etc) au origine biologic, dar nu pot fi utilizate n tratamentul infeciilor umane; b). Produi de semisintez realizai pornind de la un nucleu elaborat de un microorganism, nucleu care sufer apoi prelucrri chimice (de exemplu meticilina);

77

c). Produi de sintez chimic integral (chimioterapice antiinfecioase), de exemplu acidul nalidixic sau sulfamidele (sulfonamidele). Deoarece n momentul actual o mare parte a medicamentelor antimicrobiene sunt produse prin metode chimice, diferenierea net dintre antibiotice i chimioterapice este mai rar ntlnit n limbajul medical curent, cel mai frecvent toate aceste medicamente fiind numite antibiotice (totui trebuie s cunoatem c exist aceast diferen). 6. 3. 2. n funcie de efectul lor, medicamentele antimicrobiene pot fi bacteriostatice i bactericide. Un antibiotic este bacteriostatic dac efectul su se limiteaz la oprirea multiplicrii bacteriene (ex. tetraciclinele, cloramfenicolul, eritromicina, clindamicina, sulfonamidele etc). Un antibiotic este bactericid dac aciunea sa duce la distrugerea bacteriilor (ex. penicilinele, cefalosporinele, polimixinele, aminoglicozidele, rifampicina, vancomicina, streptograminele etc). Trebuie cunoscute situaiile patologice n care se poate administra un antibiotic bacteriostatic, precum i situaiile n care este absolut necesar administrarea unui antibiotic cu efect bactericid (spre exemplu la persoanele care prezint imunodepresie). 6. 3. 3. Clasificarea dup mecanismul de aciune a). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei peretelui celular; au efect bactericid i sunt reprezentai de antibioticele beta-lactamice (peniciline, cefalosporine, carbapeneme etc), glicopeptidele (vancomicina, teicoplanina), bacitracina, cicloserina, fosfomicina, izoniazida etc; b). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea funciei membranei celulare; au efect bactericid i sunt reprezentai de polimixine (polimixin B, colistin), gramicidin, tirocidin, imidazoli, nistatin, amfotericin B etc (ultimele trei fiind medicamente antifungice); c). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei proteice la nivelul ribozomilor; de exemplu aminoglicozidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele (lincomicina, clindamicina), acidul fusidic, streptograminele etc; d). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, de exemplu rifampicina, chinolonele, sulfonamidele, trimetoprimul, pirimetamina, novobiocina etc. Antibioticele beta-lactaminice inhib selectiv sinteza peretelui celular n mod diferit la bacteriile Gram-pozitive fa de cele Gram-negative (datorit diferenelor dintre acestea n ceea ce privete structura peretelui). Pentru realizarea acestei aciuni este necesar legarea de receptori celulari numii PBPs (penicillin-binding proteins). Beta-lactaminele inhib de exemplu reacia de transpeptidare (de formare a punilor peptidice) ntre lanurile adiacente de peptidoglican. Rezistena la beta-lactamice apare de ex. atunci cnd microorganismele produc enzime numite beta-lactamaze, care desfac inelul beta-lactamic. Alte mecanisme de rezisten sunt reprezentate de: alterarea porinelor din membrana extern (Gram-negativi) ceea ce afecteaz transportul beta-lactaminelor ctre sediul de aciune, mutaii care afecteaz structura PBSs i respectiv afinitatea fa de beta-lactamine etc. Polimixinele (polimixina B, colistinul) acioneaz selectiv pe membrana germenilor Gramnegativi, printr-un mecanism asemntor cu cel al detergenilor cationici deteriornd membrana. Se leag i de lipo-poli-zaharid i acioneaz asupra membranei externe a microbilor Gram-negativi. Nu se recomand (de prim intenie) pentru administrare pe cale general. Rezistena la polimixine apare rar. 78

Aminoglicozidele (streptomicina, kanamicina, gentamicina, spectinomicina, tobramicina etc) se ataeaz iniial de o protein receptoare specific aflat pe subunitatea 30S a ribozomului bacterian i blocheaz ulterior activitatea normal a complexului de iniiere necesar formrii de peptide. n final determin dezintegrarea poliribozomilor i separarea lor n ribozomi, incapabili de sintez proteic. Rezistena la aminoglicozide apare n special dac exist o modificare a procesului de transport activ n interiorul celulei bacteriene. La streptococi, enterococi, germeni anaerobi etc. nu exist un astfel de sistem de transport i n aceste condiii aceste bacterii nu sunt sensibile la aminoglicozide. n cazul bacteriilor sensibile, rezistena poate aprea de ex. prin producerea de enzime care adenileaz sau fosforileaz grupul hidroxil de pe molecula aminoglicozidului. Dintre cele mai redutabile reacii adverse putem aminti nefrotoxicitatea i ototoxicitatea. Ciclinele (ex. tetraciclina) se leag de subunitatea 30S a ribozomilor bacterieni i nu permit introducerea de noi aminoacizi ntr-un lan polipeptidic n curs de formare. Rezistena este de regul mediat plasmidic, dar i prin intermediul transposonilor, ducnd de ex. la sinteza unei proteine membranare care mediaz un aflux excesiv de tetraciclin i astfel nu se mai pot atinge concentraiile bacteriostatice. Ciclinele se absorb n stomac i intestin. Sunt bacteriostatice. Acioneaz pe germeni gram pozitivi i gram negativi, spirochete, mycoplasme, rickettsii, chlamydii. Printre reaciile adverse amintim senzaiile de grea, voma, diareea, toxicitatea renal i hepatic, acumularea la nivel osos i dentar. Cloramfenicolul se leag de subunitatea 50S a ribozomilor bacterieni i inhib peptidiltransferaza, interfernd cu legarea de noi aminoacizi n lanul peptidic n curs de formare. Rezistena poate aprea de ex. prin sinteza de ctre bacterii a unei acetil-transferaze sau a unei nitrat-reductaze. Acioneaz pe germeni aerobi i anaerobi gram pozitivi i gram negativi. Este un medicament bacteriostatic). Are indicaii n abcesul cerebral, febra tifoid, salmoneloze sistemice, infecii severe cu anaerobi. Printre reaciile adverse cele mai grave la care poate s duc enumerm anemia aplastic cu leucopenie i agranulocitoz. Macrolidele (eritromicina, claritromicina etc) i lincosamidele (lincomicina i clindamicina) se leag de subunitatea 50S a ribozomului bacterian, interfernd cu formarea complexului de iniiere pentru sinteza lanurilor proteice. Rezistena poate aprea datorit unei alterri a proteinelor ribozomale sau datorit sintezei unei enzime care metileaz reziduuri de adenin la nivelul ARNr. Macrolidele sunt bacteriostatice. Acioneaz pe cocii gram pozitivi i gram negativi, bacili gram pozitivi i unii bacili gram negativi. Pot aciona pe specii de Mycobacterium. Au efect asupra Treponema, Mycoplasma i Chlamydia. Sunt indicate n infeciile strectococice la bolnavii cu hipersensibilitate la betalactamine dar i n difterie, tuse convulsiv, pneumonii atipice etc. Dintre reaciile adverse amintim: grea, vom, diaree, febr, rash, reacii anafilactice. Lincosamidele (bacteriostatice) acioneaz pe germeni gram pozitivi aerobi i anaerobi i pe germeni gram negativi anaerobi. Rifampicina inhib creterea bacterian prin legarea de ARN-polimeraza ADN-dependent. Acioneaz pe mycobacterii, coci gram pozitivi i gram negativi, unii bacili gram negativi, germeni anaerobi gram pozitivi i gram negativi. Dintre indicaii putem meniona tratamentul tuberculozei, leprei, infeciilor stafilococice meticilino-rezistente sensibile (testarea sensibilitii tulpinilor respective este necesar). Chinolonele (de exemplu acidul nalidixic, norfloxacina, ofloxacina, ciprofloxacina) inhib sinteza ADN-ului microbian prin blocarea ADN-girazei. Acioneaz pe unii bacili gram negativi i gram

79

pozitivi, coci gram negativi i gram pozitivi, micoplasme, chlamydii. Dintre posibilelel reacii adverse am putea aminti: fotosensibilitate, cefalee, vertij, convulsii. Sulfamidele (sulfonamidele) sunt analogi structurali ai acidului paraaminobenzoic (PABA) i inhib dihidro-pteroat-sintetaza. Se formeaz analogi nefuncionali ai acidului folic, metabolismul celulei bacteriene fiind astfel inhibat. Rezistena apare prin alterarea dihidropteroat-sintetazei scznd capacitatea de legare a sulfonamidelor i este mediat plasmidic. Rezistena la un membru al familiei trebuie nregistrat ca rezisten i fa de celelalte substane cu structur similar. Trimetoprimul, omolog al acidului dihidrofolic, inhib reductaza acestui acid. Sulfamidele i trimetoprimul pot fi utilizate separat pentru a inhiba creterea bacterian. Dac sunt ns utilizate mpreun, vor produce o blocare dubl n secvena sintezei de ADN, rezultnd o cretere marcat a activitii lor (sinergism). O astfel de substan, frecvent folosit n practica medical, este cotrimoxazolul (ex. biseptol), coninnd sulfametoxazol i trimetoprim. Pirimetamina, la fel ca i trimetoprimul, inhib dihidro-folat-reductaza. Unele antibiotice, cum ar fi actinomicinele, sunt inhibitori eficieni ai sintezei de ADN; dar realizeaz aceast inhibiie att la nivelul celulei bacteriene ct i la nivelul celulei animale, nefiind suficient de selective pentru a putea fi utilizate n terapia antibacterian. 6. 3. 4. Clasificarea antibioticelor i chimioterapicelor dup spectrul de aciune Prin spectrul de aciune antimicrobian se nelege lista grupurilor (speciilor) de bacterii asupra crora un anume antibiotic sau chimioterapic este activ. n practic, trebuie cunoscut nu numai spectrul antimicrobian iniial al fiecrui preparat antimicrobian, ci i modificrile ulterioare, survenite n urma apariiei germenilor rezisteni. Spectrul antimicrobian iniial este stabilit pentru fiecare antibiotic n parte, o dat cu introducerea sa n terapeutic. Antibiotice cu spectru ngust Aceste antibiotice pot fi submprite n dou subgrupuri: - antibiotice cu spectru de tip penicilinic, active pe bacili Gram-pozitivi, coci Gram-pozitivi i coci Gram-negativi. Din acest grup fac parte majoritatea penicilinelor, macrolidele, lincosamidele etc; - antibiotice cu spectru de tip streptomicin, active pe bacili Gram-negativi, coci Gramnegativi, coci Gram-pozitivi. n acest grup sunt incluse aminoglicozidele, polimixinele etc. Antibiotice cu spectru larg Antibioticele din acest grup sunt active pe bacili Gram-pozitivi i negativi, coci Gram-pozitivi i negativi. Sunt active i pe spirochete, leptospire, rickettsii, chlamydii, mycoplasme. n acest grup au fost incluse cloramfenicolul i tetraciclinele. La acest grup clasic de antibiotice cu spectru larg se pot aduga alte antibiotice, cum ar fi: penicilinele cu spectru lrgit (ampicilina, amoxiciclina etc), ureidopenicilinele, tienamicinele, cefalosporinele din generaiile II-IV, unele fluorochinolone, unele sulfamide etc. 6. 3. 5. Clasificarea antibioticelor i chimioterapicelor antibacteriene dup structura chimic 1. Antibioticele betalactaminice a). Penicilinele - penicilinele naturale (de exemplu penicilina G); 80

-penicilinele penicilinazorezistente (de exemplu meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, nafcilina); - aminopenicilinele (de exemplu ampicilina, amoxicilina); - alte peniciline cu efect asupra enterobacteriilor (mecilinamul, pivmecilinamul, ciclacilina, epicilina); - peniciline stabile n prezena unor beta-lactamaze produse de enterobacterii (temocilina; n aceast categorie ar putea intra i ampicilina, amoxicilina, ticarcilina i piperacilina); - peniciline cu efect asupra Pseudomonas aeruginosa (carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, apalcilina); - alte peniciline i inhibitori de beta-lactamaze (de exemplu acid clavulanic + amoxicilin / ticarcilin, sulbactam + ampicilin, tazobactam + piperacilin); b). Cefalosporinele - din generaia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina); - din generaia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima); - din generaia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona); - din generaia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma). Cefalosporinele se mai pot clasifica i n: cefalosporine de uz oral (cefacitril, cefapirin, cefazedon, ceftezol etc); cefalosporine de uz parenteral (cefalotina, cefaloridina, cefazolina, cefamandola etc); cefalosporine care prezint o mai bun stabilitate n prezena beta-lactamazelor (cefuroxima, cefoxitima, cefotetanul, cefixima etc); cefalosporine cu activitate fa de Pseudomonas aeruginosa (ceftazidima, cefpiroma, cefepima, cefoperazona, cefsulodimul etc). c). Alte antibiotice beta-lactaminice - monobactamii (de exemplu aztreonamul); - penemii (de exemplu ritipenemul); -carbapenemii (de exemplu imipenenul, meropenemul, imipenemul + cilastatina; cilastatina este un inhibitor al dehidro-peptidazei); - oxacefemii (ex. latamoxef); - carbacefemii (ex. loracarbef). d). Inhibitori de beta-lactamaze (ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). 2. Glicopeptidele (teicoplanina i vancomicina); Vancomicina este utilizat n tratamentul infeciilor cu S. aureus meticilino-rezistent. Se administreaz intravenos deoarece nu se absoarbe n tractul gastrointestinal. Printre reaciile adverse amintim reaciile anafilactice, febr, eozinofilie, neutropenie, pierderea auzului. 3. Aminoglicozidele - streptomicina (care este de fapt un oligozaharid); - kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.; 4. ciclinele (ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc); 5. Ansamicinele (ex. rifampicina, rifabutina);

81

6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina); 7. Polipeptidele ciclice (polimixina B, colistinul); 8. Antibioticele care nu se ncadreaz n nici una din grupele de mai sus - cloramfenicolul; - lincosamidele (lincomicina i clindamicina); - acidul fusidic (cu o structur asemntoare steroizilor); - streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin); - oxazolidinonele (linezolid); - mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite n special ca rspuns la apariia tulpinilor de stafilococ rezistente la meticilin etc. Chimioterapicele 1. Sulfamidele (sulfonamidele) (ex. sulfadiazina, sulfafurazolul); 2. Co-trimoxazolul (asociere trimetoprin + sulfametoxazol) 3. Dapsona (diaminodifenilsulfona); 4. Ethambutolul; 5. Hidrazida acidului izonicotinic (HIN, izoniazida); 6. Chinolonele (ex. acidul nalidixic, ofloxacina, ciprofloxacina, norfloxacina, levofloxacina, moxifloxacina, gatifloxacina, gemifloxacina etc); 7. Nitrofuranii (ex. furazolidonul, nitrofurantoina); 8. Nitroimidazolii (ex. metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul) etc.

6. 4. Lantibioticele Denumirea de lantibiotice a fost introdus relativ recent, fiind vorba de un grup special de substane antimicrobiene cu o serie de proprieti datorit crora au fost clasificate ntre antibiotice i bacteriocine. Lantibioticele sunt sintetizate de bacterii Gram-pozitive (ex. din genurile Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Streptomyces) i prezint un spectru de activitate specific fa de anumite bacterii Gram-pozitive. Din punct de vedere al structurii chimice lantibioticele sunt polipeptide policiclice. Masa molecular a acestor substane se situeaz ntre 1.825 daltoni (mersacidina) i 3.488 daltoni (Pep5). Pe baza structurii lor diferite, s-au descris dou tipuri de lantibiotice: A i B. Tipul A: sunt lantibiotice produse de stafilococi, lactococi i bacili Gram-pozitivi, de ex. nisina, subtilina, epidermina, gallidermina i Pep5. Lantibioticele i au originea n proteine precursoare inactive (pre-lantibiotice) sintetizate la nivel ribozomal, convertite enzimatic n polipeptide active din punct de vedere biologic. n privina mecanismului de aciune se tie de ex. c nisina i Pep5 au activitate bactericid depolariznd membrana citoplasmatic a celulei bacteriene, formnd pori i inducnd autoliza acesteia. Datorit faptului c exist o specificitate a lantibioticelor fa de anumite bacterii se consider c exist i alte mecanisme implicate.

82

Genele responsabile de sinteza lantibioticelor pot fi localizate cromozomial sau plasmidic. De ex. n cazul nisinei, genele sunt localizate pe cromozonul celulei bacteriene (15) de Lactococcus lactis, iar informaia genetic pentru biosinteza epiderminei este localizat pe plasmidul pTu 32. Utilizarea lantibioticelor n industria alimentar i n practica medical Dintre lantibioticele cunoscute, nisina are cea mai larg aplicabilitate practic. Nisina inhib tulpinile din genurile Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria la o concentraie 30 ml / ml, activitatea inhibitorie fiind maxim la pH < 5,5. Nisina inhib sporularea bacteriilor din genurile Clostridium i Bacillus; nu are efect asupra bacteriilor Gramnegative sau asupra fungilor. Nisina este folosit pe scar larg n industria alimentar drept conservant natural pentru vegetale, fructe, brnzeturi proaspete i procesate, carne, pete, cacao, buturi alcoolice (vinuri). Nu prezint dezavantajele nitrailor i nitriilor (produc nitrozamin cu aciune carcinogen). n practica medical este utilizat n unguente cosmetice. Este folosit i ca agent terapeutic n medicina veterinar (n tratamentul local al infeciilor bacteriene). Epidermina, produs de Staphylococcus epidermidis, are aciune antimicrobian fa de germeni care pot aciona patogen la nivel tegumentar: Propioniibacterium acnes, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Astfel, epidermina i gallidermina (sintetizat de Staphylococcus gallinarum) constituie alternative terapeutice pentru derivatele de vitamina A i eritromicin, de ex. n cazurile de acnee juvenil, eczem, foliculite etc. Dintre lantibioticele de tip B putem exemplifica lanthiopeptina, care are aciune antiviral fa de virusul Herpes simplex.

6. 5. Rezistena microbian la antibiotice Utilizarea cu succes a oricrui agent terapeutic poate fi compromis de dezvoltarea rezistenei. Rezistena poate s apar att pentru antibioticele utilizate n tratamentul infeciilor bacteriene ct i pentru antifungice, antivirale, antiparazitare sau pentru medicamentele utilizate n tratamentul unor boli cronice. Trei condiii trebuiesc ndeplinite ca un anumit antibiotic s inhibe bacteria susceptibil: 1-antibioticul trebuie s poat s ajung la int ntr-o concentraie suficient; 2-antibioticul nu trebuie s fie inactivat nainte s se lege de int; 3-trebuie s existe n celula bacterian o int vital susceptibil la aciunea antibioticului. Cititorul este rugat s consulte i http://ecdc.europa.eu/en/eaad/pages/video.aspx. Rezistena microbian la antibiotice reprezint capacitatea unor microorganisme de a supravieui i de a se multiplica n prezena antibioticului. Fenomenul de rezisten la antibiotice a fost descris relativ rapid dup introducerea acestora (ex. Streptococcus pyogenes rezistent la sulfonamide, Staphylococcus aureus rezistent la penicilin sau Mycobacterium tuberculosis rezistent la streptomicin) n practica medical. Pe msur ce au fost descoperite mecanismele prin care medicamentele antiinfecioase afecteaz multiplicarea sau distrug diferitele tipuri de bacterii (ex. mecanismul de aciune al beta-lactaminelor) au fost descoperite i mecanismele prin care bacteriile pot rezista fa de

83

aciunea medicamentului antibacterian (ex. producerea de enzime numite beta-lactamaze / penicilinaze, cefalosporinaze etc). Rezistena poate fi natural sau dobndit. 6. 5. 1. Rezistena natural (intrinsec) reprezint rezistena tuturor membrilor unei specii bacteriene fa de un antibiotic i este determinat genetic, de exemplu rezistena bacilului tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis) la penicilina G. 6. 5. 2. Rezistena dobndit este acea rezisten necaracteristic unei specii bacteriene, dar achiziionat de anumite subpopulaii din acea specie n circumstane date; de exemplu, antibioticul acioneaz ca un presor selectiv (pacientul are o infecie n care majoritatea populaiei bacteriene este sensibil la agentul antimicrobian, dar exist tulpini care prezint rezisten; n aceste condiii, tulpinile sensibile vor fi inhibate sau distruse n timp ce tulpinile rezistente vor fi selectate; aceast situaie nu poate fi detectat dect utiliznd tehnicile de testare a sensibilitii bacteriilor la antibiotice i chimioterapice, de ex. antibiograma difuzimetric standardizat). Rezistena dobndit poate fi cromozomial sau extracromozomial. Mecanisme biochimice implicate n rezistena la antibiotice - producerea de ctre bacterie a unei enzime care inactiveaz antibioticul, de exemplu penicilinaza stafilococului auriu (codificat plasmidic) care inactiveaz nucleul beta-lactamic al penicilinelor sau diferitele tipuri de beta-lactamaze produse de bacteriile Gram-negative (ex. de enterobacterii); - scderea permeabilitii peretelui sau membranei citoplasmatice pentru antibiotic (de exemplu formele L); - elaborarea n exces de ctre bacterie a unor enzime complementare, care limiteaz sau anuleaz aciunea antibacterian a antibioticului, exercitat la nivelul enzimei respective; - alterarea intei intracelulare (ex. modificarea proteinelor ribozomale); - amplificarea sintezei de acid paraaminobenzoic, anulndu-se astfel prin diluare aciunea inhibitorie a sulfamidelor etc. (Tabelul nr. 2) 6. 5. 2. 1. Rezistena cromozomial se poate dezvolta ca rezultat al unei mutaii spontane, la ntmplare, la nivelul unui locus ce controleaz sensibilitatea fa de un anumit produs antimicrobian (deleie, substituie sau adiie de baz). Prezena substanei active antimicrobiene servete ca un mecanism selector, suprimnd organismele sensibile i favoriznd dezvoltarea unei populaii provenite din organismele mutante, rezistente la antibiotic. Mutaia spontan apare cu o frecven variind ntre 10-12-10-7. Mutaiile cromozomiale sunt definitive, afecteaz numai un anumit antibiotic sau o familie de antibiotice i se transmit vertical la toi descendenii suei bacteriene devenite rezistent. Pot fi clasificate n: mutaii ntr-un singur pas (single large step mutations) o singur mutaie duce la creterea CMI pentru un anumit antibiotic. Pot duce la euarea tratamentului atunci cnd acesta este instituit cu un singur antibiotic. mutaii n mai muli pai (multistep mutations) mutaii secveniale care duc la creterea gradat a CMI.

84

6. 5. 2. 2. Rezistena extracromozomial este mult mai frecvent dect cea cromozomial, reprezentnd circa 90% din cazurile de rezisten. n acest caz, transmiterea materialului genetic pentru rezisten se poate face transversal (orizontal), la toi membrii populaiei bacteriene existente la un anumit moment dat, prin plasmide, material plasmidic sau transpozoni. Transferul materialului genetic se poate realiza prin: - transducie; - transformare; - conjugare; - transpoziie. Transducia apare prin intervenia unor bacteriofagi care pot transporta ADN bacterian ncorporat n capsida sau genomul propriu. Dac acest material genetic include gene pentru rezistena la un antibiotic (factor R sau RTF), o celul bacterian infectat ulterior poate deveni rezistent la antibioticul respectiv i este capabil s transmit descendenilor aceast rezisten fr a veni n contact cu antibioticul respectiv. Transformarea reprezint un mod de transfer al informaiei genetice care implic ncorporarea de ADN liber din mediu (rezultat de exemplu n urma lizei unor bacterii care-l conin) ntr-o alt bacterie. Conjugarea reprezint pasajul genelor de la o celul la alta prin contact direct realizat prin intermediul unui pil sexual (pil F). Acest mecanism este considerat foarte important n rspndirea rezistenei la antibiotice. ADN-ul astfel transferat poate codifica simultan pentru germenul receptor rezistena fa de mai multe antibiotice. Transpoziia este un transfer al unor secvene scurte de ADN (transpozoni, elemente transpozabile) n interiorul unei celule bacteriene ntre dou plasmide sau ntre o plasmid i o poriune a cromozomului bacterian. 6. 5. 3. Tipuri de rezisten 6. 5. 3. 1. Rezistena fa de un agent antimicrobian poate fi: - monovalent (monorezistena), atunci cnd germenii rezist la un singur antibiotic; - plurivalent (rezistena multipl, la mai multe antibiotice); 6. 5. 3. 2. Din alt punct de vedere, rezistena se poate manifesta: - direct (leag o anumit bacterie de un singur anumit antibiotic); - ncruciat (rezistena unei bacterii fa de mai muli ageni antimicrobieni cu structur i/sau mecanism de aciune asemntor); de ex. rezistena la o sulfonamid sau la o tetraciclin confer rezisten la toate sulfonamidele sau la toate tetraciclinele n timp ce stafilococii rezisteni la meticilin (MRSA) sunt rezisteni la toate medicamentele beta-lactamice; 6. 5. 3. 3. Dup ritmul de instalare, rezistena poate fi: - cu ritm rapid de instalare (monostadial), tip streptomicin; - de ritm intermediar, tip eritromicin; - cu ritm lent de instalare (pluristadial), tip penicilin; - cu ritm foarte lent de instalare, tip vancomicin.

85

6. 5. 4. Modificri ale spectrului antimicrobian iniial Implicaiile clinice, terapeutice, epidemiologice i materiale ale fenomenului de rezisten bacterian la antibiotice i chimioterapice sunt extrem de mari. Selectarea tulpinilor rezistente prin antibioticoterapia excesiv, de multe ori abuziv, exercitat n spitale, alte uniti sanitare sau n ambulator (inclusiv prin fenomenul numit automedicaie), duce la variate aspecte negative: infecii cu germeni rezisteni, apariia i transmiterea germenilor de spital, devalorizarea i pierderea unor medicamente antibacteriene etc. O problem deosebit este i utilizarea medicamentelor antibiotice i chimioterapice n domeniul veterinar. Se estimeaz c anual se consum circa 100.000 tone de antibiotice i chimioterapice, o bun parte n ferme de animale, piscicole etc (Levy 2002). Acest exces de utilizare produce i un fenomen de poluare a mediului cu substane de acest tip, prin excreia acestora de ctre animalele tratate. Atunci cnd vorbim de utilizarea raional a antibioticelor i chimioterapicelor ar trebui s avem n vedere: utilizarea acestora n beneficiul pacientului; evaluarea clinic riguroas nsoit de teste de laborator sugestive sau care s confirme infecia i respectiv sensibilitatea la medicamente a tulpinilor izolate; instituirea tratamentului n cel mai scurt timp posibil n cazul pacienilor cu infecii severe, amenintoare de via; tratamentul trebuie s fie intit, s fie ndreptat strict ctre bacteria care a produs respectiva infecie, s se utilizeze calea de administrare cea mai potrivit, doza corespunztoare, intervalul ntre doze, durata optim a tratamentului iar pacientului s i se explice toate elementele care vor permite ca acesta s fie compliant i s respecte indicaiile medicale. Este strict necesar supravegherea fenomenului de rezisten la antibiotice i chimioterapice, testarea sensibilitii germenilor, notificarea i evaluarea statistic, publicarea periodic a datelor i punerea lor la dispoziia sistemului sanitar. Cu toate acestea, datele menionate mai sus nu sunt disponibile la nivel naional. n Romnia, profesionitii din sistemul sanitar se bazeaz fie pe experiena proprie, fie pe datele statistice din literatura internaional. Se vorbete tot mai des n zilele noastre despre superbugs, i anume, bacterii rezistente la foarte multe antibiotice. Printre acestea amintim Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile, Enterobacter spp., Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, M. tuberculosis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae etc. Termenul de superbug se refer la microbi care duc la o mortalitate i morbiditate ridicat datorit mutaiilor multiple i respectiv rezistenei la antibiotice i chimioterapice rezultate. Variantele terapeutice devin limitate iar spitalizarea este de durat mare i poate duce la costuri deosebit de mari. (3) NDM (New Delhi metallo-beta-lactamase gene; blaNDM-1) este o gen nou descoperit. Bacteriile care dein gena devin impermeabile pentru o serie de antibiotice i inactiveaz carbapenemazele. Gena se gsete la nivelul unei plasmide i din aceast cauz poate fi uor transmis. A fost prima dat identificat n India; a fost ulterior recunoscut n Pakistan, Bangladesh, UK, SUA, Canada, Australia, Belgia etc (4-7). 6. 5. 5. Date privind controlul extinderii rezistenei la antibiotice Utilizarea oricrui antibiotic n mod potenial duce la rezisten. De-a lungul anilor s-au realizat i aplicat diferite strategii de ctre CDC, Organizaia Mondial a Sntii i mai de curnd de ctre ECDC, pentru prevenirea i controlul rezistenei la antibiotice, spre exemplu:

86

 controlul strict al folosirii acestor medicamente dup o prescriere corect (ex. nu pentru un guturai sau alt infecie insensibil la antibiotice anti-bacteriene) achiziionarea antibioticelor i chimioterapicelor doar n baza prescripiei medicale controlul strict al medicamentelor utilizate la animale i n agricultur (multe dintre moleculele de antibiotice i chimioterapice folosite n terapie la om se gsesc sub alte denumiri comerciale i n tratamentul animalelor) prevenirea bolilor infecioase etc. Rezistena la antibiotice datorat rspndirii utilizrii acestora de ctre om i pentru animale a devenit o problem tot mai mare n ultimele decenii. n 2001 European Union Ministers of Health a adoptat Recomandrile legate de folosirea prudent a antibioticelor n medicina uman. Prima recomandare a fost ca statele membre s ntocmeasc i s ntreasc un sistem de supraveghere pentru folosirea antibioticelor i prevenirea rezistenei la acestea. Din 1999, Sistemul European de Supraveghere Antimicrobian (European Antimicrobial Surveillance System EARSS) ofer date legate de prevalena i rspndirea majoritii bolilor cauzate de bacterii rezistente la unul sau mai multe antibiotice. n raportul anual din 2007 EARSS afirm c datele pe care EARSS le-a adunat de-a lungul anilor aduc un mesaj neplcut dar important: rezistena la antibiotice devine o problem tot mai mare de sntatea publica an dup an i doar un efort cumulat poate schimba aceast situaie. (8) Copiii sunt cei care primesc cele mai multe antibiotice n UE mai ales pentru infecii ale tractului respirator superior. Exist date care arat c n acest caz apare i rezistena la antibiotice i chimioterapice. Tulpinile rezistente sunt rspndite printre copiii care sunt dui la cre sau la alt form de educaie precolar. La nivelul UE dei au existat cteva iniiative, s-a fcut mult prea puin n ceea ce privete aceast grup de vrst. Ar fi totui de menionat nfiinarea Reelei de Prescriere i Rezistena la Antibiotice a Copiilor din UE (The Antibiotic Resistance and Prescribing in European Children network ARPEC) care are urmtoarele scopuri: s foloseasc metodologia i datele oferite de celelalte sisteme de supraveghere pentru a dezvolta un sistem de supraveghere a rezistenei la antibiotice, pentru copiii din UE s determine diferenele legate de alegerea antibioticului, doza i indicaiile care apar ntre diferite comuniti i spitale s pun la punct recomandri privind dozele de antibiotice i chimioterapice administrate zilnic copiilor s colecteze date s initieze referine legate de rata prescrierii i rezistenei n colaborare cu Societatea European pentru Bolile Infecioase Pediatrice (European Society for Paediatric Infectious Diseases ESPID) s trimit rezultatele obinute n cadrul fiecrui proiect ctre toate rile membre. (9) CDC a dezvoltat la rndul su un plan de aciune cu privire la rezistena la antibiotice care cuprinde patru mari puncte: Supraveghere, Prevenire i Control, Cercetare i Producie. (10)

87

6. 6. Noiuni legate de alegerea corect a antibioticelor n tratamentul bolilor infecioase Instituirea i continuarea unei terapii cu antibiotice pe o durat optim (nici prea scurt i nici prea lung, existnd recomandri specifice n funcie de agentul etiologic i respectiv n funcie de patologie) trebuie s urmeze ntotdeauna parcurgerea unor etape minimale care s justifice aceast opiune terapeutic. n acest mod s-ar putea evita principalele erori n utilizarea antibioticelor, erori extrem de frecvente n momentul actual, inclusiv la nivel mondial, erori care favorizeaz n principal abuzul de antibiotice / chimioterapice i permit selectarea de microorganisme rezistente. 6. 6. 1. Etape de urmat n vederea instituirii corecte a unui tratament cu antibiotice Etapa n care se ia decizia de instituire a antibioticoterapiei Aceast etap se bazeaz pe o serie de date concrete (ns uneori pornim doar de la ipoteze) ntr-un anumit context clinic, epidemiologic, paraclinic i de laborator. Este strict necesar s reinem c ntotdeauna exist un context i c nici una dintre informaii luat singular nu permite luarea celei mai bune decizii. Nu exist o prioritate pentru clinic sau o prioritate pentru laborator; datele trebuie interpretate i integrate n contextul general. Pentru a susine decizia ncercm s rspundem ct mai precis posibil la cel puin dou ntrebri, respectiv: 1. Este n discuie o infecie cert sau cel puin foarte probabil? Argumentele principale n favoarea unei infecii pot fi: creterea temperaturii, prezena frisoanelor, identificarea unor supuraii sau inflamaii locale, modificarea evident a strii generale, icterul (colorarea n galben a tegumentelor i mucoaselor), prezena unor erupii la nivel tegumentar sau pe mucoase, modificri ale tranzitului intestinal nsoite de eliminarea de scaune mai numeroase sau de consisten sczut (diaree), tusea, condensrile pulmonare percepute auscultator sau prin examinare radiologic, sindromul meningian (foarte important de sesizat prin manevre clinice relativ simple), leucocitoza (att ca numr ct i ca procent n analiza formulei leucocitare), testele nespecifice de inflamaie (numr de leucocite, VSH, protein C reactiv, fibrinogen etc.), identificarea prezenei bacteriilor la nivel tisular sau n umori n mod normal sterile prin examene simple n cadrul diagnosticului bacteriologic direct etc. Sindromul de rspuns inflamator sistemic (SIRS) sugereaz de cele mai multe ori o infecie, dar el poate fi produs i de cauze neinfecioase (imunologice, cancer, politraumatisme, alte agresiuni fizice etc.). n acest sindrom este evaluat prezena a cel puin dou din urmtoarele condiii: temperatur central peste 38C sau mai mic de 36C, frecven cardiac peste 90 de bti pe minut, frecven respiratorie peste 20 de respiraii pe minut sau PaCO2 sub 32 mmHg, numrul leucocitelor periferice peste 12.000 pe mm3 sau sub 4.000 pe mm3 sau cu peste 10% forme imature (n band). Noiunea de sepsis include prezena infeciei alturi de sindromul de rspuns inflamator sistemic. n prezent, este recomandat o nou terminologie care s nlocuiasc vechile denumiri de septicemie, stare septic, septicopiemie etc. Sepsisulreprezint SIRS determinat de infecie. Sepsisul sever se definete ca un sepsis asociat cu disfuncie organic, hipoperfuzie sau hipotensiune. ocul septic este sepsisul nsoit de hipotensiune (indiferent de aportul normal de lichide) i de anomalii de perfuzie (cel puin acidoz lactic, oligurie sau alterarea acut a strii mentale). Hipotensiunea este definit ca tensiune arterial (maxim) sub 90 mmHg sau 88

reducerea tensiunii arteriale maxime cu peste 40% fa de nivelul obinuit. Prezena sau suspiciunea sepsisului, ocului septic sau a sindromului de disfuncie multiorganic, chiar i atunci cnd nu sunt clar demonstrate, constituie un argument hotrtor pentru administrarea de antibiotice sau chimioterapice datorit gravitii deosebite a acestor entiti clinice. Totui, chiar i n aceast situaie nu exist nici un argument logic de a institui antibioticoterapia nainte de a recolta produse pentru a fi examinate n cadrul diagnosticului bacteriologic direct. 2. Care este terenul pe care s-a instalat infecia? Evaluarea terenului, a situaiei gazdei care urmeaz a fi tratat, are un rol important n stabilirea oportunitii antibioticoterapiei. Infeciile uoare, aprute la persoane tinere anterior sntoase, de obicei nu necesit tratament cu antibiotice sau chimioterapice. Aceleai infecii aprute la pacienii cu imunodepresie fac antibioticoterapia strict necesar (i este indicat s utilizm medicamente bactericide). Existena unor factori favorizani mrete prezumia de infecie i necesit instituirea terapiei cu antibiotice, chiar n contextul unor semne fizice (exemplu febr) aparent minore. Aceti factori sunt de obicei reprezentai de imunodepresia la nivelul ntregului organism (la pacieni cu diabet, ciroz, cancer, SIDA, politraumatisme, operaii extinse etc.) sau de imunodepresie local (datorit prezenei unor catetere, sonde, unturi, proteze implantate etc.). La bolnavii imunodeprimai se va opta de obicei pentru antibiotice bactericide; n aceast situaie este de obicei acceptat asocierea de antibiotice. Etapa n care se alege medicamentul antimicrobian care urmeaz a fi administrat Din gama larg de antibiotice disponibile la ora actual (peste 250 de molecule diferite), selectarea celui mai indicat se face dup mai multe criterii. Relativ frecvent, alegerea se bazeaz pe criteriul prezumiei etiologice, cu condiia nceperii diagnosticului microbiologic direct anterior nceperii terapiei (nu exist nici o justificare, indiferent de eventuala gravitate a maladiei, pentru a administra nti antibiotice i apoi a-i aduce aminte c era preferabil s recoltezi produsul patologic, s l trimii ctre laborator n vederea izolrii, identificrii i stabilirii sensibilitii/rezistenei la antibiotice i chimioterapice a germenului implicat n respectiva patologie). Ulterior, alegerea poate fi corectat pe baza precizrii definitive a etiologiei (cu condiia ca diagnosticul microbiologic direct s fi fost lansat), dar i pe baza aprecierii eficienei clinice i a efectelor adverse ale terapiei iniiale. n vederea alegerii medicamentului antimicrobian pe care urmeaz s l administrm pacientului cu o boal infecioas este strict necesar s: a). stabilim diagnosticul etiologic, s ncercm i s reuim diferenierea infeciilor bacteriene (tratabile cu antibiotice i chimioterapice antibacteriene) de infeciile virale; elementele care ne permit orientarea spre etiologia bacterian ar fi: un tablou clinic mai sever (exist i infecii virale foarte grave, nsoite de modificri substaniale ale strii generale a pacienilor), febra mai nalt, frisoanele, inflamaia mai accentuat, prezena supuraiilor, leucocitoza (numeric i procentual n analiza formulei leucocitare). Trebuie s realizm de asemenea o examinare clinic n detaliu a pacientului (din cretet i pn la tlpi), examenul microbiologic (inclusiv examinarea microscopic citobacteriologic); b). testm sensibilitatea la antibiotice a bacteriei izolate i implicate n infecia supus antibioticoterapiei (de ex. antibiograma); c). realizm sau primim informaii privind diagnosticul anatomo-clinic al bolii; d). cunoatem proprietile farmacologice ale antibioticelor propuse a fi folosite; e). avem n vedere i criteriul economic (raportul costeficien); f). analizm necesitatea unei eventuale asocieri de antibiotice.

89

Trebuie de asemenea s avem n vedere i s decidem care este calea i modul de administrare pentru antibioticul ales n funcie de gravitatea, localizarea infeciei, caracterul acut sau subacut al bolii, tipul antibioticului ales, tolerana pentru acest antibiotic a pacientului tratat. Spre exemplu, putem folosi penicilina V (de administrare oral) n infecii de gravitate medie sau chiar i n unele infecii grave, n funcie de localizare, ca alternativ pentru penicilina G sau alte preparate beta-lactamice, dac bacteria izolat i pstreaz sensibilitatea fa de penicilin, dac gazda nu prezint hipersensibilitate de tip I fa de penicilin i dac vom reine care este procentul de absorbie al acestui medicament i n acest sens vom administra doze duble comparativ cu dozele utilizate pentru administrarea parenteral i pe stomacul gol. n cazul n care analiza noastr a permis rspunsul la toate ntrebrile listate mai sus se vor stabili dozele necesare, intervalele ntre administrri, durata tratamentului, precum i momentul opririi acestuia. Controlul terapiei antimicrobiene se va realiza pe tot parcursul administrrii incluznd metode clinice (de ex. ameliorarea semnelor i simptomelor) i metode de laborator (examene paraclinice, dozarea antibioticelor n ser etc.).

6. 7. Erori n practica antibioticoterapiei Antibioterapia se afl ntr-un impas constatat clinic prin diferite eecuri terapeutice (n cadrul tuturor specialitilor att medicale dar mai ales chirurgicale) i confirmat de numeroase studii de laborator (aceste studii sunt realizate n special n SUA i Europa de Vest i sunt mai puine i mai puin semnificative n ara noastr; constatrile diferitelor eecuri exist, chiar dac sunt prezentate de regul anecdotic i nu n publicaii accesibile ntregului sistem sanitar). n strintate, exist o tendin de a atrage n echipe mixte microbiologi, farmaciti etc. cu scopul de a monitoriza calitatea utilizrii antibioticelor i chimioterapicelor, mai mult, de a pregti specialiti pentru formarea de echipe multidisciplinare cu participarea managerilor unitilor sanitare, pentru limitarea problemelor legate de numeroasele erori comise n antibioticoterapie (Arnold 2004). Principalele cauze ale situaiei actuale sunt un numr imens de prescrieri abuzive i folosirea iraional a unor antibiotice; se estimeaz c 60% din antibioticele i chimioterapicele produse anual se risipesc inutil. Principalele rezultate sunt: apariia de specii sau de tulpini (mutante) bacteriene cu rezisten la antibiotice, nmulirea reaciilor adverse la antibiotice i chimioterapice precum i modificarea tablourilor clinice clasice ale patologiei infecioase. Cel puin teoretic soluia ar fi descoperirea de noi antibiotice (ns din ce n ce mai multe companii farmaceutice transfer interesul pentru descoperirea de medicamente antivirale i antifungice i au tendina de a renuna la cercetarea fundamental n vederea producerii de medicamente antibacteriene, Shlaes 2003) dar mult mai logic, mai corect i mai la ndemn este folosirea raional a medicamentelor antimicrobiene deja existente i evitarea erorilor fcute n practica antibioticoterapiei. Dar, care sunt cele mai frecvente erori n folosirea antibioticelor? n primul rnd este incorect s ncepem un tratatament antibiotic fr s fi examinat clinic (complet) pacientul i fr s utilizm informaiile pe care le putem obine printr-o anamnez riguroas. Este incorect s indicm folosirea acestor medicamente n stri febrile n care exist 90

doar bnuiala unei infecii. Este incorect s decidem antibioticoterapia la ntmplare sau pe ncercate (cu o eventual eroare suplimentar reprezentat de schimbarea succesiv a antibioticului n raionamentul c poate de data aceasta va merge fr s ncercm s ne fundamentm decizia pe criterii raionale (cel puin pe criterii de probabilitate). Raionamente simpliste de tipul febr = infecie = antibiotice i chimioterapice (deseori ntlnite n practic, din pcate) nu pot conduce dect la eec, la modificarea evoluiei bolii i la mpiedicarea stabilirii ulterioare a diagnosticului (mascare clinic i bacteriologic) i tratamentului corect. Cu privire la criteriile de probabilitate este adevrat c n Romnia nu exist ghiduri i recomandri privind utilizarea corect a antibioticelor, bazate pe studii actuale, realizate pe eantioane reprezentative statistic pentru Romnia i n aceste condiii referina este reprezentat de studiile fcute n SUA sau n Europa de Vest i de manualul domnului profesor Mircea Angelescu (1998). n al doilea rnd este incorect s utilizm antibiotice fr a solicita, fr a obine i fr a interpreta corect datele de laborator. Indiferent de specialitate (medical, chirurgical) i indiferent de supra-specialitate este necesar cunoaterea i utilizarea corect a unor noiuni elementare de bacteriologie. Este absolut incorect s ncepem antibioticoterapia nainte de recoltarea produsului patologic. n funcie de contextul clinic i de gravitatea patologiei n cazul creia presupunem drept etiologie o infecie bacterian este recomandabil s solicitm i efectuarea unor examene paraclinice de baz (leucogram, VSH, radiografie, sumar de urin etc). Nu trebuie s uitm c atunci cnd suspicionm o infecie bacterian, indiferent de specialitate (aceste analize pot fi efectuate chiar i personal; ca alternativ trebuie s stabilim o foarte bun colaborare ntre clinic i laborator) avem la ndemn posibilitatea i necesitatea efecturii de preparate ntre lam i lamel (native) i frotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen, Giemsa etc.) din produsul obinut prin recoltare de la pacientul cu o presupus infecie bacterian. Realizarea i examinarea frotiurilor poate dura chiar i numai 5 minute, permind n scurt timp obinerea unui rezultat orientativ, uneori foarte important. Nu ar trebui s indicm tratamentul cu antibiotice fr a ine seama de sensibilitatea la antibiotice a germenului. n cazul unor infecii grave se poate ncepe antibioticoterapia, dup criterii de probabilitate. ns, n cazul n care produsul patologic a fost recoltat anterior, a fost transmis ctre laborator, a fost prelucrat iar agentul etiologic a fost identificat i s-a stabilit care este sensibilitatea la antibiotice i chimioterapice iar evoluia clinic i paraclinic nu este favorabil, demonstrnd c antibioticul ales nu a fost cel mai potrivit, pentru c avem rezultate de laborator vom putea schimba tratamentul, de aceast dat pe criterii tiinifice evitnd schimbri repetate i la ntmplare sau chiar inducerea unui prognostic rezervat pacientului supus tratamentului din clinica n care ne desfurm activitatea). Trebuie s nu greim i s lum n considerare drept ageni etiologici diferii germeni saprofii sau condiionat patogeni, cultivai din focare sau caviti septice deschise, sau izolai din produse contaminate n cursul recoltrii. O alt eroare ar fi ignorarea posibilitii ca germenul izolat s fie doar unul dintre cei 2 sau mai muli germeni implicai. nc din anul doi de studiu se obin primele date cu privire la toate aspectele descrise mai sus precum i cu privire la testarea sensibilitii la antibiotice (de ex. antibiograma), metod care nu trebuie interpretat mecanic, nu trebuie nici subestimat i nici supraevaluat (mai ales atunci cnd este efectuat difuzimetric i / sau nu este standardizat).

91

Aa cum am mai subliniat n cadrul acestui capitol, nu trebuie niciodat s absolutizm datele clinice, datele paraclinice, datele de laborator, luate fiecare n parte i scoase din contextul general. Nu exist o prioritate pentru clinic sau o prioritate pentru laborator; datele trebuie interpretate, integrate i utilizate n contextul clinic, paraclinic i de laborator general. Aceasta reprezint, dup opinia noastr, un aspect esenial al medicinii pe care dorim s o practicm la cel mai nalt nivel, n favoarea pacienilor pe care trebuie s i tratm. n al treilea rnd este incorect s prescriem fr justificare antibiotice i chimioterapice, spre ex. n stri febrile neinfecioase (maladii cu mecanism prin hipersensibilitate, maladii ale esutului colagen, neoplazii etc), n boli infecioase cu ageni patogeni care nu sunt sensibili la antibiotice (ex. este absurd s utilizm penicilin sau orice alt antibiotic antibacterian n tratamentul gripei). Este de subliniat c este incorect s indicm antibioterapia (i s ateptm ca indicaia noastr s aib efect curativ) n cazul unor supuraii colectate neglijnd i / sau temporiznd incizia i drenajul (antibioticul nu difuzeaz n focarul purulent; n plus, va fi inactivat la acest nivel). n al patrulea rnd, atunci cnd este necesar antibioterapia, este incorect s alegem eronat un antibiotic sau o asociere de antibiotice (n cazul n care aceast asociere este strict necesar), prin necunoaterea sau nerespectarea spectrului antimicrobian, prin nefolosirea antibioticului de elecie (ex. folosirea augmentinului sau cloramfenicolului sau tetraciclinei n angina streptococic la pacientul care nu prezint hipersensibilizare la penicilin), prin utilizarea de antibiotice nedifuzibile n focar (infecia urinar nu se poate trata cu cloramfenicol deoarece cloramfenicolul se elimin prin bil sau prin urin sub form de metabolit inactiv). n plus nu trebuie s uitm faptul c lucrm cu bolnavi i nu cu boli i n acest sens pentru un anume pacient pot exista anumite contraindicaii specifice (ex. hipersensibilizare fa de antibioticul pe care dorim s l utilizm, cu posibilitatea apariiei unui oc anafilactic). Este incorect s indicm asocierea antibioticelor antagoniste din punct de vedere al mecanismului (ex. penicilin G + tetraciclin) sau s indicm asocierea de antibiotice cu acelai spectru (eroare poate fi dramatic n cazul asocierii a dou aminoglicozide sau a dou antibiotice cu spectru larg). Primul exemplu a fost ales pentru a atrage atenia privind eroarea de a asocia antibiotice care pot da reacii adverse serioase (ex. afectarea pn la determinarea apariiei surditii prin afectarea nervului acustico-vestibular), reacie de notorietate n cazul aminoglicozidelor (streptomicin, kanamicin, gentamicin, amikacin etc.). n al cincilea rnd, este incorect s indicm din start antibiotice i chimioterapice ntr-un aazis scop profilactic. Spre ex. n cazul n care pacientul prezint un panariiu la degetul inelar singura atitudine corect este de realiza incizia, drenajul, antiseptizarea i pansarea local, vindecarea urmnd a se produce; nu este necesar ci este chiar contraindicat s recomandm administrarea de antibiotice i chimioterapice. nc din primii ani de studenie se poate reine faptul c, n principiu, utilizarea antibioticelor n scop profilactic trebuie privit cu rezerve serioase. Pe de alt parte, trebuie cunoscute situaiile n care antibioticoprofilaxia este util i recomandabil (de ex. nainte i dup efectuarea unei extrageri dentare, manevr sngernd, la un pacient care are stenoz mitral).

92

n al aselea rnd, este incorect s nu studiem i s nu acumulm cunotinele necesare de microbiologie, farmacologie, fiziopatologie, semiologie medical, medicin intern, chirurgie etc. care contribuie la evitarea erorilor n conducerea tratamentului sau / i greelilor n tehnica de administrare; cunotinele acumulate ne permit s avem n vedere posibilele reacii adverse i s evitm situaii care pot deveni dramatice. Circulaia substanelor antimicrobiene n organism din momentul resorbiei i pn n momentul eliminrii (farmacocinetica substanelor antimicrobiene) trebuie cunoscut att pentru evaluarea efectului terapeutic ct i pentru prevenirea acumulrii i apariiei fenomenelor toxice (de ex. vom indica substane antimicrobiene la pacieni cu insuficien renal numai n condiiile monitorizrii valorii creatinei i creatininei sanguine, a ureei sanguine, a ratei de filtrare glomerulare, a ionogramei i a sedimentului urinar). Exist anumite caracteristici farmacocinetice pentru fiecare substan antimicrobian. Datele farmacocinetice condiioneaz biodisponibilitatea medicamentului n cazul concret al bolnavului tratat. Aceste proprieti caracteristice privesc absorbia de la locul de administrare, difuziunea n organism (esuturi i fluide), metabolizarea substanei n organism, eliminarea (ci i forme de eliminare) etc. Dup mecanismul patogenic reaciile adverse la antibiotice i chimioterapice ar putea fi reprezentate de: a. efecte toxice directe, la locul administrrii (fenomene iritative, flebite etc.), sau la distan (hepatice, renale, hemopoietice etc.); b. reacii de hipersensibilizare (erupii, oc anafilactic etc.) i c. efecte secundare (dismicrobisme de ex. prin utilizarea antibioticelor cu spectru larg, inducerea de suprainfecii, reacii autoimune etc.). n al aptelea rnd, este incorect ca atunci cnd avem un dubiu cu privire la decizia pe care urmeaz s o lum s nu ne consultm cu ali colegi, pentru a alege ntotdeauna cea mai bun variant posibil. Considerm c tria este atunci cnd ne recunoatem limitele i nu atunci cnd ncercm s demonstrm c acestea nu ar exista.

6. 8. Povestiri adevrate 6. 8. 1. Gentamicina administrat n aerosoli Datorit conjuncturii actuale internaionale, s-a concluzionat c probabilitatea unui atac terorist cu arme biologice este din ce n ce mai mare. Avnd n vedere c prevenirea poate fi o mai bun form de aprare, specialitii occidentali au hotrt s pun la punct un program naional de protecie anti-bioterorism. n Statele Unite, acest program poart numele de BioShield. Iniial au fost identificate structurile microbiene sau tulpinile care ar putea fi utilizate n cazul unui atac biologic, cele mai importante fiind: toxina botulinic, Bacillus anthracis, virusurile febrei hemoragice, Yersinia pestis, Francisella tularensis i virusul variolic. n afar de identificarea problemelor poteniale a fost necesar gsirea soluiilor de prevenire / control / combatere. n cadrul acestui capitol vom discuta numai subiectul legat de un antibiotic cunoscut, dar condiionat ntr-o form special, prezentnd astfel o serie de avantaje. Gentamicina i respectiv mecanismul de aciune al acesteia sunt elucidate. Condiionarea n aa fel nct administrarea s poate fi fcut pe care inhalatorie prezint o serie de avantaje, spre exemplu: 93

a. eliberare mai rapid; b. biodisponibilitate mai bun; c. remanen mai bun; d. posibilitate de dozare mai bun; e. capacitatea de a ajunge mai uor i mai direct la nivelul organelor afectate. Att n cazul tularemiei ct i n cazul pestei, formele pulmonare sunt cele mai grave, cu cea mai mare mortalitate i cu cea mai mare contagiozitate, cu alte cuvinte tratamentul acestor forme de boal reprezint o prioritate. Avnd n vedere toate aceste meniuni, gentamicina administrat pe cale inhalatorie trebuie avut n vedere att pentru tratament ct i pentru profilaxia post-expunere n cazul unui atac bioterorist. Aceste studii sunt foarte recente iar informaiile au devenit disponibile n ultima parte a anului 2007. 6. 8. 2. A da sau a nu da aceasta este intrebarea! Cnd administrm antibiotic? Mai ales c, spre exemplu, administrarea unui antibiotic adecvat la pacienii cu sepsis diminu mortalitatea ntr-un procent semnificativ cu ct se face mai precoce (de ordinul orelor). Aadar, administrarea de urgen a unui antibiotic depinde de capacitatea de a recunoate bolnavul critic. Legarea ulterioar de etiologia infecioas a strii critice nu face dect s confirme decizia. Dac va fi incriminat, ulterior, o alt etiologie a strii critice (IMA, pancreatita acut, HDS cu oc etc) oprirea antibioticului nu afecteaz n sens negativ evoluia, aa cum ar fi fost afectat de ntrzierea administrrii acestuia. La vrstnici, infecia urinar poate fi frecvent o cauz de sepsis. La un pacient vrstnic, febril, cu hipotensiune, cu imagine EKG nespecific pentru un IMA (posibil in primele ore), ateptm chiar i 4 ore fr s administrm antibiotic, pn la elucidarea modificrilor EKG, dar dac sursa hipotensiunii era un sepsis cu punct de plecare renal, sau altul, atunci mortalitatea poate crete de la simplu la dublu (17%-30%). La pacientul care nu e critic, se pot monitoriza semnele clinice i se poate atepta cu administrarea antibioticului pn la determinarea posibilei etiologii infecioase. Dar pe de alt parte nu trebuie s uitm c nimeni nu ne oprete, indiferent de decizia care va fi luat, s recoltm snge pentru hemoculturi, urin pentru uroculturi sau alte produse, care pot fi trimise ctre laborator nainte de nceperea tratamentului antibiotic. 6. 8. 3. S-a ntmplat nu demult n Romnia ... V aducem la cunotin cazul pacientei n vrst de 21 de ani, care s-a prezentat la medic pentru o plag tiat la nivelul falangei distale a policelui minii stngi. Pacienta se tiase n marginea unei conserve pe care o desfcuse de curnd. Plaga era n aparen profund i secionase coronar pulpa degetului ptrunznd i n patul unghial. Sngerarea abundent i ndelungat a plgii, dar i durerea pulsatil la nivelul policelui, aprut dup aproximativ o or, au fost motivele prezentrii la medic. Pacienta a menionat faptul c acas a aplicat ap oxigenat pe plag (a procedat corect, fiindc apa oxigenat, prin efectul de spumare, antreneaz cheagurile de snge i resturile anorganice de la nivelul leziunii, dar realizeaz i o uoar hemostaz, oxigennd totodat plaga i prevenind astfel dezvoltarea germenilor anaerobi). De asemenea, a aplicat local un antibiotic sub form de pulbere (ceea ce nu este la fel de corect). La spital, din cauza durerii intense care a cuprins ntre timp ntreaga mn pn la articulaia pumnului, medicul a evitat aplicarea unui prinit alcoolizat, realiznd hemostaza plgii i efectund n continuare toaletarea marginilor i interiorului acesteia, aplicnd i ap oxigenat. 94

Leziunea s-a dovedit a fi minor i n mod cert nu necesita suturare. Totui, medicul curant cunotea faptul c pacienta este student la facultatea de medicin i studiind n diferite spitale, lua aproape zilnic contact cu bolnavii, cu echipamentul medical, dar i cu celelalte cadre medicale. n mediul spitalicesc, att pacienii ct i membrii personalului sanitar se pot infecta dac exist soluii de continuitate i dac nu se respect msurile de prevenire i control. n acest context, medicul i-a propus pacientei iniierea unei antibioterapii cu oxacilin (menionnd c stafilococul alb i auriu rspund bine), timp de cinci zile, pentru a preveni apariia unei infecii piogene a degetului. Un motiv de ngrijorare l constituia durerea chinuitoare, pulsatil la nivelul minii (apare de obicei ca un fenomen nsoitor pentru un panariiu subcutanat pulpar, ns abia dup 24 - 48 de ore; n cazul de fa durerea s-a instalat la o or de la lezarea zonei). Dei iniial reticent la ideea de a lua antibiotice n scop profilactic, pacienta a acceptat, convins de ctre medic c riscul apariiei unei infecii era mare. A doua zi, sftuindu-se cu un medic din universitate, pacienta a cntrit mai bine acest risc, ajungnd la concluzia c antibioterapia pe care o urma nu era nici pe departe necesar. Medicul de la spital a tratat leziunea ca pe o plag chirurgical pentru care antibioterapia ar fi putut s fie instituit n scop profilactic (nainte de realizarea contaminrii plgii) sau metafilactic (n contextul unei inoculri bacteriene prezumtive). O alt eroare, de aceast dat a pacientei, a fost aplicarea local de pulbere antimicrobian imediat dup lezarea zonei. Evident c riscul apariiei unei infecii exista, la fel ca i n povestea drobului de sare. Pacienta a decis s urmeze antibioterapia timp de trei zile n loc de cele cinci recomandate; evoluia a fost favorabil, iar plaga s-a cicatrizat fr complicaii. Suntem convini c acest lucru a fost posibil nu datorit antibioticelor administrate, ci datorit faptului c leziunea a fost minor, precum i datorit capacitii de rspuns a organismului. Pacienta a decis ca pe viitor, n situaii similare, s analizeze mai atent beneficiile i riscurile administrrii de antibiotice, acest caz constituind un elocvent contra-exemplu. n concluzie, chiar dac fenomenul apariiei rezistenei la antibiotice este bine cunoscut i neles, iat c n Romnia anului 2007 nc se mai prescriu antibiotice pentru orice zgaib! 6. 8. 4. Antibiotice folosite ca biostimulante Nu doar fiinele umane sunt supuse uzului iraional al antibioticelor, ci i animalele de ferm. Situaiile de necesitate, n care acestea chiar sunt bolnave, reprezint numai o mic parte din totalul situaiilor n care le sunt administrate antibiotice. n majoritatea cazurilor, medicamentele antimicrobiene sunt introduse n doze mici n hrana sau apa lor pentru efectul biostimulant. nc din anii 40, antibioticele au nceput s fie folosite n fermele din toat lumea pentru capacitatea de a determina o cretere mai rapid n greutate a animalelor. O alt consecin este c acestea devin adevrate rezervoare de germeni rezisteni, care pot fi apoi transferai omului. Producia de carne crete spre beneficiul ctorva productori, dar crete concomitent i ponderea bacteriilor rezistente la antibiotice, n dauna sntii unei lumi ntregi. n UE, de la 1 ianuarie 2006 a intrat n vigoare o directiv a Comisiei Europene, care interzice folosirea antibioticelor n scop biostimulant. Lista antibioticelor utilizate n alt scop dect cel terapeutic s-a micorat treptat, de la an la an, pentru ca n 2006 responsabilii europeni, pe deplin convini de concluziile cercettorilor n domeniul microbiologiei, s le interzic complet.

95

Fenomenul rezistenei microbiene la antibiotice are o istorie aproape la fel de lung ca i cea a antibioticelor. n discursul rostit cu ocazia primirii Premiului Nobel, Alexander Fleming avertiza n legtur cu uurina cu care pot fi produse microorganisme rezistente la invenia sa penicilina. Nu este nevoie de altceva dect ca acestea s fie expuse la doze mai mici dect doza bactericid. Aceasta se ntmpla n 1945. Foarte curnd temerile sale s-au adeverit, ncepnd s apar primele tulpini rezistente. n 2009 s-a dovedit clar transmiterea de la animal la om a unui germen redutabil - stafilococul auriu rezistent la meticilin (MRSA). Aadar, n condiiile eforturilor pentru prevenirea apariiei i rspndirii germenilor rezisteni, sistarea abuzului de antibiotice n ferme ar trebui s se gseasc n lista de prioriti. (11) 6. 8. 5. Antibiotice fr reet? Tot n 2009 civa cercettori s-au adunat i au avut ca scop verificarea numrului de site-uri care ofer antibiotice fr reet. Cu ajutorul motoarelor de cutare Google i Yahoo au gsit 138 de astfel de site-uri. Dintre acestea, 36,2% vindeau antibiotice fr reet iar 63,8% ofereau o reet online. Penicilinele erau disponibile pe 94,2% din aceste site-uri, macrolidele pe 96,4%, fluoroquinolonele pe 61,6% iar cefalosporinele pe 56,5%. 98,6% exportau spre SUA. Rezultatele descrise n acest studiu sugereaz c exist o surs mare de antibiotice n SUA care nu este afectat de iniiativele legate de schimbarea prescrierii antibioticelor i care poate contribui la extinderea rezistenei la antibiotice i chimioterapice. Comunitatea medical mpreun cu instituiile de sntate public i companiile farmaceutice trebuie s-i extind eforturile pentru a controla rezistena la antibiotice. n timpul anamnezei medicul poate oferi informaii legate de antibiotice, rezistena la antibiotice i posibilele interaciuni ntre antibiotice. Pacienii au nevoie s fie educai n acest sens! (12) 6. 8. 6. i care s fie soluia? n SUA i UK se estimeaz c un foarte mare procent din infeciile nosocomiale cu S. aureus este produs de tulpini meticilino-rezistente (MRSA) i o bun parte sunt MDR. O mai mic parte din aceste tulpini (i totui numrul este n cretere) prezint nivele joase de rezisten la vancomicin. S-au descoperit noi antibiotice care pot fi utilizate n tratamentul MRSA i chiar i a tulpinilor rezistente la vancomicina (ex. daptomicina) dar nu o s treac mult timp pn se va dezvolta rezistena i la ele. Este o soluie inventarea continu de noi antibiotice? Unele tulpini de E. coli (una din cauzele comune de ITU) sunt rezistente la antibiotice din ase clase diferite incluznd cele mai nou recomandate, fluoroquinolonele. Mai mult dect att, n sudul Asiei i n China, 60-70% E. coli sunt rezistente la fluoroquinolone. (13) Aa c rmne ntrebarea - ce este de fcut? Sau mai bine zis, ce va face cititorul dup ce va citi aceste rnduri? Care este atitudinea pe care o va adopta medicul curant, studentul viitor medic sau omul care dorete pur i simplu s se informeze? Am avea o propunere: n cazul n care nu va reui s nvee sau s aplice noiunile nvate secundum arte, mcar s nu participe la implementarea n practic a celor mai frecvente erori n utilizarea antibioticelor i chimioterapicelor.

96

6. 9. Direcii de cercetare Vom prezenta mai jos cteva dintre direciile de cercetare actual pe care cititorul le poate evalua deschiznd urmtoarele link-uri: -Predicting resistance mutations using protein design algorithms http://www.pnas.org/content/107/31/13707.full -Rapid molecular detection of Tuberculosis and Rifampin resistance http://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMoa0907847 - Antibiotics Are Not Automatic AnymoreThe French National Campaign To Cut Antibiotic Overuse http://www.plosmedicine.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pmed.1000080 - Significant Reduction of Antibiotic Use in the Community after a Nationwide Campaign in France, 20022007 http://www.plosmedicine.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pmed.1000084 - Prevalence and Antimicrobial Resistance Pattern of Bacterial Meningitis in Egypt http://www.medscape.com/viewarticle/715718 - Global Health Advocates Call for Renewed Focus on Drug Resistance http://www.medscape.com/viewarticle/727041 - CDC Issues Plan to Combat Extensively Drug-Resistant Tuberculosis http://www.medscape.com/viewarticle/588332 - New Drugs and New Regimens for the Treatment of Tuberculosis: Review of the Drug Development Pipeline and Implications for National Programmes http://www.medscape.com/viewarticle/720268 - ID Society Calls for 10 New Antimicrobials by 2020 http://www.medscape.com/viewarticle/718786 -Despre antibiotice, rezistenta si testarea sensibilitatii http://wwwn.cdc.gov/dls/master/ams/intro/open.swf -Institutul National de Alergie si Boli Infectioase http://www.niaid.nih.gov/topics/antimicrobialresistance/Pages/default.aspx -European Antibiotic Awareness Day http://ecdc.europa.eu/en/eaad/Pages/Home.aspx - Alliance for the prudent use of antibiotics (a se citi si actiunile intreprinse in Romania si planurile lor de viitor) http://www.tufts.edu/med/apua/index.shtml -Antibiotics for the prevention of malaria, http://www.mpg.de/english/illustrationsDocumentation/documentation/pressReleases/2010/p ressRelease20100721/index.html

6. 10. Evaluarea cunotinelor Alegei rspunsul corect 1. Neutralizeaz aciunea unei clase de antibiotice: 97

A. nucleul betalactam B. nucleul carbapenem C. betalactaminele D. betalactamazele E. inhibitorii de betalactamaze 2. Au/Are efect bactericid: A. cefalosporinele B. tetraciclinele C. sulfonamidele D. cloramfenicolul E. eritromicina 3. Inhib sinteza peretelui celular: A. macrolidele B. tetraciclinele C. cloramfenicolul D. sulfonamidele E. penicilinele 4. n cazul rezistenei extracromozomiale, transmiterea materialului genetic NU se poate realiza prin: A. transducie B. transformare C. mutaie spontan D. conjugare E. transpoziie 5. NU se obinuiete administrarea de antibiotice bactericide la pacienii cu: A. cancer B. SIDA C. politraumatisme D. proteze valvulare E. grip

Bibliografie Liu B, Pop M, 2009, ARDB Antibiotic Resistance Genes Database, Nucleic Acid Res., 37, D443-D447 Demain AL, Sanchez S, 2009, Microbial drug discovery: 80 years of progress, J. Antibiotics, 62, 5-16 (e 16) Davies J, Davies D, 2010, Origins and Evolution of Antibiotic Resistance, Microbiol. and Molecul. Biol. Rev., 74, 417-433 98

DeNoon DJ, 2010, Extremely Drug-Resistant Infections Spreading Fast, Medscape (http://www.medscape.com/viewarticle/726857) Auwaerter PG, 2010, New Antibiotic Resistance Gene NDM-1: A Worrisome Peek Into the Future?, Medscape (http://www.medscape.com/viewarticle/728039) Kelland K, Hirschler B, 2010, New Superbugs Are Spreading From India, Medscape (http://www.medscape.com/viewarticle/726720) Goodman A, 2010, NDM-1 Gene Spreading to Multiple Bacteria Species, Making Them Antibiotic-Resistant, Medscape (http://www.medscape.com/viewarticle/729202) Kristinsson KG, Monnet DL, 2008, Increasing Multidrug Resistance and Limited Treatment Options: Situation and Initiatives in Europe, Eurosurveillance, 13 Henderson KL, Mller-Pebody B, Johnson AP, Goossens H, Sharland M, 2009, First set-up meeting for Antibiotic Resistance and Prescribing in European Children (ARPEC), Eurosurveillance ***, CDC, 2001 Public Health Action Plan, http://www.cdc.gov/drugresistance/actionplan/actionPlan.html Smith TC, Male MJ, Harper AL, Kroeger JS, Tinkler GP, Moritz ED, Capuano AW, Herwaldt LA, Diekema DJ, 2009, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strain ST398 is present in midwestern U.S. swine and swine workers., Epub, 4(1), e4258, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19145257) Mainous AG, Everett CJ, Post RE, Diaz VA, Hueston WJ, 2009, Availability of Antibiotics for Purchase Without a Prescription on the Internet, Annals of Family Medicine, 7(5), 431435(http://www.medscape.com/viewarticle/710060) Levy SB, Marshall B, 2004, Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses, Nature Medicine Sup., 10, S122-S129

99

7. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice

Testarea sensibilitii la medicamentele antimicrobiene se realizeaz (din punct de vedere didactic) n ultima etap a diagnosticului de laborator microbiologic, pentru majoritatea microorganismelor implicate etiologic. Testarea este necesar datorit apariiei i extinderii rezistenei microorganismelor la antibiotice i chimioterapice. Rezistena poate fi natural sau dobndit. Rezistena natural este determinat genetic. Rezistena dobndit este achiziionat de anumite subpopulaii dintr-o anumit specie microbian, n circumstane date, ex. prin presiunea de selecie exercitat de antibiotic. Noiuni privind evaluarea sensibilitii la ageni antimicrobieni n general, o tulpin poate fi considerat sensibil atunci cnd germenii sunt n mod eficient afectai de ctre antibiotic, iar efectul terapeutic poate fi obinut cu doze i pe ci de administrare obinuite. Tulpina va fi considerat moderat sensibil dac germenii sunt afectai ntr-o msur mai mic, iar efectul terapeutic nu poate fi obinut dect n condiii speciale (ex. prescrierea unor doze mai mari dect cele obinuite, calculate de exemplu pe kilogram/corp; utilizarea unor ci de administrare speciale injectare intravenoas, intrarahidian etc) (Figura nr. 1, Figura nr.2). n mod absolut se consider c o tulpin este rezistent dac rezultatul testrii sensibilitii in vitro este negativ. Totui, trebuie s avem n vedere c ntre rezultatele in vitro i efectul in vivo pot exista diferene. 7. 1. Metode de testare a sensibilitii bacteriilor la ageni antimicrobieni Deoarece ntre rezultatele testrii in vitro i efectul terapeutic in vivo pot exista anumite diferene, metodele de testare a sensibilitii pot fi difereniate n: a. metode de testare a sensibilitii in vitro; b. metode in vivo (metode care in cont de relaia agent terapeutic-infecie). 7. 1. 1. Metode de testare a sensibilitii in vitro Antibiograma face parte din prima categorie de metode menionate. Reprezint metoda de laborator prin care se apreciaz sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltai de la bolnavii cu infecii bacteriene, dup cultivare pe medii mbogite, care s permit dezvoltarea optim a microorganismului pentru care se efectueaz testarea (de exemplu pe agar Mueller-Hinton). Pentru antibiograme trebuie s folosim culturi pure (reprezentnd o singur tulpin bacterian), chiar n cazul infeciilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt: Tehnicile calitative o antibiograma difuzimetric comun (cu discuri) o antibiograma difuzimetric comparativ o antibiograma difuzimetric standardizat o antibiogramele difuzimetrice rapide Tehnicile cantitative o metoda diluiilor n mediu lichid o metoda diluiilor n agar o metoda microdiluiilor n agar o metoda punctelor de ruptur 100

o testul E o metode i sisteme comerciale, automatizate, de testare etc. 7. 1. 1. 1. Antibiograma difuzimetric comun Din punct de vedere tehnic nsmnm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar MuellerHinton) turnat n plci Petri. nsmnarea se poate realiza de exemplu prin inundarea plcii urmat de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (exist i alte variante tehnice). Dup circa 20 minute (timp n care placa Petri se las cu capacul ntredeschis n vecintatea becului de gaz, aprins) se aplic microcomprimatele n care sunt ncorporate antibiotice n concentraie standardizat. Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, n condiii aseptice, sau cu ajutorul unui aplicator automat (la minim 30 mm distan ntre ele i minim 15 mm de marginea plcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o plac Petri cu diametrul de 9 cm). Microcomprimatele trebuie s vin n contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul unei pense le presm uor (dup caz). Dup nc 15-20 minute, incubm plcile peste noapte n termostat, la 28 sau 35-37C, n funcie de temperatura optim de multiplicare a microorganismului testat. Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzeaz n mediu, realiznd zone de inhibiie n care coloniile microbiene nu se dezvolt (Figura nr. 3). Cu ct zona de inhibiie este mai larg, cu att germenul va fi considerat mai sensibil. Dac n interiorul zonei de inhibiie (chiar dac diametrul nregistrat este foarte mare) se dezvolt colonii, mutani rezisteni, germenul va fi considerat rezistent (Figura nr. 4). Aceast metod, cu toate c este folosit pe scar larg n laboratoare, permite de fapt numai eliminarea antibioticelor complet inactive i eventual selecionarea antibioticelor foarte active, pentru c tehnica nu este standardizat. 7. 1. 1. 2. Antibiograma difuzimetric comparativ (Stokes, Bal) Se efectueaz pentru microorganismul de testat n paralel cu un microorganism de referin, din aceeai specie (sau o specie asemntoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram-pozitivi putem alege pentru comparaie o tulpin de Staphylococcus spp. Tulpina de referin are o sensibilitate cunoscut la diferitele antibiotice pe care le utilizm. Prin aceast metod se nltur o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru microorganismul de referin i pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprim cu termenii: sensibil, intermediar, rezistent, n funcie de diametrul zonelor de inhibiie a multiplicrii celor doi germeni, fa de acelai antibiotic (jumtile de cerc se examineaz comparativ). n cazul n care cunoatem CMI (concentraia minim inhibitorie) a microorganismului de referin, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru microorganismul testat. Din punct de vedere tehnic, pe o plac de forma unui ptrat (mprit n 3 zone egale marcnd pe partea extern a plcii liniile de demarcaie) se inoculeaz n treimea medie microorganismul de referin iar n treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru care dorim s realizm testarea. Inoculul trebuie s fie astfel realizat nct s conduc la apariia dup incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care s nu fie confluente. Plasm microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaie dintre culturi. Incubm peste noapte la 35-37C urmnd ca n ziua urmtoare s citim i s interpretm rezultatele. (Figura nr. 5) 101

7. 1. 1. 3. Antibiograma difuzimetric standardizat (Kirby-Bauer, NCCLS) Din punct de vedere tehnic se realizeaz asemntor cu prima metod prezentat, dar este standardizat, fiind singura metod difuzimetric recunoscut pe plan internaional, care permite obinerea unor rezultate reproductibile i corelabile ntre laboratoare diferite (Film nr. 1). Elementele necesare standardizrii sunt: mediul (n majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru c are o valoare nutritiv corespunztoare i nu conine substane cu aciune inhibitoare) o exist elemente minerale care trebuie adugate n cazul testrii anumitor microorganisme (ex. Mg2+ i Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci cnd este testat sensibilitatea la aminoglicozide); o se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins ntre 7,2 i 7,4); o exist suplimente nutritive care trebuie adugate n cazul testrii unor microorganisme pretenioase; o grosimea mediului trebuie s fie de 4 mm (25 ml de mediu/plac de 9 cm); inoculul, care se obine de preferat din 5 colonii izolate (cultur pur) i trebuie s aib o turbiditate corespunztoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 108 uniti formatoare de colonii/ml) n majoritatea cazurilor; timpul de incubare (n majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37C, nu mai mult de 2-3 plci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare; concentraia substanelor antimicrobiene din microcomprimate i dimensiunea microcomprimatelor (6 mm diametru); alegerea substanelor antimicrobiene pentru care se face testarea; pstrarea plcilor cu mediu pn n momentul utilizrii (maxim 7 zile, n pungi de polietilen, la +4C); utilizarea tulpinilor de referin pentru controlul de calitate; interpretarea rezultatelor (se msoar diametrul zonei de inhibiie i se compar rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziie de productori i/sau centrele de referin). Metodele difuzimetrice au dezavantajul c nu permit aprecierea concentraiilor eficace ale antibioticului la nivelul focarului infecios. 7. 1. 1. 4. Metoda diluiilor n mediu lichid Acest tip de metod ofer informaii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate, fa de microorganismul testat. CMI = concentraia minim inhibitorie, reprezint cea mai mic concentraie de agent antimicrobian, exprimat n micrograme/ml, care mai exercit o aciune bacteriostatic asupra germenului testat. Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu bulion Mueller-Hinton n concentraii descrescnde (diluii binare) pornind spre ex. de la 16 micrograme/ml i pn la 0,125 micrograme/ml, n total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor, fr antibiotic (cantitatea final va fi de 1 ml n fiecare tub). Preparm un inocul standardizat turbidimetric i n condiii aseptice inoculm toate cele 10 tuburi cu cte 1 ml de inocul. Agitm pentru a omogeniza. Incubm cele 8 tuburi cu antibiotice i 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37C iar al doilea tub martor l meninem pentru aceeai perioad la temperatura frigiderului

102

(Figura nr. 6). Pentru controlul de calitate utilizm i un ir de tuburi pe care le inoculm cu o tulpin de referin corespunztoare. n ziua urmtoare citim i interpretm rezultatele. Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egal cu cantitatea de mediu, concentraia final de antibiotic se va njumti (de ex. n tubul n care diluia iniial a fost de 16 mg/ml, diluia final va fi 8 mg/ml etc.). n tubul martor meninut la +4C ar trebui s nu fie prezent creterea, n tubul martor meninut la 35-37C creterea trebuie s fie prezent (Figura nr. 7). n tuburile inoculate cu tulpina de referin trebuie s avem rezultatul corespunztor datelor pe care le cunoatem privitor la respectiva tulpin. n tuburile cu microorganismul testat, ultima diluie care a inhibat dezvoltarea microorganismului corespunde CMI. Se consider (n general, pentru c CMI difer n funcie de specia microbian) c microorganismele n cazul crora CMI este 3 mg/ml vor fi eficient inhibate de ctre antibioticul respectiv i in vivo. CMI nu are aceeai valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la amoxicilin n cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus aureus, 0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentru Haemophilus influenzae, 2 mg/ml pentru E. coli, 16 mg ml (i practic aceasta semnific rezisten in vivo) pentru Bacteroides fragilis iar n cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa sau Chlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente. 7. 1. 1. 5. Determinarea CMB (concentraia minim bactericid) Pornind de la rezultatul obinut prin metoda diluiilor n mediu lichid, se vor utiliza ca surs de inocul tuburile n care dezvoltarea microbian a fost inhibat (Figura nr. 8). Este necesar o plac Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi mprit n sectoare, numrul de sectoare fiind corespunztor numrului de tuburi fr cretere microbian. nsmnm n condiii aseptice din fiecare tub fr cretere microbian, fiecare n sectorul de plac corespunztor (Figura nr. 9). Incubm pentru 16-18 ore la 35-37C. CMB va corespunde ultimei concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele nsmnate (sectoare de plac fr apariia culturii) (Figura nr. 10). Se consider c antibioticul va fi eficient in vivo dac n serul pacientului se pot atinge concentraii de antibiotic care s depeasc de 4-8 ori CMB. Determinarea CMI i CMB este extrem de important pentru aprecierea eficacitii antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infeciilor severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc), precum i la imunodeprimai, efectuarea acestei metode este indispensabil. 7. 1. 1. 6. Metoda punctelor de ruptur (breakpoints) Metoda este folosit n laboratoarele moderne de microbiologie i este utilizat pentru a defini sensibilitatea i rezistena la antibiotice. Depinznd de metoda de testare rezultatele sunt exprimate sub forma unei concentraii (mg/l sau g/ml) sau sub forma unui diametru (mm). (1) Metoda este practicat de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales dac volumul de munc este mare sau foarte mare. Prin aceast metod se pot testa mai multe microorganisme, n acelai timp. Antibioticele sunt incorporate n mediul de cultur, la o anumit concentraie limit, n funcie de cunotinele i datele acumulate n ceea ce privete activitatea in vivo a respectivelor medicamente. Plcile sunt inoculate simultan cu mai multe tulpini bacteriene, n spot, folosind un inoculator construit special, sunt incubate n condiii corespunztoare pentru 16-18 ore. n cazul n care tulpina sau tulpinile din diferitele specii 103

bacteriene nu se dezvolt la aceast concentraie limit de antibiotic (considerat ca fiind eficace in vivo), bacteria izolat este considerat sensibil. n cazul n care bacteria se dezvolt (apare cultur bacterian), bacteria izolat este considerat rezistent. Aceast concentraie limit (breakpoint) trebuie setat n funcie de urmtoarele date: distribuia CMI, evaluarea raportului PK/PD (farmacocinetic/farmacodinamic) i rezultatele obinute n clinic n tratamentul pacienilor. PD reprezint studiul efectelor medicamentului de-a lungul timpului i este n strns legtur cu PK care reprezint modificrile concentraiilor medicamentului n timp. Punctele de ruptur trebuie stabilite nainte ca un antibiotic s fie folosit n clinic i trebuie s fie revzute cnd apar cazuri de rezisten la antibiotice. Totui setarea de puncte de ruptur nu este perfect. Metoda este util i n realizarea unor studii epidemiologice n ceea ce privete modificarea rezistenei la antibiotice n anumite zone geografice. (1-2) 7. 1. 1. 7. Testul E; Determinarea CMI prin E test E test reprezint o metod de testare in vitro a sensibilitii la antibiotice pentru diferite microorganisme, inclusiv pentru bacteriile pretenioase i germenii anaerobi. E test se aseamn metodei diluiei n agar combinnd principiile metodei difuzimetrice cu cele de diluie. E test este uor de utilizat i spre deosebire de metoda difuzimetric permite determinarea valorii CMI. (3) Din punct de vedere tehnic sunt necesare: o plac Petri cu agar Mueller-Hinton, inoculul standardizat i langhetele din plastic pe care au fost fixate antibiotice n gradient, de ex. la un capt 256 mg/ml ajungnd la cellalt capt la 0,016 mg/ml (cte o langhet pentru fiecare antibiotic, cte 15 diluii marcate pe fiecare langhet). nsmnm microorganismul care urmeaz a fi testat n condiii standardizate i depunem radiar langhetele cu antibiotice (Figura nr. 11 - Aplicarea benzii E-test pe suprafaa mediului de cultur; Film nr. 2). Principiu: Asemntor metodei difuzimetrice, E test necesit un inocul bacterian ajustat ca turbiditate (standardizat), ce urmeaz a fi depus pe mediul de cultur potrivit microorganismului studiat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloz-snge etc), n plci Petri. Benzile E test conin un gradient de agent antimicrobian i se aplic dup nsmnare. n funcie de antibiotic, gradientul acoper un ir continuu de concentraii ntre 0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,0641024 mg/ml. Dup incubare (timp de 16-18 ore la 35-37C) se formeaz o zon eliptic de inhibiie. Valoarea CMI se citete acolo unde creterea bacterian intersecteaz banda E test (Figura nr. 12 ). Materiale i reactivi necesari: plci Petri cu agar Mueller-Hinton (pstrate la 2-8C pn n momentul utilizrii); bulion Mueller-Hinton (cu 20-25 mg Ca2+ i 10-12,5 mg Mg2+/litru; se repartizeaz cte 5 ml n tuburi sterile cu capac; se pstreaz la 2-8C); medii de cultur pentru meninerea n stare viabil a tulpinilor bacteriene necesare efecturii controlului de calitate ; tulpini martor; inocul bacterian; soluie salin steril (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea inoculului bacterian;

104

 benzi E test (a. cu ageni antimicrobieni cu nucleu lactam, b. cu ali ageni antimicrobieni); se pstreaz n congelator la -20C pn n momentul utilizrii (Figurile nr. 1314. Modul de prezentare a benzilor E-test); au o durat de utilizare de 1-2 ani (pentru prima grup) i respectiv de 2-3 ani tampoane sterile; standard de turbiditate McFarland de 0,5 i 1,0; pipete Pasteur sterile; foarfece; plci Petri sterile cu diametrul de 90 mm i respectiv de 150 mm; incubator cu atmosfer obinuit reglat la 34-35C; incubarea n atmosfer mbogit cu CO2 este necesar n cazul testrii anumitor microorganisme; surs de lumin; aplicator E testi band adeziv (opional). Tehnica de lucru (Film nr. 2): A. Benzile E test scoatem plcile cu mediul de cultur i benzile E testdin congelator, le lsm la temperatura camerei pentru echilibrare termic timp de 20 minute sau pn cnd nu mai observm nici o urm de umezeal nainte de a deschide folia care include benzile, inspectm pentru a observa dac exist perforri; dac folia respectiv nu este intact, atunci benzile din interiorul ei nu se mai pot folosi; dac nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai nti tiem cu o foarfec de-a lungul liniei ntrerupte apoi ntre compartimentele ce conin benzile scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete i le punem n plci Petri sterile; apoi le putem aplica pe mediul de cultur care conine inoculul microbian de testat pstrm restul benzilor n tuburi n care introducem o substan desicant pentru a le proteja fa de umezeal; este necesar protecia i fa de cldur i expunerea direct la lumin (punem tuburile n congelator, la -20C) B. Inoculul bacterian: cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferm mai multe colonii dintr-o cultur bacterian de 18-24 de ore ntr-un tub cu soluie salin steril sau bulion; omogenizm (exist i varianta s transferm mai multe colonii n bulion, s incubm timp de 2-8 ore pn cnd obinem densitatea dorit) ajustm (vizual) densitatea folosind soluie salin steril 0,85% sau bulion, la un standard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta la standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizual a turbiditii inoculului nu garanteaz numrul corect al unitilor formatoare de colonii). C. Inocularea plcilor: introducem tamponul steril n tubul care conine suspensia bacterian de testat, rotim de cteva ori, apoi eliminm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereii interiori ai tubului;

105

 depunem inoculul pe suprafaa plcii cu mediul de cultur avnd grij s acoperim complet suprafaa mediului (ex. inoculm pe 3 direcii diferite, rotind placa cu cte o treime); lsm placa timp de circa 10 minute, ca s se usuce, nainte de a aplica benzile E test. D. Aplicarea benzilor E test: lum cu grij o band fr s atingem sau zgriem partea pe care este depus agentul antimicrobian; dac folosim pensa steril, apucm cu grij de captul benzii notat cu E (benzile trebuie s fie complet separate una de cealalt nainte de a le aplica pe suprafaa mediului de cultur inoculat cu tulpina de testat); dac se folosete aplicatorul E test, banda adeziv trebuie s fie n poziia corect (la fiecare capt al aplicatorului); aplicm banda E test pe suprafaa mediului de cultur, cu captul ce conine concentraia cea mai mare aproape de marginea plcii; dac lucrm cu plci cu diametrul de 90 mm, aplicm una sau dou benzi; dac lucrm cu plci cu diametrul de 150 mm, putem aplica ase benzi E test (benzile se pun la distane egale, radial, pornind din centrul plcii; marginea captului benzii notat cu E trebuie s ating marginea plcii); banda trebuie s fie n contact cu suprafaa agarului; eliminm eventualele bule de aer de sub band cu ajutorul unei pense ncepnd de la marginea bulei i mutnd-o n sus pe gradient pn la captul notat cu E (prezena bulelor mici nu va afecta rezultatul testrii); banda aplicat pe suprafaa agarului nu se mut n alt poziie (lund contact cu mediul de cultur, agentul antimicrobian de pe partea posterioar se elibereaz imediat); dac banda a fost aplicat cu partea posterioar n sus atunci se apuc cu grij, se ntoarce i se pune corect pe suprafaa mediului; dac banda a atins suprafaa mesei de lucru sau un alt obiect, se poate folosi n continuare att timp ct nu a luat contact cu o substan lichid. E. Incubarea: timpul i temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent antimicrobian ce urmeaz a fi testate; incubarea n atmosfer de CO2 modific pH-ul mediului de cultur i poate afecta activitatea agenilor antimicrobieni; se folosete numai n cazul n care microorganismele supuse testrii necesit pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc). Interpretarea rezultatelor: putem citi rezultatul n cazul n care creterea bacterian este confluent sau aproape confluent (Figura nr. 15 - Interpretare rezultate E-test pentru E. coli); inem placa lng o surs de lumin (atunci cnd mediul este Mueller-Hinton); citim valoarea CMI n punctul n care creterea bacterian intersecteaz banda E test; dac am utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% snge de oaie, sau geloz-chocolate MuellerHinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o surs de lumin reflectant i o lup; pe geloz-snge citim zona de inhibiie a creterii bacteriene nu zona de inhibiie a hemolizei; n cazul n care nu apare nicio zon de inhibiie, raportm valoarea CMI ca fiind mai mare dect cea mai mare concentraie a agentului antimicrobian de pe banda E test (Figura nr. 16 Interpretare rezultate E-test pentru stafilococ); dac zona de inhibiie nu intersecteaz banda 106

(zona de inhibiie se afl sub banda E test), valoarea CMI se raporteaz ca fiind mai mic dect concentraia cea mai sczut a agentului antimicrobian de pe banda E test; n cazul unei valori CMI situat ntre dou marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe care l notm va fi valoarea cea mai mare; raportm rezultatul obinut pentru tulpina studiat dup ce verificm rezultatul obinut pentru tulpina de referin (control de calitate); rezultatele CMI se interpreteaz conform criteriilor stabilite de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (Figura nr. 17 - Tabel NCCLS pentru enterobacterii). 7. 1. 1. 8. Alte tehnici de testare clasice Testarea sensibilitii la antibiotice a bacteriilor anaerobe o metodele sunt utile n special din punct de vedere al supravegherii epidemiologice, dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referin o se pot utiliza tehnici de diluie n mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluii n mediu lichid, teste pentru producerea de -lactamaz etc. Testarea sensibilitii mycobacteriilor o se efectueaz respectnd prevederile Programului Naional de Control al Tuberculozei (care indic situaiile n care vor fi efectuate aceste testri) o se pot utiliza metoda concentraiilor absolute, metoda proporiilor, metoda rapoartelor de rezisten, metode radiometrice etc (Figura nr. 18). Testarea sensibilitii altor bacterii o exist i alte bacterii pentru care trebuie respectate condiii particulare o spre exemplu pentru testarea sensibilitii stafilococilor la oxacilin/meticilin se recomand ca mediul s conin 4% NaCl, pentru testarea sensibilitii la antibiotice a streptococilor se recomand ca mediul s conin 5% snge defibrinat de berbec etc. (4) Testarea sensibilitii fungilor (antifungigrama) o ine cont de temperatura i durata de incubare, care difer fa de cele pentru bacterii, mediul utilizat fiind mediul Sabouraud o se pot utiliza tehnici de diluie n mediu lichid sau solid (Figura nr. 19). Testarea producerii de -lactamaze o este util atunci cnd se verific sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor care pot produce -lactamaz (ex. Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc) o se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine cromogene etc; exist i metode puse la punct pentru testarea sintezei de -lactamaze cu spectru extins (ESBL) (Figura nr. 20). Exist i sisteme automate (ex. ATB i rapid ATB) sau sis teme semiautomate (ex. ATB Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice, utiliznd criteriile de interpretare NCCLS (Figura nr. 21). 7. 1. 1. 9. Tehnici de biologie molecular utilizate n testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice Au fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a optimiza obinerea unor rezultate corecte i n timp ct mai scurt, cu privire la sensibilitatea/rezistena microorganismelor la antibiotice i chimioterapice. Metodele care au la baz tehnicile de 107

biologie molecular pot fi foarte utile (chiar dac costurile sunt mai ridicate). De ex. se cunoate c agentul etiologic al tuberculozei se multiplic lent pe medii de cultur i n aceste condiii rezultatele vor fi obinute n circa 2 sptmni prin metodele clasice. Se pot utiliza diferite tehnici i n final hibridizarea molecular pentru a studia diferite mutaii care pot s dea informaii cu privire la sensibilitatea/rezistena tulpinilor studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB (LIPA= Line Probe Assay), se realizeaz cu ajutorul unei truse comerciale puse la punct n USA. Metoda permite concomitent identificarea M. tuberculosis precum i testarea sensibilitii la rifampicin, dup o amplificare genetic a unui material (ADN) provenit fie din culturi mycobacteriene, fie chiar din produse clinice (Figura nr. 22). Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN-ului rezultat dintr-o amplificare prin PCR (Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor linii (benzi) paralele, pe fii de nitroceluloz. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt biotinilate (cuplate cu biotin). Dup hibridizare se adaug streptavidin conjugat cu fosfataz alcalin, acest conjugat atandu-se de produii de hibridizare rezultai anterior. Incubarea n prezena unui reactiv cromogen conduce, n cazul existenei hibridizrii, la apariia unor benzi colorate, vizibile. n cazul testrii rezistenei la rifampicin, se urmrete apariia unei/unor mutaii la nivelul genei care codific pentru subunitatea a ARN polimerazei (gena rpoB). (5-6) Identificarea apartenenei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificat cu ajutorul unei oligonucleotide specifice, situat n poziia a 3-a, dup linia care marcheaz fiecare fietest i respectiv linia care permite verificarea calitii conjugatului (conjugate control). Produsul unei tulpini sensibile la rifampicin deine fragmente amplificate, care hibridizeaz cu sondele specifice S1, S2, S3, S4 i respectiv S5. Absena uneia sau a mai multor benzi demonstreaz c tulpina este rezistent la rifampicin (Figura nr. 23). Pentru tulpinile rezistente la rifampicin, trusa comercial INNO-LIPA permite suplimentar aprecierea locusului mutaiei. De exemplu, o tulpin poate prezenta o mutaie n regiunea R5 (serin-leucin) n timp ce alt tulpin prezint o mutaie n regiunea R4a (histidin), aceste mutaii aprute la nivelul genei rpoB fiind dintre cele mai frecvente i pot fi identificate prin aceast metod.

7. 1. 2. Metode de testare a sensibilitii in vivo i de apreciere a eficienei terapeutice Eficiena terapeutic poate fi apreciat clinic, paraclinic i prin teste de laborator. Exist unele criterii nespecifice de laborator care sunt utile n aprecierea eficienei terapeutice, precum leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH, proteina C reactiv etc. Dintre metodele specifice utilizate pentru aprecierea eficacitii terapeutice sau pentru evaluarea eventualei nociviti a medicamentelor folosite, vom enumera: determinarea NEI (nivel de eficien inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte umori (Figurile nr. 24-26 - Citirea NEI din hemocultur sub terapie cu ertapenem; Film nr. 3); determinarea NEB (nivel de eficien bactericid) pentru ser, LCR sau alte umori; puterea bactericid a serului celor tratai (NEB) msoar capacitatea diluiilor din serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul coninnd germenul infectant; se determin diluia cea mai nalt de ser care mai manifest capacitate bactericid (Figurile nr. 27-29); 108

 utilizarea acestor metode a fost indicat n cazul endocarditelor bacteriene, osteomielitelor, fibrozei chistice sau sepsisului la pacieni cu variate grade de imunodepresie; produsele se recolteaz de obicei la o or dup administrarea unei doze i cu cteva minute nainte de administrarea urmtoarei doze de antibiotic; (Film nr. 4 Citirea NEI, Efectuarea NEB) determinarea nivelului de antibiotic realizat n snge, LCR sau n alte umori (prin metode microbiologice, enzimatice, HPLC etc).

7. 2. Povestiri adevrate 7.2.1. Rezistena la antibiotice a tulpinilor de S. aureus n Romnia, comparativ cu EU n statele Uniunii Europene, serviciile de sntate public i-au ndreptat atenia n ultimii ani ctre stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA), incidena acestei specii microbiene fiind ntr-o permanent cretere att n infeciile nosocomiale, ct i n cele comunitare. Alturi de ali ageni patogeni care stau la baza declanrii de infecii nosocomiale (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Aspergillus spp. etc.), MRSA este agentul etiologic izolat n aproximativ 5% din totalul acestor infecii. n vederea monitorizrii n timp i spaiu a susceptibilitii, dar i a rezistenei la antibiotice a diferitelor specii bacteriene cu potenial patogen crescut, s-a pus la punct EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System) un program de supraveghere a sensibilitii la antibioticele folosite n practica medical curent a tulpinilor izolate de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, E. coli, Enterococcus faecalis / faecium, K. pneumoniae i P. aeruginosa). Supravegherea tulpinilor de S. aureus i implicit a MRSA este realizat ncepnd cu anul 1999. n anul 2006, 31 de state din Europa au raportat ctre EARSS efectuarea testrii sensibilitii la antibiotice pentru un numr de 29.552 de tulpini de S. aureus izolate. Dintre acestea, 7.037 (23,81%) au fost identificate ca fiind MRSA. Dintre cele 31 de state, 15 au raportat o inciden a infeciilor cu MRSA mai mare de 25%. n ri precum Croaia, Grecia, Islanda, Malta, Turcia, MRSA s-a izolat cu precdere n unitile de terapie intensiv (peste 60% din totalul tulpinilor de MRSA). Din raportul pe 2006 al EARSS reiese faptul c n statele din Europa Central, rata infeciilor nosocomiale i comunitare cu MRSA se situeaz ntre 7-22%, comparativ cu partea de nord a continentului, unde rata este sub 4%. Marea Britanie a raportat ntre 1.500 i 4.000 de tulpini de MRSA pe an, Frana ntre 1.700 i 3.900 de tulpini pe an, Suedia ntre 1.300 i 2.000 de tulpini pe an, Germania ntre 800 i 1.300 de tulpini pe an, Slovenia ntre 150 i 365 de tulpini pe an, iar Bulgaria a raportat ntre 100 i 170 de tulpini pe an. n comparaie cu aceste stateRomnia a raportat n perioada 2002-2006 un numr foarte sczut de tulpini, variind ntre 78 i 92 de tulpini pe an (circa jumtate din numrul de tulpini raportate de Slovenia i de circa 16 ori mai puine dect Suedia); n acest context, datele raportate la ECDC nu au valori statistic semnificative. n anul 2005 s-a efectuat n ara noastr, la Institutul de Boli Infecioase Matei Bal, un studiu al crui obiectiv principal a fost stabilirea spectrului de sensibilitate la antibiotice pentru un numr de 589 de tulpini de S. aureus izolate. Peste jumtate din tulpini au fost izolate de la nivel faringian, dar s-au izolat tulpini i din leziuni cutanate, prin hemocultur etc. Testarea sensibilitii la antibiotice a fost efectuat prin E-test, evideniindu-se 92 (15,61%) tulpini de 109

MRSA. Acest nivel redus al meticilino-rezistenei poate fi corelat, printre altele, cu numrul mare de tulpini izolate din exsudat faringian, la care nivelul de meticilino-rezisten este mai mic de 10%. Studiul a relevat faptul c macrolidele, ciclinele i cotrimoxazolul constituie n prezent alternative terapeutice compromise, rmnnd active (pentru tulpinile identificate n institut) n antibioterapie clindamicina, rifampicina i aminoglicozidele. Procentul de tulpini de S. aureus penicilino-rezistente raportat a fost de 26% (i nu de 100% cum ar putea prea c este sugerat atunci cnd, n relaie cu o tulpin de S. aureus, penicilina este uitat complet). Tulpinile de MRSA constituie o problem de sntate public pe tot cuprinsul Europei. Totui, faptul c n unele ri (cum ar fi Cipru sau Turcia) incidena infeciilor cu MRSA este n scdere, reprezint o speran n ncercarea de a controla rata infeciilor nosocomiale i respectiv a celor comunitare n care sunt implicate tulpinile de MRSA. 7.2.2. Este nceputul sfritului erei antibioticelor? Conform unor studii recente s-a descoperit o nou gen numit New Delhi metallo beta lactamaz sau NDM 1. Aceast gen se gsete la nivelul plasmidelor i astfel poate fi copiat cu uurin i transmis altor tipuri de bacterii. Pentru prima dat bacteria care purta gena NDM a fost izolat de la un pacient suedez de origine indian care a avut infecie urinar n timp ce vizita New Delhi. Studiile arat c ntre 1 i 4% dintre bacteriile Gram negative din sudul Asiei poart gena NDM. NDM a fost identificat cu precdere la E.coli i Klebsiella pneumoniae, tulpinile devenind nalt rezistente la toate antibioticele cu excepia tigecycline i colistin. Dar exist cazuri n care nici aceste antibiotice nu sunt eficiente. n prezent nu exist alte antibiotice pentru a distruge bacteriile purttoare ale acestei gene. Pot aprea infecii obinuite precum infeciile tractului urinar cauzate de microorganisme rezistente la antibiotice. O ncercare pentru tratarea acestor infecii ar putea fi administrarea unor cocktail-uri de antibiotice n sparana c acestea vor avea un efect sau se pot folosi doze foarte mari dar exist pericolul de intoxicaie sau a altor reacii adverse. Din cauza turismului medical n general mai ales pentru proceduri precum chirurgia estetic aceast nou superbacterie se poate rspndi n ntreaga lume. n urma unui studiu s-a constat c NDM1 a fost identificat mai ales n Bangladesh, India i Pakistan i a ajuns n Marea Britanie prin intermediul unor pacieni care s-au ntors din aceste ri dup tratament. Rezistena la antibiotice trebuie considerat o problem global, mondial. (7)

Bibliografie 1. Turnidge J, Paterson DL, 2007, Setting and Revising Antibacterial Susceptibility Breakpoints, Clin. Microbiol. Rev., 20(3), 391-408. 2. Goue Denis Gohore Bi, Jun Li, Fahima Nekka, 2009, Antimicrobial breakpoint estimation accounting for variability in pharmacokinetics, Theor. Biol. Med. Model., 6, 10. 3. Kuper KM, Boles DM, Mohr JF, Wanger A, 2009, Antimicrobial Susceptibility Testing: A Primer for Clinicians, Pharmacotherapy, 29(11), 1326-1343. 4. Mandell, Bennett, Dolin, 2005, Principles and Practice of Infectious Diseases, 6th ed.

110

5. Cavusoglu C, Turhan A, Akinci P, Soyler I, 2006, Evaluation of the Genotype MTBDR Assay for Rapid Detection of Rifampin and Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates, J. Clin. Microbiol., 44(7), 2338-2342. 6. Morgan M, Kalantri S, Flores L, Pai M, 2005, A commercial line probe assay for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis, BMC Infect. Dis., 5, 62. 7. Kumarasamy K, Toleman MA, Walsh TRR, Bagaria J, Butt F, Balakrishnan R, 2010, Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study, The Lancet Infect. Dis., 10, 597-602.

111

8. Relaiile microorganism - gazd (Mara Mdlina Oanea, Gabriela Loredana Popa)

Fiina uman poate intra n contact cu microorganismele nc din perioada intrauterin, ns acest contact se realizeaz numai n cazuri patologice (infecioase, traumatice etc). n perioada postnatal ncepe stabilirea relaiilor operaionale ntre fiina uman i populaia microbian din mediul nconjurtor, fie prin colonizare saprofitic, fie prin agresiune ce devine evident. Imediat dup natere, microorganismele se stabilesc treptat pe tegumente i pe majoritatea mucoaselor. Este vorba n principal de microorganismele care vor alctui microflora normal a organismului. Aceasta joac un rol important n protejarea gazdei fa de o invazie microbian ulterioar, acionnd prin urmtoarele mecanisme: - competiia fa de aceiai nutrieni (interferen); - competiia pentru aceiai receptori de pe celulele gazdei (tropism); - producia de bacteriocine (colicine, piocine); - producerea de acizi grai volatili sau ali metabolii; - stimularea continu a sistemului imun pentru a menine un nivel sczut (dar constant) al exprimrii moleculelor din clasa a II a de histocompatibilitate (DR) pe macrofage i alte celule prezentatoare de antigen; - stimularea producerii unor factori imuni de protecie ncruciat, ca de exemplu aa-numiii anticorpi naturali. Cu alte cuvinte, trebuie avute n vedere toate aceste aspecte atunci cnd se utilizeaz antibiotice cu spectru larg, care vor scdea numrul microorganismelor la nivel intestinal i vor permite multiplicarea fungilor i a microorganismelor rezistente la aceste antibiotice. Ca urmare, la oprirea terapiei pot aprea fenomene de rebound, manifestate prin repopularea tractului digestiv n avantajul enterobacteriilor fa de germenii anaerobi.

8. 1. Flora microbian a organismului Flora microbian a organismului poate fi divizat n dou grupuri: - flora normal rezident, care se gsete n mod regulat i care dac este perturbat se restabilete prompt (sau destul de prompt) - flora tranzitorie care poate coloniza gazda pe o perioad variabil de timp, de la ore la sptmni. Flora microbian prezint tropism pentru anumite regiuni anatomice. (Tabelul nr. 1) a). La nivelul tegumentului n funcie de contactul cu mediul nconjurtor, flora bacterian prezint un grad marcat de variabilitate. Mai frecvent, la nivel tegumentar se pot gsi Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium spp., Micrococcus spp., dar,temporar, tegumentul poate fi contaminat cu germeni coliformi, chiar stafilococi potenial patogeni precum Staphylococcus aureus, ns fr manifestri nete de agresivitate.

112

b). La nivelul conjunctivei oculare Conjunctiva este puin colonizat, deoarece secreiile lacrimale conin substane bactericide (ex. lizozim), iar clipitul asigur ndeprtarea mecanic a corpilor strini, inclusiv a bacteriilor. Pot fi totui identificai Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium spp., Corynebacterium spp. c). La nivelul mucoasei nazale n mod normal se pot gsi stafilococi aurii i albi, streptococi, corynebacterii, pneumococi etc, flor supus numeroaselor contaminri prin contacte i traumatisme locale. d). La nivelul cavitii bucale La nivelul cavitii bucale flora conine diferii coci i bacili Gram-pozitivi i Gram-negativi, aerobi i anaerobi (de exemplu stafilococi, streptococi precumS. salivarius, S. sanguis, S. mutans, lactobacili, spirochete, neisserii saprofite, sau anaerobii Veillonella spp., Actinomyces spp., Fusobacterium spp., Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp.), de origine aerian sau alimentar. Exist o adevrat microbiologie oral, cu diferene n funcie de localizare. Spre exemplu, pentru o celul de la nivelul dosului limbii exist aproximativ 100-150 bacterii, ntr-un ml de saliv sunt circa 100.000.000 bacterii, iar la nivelul plcii dentare, circa 100.000.000.000 bacterii (aproximativ 35 de specii bacteriene diferite, cele dominante fiind Streptococcus sanguis i Streptococcus mutans). Placa dentar, cariile i boala parodontal sunt cauzate de bacteriile ce constituie flora normal bucal. e). La nivelul tractului respirator Mucoasa nazal este ntotdeauna bogat colonizat, fiind supus unor numeroase contaminri prin contacte i traumatisme locale. n mod normal se pot gsi Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus (la aproximativ 20% din populaie), streptococi, corynebacterii, pneumococi etc. Flora de la nivelul faringelui se aseamn n compoziie cu flora cavitii bucale. Astfel se pot gsi streptococi, neisserii saprofite, bacili Gram-negativi-Lactobacillus spp, Bacteroides spp. Tractul respirator inferior este steril, fapt datorat i clearance-ului mucociliar. f). La nivelul tractului digestiv La acest nivel exist o diferen evident n funcie de segmentele acestuia, exprimate mai ales prin chimismul local. Lund ca exemplu colonul copilului mare i al adultului, la acest nivel se gsesc o serie de bacili Gram-negativi (enterobacterii), precum i foarte numeroi germeni anaerobi (Bacteroides spp., enterococi) etc, n total existnd aproximativ 1011 bacterii la 1 g de materii fecale. Se va detalia mai jos (8.2) despre compoziia i funciile florei normale digestive. g). La nivel urogenital Urina este n mod normal steril, iar n timpul miciunii bacteriile de pe tractul urinar inferior sunt cel mai frecvent ndeprtate. Totui, n uretra anterioar poate exista o flor care este cel mai frecvent alctuit din fungi, staflococi, corinebacterii i enterobacterii. Flora vaginal este dominat de lactobacili (flora Dderlein) asociai n proporii diferite cu mycoplasme nepatogene, stafilococi, streptococi, enterococi, clostridii, Candida spp., Bacteroides spp. etc. Predominana lactobacililor menine local un pH acid nefavorabil multiplicrii altor germeni (n special patogeni). Mucusul cervical are n plus o aciune 113

bactericid prin lizozim. La femeile fr activitate sexual predomin lactobacilii, pe cnd la restul compoziia florei este mixt.

8. 2. Flora microbian normal din sistemul intestinal Cea mai puin neleas parte a organismului ndeplinete funcii eseniale fiziologice, nutriionale i de protecie. Complexitatea acestui sistem ascunde mecanisme ce influeneaz anatomia, fiziologia, ct i patologia uman. Flora normal intestinal cntrete aproximativ 1 kg i conine o bun parte din celulele corpului uman. Speciile bacteriene ce colonizeaz sistemul intestinal sunt foarte variate. Flora normal este unic, variind semnificativ de la un individ la altul, iar compoziia ei se menine constant lungi perioade de timp. Astfel a aprut noiunea de amprent microbian unic.Aceste bacterii sunt de 10 ori mai numeroase dect celulele eucariote ale corpului uman. n colon exist cele mai multe microorganisme comensale: 1011-1012 UFC/ml. Colonul este organul cel mai activ metabolic din ntreg organismul. (Figura nr. 1) 8. 2. 1. Achiziia florei normale nainte de natere, n condiii fiziologice, ftul este germ-free (nu prezint microorganisme). Apoi, ntreg corpul uman i implicit i tractul gastro-intestinal este colonizat de bacterii aerobe ce aparin microflorei materne, de ex. Escherichia coli sau Streptococcus spp. Dup aproximativ o sptmn, ncep s predomine bacteriile anaerobe. n cazul n care nou-nscutul este hrnit cu lapte matern, vor exista mai multe bacterii Grampozitive, de tipul Bifidobacterium spp. sau Lactobacillus spp. n cazul alptrii artificiale, situaie nedorit i nerecomandat pentru dezvoltarea sugarului, vor predomina bacteriile Gram-negative, iar flora microbian intestinal va deveni foarte asemntoare cu cea a adultului incluznd Enterobacteriaceae i specii din genul Bacteroides. Flora normal a adultului conine reprezentani din toate cele 3 domenii de via: Eukaryota, Bacteria, Archaea, dup cum urmeaz. Din domeniul Bacteria, regsim microorganisme din genurile Bacteroides (care reprezint circa 30% din flora normal), Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Escherichia i Lactobacillus. Din domeniul Archaea, regsim microorganisme din genul Methanobrevibacter. Iar din domeniul Eukaryota, regsim microorganisme din genurile Candida, Sacharomyces, Aspergillus i respectiv Penicillium. 8. 2. 2. Cultivarea n laborator Majoritatea speciilor bacteriene rezidente n intestin nu au putut fi cultivate pe medii standard de laborator. Acestea necesit condiii speciale, ct mai asemntoare celor din sistemul intestinal. Fiziologia acestui ecosistem este extrem de complex: interaciunile dintre factorii secretai de bacterii nu sunt nelese complet, iar efectele per ansamblu ale substanelor proprii organismului asupra florei microbiene sunt, de asemenea, puin cunoscute. Prin metode moderne ale biologiei moleculare, se poate studia, n timp util i ntr-un mod foarte eficient, ADN-ul bacterian.

114

Dintre toate structurile moleculare studiate, ARNr este cea mai puin variabil. S-a demonstrat c anumite poriuni ale secvenei ADNr a diferitor organisme nrudite ntre ele sunt remarcabil de similare. Astfel, se poate deduce urmtoarea idee: secvenierea genelor unor organisme apropiate filogenetic poate fi aliniat foarte precis, astfel obinndu-se o evaluare mult mai exact a diferenelor existente. Cum? Prin compararea zonelor hipervariabile ale ARNr, extrem de specifice unei anumite specii. Din acest motiv, genele care codific pentru ARNr (ADNr) au fost utilizate pentru a determina taxonomia, filogenia i pentru a specifica ratele de difereniere dintre speciile bacteriene. De asemenea, analiza dup realizarea secvenierii ARNr 16S ofer numeroase informaii asupra evoluiei bacteriene i asupra relaiilor dintre specii. Iniiatorul acestor metode a fost Carl Woese, cel care a propus ulterior clasificarea microorganismelor n sistemul celor trei domenii Archaea, Bacteria i Eucarya. Spre exemplu, ntr-un studiu s-a analizat prin secvenierea ARNr 16 S (aparine subunitii mici 30 S ribozomale) acid nucleic bacterian provenit de la 50 tulpini. Astfel, s-au descoperit 1.250 secvene diferite, dintre care 85% nu au putut fi identificate. Majoritatea nu aparin grupurilor taxonomice cunoscute i clasificate pn n momentul de fa, n timp ce mai mult de jumtate nu au mai fost descoperite n nici un alt situs sau n afara organismului. Pn n prezent au fost identificai aproximativ 420 membri ai florei normale, fcnd parte din 117 genuri diferite. Se presupune c exist peste 1.000 de specii bacteriene n sistemul nostru intestinal. Un exemplu de algoritm de diagnostic/identificare ar fi urmtorul: 1. Prelevarea de produs (materii fecale) 2. Depozitarea preparatului n una din urmtoarele variante: -procesare imediat sau - ngheare la -80 C sau -depozitare ntr-un aparat de depozitare i prelucrare special (PSP Spin Stool DNA Plus Kit), la temperatura camerei 3. Purificarea acidului nucleic -exist i kituri comerciale -liza celular cu ajutorul unui kit 4. Amplificarea ADN prin tehnica PCR utiliznd primeri ale cror inte sunt regiunile variabile ale genei ARNr 16S 5. Analiza i interpretarea rezultatelor 8. 2. 3. Modificri ale florei intestinale normale Compoziia florei microbiene normale este influenat de numeroi factori, precum stilul de via, dieta, starea de sntate versus starea de boal, vrsta. Astfel, dac este urmrit evoluia n timp a prezenei speciilor de Bifidobacterium i Enterobacteriaceae n sistemul intestinal, se vor observa diferene semnificative: Bifidobacterium spp. se afl n cantitate maxim la copil, n cantitate medie la adult i respectiv n cantitate minim la persoanele n vrst, n timp ce Enterobacteriaceaele se afl n cantitate maxim tot la copil, n cantitate minim la adult i n cantitate medie la persoanele n vrst. (Schema nr. 1; Factori ce determin modificarea compoziiei florei normale) 115

De-a lungul tractului gastro-intestinal se realizeaz o selecie prin cooperarea dintre gazd i diferitele bacterii. O serie de factori locali determin o distribuie neuniform a florei, dintre acetia putem aminti: -factori fizici: temperatura; gradientul de oxigen (majoritatea speciilor bacteriene sunt anaerobe); -factori chimici: pH-ul (ntre mese, nu exist microorganisme la nivel gastric); procentul de H2O; acizii biliari; secreia pancreatic; nivelele diferiilor nutrieni; secreia local de imunoglobuline; diferitele substane produse tocmai de ctre bacterie; -factori mecanici: peristaltismul intestinal (bacteriile se pot ataa de mucoas atunci cnd peristaltismul este sczut; iat i unul dintre motivele pentru care medicamentele anti-peristaltice nu sunt benefice n infeciile digestive); (Tabelul nr. 2) fenomenul de competiie ntre diferitele specii bacteriene etc.

8. 3. Funciile florei microbiene normale din sistemul intestinal 8. 3. 1. Flora normal i sistemul imun 8. 3. 1. 1. Dezvoltarea sistemului imunitar n studiul unor cercettori de la Harvard Medical School au fost urmrite efectele colonizrii cu Bacteroides fragilis a unor oareci germ-free(crescui n mediu steril). Dac n lipsa bacteriilor animalele prezentau timusul i splina incomplet dezvoltate i un numr al limfocitelor T CD4+ naive foarte mic, dup colonizarea cu Bacteroides fragilis toate defectele au disprut. Mecanismul prin care flora determin o dezvoltare normal a sistemului imunitar se pare c este urmtorul: - bacteriile au la nivelul membranei externe un carbohidrat (PSA) cu o structur special; - PSA este recunoscut i cooptat de celulele dendritice din mucoasa intestinal; - celulele dendritice l prezint limfocitelor T naive i determin proliferarea limfocitelor Th1, cu adoptarea unui rspuns imun de tip celular . Dac n lipsa florei, organismul tinde spre un rspuns imun de tip umoral, realizat prin limfocitele Th2, n prezena acesteia se echilibreaz reacia sistemului imunitar Th1-Th2. Astfel, flora microbian normal educ sistemul imun i contribuie la dezvoltarea i funcionarea normal a acestuia. Tolerana fa de bacteriile nepatogene, precum i sensibilitatea fa de bacteriile patogene se dezvolt ncepnd cu primele zile de dup natere, iar echilibrul dintre ele este esenial. (Figura nr. 2)

116

8. 3. 1. 2. Flora microbian intestinal ar putea reprezenta cheia n prevenirea unor stri de hipersensibilitate Conform acestor explicaii, n lipsa florei, sistemul imun tinde s se orienteze spre un rspuns de tip umoral. Acest tip de rspuns imun poate fi implicat n apariia strilor de hipersensibilitate (ex. de tip I), printr-o secreie excesiv de imunoglobuline. ntr-un studiu al cercettorilor de la University of Michigan Medical School, s-a observat o hipersensibilitate la nivel respirator, aprut fa de ovalbumin (un cunoscut alergen) la oarecii cu flora normal gastro-intestinal distrus de antibiotice. Un alt argument al implicaiilor florei normale asupra sistemului imunitar este diferena cunoscut dintre compoziia florei normale a copiilor cu diversele forme de hipersensibilitate, comparativ cu flora intestinal la copiii sntoi; copiii din prima categorie prezint un nivel crescut al speciilor de Clostridium difficile i Staphylococcus aureus, n timp ce speciile din genurile Bacteroides i Bifidobacteria sunt n cantitate mic. 8. 3. 1. 3. Stresul produs de ctre sistemul imunitar pare s reprezinte un semnal de atac pentru bacterii S-a descoperit faptul c Pseudomonas aeruginosa, ce aparine florei normale la 3% din oameni, deine receptori pentru IFN-, mesager al sistemului imun, util n reglarea rspunsului imun, inclusiv n cazul activrii rspunsului imun anti-infecios. Aceast citokin este recunoscut drept o structur negativ i, drept consecin, bacteria i activeaz genele de patogenitate. n aceste condiii, Pseudomonas aeruginosa reuete s eludeze rspunsului imun, se multiplic, selecteaz factori de rezisten la antibiotice, secret toxine, sau poate penetra peretele intestinal (P. aeruginosa a fost izolat n sepsis, iar unica surs posibil era reprezentat de flora intestinal). n urma unor intervenii chirurgicale majore a fost raportat o frecven crescut a sepsisului cu implicarea Pseudomonas aeruginosa. Ipoteza foarte interesant i relativ recent, care decurge din diversele studii realizate de cercettori din universitile americane este c bacteriile nu simt nevoia i nici nu intenioneaz s descopere o oportunitate de atac, dar, atunci cnd se simt ameninate, dezvolt un plan de reacie. 8. 3. 1. 4. Bacteriile au propriul sistem imunitar La ntrebarea privind modul de rspuns al bacteriilor fa de informaia genetic extern sistemului n care se dezvolt n mod obinuit, cercettorii au lansat o serie de ipoteze. Se pare c bacteriile au capacitatea de a recunoate ADN-ul strin. n materialul nuclear bacteriile dein proteina H-NS care are funcia unui receptor pentru moleculele de adenin i timin din structura ADN-ului existent n mediul exterior. Aceast protein previne activarea lui i blocheaz exprimarea informaiilor ce ar putea duna bacteriei. Se pare c microorganismele pot folosi ADN din surse externe pentru a exprima caractere de patogenitate. Cercettorii sugereaz un fapt foarte interesant: bacterii cunoscute n prezent drept patogene, n trecut au fost nepatogene (Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia pestis etc., ar fi devenit patogeneprin cooptarea de ADN-ului din mediul extern). Aceste studii ofer i o nou viziune asupra evoluiei bacteriilor dar i asupra utilizrii capacitii unor bacterii (modificate genetic) de a produce proteine recombinate. La bacteriile lipsite de HNS, care nu inactiveaz structurile genetice umane, producia de proteine este mai eficient.

117

8. 3. 1. 5. Diferenierea bacteriilor comensale de cele patogene Mecanisme ale gazdei Organismul gazd deine sistemul PRR (pattern recognition receptor), care include familia TLR (toll-like receptors) de receptori extracelulari i NOD/CARD (nucleotide binding oligomerization domain / caspase recruitment domain isoforms), familie de receptori intracelulari. (Figura nr. 3) Celule implicate n procesul de difereniere sunt: - enterocitele de suprafa; - celulele M din foliculii limfoizi i - celulele intestinale dendritice. Enterocitele dein receptori PRR, iar la contactul cu bacteriile patogene elibereaz IgA, chemokine, citokine i peptide antibacteriene. Celulele M transport antigenele luminale ctre celulele prezentatoare de antigen (celule dendritice, macrofage etc.) care le prezint n continuare limfocitelor T naive. Celulele intestinale dendritice dein receptori PRR. Ele i trimit dendritele ctre suprafa, recunosc antigenele, le coopteaz i le transport ctre ganglionul limfatic. Aici prezint antigenele limfocitelor T naive. n ganglion este declanat rspunsul imun care poate fi efector, prin intermediul limfocitelor T helper (Th1, Th2), sau reglator, prin limfocitele T cu rol n reglarea rspunsului imun. La contactul dintre bacteria comensal i receptori nu apare rspuns inflamator sau chiar poate s apar un efect de protecie, prin inhibiia reaciilor inflamatorii care ar putea fi declanate de bacteriile patogene. Molecule precum TOLLIP (Toll interacting protein), SIGIRR (single Ig IL-1 R-related molecule) i NOD2 determin tolerana fa de flora normal gastro-intestinal, prin inhibarea TLR sau prin blocarea cascadei inflamatorii. Limfocitele T reglatoare i celulele intestinale dendritice deprim la rndul lor reacia inflamatorie. Mecanisme ale florei Tolerana fa de flora normal nu este determinat doar de structurile gazdei. Bacteriile comensale dein mecanisme efectoare care le permit supravieuirea n sistemul intestinal. Astfel, ele pot prezenta pe suprafa molecule asemntoare cu cele ale gazdei (ex. Bacteroides spp.) sau pot secreta molecule care mediaz eludarea mecanismelor de aprare ale gazdei. Recent s-a demonstrat c secreia se realizeaz prin sisteme de secreie de tip III (injectarea unor molecule n celulele eucariote, prin intermediul unui flagel) i de tip IV (transportul ADNului sau a unor proteine n celulele eucariote, asemntor mecanismului de conjugare), mecanisme pn acum descrise doar la bacteriile patogene. (Figura nr. 4) Flora normal limiteaz semnalele inflamatorii declanate de bacteriile patogene prin urmtorul mecanism (Figura nr. 5): - NF-kB (transcription factor nuclear factor) este un factor prin care bacteriile patogene transmit semnale inflamatorii la nivelul celulelor epiteliale intestinale. Acest factor determin transcripia genelor p55-p65, cu producia de chemokine i citokine. - flora microbian intestinal activeaz PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) care export p65 n citoplasma enterocitului. Astfel transcripia este blocat, de asemenea i cascada inflamatorie. Spre exemplu, flora intestinal normal scade rspunsul inflamator fa de Salmonella typhimurium.

118

8. 3. 2. Flora microbian normal inhib dezvoltarea bacteriilor patogene prin efectul de barier sau fenomenul de competiie ntr-un organism gazd sntos, flora normal realizeaz un strat protector de-a lungul sistemului intestinal. Bacteriile comensale ocup situsurile de ataare ale mucoasei i consum factorii nutriionali produi de enterocite. La rndul lor, celulele intestinale secret produi antibacterieni, chemokine, citokine i IgA. (Figura nr. 6) n anumite condiii, spre exemplu atunci cnd: - exist o cantitate mai mare de tulpini din specii bacteriene patogene; - este urmat un tratament ndelungat cu antibiotice (mai ales dac au spectru larg); - exist factori care deprim mecanismele de aprare ale gazdei (ex. o stare de imunosupresie, o modificare a tranzitului prin peristaltism sczut etc.); - se exercit aciunea unor factori externi (ex. radiaii, arsuri, substane chimice etc.) flora microbian este afectat, iar bacteriile patogene pot invada mucoasa intestinal. 8. 3. 3. Flora normal intestinal determin greutatea fiecrui individ ntr-un studiu realizat n anul 2006 pe oareci germ-free, hrnii cu alimente bogate n polizaharide, s-a observat c animalele colonizate doar cu Methanobrevibacter smithii i cu Bacteroides thetaiotaomicron au prezentat o depunere semnificativ mai mare de grsime n comparaie cu animalele din alte grupuri de control. S-a demonstrat c: - Bacteroides thetaiotaomicron intervine n dezvoltarea vascularizaiei intestinale; induce formarea reelelor capilare i stimuleaz absorbia i procesarea carbohidrailor; n timp ce - Methanobrevibacter smithii deine funcia unui reglator caloric n intestinul distal i prin sinergie cu B. thetaiotaomicron stimuleaz digestia zaharurilor i crete absorbia caloriilor. Mai recent, s-au descoperit numeroase mecanisme prin care flora microbian normal intervine n reglarea greutii corporale i a depunerilor adipoase. (Figura nr. 7) Primul dintre acestea ar fi influenarea metabolizrii nutrienilor i a reglrii energetice. S-a demonstrat faptul c bacteriile metabolizeaz polizaharide nondigerabile transformndu-le n produi digerabili, astfel crescnd extracia energetic. O alt ipotez stabilete o legtur ntre flora normal intestinal i homeostazia metabolic. O dieta bogat n lipide moduleaz populaiile bacteriene dominante la nivel intestinal: cresc bacteriile Gram negative i scad bifidobacteriile, eubacteriile i Bacteroides spp. Aceast modificare determin creterea nivelului plasmatic al lipopolizaharidelor (LPZ) care induce un rspuns inflamator cronic de mic intensitate la nivelul ficatului, al esutului adipos i al hipotalamusului. Apare o cretere n greutate i o acumulare excesiv a lipidelor la nivel hepatic. n timp, crete riscul apariiei rezistenei la insulin i al dezvoltrii diabetului zaharat de tip 2. (Figura nr. 8) Un al treilea mecanism este acela prin care flora normal induce reglarea unor gene ale gazdei. Acestea sunt implicate n modularea depozitelor i a consumului energetic. Aceste descoperiri ar putea s aib o mare importan att n tratamentul obezitii ct i n tratamentul celor subnutrii. Ar putea explica de ce oameni care consum aceeai cantitate de hran, prezint modaliti diferite de depunere a grsimilor. Totui ar rmne un semn de ntrebare: diferenele observate n flora normal a pacienilor obezi este cauza sau consecina obezitii? 8. 3. 4. Fermentarea i absorbia polizaharidelor n colonul proximal 119

Corpul uman nu deine enzimele necesare fermentrii polizaharidelor. Flora normal ndeplinete aceast funcie. Prin fermentare zaharolitic, bacteriile produc acizi grai cu lan scurt de carbon i gaz. Microorganismele florei normale stimuleaz i controleaz dezvoltarea celulelor intestinale (epiteliale i ale esutului limfoid), prin furnizarea factorilor nutriionali necesari. Bacteriile previn lezarea mucoasei, aceasta constituind o posibil funcie anti-cancerigen. Acizii grai cu lan scurt de carbon, produi de flor, au ca efect scderea pH-ului n lumenul intestinal. Astfel este redus numrul bacteriilor patogene, deoarece acestea au o rezisten sczut la pH acid. Prin fermentarea zaharolitic, flora are o important funcie energetic, crete reabsorbia apei, precum i absorbia unor nutrieni (Ca, Mg, Fe). 8. 3. 5. Alte funcii 8. 3. 5. 1. Fermentarea proteolitic n colonul distal - importana dietei reduse n proteine Prin fermentarea proteolitic flora normal intestinal produce o serie de toxine i substane cu posibil rol n carcinogenez. Cantitatea acestor substane este n relaie direct cu cantitatea de proteine ingerate. 8. 3. 5. 2. Conversia acizilor biliari n cocarcinogeni Bacterii precum Streptococcus faecalis, Veilonella spp. metabolizeaz prin deconjugare sau hidroliz acizii biliari dezoxicolic i litocolic, cu producie de cocarcinogeni. Lactobacillus bifidus blocheaz acidul colic intracelular i astfel mpiedic formarea de cocarcinogeni. 8. 3. 5. 2. Biosinteza vitaminei K Flora normal produce 50% din necesarul zilnic de vitamin K. Bacteroides fragilis i Escherichia coli particip la sinteza vitaminei K2. 8. 3. 5. 3. Absorbia vitaminei B12 A fost dovedit rolul florei intestinale normale n absorbia de vitamin B12. 8. 3. 6. Flora microbian normal - partenerul silenios n manifestarea bolii Boala inflamatorie intestinal (boala Crohn i colita ulcerativ) reprezint un exemplu care trebuie luat n discuie i aflat n relaie cu flora intestinal normal. (Figura nr. 9) Boala inflamatorie intestinal include: - boala Crohn, n care procesele inflamatorii apar n principal la nivel intestinal, dar i la nivelul altor organe. Cel mai frecvent sunt afectate segmentele terminale ale intestinului subire; n cazul afectrii colonice pot aprea fistule i abcese n regiunea anal. - colita ulcerativ include rspunsul inflamator la nivelul mucoasei ce cptuete interiorul rectului (proctita) sau la nivelul ntregului colon (colit ulcerativ). n momentul actual, nu a fost stabilit cu exactitate cauza apariiei acestei entiti patologice. Totui, s-a observat c exist anumii factori declanatori, prezeni la persoanele afectate: - o predispoziie genetic; - lipsa alptrii la sn n perioada de sugar i nou-nscut; - igiena excesivn copilrie, cu o insuficient dezvoltare a rspunsului imun; 120

- excese n consumul de grsimi animale i carbohidrai; - tratament cu antibiotice utilizat frecvent. Se pare c unul dintre elementele de luat n consideraie ar fi pierderea toleranei fa de flora normal intestinal, cu apariia unui rspuns imun aberant, cu stri de hipersensibilitate i reacii autoimune. Apare o permeabilitate intestinal crescut. Compoziia florei normale este modificat (de ex. specii din genul Clostridium apar n proporie mai mare fa de normal), dar nu s-a putut demonstra dac aceasta determin boala sau dac este doar un efect al inflamaiei intestinale. Se pare c exist i o serie de alte boli n care este implicat flora normal, spre ex. neoplazii (digestive sau n afara sistemului digestiv), infecii produse n alte sisteme dup modificarea habitatului (ex. Escherichia coli n momentul n care ajunge la nivelul tractul urinar), obezitate, stri de hipersensibilitate, autism, depresie etc. 8. 3. 7. Farmabioticele Reprezint orice form de exploatare farmaceutic a florei normale (probiotice, prebiotice, sinbiotice). Probioticele sunt suplimente alimentare care conin microorganisme vii (bacterii, fungi) cu efecte benefice asupra corpului uman; bacteriile folosite sunt n general cele productoare de acid lactic (scad pH i mpiedic dezvoltarea bacteriilor patogene). (Figura nr. 7) Genurile utilizate sunt Lactobacillus i Bacteroides. Prebioticele reprezint ingrediente alimentare non-digerabile care afecteaz n mod pozitiv gazda, stimulnd n mod selectiv creterea i/sau activitatea unei sau a unui numr limitat de bacterii din colon; majoritatea sunt carbohidrai iar bacteriile stimulate sunt Bifidobacteria sau bacteriile productoare de acid lactic. Sinbioticele sunt produse care conin att probiotice, ct i prebiotice. Exist dovezi ce susin rolul terapeutic al probioticelor n boala inflamatorie intestinal, infecii, cancer, artrit.

8. 4. Relaii microorganism-gazd Cu o parte din microorganismele ntlnite organismul stabilete relaii de simbioz, convieuirea fiind folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la care particip unii coliformi intestinali). Foarte multe din microorganismele care alctuiesc microflora normal se afl n relaii de comensualism cu organismul, germenii depinznd nutriional de gazd, creia nu i creeaz prejudicii. Aceast convieuire exprim ns un echilibru instabil, care poate fi uor tulburat. Diferii factori (ai gazdei, din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor) pot modifica aceste relaii, astfel nct unele microorganisme din flora normal pot manifesta aspecte patogene - este vorba de microorganismele condiionat patogene. Relaia de parazitism tipic apare ns doar atunci cnd microorganismele se dezvolt n detrimentul gazdei, cu manifestri clinice mai mult sau mai puin evidente. Astfel, n cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta dect n organismul gazdei (de exemplu Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae etc). Alte bacterii sunt facultativ parazite, putnd tri i libere n natur, dar o dat 121

ptrunse n organism stabilesc cu acesta relaii de parazitism (de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).

8. 5. Povestire adevrat Rolul i importana florei microbiene normale a organismului, sunt mai mult dect bine stabilite. Rolul infecionistului este, ca pe durata tratamentelor cu antibiotice pentru diverse afeciuni, s afecteze ct mai puin aceast flor. O prim idee este utilizarea de antibiotice cu spectru ct mai intit (ngust), cu efect asupra patogenului respectiv. Pe de alt parte piatra de ncercare a medicilor, credem, o reprezint evitarea tratamentelor antibiotice inutile. Ci dintre medici nu recomand scheme dup scheme de medicamente anti-stafilococice doar pentru c la exsudatul faringian se izoleaz un stafilococ, fie el chiar i auriu? Mai toi. ncercm sterilizarea de acel stafilococ, doar dac pacientul urmeaz s primeasc un transplant (ex. medular sau hepatic) sau dac va primi un tratament intens imunosupresor, altfel nici nu trebuie cutat! Iar pe de alt parte, rmne o ntrebare pe care o punem tuturor generaiilor de studeni cu care lucrm: n cte dintre cazurile de infecii stafilococice ntlnite i raportate n foile de observaie pe care le vor vedea este menionat i testul coagulazei? ns, revenind la subiectul acestui capitol, nu trebuie s uitm niciodat c utilizarea medicamentelor antibiotice i chimioterapice, n special a celor cu spectru larg, afecteaz uneori decisiv flora microbian normal a crei utilitate este n momentul de fa binecunoscut.

8. 6. tiai c ... ....Gregor Reid, director al Centrului Canadian petru Cercetarea i Dezvoltarea Probioticelor a afirmat: Lactobacilul este doar o bacterie. S spui c un produs conine lactobacil este ca i cum ai spune c l aduci pe George Cloney la o petrecere. Poate fi actorul sau poate fi doar un tip de 85 de ani din Atlanta pe care ntmpltor l cheam George Cloney. n cazul probioticelor exist diferene importante ntre tulpini? ....atunci cnd dorii s achizionai produse ce conin probiotice ar trebui s le cutai pe acelea pe a cror etichet este specificat tulpina coninut i care ofer cititorilor acces liber la studiile tiinifice de suport? O surs bun pentru informarea asupra efectelor variatelor tulpini probiotice este www.PubMed.gov. ....putei s v facei singuri iaurt cu probiotice? Avei nevoie de 1l lapte steril-orice tip, chiar i de soia, un iaurt-sursa de probiotice i de un recipient n care dorii s facei iaurtul. Cuptorul se ncalzete timp de 15 minute la 180 grade, se las s se mai rceasca timp de 10 minute. Se aeaz n cuptor recipientul i compoziia pentru iaurt. Se nchide ua de la cuptor i se las 12 ore, peste noapte. Dac diminea observai c nu a ajuns la consistena dorit mai lsai-l n cuptor timp de 12-24 ore.

8. 8. Evaluarea cunotinelor

122

Descoperii rspunsul corect: 1. Unde exist numrul cel mai mare de bacterii comensale? a. Pe tegumente b. n intestine c. n orofaringe 2. Care sunt celulele implicate n educarea sistemului imunitar de ctre flora intestinal? a. bacteriile comensale, celulele dendritice, limfocitele T, limfocitele B b. bacteriile comensale, celulele dendritice din mucoasa intestinal, limfocitele T c. celulele epiteliale intestinale, limfocitele T, limfocitele B 3. Factorul ce stimuleaz dezvoltarea florei normale intestinale este: a. peristaltismul redus b. antibioticele c. alptarea

8.7. Direcii de cercetare Pentru o cunoatere suplimentar a acestei problematici, putei examina i urmtoarele articole: Probiotics in inflammatory bowel disease: is it all gut flora modulation? S Ghosh, D van Heel, R J Playford Gut. 2004 May; 53(5): 620622. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1774052/ Inflammatory Bowel Disease Live Transmission, Gail A. Hecht, M.D. N Engl J Med; 358:528530 January 31, 2008 http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMcibr0707718 Alterations in Intestinal Microbial Flora and Human Disease Mohamed Othman; Roberto Agero; Henry C. Lin Curr Opin Gastroenterol. 2008;24(1):11-16. 2008 Lippincott Williams & Wilkins http://www.medscape.com/viewarticle/568375

123

9. Patogenitate i Virulen (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

9. 1. Agenii infecioi Agenii cauzali ai bolilor infecioase (microorganismele condiionat patogene, dar mai ales germenii patogeni) sunt foarte numeroi. Ei se pot mpri n urmtoarele grupe mari: - virusuri = agent patogen care se reproduce numai n interiorul celulelor vii i care provoac boli infecioase numite viroze; - chlamydii = bacterii Gram-negative, strict parazite, imobile, care se multiplic n citoplasma celulelor gazd printr-un ciclu de dezvoltare caracteristic; - mycoplasme = cele mai mici microorganisme care pot tri liber n natur i care se pot dezvolta pe medii artificiale mbogite; - rickettsii = microorganisme care au dimensiuni mai mici dect bacteriile; de regul nu se pot cultiva n afara celulelor vii; - bacterii propriu-zise; - fungi; - protozoare = grup de organisme unicelulare, din grupul protistelor; - metazoare. n ultimii 25-30 de ani se discut din ce n ce mai mult despre rolul jucat de prioni, constituii dintr-o particul de natur proteic avnd caracter infecios, lipsit de acid nucleic, cu potenial patogen destul de subtil exprimat. Prionii rezist la aciunea a numeroi factori fizici i chimici care inactiveaz virusurile. Sunt capabili de a se reproduce. Afecteaz att oamenii ct i mamiferele. Sunt implicai etiologic n maladii cu evoluie lent, precum encefalopatia spongiform transmisibil care include spre exemplu boala Creutzfeldt-Jacob, insomnia fatal familial etc, afeciuni n care sunt prezente leziuni degenerative la nivelul SNC. Pornindu-se de la encefalopatia spongiform bovin, ncepnd cu anul 1996 au fost descrise afeciuni umane, dup consumul de carne de vit; maladia poart numele de Creutzfeldt-Jacob noua variant. Principalele manifestri sunt reprezentate de: depresie, anxietate, alterarea ritmului somnveghe. La o treime din pacieni, manifestrile oculare pot masca demena. Deteriorarea mental este rapid progresiv, de la descoperirea simptomelor pn la deces trecnd n medie 7-9 luni. (1) Microorganismul patogen este capabil s colonizeze diferite zone ale gazdei, producnd un proces infecios n primul rnd prin invazia i penetrarea barierelor dermice i ale mucoaselor, multiplicarea ducnd la distrucia tisular i invadarea arborelui limfatic i vascular (sepsis). Aceste aspecte sunt influenate n larg msur de: - factorii de patogenitate ai microorganismului; - factorii de aprare ai gazdei.

9. 2. Patogenitate i virulen. Caracterele de patogenitate ale bacteriilor

124

Patogenitatea reprezint capacitatea unui germen de a declana n organismul gazd fenomene morbide, patogene, modificri locale, generale i functio laesa. Patogenitatea este un atribut de specie i este determinat genetic. Virulena reprezint gradul diferit de patogenitate exprimat n cadrul unei specii. Este un atribut al tulpinii microbiene agresoare. Variabilitatea n exprimarea patogenitii depinde de condiiile n care triete microorganismul respectiv (de exemplu, o populaie bacterian care a pierdut virulena n condiii nefavorabile poate redeveni virulent n anumite condiii, aa cum se ntmpl cu tulpina vaccinal BCG la pacienii cu infecie HIV / SIDA). Virulena poate fi cuantificabil de ex. prin numrul de microorganisme necesare n condiii standard pentru a omor 50% dintr-un grup de animale (acest numr este numit DL50, adic doza letal 50%). Factorii care condiioneaz patogenitatea i virulena unei specii (tulpini) microbiene pot fi: - multiplicarea i invazivitatea manifestat de germenii patogeni; - multiplicarea i elaborarea de toxine de ctre germenii toxigeni (n general exotoxine).

9. 2. 1. Multiplicarea i invazivitatea Germenii patogeni se multiplic la poarta de intrare i invadeaz organismul prin formarea de abcese i prin propagarea din aproape n aproape n pat de ulei, dar pot trece i direct n circulaia general. n acest caz produc infecii la distan. Pentru a avea loc aceast succesiune a evenimentelor, germenii trebuie s poat rezista reaciilor de aprare nespecific a gazdei (de exemplu fagocitozei) i s poat adera de celulele mucoaselor (prin adezine) sau de anexele dermului. Exist o aderen nespecific, de fapt un proces chimic i fizic, reversibil, cu implicarea atraciei hidrofobe, electrostatice dar i a micrii browniene i a existenei biofilmului de polimeri. Aderena specific poate fi la rndul su reversibil dar, dac implic suficient de muli factori (structurali, diferite fore de legtur), poate deveni ireversibil. Biofilmul include populaii bacteriene aparinnd uneia sau mai multor specii, nconjurate de polimeri extracelulari (EPS - extracellular polymeric substances). Microorganismele ader ntre ele, dar i la suprafee, formndu-se o structur asemntoare unui sistem circulator ce permite accesul nutrienilor i eliminarea substanelor reziduale, precum i comunicarea interbacterian. Dezvoltarea biofilmului cuprinde 5 etape (Figura nr. 1): ataarea reversibil, ataarea ireversibil, maturarea 1, maturarea 2 i dispersia. Industrial, biofilmele sunt responsabile de ancrasarea rezervoarelor de stocare i de nfundarea conductelor de ap. Din punct de vedere medical, se pot observa n cazul endocarditei (pe valve), otitei medii, plcii dentare i pot reprezenta o problem pentru pacienii cu fibroz chistic. Biofilmele se dezvolt i pe implanturi sintetice cum ar fi: catetere intravasculare, valve, pacemakere, instrumente ortopedice, lentile de contact etc. O caracteristic foarte important a biofilmelor este reprezentat de rezistena crescut la antibiotice, de pn la 500 de ori mai mare. Responsabile de aceasta sunt att EPS, care acioneaz ca o barier sau care pot chiar inactiva antibioticele, ct i faptul c n cadrul biofilmului bacteriile cresc mult mai greu, astfel nct o activitate metabolic sczut va conduce la o asimilarea mai lent a antibioticelor. 125

Dintre bacteriile implicate n producerea de biofilme amintim: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, streptococi i hemolitici etc. (2) Poate fi luat n discuie i tropismul, care poate fi specific pentru anumite structuri ale gazdei [ex. tulpinile de E. coli uropatogene ader cu ajutorul unei adezine papG (pyelonephritisassociated pili), numai la anumii receptori situai la suprafaa celulelor epiteliale renale] sau ar putea fi specific de specie (de ex. streptococul piogen din grupul A, meningococul sau gonococul infecteaz numai gazda uman). 9. 2. 1. 1. Factori somatici care permit multiplicarea i invazivitatea germenilor - pilii comuni (fimbriile), cu rol n aderare. Bacteriile pot produce unul sau mai multe tipuri de pili, astfel c cele care produc pili specifici, vor fi asociate cu capacitatea de a infecta un anumit tip de esut. De exemplu, E. coli uropatogen prezint pili de tip P sau Pap, avnd tropism pentru tractul urinar. (3) - lectinele (proteine care au tropism pentru carbohidrai); - liganzii (molecule care realizeaz legturi specifice cu anumite molecule complementare de la nivelul substratului); - glicocalixul (component structural extern a polizaharidului de la suprafaa celulei bacteriene); - noroiul (un mediu vscos peribacterian, constnd dintr-o subclas de substane polimerice extracelulare ce conin n general polizaharide i mediaz ataarea nespecific a bacteriilor ntrun strat vscos); - capsula (are proprieti antifagocitare i uneori este implicat n aderare, spre ex. n cazul Streptococcus mutans, cu efecte cario-genetice); - adezinele (de fapt, toi factorii enumerai mai sus pot fi definii drept adezine); - substane componente ale peretelui bacterian - proteina M a streptococului beta-hemolitic de grup A (Figura nr. 2); Proteina M este un dimer ancorat n membrana citoplasmatic, ce va proemina la suprafaa peretelui bacterian, msurnd de la acest nivel 50-60 nm. Aceasta are rolul de a mpiedica fagocitoza sau opsonizarea de ctre PMN, n lipsa anticorpilor specifici; anticorpii se vor lega la captul variabil N-terminal al dimerilor. - antigenul Vi de suprafa al unor bacili Gram-negativi (de exemplu, Salmonella typhi etc). Antigenul Vi este un polizaharid capsular ce are capacitatea de a mpiedica aciunea anticorpilor, are proprieti antifagocitare i crete rezistena la peroxid. Serotipurile care prezint acest antigen sunt: Typhi, Paratyphi C i Dublin. Unele tulpini de Citrobacter freundii produc un compus asociat bacteriei identic cu Vi al primelor dou serotipuri, fiind sursa ideal de antigen Vi, necesar preparrii antiserului. - polizaharidul A al S. aureus (un acid teichoic); - antigenul O al bacteriilor Gram-negative (Figura nr. 3); Antigenul O face parte din lipopolizaharid/lipooligozaharid (LPZ/LOZ), structur ce are rolul de a proteja bacteria de enzime ce au capacitatea de a degrada peptidoglicanul (de exemplu, lizozimul) i ofer rezisten mpotriva srurilor biliare, complementului (diminund activitatea MAC membrane attack complex) i fagocitozei; prezint i activitate mitogen, stimulnd diferenierea policlonal i multiplicarea limfocitelor B, determinnd astfel secreia de imunoglobuline, precum IgM i IgG.

126

LPZ cuprinde 3 regiuni: lipidul A (regiunea I), o poriune centrala rugoas polizaharidic (regiunea II) i polizaharidul O / antigenul O (regiunea III). - antigenele de tip K (cu structur polizaharidic sau polipeptidic - pentru Bacillus anthracis) etc. n ceea ce privete procesul aderenei, se cunoate faptul c orice obiect aflat n imersie atrage particulele suspendate, inclusiv microorganismele, la suprafaa lui. Teoria coloidal DLVO (dup numele autorilor) menioneaz c la nivelul suprafeei de imersie exist 2 poziii de stabilitate termodinamic, prin intervenia gravitaiei, chemotaxiei, forelor de tip van der Waals, forelor electrostatice i tensiunii superficiale (Schema nr. 1). Contrabalansarea forelor de atracie i repulsie conduce la mpingerea dezordonat a particulelor spre un minim secundar, poziie ce se situeaz la suprafaa de imersie. Acest minim secundar corespunde fenomenului de adsorbie sau reinere (docking), proces reversibil. Ulterior sunt implicate i alte fore de legtur (covalente, de hidrogen, ionice, hidrofobe) care vor duce la atingerea minimumului primar, cnd particulele devin legate ireversibil de substrat. Aderena se produce atunci cnd particulele prsesc minimumul secundar i intr n minimumul primar. Pentru unele bacterii (ex. V. cholerae, unele tulpini de E. coli, B. pertussis, Helicobacter pylori) ataarea este destinaia final, n timp ce pentru altele (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia) reprezint doar o etap, urmnd penetrarea tisular i / sau diseminarea n organism. 9. 2. 1. 2. Factori solubili care permit multiplicarea i invazivitatea germenilor (agresine) (Tabelul nr. 1) - coagulaza liber i/sau legat a S. aureus care transform fibrinogenul n fibrin i pe de o parte poate masca bacteria nconjurat de structuri asemntoare cu ale gazdei, pe de alt parte poate preveni fagocitarea sau chiar mpiedica ajungerea antibioticelor i chimioterapicelor la sediul infeciei; - leucocidina secretat dup ce stafilococul a fost fagocitat i care transform leucocitul n piocit (se inser n membrana leucocitului i produce pori sau degradeaz enzimatic fosfolipidele de la nivelul membranei); - producerea unor substane care cresc concentraia intracelular de AMPc pn la concentraii ce inhib fuzionarea fagozom-lizozom (de exemplu la Mycobacterium tuberculosis); - producerea de catalaz (de exemplu: Staphylococcus aureus, Mycobacterium fortuitum), glutation peroxidaz, superoxid dismutaz, citocrom oxidaz (Vibrio spp., Pseudomonas aeruginosa, Neisseria spp.) care inhib sau inactiveaz radicalii activi de oxigen; - producerea unor factori care confer rezisten la enzimele lizozomale, dup fuzionarea fagozom-lizozom (Salmonella enteritidis, Mycobacterium leprae etc); - producerea de enzime litice: 1. colagenaza (este produs de Clostridium histolyticum i Clostridium perfringens i distruge colagenul prezent n muchi facilitnd rspndirea procesului infecios), hialuronidaza (scindeaz acidul hialuronic, o component a esutului conjunctiv), fibrinolizina (determin liza cheagului prin convertirea plasminogenului n plasmin) etc (streptococ, stafilococ, unele clostridii);

127

2. lecitinaza (distruge lecitina din structura membranei celulare, de exemplu Clostridium perfringens, Bacillus anthracis); 3. fosfolipaza (toxina a) (realizeaz hidroliza fosfolipidelor din membrana celular, prin ndeprtarea capetelor polare, de exemplu Clostridium perfringens); 4. neuraminidaze (degradeaz acidul sialic, de exemplu V. cholerae, Shigella dysenteriae); 5. proteaze, nucleaze ( DN-aze, RN-aze cu activitate endo- i exonucleazic asupra ADN i ARN, genernd 3-nucleotide), carbohidraze, lipaze etc; 6. hemolizine sunt enzime ce lizeaz hematiile din mediile de cultur cu snge (streptococ, stafilococ, unele clostridii) etc. - producerea unor substane care inhib sau modific rspunsul imun 1. IgA proteaza (cliveaz IgA n regiunea balama, de exemplu gonococ, meningococ, H. influenzae); 2. proteina A stafilococic (inhib opsonizarea); 3. endotoxina care crete sinteza de IL-1, IL-6, IL-8, TNF- etc; 4. inducerea apariiei unor reacii autoimune; 5. producerea superantigenelor (de exemplu S. aureus prin producerea toxinei implicat n sindromul de oc toxic, TSST-1), molecule care pot activa independent celulele T4 (sunt printre cei mai puternici mitogeni ai limfocitelor T); stimularea datorat lor poate determina att anergie, ct i hiperactivarea sistemului imun. (Figura nr. 4) Rezult o secreie n exces de IL-2 care interfer cu sinteza altor citokine (TNF-, IL-1, IL-8 etc). Alte exemple de superantigene ar fi: toxina pirogenic streptococic (produs de tulpinile lizogenizate), enterotoxinele stafilococice (S. aureus), subtane cu efecte asemntoare hormonilor (ex. toxina stabil termic produs de E. coli enterotoxigen) etc. Fiecare din substanele de mai sus are un rol bine definit n evoluia reaciei inflamatorii locale.

9. 2. 2. Multiplicare i toxinogenez Germenii se multiplic la poarta de intrare i elaboreaz exotoxine care produc alterri celulare i distrucii tisulare la distan, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote i prin functio laesa (toxikon era otrava n care erau nmuiate sgeile lupttorilor greci). Din punct de vedere didactic trebuie menionate urmtoarele noiuni: 9. 2. 2. 1. Exotoxinele

128

Exotoxinele sunt elaborate n general de microbi Gram-pozitivi lizogenizai (de exemplu bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar i de bacili Gram-negativi, prin mecanism cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli). (Tabelul nr. 2) Au structur proteic, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar legrii de receptorii celulei gazd i internalizrii ulterioare a poriuni enzimatice A (active). Exotoxina nu i exercit efectele toxice dect dup ce poriunea A este eliberat din structura iniial. Sunt secretate n timpul vieii germenilor. Sunt difuzibile la distan. Toxicitatea lor este foarte mare, doza letal fiind de circa 0,1 g/kg corp (pn la 1 ng/kg corp n cazul toxinei botulinice). Au afinitate diferit n funcie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard, SNC, rinichi n cazul bacilului difteric). Manifestrile clinice apar dup o perioad de laten (cnd toxina este deja fixat pe celulele int). Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecii i reprezint urgene medicale, toxina putnd fi neutralizat numai dac este liber n circulaie. Au putere antigenic mare, fa de ele aprnd anticorpi antitoxin. Un alt exemplu important privind exotoxinele se refer la Tcd A i Tcd B, produse de Clostridium difficile i care acioneaz asupra celulelor intestinului gros, fiind responsabile de o boal diareic uoar, pn la colit fulminant. Ele produc la acest nivel leziuni microscopice, dar i leziuni mari, asemntoare unor plgi; endoscopic, se vor identifica noduli. Prin degradarea proteinelor Rho, Rac i Cdc 42, responsabile de reglarea proceselor structurale dependente de polimerizarea actinei, se poate observa la microscopul electronic alterarea microfilamentelor de actin, rezultnd marginalizarea nucleului, schimbri n morfologia citoscheletului, dar i alte modificri (alterarea suprafeei celulare i rearanjarea microvililor). (Figura nr. 5) Astfel, modificrile produse de toxinele Tcd A i Tcd B sunt: inflamaia, creterea permeabilitii esutului epitelial intestinal, stimularea producerii de chemokine i citokine, acumularea de neutrofile, producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului, activarea mastocitelor, producerea substanei P, distrugerea direct a mucoasei intestinale, ruperea jonciunilor strnse (Zonula occludens), degradarea actinei F. Substana P este responsabil de: activarea neuronilor din submucoas, eliberarea TNF-, activarea macrofagelor din lamina propria; este implicat n diareea inflamatorie. 9. 2. 2. 2. Antitoxinele Avnd structur proteic, exotoxinele sunt imunogene i determin apariia de anticorpi specifici (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxic prin cuplare specific cu toxina. (Tabelul nr. 3) Se pot obine astfel seruri imune utile n seroterapia specific. De regul aceste seruri sunt preparate pe cal i sunt utile n neutralizarea exotoxinelor (ex. n tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului). Administrarea antitoxinelor trebuie fcut cu precauie datorit faptului c anticorpii preparai pe cal reprezint n acelai timp i antigene pentru gazda uman, dar n acelai timp ct mai curnd posibil. Tratamentul acestor entiti clinice este complex i nu reprezint subiectul acestui manual. Administrarea antitoxinelor trebuie fcut dup o testare a unei eventuale hipersensibiliti i n cazul c aceasta exist se recurge la desensibilizare i abia ulterior la seroterapie (administrarea 129

de antitoxin). O alternativ ar fi administrarea de imunoglobuline umane specifice, dac acestea sunt disponibile. 9. 2. 2. 3. Anatoxinele Exotoxinele pot fi detoxifiate ntr-un anumit interval de timp sub aciunea conjugat a temperaturii i formolului. Prin acest procedeu i pierd puterea toxic, dar i menin puterea imunogen i devin anatoxine. Anatoxinele se utilizeaz n profilaxia bolilor produse de germenii respectivi (n cadrul vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum i pentru hiperimunizarea animalelor n scopul obinerii de seruri antitoxice (antidifteric, antitetanic, antibotulinic etc). 9. 2. 2. 4. Endotoxinele Endotoxinele au fost evideniate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei externe. Sunt elaborate de acetia i apoi incluse n peretele bacterian, eliberndu-se n urma distrugerii germenilor. Au structur lipopolizaharidic (LPZ sau LOZ), n constituia lor intrnd acizi grai, un lipid A i lanuri de polizaharide. (Figura nr. 6) Au efecte toxice la nivelul celulelor majoritii mamiferelor; aceste efecte sunt similare indiferent de specia bacterian care le elibereaz. Toxicitatea lor este ceva mai redus (n comparaie cu exotoxinele), dar pot aciona la mai multe nivele inducnd apariia febrei, leucopeniei, hiperpermeabilitii vasculare, hipotensiunii arteriale pn la colaps, sindromului de coagulare intravascular diseminat etc. Sunt implicate ntre altele n apariia ocului endotoxic (se elibereaz o cantitate de endotoxin proporional cu numrul germenilor distrui). Studiile arat c mortalitatea n ocul endotoxic este n relaie destul de direct cu cantitatea de endotoxin / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se identific 100 uniti endotoxin / ml de plasm. Aa cum am menionat n capitolul privind structura bacterian, componenta toxic este reprezentat de lipidul A; totui, i polizaharidul O (structur antigenic) contribuie la patogenitate s-a dovedit c bacteriile de la care s-a extras polizaharidul O sunt mai uor distruse prin mecanisme care implic sistemul complement. LPZ aflat n circulaie se cupleaz cu proteine plasmatice (LPS-binding plasma proteins) i apoi este recunoscut prin intermediul receptorilor CD14 de ctre monocite i macrofage. Se activeaz rspunsul inflamator, coagularea intravascular, apariia de hemoragii i n final poate rezulta ocul. Sunt implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 i TNF- care la rndul lor stimuleaz cutia Pandorei i respectiv producia de leucotriene i prostaglandine (cu efect de cretere a fenomenelor inflamaiei). Sunt activate att sistemele de coagulare ct i sistemul complement iar cascadele de reacii care apar sunt rareori reversibile n urma tratamentului. Puterea antigenic i imunogen este mai redus fa de exotoxine. LPZ n calitate de mitogen stimuleaz o activare policlonal a LB, cu secreia de IgG i IgM. n afara LPZ sau LOZ, mai sunt i alte endotoxine, prezente la bacteriile Gram-pozitive: - delta endotoxina prezent la Bacillus thuringiensis, toxin care nu afecteaz omul, deoarece acesta nu prezint enzime i receptori care s o proceseze; - Listeria monocytogenes produce o substan endotoxin-like etc.

9. 3. Aprarea organismului fa de infecii 130

Aprarea organismului fa de infecii se realizeaz prin diferite mijloace nespecifice i specifice. Acestea exprim mpreun capacitatea normal de pstrare a homeostaziei organismului prin rezistena fa de aderarea microorganismelor de celulele esuturilor expuse, fa de colonizarea i multiplicarea germenilor n organism, prevenind invazia agenilor patogeni. Principalele componente ale aprrii antiinfecioase sunt reprezentate de: 9.3.1. bariera anatomic cutaneo-mucoas, care acioneaz prin: - Integritatea sa anatomic: Pielea este o barier n faa invaziei microorganismelor deoarece este format din straturi de celule strns unite ntre ele, dar i datorit stratului de keratin. Descuamarea continu a straturilor pielii are rol n eliminarea microorganismelor. n general bacteriile nu pot penetra pielea. Procesul infecios poate debuta n urma unor traumatisme, intervenii chirurgicale, utilizarea de catetere iv, interveniei unor vectori. (3) - Sinteza unor peptide cu rol dezinfectant: dermicidin, -defensin. Acestea au i rol de chemokine, favoriznd migrarea celulelor cu rol n fagocitoz. - Mucoasele sunt umede i dein mai multe bacterii dect pielea. Majoritatea celulelor epiteliale secret aceleai peptide ca i cele ale pielii. n plus conin saliv, mucus, lacrimi, cu rol antimicrobian. Lacrimile au rol protector i prin coninutul crescut de lizozim. - Prezena de: IgA secretorii (sunt secretate IgA i IgG cu rol n aglutinarea, dar i blocarea competitiv a receptorilor celulelor. Cantitatea de IgA la nivelul fluidelor mucoaselor este mai mare dect IgG datorit rezistenei acesteia la proteoliz prin cuplarea cu un polipeptid. IgA se poate lega de bacteriile patogene intracelulare mpiedicnd ptrunderea acestora n celule.), lactoferin (protein cu rol n legarea fierului. Fierul este un element important pentru supravieuirea bacteriilor. Cu toate acestea, bacteriile care colonizeaz pielea i mucoasele au mecanisme de achiziionare a fierului chiar n prezena acestor proteine), alfa 1 antitripsin, lizozim (joac unul din rolurile cele mai importante, avnd efect antimicrobian asupra bacteriilor gram pozitive prin hidroliza aminoacizilor din componena peptidoglicanilor) etc.; - pH-ul acid al unor secreii locale: pH-ul acid i flora bacterian au rol n inhibarea invaziei bacteriilor patogene. Zonele inflamate au susceptibilitate crescut la colonizare. - Prezena microflorei normale, ce constituie nia ecologic pe care germenii nou venii tind s o ocupe. Flora comensal este un ecosistem cu rol n aprarea mpotriva invaziei microorganismelor patogene. Mecanismele competitive sunt: competiia pentru aceleai substane nutritive, competiia pentru aceiasi receptori. Secret i bacteriocine, fiind toxice pentru alte bacterii, dar de obicei din aceeai specie, acizi grai volatili sau ali metabolii toxici. 9.3.2. barierele de organ - Bariera hematoencefalic: este o barier fiziologic ntre sistemul sangvin i sistemul nervos central (SNC). Aceasta servete la meninerea unei homeostazii constante n SNC. Aceast barier are rolul de filtru, mpiedicnd ptrunderea n creier a unor substane toxice, germeni patogeni, care se pot afla n snge. n acelai timp bariera permite ptrunderea din snge a substanelor nutritive necesare SNC. - Tractul respirator: particulele inhalate pot supravieui filtrrii n tractul respirator superior i traheobronic. Fluxul turbulent determin depunerea particulelor de dimensiuni mari la nivelul mucusului tractului respirator, iar sistemul mucociliar le ndeparteaz din plmani. Efortul de 131

tuse ajut la eliminare. Secreiile bronice conin substane precum: lizozim, -defensine, lectine. Cnd particulele inhalate ajung la nivelul alveolelor ndeprtarea este realizat de macrofage i histiocite. Toate aceste mecanisme de aprare pot fi nvinse de microorganisme prin cantitatea acestora sau prin expunere ndelungat. Poluarea aerului, prezena traheostomei, agenii alergici, defectele genetice etc. pot diminua mecanismele de aprare ale tractului respirator. - Tubul digestiv: Bariera acestuia este reprezentat de aciditatea gastric i rolul antibacterian al diferitelor enzime (pancreatice, intestinale, biliare). Peristaltismul i descuamarea celulelor epiteliale au i ele rol n aprarea antimicrobian. Salmonella spp. i M. tuberculosis produc infecii la persoanele cu aclorhidrie, iar peristaltismul ncetinit favorizeaz infecia cu Shigella spp. Pierderea jonciunilor strnse dintre enterocite poate favoriza translocarea bacteriilor n circulaie. - Tractul genitourinar: urina este n mod normal steril. Factorii care mpiedic colonizarea bacterien sunt pH-ul, ureea, hipertonicitatea, glicoproteina Tamm-Horsfall (produs de rinichi i excretat n cantitate mare n urin). Glicoproteina Tamm-Horsfall acioneaz ca un burete, bacteriile leagndu-se de aceasta i astfel mpiedicnd colonizarea esuturilor. Tractul urinar inferior este splat de fluxul urinar de 4-8 ori pe zi, eliminnd organismele patogene. Retenia urinar este una dintre principalele cauze ale infeciilor urinare. 9.3.3. ganglionii limfatici de pe traiectul vaselor limfatice; Link Capitolul 10 9.3.4. sistemul fagocitar: Fagocitoza este mecanismul de nglobare i distrugere a microorganismelor de ctre celulele dendritice, PMN, macrofage etc. Macrofagele se gsesc n toate esuturile corpului, iar celulele PMN i monocitele circul prin snge i sistemul limfatic. Chemokinele au rol n iniierea migrrii celulelor fagocitare spre esuturi, avnd rol n inflamaie. Cnd o bacterie este internalizat ntr-un fagozom, este distrus de radicalii de oxigen, i de diverse peptide. Microorganismele sunt digerate, iar peptidele se cupleaz cu moleculele complexului major de histocompatibilitate, fiind ulterior prezentate limfocitelor T, determinnd multiplicarea acestora i activarea rspunsului imun celular i umoral. Fagocitoza este mai eficient n spaiile intratisulare nguste (alveolele pulmonare), dect la nivelul suprafeelor ntinse (sinovial) sau n snge. Opsonizarea favorizeaz fagocitoza. 9.3.5. sistemul complement; Link Capitolul 15 (Sistemul complement) 9.3.6. citokinele: Link Capitolul 13 (Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi) - interferonii (alfa, beta, gamma); - interleukinele; - colony-stimulating factor (CSF); - citolizinele-factorul de necroz al tumorilor (TNF) alfa i beta; - poliperforinele; - factorii de cretere, de exemplu transforming growth factor (TGF) alfa i beta; - factorii supresori i inhibitori ai multiplicrii. 9.3.7. sistemul imun (umoral i celular);

132

9.3.8. ali factori: - complexul major de histocompatibilitate (MHC); Link Capitolul 12 - imunitatea de specie (natural, nnscut); - factorii nutriionali (vitamine, fier, zinc etc): Scderea fierului seric poate fi rezultatul rspunsului inflamator. Bacteriile necesit fier pentru cretere. Transferina are rol n legarea fierului i transportarea sa n macrofage, scznd astfel, cantitatea de fier pe care o pot folosi bacteriile. Nivelul de zinc scade n timpul inflamaiei. Acesta grbete vindecarea rnilor, are rol n sinteza proteic i crete responsivitatea limfocitelor. Persoanele malnutrite sunt predispuse la infecii severe. Cele mai importante vitamine (din acest punct de vedere) sunt vitaminele A i D. Anecdotic, anterior descoperirii tuberculostaticelor, tuberculoza se trata prin diet; pacientul consuma pn la 30 de ou zilnic. - factorii endocrini: vasopresina, insulina, glucagonul cresc cantitativ. Catabolismul proteic produce aminoacizi care ulterior vor fi folosii la sinteza celulelor de aprare i a proteinelor. Estrogenii au rol n protecie la nivel vaginal. Activitatea limfocitelor T este inhibat n timpul sarcinii, astfel pot aprea infecii severe cauzate de virusul poliomielitei, streptococii hemolitici de grup A, N. gonorrhoeae mai ales pn n trimestrul al III-lea de sarcin. - factori genetici: Susceptibilitatea, mortalitatea i morbiditatea legate de infecie sunt influenate de bagajul genetic. Cauzele pentru aceast susceptibilitate crescut sunt polimorfismul genetic, defecte ale componentelor complementului, citokinelor, chemokinelor sau ale receptorilor acestora. - stresul: Stresul crete susceptibilitatea organismului la infecii. - sistemul nervos central.

9. 4. Povestiri adevrate 9. 4. 1. LPZ i CID Coagulare intravascular diseminat n cadrul unei enterocolite ulceronecrotice la un prematur cu nutriie parenteral total (Punct de plecare: LPZ-ul germenilor Gram-negativi) n primvara anului 2007, ntr-o maternitate din Bucureti s-a nscut pe cale natural un prematur cu vrsta de gestaie de 30 sptmni i greutate de 1.600 g, cu scorul Apgar 7 (la 5 minute de la natere). Mama copilului a prezentat n cursul sarcinii infecii urinare recidivante cu Escherichia coli. Cu circa 12-14 ore nainte de natere a avut loc ruperea prematur a membranelor (travaliul cu membrane rupte peste 12 ore implic riscul producerii de infecii). Prematurul a prezentat de la natere o detres respiratorie, pentru care a necesitat ventilaie cu presiune pozitiv continu i nutriie parenteral total (avnd, n plus, intoleran digestiv). Nutriia parenteral continu a presupus cateterizarea venoas central a copilului. ntruct aceast cateterizare, asociat cu ventilaia asistat cresc riscul infecios al nou-nscutului, s-a instituit antibioterapia empiric de protecie cu ampicilin i gentamicin. Evoluia copilului a fost iniial favorabil timp de o sptmn, pentru ca ulterior acesta s dezvolte o patologie digestiv manifestat prin abdomen meteorizat (mrit de volum), vrsturi bilioase i scaune sanguinolente, asociate cu febr (39C). S-a pus diagnosticul clinic i radiologic de enterocolit ulceronecrotic (necroz intestinal de etiologie incert) i sepsis neonatal.

133

Testele de laborator efectuate (procalcitonin, proteina C reactiv) au fost intens pozitive. Culturile din aspiratul gastric i materii fecale au evideniat prezena E. coli. Hemocultura a fost negativ, ceea ce nu este surprinztor n contextul n care nou-nscutul a primit tratament cu antibiotice anterior recoltrii probelor. Pe parcursul urmtoarelor zile, copilul a dezvoltat simptome clinice i paraclinice de CID (coagulare intravascular diseminat): sngerri la locurile de injectare, hemoragie pulmonar, trombocitopenie, timp parial de tromboplastin i timp de protrombin crescute, hipofibrinogenemie, prezena n cantitate mare a produilor de degradare ai fibrinei). S-a instituit terapia de urgen cu imipenem i gentamicin (la care E. coli se dovedise a fi sensibil), cu plasm proaspt congelat i cu concentrat trombocitar. Starea copilului nu s-a ameliorat sub tratament, hemoragia pulmonar agravndu-se. S-a efectuat, ca ultim alternativ, o transfuzie de snge izogrup i s-a recurs la ventilaie asistat n sistem IPPV Intermittent Positive Pressure Ventilation. Evoluia copilului a fost n continuare nefavorabil, hemoragia pulmonar continund s se agraveze i ducnd n final la stop cardiorespirator ireversibil la manevrele de resuscitare. Nou-nscutul a decedat dup 10 zile din cauza sindromului de CID. Discuii Sursa infeciei cu E. coli nu a putut fi precizat cu certitudine (medicii au suspicionat, totui, ca surs cea mai probabil, lichidul amniotic infectat al mamei). Detresa respiratorie, ventilaia asistat i cateterizarea venoas central au constituit factori de risc major n producerea enterocolitei ulceronecrotice. Necroza esutului intestinal a favorizat diseminarea pe cale sanguin a E. coli existent la acel nivel. Astfel, s-a instalat sepsisul neonatal, care s-a complicat ulterior cu CID. Complexitatea cazului, prin multitudinea complicaiilor aprute, a fost un factor de gravitate care a condus n final la decesul copilului. 9. 4. 2. Infeciile cu Staphylococcus aureus comunitar meticilino-rezistent la pacienii transplantai renal Tnr de 32 ani, afro-american, cu hipertensiune i diabet zaharat tip 1, transplantat renal n urm cu 28 luni se interneaz pentru febr, durere n flancul stng, i o scdere n greutate de peste 10 kg n ultima lun. De aproximativ 6 luni pacientul acuz dureri intermitente n flancul stng. n ultimul an, pacientul a avut multiple episoade de furunculoz i celulit fesier. Culturile efectuate evideniaz un Stafilococ auriu meticilino-rezistent, cu urmtoarele rezultate la antibigram: rezistent la oxacilin, eritromicin, dar sensibil la vancomicin, biseptol, tetraciclin, rifampicin, linezolid. Leziunile au fost incizate i drenate, iar apoi a primit tratament cu cefalexin, augmentin, biseptol i a efectuat decolonizarea nazal cu mupirocin. (4) n cursul anamnezei, pacientul relateaz raporturi sexuale cu persoane de acelai sex i i se efectueaz serologia HIV, rezultatul fiind negativ. Cura posttransplant a fost efectuat fr complicaii cu tacrolimus, micofenolat mofetil i prednison. La examenul obiectiv: temperatura 36,9C, puls 74/min, TA 100/68 mmHg, frecvena respiratorie 19/min. Analizele de laborator evideniaz o leucocitoz (20.200 cel/mm3) cu neutrofilie, VSH de 107 mm/h, Proteina C reactiv 21,5 mg/dl, creatinina 1,8 mg/dl.

134

Examenul CT abdomino-pelvin evideniaz un abces la nivelul iliopsoasului de 6,6 pe 8,5 cm, iar pe IRM-ul de coloan lombar se observ osteomielit la nivelul corpului vertebral L5 i a procesului stng transvers. Abcesul a fost drenat, iar n culturi a crescut Staphylococcus aureus meticilino-rezistent. Culturile n anaerobioz au fost negative. Hemoculturile nu s-au pozitivat. A efectuat 6 sptmani tratament parenteral cu vancomicin, urmat 2 sptmni de tratament cu linezolid per os datorit dorinei pacientului de a merge la munc. A primit apoi Biseptol nc 8 sptmni. Dup terminarea tratamentului VSH-ul a sczut la 14 mm/h, cu o Protein C Reactiv 0,7 mg/dl. La 6 luni nu s-au nregistrat recderi. n afar de identificare bacteriei i antibiogram s-a efectuat i latex aglutinare pentru evidenierea PB2 (protein binding 2). Cu ajutorul tehnicii PCR a fost detectat fraciunea genic responsabil de sinteza leucocidinei Panton-Valentine. (5) Discuii: Infeciile reprezint complicaiile cele mai frecvente la pacienii transplantai. Infeciile cu Stafilococ auriu meticilino-rezistent sunt predominant infecii intraspitaliceti i au devenit o problem de sntate public. (6) Un alt factor de risc important pentru infecia cu Stafilococ este i diabetul zaharat. Leucocidina PantonValentine este un factor solubil, care permit multiplicarea i invazivitatea stafilococului. Determin liza polimorfonuclearelor i monocitelor. Este considerat un factor de virulen, care determin creterea severitii bolii att n afeciunile cutanate, ct i n osteomielit sau pneumonii necrotizante.

9. 5. Direcii de cercetare 1) Un nou mecanism ce afecteaz virulena i sensibilitatea la antibiotice a Salmonella spp. http://www.sciencedaily.com/releases/2010/07/100729172433.htm 2) Toxinele: prieteni sau dumani? http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2640701/pdf/10221874.pdf 3) Penetrarea barierei snge-creier de ctre Staphylococcus aureus (rolul acidului lipoteichoic) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2893325/ 4) Reglarea expresiei hemolizinelor i a virulenei Stafilococului auriu de ctre diverse kinaze i fosfataze http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2884019/ 5) Noi Metalo--Lactamaze http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20577157 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2786356/ 6) Patogenitate bacterian http://textbookofbacteriology.net/pathogenesis.html

9. 6. Evaluarea cunotinelor

135

1. Prionii sunt constituii din: A. ADN-nveli proteic B. ARN-nveli proteic C. o particul proteic D. miez glucidic + nveli proteic 2. Lactoferina are capacitatea de legare a: A. fierului B. zincului C. cuprului D. magneziului 3. Biofilmul: A. reprezint o populaie bacterian aparinnd unei specii B. cuprinde bacterii ce ader doar ntre ele C. se poate dezvolta pe un cord transplantat D. cuprinde bacterii sensibile la penicilin E. cuprinde bacterii i polimeri extracelulari 4. Sunt factori solubili care permit multiplicarea i invazivitatea germenilor: A. coagulaza, glicocalixul, capsula B. superoxid dismutaza, proteina M, antigenul Vi C. leucocidina, catalaza, hemolizine D. antigenul K, pilii, capsula 5. Una dintre urmtoarele reprezint o substan ce modific rspunsul imun: A. neuramidaza B. Ig A proteaza C. pilii D. noroiul

Bibliografie 1. Gerald L. Mandell, John E. Bennett, Raphael Dolin, 2009, Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, 37-47, 2423-2435. 2. Topley, Wilson, 2006, Microbiology and Microbial Infections 10th edition 3. Gerald L. Mandell, John E. Bennett, Raphael Dolin, 2005, Principles and Practice of Infectious Diseases, 6th ed., 20-23 4. Dehority W., E. Wang, P. S. Vernon, C. Lee, F. Perdreau-Remington, and J. Bradley, 2006, Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus necrotizing fasciitis in a neonate, Pediatr. Infect. Dis. J., 25, 1080-1081

136

5. Salliot C., V. Zeller, X. Puechal, V. Manceron, S. Sire, N. Varache, J. Etienne, N. Desplaces, J. M. Ziza, 2006, Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus aureus infections: report of 4 French cases, Scand. J. Infect. Dis., 38, 192-195 6. Linares L., C. Cervera, F. Cofn, M. J. Ricart, N. Esforzado, V. Torregrosa, F. Oppenheimer, J. M. Campistol, F. Marco, and A. Moreno, 2007, Epidemiology and outcomes of multiple antibiotic-resistant bacterial infection in renal transplantation, Transplant. Proc., 39, 2222-2224

137

Noiuni de imunologie
Imunologia este o tiin care a aprut relativ recent, iniial ca un domeniu al Microbiologiei, studiind mecanismele de aprare a organismelor (uman i animal) fa de agresiunea din cursul procesului infecios. n Imperiul Roman immunitas nsemna scutirea de anumite obligaii. n primul secol dup Iisus Christos, descriind rezistena la veninul unor erpi veninoi, Lucanus a considerat c immunitas nseamn scutit de a te mbolnvi. Observaiile medicului englez Edward Jenner privind faptul c o parte dintre persoanele care mulgeau vacile nu s-au mbolnvit n cursul epidemiei de variol, dar i faptul c pustulele care apreau pe ugerul vacilor, ca i pe tegumentul minii persoanelor care mulgeau se asemnau, au dus la concluzia c ntre aceste fenomene exist o legtur. n 1796, Jenner a realizat una dintre primele experiene pe om (a inoculat secreie din pustulele de la vaci la un copil; ulterior a inoculat secreie de la pacieni cu variol, iar copilul se pare c nu s-a mbolnvit de variol). Cu toate acestea, reaciile n mass-media vremii nu au ntrziat s apar. (Figura nr. 1) vacile din poza de la RM Imunologia a fost fundamentat de studiile realizate de ctre marii cercettori Pasteur i Metchnikoff. Louis Pasteur a vaccinat gini mpotriva holerei aviare, a vaccinat oi mpotriva antraxului i a reuit prevenirea infeciei cu virusul rabic. Pasteur a decis s denumeasc procedeul de inoculare cu germeni atenuai, urmat de protecia fa de boal, vaccinare (probabil pentru c Jenner a obinut primele sale rezultate recoltnd i inoculnd produsul obinut de la vaci). Ilia Metchinikoff a descoperit fagocitoza. Emil von Behring i S. Kitasato au studiat fenomenul prin care se obin antitoxinele i ulterior au realizat experimentele care au stat la baza seroterapiei. Despre hipersensibilitate a nceput s se discute n 1902, iar termenul de histocompatibilitate este cunoscut din 1946. Aceste studii i multe altele, care ar merita dedicarea unui volum ntreg, mult amplificate n deceniile care au urmat sunt mai departe n continu micare, cu numeroase descoperiri chiar i n prezent. Relaia ntre organismul gazd i sistemul imun (organe, celule, anticorpi, citokine etc) ar putea fi asemnat cu relaia stabilit ntre o ar i armata rii respective, cu sisteme de control, sisteme de comand, reacii la nevoie (uneori n regim de urgen) n care exist implicare important i din partea altor sisteme (nervos, endocrin). Mai mult dect n exemplul privind situaia la nivelul unei ri, soldaii din sistemul imun (de ex. LT citotoxice, celulele NK) pot avea att o activitate efectoare ct i de control i retro-control (i depesc limitele de simpli soldai). S-ar putea ridica o ntrebare i anume: de ce avem nevoie de un sistem imunitar? S nu uitm faptul c n fiecare zi organismul nostru se ntlnete cu nenumrabile microorganisme: bacterii, virusuri, parazii etc. Unele microorganisme nu ne afecteaz n nici un mod, altele au efecte benefice fa de organismul nostru, n timp ce o mare parte dintre microorganisme pot duce la apariia unor mbolnviri. n acest context, sistemul imun a fost nevoit s gseasc modaliti prin care s lupte mpotriva microorganismelor patogene i condiionat patogene. Mai mult dect att, chiar i substane strine (non-self) neinfecioase dar i structuri proprii modificate pot duce la un rspuns imun. S-a demonstrat i faptul c mecanisme care n mod normal protejeaz organismul de eventualele infecii pot fi implicate n determinarea unor leziuni tisulare sau de organ. 138

Avnd n vedere toate aceste aspecte (dorim s subliniem faptul c realitatea este cu mult mai complex), o definiie a imunitii ar putea fi urmtoarea: imunitatea reprezint o reacie fa de orice structur non-self (fie microorganism sau o substan strin de tipul unei macromolecule proteice, glicoproteice etc) sau fa de o celul sau structur proprie care a suferit modificri. Informaiile privind sistemul imun sunt prezentate n cadrul mai multor catedre i discipline. Avnd drept int o ct mai bun nelegere a capitolelor pe care ne-am gndit s le introducem n Manualul de Microbiologie dorim s facem o scurt trecere n revist a organelor, celulelor, moleculelor i mecanismelor implicate n imunitate. Menionm faptul c nu vei gsi aici toate definiiile i explicaiile; pentru aceasta cititorul va trebui s parcurg fiecare capitol n parte. Etapele pe care le descriem au doar scop didactic; n realitate fenomenele se petrec simultan i sunt mult mai complexe dect pot fi explicate ntr-un simplu manual sau chiar i dect ar putea fi acestea explicate de oamenii de stiin, n acest moment. Ceea ce noi cunoatem este, de fapt, o pictur ntr-un ocean. Astfel, ne propunem s lum ca exemplu un microorganism oarecare - un antigen. n cazul n care acesta reuete s depeasc barierele naturale ale organismului (piele, mucoase etc) i s ptrund n gazd, urmtoarea linie de aprare este reprezentat de imunitatea nnscut. Fagocitele reprezentate spre exemplu de macrofage i granulocite recunosc microbii de orice fel (recunoaterea nu este specific) i ncep procesul de fagocitoz. Apare i rspunsul inflamator. Ulterior intr n aciune imunitatea adaptativ care se manifest cu ajutorul limfocitelor. Aceasta din urm este specific deoarece dezvolt n timp (cateva zile) celule i molecule specifice pentru a lupta strict mpotriva acestui antigen. O alt deosebire major ntre cele dou tipuri de imunitate este reprezentat de capacitatea limfocitelor de a se transforma n limfocite cu memorie dup ntlnirea cu un anumit antigen. Astfel, spre deosebire de macrofage i granulocite, la o a doua ntlnire cu acelai antigen, limfocitele l vor recunoate iar procesul de aprare se va declana mult mai rapid. Explicnd puin mai n n profunzime (menionm c explicaii mai detaliate vor fi furnizate n capitolul 11 i n alte capitole care urmeaz) avem n vedere faptul c antigenul ptruns n organism este captat de ctre celulele prezentatoare de antigen (APC) (macrofage, celule dendritice, limfocite B etc). Antigenul nu poate fi recunoscut ca atare de ctre sistemul imun deoarece doar o anumit parte a lui numit epitop prezint proprietatea de imunogenicitate la valoare maxim i poate declana un rspuns imun. Antigenul este endocitat de ctre APC, prelucrat n lizozomi iar epitopii rezultai vor fi prezentai limfocitelor n complex cu moleculele sistemului major de histocompatibilitate (MHC). MHC include molecule prezente pe celulele organismului uman (vezi capitolul 12). Limfocitele vor declana un rspuns imun. Exist dou tipuri principale de limfocite i anume limfocitele T i limfocitele B, dup cum exist dou tipuri de rspuns imun, umoral i celular. Limfocitele T secret citokine care pot activa oricare din cele dou tipuri de rspuns imun iar limfocitele B (dup proliferare i blastizare) secret imunoglobuline (anticorpi) implicate n rspunsul imun umoral. Antigenele pot fi clasificate n mai multe grupe: exogene/endogene, timodependente/ timoindependente etc. Rspunsul imun umoral este declanat de antigene exogene timodependente i independente prezentate pe MHC II, iar rspunsul imun celular este declanat de antigene endogene timodependente prezentate pe MHC I. 139

n cazul n care ne ntrebm: cine produce aceste celule i unde se desfoar rspunsul imun? O parte a explicaiei ar include existena organor limfoide primare precum mduva osoas hematogen (sediul producerii limfocitelor T i B i maturrii limfocitelor B) i timusul (sediul maturrii limfocitelor T) i organe limfoide secundare precum pulpa alb a splinei unde se desfoar rspunsul imun umoral i este iniiat cel celular care se desfoar apoi la locul infeciei i ganglionii limfatici (vezi i capitolul 10). Sistemul imun se poate confrunta cu o mare problem, i anume, aceea de a menine balana ntre un rspuns imun eficace i limitarea apariiei de leziuni tisulare (n cadrul unui RI exagerat). Cnd aceast balan se rupe apar bolile autoimune i strile de hipersensibilitate. Povestire adevrat: Povestea vaccinului Edward Jenner s-a nscut pe data de 17 mai 1749 n Berkeley, Gloucestershire. nca de mic el a fost interesat de tiine i natur. Pe atunci circula zvonul cum c lptresele sunt protejate de variol, zvon pe care l-a auzit i el. La 21 ani a plecat n Londra i a devenit studentul lui John Hunter, cel mai renumit chirurg din Anglia i un respectat i cunoscut biolog i anatomist. ntre cei doi s-a nchegat o prietenie adevrat. Jenner a studiat geologia i a fcut mai multe experimente cu snge uman. A ctigat experien n biologie i bineneles, n chirurgie. De-a lungul anilor, Jenner a tot auzit zvonul c lptresele erau protejate de variola. Punnd lucrurile n balan, Jenner a concluzionat c forma de variol fcut de vaci ar putea avea o oarecare legtur cu un posibil mecanism de protecie. n mai 1796 a gsit o tnr lptreas, Sarah Nelms, care avea leziuni nou aprute datorit variolei vacilor pe mini i brae. Pe data de 14 mai 1796 a inoculat material din leziunile ei la biatul unui servitor n vrst de 8 ani, James Phipps. Ulterior, biatul a prezentat febr i discomfort n zona axilar. La 9 zile a prezentat simptomele unei rceli i i-a pierdut apetitul dar ziua urmtoare era iar bine. n iulie 1796 Jenner l-a inoculat iar pe biat, de data aceasta cu material dintr-o leziune nou aprut de variol uman. Baiatul nu a dezvoltat boala aa c Jenner a concluzionat c acesta era protejat complet. n 1797, Jenner a trimis un scurt comunicat spre Societatea Regal descriind experimentul i observaiile sale. Totui, lucrarea a fost respins. n 1798, dup ce a mai experimentat pe civa oameni, Jenner a publicat o mic carte numit O incursiune n cauzele i efectele vaccinului antivariolic, o boal descoperit n unele din rile vestice ale Angliei, mai ales n Gloucestershire i cunoscut sub numele de variola vacilor. Cuvntul latin pentru vac este vacca iar pentru variola vacilor este vaccinia. Jenner a decis s denumeasc aceast nou procedur vaccinare. n 1798 publicaia avea trei pri. n prima parte Jenner prezint viziunea sa legat de variola vacilor ca o boal a cailor transmis la vaci. Teoria a fost infirmat n timpul vieii lui Jenner. Apoi a prezentat ipoteza c infecia cu variola vacilor protejeaz de infecia cu variol uman. n cea de-a doua parte sunt continuate observaiile critice relevante pentru testarea ipotezei sale. A treia parte a fost o discuie lung, n parte polemic, legat de descoperirile i problemele variate legate de variol. Reaciile la aceast publicaie au fost din cele mai diverse. Jenner a plecat la Londra n cutare de voluntari pentru vaccinare. Dup trei luni nu gsise nici mcar unul singur. El a pornit un studiu la nivel naional n cutarea persoanelor care prezint rezisten la variol n rndul celor care fcuser variola vacii. Rezultatul acestui studiu i-a confirmat teoria. n ciuda erorilor i controverselor nenumrate folosirea vaccinrii s-a rspndit rapid n ntreaga Anglie i pn n 1800 a atins majoritatea rilor Europene (Jenner a vaccinat n 140

1801 populaia din Cluj i Trgu Mure, apoi aceast procedur s-a extins n ntreaga ar n urmtorii 31 de ani (1). Dei a fost apreciat la nivel mondial i i s-au acordat multe onoruri, Jenner nu a avut intenia s se mbogeasc. n 1802, Parlamentul Britanic i-a oferit suma de 10,000 pentru descoperirea sa, iar cinci ani ulterior i-a oferit nca 20,000. Pe de alta parte, el a fost i subiectul ridiculei i atacurilor, nu doar al onorurilor. n ciuda acestor lucruri el i-a continuat activitile n slujba vaccinrii. Lucrarea lui Jenner reprezint prima ncercare tiinific de control a bolilor infecioase prin folosirea deliberat a vaccinrii. Totui, nu el este cel care a descoperit vaccinarea, dar a fost primul care a oferit un status tiinific acestei proceduri. Benjamin Jesty este cel care a vaccinat primul mpotriva variolei. La sfritul secolului XIX s-a descoperit c vaccinarea nu confer imunitate pentru toat viaa i de aceea este nevoie de revaccinare. Mortalitatea datorat variolei era n scdere, dar epidemiile artau c boala nc nu era inut sub control. n 1950 s-au implemantat mai multe msuri de control i variola a fost eradicat n mai multe zone ale Europei i America de Nord. Procesul de eradicare la nivel mondial al variolei a fost discutat atunci cnd Adunarea Mondial a Sntii a primit un raport, n 1958, legat de consecinele catastrofale ale variolei n 63 de ri. n 1967 s-a nceput o campanie global condus de Organizaia Mondial a Sntii care a dus la eradicarea variolei n 1977. n data de 8 mai 1980 Adunarea Mondial a Sntii a anunat c lumea nu mai are variol i a recomandat ca toate rile s nceteze vaccinarea. (2) Nu am dorit s povestim totul legat de vaccinare n cadrul acestui capitol, ci doar s v introducem puin n povestea acestei tehnici pentru a arta evoluia lucrurilor i efectul benefic pe care l-a avut aceast descoperire n ntreaga lume. Aa cum se tie, vaccinarea rmne momentan singura metoda cu cel mai bun raport cost-eficien. Pe aceast cale dorim s sensibilizm studenii la medicin i cititorii acestei cri n ceea ce privete vaccinarea i s infirmm teoriile greite care au circulat i continu s circule n ultimul timp.

Bibliografie 1. Mihancea N., 1979, History of smallpox vaccination in Romania and source of the IC strains of vaccinia virus, Rev Ig Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol Pneumoftiziol Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol., 24(4), 247-52 2. Riedel S, 2005, Edward Jenner and the history of smallpox and vaccination, Proc. (Bayl Univ Med Cent), 18(1), 21-25.

141

10. Organele cu rol n imunitate (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Roxana Micu)
Dup secvena de intrare n funcie i rolul deinut, se descriu trei tipuri de organe imune: stem, primare i secundare. (Tabelul nr. 1) 10. 1. Organele su (stem) 10. 1. 1. Sistemul hematopoietic i celulele stem Sistemul hematopoietic cuprinde organele stem cu funcie dubl, hematologic i imunologic. Celula multipotent, primordial (su, stem, matc) se formeaz iniial la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior n esutul hematopoietic din ficatul embrionului. Celula stem se afl la originea tuturor liniilor hematopoietice (vezi i 11.1.). Din celulele stem multipotente rezult celulele liniei limfocitare (din care iau natere limfocitele B i T) i celulele liniei mieloide (precursoare pentru liniile eritrocitar, megakariocitar, monocito-macrofagic i granulocitar). 10. 1. 2. Mezodermul embrionar i ficatul fetal Organele care conin celulele stem hematopoietice sunt active de-a lungul vieii embrionare i fetale, ntr-o anumit succesiune. n primele sptmni de via, ele sunt situate n mezodermul intra-embrionar i extra-embrionar (sacul vitelin). La ft, celulele stem migreaz i se localizeaz la nivel hepatic. n cea de-a zecea sptmn de via intrauterin, apar primele celule stem n os. dup cea de-a 20-a sptmn, la ftul uman, hematopoieza devine exclusiv medular. 10. 1. 3. Mduva osoas Teritoriul hematopoietic (MOH) se reduce odat cu vrsta: la copil, toate oasele au funcie hematopoietic; la adult, teritoriul hematopoietic se restrnge la oasele trunchiului i bazinului, atingnd un volum de circa 5 litri la un subiect de 60 kg; la persoanele vrstnice, funcia hematopoietic se menine la nivelul sternului, vertebrelor i al oaselor coxale.

10. 2. Organele limfoide primare organele limfoide primare, numite i centrale, sunt situate n afara cilor de acces i circulaie antigenic. n aceste organe diferenierea apare precoce, n viaa embrionar, naintea celor secundare. Proliferarea limfocitar este intens i independent de stimularea antigenic. Organele limfoide primare au urmtoarele roluri: permit multiplicarea limfocitelor T (timodependente) i B (dependente de mduva roie hematogen / bone marrow - la mamifere). gzduiesc primele stadii de difereniere, pn la limfocitele T sau B mature, apte s recunoasc structurile antigenice i s fie stimulate de antigene. efectorii imuni nva la acest nivel s recunoasc i s tolereze constituenii propriului organism (auto-recunoatere i toleran fa de self).

142

Un limfocit T sau B matur care a prsit timusul, respectiv mduva osoas hematogen, nu mai revine niciodat la acest nivel, cele dou organe fiind n afara cilor de recirculare a limfocitelor antigen-specifice din organele limfoide secundare. 10. 2. 1. Timusul Timusul se formeaz n perioada de dezvoltare a celui de-al treilea arc branchial. nc din stadiul de dezvoltare fetal, timusul este prezent n cavitatea toracic, fiind dispus retrosternal, ca un organ bine difereniat, deja funcional. Agenezia acestei regiuni duce la apariia unui deficit congenital rar, sindromul Di George (aplazia congenital timic sau boala pipernicirii), caracterizat prin tulburri ale imunitii celulare i implicit prin susceptibilitate crescut la infecii (respiratorii, digestive i cutanate, produse n special de fungi i virusuri i mai rar de ctre bacterii), tetanie neonatal (datorat absenei paratiroidelor) i malformaii congenitale diverse (arc aortic dublu, tetralogie Fallot, micrognatism, atrezie de esofag etc). Timusul este un organ situat n mediastinul anterior i superior, retrosternal, format din doi lobi unii printr-un istm median. Fiecare lob este format din lobuli compartimentai de septuri derivate din capsula organului. Lobulul timic este alctuit din 2 zone: cortical (la exterior) i medular (la interior). Iniial se dezvolt zona cortical. Greutatea sa variaz cu vrsta (este bine dezvoltat la ft, greutatea crete pn la pubertate dezvoltarea maxim se realizeaz la vrsta de 10-12 ani, apoi sufer o involuie lent, fr s dispar total). n zona cortical, trama de-a lungul creia se plaseaz protimocitele (sosite n timus de la MOH) cuprinde celule epiteliale, celule dendritice intratimice i macrofage. Limfocitele mici, denumite i timocite corticale, sunt numeroase, grupate n grmezi, n jurul celulelor epiteliale. Ele se divid activ, dar nu se structureaz n noduli limfatici. n zona medular, celulele epiteliale sunt izolate sau grupate formnd corpusculii lui Hassal (formaiuni de celule epiteliale care degenereaz, fiind mereu nlocuite cu alte celule similare), caracteristici timusului. Se consider c au rol fagocitar. Cresc att numeric ct i ca dimensiuni, probabil datorit contactului cu microorganismele din flora normal, dar i contaminrii cu alte microorganisme. Medulara mai conine i celule dendritice, macrofage i timocite. Timocitele medulare sunt mult mai dispersate dect cele din zona cortical. La acest nivel are loc selecia negativ a timocitelor. Timusul are capacitatea de a elimina prin selecie pozitiv celulele care, odat eliberate n circulaie, nu ar fi putut produce efectul scontat, deoarece nu ar fi recunoscut structurile non self i prin selecie negativ celulele care ar fi dat reacii autoimune. Populaia limfocitar aflat n proces de multiplicare n timus, este foarte sensibil la aciunea corticosteroizilor, 95% din limfocite fiind distruse. Restul de 5% din limfocitele cortico-rezistente sunt cele care, la finalul maturaiei, trec n circulaie. Se pare c iniial are loc distrugerea a 80% dintre limfocite, 20% ajung la nivel medular i dintre acestea supravieuiesc cele 1-5% limfocite cortico-rezistente. Timocitele ajunse n zona medular sunt mai rezistente la aciunea cortizolului dect cele din zona cortical. (Figura nr. 1) Rolul timusului se manifest local i la distan: rolul local, const n transformarea limfocitelor nedifereniate n limfocite T mature, cu achiziia de receptori pentru antigene (TCR). Procesul de multiplicare i difereniere are loc, n principal, n regiunea cortical. Celulele achiziioneaz progresiv markeri ai limfocitului T adult: 143

molecule CD2, CD3, CD4, CD8 i TCR. Urmeaz o dubl selecie, pozitiv i negativ. n selecia pozitiv, timocitele care recunosc antigenele strine fixate pe moleculele MHC pot prolifera (timocitele CD4+ recunosc moleculele MHC clasa II, timocitele CD8+ recunosc moleculele MHC clasa I), n timp ce acele limfocite care nu i-au dezvoltat receptori pentru antigene sunt distruse. n selecia negativ, timocitele care recunosc structurile self sunt distruse, eliminnduse astfel timocitele puternic autoreactive, care ar conduce la apariia unor fenomene autoimune imediat dup natere. n timus are loc multiplicarea, diferenierea i selecia limfocitelor T. Tot la nivel timic are loc producerea celulelor de control, cu rol n prevenirea bolilor autoimune (experienele realizate prin nlocuirea limfocitelor proprii cu limfocite de la persoane sntoase a dus, pentru un timp, la dispariia semnelor de boal, dovedind astfel existena acestor celule timice). (Figura nr. 2) rolul la distan se realizeaz prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina, timopoietinele, timozinele, factorul umoral timic etc). Aceti factori au funcii diverse, unii dintre ei influennd diferenierea limfocitelor T n ariile timodependente din organele limfoide periferice. Acioneaz att la nivelul timusului ct i la distan. Cteva informaii despre factorii timici: Timozina are efecte asupra limfocitelor T, stimulndu-le activitatea citotoxic i crescnd sinteza de IL-6. In vivo, stimuleaz LH i GnRH, iar in vitro Prolactina i GH. Timostimulina necesit Zn pentru a aciona. Are efect asupra dezvoltrii protimocitelor n MOH. Factorul umoral timic induce producerea de IL-2 (are potenial antiviral). Timopoietina intervine n procesul de difereniere a limfocitelor T. 10. 2. 2. Mduva osoas hematogen la mamifere La mamifere, se menine divizarea funcional n limfocite T i B, dar nu exist bursa lui Fabritzius. Transformarea celulei stem n limfocit B matur are loc n mduva osoas hematogen (bone marrow, LB). La copii, rolul de organ limfoid primar este asigurat att de mduva din oasele late ct i din oasele lungi; ulterior, mduva de la nivelul oaselor lungi este nlocuit cu esut adipos, care mai trziu se fibrozeaz, iar mduva activ rmne la nivelul oaselor late (stern, coxal, coaste, vertebre). Cazurile cu deficit imunitar selectiv pentru limfocite B (ex. maladia Bruton), confirm existena unei autonomii a acestei populaii. Transplantul de mduv osoas hematogenrestaureaz imunitatea umoral, ducnd la dispariia perturbrilor. Dintre funciile mduvei osoase hematogen n imunitate amintim: 1. meninerea unui procent de celule stem cu difereniere spre linia limfocitar i primele stadii ale seriei T i B; 2. maturarea i diferenierea complet a limfocitelor B n celule B mature, apte s colonizeze organele limfoide secundare. La nivelul mduvei exist mai multe tipuri de celule: celule cap de serie i celule tinere care deriv din acestea, celule din seria granulocitar, celule din seria megakariocitar, celule din seria eritrocitar, celule din seria monocito-macrofagic, celulele din seria limfoid (dar nu exist LT, ci doar protimocite, limfocite T nedifereniate).

10. 3. Organele limfoide secundare

144

Dezvoltarea organelor limfoide secundare, numite i periferice sau efectoare, este tardiv fa de cea a organelor limfoide primare, atingnd dezvoltarea deplin numai dup stimularea antigenic. Amintim ca exemple de organe limfoide secundare: ganglionii limfatici, splina i organele limfoide ataate sistemului digestiv (apendice, amigdale, plci Peyer) etc. La nivelul acestor organe se cantoneaz limfocitele T provenite din timus i limfocitele B provenite din mduva osoas hematogen, migrate pe calea torentului circulator. n organele limfoide secundare, aceste celule se vor activa n urma contactului cu antigenele. n anumite zone ale organelor limfoide secundare, precum cele din ganglionii limfatici sau din splin, se gsesc grupuri de celule, constituite n special din limfocite B, denumite foliculi sau noduli limfatici. naintea stimulrii antigenice, aceti foliculi primari sunt n repaus, cu limfocite mici apropiate unele de altele, determinnd un aspect dens, caracteristic. Aceste limfocite mature sunt denumite naive, deoarece nu au avut contact cu antigenul. Dup circa 3-6 zile de la stimularea antigenic, foliculii primari se transform n foliculi secundari, cu un centru germinativ clar, nconjurat de o zon mai ntunecat. n jurul foliculului exist o zon marginal puin vizibil, constituit din limfocite B cu memorie. Foliculul secundar persist cteva sptmni dup care redevine folicul primar. Organele limfoide secundare cuprind urmtoarele grupe: 10. 3. 1. Ganglionii limfatici Ganglionii limfatici (nodulii limfatici) reprezint structuri imune, organizate, situate la interseciile traseelor limfatice. Au urmtoarele roluri: colecteaz structurile antigenice care traverseaz teritoriul vaselor limfatice aferente (libere sau captate de macrofage i/sau de celulele dendritice); induc un rspuns imun fa de antigenele de tip celular, n regiunea paracortical (dnd natere la limfocite T specifice) sau fa de antigene de tip umoral, n foliculii limfatici cu limfocite B active, maturate n mduva osoas hematogen i stocheaz informaiile imune datorit limfocitelor cu memorie dar au rol i n diseminarea rspunsului imun prin circulaia limfocitelor pe calea traseelor limfatice eferente, ctre torentul circulator i ulterior spre alte teritorii ganglionare, splenice, digestive sau respiratorii. n seciune anatomo-patologic transversal remarcm la exterior o zon cortical (cuprinde n special limfocite B, instruite la nivel medular, aglomerate sub form de noduli limfatici. n mijlocul nodulilor se afl centrii germinativi. Foliculii cresc mult n dimensiuni dup infecie, iar ganglionii limfatici devin palpabili i dureroi. Sub zona cortical se afl zona paracortical (cuprinde n special limfocite T). n mijloc se afl zona medular, n care se gsesc att limfocite B ct i limfocite T. n ganglionii limfatici se mai gsesc macrofage, celule dendritice etc. (Figura nr. 2) 10. 3. 2. Splina Splina este cel mai mare organ limfoid secundar, avnd ns i alte funcii: joac rolul unui filtru care n mod nespecific ndeprteaz/elimin complexele antigenanticorp circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex. cu Plasmodium spp., Babesia microti); are o eficien remarcabil n ndeprtarea/eliminarea microorganismelor slab opsonizate precum i celor capsulate (ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Capnocytophaga spp.); 145

 eliminarea hematiilor degradate, mbtrnite; reglarea volumului sngelui etc. Pe seciune, splina are o culoare roie, cu formaiuni albe diseminate, numite corpusculii Malpighi (foliculi splenici). Splina este compus din dou tipuri de esuturi: pulpa roie implicat n distrugerea hematiilor i pulpa alb, corespunztoare esutului limfoid. Aceasta din urm este organizat sub forma unor grupri de limfocite T dispuse n imediata vecintate a arteriolelor (manoane de limfocite T - teaca limfatic periarterial), iar spre periferia acestora se gsesc cordoane de limfocite B (zona marginal). Se consider c zona bogat n limfocite T este zona timo-dependent, n timp ce zona cu limfocite B este zona medulo-dependent. Vascularizaia splinei are o serie de particulariti. Artera splenic intr prin hilul splenic iar ramificaiile sale, arterele trabeculare, urmeaz cloazoanele conjunctive. Din aceste artere se nasc ramificaii, arterele centrale nconjurate de manoane de limfocite T, vase care asigur irigaia foliculilor limfatici i artere penicilate care intr direct n contact cu sinusurile venoase ale pulpei roii. Din arteriole se nasc capilarele, apoi venulele postcapilare situate n zona sinusului marginal. (Figura nr. 3) la nivelul zonei marginale are loc captarea antigenelor de ctre celulele reticulare. Dup 24 de ore, antigenul se regsete la nivelul centrului germinativ al foliculului sau n zona timodependent. La periferia foliculilor splenici se gsesc plasmocite. La acest nivel are loc sintez de anticorpi (n special dup stimuli antigenici solubili, venii pe calea torentului circulator). Dup sintez, moleculele de anticorpi sunt antrenate sanguin i pot ajunge n tot organismul. Splina reprezint un organ n care are loc sinteza anticorpilor de tip IgM i diferenierea spre LB cu memorie n cadrul RI primar. Splina are i rol n sinteza unei enzime care desprinde tuftsina (tetrapeptid rezultat din clivarea enzimatic a poriunii Fc din molecula de IgG) de pe molecula de IgG (tuftsina la rndul ei are rol n creterea funciei fagocitare a PMN i n chemotactism). Hipofuncia splenic i n special splenectomia favorizeaz apariia unor infecii grave, inclusiv sepsis, cu microorganisme capsulate i microorganisme care paraziteaz eritrocitele. Este necesar aplicarea unei strategii de prevenire a infeciilor, incluznd vaccinarea i uneori profilaxia cu antibiotice i chimioterapice. 10. 3. 3. Sistemul limfoid asociat mucoaselor (MALT - mucous associated lymphoid tissue) Cile respiratorii, tractul digestiv i cel uro-genital sunt nconjurate pe toat lungimea lor de esut limfoid difuz (sau nodular), bogat n limfocite B i plasmocite care secret sIgA. Datorit particularitilor funcionale, MALT se subdivide n: Sistemul imunitar nazo-faringian (NALT - nasopharynx associated lymphoid tissue) reprezentat de inelul lui Waldeyer cu diferitele amigdale (palatine, faringian, linguale) i structuri adenoide. Amigdalele sunt constituite din foliculi limfoizi agregai i esut limfoid difuz n strns asociere cu epiteliul faringian. Amigdalele sunt lipsite de vase limfatice, la fel ca i splina. Amigdalele au un rol protector important n regiunea esofagian, faringian i a arborelui traheobronic, constituind un prim obstacol mpotriva infeciilor. Cu toate c dup amigdalectomie nu rezult infecii severe, decizia privind aceast operaie trebuie luat numai dup o analiz critic, punnd n balan att beneficiile ct i posibilele urmri negative.

146

Structurile adenoide se inflameaz frecvent n timpul copilriei (dup diferitele i frecventele infecii respiratorii) i deseori, crescnd n dimensiuni, trebuie extirpate; Sistemul imunitar asociat tubului digestiv (GALT - gut associated lymphoid tissue) cuprinde plcile Peyer i formaiunile limfoide ale apendicelui (secret IgA), limfocitele intra-epiteliale i limfocitele sub-epiteliale. Plcile Peyer reprezint aglomerri de celule limfoide (la nivelul jejunului, duodenului i ileonului). Dup infecii bacteriene se mresc i se pot uni n adevrate cordoane limfoide. Nu au vase limfatice proprii; Sistemul imunitar asociat arborelui bronic (BALT - bronchus associated lymphoid tissue); Sistemul imunitar asociat cilor uro-genitale, prezent n special la nivelul vaginului; Sistemul imunitar asociat glandelor mamare (mammary associated lymphoid tissue). Laptele matern conine IgA secretorie (sIgA) cu rol protector pentru noul nscut fa de infeciile digestive. IgA nu poate trece prin bariera hemato-placentar, dar sIgA poate fi primit n timpul alptrii, asigurnd protecia nou-nscutului i sugarului fa de o serie de patogeni, n primele luni de via. n organele limfoide secundare, distribuia limfocitelor i a celorlalte celule imune este controlat de citokine i chemokine. Membrii familiei TNF (tumour necrosis factors) (citokine implicate n reacii inflamatorii) au un rol deosebit de important n dezvoltarea normal a organelor limfoide. Celulele imune au receptori pentru aceti mediatori, acest lucru fiind demonstrat pe cobai la care s-au distrus o serie de receptori pentru a se pune n eviden care este rolul lor. Molecula MIP-3 face parte din categoria chemokinelor pentru care limfocitele T prezint receptori. Datorit acestei substane, limfocitele T se localizeaz cu strictee n zonele timodependente. Receptorul pentru MIP-3 se numete CCR7, iar la cobaii la care receptorii CCR7 au fost distrui s-a observat absena marcat a zonelor timodependente i un rspuns imun primar extrem de slab. Celulele dendritice interdigitate produc chemokina MIP-3 i pentru c sunt prezente n zonele timodependente, atrag acolo limfocite T mature. Receptorul CCR7 este prezent n proporie mic i la nivelul limfocitelor B, lucru care explic migrarea acestora prin zonele timodependente ctre foliculii limfatici.

10. 4. Povestire adevrat Apendicele vermiform, o prelungire a cecumului, reprezint un organ ce aparine GALT (Gut Associated Lymphoid Tissue). Rolul GALT este de a interveni n aprarea mucoasei tractului digestiv, avnd n alctuire esut limfoid abundent organizat n structuri specializate (amigdale, apendice, plci Peyer) sau distribuit difuz n submucoasa peretelui tubului digestiv. La scurt timp dup natere, apendicele, fiind un segment al intestinului gros, devine colonizat de flora enteric ce populeaz cecumul i colonul. Este presupus ideea c un contact ndelungat al esutului limfoid din componena apendicelui cu flora comensal a intestinului, contribuie la meninerea toleranei imune fa de populaiile bacteriene. Aadar, funcia apendicelui difer de cea a plcilor Peyer sau a amigdalelor prin faptul c nu apr organismul de microorganisme poteniat patogene nou-ptrunse n organism, ci favorizeaz desfurarea relaiei simbiotice ntre gazd i germenii saprofii.

147

Inflamarea apendicelui (apendicit) este o afeciune frecvent ntlnit n seciile de chirurgie, iar apendicectomia a devenit o procedur de rutin, avnd puine riscuri (n general datorate efectelor anesteziei). Studii recente afirm c apendicectomia (desfurat n cazul unei apendicite acute i nu atunci cnd nu exist de fapt aceast afeciune) are efecte benefice n scderea incidenei dezvoltrii colitei ulcerative. S-a constatat c la pacienii suferinzi de apendicit la vrste tinere care au fost supui operaiei, a sczut riscul de apariie a colitei ulcerative cu pn la dou treimi. Se pare c efectul este dat de o stimulare a limfocitelor T supresoare ce survine n urma procedurii chirurgicale. ns apendicectomia nu reprezint o soluie n cazul celor la care boala s-a instalat deja. Colita ulcerativ este o boal inflamatorie a intestinului caracterizat prin apariia ulceraiilor n peretele colonului, diaree cu snge i crampe abdominale. Cauzele instalrii bolii sunt multiple, de natur genetic, cauz autoimun, alimentaie necorespunztoare. Un parcurs de 10 ani netratat poate degenera n cancer de colon sau cancer rectal. Chiar dac apendicectomiile au devenit floare la ureche pentru muli medici chirurgi iar pacienii nu se tem de o operaie uoar, este de reinut faptul c diagnosticul trebuie instaurat corect de ctre medic care adesea uit c durerea la nivelul zonei inghinale drepte nu este semnul patognomonic pentru apendicit i nu se mai obosete s mai fac alte teste, realiznd uneori o operaie inutil i netratnd pn la urm suferina pacientului.

10. 5. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. http://emedicine.medscape.com/article/207891-overview http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=imm&part=A869 http://www.jimmunol.org/cgi/content/abstract/183/4/2205 http://vet.sagepub.com/content/36/5/357.long http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ibd.20453/pdf http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/reprint/106/6/1901

10. 6. Verificai-v cunotinele La ntrebrile urmtoare, alegei un singur rspuns corect. Care este diferena dintre organele limfoide primare i cele secundare? localizarea lor: cele primare au localizare visceral, cele secundare se localizeaz n mucoase; n organele limfoide primare nu apare rspunsul imun fa de un antigen, pe cnd n cele secundare da; nu exist diferene ntre cele dou tipuri de organe; organele limfoide secundare sunt sediul formrii i diferenierii limfocitelor, iar organele limfoide primare sunt destinaiile la care ajung limfocitele mature. 148

Care este organul care pe lng funcia limfoid, are i funcie hematoformatoare n ansamblu? splina; ganglionul limfatic; timusul; mduva osoas hematogen.

Ce este fenomenul de selecie a limfocitelor? un mecanism prin care se genereaz un rspuns imun mpotriva unei substane non-self; un proces generalizat ce are loc n toate organele limfoide, avnd ca rezultat limfocite B i T mature; un fenomen prin care sunt alese limfocitele T cele mai potrivite s intre n circulaia sanguin (5% din limfocitele T totale); totalitatea reaciilor prin care trece un limfocit B pentru a deveni plasmocit (celul secretoare de anticorpi).

Care dintre aceste roluri i se atribuie splinei? rol n distrugerea hematiilor mbtrnite; rol hematoformator, fiind un organ limfoid primar; rol n aprarea mucoaselor, aparinnd MALT; rol n selecia i maturarea limfocitelor T.

Care este afirmaia adevrat? un folicul secundar prezint, din punct de vedere histologic, o zon periferic i un centru germinativ; plcile Peyer sunt agregate de foliculi limfatici prezente n timus; ganglionii limfatici sunt relee pe calea circulaiei sanguine; n mduva osoas hematogen se matureaz att limfocitele T, ct i limfocitele B.

10. 7. Bibliografie recent 1. Charles A Janeway, Jr, Paul Travers, Mark Walport, Mark J Shlomchik, 2001, Immunobiology 5th edition 2. Gerd-Rudiger Burmester, Antonio Pezzutto, 2003, Color Atlas of Immunology 149

3. http://ebooks.unibuc.ro/biologie/mihaiescu/index.htm 4. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai, 2007, Cellular and Molecular Immunology 5. http://www.nejm.org 6. http://www.medscape.com 7. Lee Goldman, Dennis Ausiello, 2008, Cecil Medicine, 3rd edition 8. Jawetz, Melnick, Adelberg, 2007, Medical Microbiology, 24th edition 9. Junqueira, Carneiro, 2005, Basic Histology Text & Atlas 10. T. W. Sadler, 2006, Medical Embryology

150

11. Celulele imunitii (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)

11. 1. Celula stem Celula multipotent, primordial, su, stem, matc, se formeaz la circa 3 sptmni de la nidaia zigotului, iniial la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior n esutul hematopoietic din ficatul embrionului. Dup natere, celula stem ar mai putea fi pus n eviden n mduva oaselor late i lungi (la copii) i n mduva oaselor late (la aduli); un numr foarte mic de celule stem mai pot fi identificate n circulaie. Primul derivat al celulei stem este hemocitoblastul (hematopoietic progenitor), care seamn foarte mult cu celula stem dar deine probabil un semnal de orientare ctre mduva roie hematogen sau ctre timus. Exist i un alt derivat, limfoblastul (lymphoid progenitor). Celula stem se afl la originea tuturor liniilor hematopoietice. n funcie de gradul de potenialitate exist celule stem totipotente (CFU-LM), pluripotente, multipotente (CFU-M, GEMM), bipotente, unipotente (CFU-Eo, CFU-Baso, CFU-Mega). Prezint capacitate de autontreinere (self-renewal) i genereaz descendeni n lipsa stimulilor antigenici. Rspunde la diferite mecanisme de control complexe. Din punct de vedere morfologic se aseamn foarte mult cu limfocitul imunocompetent. Este foarte uor de distrus de ctre radiaii dar nu i de ctre chimioterapice. Descoperirea metodelor de izolare i cultivare a celulelor stem (1998) a creat o nou speran: tratamentul cu celule stem ar putea ajuta la vindecarea unor boli grave (considerate astzi ca fiind incurabile). Celulele stem fiind progenitori nedifereniai se pot divide i dezvolta ntr-o multitudine de alte tipuri de celule, putnd duce la formare de esuturi i organe. Cercettorii estimeaz c aceste celule ar putea fi folosite, n viitor, pentru repararea diferitelor structuri distruse sau n suferin, dar chiar i pentru sinteza de organe. Totui, sunt nc destul de multe probleme tehnice care trebuie surmontate. (Figura nr.1 Evoluia celulei stem)

11. 2. Celulele implicate n rspunsul imun Toate celulele sistemului hematopoietic intervin, n diferite msuri, n imunitate. Aa cum am menionat anterior, aceste celule acioneaz ca nite adevrai soldai (de ex. LT citotoxice, celulele NK), care pot avea att o activitatea efectoare ct i de control i retro-control (depindu-i condiia de simpli ostai). Limfocitele T i B suntelementele centrale alerspunsului imun specific. Celulele NK sunt celule fundamentale (alturi de fagocite) n imunitatea nnscut. Monocitele / macrofagele, neutrofilele, eozinofilele, bazofilele i mastocitele acioneaz n diferite momente ale rspunsului imun. Plachetele sanguine intervin n lupta anti-parazitar iar globulele roii particip la eliminarea complexelor imune. Celule pot reaciona n mod nespecific, indiferent de natura agentului agresor (ex. granulocitele PMN, eozinofilele, bazofilele, mastocitele, monocitele, macrofagele, celulele dendritice etc) sau pot participa la o reacie specific, condiionat de structura moleculelor antigenice, prin intermediul receptorilor (ex. limfocitele). 151

Termenul generic de limfocite, include o multitudine de celule distincte, imposibil de difereniat morfologic (n microscopia obinuit sau chiar i n microscopia electronic). Pe baza caracterelor morfologice, este totui posibil identificarea a dou tipuri de limfocite: - limfocitele mici (small lymphocytes), cele mai numeroase (circa 85% din numrul total al limfocitelor); aici se ncadreaz majoritatea limfocitelor T, limfocitelor B, celulelor dendritice i rarelor celule stem hematopoietice aflate n circulaie. - limfocitele mari cu granulaii (large granular lymphocytes), reprezentnd circa 5-15% din totalul limfocitelor. Dintre acestea amintim celulele NK (ucigae n mod natural / natural killer) i limfocitele T citotoxice. Aspectul morfologic nu ne permite s apreciem care este starea de activare celular. Dac folosim culturi celulare, n prezena unor ageni mitogeni nespecifici [ex. fitohemaglutinin, concavalin A, lipopolizaharide, lectine cum ar fi PWM (pokeweed mitogen) etc] sau a unor antigene specifice, limfocitele T sau B aflate anterior n repaus cresc n dimensiuni, prezint modificri la nivelul nucleului (cromatin fin, citoplasm mai abundent i mai albastr pe frotiu), fiind denumite imunoblaste.

11. 3. Clasificarea limfocitelor Clasificarea limfocitelor se realizeaz pe baza: funciilor i identificrii markerilor celulari. Funciile limfocitelor. S-a demonstrat c pe lng limfocitele B, exist o mare varietate funcional de limfocite T [ajuttoare (helper, LTh), supresoare, citotoxice sau responsabile de imunitatea celular]. Funcionalitatea limfocitelor este dificil de studiat n practica curent, mai ales c o singur celul poate avea mai multe funcii. Una dintre tehnicile de cercetare curent, citometria n flux, utilizeaz anticorpi monoclonali obinui n urma imunizrii oarecilor cu limfocite umane normale sau patologice. Markerii celulari sunt nregistrai cu prefixul CD, termen derivat din cluster of differentiation (clas de difereniere), nomenclatur stabilit n anul 1982. De atunci au fost identificai peste 300 markeri sau sub-markeri CD. Celulele stem hematopoietice i diferitele celule cu rol n imunitate pot fi mprite n grupe i subgrupe. Pentru activarea limfocitelor este nevoie de dou semnale: unul care provine de la antigen altul provenit de la moleculele accesorii de pe suprafaa APC (B7/CD80) pentru LT sau de pe LTh (CD40L) pentru LB. Limfocitele care sunt stimulate doar de primul semnal devin neresponsive la alte semnale antigenice i nici nu se activeaz pentru a reaciona fa de primul semnal antigenic. Etapele activrii limfocitelor: sinteza de citokine dar i de receptori pentru acestea de ctre limfocitele naive dar mature proliferarea limfocitar (expansiunea clonal) - n unele infecii numrul LT poate crete de 50.000 ori, iar al LB de 5.000 ori transformarea limfocitelor naive n limfocite efectoare cu rol n eliminarea antigenului 152

 diferenierea limfocitelor efectoare n limfocite cu memorie. Aadar, avem de-a face cu trei tipuri de limfocite: naive mature dar care nu au avut contact cu antigenul; acestea urmeaz s fie distruse n cazul n care ntr-o perioad de 1-3 luni nu au contact antigenic efectoare cu memorie - care vor reaciona mai rapid la a doua stimulare cu acelai antigen.

11. 3. 1. Limfocitele T (LT) (Figura nr. 2 Maturarea limfocitelor) Limfocitele T sunt majoritare n circulaia sanguin, reprezentnd circa 70% din totalul limfocitelor [2/3 sunt LT4 (CD4+) i 1/3 sunt LT8 (CD8+)]. Limfocitele T sunt localizate la nivelul organelor limfoide secundare n zone speciale: zona paracortical a ganglionilor, manonul limfoid n jurul arterelor centrale splenice. Limfocitele T sunt implicate n principal n imunitatea mediat celular. Pe de o parte particip la eliminarea structurilor strine dar i a structurilor proprii modificate (prin mbtrnire, n urma unei infecii, cu multiplicare neoplazic) iar pe de alt parte coopereaz cu limfocitele B n rspunsul imun umoral. De fapt, funciile exercitate de LT sunt mult mai complexe. Cea mai important funcie a limfocitelor T este inducerea unui rspuns sau a unei reacii imune specifice la antigene, prin recunoaterea unor peptide antigenice fixate pe moleculele MHC (complex major de histocompatibilitate). n acest scop pe limfocitul T exist un receptor pentru antigen (TCR), asociat ntotdeauna cu un complex molecular transductor CD 3. Linia limfocitar T se matureaz n dou organe: (a) mduv osoas i (b) timus. Din celula stem hematopoietic multipotent (CD34+, CD38-), prima difereniere conduce la apariia CFU-L (colony forming unit-lymphocyte) comun limfocitelor T i B (CD34+, CD45RA+, CD10+) din care rezult protimocitul. Protimocitul prsete mduva roie hematogen i se cantoneaz n corticala timic. Maturizarea timocitelor nu a putut fi studiat la om, astfel nct datele se obin prin extrapolarea informaiilor obinute experimental, la animale de laborator. Protimocitele i apoi timocitele imature se gsesc n corticala timic (subcapsular), n contact cu celulele epiteliale i cu macrofagele (rare) de la acest nivel. Aceste celule tinere au o capacitate foarte mare de multiplicare. Se deplaseaz prin cortex spre jonciunea cortico-medular i vin n contact cu celulele dendritice i cu macrofagele. La acest nivel are loc o nou multiplicare relativ intens. Este de remarcat faptul c n cursul acestui proces, doar 1-5% din celulele tinere ajung limfocite T mature. Restul, de cel puin 95% din celule, mor prin apoptoz. Activarea unui limfocit T specific se face printr-un mecanism dublu: 1. contactul (direct) celul celul, cu o celul prezentatoare de antigen (APC); 2. stimularea (indirect) de ctre citokine: IL1, IL-6, IFN-g i IL-2. Limfocitul produce la rndul su att IL-2 ct i lanul a al receptorului Il-2, contribuind la activarea altor LT specifice. LT sunt activate doar de ctre antigenele timodependente (vezi Cap. 16, paragraf 16.1.2.); procesul se desfoar la distan de locul de ptrundere al antigenului, i anume n organele limfoide secundare unde o APC i prezint structurile antigenice. Consecina activrii LT este transformarea acestuia n limfoblast T.

153

Tipuri de limfocite T Limfocitele T ajuttoare (T helper, CD4+) (LTh/Th) Limfocitul Th este un veritabil coordonator, orientnd rspunsul imun (RI) ctre RI celular sau ctre RI umoral. Exist cinci subtipuri de LTh (Th0, Th1, Th2, Th3 i Th17): limfocitele Th0 sunt limfocite tinere (sub influena unor stimuli moleculari, ex. IL-4, IL12, se vor transforma n limfocite Th1 sau n limfocite Th2); limfocitele Th1 sintetizeaz limfotoxin, IL-2, IFN-, TNF- i TNF- o au rol foarte important n aprarea anti-viral, i anti-neoplazic (dar i n aprarea antifungic i anti-bacterian), o sunt implicate mai ales n RIC, o stimuleaz switch-ul izotipic spre IgG2 i IgG3, o amplific rolul citotoxic al macrofagelor i stimuleaz proliferarea LTc; limfocitele Th2 sintetizeaz IL2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13; o au rol mai ales n RIU, o sunt implicate n reaciile de hipersensibilitate, o stimuleaz proliferarea LB i secreia de anticorpi; o sunt stimulate de semnale venite de la bazofile i eozinofile (papaina duce la sinteza de IL-4 de ctre bazofile care duce la stimularea rspunsului Th2) (1). limfocitele Th3 (limfocitele T reglatorii) deprim funcia altor limfocite (CD4+, CD8+, LB, NK); secret Il-10 (inhib Th1 i Th2, deci RIU i RIC) i TGF- (inhib rspunsul imun); sunt CD4+ i CD25+; relativ recent au fost identificate limfocitele Th17; acestea se gsesc la interfaa dintre mediul extern i mediul intern (ex. la nivelul tegumentului, de-a lungul tractului gastrointestinal); sintetizeaz IL-6, IL-17 i TNF-; o au rol de protecie la nivelul acestor suprafee, o studii recente au aratat c sunt implicate n inducerea i exacerbarea autoimunitii i inflamaiei (datorit IL-17), o activeaz RIC (importante n RI prin recrutarea neutrofilelor i macrofagelor la locul infeciei), o sunt n relaie cu LT reglatorii care previn fenomenele inflamatorii i mediaz tolerana imun (2), o secreia lor este stimulat de IL-23, o LTh-17 cu memorie reacioneaza fa de antigenele Candida albicans (3). Limfocitele T citotoxice (Tc, CD8+) Se refer n principal la LT CD8+, cu toate c aceast proprietate a fost observat i la unele LT CD4+, cu urmtoarele diferene: LTc CD8+ pot liza oricare dintre celulele organismului care exprim molecule HLA I (HLA human leukocyte antigen system) LTc CD4+ i limiteaz funcia la celulele care exprim molecule HLA II. Au mai multe roluri, de ex. realizeaz supravegherea imunologic prevenind multiplicarea anarhic a celulelor. Dac de ex. apar antigene tumorale, LTc au capacitatea de a le recunoate, de a se multiplica/activa i de a le distruge. n aceast supraveghere, LTc sunt ajutate de celulele NK. Distrugerea antigenelor este indus prin dou mecanisme: inducerea apoptozei prin intermediul unui receptor al morii celulare, ceea ce duce la fragmentarea ADN-ului celulei int; 154

 atacul asupra celulei int prin perforine (proteine ce rup membrana plasmatic sau lizozomal) i granzine (serin proteaze care lizeaz substraturi sau activeaz diverse proteaze) sintetizate i eliberate de ctre LTc. LTc au un rol important n aprarea mpotriva celulelor infectate viral. Activitatea lor este intensificat de IFN-g. Importana activitii litice a LTc a fost demonstrat att experimental (pe modele animale) ct i la pacieni care prezentau defecte ale citotoxicitii. Exist sindroame genetice transmise autozomal recesiv n cadrul crora este afectat citotoxicitatea sau prezentnd mutaii la nivelul genei ce codific informaia pentru sinteza de perforine. Aceste sindroame au fost asociate cu imposibilitatea controlrii infeciilor virale, mai ales cu CMV, EBV i HSV (4). Limfocitele T inductoare ale hipersensibilitii ntrziate Sunt celule care secret IL-2 i n acelai timp IFN-g, activatoare pentru alte limfocite T, macrofage i celulele NK. Limfocitele T supresoare (Ts, CD8+) Limfocitul T supresor este o celul CD8+, ca i LT citotoxic. Limfocitele Ts au rol n reglarea rspunsului imun, meninndu-l n limite normale. n lipsa Ts, orice stimul antigenic ar putea fi urmat de o proliferare anarhic a unei clone de limfocite (acele limfocite dotate cu receptorul specific pentru respectiva structur antigenic). n mod normal, ntre populaiile de limfocite Th i Ts exist un echilibru, care se cuantific prin raportul Th/Ts, raport care trebuie s fie supraunitar. Exemplul cel mai cunoscut n care valoarea raportului devine subunitar este infecia HIV / SIDA. O parte dintre limfocitele T nu au funcie efectoare i se transform n LT cu memorie. Limfocitele T ( T cells) Limfocitele T sunt sechestrate la nivelul barierelor epiteliale sau la nivelul focarului inflamator i manifest citotoxicitate fa de diverse inte. Sunt activate direct de antigen (non-peptide de dimensiuni mici) fr a fi necesar prezentarea n conjuncie cu MHC. Reacioneaza fa de extractele mycobacteriene. Sunt stimulate de gruprile fosfat din diveri compui precum NTP (nucleotid trifosfat din ADN i ARN). Teste efectuate pe animale de laborator care au fost infectate cu Listeria spp., Leischmania spp., Mycobacterium spp., Plasmodium i Salmonella spp. au artat un nivel de protecie mediu realizat de aceste limfocite. Se acumuleaz la nivelul focarului inflamator n boli cu implicare imun precum artrita reumatoid sau sarcoidoza (cauza nu este cunoscut). Sunt implicate att n imunitatea nnscut ct i n cea adaptativ, prin secreia de citokine i chemokine abilitatea de a ajuta LB s se transforme n limfocite cu memorie. Limfocitele T NK (NKT cells) Limfocitele T NKintervin n RIP i produc cantiti crescute de IL-4. mprumut proprieti att de la LT ct i de la NK.

155

11. 3. 2. Limfocitele B (LB) (Figura nr. 2 Maturarea limfocitelor) Limfocitele B reprezint 5% pn la 15% din limfocitele din snge (300 pn la 600 elemente/mm3) i constituie majoritatea celulelor din foliculii limfatici, ganglioni i splin. Rolul lor esenial este sinteza anticorpilor, n cursul RIU specific. Au fost denumite astfel deoarece s-a descoperit c la psri LB se dezvolv n bursa lui Fabricius. La om LB se dezvolt n mduva osoas hematogen (bone marrow). Limfocitele B provin (la om i la mamifere) din celulele stem hematopoietice (CD34+, CD38 -). Toat linia limfocitar B (celule imature sau mature) are markeri specifici de suprafa CD19 i CD20, utilizai pentru identificarea celulelor B (ex. n citometria n flux); identificarea prin aceeai metod a markerului CD10 permite ncadrarea n stadiul de limfocit matur. Limfocitul B prsete mduva osoas i trece n zonele B din organele limfoide secundare (ganglioni limfatici, splin etc). LB naiv (virgin) este pregtit pentru a rspunde stimulului antigenic, dei se gsete n stare de repaus, n ateptarea primei stimulri antigenice. n acest stadiu, LB are urmtoarele caracteristici: exprim la nivelul membranei imunoglobuline din clasele IgM i IgD; exprim receptori pentru interleukinele IL-1 i IL-4; exprim receptori pentru complement CR1 (CD35) i CR2 (CD21). Ultimul recunoate fragmentul C3d, component degradat al fragmentului C3 al complementului. Acesta contribuie la activarea limfocitului B. exprim receptori pentru anumite lectine (ex. PWM) utilizate in vitro pentru transformarea limfoblastic a limfocitelor B, dar i receptori pentru endotoxine bacteriene (LPZ). Transformarea unui LB naiv ntr-un LB activ i apoi n plasmocit necesit intervenia succesiv a citokinelor (ca ntr-o cascad). Activarea are loc datorit recunoaterii antigenice dar i datorit secreiei de IL-1 de ctre celula prezentatoare de antigen (APC) i respectiv secreiei de IL-4 de ctre Th2. Limfocitul B activ exprim receptori pentru alte interleukine, n special IL-5 i IL-6 i lanul a al IL-2. LB se va divide i va da natere la numeroase celule identice n foliculul limfoid secundar. Limfocitul B se difereniaz progresiv ntr-un limfoblast sau imunoblast care secret IgM. Sub aciunea diferitelor citokine are loc comutarea izotipic (isotypic switch) de la IgM la IgG, IgA sau IgE; n urma acestei comutri plasmocitul va secreta IgG, IgA sau IgE. De exemplu, sub aciunea IL-4 are loc comutarea izotipic a IgM n IgG sau IgE iar sub aciunea IL-5 n IgA. Exist i limfocite B active care nu se transform n plasmocite ci persist sub form de limfocite B cu memorie, cu o durat de via lung (asigurnd spre exemplu protecia fa de o nou mbolnvire, de ex. dup scarlatin/infecie cu streptococul piogen de grup A, lizogenizat). Limfocitul B are urmtoarele funcii: 1. Prezentarea antigenelor ctre LT; 2. Sinteza imunoglobulinelor (anticorpilor). n cazul antigenelor timo-dependente, are loc trecerea de la rspunsul primar cu secreie predominent de IgM, la un rspuns secundar cu predominena IgG sau mai rar a IgA sau IgE. n cazul antigenelor timo-independente, se menine sinteza anticorpilor din clasa IgM. Limfoblastul (lymphoid progenitor) d natere la trei linii celulare (LT, LB i NK). Exist o gen (Pax5) care este esenial pentru maturarea LB (5).

156

11. 3. 3. Celulele NK (Natural killer cells) Numele de celule NK a fost dat acestei populaii celulare datorit puterii lor citotoxice spontane, fr a avea nevoie de un stimul imun sau de prezena MHC (complexul major de histocompatibilitate). Numite iniial celule de clasa a III-a (nefiind LB sau LT), ulterior celule nule (pentru c pe suprafaa lor nu fuseser, nc, pui n eviden receptori), n final au fost numite celule NK (ucigae n mod nativ, natural killer).Fac parte dintre limfocitele mari cu granulaii (large granular lymphocytes). Se gsesc n mduva osoas hematogen, splin i n sngele periferic. Celulele NK reprezint o linie primordial de aprare a organismului (imunitatea nnscut), pe care l ajut s elimine celulele modificate datorit unor infecii, sau celulele modificate neoplazic, n special n neoplazii hematologice (ex. leucemie). Spre deosebire de limfocitele Tc celulele NK nu au TCR (au ns, de ex., receptori pentru molecule de IgG), n cazul celulelor NK nu exist rspuns imun secundar (de memorie).

11. 4. Celulele prezentatoare de antigen (antigen presenting cells) Capacitatea de a prezenta antigene limfocitelor Th, iar prin aceasta de a induce un RI specific, este asigurat de dou categorii de celule prezentatoare de antigen (APC): - celulele profesionale / specializate celulele dendritice, monocitele / macrofagele i limfocitele B; - celulele ocazionale (ndeplinesc funcia doar n anumite condiii de activare celular) neutrofilele, celulele endoteliale i celulele epiteliale. Celulele prezentatoare de antigen (APC) au urmtoarele funcii (Figura nr. 3): recunosc antigenele T dependente prin receptorii membranari, le endociteaz i prelucreaz, transport antigenele native de la esuturi la organele limfoide secundare, prezint antigenele native LT urmnd selecia clonei de limfocite specifice acelui antigen, activeaz fie LTc fie LTh. Celulele dendritice se gsesc n aproape toate esuturile organismului, incluznd sngele i organele limfoide. La nivelul esuturilor periferice formeaz o reea care se extinde i n spaiile dintre celulele parenchimatoase astfel nct pot detecta orice microorganism aflat n acea zon. Celulele dendritice posed dou sisteme de supraveghere imunologic: macropinocitoz (n fiecare or inger echivalentul volumului lor; nu ateapt pasiv apariia antigenului care s le stimuleze), au pe membran mai multe tipuri de receptori pentru mai multe tipuri de particule. Sunt clasificate, n funcie de distribuia n organism i de particularitile fenotipice, n trei mari clase i ase tipuri: 157

a). Celule dendritice tisulare celule Langerhans CDL, care la nivel cutanat formeaz un strat continuu ntre derm i epiderm (dar le gsim i la nivelul tubului digestiv i organelor genitale), celule interstiiale - CDI, care se gsesc n interstiiul esuturilor; b). Celule dendritice limfoide (din organele limfoide secundare) celule interdigitate - CDID, n ariile T dependente din organele limfoide secundare, celule foliculare - CDF, n ariile B dependente din organele limfoide secundare; c). Celule dendritice circulatorii celule sanguine - CDS, n vasele sanguine, aflate n tranzit, celule limfatice, vluroase - CDV, n vasele limfatice, aflate n tranzit. Toate celulele dendritice au origine medular, provenind din aceeai entitate celular - CDS (o parte dintre CDS ptrund n esutul cutanat i mucoase, iar alt parte n interstiiu). Pot s ndeplineasc funcia de APC deoarece prezint receptori de tip CR, FcR i sintetizeaz molecule MHC II (cu excepia CDF). Aadar, celulele dendritice sunt eliberate n circulaie din mduva osoas hematogen i se transform n CDS. De aici pot urma dou ci: n esutul cutanat se transform n CDL (capteaz antigenele opsonizate), apoi iau calea vaselor limfatice transformndu-se n CDV, ajung la nivelul organelor limfoide secundare unde se transform n CDID care prezint pe membrana epitopi n conjuncie cu MHC II. n interstiiu se transform n CDI, apoi fie iau calea vaselor limfatice (i urmeaz drumul de mai sus), fie trec n circulaie, se transform din nou n CDS i ajung n splin unde fie o ajung periarteriolar (zona cu LT) i se transform n CDF care reprezint filtre pentru antigenele solubile, o ajung n jurul zonei periarteriolare (zona cu LB) i se transform n CDID. Subliniem c este vorba despre aceeai celul dendritic, n circulaie prin organism; n funcie de locul n care ajunge are alte caracteristici structurale i funcionale. Celulele dendritice tipice (CDL, CDI, CDID) au form neregulat, cu prelungiri numeroase, lungi i efilate (de unde vine i denumirea lor). n citoplasma celulelor dendritice se gsesc numeroase mitocondrii. CDF nu au att de multe prelungiri i se dispun n grmezi. CDS au aspect rotund ovalar iar CDL sunt celule vluroase. Au rol important n maturizarea precursorilor LT. Induc tolerana LT, eliminnd LT autoreactive (cele care la nivel timic au interacionat cu MHC i ar putea s reacioneze la fel de puternic i cu celulele somatice normale din organismul uman i s genereze autoimunitatea). Astfel, CD elimina LT care au scpat seleciei negative (vezi Cap. 10, paragraf 10.2.1.). Se pare c aceste celule intervin n declanarea RI naintea macrofagelor. Monocitele / macrofagele pot fagocita exo-antigenele ntr-o vacuol numit endozom primar. Fuziunea endozomilor secundari cu lizozomii permite degradarea antigenelor n peptide imunogenice. Moleculele MHC II, produse la nivelul reticulului endoplasmic, pot ncrca aceste peptide. Fago-lizozomii fuzioneaz cu membrana plasmatic i astfel, peptidul de pe MHC II se exprim la suprafaa extern a macrofagelor. Macrofagele reprezint APC majoritare n organism, ns nu toate pot ndeplini funcia de APC, respectiv: cele care nu au capacitatea s funcioneze ca APC vor rmne implicate n rspunsul inflamator, 158

 celelalte vor funciona ca APC n cinci etape 1. captarea Ag (proces imunologic nespecific, mediat de receptori); 2. endocitarea Ag captate (realizat doar de ctre macrofagele activate metabolic); 3. prelucrarea Ag native captate (are loc la nivel lizozomal iar la finalul ei, rmne un epitop, format dintr-o hapten cu specificitate maxim i o protein carrier); 4. conservarea epitopilor n anumite sectoare subcelulare (n acest fel este asigurat autontreinerea RI n timp); 5. prezentarea epitopilor pe membrana APC, cuplai n permanen cu molecule MHC. Sistemul MM exprim molecule MHC II, mai ales dup activarea prin interferonul gamm a (IFNg). Dup contactul cu limfocitul T, macrofagele secret IL-1 i IL-6 i TNF-a; TNF-a activeaz RI i procesul inflamator local. Limfocitele B pot funciona ca APC profesionale numai n condiii de activare metabolic. Au capacitatea de a recunoate epitopii conformaionali ai antigenelor i de a-i prezenta limfocitelor T (de peste 30 de ani a fost dovedit faptul c RI la antigenele timo-dependente necesit cooperarea LB-LT). Prezint pe suprafaa lor receptori de tip CR i FcR i pot sintetiza molecule MHC II. LB recunosc i prezint numai Ag solubile. Exist studii care afirm faptul c LB au o mai mare eficien n procesul de prezentare al antigenelor n comparaie cu macrofagele. LB naive dar mature (nc nu au avut contact cu antigenul, dar au fost maturate n mduva osoas hematogen) sunt stimulate de antigen. Ag este captat prin intermediul BCR (receptor pentru antigen de pe LB). LB capteaz antigenul, l proceseaz, prezint apoi epitopii n complex cu molecule MHC II spre LTh CD4+. Acesta din urm trimite semnale ctre alte LB prin citokine i molecule de suprafa iar LB ncep s prolifereze, se transform n limfoblaste B, apoi n plasmocite care vor secreta anticorpi.

11. 5. Sistemul mononuclear fagocitar (sistemul MM) Monocitele / macrofagele reprezint o linie celular cu funcie important n imunologie, prin intervenia lor n imunitatea natural, n prezentarea antigenic i n reacia imun specific. Principalele funcii ale sistemului MM sunt reprezentate de: recunoaterea structurilor strine (non-self) sau modificate, fagocitarea, prelucrarea i prezentarea acestora (n context MHC), citotoxicitate, citostatism, secreie a diferitelor molecule (ex. IL-1, TNF-) i reglarea reaciilor n cadrul rspunsului imun. Macrofagele, alturi de celulele dendritice i celulele epiteliale, formeaz sistemul reticulohistiocitar (SRH). Macrofagele pot fi observate n toate esuturile. Se formeaz n mduva osoas hematogen, dintr-un precursor comun monoblast-mieloblast i cnd devin mature poart numele de monocite. n acest stadiu, moleculele MHC II fie nu exist fie sunt slab exprimate, ca semn al unui status funcional redus (devin foarte bine reprezentate dup stimulare). Monocitele circul n snge 6-8 ore, dup care migreaz n esuturi unde iau nume diferite i ndeplinesc funcii diferite: histiocite n esutul conjunctiv; celule gliale (microglii) n esutul nervos; osteoclaste; macrofage alveolare pulmonare; celule Kuppfer n ficat; macrofage 159

splenice; macrofage peritubulare n rinichi; macrofage ganglionare, n mduva osoas i timus (macrofagele din aceste organe nu trebuie confundate cu celulele dendritice, care pot avea, la rndul lor, o capacitate fagocitar fa de limfocitele n apoptoz). Monocitele / macrofagele prezintreceptori pentru carbohidrai, receptori pentru M-CSF, receptori pentru imunoglobuline i complement. n cadrul procesului de recunoatere, fagocitare i prelucrare a structurilor strine sau a structurilor proprii modificate, spre deosebire de PMN care distrug complet structurile fagocitate, sistemul MM produce un anumit grad de distrugere, cu conservarea gruprilor specifice, necesare stimulrii rspunsului imun. Citotoxicitatea exercitat de macrofage poate fi direct (n cursul procesului de fagocitoz), n urma contactului cu membrana celulei int sau prin citotoxicitate mediat celular, dependent de anticorpi (ADCC) (n acest caz, anticorpii se fixeaz cu captul Fab pe epitopii celulei int i cu fragmentul Fc de macrofag). Macrofagul produce substane litice cu care perforeaz membrana celulei int (asemntor cu aciunea ADCC a celulelor NK). Macrofagele secret un numr foarte mare de substane: cea mai mare parte a factorilor sistemului complement, enzime proteolitice (ex. colagenaze, serinproteaze, hidrolaze), proteine cu rol n adeziunea celular (ex. fibronectin), factori de coagulare, interleukine (IL-1, IL-6, TNF-a, factorul de cretere al trombocitelor/fibroblastelor, factorul de stimulare al coloniilor de granulocite/granulocite-macrofage, endorfine etc) etc. Etapele fagocitozei (Schema nr. 1): 1. Migrarea macrofagelor la locul infeciei, 2. Aderarea macrofagelor la celula int, 3. Ingestia celulei int, 4. Formarea fagolizozomului, 5. Inactivarea intracelular a celulei int, 6. Digestia intracelulara a celulei int. Iat cteva studii interesante legate de funciile macrofagelor i modul n care acestea interacioneaz cu diferitele microorganisme. Lipoarabinomananul (LAM) este considerat unul din factorii de virulen ai Mycobacterium tuberculosis. S-a demonstrat c LAM este incorporat n plutele lipidice din interiorul membranei macrofagelor prin intermediul glicozil-fosfatidil-inozitolui ducnd la reducerea maturrii fagozomilor i protejnd astfel celula fagocitat (6). Toxina pertusis (TP) produs de Bordetella pertussis este implicat n tusea convulsiv. S -a studiat interrelaia dintre TP i macrofagele alveolare n cursul procesului infecios. La un lot de oricei s-au eliminat macrofagele alveolare ceea ce a condus la intensificarea manifestrilor procesului infecios, cu toate c imediat s-a produs un influx de neutrofile la locul infeciei. Mai mult dect att, lipsa macrofagelor a dus la declanarea procesului infecios chiar i cu tulpini care erau deficitare n sinteza TP (7). Endocardita poate fi cauzat de streptococii orali. Mecanismul nu este complet elucidat, dar se pare c monocitele au un rol important. Dei celulele monucleare din sngele periferic sintetizeaz titruri crescute de IL-12, monocitele tind s dispar. Acest lucru scoate n eviden 160

faptul c monocitele infectate streptococic se transform n celule dendritice secretoare de IL12 i nu n macrofage. Celule sanguine mononucleare periferice de la subieci sntoi au fost infectate cu ase tulpini de streptococi orali. S-a observat c monocitele stimulate de aceste antigene exprim fenotipul i funcia celulelor dendritice (8). Mai multe studii au artat c M. leprae activeaz puine macrofage i celule dendritice. S-a demonstrat c la nivelul monocitelor naive M. leprae induce niveluri crescute de citokine ce inhib monocitele. M. leprae este implicat att ntr-o stimulare ct i ntr-o inhibare a monocitelor (9).

11. 6. Alte celule implicate n rspunsul imun Neutrofilele Sunt cele mai abundente granulocite din circulaia periferic. Neutrofilele intervin n: imunitatea natural prin fagocitoz i imunitatea specific, datorit receptorilor proprii pentru imunoglobuline i complement, n colaborare cu limfocitele i alte APC. Principalii factori care atrag PMN la nivelul focarului infecios sunt: complexele Ag-Ac, subcomponenta C5a a sistemului complement, derivaii acidului arahidonic (ex. leucotriena B4). Dup fagocitare, PMN utilizeaz pentru degradarea structurilor strine diferite enzime precum: lizozim, proteinaze neutre (ex. elastaze), hidrolaze acide (ex. glicerofosfataze). Sunt generai i radicali activi de oxigen. S-a studiat relaia ntre neutrofile i macrofage n cadrul infeciei cu Mycobacterium tuberculosis. Dup infectarea experimental a cobailor, neutrofilele au fagocitat microbul i au secretat IL-8 i TNF- (cu rol activator asupra macrofagelor). Neutrofilele i macrofagele au fost prelevate i cultivate mpreun i separat, apoi infectate. IL-8 a fost detectat la nivele mult crescute n culturile care conineau att macrofage ct i neutrofile n comparaie cu situaia n care culturile conineau separat macrofage, respectiv neutrofile. S-au folosit mai multe tehnici de cultivare i s-a ajuns la concluzia c i TNF- este la un nivel mai nalt n culturile ce conineau ambele tipuri de celule. Ulterior, cultura a fost tratat cu anticorpi policlonali anti TNF- iar rspunsul macrofagelor la stimularea neutrofilelor infectate a fost complet anulat. Acest studiu demonstreaz c TNF- produs de neutrofilele infectate ar putea fi responsabil de activarea macrofagelor alveolare (10). Eozinofilele Eozinofilele reprezint n mod normal ntre 1% i 3-5% din leucocitele sanguine. Procentul eozinofilelor crete n alergii sau n infeciile parazitare. Funcia lor fagocitar, prin receptorii de IgG i IgE i mecanismul ADCC, este relativ limitat. Totui, eozinofilele pot fagocita fungi, complexe Ag-Ac, bacterii. Granulele lor conin produi toxici pentru diferii parazii.

161

Pe de alt parte, eozinofilele produc histaminaz i arilsulfataz care inactiveaz histamina i respectiv leucotrienele produse de mastocite. Prin aceti factori se reduce rspunsul inflamator i migrarea leucocitelor n focarul infecios. Mai multe studii au demonstrat rolul eozinofilelor n cadrul imunitii nnscute i adaptative ndreptate mpotriva infeciilor cu parazii. Nu a fost dovedit c eozinofilele ar iniia rspunsul imun fa de parazii. Plecnd de la ipoteza c eozinofilele ar putea fi celule prezentatoare de antigen n infeciile parazitare, eozinofilele au fost expuse la un anumit parazit i s-a examinat expresia diferiilor markeri de suprafa implicai n activarea celular. S-a remarcat o cretere de 6 ori a CD69 i MHC II, de 4 ori a CD86 (molecula costimulatoare pentru LT). Abilitatea eozinofilelor de a prezenta antigenul a fost explorat i prin cultivarea lor mpreun cu LTCD4+. Eozinofilele au avut capacitatea de a transforma LT naive n LTh2 productoare de IL-5 (11). Bazofilele i mastocitele Conin granule metacromatice i receptori pentru IgE. Au rol n reacia de hipersensibilitate mediat umoral (tip I). Principalul mediator n declanarea HS de tip I este histamina. Ambele sunt implicate n aprarea anti-parazitar. Mastocitele nu se gsesc n cantitate mare n snge, dar sunt ntlnite la nivelul esuturilor conjunctive n apropierea vaselor sanguine i limfatice, aproape de sau n interiorul nervilor i sub epiteliile organelor care vin n contact cu mediul extern (plmn, intestin, piele). Bazofilele se difereniaz i matureaz n mduva osoas hematogen, apoi circul prin snge. Att bazofilele ct i mastocitele secret citokine dar spre deosebire de mastocite, bazofilele secret i IL-4. A fost studiat un eventual rol n diferenierea limfocitelor helper spre linia Th2 (proces care necesit IL-4) (12). A fost demonstrat prezena bazofilelor n ganglionii limfatici, n apropierea LT ca i faptul c secreia de IL-4 poate fi declanat de un stimul independent de IgE (13). Mastocitoza (Figura nr. 4) - Mastocitoza) este o boal n care apare hiperplazia mastocitelor cu exces de mediatori la nivelul pielii, tractului gastrointestinal, mduvei osoase hematogene, ficatului, splinei i ganglionilor limfatici. Incidena bolii este de 3-7/1.000.000 locuitori. Poate aprea la orice vrst (valorile cele mai mari sunt nregistrate n primii doi ani de via i n decada a treia i a patra). Se datoreaz mutaiei genei ce activeaz factorul de cretere pentru mastocite. Plachetele Plachetele au un rol accesoriu n reacia imun. Ele conin serotonin i exprim receptori pentru IgG i IgE. Plachetele ader la endoteliul vascular, se agreg i elibereaz substane care cresc permeabilitatea capilar i activeaz sistemul complement. Datorit Ig fixate pe membrana lor, plachetele pot adera la parazii i pot elibera radicali liberi ai oxigenului cu efect toxic pentru acetia. Globulele roii Alturi de rolul principal de a transporta oxigenul la esuturi i bioxidul de carbon la plmni, globulele roii dein receptori pentru sistemul complement, faciliteaz transportul complexelor imune din snge la celulele Kuppfer din ficat, prin fixarea lor pe receptorii pentru complement.

162

11. 7. Direcii de cercetare Prezentm cteva dintre posibilele direcii de cercetare pe care cititorul le poate evalua deschiznd urmtoarele link-uri: 1. Human endometriosis is associated with plasma cells and overexpression of B lymphocyte stimulator (http://www.pnas.org/content/104/30/12451.abstract?sid=053b0c70-97fc-4804ac6a-622ed823e269 ) 2. CD8 tumor-infiltrating lymphocytes are predictive of survival in muscle-invasive urothelial carcinoma (http://www.pnas.org/content/104/10/3967.abstract?sid=0d4f7416-7328-4a638325-a06694781bf8 ) 3. 3D visualization of HIV transfer at the virological synapse between dendritic cells and T cells (http://www.pnas.org/content/107/30/13336.abstract?sid=71cd1eae-e84c-42db-803718274860d243 ) 4. T cells turn professional(http://www.nature.com/nri/journal/v5/n7/full/nri1651.html) 5. Th17 cells and regulatory T cells: new light on pathophysiology of preeclampsia (http://www.nature.com/icb/journal/v88/n6/full/icb201068a.html) 6. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer (http://www.nature.com/nri/journal/v5/n4/abs/nri1592.html) 7. Lung inflammation: Disarming neutrophils in cystic fibrosis (http://www.nature.com/nri/journal/v8/n1/full/nri2244.html) 8. Effect of Malnutrition on K+ Current in T Lymphocytes (http://cvi.asm.org/cgi/content/full/12/7/808?maxtoshow=&hits=80&RESULTFORMAT=1&ando rexacttitle=and&titleabstract=T+lymphocytes&andorexacttitleabs=and&andorexactfulltext=and &searchid=1&FIRSTINDEX=0&sortspec=relevance&fdate=1/1/2005&resourcetype=HWCIT)

11. 8. Evaluarea cunotinelor 1. Una din urmtoarele afirmaii legate de celula stem este adevrat: A. Se formeaz la circa 3 luni de la nidaia zigotului; B. D natere hemocitoblastului i limfoblastului; C. Poate fi gsit n mduva spinal; D. Se afl la originea unor linii hematopoietice. 2. Legat de limfocite, o afirmaie este fals: A. LT sunt majoritare n snge; B. LT se gsesc n paracorticala ganglionilor i manonul limfoid din jurul arterelor centrale splenice; C. LT induc o reacie specific antigenic; D. LB au rol esenial n sinteza anticorpilor n cursul RIC specific. 3. LTh: A. LTh1 stimuleaz switch-ul izotipic spre IgM; B. LTh0 sunt limfocite tinere care dau natere celorlalte tipuri de limfocite; C. LTh2 sunt implicate n aprarea antineoplazic; D. LTh17 duc la reacii de hipersensibilitate; E. LTh0 genereaz inflamaie tisular. 163

4.

Una din urmtoarele celule nu este APC: A. Celula Langerhans; B. Celula dendritic; C. Monocitul/macrofagul; D. LT 5. Eozinofilele: A. Procentul lor crete n alergii sau infecii parazitare; B. Sunt majoritare n infeciile bacteriene; C. n mod normal reprezint 50% din leucocitele sanguine; D. Pot duce la o boal numit mastocitoz.

Bibliografie 1. Bird L, 2008, Allergy and Asthma: Calling all TH2 cells, Nature Rev. Immunol., 8, 162 2. Bettelli E, Korn T, Oukka M, Kuchroo VK, 2008, Induction and effector functions of TH17 cells, Nature, 453, 1051-1057 3. Dong C, 2008, TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming, Nature Rev. Immunol., 8, 337-348 4. Trapani JA, Smyth MJ, 2002, Functional significance of the perforin/granzyme cell death pathway, Nature Rev. Immunol., 2, 735747 5. Bell E, 2007, Turning B cells into T cells, Nature Rev. Immunol., 7, 838-839 6. Welin A, Winberg ME, Abdalla H et al., 2008, Incorporation of Mycobacterium tuberculosisLipoarabinomannan into Macrophage Membrane Rafts Is a Prerequisite for the Phagosomal Maturation Block, Infection Immunity, 76, 2882-2887 7. Carbonetti NH, Artamonova GV, Rooijen N, Ayala V, 2007, Pertussis Toxin Targets Airway Macrophages To Promote Bordetella pertussis Infection of the Respiratory Tract, Infection Immunity, 75, 1713-1720 8. Hahn CL, Schenkein HA, Tew JG, 2005, Endocarditis-Associated Oral Streptococci Promote Rapid Differentiation of Monocytes into Mature Dendritic Cells, Infection Immunity, 73, 50155021 9. Sinsimer D, Fallows D, Peixoto B et al., 2010, Mycobacterium leprae Actively Modulates the Cytokine Response in Nave Human Monocytes, Infection Immunity, 78, 293-300 10. Sawant KV, McMurray DN, 2007, Guinea Pig Neutrophils Infected with Mycobacterium tuberculosis Produce Cytokines Which Activate Alveolar Macrophages in Noncontact Cultures, Infection Immunity, 75, 1870-1877 11. Padigel U, Lee J, Nolan T et al.,2006, Eosinophils Can Function as Antigen-Presenting Cells To Induce Primary and Secondary Immune Responses to Strongyloides stercoralis, Infection Immunity, 74, 3232-3238 12. MacGlashan D, 2008, New roles for basophils, Immunol. Cell Biol., 86, 637-638 13. Sokol CL, Barton GM, Farr AG, Medzhitov R., 2008, A mechanism for the initiation of allergen-induced T helper type 2 responses, Nat. Immunol., 9, 310-318

12. Complexul major de histocompatibilitate (MHC); Sistemul HLA (MI Popa)

164

12. 1. Definiie i istoric Complexul major de histocompatibilitate (MHC) uman, sau sistemul HLA, corespunde unor moleculele exprimate pe membrana celular. Au fost descoperite ca alloantigene (alloantigen = antigen ce exist n forme alternative = alele n cadrul unei specii; alloantigenul induce rspuns imun atunci cnd este transferat la indivizii din aceeai specie, crora le lipsete respectiva form a antigenului; exemplu: sistemul ABO al grupelor sangvine) de care depindea compatibilitatea grefelor cutanate sau de organ. Un fragment de esut recoltat de la o gazd i grefat la un receptor diferit, chiar dac face parte din aceeai specie, este de regul eliminat. Dac dup eliminare se ncearc o nou grefare, cu acelai tip de esut, eliminarea este mai rapid. Pornind de la aceste observaii s-a pus numele de antigene de histocompatibilitate [primul rol identificat pentru acestea (dar existena lor nu este legat doar de fenomenul de compatibilitate/respingere a grefelor de esut sau organ]. Eliminarea esuturilor este controlat genetic, de mai multe gene care codific pentru sinteza de proteine diferite la subieci diferii (gene de histocompatibilitate). Exist antigene majore de histocompatibilitate (MHC) i antigene minore (situaie n care eliminarea grefelor are loc, de regul, tardiv). nelegerea acestor fenomene este legat de 3 descoperiri succesive: Complexul major de histocompatibilitate. Cercetrile lui Gorer (1963) pe grefe tumorale prelevate de la un oarece i grefate la altul, au artat c grefa este respins n caz de histoincompatibilitate sau tolerat n caz de histo-compatibilitate. Rejetul sau tolerana sunt dictate genetic. Aceasta a dus la descoperirea sistemului major numit H2 la oarece i a mai multor sisteme minore. Ulterior, existena MHC a fost confirmat la toate mamiferele, regiunea fiind denumit n funcie de specie (ex. H2 la oarece, ChLA la cimpanzeu). Sistemul HLA. n 1958 se pune n eviden, n serul unui pacient cu aplazie medular i politransfuzat, un alloanticorp care aglutineaz leucocitele altor subieci. Aceasta st la originea descoperirii sistemului allotipic HLA (human leucocyte locus A), evideniat la nivelul leucocitelor, apoi la majoritatea celulelor. Exist o mprire a sistemului HLA pe mai multe gene HLA-A, HLAB, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP i HLA-DQ. Studiul supravieuirii grefelor cutanate, ntre donor i receptor HLA identic sau diferit a dovedit c sistemul HLA corespunde genetic i funcional cu MHC uman. Rspunsul imun. Rolul fiziologic a fost descoperit ulterior. Proprietatea de a rspunde la un anumit antigen depinde de genele MHC, numite din acest motiv gene ale rspunsului imun. Doherty i Zinkeragel au demonstrat n 1974 c rspunsul imun este limitat de complexul major de histocompatibilitate (MHC) individual.

12. 2. Structur i clasificare Sistemul HLA cuprinde un ansamblu de gene localizate pe un segment al braului scurt al cromozomului 6 (Figura nr. 1). 165

Genele HLA posed trei caracteristici importante: 1. polimorfismul - fiecare gen este polialelic (cu excepia HLA-DRA), fiind evideniate peste 50 de alele n sistemul MHC uman; aceasta este principala caracteristic a HLA ce face ca organismul uman s fie capabil de recunoaterea a miliarde de antigene din natur prin arsenalul de MHC cu conformaie specific fiecrui antigen. 2. codominana - la un subiect heterozigot, sunt exprimate dou alele diferite; 3. legtura strns -toate genele situate pe acelai cromozom se transmit n bloc descendentului, sub form de haplotip. Moleculele HLA aparin superfamiliei imunoglobulinelor, modelul lor structural de baz fiind motivul imunoglobulinic cu o punte disulfidic intramolecular. Sistemul HLA este mprit n dou grupe principale: HLA clasa I i HLA clasa II, denumirea respectnd cronologia descoperirii lor, i nu organizarea pe cromozom. Exist i HLA clasa III (nu este implicat n histocompatibilitate). Moleculele HLA clasa I Aceste molecule sunt heterodimeri formai prin legtur noncovalent ntre un lan greu polimorf a i un lanuor nonpolimorf 2m (Figura nr. 2) lanul greu a (44 kDa) este o protein transmembranar cu polimorfism alelic, codat de o gen a sistemului HLA; cuprinde 3 domenii extracelulare, o poriune transmembranar i o parte intracitoplasmatic scurt; lanul 2m (11,5 kDa) este codat de o gen de pe cromozomul 15 i cuprinde un singur domeniu; este extracelular, legat noncovalent de lanul a. Moleculele HLA-I sunt prezente pe majoritatea celulelor organismului, formnd pe suprafaa acestora un receptor constitutiv. Dintre celulele anucleate, aceste molecule sunt adesea absente la nivelul globulelor roii dar prezente n cantitate mare la nivelul plachetelor sanguine. Expresia lor pe celulele nucleate este variabil, n funcie de tipul celular: pe limfocitele T sau B i polimorfonucleare sunt exprimate 104-5105 molecule/celul n timp ce pe hepatocite sunt slab exprimate iar pe celulele nervoase i spermatozoizi aproape lipsesc. Pentru HLA-I exist 3 gene ce codific antigene majore de histocompatibilitate: HLA-A, HLA-B, HLA-C i 3 gene pentru antigene minore: HLA-E, HLA-F, HLA-G. Moleculele HLA clasa a II-a Aceste molecule sunt heterodimeri cuprinznd un lan polipeptidic a i un lan polipeptidic (Figura nr. 3) lanul greu a (33-34 kDa) cuprinde dou domenii externe a1 i a2, o poriune transmembranar i o terminaie carboxilic scurt intracitoplasmatic; lanul uor (28 kDa) are o structur asemntoare, cu dou domenii externe 1 i 2. Moleculele clasei a II-a au o distribuie mult mai restrns n comparaie cu moleculele clasei I. Ele sunt exprimate pe celulele prezentatoare de antigen (APC): celule dendritice (celule Langerhans din piele, celule interdigitate ganglionare i din timus, celule dendritice din epiteliul cilor respiratorii), monocite / macrofage i limfocite B. Limfocitele T nu exprim astfel de molecule dect dup activare.

166

Moleculele clasei a II-a au fost descoperite i la nivelul endoteliului vascular i al celulelor epiteliale ale intestinului gros. n cazuri patologice, moleculele clasei a II-a au fost depistate la nivelul celulelor din insulele lui Langerhans n diabetul insulinodependent, al canalelor biliare n ciroza biliar primitiv i al celulelor tiroidiene n afeciunile tiroidiene autoimune. Expresia moleculelor este indus de mediatori precum: IFN-g, TNF-a i , IL-4, IL-13 i GM-CSF cu rol esenial n rspunsul imun. Prostaglandina E2 inhib sinteza lor pe monocite / macrofage. Regiunea HLA-II conine gene ce codific HLA-DR, DQ, DP, DM, i pe lng acestea, cteva molecule accesorii: PSMB8, PSMB9, TAP1, TAP2, BTNL2. Moleculele HLA-III nu sunt implicate n histocompatibilitate. Sunt total diferite de cele de clasele I i II. Nu se afl ataate pe membranele celulare i nu intervin n recunoaterea peptidelor antigenice.

12. 3. Roluri Limfocitele T protejeaz organismul uman de 2 mari categorii de ageni patogeni: virusurile, care preiau comanda celulei pe care o infecteaz (devenind astfel antigene endogene) i bacteriile care se replic autonom, majoritatea extracelular. Cele 2 clase ale MHC sunt eseniale n recunoaterea i rspunsul imun fa de peptide derivate din agresori. n lupta dintr-o infecie viral, virusul este eliminat de ctre LT CD8+ care recunoate peptide virale endogene ataate de MHC-I. n schimb, o bacterie e eliminat prin fagocitare de ctre macrofage sau neutrofile. LT CD4+ recunoate peptidele bacteriene legate de MHC-II i direcioneaz rspunsul imun ctre activarea macrofagelor i producia de anticorpi care opsonizeaz bacteria. Moleculele de histocompatibilitate au aadar un rol fundamental n prezentarea peptidului antigenic ctre: limfocitul T helper - HLA-II sau limfocitul T citotoxic - HLA-I. n aceast comunicare intercelular intr n contact 3 molecule: HLA peptidul antigenic TCR. Rolul moleculelor HLA clasa I Au rol n principal n reacia imun care implic intervenia LTc. Moleculele HLA I prezint un peptid endogen sintetizat de o celul contaminat de o bacterie/un virus/un parazit cu dezvoltare intracelular sau un peptid endogen rezultat din degradarea unor celule self tumorale sau mbtrnite ctre receptorul de antigen (TCR) al limfocitului T CD8+. Se va obine astfel un rspuns imun celular prin activarea i multiplicarea LTc avnd ca rezultat liza celulelor int ce au prezentat antigenul prin HLA-I. (Figura nr. 4) Rolul moleculelor HLA clasa a II-a

167

Ele intervin n principal n rspunsul imun n care sunt implicate APC i LTh. Moleculele HLA II prezint limfocitului Th CD4+ peptide de origine exogen, provenite din proteinele endocitate i degradate de APC. (Figura nr. 5) Etape: a) Legarea antigenului exogen de molecula HLA clasa II: 1. Endocitoza - particulele antigenice (bacterii, proteine strine) sunt internalizate nespecific de monocite / macrofage sau specific de limfocitele B prin IgM. Ele urmeaz calea endocitozei; 2. Generarea peptidelor antigenice - prin fuzionarea endozomilor cu lizozomii, proteinele sunt degradate n peptide prin activarea proteazelor lizozomale la un pH acid; 3. Asocierea cu HLA II - moleculele HLA clasa II-a sintetizate n reticulul endoplasmic sunt asociate, sub forma unui complex, cu o protein accesorie, lanul invariabil II. Aceasta mpiedic legarea peptidelor endogene de HLA-II prin blocarea situsului de legare n timpul sintezei sale i permite legarea peptidelor exogene prin distrugerea lanului dup terminarea sintezei; 4. Trecerea prin membrana celular - ansamblul HLA-II-peptid exogen este exprimat la suprafaa APC. (Figura nr. 6) b) Interaciunea ntre APC i limfocitul T helper: Peptidele antigenice sunt recunoscute de ctre LTh prin TCR numai dac sunt prezentate de ctre APC pe MHC-II. Pe de alta parte, limfocitul helper CD4+, prin TCR-ul su nu poate interaciona cu o APC dect dac recunoate antigenele cuplate cu moleculele MHC ale individului (restricie allogenic). Molecula accesorie CD4 a limfocitului helper interacioneaz cu domeniul 2constant al HLA-II declannd astfel primul semnal ctre limfocit pentru activarea sa. n urma unor reacii n cascad LT va intra n mitoz, va secreta o serie de citokine i va colabora cu LB spre producia de anticorpi avnd ca scop eliminarea antigenelor exogene. Specificitatea reaciei este datorat asocierii trimoleculare TCR, HLA, peptid antigenic. O parte din moleculele codificate de regiunea HLA-II sunt implicate n procesarea i ncrcarea peptidelor pe HLA-I. Astfel, PSMB8 i PSMB9 sunt subuniti ale proteozomului iar TAP1 i TAP2 transport peptidele endogene din citoplasm n RE. BTNL2 este implicat n susceptibilitatea la sarcoidoz Moleculele HLA-III sunt mprite n dou categorii n funcie de rol: a.) cu rol n imunitate i inflamaie: componentele complementului C2 i C4, TNF, HSP (proteina de oc termic); b.) cu rol enzimatic: CYP21

12. 4. Povestiri adevrate 12.4.1. Polimorfismul HLA Orice celul care prezint un tip de HLA diferit de cel al organismului este considerat non-self, un invadator, iar rezultatul este acela de rejecie a esutului compus din respectivele celule. Din cauza importanei HLA n transplant, locusurile HLA sunt printre cele mai frecvent serotipate sau analizate prin PCR fa de oricare alte alele autozomale.

168

n diferite studii, s-a analizat importana compatibilitii HLA n transplantul de inim, rinichi, celule stem hematopoietice. Polimorfismul sistemului HLA este foarte mare i de aceea probabilitatea ca organele donoare s fie potrivite primitorului este foarte mic. n transplanturi a existat practica de a se aloca organe fr a se lua n considerare compatibilitatea HLA donor-receptor. De aceea, n trecut, nu a fost posibil analizarea corespunztoare a ratei de succes a transplantului cu organe compatibile HLA. ntr-un studiu realizat pe 8.331 de pacieni, internai n 104 centre din 24 state din USA, doar 128 subieci au primit cte o gref cardiac compatibil HLA (A, B sau DR) sau doar cu o singur incompatibilitate. S-a observat supravieuirea esutului pe o durat de 3 ani, iar rezultatele au fost dependente de sistemul HLA. Astfel, au avut succes: la compatibilitate maxim 834% transplanturi fa de 76 2% transplanturi la 2 nepotriviri. Aadar, supravieuirea grefei n transplantul de cord este semnificativ influenat de compatibilitatea HLA. Exist dou tipuri de incompatibilitate: a antigenelor (detectabil serologic) i a alelelor (detectabil prin metode de analizare a ADN-ului). ntr-un studiu s-a testat ipoteza conform creia incompatibilitatea alelelor este mai puin imunogen dect incompatibilitatea antigenelor i, astfel, este mai puin asociat cu rejecia de transplant cu celule stem hematopoietice. Peste 450 de pacieni cu leucemie mieloid cronic au primit transplant de mduv de la donori diferii. Prin secvenierea ADN, s-au analizat alelele clasei I HLA (A, B, C) i s-au observat ratele de respingere a grefei la transplanturile fr nici o incompatibilitate, la cele cu o singur incompatibilitate a alelelor sau a antigenelor sau la transplanturile cu 2 sau mai multe nepotriviri. Rezultatele au confirmat ipoteza i, astfel, riscul rejeciei de transplant a fost semnificativ mai mare la cei cu o incompatibilitate antigenic HLA, fa de cei cu o incompatibilitate alelic. Riscul a fost de asemenea crescut la cei cu mai multe nepotriviri HLA i la primitorii homozigoi HLA n locusul de incompatibilitate. n concluzie, transplanturile de la donori cu o singur incompatibilitate a alelelor HLA au un risc sczut de rejecie i pot fi realizate cu succes. n schimb, incompatibilitatea de antigene HLA, detectabil serologic, crete riscul de respingere a esutului. 12.4.2. Asocierea subtipurilor HLA cu susceptibilitatea la boli Studii epidemiologice au demonstrat c peste 40 de boli se ntlnesc mai frecvent la indivizi purttori ai anumitor alele HLA I sau II dect la populaia general. Importana acestor efecte este extrem de mare, dei nu vor fi probabil niciodat demonstrate ca absolute. De exemplu, ntre 90% i 95% din pacienii caucazieni cu spondilit ankilozant posed HLA-B27 (1), iar 30%50% din pacienii caucazieni cu diabet zaharat tip I sunt HLA-DQ2/DQ8 heterozigoi. Interesant este faptul c HLA-DQ6 pare a fi responsabil de protecia mpotriva diabetului zaharat de tip I. Majoritatea bolilor care au legtur cu anumite gene HLA au un caracter autoimun. Baza molecular a acestei legturi este necunoscut din cauza lipsei identificrii autoantigenului primar care reprezint trigger-ul. (2) Cu toate c mecanismele prin care genotipurile HLA controleaz susceptibilitatea la aceste boli sunt nc incomplet definite, se crede c participarea moleculelor MHC n stabilirea toleranei imunologice i n recunoaterea antigenelor st la baza acestor fenomene. Alelele HLA ce ofer protecie pot media eliminarea n timus a LT potenial patogene responsabile de autoimunitate, n timp ce alelele HLA susceptibile pot eua n eliminarea LT patogene. 169

Pe de alt parte, genotipurile HLA pot guverna receptivitatea la anumite vaccinuri. Spre exemplu, subiecii care au alela HLA-DR3 sunt, ntr-o proporie crescut substanial, nereceptivi la vaccinarea cu antigenul de suprafa al hepatitei B. Totodata, indivizii cu HLA-DRB1*03 sau HLA-DQA1*0201 au o inciden crescut de seronegativitate la vaccinarea mpotriva pojarului. (3) Un studiu realizat de curnd pe ceteni americani caucazieni certific faptul c homozigoii HLA-DR13-DQ6 prezint risc crescut de asociere a distoniei cervicale. (4) O alt boal cu caracter autoimun i conexiuni certe cu sistemul HLA este scleroza multipl. (5 6) 12.4.3. Prezentarea de antigene independent de MHC Recent s-a fundamentat ideea conform creia exist o clas nou de LT care recunosc antigene prezentate de molecule ce nu sunt MHC-I sau MHC-II. Una dintre aceste clase de LT folosete un receptor pentru antigen ce recunoate antigene lipidice prezentate pe molecule CD1. CD1 sunt asemntoare structural cu MHC-I, ns lanurile CD1 formeaz un situs ce poate acomoda componente glicolipidice ale patogenilor microbieni. Astfel, complexele CD1-glicolipide servesc drept int pentru recunoaterea de ctre LT ce au un tip special de receptor: TCR. Aceast prezentare a glicolipidelor microbiene pe molecule CD1 pare s fie responsabil de recunoaterea independent de MHC a mycobacteriilor. (3)

12. 5. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. 1. Early selection in Gag by protective HLA alleles contributes to reduced HIV-1 replication capacity that may be largely compensated in chronic infection, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20810731 2. Additive contribution of HLA class I alleles in the immune control of HIV-1 infection. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20660184 3. The impact of HLA genotyping on survival following unrelated donor haematopoietic stem cell transplantation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20560963 4. Impact of human leukocyte antigen matching on hepatitis B virus recurrence after liver transplantation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20382583

12. 6. Verificai-v cunotinele 1. Principala caracteristic a sistemului HLA este: A. codominana B. specificitatea C. polimorfismul D. histocompatibilitatea 170

E. imunogenicitatea. 2. Moleculele MHC-II se afl pe: A. majoritatea celulelor din organism B. numai pe celulele nucleate C. numai pe macrofage D. toate APC E. limfocite 3. Colaborare intercelular exist ntre: A. HLA-II i LTc B. HLA-I i LTc C. APC i HLA-I D. HLA-I i LTh E. HLA-I i HLA-II 4. Moleculele HLA-II prezint ctre limfocite n situsul lor: A. imunoglobuline B. sfingolipide C. peptide exogene D. TCR E. peptide endogene

Bibliografie 1. Reveille JD., 2009, Recent studies on the genetic basis of ankylosing spondylitis, Current Rheumatology Reports., 11(5), 340-8 2. Caillat-ZuchmanS., 2009, Molecular mechanisms of HLA association with autoimmune disease, Tissue Antigens, 73 (1), 1-8 3. David D Chaplin, 2010, Overview of the immune response, Journal of Allergy and Clinical Immunology, 125 (2 Suppl 2), S3-23 4. Deitiker PR, Oshima M., Jankovic J., Duane DD., Aoki KR., Atassi MZ., 2010, Association of HLA Clas II alleles and haplotypes with cervical dystonia: HLA DR13-DQ6 (DQB1*0604) homozygotes are at greatley increased risk of cervical dystonia in Caucasian Americans, Autoimmunity, Epub ahead of print 5. Romero-Pinel L., Pujal JM, Martinez-Yelamos S., Gubieras L, Matas E., Bau L., Torrabadella M., Azqueta C., Arbizu T., 2010, HLA-DRB1: genetic susceptibility and disability progression in a Spanish multiple sclerosis population, European Journal of Neurology, Epub ahead of print 6. Link J., Lorentzen AR., Kockum I., Duvefelt K., Lie BA., Celius EG., Harbo HF., Hillert J., Brynedal B., 2010, Two HLA class I genes independently associated with multiple sclerosis, Journal of Neuroimmunology, Epub ahead of print

13. Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi (A Muntean, MI Popa)

171

Interaciunile ntre celulele imunitare se realizeaz prin dou mecanisme complementare: contactul celular strns, care necesit prezena moleculelor de adeziune (direct); prezena factorilor stimulatori, citokine, secretate de una din cele dou celule aflate n contact sau, uneori, de o celul aflat la distan (indirect). Rezultatul va fi activarea sau inhibarea funciei celulare, ca urmare a transportului informaiei prin mesagerii secunzi spre organitele intracitoplasmatice, membrana celular sau genele nucleare. 13. 1. Moleculele de adeziune Contactul ntre dou celule nu se face spontan. Rolul moleculelor de adeziune este complex i nu se limiteaz la procesele imunologice. Legturile intercelulare asigurate de liganzi sunt reacii chimice clasice specifice, saturabile i reversibile. Clasificarea moleculelor de adeziune se poate face n dou moduri, structural i funcional.

13. 1. 1. Clasificarea structural a moleculelor de adeziune Clasificarea structural a moleculelor de adeziune se bazeaz pe caracteristicile chimice ale moleculei care permit legarea sa de o anumit superfamilie sau familie de proteine. Expresia lor pe suprafaa celulei poate fi constitutiv sau indus n urma activrii celulare. Selectinele (LECAM-family, leucocyte-endothelial cell adhesion molecule) Selectinele sunt glicoproteine transmembranare cu un domeniu N-terminal lectinic-calciudependent i domenii reglatoare pentru sistemul complement. Selectinele au rol n adeziunea intercelular; joac un rol important n amorsarea procesului inflamator. L-selectinele sunt exprimate constitutiv pe suprafaa leucocitelor, n timp ce expresia Eselectinelor pe endoteliu este indus de ctre TNF-a, IL-1 i lipopolizaharidele bacteriene iar a Pselectinelor de ctre C5b, histamin i trombin. L-selectinele joac un rol important pentru LT imature i APC (celule dendritice) care sunt astfel direcionate ctre situsuri cu rol imunologic important, precum nodulii limfatici sau GALT. P-selectinele formeaz mpreun cu factorul Willebrand granule denumite corpusculii Weibel-Palade. P-selectinele sunt primele expuse pe versantul circulator, fiind stocate n vezicule. Integrinele Familia integrinelor cuprinde peste 20 de membri, glicoproteine transmembranare cu structur heterodimeric (a, ). Iniial au fost caracterizate 3 subfamilii, cu lanul comun i lanul a diferit, pentru ca n prezent s se cunoasc faptul c lanul a se poate asocia cu mai multe lanuri ( 1-8). Localizarea integrinelor este ubicuitar (cel puin un membru al acestei familii pe toate celulele nucleate). Leucocitele pot exprima cel puin 13 astfel de receptori. Celulele epiteliale exprim la rndul lor o serie de integrine, constitutiv sau indus, n urma procesului inflamator. Integrinele intervin n legarea intercelular i ntre celul i substrat, prin care contribuie la organizarea tisular i migrarea celular, alturi de superfamilia imunoglobulinelor; subfamilia 172

2-integrinelor stimuleaz proliferarea limfocitelor T, la contactul cu celulele dendritice; cresc sinteza de citokine (1 i 2-integrinele stimuleaz producia de TNF-a i a celulei T; 2integrinele stimuleaz producia de IL-1 a monocitelor, la contactul cu limfocitul T). Integrinele au dou stadii conformaionale, cu specificitate diferit fa de substrat (Figura nr. 1). Acestea sunt influenate de procese celulare interne de fosforilare ce induc schimbri conformaionale, ca rspuns la factori din mediu (vezi seciunea de integrare a cunotinelor: recrutarea celulelor din torentul sangvin). Superfamilia imunoglobulinelor (imunoglobulin-like) Moleculele de adeziune din aceast clas au o structur imunoglobulin-like prin expresia extracelular a unor domenii repetitive de tip imunoglobulinic. Sunt clasificate n trei subfamilii: ICAM (intercellular adhesion molecule), VCAM (vascular cell adhesion molecule) i PECAM (platelet-endothelial cell adhesion molecule). Moleculele de adeziune din aceast clas intervin n legarea intercelular, mai ales n interaciunea leucocit-endoteliu. Prin cuplarea lor cu liganzii de selecie (integrine) intervin n legarea leucocitar i prin aceasta n controlul infiltratului inflamator local. Expresia lor pe suprafaa celular este constitutiv sau indus de citokine. Caderinele Caderinele sunt formate dintr-un singur lan polipeptidic i sunt exprimate constitutiv pe suprafaa celulelor. Au rol n legarea intercelular prin aderarea unora de altele, pe celulele adiacente, printr-un mecanism calciu-dependent. Prin funcia lor asigur integritatea epiteliilor. Caderinele sunt clasificate n patru subfamilii: E-caderine (pe epitelii), V-caderine (pe endoteliu), P-caderine (placentare), N-caderine (n sistemului nervos central i ochi). adresine vasculare Sunt glicoproteine exprimate pe suprafaa celulelor endoteliale i intervin n homing-ul limfocitar, respectiv n direcionarea limfocitelor spre ganglionii limfatici i esuturile extraganglionare. Carbohidraii Reprezint liganzii specifici pentru selectine i nu constituie o clas distinct de molecule de adeziune. 13. 1. 2. Clasificarea funcional a moleculelor de adeziune

13. 1. 2. 1. Moleculele accesorii asociate cu TCR molecula CD4 Aceast molecul este exprimat pe suprafaa a 2/3 din LT mature circulante, definind subsetul de LT CD4+. Molecula CD4 este prezent i pe suprafaa celulelor dendritice cutanate i pe 173

monocitele/macrofagele activate. Este o molecul de 55-67 kDa, cu o parte extracelular compus din 4 domenii din superfamilia Ig, care recunoate o parte constant situat la nivelul domeniului 2 a moleculei HLA II. molecula CD8 Aceast molecul este exprimat pe suprafaa a 1/3 din LT mature circulante. Definete subsetul de LT cu activitate citotoxic i unele celule NK (n proporie mai mic) (Figura nr. 2). Molecula CD8 este homodimeric (CD8a/CD8a) sau heterodimeric (CD8a/CD8b). Rolul su primordial este s asigure interaciunea cu o parte monomorf a moleculei HLA I, pentru recunoaterea domeniului a3 al acestei molecule. Molecula CD8, ca i molecula CD4, este asociat cu tirozinkinaza. NB. Pentru mai multe informaii despre apoptoz, vezi capitolul Toleran Imunologic. 13. 1. 2. 2. Moleculele de adeziune necesare costimulrii ntre celulele prezentatoare de antigen i limfocitele T n permanen, ntre APC i LT se stabilesc cupluri de adeziune intercelular. Este nevoie de prezena APC dar i de o colaborare bidirecional (crosstalk) ntre APC i LT (trebuie s existe o dubl activare a celor dou tipuri de celule, n sens anterograd i retrograd), ntruct n lipsa acestora, limfocitul T nu este capabil s capteze i cu att mai mult, s prelucreze Ag native T-dependente (Figura nr. 3). Cuplurile de adeziune stabilesc un efect de fermoar ntre membrana APC i LT, legtura avnd loc nainte ca TCR s vin n contact cu epitopul (cuplul se formeaz chiar dac APC prezint un epitop pentru care LT nu are receptori specifici). Se descriu trei cupluri: Cuplul B7-CD28 Molecula B7 se exprim pe suprafaa majoritii APC (celule dendritice n repaus, macrofage activate i LB activate). Dei este absent pe macrofagele i LB n repaus, n urma costimulrii acestora, molecula B7 se exprim pe suprafaa lor, pentru a asigura o cooperare celular pozitiv. Molecula CD28, care recunoate receptorul B7, este prezent pe toate LT, cu excepia LT supresoare i permite costimularea ntre APC i LT. Rezultatul este transcripia unor factori antiapoptotici precum Bcl-x i IL-2. Cuplul B7-CTLA-4 (CD80) Molecula CTLA-4 nu este exprimat dect de LT CD4+ sau T CD8+, ntr-o proporie mai mic dect molecula CD28 dar cu o afinitate de 20 de ori mai mare pentru molecula B7. Interaciunea cu APC poate induce inhibiie i chiar apoptoz. NB. CTLA-4 competiioneaz cu CD28 pentru legarea moleculei B7, exprimat pe membrana APC. Datorit efectelor discrepante activatoare/inhibitoare se pune problema nelegerii modului n care LT va traduce semnalul primit. 1). Dac APC este activat de prezena n mediu a citokinelor pro-inflamatorii (ex. IL2), va prezenta un numr mai mare de molecule B7, favoriznd legarea CD28, iar semnalul transmis va fi activator (Figura nr. 4).

174

2). n cazul n care APC este puin activat, va exprima pe membrana sa puine molecule B7. Acest fapt va oferi un avantaj de legare moleculelor cu afinitate mai mare, aa nct majoritatea moleculelor legate vor fi de tip CTLA-4 (CD80), iar semnalul transmis va fi inhibitor (Figura nr. 5). Raportul semnalului activator/inhibitor transmis de aceste cupluri moleculare este modulat de factorii de mediu i decide comportamentul ulterior al LT (vezi capitolul Toleran Imunologic pentru mai multe detalii). Cuplul CD40 i CD40L Molecula CD40 se exprim pe toate celulele prezentatoare de antigen n repaus - celule dendritice, LB i monocite/macrofage dar i pe progenitorii hematopoietici i celulele epiteliale. Molecula CD40L (L pentru ligand) nu se exprim dect pe LT activate CD4+ sau CD8+ i nu pe cele n repaus. Este de asemenea prezent pe bazofile i mastocite. Sindromul hiper-IgM, Xlinkat se caracterizeaz prin absena moleculei CD40L funcionale. Mecanismul prin care interaciunea CD40-CD40L stimuleaz rspunsul LT pare a fi reprezentat de intensificarea secreiei de IL-12 i creterea numrului de molecule B7 de pe membrana APC (APC licensing), ducnd la recrutarea mai multor celule prezentatoare de antigen i potenarea semnalului costimulator transmis de aceste celule. 13. 1. 2. 3. Moleculele de adeziune necesare costimulrii ntre celulele prezentatoare de antigen i limfocitele T helper sau limfocitele T citotoxice i int. Aceti liganzi cuprind urmtoarele dou cupluri: Cuplul LFA2 (CD2) i LFA3 (CD58) (LFA - leukocyte function - associated antigen) Molecula LFA2 (CD2) permite formarea rozetelor E (E pentru eritrocite) ntre LT umane i eritrocitele de oaie. Fenomenul se datoreaz prezenei LFA3 pe eritrocitele de oaie. Molecula LFA3 (CD58) are o distribuie larg, care cuprinde celulele endoteliale vasculare, fibroblatii, limfocitele i macrofagele. Cuplul LFA1 i ICAM 1, 2 i 3 Molecula LFA1 corespunde integrinei aL/2 (CD11a/CD18). Prezena sa este relativ difuz la nivelul diferitelor leucocite (neutrofile, monocite, LT, LB i LT de memorie). ICAM1 (CD54), ICAM2 i ICAM3 sunt puternic exprimate la nivelul LT citotoxice i permit activarea lor. ICAM1 se gsete pe neutrofile n repaus, celule endoteliale, monocito/macrofage i LB activate. Aceste dou cupluri de adeziune permit recunoaterea i interaciunea ntre LT CD4+ i APC sau ntre LT CD8+ i celula int, proces completat de specificitatea TCR. Conexiunea constituit ntre LT CD4+ i APC a fost numit sinaps imunologic, subliniind transferul informaional implicat n recunoaterea epitopului exprimat pe moleculele MHC II de ctre TCR (Figura nr. 6).

13. 2. Citokinele (Interleukinele)

175

Citokinele sunt substane proteice, solubile, cu greutate molecular mic, 8-70 kDa. cel mai frecvent sunt sintetizate de ctre celule dup activare prealabil, acionnd ca mediatori asupra altor celule sau asupra lor nsi, n cantiti foarte mici, de ordinul pico sau nanogramelor. n momentul de fa au fost identificate peste 100 de molecule diferite de citokine. O parte dintre citokine au n special efecte chemotactice i din acest motiv au fost numite chemokine. Termenii de limfokine (substane sintetizate de limfocite) sau de monokine (provenind din monocite) nu se mai folosesc deoarece citokinele sunt sintetizate de o gam mult mai larg de celule. Termenul de interleukine, care indic o aciune ntre dou leucocite, a persistat i continu s persiste n denumirea prescurtat, de la IL-1 la IL-35. Termenul de citokine pare s fie cel mai adecvat. n unele cazuri, denumirea provine de la una din activitile care au permis descoperirea citokinei: TNF (tumor necrosis factor), IFN (interferon), GM-CSF (granulocyte/monocyte-colony stimulating factor), G-CSF (granulocyteCSF), M-CSF (monocyte-CSF), TGF (transforming growth factor). n afara sistemului imun i hematopoietic au fost descoperii i ali factori de cretere: NGF (nerve growth factor), FGF (fibroblast growth factor), EGF (epithelial growth factor) etc. Citokinele acioneaz datorit prezenei receptorilor specifici, desemnai prin denumirea lor englez: IL-1R, IL-2R, TNF-R etc. Ei sunt prezeni uneori pe aceeai celul care a sintetizat citokina (efect autocrin) sau pe alte celule (efect exocrin). O clasificare atotcuprinztoare a citokinelor este foarte dificil, din punct de vedere funcional, pentru motivele prezentate (i care reprezint un punct din cutia Pandorei la care se face uneori referire, atunci cnd sunt luate n discuie aceste structuri). Din punct de vedere didactic (i funcional), vom ncerca s prezentm n continuare o grupare a celor mai cunoscute dintre citokine.

13. 2. 1. Citokine pro-inflamatorii n cadrul procesului infecios, diferitele microorganisme care au sau dobndesc prin variabilitate un efect de agresiune fa de organismul gazd, antreneaz un rspuns la nivelul endoteliului vascular; una dintre primele reacii este reprezentat de mobilizarea leucocitelor polimorfonucleare neutrofile (PMN). n aceast etap intervin i o serie de citokine. TNF- i TNF- TNF- este produs de monocite / macrofage dar i de diverse alte celule (limfocite T, limfocite B, celule NK, fibroblaste, mastocite, bazofile, celule gliale etc), ca reacie la contactul cu diferite bacterii sau lipopolizaharidele din peretele germenilor Gram-negativi. Sursa cea mai important pentru TNF- rmne ns sistemul monocito-macrofagic. TNF- favorizeaz expresia moleculelor de adeziune la nivelul endoteliului vascular i al monocitelor; atrage ctre sediul procesului infecios alte monocite i leucocitele PMN. Are o activitate anti-viral, anti-parazitar i anti-tumoral. Stimuleaz lipoliza, glicoliza muscular i reabsorbia osoas prin care poate antrena apariia caexiei (TNF a fost numit iniial caexin). Induce formarea altor mediatori ai inflamaiei (leucotriene, PAF). Formarea sa este la rndul su indus de IFN, IL-1, factori de cretere sintetizai de monocit, endotoxinele bacteriilor Gram-negative, diferite virusuri, bacterii, unele componente ale sistemului complement, leucotriene i prostaglandine. Eliberarea TNF- este inhibat de glucocorticoizi, 2-macroglobuline, 2-antitripsin etc. TNF- 176

este sintetizat de LT activate i celule NK i are aciuni identice cu TNF-, acionnd pe acelai tip de receptori. n momentul de fa este clasificat ntre limfotoxine (LT-). IL-1 i IL-6 Sunt dou citokine cu rol asemntor. Sunt produse de numeroase celule: monocite, macrofage, LT, LB, celule endoteliale vasculare, keratinocite (din piele), astrocite i celule gliale (din creier) etc. IL-1 se gsete sub dou forme: IL-1a fixat la membran i IL-1 secretat. Experimental a fost demonstrat c stimularea cu orice structur microbian a celulelor care n mod potenial sintetizeaz IL-1 va duce la sinteza acestor molecule (IL-1a i IL-1). Ele sunt codificate de gene diferite dar recunosc aceeai receptori: primul receptor IL-1R1 induce transducia informaiei la nivel celular, n timp ce IL-1R2 nu induce un semnal celular. IL-1 are funcie imunologic, activnd la nivel superior LTh, care se vor divide mitotic i se vor diferenia n diverse clase. IL 1, eliberat n spaiul extracelular i n snge, exercit o puternic aciune proinflamatorie. Celulele care sintetizeaz IL-1 produc cteva ore mai trziu un antagonist al receptorului de IL-1, numit IL-1Ra, care face ca aciunea IL-1 s fie tranzitorie. IL-1 induce creterea expresiei moleculelor de adeziune; activeaz limfocitele T i B; crete sinteza proteinelor de faz acut la nivel hepatic; crete catabolismul celulelor musculare i al osteoclastelor (rezorbie osoas); activeaz sistemul nervos central cu febr, anorexie i insomnie. Fiind i prima interleukin numit ca atare, IL-1 a fost considerat iniial drept o molecul piretogen. Inocularea de IL-1 la subieci umani conduce la apariia febrei i frisonului. Concentraia de IL-1 din plasm poate s creasc i n condiii fiziologice (ex. n stres nepatologic, exces de vitamin A, n timpul menstruaiei). IL-6 are o aciune att asupra sistemului imun ct i asupra unor celule care nu aparin acestuia, asemntoare cu aceea a Il-1, cu o singur diferen: ea acioneaz mai ales pe maturaia terminal a LB n plasmocite i pe diferenierea LT citotoxice. Ca i IL-1, produce proteoliz endogen, induce sinteza proteinelor inflamatorii la nivel hepatic (fibrinogen, haptoglobin, 1antitripsin, protein C reactiv etc) i activeaz sistemul nervos central conducnd la apariia febrei, anorexiei, somnolenei etc. IL-6 induce sinteza de imunoglobuline; are i rol n maturarea celulelor pe linia megakariocitar. Sinteza IL-6 este stimulat de IL-1. Limfotoxinele Limfotoxina (LTx) a fost identificat n urma efectului citotoxic exercitat de limfocitele activate, ulterior a fost sintetizat i caracterizat, dar s-a dovedit c nu exist un singur factor de acest tip, ci o serie de substane care ar putea fi grupate ntr-o superfamilie. Iniial LT-, o limfotoxin solubil, a fost definit drept factor de necroz tumoral (TNF-). Dintre numeroii membri ai superfamiliei limfotoxinelor menionm LT- i LT-, sintetizate n special de LT i LB activate, dar i de ctre celulele NK sau celule LAK (lymphokine activated killer cells). Au rol n etapele de iniiere a inflamaiei i se pare c au un rol n realizarea unei protecii fa de agresiunea microbian. IFN-g Dintre efectele pro-inflamatorii ale IFN- amintim activarea macrofagelor (acest interferon este probabil cea mai important substan care produce trecerea macrofagelor de la o stare n ateptare la starea activ, bactericid) i astfel intervine n fazele iniiale ale inflamaiei dar i n 177

diferenierea clonelor de limfocite care reacioneaz fa de structurile bacteriene agresoare (Figura nr. 7). Alte efecte vor fi prezentate n urmtoarele subpuncte. IL-10 Acioneaz att asupra celulelor hematopoietice ct i asupra altor celule. Dac iniial s-a considerat c are efecte pro-inflamatorii, n momentul de fa se cunoate faptul c, prin efectele inhibitorii asupra monocitelor, neutrofilelor, celulelor dendritice, este de fapt o interleukin cu efect anti-inflamator. A fost numit i factor de inhibare al macrofagelor. IL-11 Sinteza IL-11 poate avea loc la nivelul fibroblastelor, condrocitelor, sinoviocitelor, keratinocitelor, celulelor endoteliale, celulelor epiteliale etc. Administrarea de IL-11 stimuleaz sinteza unor reactani de faz acut, la fel ca i IL-6. Totui, efectul esenial al IL-11 se adreseaz creterii trombocitare. Are i efecte anti-inflamatorii la nivelul adipocitelor i osteoclastelor. Relativ recent, a fost avizat utilizarea IL-11 n tratamentul asociat chimioterapiei din cancer, pentru a preveni apariia unei trombocitopenii severe la pacienii care primesc medicaie citotoxic, anti-tumoral. IL-12 Cunoscut drept o substan care induce sinteza de IFN-, IL-12 are i alte efecte de stimulare a rspunsului inflamator al gazdei, n urma unui proces infecios. Sursa cea mai important de IL12 este reprezentat de celulele dendritice. IL-16 Iniial a fost considerat o chemokin pentru LT Helper (CD4 +), dar poate exercita astfel de activiti i fa de alte celule implicate n procesul infecios i n inflamaie. Sursa principal de IL-16 este reprezentat de LT CD8+. IL-17 (A, B, C, F) Au efecte proinflamatorii i de stimulare a hematopoiezei. IL-18 A fost considerat drept o molecul care induce sinteza de IFN-. Ulterior s-a dovedit c singur, nu duce la o stimulare eficient, dar n asociere cu IL-12, efectul de stimulare al sintezei de IFN- demonstreaz sinergism. IL-18 este sintetizat n special de macrofagele activate i de ctre celulele dendritice, dar exist i alte celule productoare de IL-18 (monocite, keratinocite, celule epiteliale intestinale etc). Are efecte pro-inflamatorii, efecte n procesul infecios declanat de o serie de bacterii (ex. Listeria spp.), parazii (ex. Cryptococcus neoformans) sau virusuri (ex. virusul gripal), efecte anti-tumorale i intervine n patogenia unor boli n care exist inflamaie cronic sau n boli autoimune. IL-22 Este o citokin nrudit cu IL-10, dar cu puternice proprieti pro-inflamatorii. ntr-un studiu pe celule pulmonare, s-a demonstrat un rspuns semnificativ IL-22 mARN la 6 ore de la debutul infeciei cu Klebsiella pneumoniae. Rspunsul indus n celule cultivate n prezena aceastei 178

citokine, este de exprimare a moleculelor defensive n celulele epiteliale traheale. Unul din efectele induse de aceast citokin este exprimarea moleculei lipocalin-2, cu rol n sechestrarea fierului. ntr-un model de infecie colonic s-a demonstrat c lipsa IL-22 duce la instabiltatea barierei epiteliale i diseminare bacterian. IL-23 Are efecte asemntoare cu IL-12, exercitate n combinaie cu IL-12. Este sintetizat mai ales de celulele dendritice. HMGB1 (high mobility group box chromosomal protein 1) Iniial a fost caracterizat ca o protein non-histonic cu rol n arhitectura cromozomilor. S-a demonstrat c aceast citokin cu totul particular are rol pro-inflamator, fiind eliberat din celulele necrotice (i doar n mic msur de cele apoptotice), jucnd rol de DAMP (Damage Associated Molecular Pattern) dar i secretat activ de macrofage stimulate. Receptorul membranar specific, numit RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-products) mediaz efectele sale. Aceast protein are un rol patogenic important n sepsis i medierea efectelor de faz trzie ale LPZ-ului. Astfel, s-a demonstrat experimental, la animale, c mortalitatea n sepsis a fost redus prin administrarea pasiv de anticorpi anti-HMGB1.

13. 2. 2. Citokine cu aciune anti-viral i anti-proliferativ n aceast categorie sunt cuprinse mai multe interleukine. Spre exemplu interferonul a i . IFN-a este produs de monocite i celulele hematopoietice iar IFN- este produs de alte celule de tipul fibroblatilor i al celulelor endoteliale. Cele dou citokine prezint aciune anti-viral i anti-proliferativ; stimuleaz celulele NK; cresc expresia moleculelor MHC I; activeaz producia de IL-2 de ctre monocite/macrofage i celule dendritice; induc sinteza de IFN-g, cu aciune anti-viral i antiproliferativ. IL-2, cu efect autocrin i paracrin, a fost prima interleukin utilizat n terapia cancerului (administrarea pe cale intravenoas a fost asociat, din nefericire, cu efecte toxice severe; datorit acestor efecte, dar i descoperirii unor efecte similare prin administrarea altor molecule n alte situaii clinice, n momentul de fa a intrat ntre noiunile medicale clasice i definirea sindromului de toxicitate al citokinelor). Mai recent, se ncearc administrarea IL-2 la pacienii cu infecie HIV / SIDA, n sperana c efectele proliferative asupra LT CD4+ vor mbunti istoria natural a bolii. O analiz recent a datelor din dou mari studii clinice a artat un efect neutru al terapiei. (1) Prin potenarea activitii citotoxice a LT i a celulelor LAK, IL-12 ar putea avea utilitate clinic n inhibarea procesului infecios determinat de virusuri dar i n diferite forme de neoplazii. IL-18 are sau induce efecte mpotriva virusului Epstein-Barr, virusului gripal, virusului herpes simplex etc dar are i efecte anti-tumorale.

179

13. 2. 3. Citokine activatoare ale rspunsului imun celular Citokinele cu rol n rspunsul imun celular au ca surs de provenien limfocitele Th1. n aceast categorie sunt incluse urmtoarele citokine. IL-2 este produs n special de LT CD4+ de tip Th0 i Th1 (cu rol n RIP de tip celular) activate i ntr-o mai mic msur de celulele NK i de celulele dendritice. i LT Th2 (cu rol n RIP de tip umoral) pot sintetiza IL-2. IL-2 acioneaz asupra diferitelor celule cu rol n imunitate [asupra limfocitelor T acioneaz printr-un mecanism autocrin, antrennd proliferarea i activarea spre subsetul Th1 dar i Th2; transform celulele Nk n celule LAK (lymphokine activated killer cells); antreneaz proliferarea limfocitelor B]. Acioneaz sinergic cu IL-12 i IFN stimulnd activitatea citotoxic a celulelor NK. IL-2 a fost prima dintre interleukine care a fost caracterizat pn la nivel structural. Este o interleukin cu 133 aminoacizi, o greutate molecular de 15,5 kDa; gena care codific sinteza de IL-2 se gsete pe cromozomul 4. IFN-g este produs de limfocitele Th1; sursa esenial pentru aceast interleukin este reprezentat de celulele NK. Rolul principal al IFN-g este activarea macrofagelor, cu producerea speciilor reactive ale oxigenului i NO, cu efect bactericid asupra microorganismelor intracelulare. Prin aciunea sa anti-Th2, reduce rspunsul imun umoral. IFN- controleaz funcii imune implicate n aprarea antibacterian, antiviral i antiparazitar.

13. 2. 4. Citokine activatoare ale rspunsului imun umoral Aceste citokine sintetizate de ex. de ctre limfocitele Th2 i unele mastocite, orienteaz rspunsul imun umoral spre diferitele clase i subclase de imunoglobuline. IL-4 acioneaz n etapa iniial a rspunsului imun umoral, permind trecerea LB din stadiul G0 la stadiul G1. Stimuleaz producerea i maturarea intramedular a LB. Aciunea sa este ntrit de IL-1. De asemenea, stimuleaz producerea de IgG, specific RIU secundar i blocheaz producerea de IgM, specific RIU primar. Mecanismul are loc la nivel de genom i se numete izotipic switch (comutare izotipic) (Figura nr. 8). Citokina este totodat un factor de cretere pentru bazofile i mastocite. Are de asemenea rol n hematopoiez. Acioneaz sinergic cu IL-3 n cursul diferenierii mastocitelor i limfocitelor. Dac exist o sintez crescut peste normal a IL-4 de ctre LT Th2, se nregistreaz o cretere semnificativ a sintezei de IgE iar din punct de vedere clinic apariia manifestrilor hipersensibiliti de tip umoral (tip I). IL-5 stimuleaz RIU la nivelul mucoaselor. Intr n aciune mai trziu, alturi de IL-2, permind multiplicarea LB. IL-5 are rol de factor de cretere pentru leucocitele polimorfonucleare eozinofile dar are efecte stimulatoare i asupra bazofilelor. La fel ca i IL -4 i IL-5, are rol hematopoietic. Stimuleaz sinteza de Ig A de ctre limfocitele B. Datorit efectelor menionate, un tratament novator al afeciunilor datorate hipersensibilitii de tip I ar putea s se adreseze tocmai IL-5 (medicamente anti- alergice care s aib drept int molecula IL-5). Printre numeroasele sale activiti, IL-6 este o citokin proinflamatorie, cu aciune tardiv n procesul de maturaie a imunoblastelor n plasmocite.

180

 IL-10 induce diferenierea iniial a liniei de celule B. IL-10 inhib citokinele proinflamatorii i sinteza de IFN-g, comportndu-se ca o citokin reglatorie negativ pe subsetul Th1. Are de asemenea i rol stimulator, n cazul maturrii mastocitelor, n cazul aprrii antivirale i antitumorale, precum i rol chemoatractant pentru limfocitele T (CD8+). IL-13 este produs de LT Th2 activate (dar exist i clone de LT Th1, Th0 sau LT CD8+ care pot sintetiza aceast molecul). IL-13 inhib sinteza citokinelor proinflamatorii i, ca i IL-4, stimuleaz sinteza IgE.

13. 2. 5. Chemokine Aceste molecule de adeziune cuprind aproximativ 50 de membri divizai n mai multe familii (CC, CXC, XC, CX3C). Denumirea familiilor i moleculelor aferente a fost standardizat n raport cu structura chimic, pe baza numrului i poziionrii gruprilor de cistein. Numele receptorilor chemokinelor (citokine cu rol n chemotaxie) se stabilete pornind de la grupul de litere prezentat, la care se adaug litera R i un numr, n timp ce liganzii conin litera L i un numr. Ele prezint o activitate chemotactic fa de limfocite, monocite, eozinofile etc. Neutrofilele, de exemplu, exprim receptori CXCR1 i CXCR2, n timp ce eozinofilele, bazofilele i monocitele exprim receptori CCR1, CCR2, CCR3 i CCR5. Aceste structuri exist n permanen pe suprafaa celulelor normale circulante i pot fi detectate prin metode de laborator. Majoritatea liganzilor sunt molecule solubile, ce se secret n torentul circulator, n timp ce unii liganzi (CX3CL1, CXCL16) conin o poriune transmembranar, permind ancorarea celulelor de endoteliul vascular n condiii de flux fiziologic. Prin intermediul acestor receptori, celulele menionate vor reaciona la stimulul primit de la celulele endoteliale sau de la alte celule agresate de toxine bacteriene; un alt stimul este reprezentat de citokinele pro-inflamatorii (ex. IL-1, TNF, IFN etc). Trebuie menionat c studiile arat tot mai des rolul chemokinele n procese patologice, precum ateroscleroz, scleroza multipl etc.

13. 2. 6. Hematopoietine Hematopoieza este controlat de ctre un sistem fiziologic autoreglabil, prin care se menine un compartiment de celule stem i un compartiment de difereniere pentru toate liniile sanguine. Sistemul necesit un echilibru ntre sinteza osoas i meninerea unui spaiu hematopoietic medular graie echilibrului ntre osteoblaste i osteoclaste. n procesul de proliferare i difereniere a celulelor stem intervin numeroase citokine: SCF (stem cell factor) provine n principal din celulele stromale ale mduvei osoase. SCF este produs att n form solubil ct i ntr-o form legat de membrana citoplasmatic. IL-3 sau multi-CSF (multi-colony stimulating factor) este un polipeptid cu greutatea molecular 20-30 kDa, cu 133 aminoacizi. Sinteza IL-3 este apanajul LT activate n urma stimulrii antigenice dar i al mastocitelor sau eozinofilelor. Gena care codific pentru sinteza IL 181

3 se afl pe cromozomul 5. Rolul su este de-a stimula proliferarea i diferenierea celulelor stem spre diferitele linii. IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-11 i IL-15: - IL-4 stimuleaz diferenierea i creterea bazofilelor i mastocitelor; - IL-5 are acelai rol fa de eozinofile; - IL-7 este un factor de cretere produs de celulele stromale medulare i timice care induce proliferarea L pre T i pre B; - IL-10 favorizeaz dezvoltarea megacariocitelor; - IL-11 este un factor de cretere pentru linia trombocitar, dar are i efect pro-inflamator; - Il-15 permite diferenierea celulelor stem spre NK. Factorii de cretere ai liniilor hematopoietice: factorii de cretere stimuleaz celulele hematopoietice deja difereniate, respectiv progenitorii, permind creterea i evoluia lor spre stadiile ulterioare, pn la maturizare. Se cunosc GM-CSF (granulocyte-macrophage colonystimulating factor) pentru linia monoblastic i mieloblastic, G-CSF (granulocyte CSF) pentru linia mieloblastic, M-CSF (macrophage GSF) pentru linia monoblastic, alturi de interleukinele menionate anterior, n special IL-3.

13. 3. Mesagerii secunzi Stimularea celular debuteaz prin interaciunea unui numr mare de receptori membranari celulari. Alturi de moleculele de adeziune i receptorii de citokine, mai trebuie amintii receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (FcR) i receptorii pentru complement (CR). Acetia au o importan sporit n recunoaterea patogenilor i reprezint startul procesului de procesare antigenic n cadrul rspunsului imun nscut. Transducia semnalului primit necesit intervenia mesagerilor secunzi, care transmit informaia printr-o reacie n cascad, pn la nivelul membranei celulare, al organitelor intracitoplasmatice sau al nucleului. n acest ultim caz, este vorba de o aciune asupra unor gene, care va antrena sinteza unor proteine sau activarea ciclului celular (modificri transcripionale). ntregul mecanism este complex i necesit interaciunea ntre partea intracitoplasmatic a receptorilor membranari i mesagerii secunzi. n unele cazuri, molecula receptor membranar care primete semnalul extracelular comunic direct cu mesagerii secunzi printr-un motiv intracelular (de exemplu, motivul activator ITAM). n alte cazuri, molecula receptor cu o parte intracelular limitat la civa aminoacizi, este asociat la alte molecule, fomnd adevrate domenii de amplificare a semnalului (molecular scaffolds). Partea intracelular astfel dezvoltat poart motivul de interaciune cu mesagerul secund. n acest sens pot fi citate diverse exemple: complexul CD3 al TCR, moleculele Iga i Ig ale BCR, moleculele gc ale receptorilor membranari pentru interleukine. (Figurile nr. 9-10)

Recrutarea leucocitelor circulante Molecule de adeziune i Citokine 182

Primii mediatori ai inflamaiei sunt molecule preformate, cu caracter nespecific ce apar ca rezultat al agresiunii tisulare (reflex axonal epinefrin, activarea mastocitelor rezidente histamin, sau ca urmare a activrii cascadei coagulrii trombin). Aceti mediatori sunt responsabili de modificrile reologice specifice inflamaiei i de recrutarea leucocitar prin activarea celulelor endotelialiale adiacente. Consecinele sunt permeabilizarea patului vascular i expunerea pe versantul circulator a moleculelor de adeziune. P- i E-selectinele sunt primele expuse, avnd rol n marginalizarea leucocitelor din torentul sangvin (Figura nr. 11). Un antigen glicozilat de pe leucocite joac rol de ligand (Sialyl-Lewis X) pentru cele dou selectine, ducnd la contactul celulelor cu endoteliul, cu rol n ncetinirea leucocitelor rolling leucocitar (adeziunea este insuficient de puternic pentru a constitui o legtur ferm). Citokinele (IL1 i TNFa) duc la exprimarea pe endoteliul activat a moleculelor immunoglobin like (ICAM-1). Acestea sunt liganzi pentru integrine aflate pe suprafaa leucocitelor (LFA-1 i Mac-1). Chemokine solubile din focarul inflamator (ex: IL-8) leag receptori specifici de pe membrana leucocitar (IL-8R). Ca urmare a semnalizrii intracelulare determinat de citokine, se induc schimbri conformaionale n structura integrinelor (semnalizare inside-out). Integrinele trec astfel de la stadiul conformaional cu afinitate redus la cel cu afinitate crescut pentru ligandul lor. Rolul integrinelor este de a stabili o adeziunea ferm a leucocitelor la endoteliu. Urmeaz reorganizarea scheletului celular i diapedeza leucocitar mediat tot de integrine (semnalizare outside-in). Integrinele mediaz i ataarea leucocitar la componentele matricei extracelulare, conducnd la exocitoza enzimelor de clivare a matricei pentru a permite naintarea leucocitelor spre focarul de inflamaie. Procesul de dirijare a migrrii leucocitare se bazeaz pe emiterea de prelungiri membranare n direcia dictat de gradientul de concentraie a mediatorilor chemotactici.

13. 4. Povestire adevrat Povestirea adevrat este preluat din literaur i subliniaz mai multe principii care merit nsuite nc din anul al 2-lea de studenie. Introducerea n practica medical curent a unui nou medicament reprezint concomitent un maraton (ntruct dureaz n jur de 15 ani) ct i un concurs (ntre companii farmaceutice, echipe de cercetare). Exist ns un proces riguros de testare ce trebuie urmat cu strictee. Studiile sunt coordonate astfel nct se efectueaz studii de siguran i de eficacitate, pe modele celulare, apoi animale de laborator, iar abia n final pe oameni (voluntari). De multe ori ns, rezultatele foarte promitoare ale studiilor preclinice sunt drmate de ineficiena noilor substane n clinic. Aceste date conflictuale trebuie foarte bine investigate i trebuie efectuat un bilan riguros care s aib drept scop binele pacienilor. Toate aceste faze trebuie foarte bine documentate i supervizate. Prima etap a studiilor clinice, o reprezint validarea siguranei de administrare la tineri voluntari sntoi. Asemntor terapiilor cu anticorpi anti-CTLA4 sau cu IL-2 pentru activarea limfocitelor T, investigaiile preclinice au artat un potenial beneficiu n folosirea anticorpilor direcionai antiCD28, cu aciune de superagoniti i rol de a activa i expansiona numrul de limfocite T in vivo, 183

independent de stimularea receptorului TCR. n modelul murin, s-a demonstrat c un anticorp cu aceeai specificitate a expansionat preferenial sectorul CD4+CD25+, de limfocite reglatoare, avnd un profil bun de siguran. Noul anticorp, numit TGN1412, fost administrat la 6 voluntari tineri, sntoi. n decursul a 90 de minute, voluntarii au suferit evenimente adverse sistemice, polimorfe, ce au fost atribuite unei descrcri masive de citokine (furtun citokinic/ cytokine storm). Fenomene asemntoare au fost identificate ntr-un numr impresionant de patologii, existnd n continuare destul de multe necunoscute. Toi pacienii au prezentat rspuns inflamator sistemic caracterizat prin eritem, hipertermie, scdere a tensiunii sistolice cu cel puin 20 mmHg i tahicardie compensatorie. Majoritatea pacieni au dezvoltat o suferin pulmonar nsoit de permeabilizare vascular i infiltrare a spaiilor alveolare cu lichid, ducnd la suferin sever. Toi pacienii au necesitat tratament suportiv cu intubaie, tratament de stabilizare hemodinamic i dializ, iar tratamentul specific, imunomodulator, a constat n administrarea de anticorpi anti-IL2 i corticoterapie. Conform protocolului de studiu, s-au monitorizat limfocitele i citokinele circulante. S-a constatat o cretere dramatic a TNF- la o or de la infuzia anticorpului ct i a IL-2, IL-4, IL-10 i IFN- n decurs de 4 ore. Pacienii cu evoluia cea mai grav au avut nivele ridicate de citokine circulante pentru o durat mai lung de timp. Toi voluntarii au supravieuit sindromului de rspuns inflamator sistemic (Systemic Inflammatory Response Syndrome - SIRS). Analiza acestor reacii precum i publicarea rezultatelor a contribuit la o mai buna nelegere a patofiziologiei furtunii citokinice. Mai mult, urmrirea acestor fenomene, ca evoluie natural i sub tratament a contribuit la nelegerea tratamentului. Merit admirat faptul c o poveste de eec pentru o molecul candidat a fost publicat i a contribuit, n felul acesta, la viitorul succes n domeniu.

13. 5. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. 1. Charo IF, Ransohoff RM, 2006, The Many Roles of Chemokines and Chemokine Receptors in Inflammation, N Engl J Med., 354, 610-621 2. Andersson U, Erlandsson-Harris H,Yang H, Tracey KJ, 2002, HMGB1 as a DNA-binding cytokine, Journal of Leukocyte Biology, 72, 1084-1091 3. Cai B, Deitch EA, Ulloa L, 2010, Novel Insights for Systemic Inflammation in Sepsis and Hemorrhage, Mediators Inflamm., Article ID 642462. 4. Lee WL, Slutsky AS, 2010, Sepsis and Endothelial Permeability, N Engl J Med., 363, 689-691 5. Suntharalingam G, Meghan RP, Ward S, Brett SJ et al., 2006, Cytokine Storm in a Phase 1 Trial of the Anti-CD28 Monoclonal Antibody TGN1412., N Engl J Med., 355, 1018-1028.

13. 6. Verificai-v cunotinele La ntrebrile urmtoare, alegei rspunsul corect. 184

1. a. b. c. d. 2. a. b. c. d. 3. 4. 5. a. b. c. d. e.

Rolling-ul leucocitar este mediat de interaciunea: Receptorii pentru chemokine (CXCR) - Chemokine Selectine Antigen Lewis X Integrine Receptori de integrine Integrine Fibrin Inducerea comutrii izotipice IgM IgG este realizat de: TNF alfa IL-1 IL-4 HMGB-1 Descriei cuplurile moleculare componente ale sinapsei imunologice. Enumerati rolurile Interferonului Gamma. Au efect imunoinhibitor (rspuns multiplu): TLR IL-4 IL-10 CTLA-4 IL-13

Bibliografie 1. The INSIGHTESPRIT Study Group and SILCAAT Scientific Committee, Interleukin-2 Therapy in Patients with HIV Infection. N Engl J Med., 2009, 361(16), 1548-1559

14. Imunoglobulinele (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)

185

Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele exist n plasm, lichid interstiial i secreii i au capacitatea de a recunoate i de a se combina specific cu antigenul inductor al rspunsului imun. Lor li se adaug proteinele patologice cu aceeai structur dar fr activitate de anticorpi. De exemplu, n mielomul multiplu sau n macroglobulinemia Waldenstrm's a fost identificat proteina patologic Bence-Jones (poate fi identificat n snge sau n urin; este vorba de o sintez anormal de lanuri uoare; a fost descris de H. Bence Jones n 1847). Termenul de imunoglobuline (Ig) l nlocuiete pe cel de gama-globuline. Acest termen nu este corect, deoarece nu toi anticorpii migreaz electroforetic n regiunea gama. Toi anticorpii sunt imunoglobuline. Imunoglobulinele pot fi anticorpi, dar au i alte roluri. Denumirea de anticorp se pare c a fost dat pentru substanele mpotriva corpilor bacterieni, ceea ce nu este corect, deoarece exist anticorpi i fa de alte structuri (inclusiv mpotriva structurilor proprii, n bolile autoimune) sau chiar i n cazul bacteriilor, pot exista anticorpi diferii fa de structuri diferite ale aceleai bacterii (ex. anticorpi fa de cele peste 90 de tipuri capsulare ale Streptococcus pneumoniae). Imunoglobulinele sunt diferite de alte structuri proteice: - recunosc i reacioneaz specific cu structura antigenic din cauza creia au aprut; - au funcie de anticorp, dar dac sunt inoculate la un individ dintr-o specie diferit vor avea rolul de antigene pentru respectivul individ; - sunt singurele structuri proteice care sunt sintetizate dup un stimul antigenic; - pot activa sistemul complement etc. S-a reuit sinteza de anticorpi monoclonali himerizai, alctuii dintr-o parte de molecul uman i alta animal; fiind de izotip uman nu vor mai aprea ca i structuri antigenice i nu vor mai fi respini.

14. 1. Structura general Structura de baz a unei Ig monomer (ex. IgG1) cuprinde dou lanuri grele identice i dou lanuri uoare identice, legate ntre ele prin puni disulfurice: dou puni ntre cele dou lanuri grele (n cazul IgG1) i o singur punte ntre fiecare lan greu i uor. Aceast schem structural a fost identificat n urma mai multor experimente (reducere i alchilare, aciunea papainei, aciunea pepsinei). Pepsina poate de ex. s degradeze enzimatic o molecul de imunoglobulin, acionnd la nivelul aminoacidului Leucin din structura lanurilor grele. Duce astfel la apariia unui fragment cu greutate molecular destul de mare format la rndul su din 2 fragmente Fab unite [acest fragment poart numele de F(ab)2]. Fragmentele unei Ig sunt urmtoarele: - Fab: prima jumtate a lanului greu i ntregul lan uor, legate ntre ele printr-o punte disulfuric, obinute sub aciunea papainei, prin scindarea naintea regiunii balama, cu un singur situs de legare; - F(ab) 2: cele dou fragmente Fab i regiunea balama, care rezult dup aciunea pepsinei, constituie un fragment superior celor dou fragmente Fab i conine dou situsuri de legare; - Fc: jumtile terminale ale celor dou lanuri grele unite prin puni disulfurice la nivelul regiunii balama;

186

- pFc: cuprinde fragmentele peptidice rezultate dup aciunea pepsinei, cu ntregul domeniu CH3 situat dup aminoacidul 333 al lanului greu; - Fd: corespunde primei pri a lanului greu dup aciunea papainei, cu formarea fragmentului Fab, i dup reacia de reducere-alchilare, pentru a extrage lanul uor; - Fv: corespunde prilor variabile ale lanului greu i lanului uor (VH+VL). Pentru Ig, noiunea de domeniu se regsete la lanurile grele n 4 exemplare (IgG, IgA, IgD) sau 5 exemplare (IgM, IgE) i la lanurile uoare n 2 exemplare. Terminologia utilizat este urmtoarea: Lanurile grele: - VH - pentru fragmentul greu variabil (variable heavy), comun tuturor claselor i subclaselor cu aceeai specificitate. - CH 1, CH 2, CH 3 i CH 4, - pentru fragmentul greu constant (constant heavy), care conine diferenele pentru fiecare clas i subclas; de exemplu pentru IgG1 exist fragmentele Cg11 , Cg12 i Cg13 i pentru IgM, fragmentele Cm1, Cm2, Cm3,Cm4. Lanurile uoare: - VL pentru fragmentul uor variabil (variable light), diferit pentru lanurile kappa i lambda: Vk i Vl. - CL pentru fragmentul uor constant (constant light), cu un singur lan Ck i patru Cl funcionale. Domeniile variabile VL i VH formeaz locul unde anticorpul se cupleaz cu determinantul antigenic (epitop). Faa interioar a situsului anticorpului (situs combinativ) vine n contact direct cu epitopul i se numete paratop. Faa exterioar a situsului combinativ se numete idiotip.

14. 2. Structura particular a fiecrei clase sau subclase de Ig IgG IgG (prototipul de Ac) reprezint circa 75% din totalul imunoglobulinelor din ser i are o distribuie aproximativ egal n vase i esuturi. Exist patru subclase de IgG (molecule cu termorezisten mai mare), cu structur asemntoare, o mas molecular de 146.000 (excepie fcnd IgG3 cu o mas de 170.000), 3 domenii constante pentru lanul greu i un procentaj de hidrai de carbon de 2-3 %. Concentraia sanguin a IgG este de ordinul 11 g/l, din care IgG1 - 66 %, IgG2 - 23 %, IgG3 - 7% i IgG4 - 4 %. IgG are receptori pentru sistemul complement. Poate trece prin bariera hemato-placentar (dup a 20-a sptmn de via intra uterin). Apare n RI secundar. IgM Sunt anticorpi aglutinani i reprezint cei mai eficace activatori ai complementului. Ac IgM sunt caracteristici pentru RI primar, producia lor fiind stimulat de ctre IL-4, care nu activeaz mecanismul de switch izotipic. IgM membranar (IgMm) este exprimat pe suprafaa LB. Are structur monomeric i se termin prin aminoacizii 556-597, cuprinznd n mod particular o parte intramembranar hidrofob i 3 aminoacizi intracitoplasmatici. Fiecare molecul de IgMm este asociat cu 2 187

lanuri Iga i 2 lanuri Ig. Ansamblul formeaz BCR (B cell receptor), comparabil cu TCR-ul limfocitului T. IgM seric (IgMs) cuprinde un lan greu cu un domeniu variabil VH, 4 domenii constante Cm1 Cm4 i un procent ridicat de hidrai de carbon (12 %). Molecula nsi este un pentamer cu un prim inel al punii disulfurice la sfritul lui Cm3, un al doilea la terminarea lui Cm4 i un lan J (joining chain). Masa molecular este foarte mare (circa 970.000 D), cu un coeficient de sedimentare de 19 S. Concentraia seric este de 1,2 g / l. Reprezint circa 5-10% din totalul imunoglobulinelor din ser. Are 10 situsuri combinative dintre care numai 5 sunt funcionale. IgM are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-placentar. Apare n RI primar. IgA IgA seric. Sub forma IgA1 (80%) i IgA2 (20%), ea se gsete ca monomer (GM 160.000, 7 S) sau ca dimer sau trimer, ultimele dou forme cu lanul J de jonciune. IgA2 are o structur original. Lanurile uoare unite ntre ele printr-o punte disulfuric nu sunt legate printr-o legtur covalent cu lanurile grele. Concentraia sanguin a IgA este de 2,4 g / l. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-placentar. Nu particip la aglutinarea, precipitarea sau liza antigenelor corpusculare. Are activitate bactericid mai mare dect IgG i dect IgM. IgA exocrin sau secretorie cuprinde dou subclase IgA1 i IgA2. Masa molecular este de 400.000, cu coeficient de sedimentare de 11 S. Molecula cuprinde dou uniti de IgA reunite printr-un lan J. Acest ansamblu este nconjurat de unitatea secretorie sintetizat de celulele epiteliale ale tubului digestiv. Au rol important n aprarea la nivelul mucoaselor (digestiv, respiratorie etc) i n reglarea compoziiei florei microbiene de la suprafaa acestora. Este important ca nou-nscutul s primeasc de la mam colostrul i apoi s fie alimentat pe cale natural pentru a primi IgA (sinteza proprie ncepe dup circa 1 lun de la natere). IgD Are un nivel seric sczut iar rolul su nc nu este pe deplin cunoscut. IgD se afl, mai ales, la suprafaa limfocitului B n asociere cu IgMm unde ar putea juca rolul de receptor activ de difereniere celular i memorie. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate traversa bariera hemato-placentar. Concentraia de IgD crete n ser de la natere i pn la vrsta de 15 ani. Crete n serul femeilor nsrcinate. IgE Dei concentraia lor seric este infim (0,0001 g/l), fixarea pe bazofile i mastocite le confer un rol important n inflamaie i hipersensibilitatea de tip imediat. posed, ca i IgM, un al patrulea domeniu constant, care i confer o mas molecular de 190.000 D i un coeficient de sedimentare 8S, superior IgG. IgE se fixeaz pe receptor prin intermediul domeniilorCe2 i Ce3,ntr-o poziie aproape orizontal. Lanurile uoare Acestea sunt n proporie de 2/3 lanuri kappa i 1/3 lanuri lambda, excepie fcnd IgD la care lanurile lambda sunt majoritare.

188

14. 3. Determinanii antigenici ai imunoglobulinelor Imunoglobulinele inoculate la o specie diferit vor avea rol de antigene i n aceast calitate prezint 3 tipuri diferite de determinani sau markeri antigenici. Izotipia Determinanii izotipici sunt prezeni la toi indivizii aceleiai specii. Ei iau natere n cursul diferenierii speciei. Anticorpii anti-izotip sunt obinui prin injectarea Ig umane policlonale sau monoclonale la animal (ex. iepure). Anticorpii anti-IgA apar uneori la subiecii cu deficit de IgA dup transfuzia de snge i stau la originea ocului cu hipotensiune arterial. Ei pot fi considerai anticorpi anti-izotip. Allotipia Caracterele antigenice prezente la unii indivizi dintr-o anumit specie, bazate pe deosebirea a 13 aminoacizi, corespund variaiei aprute n cadrul respectivei specii. n mod natural (n lipsa unei injectri prealabile de snge sau plasm), se pot gsi anticorpi anti-allotipici la subiecii care nu au allotipurile corespunztoare, la 1% din subiecii normali i la 3-5% dintre bolnavii cu poliartrit reumatoid. Diferitele sisteme cunoscute se noteaz folosind litera clasei de Ig i litera K pentru kappa, urmate eventual de numrul subclasei i n final litera m pentru marker (ex. sistemul Gm, sistemul A2m, sistemul Km). Idiotipia n definiia iniial, acest caracter antigenic era propriu unei imunizri, la un animal care a produs anticorpi. Oudin a obinut primii anticorpi anti-idiotipici n modul urmtor: ntr-o prim etap a imunizat un iepure mpotriva Salmonella spp. i a obinut un prim tip de anticorpi numii Ab1 mpotriva acestei specii. Apoi un al doilea iepure a fost imunizat cu acest imunoser i s -au obinut anticorpi numii Ab2 sau anticorpi anti-anti-Salmonella sau anti-idiotip Ab1. Aceti anticorpi nu recunosc dect serul primului animal imunizat i nu serul dinaintea imunizrii sau serul unui alt animal imunizat pentru aceeai Salmonella. Un anticorp Ab2 poate recunoate m ai muli Ab1 de la animale diferite, recunoscnd anticorpii cu aceeai specificitate anti-Salmonella. Pornind de la Ab2 se poate imuniza un alt animal care sintetizeaz anticorpi Ab3, anti-idiotip Ab2, aa-zii anti-anti-idiotip. Pentru anticorpii Ab2 se disting Ab2-a care nu inhib reacia antigen-Ab1 i Ab2- care, dimpotriv, inhib aceast reacie. Anticorpii Ab2- sunt numii imagine intern a epitopului de plecare E1, ceea ce nseamn ce au o structur imunologic asemntoare, recunoscut de Ab1. Determinanii antigenici idiotipici se gsesc la nivelul prilor variabile ale lanului greu i lanului uor, i uneori sunt constituii din cele dou lanuri. Ei pot corespunde segmentelor hipervariabile, respectiv paratopilor imunoglobulinelor.

14. 4. Proprieti fizico-chimice 14. 4. 1. Ig policlonale 189

Termenul de clon a fost mprumutat din bacteriologie, unde toate microorganismele care deriv dintr-o bacterie sunt identice ntre ele i cu prima bacterie. n imunologie, aceasta desemneaz toate celulele derivate dintr-un limfocit (cu o specificitate imunologic). Un rspuns imun obinuit corespunde unui rspuns policlonal cu imunoglobuline: de diferite clase i subclase de imunoglobuline: IgM, IgG1 etc.; cu dou allotipuri, dac subiectul este heterozigot; de ex. Gm (1,2,17) / Gm (3); cu lanuri uoare kappa i lambda; cu diferite specificiti fa de antigen, n recunoaterea diverilor determinani antigenici iar pentru fiecare determinant antigenic, prezena unor epitopi diferii; cu diferite afiniti. Ansamblul sintezei determin o hipergamaglobulinemie difuz datorat heterogenitii Ig prezente, corespunztoare numrului de clone limfocitare diferite, i se traduce prin molecule cu ncrctur electric diferit. 14. 4. 2. Ig monoclonale au urmtoarele caracteristici: o singur i subclas de Ig, de exemplu IgA2; un singur lan uor, de exemplu lambda; un singur allotip prezent, de ex. A2 m2 la un subiect heterozigot A2 m1/ A2 m2; o specificitate unic, ce recunoate un anumit epitop; afinitate unic. Acest aspect poate rezulta din proliferarea benign (imunoglobulin monoclonal benign) sau malign (mielom multiplu, boal Waldenstrom) a unui LB matur. Toate Ig secretate de clon au o structur chimic identic, cu mobilitate electroforetic unic, astfel nct electroforetic proteinele prezint un vrf cu baz ngust, iar imunoelectroforetic se caracterizeaz prin apariia celei de-a doua curburi a arcului normal, avnd urmtoarele 3 caracteristici: linie groas, curb foarte marcat, poziie mai apropiat de imunoserul revelator.

14. 5. Ontogenia imunoglobulinelor Ftul este capabil s sintetizeze, din a zecea sptmn, cantiti foarte mici de IgM i cantiti importante din a 12-a sptmn. IgG materne nu traverseaz bariera placentar dect dup a 20-a sptmn. n absena unei infecii congenitale (toxoplasmoz, sifilis etc), n sngele nou nscutului se gsete o cantitate de IgM fetal care nu depete 10% din valoarea adultului. Nivelul IgG la nou-nscut este de 110% din nivelul adultului normal, ca urmare a transferului activ, de la mam la ft. Dup scderea nivelului IgG materne (care pot persista pn n lunile 3-6 de via i chiar pn la 18 luni) se observ o sintez activ a diferitelor clase: IgM are nivel normal la 1 an; IgG ajunge la valori normale la 3 ani; IgA i IgE au un nivel normal la 14 ani.

14. 6. Funcii

190

Proprietile fragmentului Fab Fragmentul Fv particip singur la formarea situsului de legare al anticorpilor, cu intervenia egal a domeniului VH al lanului greu i al domeniului VL al lanului uor. Aminoacizii celor 3 regiuni hipervariabile ale fiecrui lan, situai la distan n structura primar, dar apropiai n structura cuaternar, contribuie la formarea acestuia. Legtura antigen-anticorp se realizeaz prin legturi non covalente, reversibile. Proprietile fragmentului Fc Unele dintre aceste proprieti nu apar dect dac anticorpul a fixat antigenul sau a fost alterat de cldur, formnd agregate. Acest aspect este valabil pentru fixarea complementului i recunoaterea factorului reumatoid. n cazul subclaselor de IgG ordinea reactivitii este urmtoarea: IgG3 > IgG1 > IgG2 > IgG4. Viteza de catabolizare depinde de regiunea CH 2 a diferitelor clase i subclase de Ig. IgG (cu excepia IgG3) au un timp de njumtire de 21 de zile. Toate IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) traverseaz activ placenta, IgG1 trecnd cel mai uor. Aa cum am artat mai sus, nou-nscutul are o concentraie a IgG de 110% fa de cea matern, ceea ce indic prezena unui transfer foarte activ. IgM i IgA materne nu traverseaz placenta, Ig din aceste clase gsite la nou-nscut fiind de origine fetal. Cunoaterea acestor aspecte este foarte util pentru evidenierea unei afectri intrauterine sau a unui simplu transfer de Ig materne. n caz de suspiciune de toxoplasmoz congenital, se indic dozarea IgM i IgA antitoxoplasma n serul nou-nscutului (au existat, din nefericire, recomandri de ntrerupere a sarcinii n cazul n care la mam au fost identificai anticorpi anti-toxoplasma de tip IgG). Fixarea complementului poate avea loc n calea clasic; IgG1, IgG2 i IgG3 i IgM au un receptor ascuns n stare nativ pentru C1q, care va fi activat n timpul fixrii anticorpului pe antigen. Acest receptor se afl n regiunea CH2 a IgG i n domeniul CH4 al IgM. Teoretic, o singur molecul de IgM pentameric este suficient pentru activarea complementului, datorit celor dou situsuri apropiate. tiind c IgG sunt de 1.000 de ori mai puin eficace dect IgM, pentru activarea complementului sunt necesare dou molecule IgG, apropiate una de cealalt. Calea altern poate fi activat de IgG sau IgA, prin fixarea pe C3b. Receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (Fc receptor, FcR) sunt molecule membranare specifice pentru fiecare clas de Ig, care induc o activare a celulelor purttoare. Se disting receptori cu mare afinitate Fc RI, care fixeaz un monomer de Ig i sunt activai cnd antigenul se leag de anticorp formnd o punte ntre doi receptori cu slab afinitate Fc R II i Fc R III, care nu pot fixa dect complexe antigen-anticorp multivalente, formate n prealabil. Celulele purttoare de receptori pentru Ig sunt: macrofagele, monocitele i neutrofilele au urmtorii receptori: Fc g RI, Fc g RII, Fc g RIII, care permit fagocitarea complexelor imune, a celulelor sau microorganismelor acoperite cu anticorpi IgG; celulele NK cu receptori Fc g RIII, care permit inducerea unei citotoxiciti fa de celula int sau un microorganism, prin citotoxicitate anticorp dependent (ADCC) (antibody dependent cellular cytotoxicity). n acest mod celulele NK se pot fixa pe celula int i o pot liza; bazofilele circulante i mastocitele au receptori pentru IgE (Fc e RI i Fc e RII), inductoare ale hipersensibilitii imediate;

191

 eozinofilele i plachetele au receptori de slab afinitate Fc e RII. Plachetele au i receptori Fc g care le confer o activitate antiparazitar; limfocitele au diveri receptori de slab afinitate. Receptorul numit poly Ig R (receptor Ig polimeric) permite fixarea de IgA dimeric sintetizat pe plasmocite i faciliteaz intrarea lor ntr-o vacuol care traverseaz citoplasma celulelor epiteliale intestinale. Este prezent i la nivelul canalelor secretorii ale glandelor exocrine.

14. 7. Povestiri adevrate Apariia unor infecii respiratorii severe la persoane cu deficit de IgA Cele 2 cazuri prezentate demonstreaz importana existenei unor valori normale a imunoglobulinelor, discutndu-se ca i exemplu concret situaia IgA. n ambele cazuri, deficitul imun congenital a fost diagnosticat tardiv, la 2 ani i jumtate i respectiv la 5 ani, cu ocazia unor infecii respiratorii joase. n nici unul dintre cazuri nu a fost posibil stabilirea etiologiei, pentru c s-au administrat antibiotice i chimioterapice nainte de a se recolta produse patologice pentru nceperea diagnosticului bacteriologic, direct. Primul caz Un copil de sex masculin, n vrst de 5 ani, se interneaz ntr-o clinic de pediatrie, datorit faptului c n cursul internrii ntr-un spital de nivel inferior nu s-a obinut vindecarea pneumoniei de care suferea. Motivele internrii au fost: stare general alterat, lipsa evoluiei favorabile n cursul internrii precedente. Istoricul bolii a artat c este vorba de un copil care a fcut n fiecare an mai multe infecii respiratorii joase (3-5 / an, n fiecare an) i mult mai numeroase infecii acute ale cilor respiratorii superioare (IACRS). Boala a debutat n finalul anului precedent, cu simptome respiratorii pentru care prinii au administrat paracetamol i picturi cu un decongestiv nazal. Dup 2 sptmni, datorit intensificrii semnelor respiratorii, medicul de familie recomand internarea n cel mai apropiat spital, diagnosticul la internare fiind pneumonie cu pleurezie. n spital s-a administrat o asociere de ceftriaxon cu gentamicin, dar semnele respiratorii s-au meninut, aprnd n plus semne de insuficien respiratorie; n aceste condiii copilul se transfer n clinica de pediatrie. Examenul clinic la camera de gard relev o stare general foarte alterat, dificulti n respiraie, respiraii frecvente, tiraj intercostal, lipsa murmurului vezicular la baza hemitoracelui stng, submatitate la percuie i raluri crepitante nsoite de frectur pleural la auscultaie n treimea medie a hemitoracelui stng. n clinica de pediatrie sa recoltat snge pentru hemoculturi i lichid pleural, produsele fiind trimise pentru diagnosticul bacteriologic, direct. Hemoculturile au fost negative. Cultura din lichidul pleural a fost negativ. Valorile celorlalte analize de laborator au fost urmtoarele: VSH = 85 mm/or, numr de leucocite = 28.000/mm3 (dintre care, peste 20.000/mm3 neutrofile, 72%), proteina C reactiv=9,8 mg/dL. Dozarea imunoglobulinelor serice a artat valori mari pentru Ig G (1.800 mg/dL), o valoare de 242 mg/dL pentru Ig M, n timp ce IgA a fost nedozabil (0 mg/dl). Fraciunea C3 a complementului a fost dozabil, n cantitate de circa 10 ori mai mare dect valorile normale, cu complexe imune circulante dozabile, la valori mari. 192

Diagnosticul de pneumonie stng cu pleurezie, probabil de etiologie bacterian, n condiiile unui deficit absolut de IgA, a condus la instituirea tratamentului cu o asociere de medicamente antibacteriene (ceftriaxon, amikacin i teicoplanin) alturi de dezobstruante, meninerea permeabilitii cilor respiratorii i administrare de oxigen. S-au administrat de asemenea imunoglobuline pe care intravenoas. Datorit faptului c n ciuda unei evoluii favorabile din punct de vedere clinic, semnele fizice de la nivel pulmonar s-au meninut iar temperatura nu a cobort sub 38,1C, s-a administrat suplimentar un medicament antifungic evoluia fiind favorabil. Tratamentul a fost continuat timp de 3 sptmni, dup care copilul a fost externat cu recomandarea de a reveni la control clinic, radiologic i bio-umoral. La controlul efectuat s-a constatat c deficitul de IgA nu a fost corectat i s-a meninut i dup vindecarea pacientului, fiind probabil o cauz a patologiei i nu un rezultat al acesteia. Al doilea caz Un copil de sex feminin, se interneaz la vrsta de 2 ani i 6 luni ntr-o clinic de pediatrie, prin transfer dintr-un spital de nivel inferior, datorit evoluiei nefavorabile a unei pneumonii. S-a nscut prematur, dup 8 luni de gestaie, cu greutate de 1.100 g, Apgar 7. A fost ngrijit n maternitate pn la vrsta de 2 luni i jumtate. Pn la vrsta de 2 ani i jumtate a fcut repetate infecii acute ale cilor respiratorii inferioare (IACRI) (minim 4 episoade / an). Motivele internrii au fost: febr, tuse i dispnee. Din discuia cu prinii s-a aflat c tusea i febra au aprut cu 10 zile anterior internrii; ulterior copilul a nceput s respire din ce n ce mai dificil. A primit n ambulatoriu ampicilin (pe cale oral), apoi cotrimoxazol (biseptol). Pentru c evoluia a fost nefavorabil, mama a fost sftuit s se prezinte pentru internare, la spital. S-au prezentat la primul spital. Examenul clinic la internare a evideniat: febr (38,3C), paloare, numr ridicat de respiraii/minut, tiraj (deprimare a structurilor suprasternale n timpul inspirului) i sindrom de matitate n treimea inferioar a hemitoracelui drept (la inspecie, auscultator i la percuie). La examenul radiologic s-a vzut opacifierea neomogen a jumtii inferioare a hemitoracelui drept. Din rezultatele celorlalte investigaii se amintesc: VSH= 120 mm/or, leucocitoz (12.400 / mm3) cu neutrofilie (75%), hipoxemie (cu scderea presiunii de oxigen). Imediat dup internare s-a administrat ceftriaxon, apoi amoxicilin-acid clavulanic n asociere cu ciprofloxacin, fr ca evoluia s fie pozitiv. n aceste condiii, s-a recomandat transferul ntr-o clinic de pediatrie, de nivel superior. Diagnosticul la internare n clinica de pediatrie a fost: pneumonie dreapt, sepsis bacterian. Examenul clinic la internare a revelat o stare general profund alterat, prezena unui facies suferind, foarte palid, hipertermie (39C), deficit al strii de nutriie (greutate = 10,7 kg), cianoz peri-oro-nazal accentuat la plns i alte eforturi, polipnee (80 respiraii / minut), bti ale aripioarelor nazale, matitate cu absena murmurului vezicular n dou treimi inferioare ale hemitoracelui drept, raluri crepitante la baza hemitoracelui drept, ficat la 2,5 cm sub rebordul costal, dureros la palpare. Radiografia pulmonar efectuat la internare a evideniat opacifierea omogen a hemitoracelui drept. Celelalte investigaii de laborator au avut urmtoarele valori: VSH = 75 mm/h, hemoglobin = 8,2 g/dL, leucocitoz (L = 24.800/mm3) cu neutrofilie (peste 15.600 neutrofile/mm3, 63%), modificri ECG. S-a pus diagnosticul de pneumonie cu pleurezie dreapt important, insuficien respiratorie acut, insuficien cardiac, anemie, hipotrofie ponderal. S -a realizat 193

puncia pleural (att pentru a elimina aceast cauz de presiune mecanic asupra arborelui cardiovascular ct i pentru punerea diagnosticului etiologic i stabilirea sensibilitii la antibiotice a agentului sau agenilor etiologici). S-a recoltat i snge pentru hemoculturi, nainte de administrarea altor medicamente antibiotice sau chimioterapice. Lichidul pleural era sub presiune; s-au extras cu uurin peste 375 mililitri de lichid opac, tulbure. Produsele au fost trimise imediat ctre laboratorul de bacteriologie. Frotiul colorat Gram a pus n eviden rare PMN (2-5 / cmp) i rari coci Gram-pozitivi, aezai unul cte unul sau n diplo. Coloraia ZiehlNielsen nu a pus n eviden bacili acid-alcoolo rezisteni. Att culturile din lichidul pleural ct i cele hemoculturi au rmas sterile. Prin reacii antigen-anticorp s-a ncercat punerea n eviden a prezenei antigenelor capsulare n lichidul pleural (pneumococ, H. influenzae, meningococ), dar reaciile au fost negative. Dozarea imunoglobulinelor serice a artat valori mari pentru Ig G (1.400 mg/dL), o valoare de 160 mg/dL pentru IgM, n timp ce IgA a fost nedozabil (0 mg/dl). Fraciunea C3 a complementului a fost dozabil, n cantitate mai mare dect valorile normale. n condiiile obinerii acestor date clinice, paraclinice i de laborator, s-au administrat antibiotice n asociere [iniial o combinaie ntre un glicopeptid i o cefalosporin de generaia a III-a (pentru 2 sptmni), apoi o combinaie ntre vancomicin i amikacin (pentru nc 2 sptmni)], n afar de drenajul lichidului pleural (sub control clinic i paraclinic), administrare de oxigen, administrare de lichide, electrolii i substane nutritive intravenos. Avndu-se n vedere rezultatul dozrii imunoglobulinelor, s-au administrat i imunoglobuline intravenos. Lent, evoluia din punct de vedere clinic a fost favorabil. Pe partea dreapt, radiologic s-a constatat organizarea unui proces pahipleuritic. Copilul a fost spitalizat pentru o lun, iar nainte de externare valorile bio-umorale au fost urmtoarele: VSH =12 mm/or, numr de leucocite= 6.500/ mm3 (fr neutrofilie), hemoglobin = 10.2/dL, hematocrit = 34%, IgA = 0 mg/dL. Discuii Cu excepia vrstei, au existat o serie de asemnri ntre cele dou cazuri. Ambii copii au avut n antecedente episoade de IACRS i IACRI, mai multe / an, n fiecare an, fr diagnostic etiologic, pentru care au primit tratament la domiciliu, de regul incluznd antibiotice sau chimioterapice. Episodul infecios discutat, datorit evoluiei grave, a condus la recomandarea de internare i n fiecare dintre cele dou cazuri internarea a fost realizat, succesiv, la dou nivele spitaliceti. n ambele cazuri, la spitalul de nivel inferior, copii au primit tratament antibiotic nainte de recoltarea produselor pentru punerea unui diagnostic etiologic. n aceste condiii nu a fost posibil nici stabilirea sensibilitii microorganismelor implicate i tratamentul anti-infecios a fost condus empiric, ceea ce ar fi putut reprezenta un important factor de risc, inclusiv pierderea pacientului. n primul caz nu s-a putut emite nici o ipotez privind etiologia (alta dect bacterian) iar n al doilea caz, elementele observate la studierea frotiului din lichidul pleural au permis suspicionarea unei pneumonii de etiologie pneumococic. Tratamentele conduse n ambulatoriu, auto-tratamentele stabilite de prini (n baza amintirii unor recomandri medicale anterioare), lipsa unei culturi medicale care s ridice suspiciunea privind o cauz de baz care s explice un numr de infecii respiratorii, repetate, mai numeroase dect n mod obinuit, ne fac s realizm motivele pentru care deficitul imun a fost descoperit relativ tardiv (cu toate c n ambele cazuri a existat un deficit absolut n sinteza de IgA, foarte probabil un deficit primar).

194

Pe de o parte, din aceste prezentri sesizm, foarte concret, importana bunei funcionri a sistemului imun i una dintre situaiile care pot aprea n cazul existenei unor deficiene, iar pe de alt parte este de subliniat c tratamentul bolilor infecioase ar trebui realizat numai dup diagnosticul etiologic, cu testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice, singura variant corect, care poate veni n sprijinul pacienilor pe care trebuie s i ngrijim.

15. Sistemul complement (MI Popa, Roxana Micu)

195

Complementul, un complex multienzimatic format din circa 30 de componente, reprezint unul dintre principalii constitueni ai aprrii naturale, ai imunitii umorale i respectiv un element important al reaciei imune survenite ca urmare a formrii complexelor antigen-anticorp (are rol esenial n rspunsul inflamator). Sistemul complement (C') reprezint o component normal a serului. Sistemul complement are o serie de funcii importante: aprarea nespecific mpotriva infeciei (liza virusurilor, liza bacteriilor, liza celulelor strine, favorizarea prin opsonizare a fagocitozei, chemotactism pentru PMN i sistemul MM etc); eliminarea complexelor imune i a celulelor apoptotice; reglarea fiziologic a RI, dar particip i la creterea permeabilitii capilarelor, stimularea contractilitii musculaturii netede etc. n cele mai multe mprejurri, sistemul complement are efecte benefice; totui sunt de menionat i unele efecte negative (ex. particip la reaciile anafilactice, este implicat n hipersensibilitatea citolitic-citotoxic etc). Sistemul complement cuprinde circa 30 de componente celulare sau plasmatice. Componentele sale suntsintetizate de hepatocite, macrofage, celule epiteliale intestinale etc. Substanele activatoare reprezint 5% din suma proteinelor serice (circa 3 g/l); componenta C3 este componenta care se gsete n cantitatea cea mai mare (circa 1,3 g/l). (Tabelul nr. 1) Sistemul C' se poate activa pe trei ci, respectiv calea clasic, calea lectinic i calea altern. Activarea pe calea clasic este declanat n primul rnd de formarea complexelor imune (AgAc), dar i de apariia celulelor apoptotice, anumite virusuri sau de proteina C reactiv cuplat cu anumii liganzi (Figura nr. 1). Calea lectinic poate fi activat de lectina care leag manoza de pe suprafaa bacteriilor (MBL, Mannan-Binding Lectin), dar i de alte proteine asemntoare. Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ce nu au origine imun i prezint cel puin dou situsuri identice de legare specific a unor structuri glucidice; MBL este o protein din clasa colectinelor, avnd domenii lectinice prin care se ataaz glucidelor i un domeniu colagen-like. MBL se gsete n cantitate mic n serul indivizilor sntoi, ns n cazul infeciilor acute, concentraia acesteia crete semnificativ. S-a constatat c persoanele care au deficit de MBL dezvolt n copilrie mult mai multe infecii dect copiii normali, lucru ce atest importana aprrii organismului prin activarea complementului pe calea lectinic la vrste la care sistemul imun nu s-a constituit n totalitate din punct de vedere funcional. Interaciunea acestora formeaz un complex asemntor celui format n primele subetape ale cii clasice (C1qrs) i activeaz calea clasic fr a necesita prezena complexelor antigenanticorp. Pe lng MBL, alte trei proteine pot, prin legarea lor de anumite structuri antigenice, s declaneze activarea complementului pe calea lectinic. Aceste proteine sunt ficolina-1, ficolina2 i ficolina-3. Pot lega zaharuri sau compui acetilai prezeni pe suprafaa microorganismelor. Dintre MBL i ficoline, cea mai abundent n plasm i cea care intervine cel mai adesea n declanarea cii lectinice, este ficolina-3, numit i antigenul Hakata sau -2 macroglicoproteina termolabil. (1) Calea altern poate fi activat de bacterii, fungi, virusuri, parazii, venin de viper, produi de coagulare, celule tumorale etc.

196

Calea clasic i calea altern (alternativ) converg ctre C3, apoi urmeaz o cale efectoare comun, implicnd ultimele componente ale sistemului complement (Figura nr. 3). n fiecare dintre etape, intervin proteine activatoare, inhibitoare sau reglatoare precum i receptorii pentru complement. Aceste elemente se gsesc fie n plasm fie la nivelul peretelui celulelor autologe sau omologe. n mod curent, sistemul complement este desemnat prin litera C. Pentru fiecare component studiat i bine delimitat n cadrul cascadei de activare se adaug o cifr, de la C1 la C9, care este eventual urmat de o liter (care reprezint o anumit subdiviziune; spre exemplu, pentru C1 exist C1q, C1r i respectiv C1s). Ca urmare a activrii sistemului C', unele componente (C4, C2, C3, C5), sunt fragmentate, aceste fragmente fiind desemnate printr-o liter ataat componentei iniiale (exemplu C3a i C3b). n general componenta b este de dimensiuni mai mari (excepie C2a, fragment nglobat ntr-un complex proteolitic i care are dimensiuni mai mari dect C2b) i se fixeaz la nivelul structurii int, n timp ce componenta a este mai mic, este solubil i posed o activitate anafilactoid sau chimiotactic. Anafilatoxinele sunt polipeptide mici, eliberate n cursul cascadei de activare a complementului, care prezint receptori pe mastocite, monocite, macrofage, neutrofile, trombocite i au efect proinflamator. Cea mai puternic dintre anafilatoxine este C5a. Aciunile anafilatoxinelor sunt de tipul: contracie a musculaturii netede, cretere a permeabilitii vasculare, degranulare bazofilic i mastocitar, chemotactismul i activarea granulocitelor care vor conduce la eliberarea enzimelor litice i a radicalilor liberi. Compusul b poate fi mai departe fragmentat (exemplu C3c i C3d). Un compus inactivat este indicat prin litera i (exemplu: C3bi sau iC3b). Componentele sistemului complement sunt prezentate n tabelul nr. 1.

15. 1. Calea clasic Activarea sistemului complement Componentele C' se gsesc n ser, n stare inactiv. Pentru a declana activarea lor este necesar un stimul. Pentru calea clasic, punctul de pornire este reprezentat de ctre complexele antigen-anticorp (Figura nr. 1), unde anticorpii sunt de tip IgM (domeniul CH4) sau de tip IgG (domeniul CH2) corespunznd subclaselor IgGl, IgG2 sau IgG3. Complementul poate fi activat de o singur molecul de IgM sau de ctre dou molecule de IgG apropiate una de alta. Activarea este posibil i n cazul unor molecule de IgG agregate. n mod asemntor, calea clasic poate fi activat i de ctre unele microorganisme sau diferite substane chimice: bacterii Gram-negative (Salmonella spp., E. coli, Neisseria spp.), retrovirusuri, glicoproteina anvelopei HIV, complexe heparin-protamin etc. n cursul activrii intervin urmtoarele proteine:

197

C1. n sngele circulant exist un complex plurimolecular ce conine o molecul de C1q (molecul ce aparine familiei colectinelor, precum MBL), dou molecule de C1r i dou molecule de C1s, situate n jurul ionilor de calciu i asociate inhibitorului C1, denumit C1inh. La persoanele cu deficit congenital de C1 inh, complementul se activeaz cronic n mod spontan, provocnd episoade severe i recurente de edem edem angioneurotic. Compusul C1q, cu o greutate molecular de 400.000 Da, a fost comparat cu un buchet de 6 lalele. Fiecare floare este la rndul su compus din 3 lanuri de proteine alipite i terminate n mod globular. Fixarea C1q prin mai puin de dou pri globulare periferice pe fragmentele Fc ale imunoglobulinelor permite activarea sa cu eliberarea C1inh din complexul plurimolecular. Acest fenomen antreneaz pe de alt parte autoactivarea moleculelor C1r i C1s. Componenta C1s are o activitate serinesterazic, prin care poate s cliveze urmtoarele 2 componente: C4 i C2. C4 este fragmentat n C4a, molecul mic, cu activitate anafilactoid i respectiv C4b, de dimensiuni mai mari, care se leag printr-o legtur covalent fie de fragmentul Fab al anticorpului fie la nivelul peretelui bacterian sau la nivelul unor celule (strine, proprii modificate, infectate etc). Ansamblul formeaz complexul C1-C4b, notat pe scurt C14b. C2. Aceeai esteraz (C1s) mpreun cu fragmentul C4b, cliveaz o molecul de C2 n C2b (o molecul mic, cu activitate de tip kinin) i n C2a (molecula de dimensiune mai mare, care se leag de structura int). Ansamblul necesit prezena Mg2+ i formeaz C3 convertaza cii clasice sau C4b2a. n acest moment, anticorpii i respectiv componenta C1 pot s se detaeze de structura int, iar procesul poate continua. C3 este clivat n C3a i C3b de ctre C4b2a. C3a este o molecul mai mic i are, n mod primordial, o activitate anafilactoid i chimiotactic, n timp ce subcomponenta C3b se fixeaz pe structura int datorit unei puni realizate ntre un radical tioester i o grupare ( -OH) sau (NH2) de pe suprafaa celular acceptoare. Pe de alt parte, C3b poate fi inactivat de factorul I (rezultnd C3bi), iar apoi clivat ntr-o molecul mare C3c (liber) i o molecul C3dg restant pe structura int, care poate apoi s se transforme n C3d. C3b format permite constituirea C5 convertazei (C4b2a-C3b) pe calea clasic. (Figura nr. 1) Calea clasic de activare a complementului poate fi amplificat foarte mult. Fiecare complex antigen-anticorp leag o molecul de C1, iar C1s n stare activ cliveaz pn la 100 molecule de C4. Din acestea, doar 20 de fragmente C4b se ataaz complexelor antigen-anticorp. C3 convertaza cii clasice cliveaz mii de molecule de C3. Aceste lucru dovedete imensa capacitate de amplificare a acestui lan de reacii biochimice.

15. 2. Calea altern i calea de amplificare Calea altern constituie una dintre primele linii de aprare a organismului fa de un agent patogen, naintea constituirii rspunsului imun.

198

Aceast cale poate fi activat de ctre diferite microorganisme, de componente ale acestora, de numeroase substane neimune, spre exemplu: bacterii Gram-pozitive (ex. Streptococcus pneumoniae) sau Gram-negative, virusuri (dar i celule infectate sau transformate de ctre virusuri), fungi (ex. Candida albicans), parazii (ex. Schistosoma mansoni, Trypanosoma cruzi), endotoxine bacteriene, alte substane (insulin, hemoglobin, zymosan, fibre de azbest, gluten, prafuri, unele substane de contrast utilizate n radiologie, venin de viper sau veninul altor erpi etc.). Calea altern poate fi activat de complexele imune care cuprind IgG sau IgA. Printre componentele cii alterne se numr: C3. n plasm, prin proteoliza spontan a C3, sunt formate n permanen mici cantiti de C3b. Moleculele de C3b se fixeaz de suprafeele acceptoare, n particular de peretele microorganismelor sau de celulele infectate i alterate. Cteva bacterii, a cror structur este bogat n acid sialic, pot evita aciunea sistemului complement. La rndul su, C3b acioneaz asupra factorului B. Factorul B. Element al cii de amplificare, factorul B este clivat n Ba i Bb. Complexul C3bBb, format n prezena ionilor de Mg2+, constituie C3-convertaza alternativ, care cliveaz noile molecule de C3 n C3b. Acest clivaj accelerat de C3, d natere C5-convertazei (C3bBb)n. Factorul D, factor prezent sub form activ n ser nainte de activarea C, cliveaz factorul B, ceea ce faciliteaz formarea complexului C3bBb. Ansamblul factorilor activatori ai cii clasice i alternative realizeaz o bucl de amplificare, care permite transformarea numeroaselor molecule de C3 n C3b astfel nct C3b s acopere (opsonizeze) peretele bacterian. (Figura nr. 2)

15. 3. Calea final comun Calea final comun mai este numit i calea efectoare sau calea litic. Activarea ncepe de la C5-convertaza cii clasice (C4b2a-C3b)n i respectiv de la (C3bBb)n n cadrul cii alternative. Activarea cuprinde de fapt complexul de atac al membranei (Membrane Attack Complex), MAC): C5. Convertazele-C5 pentru calea clasic i respectiv pentru calea altern cliveaz C5 n C5a, molecula mic, liber i C5b, molecula mare care se fixeaz pe structura int. Att C5a, ct i molecula care rezult n urma transformrii sale n C5-dezarginin, acioneaz la nivelul receptorului C5a-R al mastocitelor i bazofilelor. C6, C7, C8. C5b antreneaz legtura dintre C6 i C7, formnd un complex C5b67 notat prescurtat C5b7. Complexele C5b7 se leag de o molecul de C8 care se implanteaz n membran apoi mai multe molecule de C9 vor forma un complex membranar C5b9m.

199

C9. Aceast protein are dou proprieti: 1. de a se insera la nivel membranar, graie unei fee hidrofobe; 2. de a polimeriza, formnd astfel peretele unei soluii de continuitate de circa 10 nm n diametru la nivelul membranelor celulelor int (limfocitul T utilizeaz o substan numit perforin, cu efect asemntor cu cel produs de C9). Formarea sau fixarea complexului C5b9 n cantiti sublitice la suprafaa celulelor antreneaz sinteza i eliberarea mediatorilor inflamaiei (leucotriene, IL-1 etc). (Figura nr. 3) Exist o serie de mecanisme de reglare a activitii sistemului complement, acestea fiind mediate de proteine reglatoare care intervin la un moment dat n cursul cascadei de activare, avnd capacitatea de a o limita sau chiar opri. (Tabelul nr. 2) n general, aceste proteine inhib formarea C3 convertazei sau promoveaz disocierea ei (cnd aceasta deja s-a format). Decay Accelerating Factor (DAF) Factorul de accelerare a disocierii C3 convertazei este o protein care poate dezactiva C3 convertaza cii clasice, dar are i rolul de a inhiba formarea ei, nepermind elementelor C2a i C4b s interacioneze. mpreun cu CR1 (complement receptor 1), DAF competiioneaz cu factorul B la legarea de C3b, prevenind astfel constituirea C3 convertazei cii alterne. Acest complex DAF-CR1 poate s disloce Bb din compusul C3bBb, disociind C3 convertaza cii alterne. Factorul H are aciune similar. Tot din categoria proteinelor reglatoare face parte i Factorul I, o proteaz din plasm care cliveaz C3b n mai multe situsuri, inactivndu-l. Iniial rezult C3bi, apoi C3c i C3dg (fragment ce rmne ataat membranei celulare). Properdina (factorul P), n contrast cu toi compuii enumerai anterior, intervine n reglarea sistemului complement prin stabilizarea C3 convertazei cii alterne. Deficienele de properdin au fost asociate cu creterea susceptibilitii fa de infeciile provocate de Neisseria spp.

15. 4. Receptorii pentru complement (CR) Cei mai importani receptori recunosc C3b sau derivaii si C3bi i C3d. CR1 (CD35) sau receptorul pentru C3b CR1 sau receptorul pentru C3b i C4b este prezent pe hematii, trombocite, neutrofile, eozinofile, monocite i macrofage, limfocite B i T4 precum i la nivelul podocitelor glomerulare. Acest receptor permite transportul complexelor imune prin intermediul globulelor roii spre macrofagele hepatice sau celulele Kuppfer. Pe de alt parte, fenomenul de aderen imun realizat prin intermediul macrofagelor de particulele ncrcate cu C3b, permite fagocitoza complexelor i eliminarea lor. Dac sunt prezeni i anticorpii, aceast aciune este decuplat, graie aciunii conjugate a receptorilor de Ig. Ar mai fi de menionat c CR1, prezent pe celulele dendritice intrafoliculare, permite prezentarea antigenului situat n cadrul complexului imun acoperit de componente ale complementului. CR1 acioneaz drept cofactor al factorului I, fiind una dintre componentele ce intervin n reglarea aciunii complementului. (2) Variaiile expresiei genetice a CR1 se coreleaz direct cu apariia lupsului eritematos i formelor severe de malarie. n prezent este speculat scopul terapeutic pe care l are CR1 solubil. (3) 200

CR2 (CD21) sau receptorul pentru C3d Receptorul pentru C3dg sau C3d, este prezent pe limfocitele B, pe celulele foliculare dendritice i pe celulele mucoase din orofaringe. C3d antreneaz stimularea i proliferarea limfocitelor B prin intermediul complexelor imune acoperite de C3d sau permite prezentarea antigenului prin intermediul celulelor dendritice. Spre ex. penetrarea la nivel faringian i respectiv infectarea ulterioar a limfocitelor de ctre virusul Epstein-Barr se realizeaz prin intermediul acestui receptor. CR2 este implicat direct n inducerea rspunsului imun umoral primar. CR3 (CD11b/CD18) sau receptorul pentru C3bi CR3 sau receptorul C3bi se gsete pe monocite, macrofage, neutrofile i pe celulele foliculare dendritice. El permite fenomenele de aderen imun precum i fagocitoza particulelor acoperite de C3bi sau citoliza bacteriei prin fenomenul de ADCC (antibody dependent cellmediated cytotoxicity). CR3 permite de asemenea prezentarea antigenului prin intermediul celulelor dendritice. Are un rol important n stabilirea adeziunii dintre leucocite i endoteliu, fiind presuspus faptul c CR3 este ligand pentru ICAM (Intercellular Adhesion Molecule) exprimat pe celula endotelial. (4) CR3aR, C4a, C5a, C1q, HR Exist, de asemenea, receptori pentru fragmentele mici C3a (C3aR), C4a (C4aR) i C5a (C5aR) la nivelul mastocitelor, monocitelor, macrofagelor, neutrofilelor i trombocitelor. Aceti receptori activai antreneaz fenomene inflamatorii, activnd aceste celule i permind eliberarea substanelor inflamatorii sau atragerea neutrofilelor. Receptorul pentru C1q (C1qR) precum i receptorul pentru factorul H (HR) permit fagocitoza particulelor opsonizate.

15. 5. Rolul biologic al sistemului complement Sistemul complement prezint numeroase activiti biologice: 15. 5. 1. n inflamaie sunt implicai diferii compui solubili de talie mic. C3a i C4a au o mas molecular apropiat de 10.000 Da i sunt numite anafilatoxine. Ele pot s se fixeze pe bazofile i pe mastocite atrgnd eliberarea de histamin precum i vasodilataie, unul dintre primele elemente ale rspunsului inflamator. C2b (kinina-C2) este capabil s creasc permeabilitatea vascular. C5a posed o activitate chimiotactic pozitiv fa de neutrofile i conduce la agregarea polinuclearelor, n urma activrii complementului. Complexul C5b7 fixat pe membrane sau pe complexele imune are de asemenea aciune chimiotactic pentru polinucleare. 15. 5. 2. n aprarea anti-infecioas. Agenii infecioi extracelulari pot fi acoperii de componente ale sistemului complement fie n urma activrii directe (calea alternativ activnd direct C3), fie prin intermediul anticorpilor care fixeaz complementul. n final, complexele de 201

atac ale membranei (componentele C5-C9) lizeaz diferite microorganisme: bacterii, virusuri sau parazii. Aceasta reprezint o activitate citolitic direct a complementului cu sau fr prezena anticorpilor. Prin mecanisme asemntoare, agenii infecioi pot fi acoperii de C3b sau C3bi care sunt recunoscui de diferii receptori, prezeni la nivelul diferitelor celule fagocitare eseniale: neutrofile i macrofage. Dup aderare, acestea vor fagocita microorganismele. Diferite microorganisme au dezvoltat mecanisme de rezisten la aciunea complementului: ex. prezena unei capsule care mpiedic activarea cii alternative (S. pneumoniae, Haemophilus influenzae), sintetizarea unor substane care fixeaz C3b sau antreneaz o rezisten la inseria complexului de atac al membranei. 15. 5. 3. n metabolismul complexelor imune. Curarea (clearance-ul) complexelor imune este facilitat n mare msur de ctre sistemul complement. Simpla fixare a complementului inhib formarea complexelor imune de talie mare (calea clasic) i le solubilizeaz. Totui complexele circulante acoperite de C3b pot adera la hematii, iar apoi pot fi transportate pn la nivelul celulelor Kuppfer hepatice, pentru a fi fagocitate. C1q are proprietatea de a precipita complexele imune in vitro. Aceast proprietate st la baza diverselor metode de detectare a complexelor imune circulante. 15. 5. 4. n reglarea rspunsului imun.Pe limfocitele B se gsesc receptori pentru C3d sau C3dg (CR2). 15. 5. 5. n inducerea secreiei de citokine de ctre monocite i macrofage prin intermediul receptorilor C3. (5) Sistemul C' poate aciona n sistem heterolog (C' recoltat de la animale, de ex. nurc, cobai se poate folosi n reacii de diagnostic n microbiologia medical, sistemul indicator provenind de la un alt animal de ex. oaie, bou) i din aceast cauz a fost i este nc folosit n foarte multe situaii. Trebuie ns reinut faptul c sistemul C' se degradeaz rapid la temperaturi mai mari de 56C i din aceast cauz reactivii care conin C' trebuie meninui la rece (0C) inclusiv pe timpul transportului.

15. 6. Povestiri adevrate 15. 6. 1. Infecie grav cu SGB n cazul deficitului de complement Streptococii de grup B (Streptococcus agalactiae) reprezint o cauz frecvent a infeciilor grave la nou-nscui i copiii mici. Prognosticul cel mai nefavorabil l au sepsisul i infeciile localizate la nivelul sistemului nervos central. n special n sepsis, dar i n cazul meningitelor, evoluia poate fi ctre oc i insuficien multipl de organ (eliberarea sistemic a TNF-, de ctre monocite i macrofage este corelat cu gravitatea i riscul evoluiei ctre deces). Gravitatea infeciilor este ns dependent i de imaturitatea mecanismelor de aprare la vrste mici. Se poate constata o insuficient producie de PMN neutrofile, o activitate mai sczut a sistemului complement, un procent mai nsemnat de limfocite T naive.

202

Dei sinteza elementelor care formeaz sistemul complement ncepe relativ repede, n perioada fetal (ntre sptmnile 6 - 14 de via intrauterin), concentraia acestora la natere nu depete jumtate din cea de la adult. Dintre efectele necesare ale sistemului complement, opsonizarea reprezint o etap esenial n cadrul unei fagocitoze eficiente. Componenta C3 a sistemului complement reprezint punctul de convergen ntre calea clasic i calea alternativ (altern). C3 favorizeaz fagocitoza prin structuri care se ataeaz suprafeei bacteriene i sunt recunoscute de anumii receptori. Pe suprafaa neutrofilelor sunt expui receptorii CR1 (CD35) - care se leag de componenta C3b. Neutrofilele prezint i receptori CR3. Comparativ cu configuraia receptorilor la adult, neutrofilele nou-nscuilor sunt deficitare n exprimarea CR3. Un studiu recent a demonstrat c blocarea (la adult) receptorilor CR3 mpiedic buna desfurare a proceselor de opsonizare i fagocitoz. Acelai studiu a emis ipoteza c depozitarea unor anumii compui de clivare ai C3 pe suprafaa streptococului de grup B ar fi un factor important n aprarea gazdei mpotriva agravrii infeciei. Alte experimente au artat c la oriceii cu deficit de C3 eliberarea de TNF- indus de streptococ este semnificativ redus. n concluzie, calea altern a complementului i factorul C3 ar putea reprezenta cheia eliberrii de TNF-. Abilitatea streptococului de grup B de a activa sistemul complement a fost demonstrat n vitro. Dei se tie c nou-nscuii prezint concentraii relativ mici ale complementului, n mod aparent calea altern este suficient de activ nct s amplifice eliberarea de TNF- n cazul infeciilor streptococice. Acest fapt a fost demonstrat de diferite studii care au certificat creterea marcat a eliberrii TNF- de ctre monocitele nou-nscuilor. Avnd n vedere c eliberarea de TNF- ca rspuns la infeciile grave cu streptococ de grup B pare s aib o strns legtur cu fiziopatologia acestor infecii, se consider c terapia adjuvant imunomodulatoare administrat cu scopul de a reduce activitatea pro-inflamatorie a streptococului ar putea fi eficient. O astfel de terapie ar include i modularea cii alterne a complementului. 15. 6. 2. Consecine ale deficitului de properdin Sistemul complement este un complex de molecule care face parte din ansamblul imunitii nespecifice. De-a lungul timpului, s-au descoperit o serie de afeciuni corelate cu deficiene ale acestor compui dintre care i boli autoimune, dar i reacii de hipersensibilitate. Un subiect ndelung studiat l reprezint deficitul de properdin i predispoziia persoanelor care posed aceast caren fa de infeciile cu specii din genul Neisseria. Properdina este o glicoprotein reglatoare a cii alterne de activare a complementului, singura care regleaz pozitiv cascada enzimatic prin stabilizarea C3 i C5 convertazei cii alterne. Concentraia seric fiziologic de properdin este de 5-15 g/ml, fiind un amestec de monomeri, dimeri, trimeri i tetrameri n raport de 1:2:1. n 1982, ntr-o familie suedez, a fost descris primul caz de caren de properdin n asociere cu o infecie meningococic cu debut fulminant. Ulterior, studiindu-se aceast problem, s-a ajuns la concluzia c exist 3 tipuri diferite de deficit de properdin (observate clinic la indivizi diferii). Primul tip se caracterizeaz prin absena proteinei n plasm. Cel de-al doilea se manifest printr-un titru foarte sczut al properdinei, iar cel de-al treile tip presupune o concentraie seric normal, dar o variant nefuncional a proteinei.

203

Detectarea unei astfel de condiii la un pacient este foarte dificil de fcut. Pe lng testele de laborator care sunt foarte laborioase, este necesar un istoric infecios al pacientului i al familiei acestuia. Din pricina diagnosticului greu de stabilit, deficitul de properdin este rar ntlnit, ns prezent n faz ocult (nediagnosticat) n special n cadrul rasei caucaziene, nefiind reportate cazuri la nici o alt populaie. Formele de deficit de properdin sunt maladii genetice transmisibile, X-linkate. Se cunoate deja, n toate trei tipurile bolii, care sunt mutaiile ce survin i unde sunt acestea localizate. Predispoziia fa de infeciile cu Neisseria meningitidis apare ca manifestare clinic n toate tipurile deficitului de properdin. Serotipurile cel mai des implicate n astfel de infecii sunt W135 i Y, mai puin serotipul B, fa de care s-a constatat c organismul uman i-a dezvoltat metode mai eficiente de aprare prin mecanisme de fagocitoz. Indivizii cu deficit de properdin au un risc mai crescut de 250 de ori de a dezvolta o infecie meningococi dect restul populaiei sntoase. Dac la o persoan normal, ansele cele mai mari de a face infecie cu meningococ sunt la vrsta de 6 ani, la un individ cu deficit de properdin, vrful riscului dezvoltrii infeciei este n jurul vrstei de 14 ani. Mortalitatea n astfel de cazuri este de pn la 75%. Infeciile recurente sunt extrem de rare n condiiile date, fapt ce atest c probabil aprarea umoral devine mai eficient la aceste persoane. Pacienii cu deficit de properdin au un rspuns umoral adecvat la vaccinul tetravalent antimeningococic (care conine antigene din serotipurile A, C, Y, W135), organismul genernd anticorpi anticapsulari ce devin eficieni n combaterea instalrii infeciei. Partea bun este c nu la toi pacienii la care este detectat deficitul de properdin se dezvolt infecii meningococice. Acest lucru a sugerat c exist i ali factori adiionali care favorizeaz predispoziia ctre aceste infecii. S-a constatat astfel c la o parte dintre indivizii cu deficit de properdin, lipsea alotipul G2m(n) (alotipul reprezentnd o secven aminoacidic de pe lanul g al moleculei de IgG2 specific fiecrui individ). Se speculeaz c aceast combinaie: deficit de properdin lipsa alotipului G2m(n) este un temei relevant care explic de ce indivizii afectai prezint un risc net superior de a se imbolnvii de infecii meningococice.

15. 7. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0900381#article Studiu clinic despre deficitul moleculelor implicate n activarea complementului pe calea lectinic. http://www.jci.org/articles/view/20309 Implicarea sistemului complement n sidromul antifosolipidic i n artrita reumatoid. http://pharmrev.aspetjournals.org/content/50/1/59.full Ageni farmacologici inhibitori ai aciunii complementului. http://emedicine.medscape.com/article/886128-overview Deficiene ale structurilor sistemului complement.

204

15. 8. Verificai-v cunotinele Urmatoarele ntrebri au un singur rspuns corect. 1. C3 convertaza: A. este o enzim proteolitic, cu activitate anafilactoid B. se poate constitui pe dou ci, rezultnd 2 compui diferii structural, dar cu aceeai funcie C. scindeaz componenta C5 n C5a i C5b D. sub aciunea sa, n membrana celulei atacate se formeaz MAC (Membrane Attack Complex) E. nici un rspuns nu este corect. 2. Afirmaia adevrat este: A. sistemul complement este una dintre componentele implicate n aprarea nespecific B. nu exist nici o bacterie care s poat scpa de aciunea sistemului complement, ntruct toate bacteriile reprezint structuri non-self care genereaz un rspuns imun C. calea clasic de activare a complementului presupune interaciunea componentei C1q cu paratopii (Fab) anticorpilor din complexele antigen-anticorp D. componentele sistemului complement se gsesc permanent n ser n stare activ, pregtite pentru a interveni ori de cte ori apare un agent patogen E. rspunsurile de la punctele A i C sunt adevrate. 3. Receptorii pentru complement: A. sunt proteine circulante n ser care se pot combina cu structurile complementului pentru a fi transportate ctre splin B. se gsesc pe toate celulele din organism C. sunt proteine prezente n membrana celulelor imunitare care intervin n multiple roluri ale sistemului complement (cum ar fi transportul eritrocitelor senescente ctre splin sau ficat) D. sunt doar de dou tipuri i prin intermediul lor, moleculele de C3b pot opsoniza celula int E. nici un rspuns nu este corect. 4. Calea comun de activare a sistemului complement: A. are ca rezultat formarea C3 convertazei B. poate fi inhibat de ctre properdin C. este amplificat sub aciunea DAF (Decay Accelerating Factor) D. debuteaz prin scindarea componentei C5 sub aciunea C5 convertazei E. toate rspunsurile sunt corecte. 5. Care dintre componente activeaz cel mai uor calea clasic? A. complexele antigen-anticorp B. bacteriile care au un coninut bogat n manoz la nivelul peretelui celular C. bacteriile ncapsulate D. celulele tumorale E. sunt corecte rspunsurile A i D.

205

Bibliografie recent Munthe-Fog L, Hummelshoj T, Honore C et al., 2009, Immunodeficiency associated with FCN3 mutation and ficolin-3 deficiency, N Engl J Med, 360, 2637-2644 Rochowiak A, Niemir ZI, Merkur Lekarski P, 2010, The structure and role of CR1 complement receptor in physiology, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20369732 Rochowiak A, Niemir ZI, Merkur Lekarski P, 2010, The structure and role of CR1 complement receptor in pathology, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20369733 Schwartz RA, Thomas I, 2010, Complement receptor deficiency, http://emedicine.medscape.com/article/1051238-overview Erdei A, Molnar E, Csomor E et al., 2004, Indirect effects of C3 on the adaptive responses, IN: The Complement system. Novel Roles in Health and Disease

16. Antigenele (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

206

Antigenul se definete drept o substan recunoscut specific de ctre sistemul imun. Ali autori consider c antigenul este o substan capabil s induc un rspuns imun (imunogenicitate) i s fie recunoscut de ctre sistemul imun (specificitate). Rspunsul imun (RI) tinde s neutralizeze i s elimine antigenul din cauza cruia s-a declanat. Antigenele (Ag) care pot declana RI sunt definite drept substane imunogene. Haptenele reprezint Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declana activarea limfocitelor (fr de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene numai dac se combin cu macromolecule carrier. Aadar, haptena este un antigen incomplet, are specificitate dar nu are imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic rezultat prin degradarea moleculei de penicilin este o hapten. Pot aprea reacii de hipersensibilitate dup cel puin al doilea contact cu aceast structur i numai n condiiile n care gazda ntr n categoria persoanelor atopice, avnd structura genetic de codificare pentru o protein carrier, care cupleaz acidul penicilinoic stimulnd astfel RI. Tolerogenele sunt Ag care declaneaz activarea limfocitelor, ns RI este inhibat activ, imediat. Orice bacterie trebuie vzut ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt imunogene (unele pot fihaptene altele tolerogene). Mecanismele de aprare mpotriva microorganismelor sunt diferite dar pot fi deduse n funcie de structura i caracterele de patogenitate ale respectivei bacterii. Acesta este un alt exemplu care demonstreaz faptul c ntre capitole diferite exist legturi importante, iar noiunile citite i nelese la timpul lor pot fi foarte utile, ulterior. Exist 4 tipuri principale de perete bacterian (tip gram pozitiv, gram negativ, tip micobacterian i spirochetal) iar patogenitatea poate varia ntre 2 extreme (toxicitate fr invazivitate i invazivitate fr toxicitate). (Figura nr. 1) Recunoaterea antigenului depinde de structurile complementare ale sistemului imun, preexistente introducerii sale. Moleculele CMH clasa I sau II pot prezenta o multitudine de peptide antigenice diferite i nu sunt specifice unui antigen n mod particular. Moleculele simple precum apa, srurile minerale i ureea sau comune majoritii speciilor (ca acizii grai, creatinina, mono- i dizaharidele, fibrina) nu sunt antigene. Pe de alt parte, moleculele mici de tipul metalelor grele (crom, nichel), responsabile de apariia hipersensibilitii, sau medicamentele, pot deveni antigene dup ce se asociaz cu diferite macromolecule.

16. 1. Clasificarea antigenelor

16. 1. 1. n relaie cu subiectul n care are loc RI Heteroantigenele sunt substane diferite de antigenele proprii animalului imunizat, provenite de la o alt specie. Imunizarea este cu att mai uor de obinut cu ct ntre specii diferenele sunt 207

mai mari i ndeprtarea filogenetic este mai important. Termenul izotip indic un caracter comun tuturor indivizilor unei specii, i, n acelai timp, corespunde unui xenoantigen pentru celelalte specii. Alloantigenele sunt prezente la unii indivizi din aceeai specie. Alloanticorpii sunt obinui prin imunizarea intra-specie sau inter-specii, dup absorbia anticorpilor anti-izotip. Autoantigenele sunt substane recunoscute prin rspunsul imun i prezente la animalul imunizat sau la om n contextul unei afeciuni autoimune. n mod normal, un individ nu declaneaz un rspuns imun mpotriva structurilor proprii. Un rspuns autoimun se poate obine prin imunizarea animalului cu substane proprii mpreun cu adjuvani sau prin injectarea unor substane self uor alterate. Idiotipul se refer la un caracter propriu prilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau anticorpilor aprui dup imunizarea fa de un antigen dat.

16. 1. 2. n relaie cu tipul de rspuns imun Antigenele timodependente Rspunsul celular sau umoral timodependent nu se poate produce la un animal timectomizat n timpul vieii intrauterine sau la natere, la oarecele nud, timectomizat sau la un subiect cu maladia di George, caracterizat prin absena congenital a timusului. Antigenele timodependente sunt n general de natur proteic dar pot fi i de natur glucidic. Ele induc un rspuns primar iniial slab, de izotip IgM, cu memorie, urmat de un rspuns secundar specific, cu IgG, IgA sau IgE. Pentru obinerea sa, sunt necesare 3 celule (o celul prezentatoare de antigen, un limfocit T helper i un limfocit B) sau 2 celule (atunci cnd LB joac i rolul de APC). Antigenele timoindependente Producerea de anticorpi fa de antigenele timoindependente nu necesit prezena LT. Antigenele sunt n general glucide cu determinani antigenici repetitivi, cu o metabolizare i o rat de degradare lent.Cele mai importante exemple sunt polizaharidele bacteriene care au aceeai structur glucidic repetitiv dispus de-a lungul peretelui celular. flagelina, antigen proteic cu determinani antigenici repetitivi, face parte din antigenele timoindependente.

16. 1. 3. n funcie de repartiia antigenelor n natur Existena anticorpilor naturali i a celor aprui n urma unui rspuns imun face necesar divizarea antigenelor n dou categorii: Antigene ubicuitare: Antigenele ABH ale grupului sanguin ABO sunt larg rspndite n natur. Prezena lor n bacteriile intestinale saprofite duce la imunizare n primele luni de via. Rspunsul imun este de tip timoindependent. Anticorpii naturali anti-A i anti-B sunt din clasa 208

IgM, uor adsorbabili de substanele A sau B salivare. Aceti anticorpi, considerai alloanticorpi n cazul transfuziilor sanguine, sunt de fapt heteroanticorpi. Antigene restrnse: Unele antigene sunt limitate la o singur specie i la un singur tip celular (un exemplu fiind antigenele sanguine Rh). Anticorpii aprui n urma rspunsului imun nu apar dect dup contactul cu hematiile unui subiect de grup diferit, dup o transfuzie sau dup pasajul hematiilor fetale n sngele femeii gravide.

16. 1. 4. n funcie de natura chimic Polizaharidele ca i partea glucidic a glicoproteinelor sunt n general antigene. Exemplele cele mai cunoscute sunt antigenele care definesc grupele sanguine (la acestea, specificitatea este dat de diferitele zaharuri) i antigenele clasice ale diferitelor microorganisme. Antigenele lipidice i datoreaz antigenicitatea cuplrii cu pri glucidice sau proteice, aa cum este cardiolipina, extras din mitocondrii, fa de care apare reacia imun n sifilis. Atunci cnd au o greutate molecular mai mare de 4.000 Da, polipeptidele sau proteinele devin antigene i imunogene. Cel mai mic imunogen cunoscut este vasopresina (greutate molecular 1.000, cu doar 9 aminoacizi). Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ubicuitare; sunt antigene i imunogene. Lipidele cuplate cu zaharuri formeaz lipopolizaharide/lipooligozaharide (LPZ/LOZ), de ex. n peretele bacteriilor Gram-negative (Neisseria spp., Salmonella spp., Vibrio spp., Brucella spp. etc). Obinerea de anticorpi anti-acizi nucleici dup imunizarea unui animal este dificil. n unele afeciuni autoimune, de tipul lupusului eritematos diseminat, se observ diferite tipuri de anticorpi anti-acizi nucleici. Compuii sintetici cu structura cea mai variat pot fi antigene dac greutatea lor molecular este suficient de mare sau dac sunt legai de proteine purttoare (carrier). Compuii sintetici au importan n determinarea imunogenicitii i specificitii antigenice. Un posibil tip de antigene este reprezentat de medicamente, responsabile de reacia alergic din patologia uman (ex. hipersensibilitatea de tip I fa de beta-lactamine). Superantigenele sunt molecule care se leag n exteriorul moleculelor MHC II i de o secven peptidic din familia TCR; aceste molecule, fr a fi recunoscute specific, acioneaz pe numeroase clone celulare T cu structur comun. Aceast proprietate a fost observat la enterotoxinele stafilococice, la nucleocapsida virusului rabiei etc. Se consider c superantigenele pot avea un rol n inducerea bolilor autoimune.

16. 1. 5. n funcie de potenialul de a stimula RI i de a reaciona cu Ac n funcie de potenialul de a stimula RI i de a reaciona cu Ac formai n cadrul acestui RI, antigenele pot fi: - Ag complete (majoritatea) care pot declana RI i pot reaciona cu Ac aprui;

209

- Ag incomplete care nu pot declana RI dar pot reaciona (in vitro) cu Ac; sunt de ex. epitopi izolai, nelegai de grupri purttoare (pot fi haptene).

16. 1. 6. n funcie de specia microorganismului implicat Antigenele bacteriene includ substane legate de corpul celular (proteina M a streptococului beta-hemolitic de grup A, polizaharidul A de la stafilococul auriu, antigenul O al bacteriilor Gram-negative, antigenul Vi de la Salmonella typhi, antigenele K i de tip K de la bacteriile capsulate, antigenele H ale bacteriilor ciliate) sau eliberate sub form de exotoxine sau enzime extracelulare (bacil difteric sau streptococ beta-hemolitic de grup A dac sunt lizogenizai, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Vibrio cholerae, Shigella shiga, Bordetella pertussis etc). (vezi i capitolele 2 i 9) Antigenele virale sunt localizate la nivelul capsidei, fac parte din nveliul extern (ex. hemaglutinine) sau constituie proteine i glicoproteine structurale. Antigenele parazitare au un caracter complex i un aspect mozaicat, datorat de ex. marii diversiti a ciclurilor biologice parazitare. La o singur specie parazitar pot fi evideniate mai multe tipuri de antigene (ex. 20 de antigene la Plasmodium falciparum). Antigenele parazitare pot fi somatice i metabolice.

16. 2. Proprietile antigenelor Dup majoritatea autorilor, antigenele prezint dou proprieti fundamentale: specificitatea i imunogenicitatea.

16. 2. 1. Specificitatea imunologic Specificitatea unui antigen este proprietatea de a fi recunoscut prin RI pe care l-a declanat i nu prin RI declanat de alte antigene, diferite. Toate tehnicile imunologice se bazeaz pe aceast proprietate fundamental. Reacia ncruciat Dei specificitatea reaciei imune este regula, exist totui i excepii, reaciile ncruciate, atunci cnd 2 antigene de origine diferit reacioneaz cu acelai anticorp (datorit unei asemnri structurale). Epitopul este o parte bine definit din structura antigenului, care intr n contact cu situsul de combinare al anticorpului. Structura corespondent sau receptorul de antigen al imunoglobulinei se numete paratop. Determinantul antigenic este un punct cald al antigenului, recunoscut n cadrul diferitelor rspunsuri imune. El corespunde mai multor epitopi centrai pe acelai loc. ntr-un Ag, determinanii antigenici sunt situai frecvent la extremiti sau n unghiurile moleculei. Un Ag prezint n general mai muli determinani antigenici, fie sub forma aceleiai structuri glucidice 210

repetitive, fie sub forma mai multor motive proteice diferite, recunoscute de ctre sistemul imun. Numrul determinanilor antigenici care pot fi recunoscui de ctre sistemul imun constituie repertoriul imun. Pe baza cunotinelor asupra structurii prii variabile a imunoglobulinelor, genomul uman codific pentru aproximativ 107-108 tipuri posibile de anticorpi diferii. n plus, mutaiile frecvente n linia B aduc posibiliti suplimentare, lrgind repertoriul imun. Acelai Ac poate recunoate mai muli determinani antigenici diferii, cu afiniti variabile. Pe de alt parte, o molecul de antigen are mai muli epitopi (10-20), valena antigenului fiind dat tocmai de numrul acestora (de ex. dac exist 16 epitopi, valena este 16 i ar putea fixa 8 molecule de anticorpi din clasa IgG, fiecare cu cte 2 situsuri combinative). Fiecare epitop este recunoscut i declaneaz un RI i sinteza de anticorpi care l recunosc doar pe el.

16. 2. 2. Imunogenicitatea Imunogenicitatea este capacitatea unui Ag de a induce un rspuns imun umoral sau celular. O hapten este o molecul mic (natural sau artificial), incapabil s induc singur un rspuns imun dar care poate fi recunoscut de componentele sistemului imun. Termenul a fost introdus de Landsteiner n 1930. Haptena are specificitate dar nu are imunogenicitate. Termenul de hapten nu este sinonim cu cel de determinant antigenic: haptena poate fi mai mic, egal sau mai mare ca epitopul. Purttorul(carrier-ul) este partea Ag cu structur proteic, n general, care prin cuplare cu haptena face ca aceasta s devin imunogen.

16. 2. 3. Alergenicitatea Unele antigene sunt capabile s induc producia de anticorpi IgE i prin aceasta s provoace o reacie de hipersensibilitate mediat umoral (tip I). Principalele alergene cunoscute sunt polenul, veninul de viper, praful de acarieni i unele fragmente sau produse de origine animal.

16. 2. 4. Asocierea cu factorii adjuvani Un adjuvant poate crete intensitatea rspunsului imun fa de un antigen la care acesta este asociat. Adjuvanii pot fi utili atunci cnd antigenele sunt eliminate rapid i nu exist timpul necesar pentru stimularea RI. Pentru ca Ag s persiste ct mai mult, ele sunt asociate cu aceste substane numite generic adjuvani (ex. hidroxid de aluminiu, saponin, adjuvant Freund etc).

16. 2. 5. Rspunsul la mitogene

211

Pe lng rspunsul imun specific, antigenele pot antrena o hipergamaglobulinemie global, stimulnd diviziunea limfocitelor B. Aceasta se observ frecvent n cursul infeciilor sau inoculrii de lipopolizaharide enterobacteriene.

16. 2. 6. Alte efecte datorate antigenelor Pot aprea i alte modificri n organismul gazd, care in de rspunsul imun. Persistena activrii macrofagelor ntr-un focar poate determina formarea granuloamelor. Acestea sunt formate (concentric, dinspre interior spre exterior) din structuri proprii i antigene fagocitate sau nu de macrofage, celule gigante multinucleate numite i celule epitelioide (formate din fuziunea macrofagelor activate), acumulare periferic de celule T, neutrofile i celule dendritice printre fibrele de colagen. n cazul tuberculozei (TB) centrul granulomului este reprezentat de cazeum. n cazul persoanelor diabetice, a persoanelor cu SIDA sau cu alte stri de imunodepresie procesul de formare a granuloamelor poate fi afectat, infecia nu trece n stadiu latent ci rmne activ. Un alt argument poate fi reprezentat de urmtoarea constatare: adminstrarea de anticorpi blocani ai TNF (de exemplu, ca tratament simptomatic n artrita reumatoid) reactiveaz rapid tuberculoza. Rspunsul organismului la agresiunea bacterian se poate solda i cu alte afectri i chiar distrugeri la nivel tisular, oc toxico-septic sau reacii de tip Schwartzman. ocul toxico septic este provocat de o producere excesiv de citokine n cursul sepsisului, n special n infeciile cu germeni Gram negativi i respectiv cu eliminare important de LPZ. Apar febr nalt, colaps circulator, CID (coagulare intravascular diseminat), necroz hemoragic i eventual afectare multipl de organ (MOF - multiple organ failure). n mod paradoxal, pacienii care i revin dup acest tip de oc pot dezvolta paralizie imun, fiind susceptibili unei infecii secundare. Reacia Schwartzman (Sanarelli-Schwartzman) poate s apar experimental atunci cnd, injectnd subcutanat o doz mic de endotoxin, rezult inflamaie uoar; ulterior, la injectarea intravenoas dup 24 de ore a endotoxinei, zona anterior inflamat devine hemoragic n cteva ore. Aceast reacie poate aprea dup infecii cu bacterii Gram negative, streptococi, mycobacterii, Corynebaterium diphteriae etc. O a doua injectare dup nc 24 de ore de la prima injectare intravenoas a endotoxinei/bacteriei poate determina colaps circulator i necroz bilateral a cortexului renal. Mai pot aprea necroze la nivelul pancreasului, epifizei, corticosuprarenalelor, tubului digestiv, tromboze i CID. La nivel microscopic apar modificri endoteliale, depozite de fibrin, acumulare de neutrofile i degranularea acestora. Titrul interferonului se coreleaz cu distrugerile tisulare, iar titrul TNF se coreleaz cu manifestrile sistemice. Aceasta reacie Schwartzman ar putea s se afle la originea rash-ul ce apare la copii cu meningita meningococic sau a ocului septicotoxic. Organismul uman reuete, de obicei, s menin o balan i nu apar agresiuni (auto-agresiuni) evidente n cursul infeciilor bacteriene. Principalele citokine imunoregulatoare sunt IL-10 si TGF. Exist i bacterii care profit tocmai de aceast balan a organismului. Hemaglutinina i adenilat ciclaza (factori de virulen ai B. pertussis) favorizeaz secreia de Il-10, ceea ce conduce la favorizarea persistena bacteriene n organism prin inhibarea TH1. O perturbare a acestei balane o poate determina omul prin tratament antibiotic (auto-administrat sau nu)

212

soldat cu distrugerea masiv a bacteriilor. Poate rezulta un rspuns inflamator sever cu distrugeri tisulare.

16. 3. Factorii de care depinde imunogenitatea 1. Structura chimic trebuie s fie ct mai diferit (provenind de la o specie ct mai ndeprtat) fa de structurile proprii [noiunea de structur strin este de fapt o noiune chimic; modificarea unui singur aminoacid din structura primar a unei molecule proteice va fi sesizat ca atare i va duce la un RI, ca i cum ar fi vorba de o structur nou (diferit, strin, modificat)]; cu ct structura chimic antigenic provine de la o specie mai ndeprtat filogenetic, cu att RI va fi mai puternic; 2. Structura trebuie s aib un grad de rigiditate (s se menin ca atare); 3. Structura trebuie s persiste suficient de mult n organism (n cazul n care respectiva structur este rapid epurat, nu va duce la apariia unui RI); n acest sens pot fi date ca exemplu anumite structuri antigenice care sunt necesare pentru prevenirea unor mbolnviri (vaccinuri), dar care nu persist suficient de mult n organismul gazd, motiv pentru care au fost asociate cu substane adjuvante (srurile de aluminiu au fost folosite n calitate de adjuvani pentru prima dat n 1950, n vaccinul Salk; diferite substane adjuvante sunt utilizate n vaccinul DTP, vaccinurile anti-HBV, anti-Haemophilus influenzae tip b etc); 4. Greutatea molecular trebuie s fie ct mai mare (de regul peste 4-5.000 Da); antigenele cu molecul mic pot stimula rspunsul imun dup cuplarea cu o protein carrier; 5. Structura chimic trebuie s fie ct mai complex (cele mai imunogene sunt proteinele iar cele mai puin imunogene sunt lipidele i acizii nucleici); 6. Doza de antigen, calea de administrare, momentul administrrii antigenului etc. sunt ali factori de care depinde imunogenitatea. Toi aceti factori sunt valabili n contextul CMH al gazdei care urmeaz s reacioneze fa de respectivul antigen.

16. 4. Povestiri adevrate 16.4.1. Antigene ... reacii ... aprare ... Dar care ar fiutilitatea clasificrii antigenelor? Diferite categorii de antigene vor dirija diferit rspunsul imun i vor ncearca s l pcleasc, fiecare in stil propriu. Prima linie de aprare a organismului este reprezentat de piele i mucoase, de acizii grai secretai la nivel dermic (toxici pentru majoritatea bacteriilor), de micrile cililor traheali, de fluxul urinar, de pH-ul acid stomacal sau vaginal etc. Bacterile comensale pot limita invazia bacteriana prin producerea unor proteine antibacteriene numite colicine. A doua linie de aprare este reprezentat de rspunsul imun nnscut (innate), fr intervenia LT sau LB. Aciunea este ndreptat mpotriva aa-ziselor Ag microbiene comune, reunite sub denumirea de PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) i cuprinde molecule ce n literatura anglo-saxon sunt grupate sub denumirea de patern recognition molecules (ex: colectine, ficoline, TLR-Toll like receptor, receptorul manozei, proteinele NOD, proteina A din 213

surfactantul pulmonar, complementul, PCR - proteina C reactiv). Spre exemplu, LPZ-ul bacteriilor Gram negative este unul dintre cei mai importani reprezentani ai PAMPs. LPZ se cupleaz cu TLR4, activnd astfel raspunsul imun, cu stimularea secreiei de TNF alfa, Il-1, creterea adezivitii celulare, secreia de peptide i amine vasoactive i scderea consecutiv a tensiunii arteriale. Bacteriile Gram pozitive posed acid lipotechoic i peptidoglicani (polizaharidele nu au suficient potenial imunogen). TLR-urile implicate sunt de data aceasta 1, 2 si 6. n recunoaterea lipoproteinelor mycoplasmelor, mycobacteriilor i spirochetelor intervin LBP i TLR4. TLR4 se mai numete i CD14. Cum se prezint aceste pattern recognition molecules? Majoritatea sunt exprimate la suprafaa celulelor organismului (in special de la nivelul porilor de intrare) i sunt ndreptate mpotriva patogenilor extracelulari. Dar exist i molecule pentru patogenii care au ptruns n celul, care se afl nu la nivelul membranei celulare ci la nivelul fagozomilor (TLR 9) sau solubili n citosol. (Figura nr. 2). Listeria spp., Helicobacter pylori i Salmonella spp. genereaz PAMPs intracelulare. (Film nr. 1) http://www.youtube.com/watch?v=2LchUweyRx0 16.4.2. Rspuns imun nespecific ... specific ... Rspunsul nespecific presupune: -activarea complementului pe calea alternativ (bacteriile Gram negative sunt succeptibile la liza iniiat de complexul C5b-9) -eliberarea de citokine proinflamatorii, care cresc proprietiile adezive ale sistemului endotelial (C5a, eliberat n cadrul formrii complexului litic, funcioneaz pe post de chemoatractant pentru neutrofile i mastocite), i leucotriene care vor crete permeabilitatea. Macrofagele elibereaz TNF i Il-1, care mpreun cu chemokinele CCL2, CCL3 i CXCL8 direcioneaz recrutarea de populaii leucocitare. TNF, IL-1 i IL-6 iniiaz rspunsul inflamator acut i cresc producia de componente ale complementului. PCR opsonizeaz bacteriile favoriznd fagocitoza acestora. IL-12 i IL-18 stimuleaz NK sa produca IFN gama, care va activa macrofagele) -genereaz semnale care influeneaz si rspunsul imun specific (Celulele dendritice joac un rol crucial n activarea LT. Activarea acestora n periferie induce migrarea lor la nivelul nodulilor limfatici, unde crete exprimarea MHC, a moleculelor co-stimulatoare: CD40, CD80, CD86 i a citokinelor ce induc diferenierea LT. Contactul PAMPs-TLR crete producia local de IFN gama, IL-12 i IL-18 care vor stimula diferenierea LT, n special a TH1) Rspunsul specific se bazeaz pe activitatea LB i a LT. Are loc un proces complex de interacii celulare cu rol de amplificare a semnalizrii iniiale i de evitare a rspunsului imun la un semnal fals. LB au n principal rolul de a secreta Ac i de a pstra o memorie a agresiunilor infecioase. Anticorpii pot fi suficieni numai dac patogenitatea este indus de o singur toxin sau molecul de adeziune iar Ac produi sunt directionai mpotriva acestei molecule cu rol patogen. Anticorpii opsonizani sunt importani pentru rezistena mpotriva bacteriilor extracelulare. Bacterile patogene pot eluda rspunsul n anticorpi, aa cum se petrece n cazul Neisseria gonorrhoeae, de aceea omul se poate infecta n mod repetat cu acest microorganism, ns n sngele su s nu se gseasc dovezi ale imunitii protective. (Film nr. 2) http://www.youtube.com/watch?v=23lSlwzXnKM 214

16.4.3. Dar alte modaliti de eludare a rspunsului imun? Antigenul O, avnd un lan polizaharidic lung, poate fixa complementul la distan de bistratul lipidic, astfel nct acesta nu ii poate exercita aciunea litic. E. coli, Salmonella spp. i Pseudomonas aeruginosa fixeaz complementul dar l taie rapid de pe suprafaa celular. Alte microorganisme exploateaz mecanismele fiziologice ale organismului gazd pentru a pcli sistemul imun. Cnd C3b s-a ataat de o membran celular poate interaciona cu factorul B, care va amplifica activarea complementului sau poate interaciona cu factorii H i I, care vor inhiba complementul. Prezena acidului sialic favorizeaz interacia complementului cu factorii H i I iar celulele organismului uman reprezint un mediu bogat n acid sialic. Prin acest mod se apr Neisseria meningitidis, E. coli K1 dar i streptococii beta hemolitici de grup B. Proteina M a steptococcilor de grup A funcioneaz ca un acceptor al factorului H (s nu uitm c aceti streptococi posed i o gen ce codific sinteza unei C5a proteaze). 16.4.4. Leucocite ... macrofage ... fagocitoz ... Totui, mpotriva majoritii bacteriilor este neaprat nevoie de intervenia fagocitelor. Fagocitele elimin cea mai mare parte a bacteriilor prin chemotaxie, adeziune, internalizare i apoptoz. Activarea optim a macrofagelor este dependent de TH1 (CD4+). Macrofagul este principala celul prezentatoare de antigen, dar are i rolul de a secreta citokine, enzime, molecule ale complementului, are efect procoagulant, produce specii reactive de oxigen i NO care sunt foarte toxice, i endociteaz bacterii i fungi. Rolul su n ansamblu este de a iniia, propaga, preveni, supresa i finaliza rspunsul imun. Macrofagele se dezvolt din monocitele circulante (ca i celulele dendritice mieloide i osteoclastele) i pot exista sub form ciculant sau sub form tisular. Citokinele eliberate de TH1 stimuleaz inflamaia i activitatea antimicrobian a macrofagelor, n timp ce citokinele eliberate de TH2 induc o prezentare antigenic eficient ctre LB. TGF beta, corticosteroizii i IL-10 induc un fenotip antiinflamator. Macrofagele internalizeaz patogenii, utiliznd o varietate de receptori (receptorul pentru LPZ, TLR, beta-glucanR, manoseR, receptorii pentru complement CR1, CR3, CR4). (Film nr. 3) http://www.youtube.com/watch?v=CHrk0ofcLDo Ataarea de antigenele bacteriene a macrofagelor se poate face direct, prin intermediul TLR, manose receptor (MR), scavenger receptors i dectin-1b sau indirect, dup opsonizarea bacteriei cu Ac, fibronectin, vitronectin sau complement, prin intermediul CR1, CR3, CR4, MBL, integrine, FcRI, FcRII, FcRIII. Macrofagele tisulare (alveolare, celulele Kupfer etc.) ofer o oarecare protecie, ns necesit intervenia altor fagocite (leucocite, neutrofile) care vor fi atrase n focarul inflamator de componente bacteriene, de componenta C5a a complementului, de chemokine i citokine sintetizate de macrofagele din esutul respectiv i de unele celulele epiteliale. Streptococcus pyogenes va determina leziuni acute i atragerea la nivelul focarului infecios n special a neutrofilelor, n timp ce Mycobacterium tuberculosis determin leziuni cronice i va atrage macrofage, LT i celule multinucleate derivate din macrofage. Dup cum tii, macrofagele produc specii reactive de oxigen (foarte toxice pentru microorganism, dar i pentru celulele organismului gazd). O specie reactiv de oxigen se 215

formeaz n principal pe calea anionului superoxid. O astfel de substan are adugat un electron, care o va face instabil i care va determina un ir de reacii n lan n organism. Studii recente pe neutrofile au demonstrat c speciile reactive de oxigen sunt bactericide i indirect (prin inducerea unui flux de Kn fagozomi) activeaz producerea de proteaze. NO se formeaz din L-arginin sub aciunea NO-sintetazei, care poate fi indus de IFN i TNF, NO fiind tot o specie reactiv de oxigen, format pe alt cale dect a anionului superoxid. Dar exist i metode oxigen-independente prin care fagocitele pot distruge bacteriile, de exemplu, prin intermediuil proteinelor cationice. Defensina din granulele neutrofilelor se inser ntre lipidele membranei bacteriene i creaz un canal transmembranar care va duce la liza respectivului microorganism. Microbii sensibili la defensin sunt Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Cryptococcus neoformans. Catepsina G i azurocidina sunt active pe bacteriile Gram negative. Fierul este foarte important pentru dezvoltarea bacteriilor intracelulare, neutrofilele ngreunnd accesul microorganismelor la acest element. ns, organismul gazd are nevoie crescut de fier de vreme ce este co-enzim pentru generarea NO i pentru lanul respirator. E foarte important de reinut c neutrofilul are o via scurt dar este foarte agresiv cu bacteriile, n timp ce macrofagul are o via mai lung, ns neactivat, este un ... prieten al bacteriilor. Cel mai important factor de activare a macrofagelor este IFN, iar acesta este produs n cele mai mari cantiti de TH1 (CD4+). Exist diferite metode prin care patogenii pclesc aprarea fagocitar. Listeria monocytogenes, Shigella spp. i Burkholderia pseudomallei elibereaz enzime care distrug membrana fagozomilor, mpidedicnd asfel unirea cu lizozomii i formarea complexului fagolizozom. M. leprae i Salmonella spp. se ndreapt spre celulele Schwann, hepatocite i celulele epiteliale, care au o capacitate mai redus de aprare. Streptococcus pneumoniae i C. neoformans au un nveli protector, care inhib ataarea macrofagelor de aceste bacterii. Stafilococii posed catalaz, care scade stresul oxidativ. M. leprae se nconjoar cu un glicolipid care absoarbe radicalii liberi. Micobacteriile, n general, elibereaz lipoarabinoman, care scade eficiena IFN n activarea macrofagelor. Celulele gazdei infectate cu Salmonella enteritidis, M. tuberculosis sau Chlamydia trachomatis nu ii exercit corespunztor funcia de prezentare a antigenelor. Yersinia spp. induce apoptoza celulei gazd. Dup internalizarea anumitor antigene urmeaz expunerea acestora la suprafaa APC. Recunoaterea de ctre TCR (T cell receptor) a Ag impune ca acest Ag s fie legat de o molecul MHC (major histocompatibility complex). Ag endogene (peptide) vor fi prezentate pe MHC I, iar Ag exogene (peptide derivate din proteine extracelulare, care au ajuns la nivelul APC prin fagocitoz sau endocitoz, aa cum este cazul antigenelor bacteriene) pe MHC II. Genotipic, MHC I sunt codificate de genele HLA-A, HLA-B, iar MHC II, de HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR. CD1 este o molecul asemntoare MHC I care prezint antigene lipidice (M. tuberculosis, H. influenzae). (Film nr. 4) http://www.youtube.com/watch?v=m0ShUtbPllY 16.4.5. Intervenia LT ... LTc (CD8+) pot elibera microorganismele care s-au ascuns la nivelul celulelor gazd. S-a demonstrat c prbuirea sistemului MHC I la oareci duce la lipsa de rspuns din partea LTc i consecutiv, aceti oareci devin susceptibili la infecia cu M. tuberculosis. Tendinele actuale sunt de a gsi un vaccin care s stimuleze formarea LTc (Figura nr. 3). S-a mai observat c pe 216

lng dependena activrii LTc de prezentarea MHC I-Ag, mai exist i o dependen de activitatea litic a fagozomilor. TCR (fie ei situai pe LT CD4+ sau CD8+) sunt de 2 tipuri: cu lanuri i cu lanuri . Aceste 2 tipuri difer prea puin ca structur i mai mult ca distribuie. Consecutiv, cele 2 specii de receptori vor avea funcii diferite. TCR se gsesc la nivelul sngelui periferic i a timocitelor, iar TCR la nivelul pielii, mucoaselor, aparatului digestiv i reproductor. De aceea s-a ridicat ipoteza conform creia LT n care predomin TCR s nu aib neaparat nevoie de prezentare MHC-Ag pentru activare (Unele LT recunosc fosfoliganzi derivai din M. tuberculosis care le determin activarea). Superantigenele activeaz direct LT, fr a mai fi nevoie de prezentarea lor de ctre un APC pe un MHC. Stafilococcii i streptococcii posed 21 de superantigene, probabil cu rol adaptativ. S ar putea ca motivul s fie o ct mai rapid depleie de LT a gazdei i inhibarea producerii de anticorpi. Certa e ns toxicitatea determinat de eliberarea masiv de citokine. TSST-1 (toxic shock syndrom toxin-1) aparinnd stafilococcilor este un exemplu de superantigen. i proteina M a Streptococcus pyogenes formez un complex cu fibrinogenul, complex care se leag de integrinele de pe neutrofile, determinnd eliberarea n cantiti mari a mediatorilor inflamatori. Dac un antigen convenional activeaz 0,01-0,1% LT, superantigenele activeaz 5-30% din populaia LT. 16.4.6. TSS ... HSP ... utilitatea antigenelor ... Datele din USA referitoare la TSS (toxic shock syndrome) publicate ntr-un articol n 2010 relev o incidena a infeciilor GAS (group A streptococci) de 1,5-5,2o/oooo/an, din care 8-14% au dezvoltat TSS, cu o mortalitate de 30-70%. O epidemie de varicel crete riscul de TSS la 62,74o/oooo. La 50% din pacienii cu TSS au avut afectri severe de esuturi moi, precum fasciita necrozant, miozit, celulit. (1) HSP (Heat shock proteins) sunt proteine comune att organismelor umane, ct si bacteriilor i au fost denumite astfel datorit faptului c s-a remarcat creterea expresiei acestora n condiii de temperaturi ridicate sau fa de ali factori de stres (ex. un proces infecios). HSP au rol n asamblarea, formarea structurii cuaternare a proteinelor i n transportul altor molecule. n timpul unei invazii bacteriene, sistemul imun se ndreapt i mpotriva HSP, att a celor autohtone, ct i a celor bacteriene. HSP activeaz sistemul imun prin intermediul CD91, CD40, CD14 i anumii TLR. Datorit asemnrii structurale ntre cele 2 tipuri de HSP se presupune c aceste proteine ar avea un rol important n generarea bolilor autoimune. Tot timpul ne aflm sub influena antigenelor bacteriene. Unele asigur sau nlesnesc procese fiziologice, aa cum se ntmpl la nivelul intestinului gros, altele, prin competiie ne protejeaz de germeni viruleni, aa cum se ntmpl de ex. la nivelul foselor nazale. Dar exist i teoria igieniei, neconfirmat i nu neaprat adevarat sau aplicabil tuturor microorganismelor, conform creia i infecia uoar i tranzitorie (nu boala) cu bacterii patogene este de folos. Alergiile (strile de hipersensibilitate), bolile inflamatorii ale intestinului subire i bolile autoimune ar fi generate de un dezechilibru imun generat de igien, vaccinuri i antibiotice. Ideea este nu de a elimina aceste 3 modaliti clasice de aprare mpotriva infeciilor, ci de a afla cum, cnd i ct trebuie folosit fiecare arm i de a cunoate ct mai bine adversarul mpotriva cruia o folosim. 16.4.7. oc toxico septic sau alergie? Streptococ sau Stafilococ? 217

Pacienta n vrst de 25 ani, se prezint la camera de gard dup 2 zile de rash cutanat i o durere surd difuz n cadranul stng inferior al toracelui. n urm cu o sptmn a fost diagnosticat cu faringita streptococic i a primit amoxicilin. Sa prezentat dup 3 zile la serviciul de dermatologie datorit rash-ului, unde i s-a pus diagnosticul de alergie la amoxicilin. Prin urmare, a fost ntrerupt tratamentul cu amoxicilin i s-a recomandat prednison. Este corect atitudinea dermatologului? Argumentai. La efectuarea anamnezei pacienta acuz grea, vrsturi, febr, fatigabilitate, dezorientare i durerea surd menionat mai sus. Neag s fi avut sngerri (melen, hemoptizie, hemoroizi). Examen i analize: TA=65/35 mmHg, AV=110-120bpm, FR=20/min, T:39,7C, SO2=93%. La examenul fizic: pacienta este palid, cu starea general alterat. Orofaringele clar, fr exsudate sau eritem, crepitaii difuze la auscultaia pulmonar, fr sufluri supraadugate sau zgomote patologice cardiace, abdomen suplu, mobil cu respiraia. n tabel sunt listate determinrile biochimice i hematologice anormale (comparativ, valorile normale). (Tabelul nr. 1) Se efectueaza o radiografie (Rx) cardio-pulmonar, care este n concordan cu explorrile paraclinice i cu examenul clinic, punndu-se diagnosticul de etap, ARDS (adult respiratory distress syndrome). (Figura nr. 3) La ntoarcerea de la radiologie, pacienta devine iar hipotensiv, tahicardic, tahipneic; febra se menine n ciuda adminitrrii de acetaminofen. Se decide intubarea pacientei datorit insuficienei respiratorii ce se agraveaz, se recolteaz probe de snge, urin, exsudat faringian i se face o puncie lombar. Se solicit titrul ASLO i TSST-1. Se iniiaz tratament cu clindamicin, vancomicin i meropenem iar pacienta este transferat n serviciul de ATI. Comentarii explicative n 1993 s-a ajuns la un consens privind TSS produs de streptococi, care presupune stabilirea diagnosticului pozitiv dac sunt ndeplinite concomitent urmtoarele condiii: 1) Izolarea streptococcilor de grup A (GAS) dintr-o zon n mod normal steril (snge, fluid cerebro-spinal, pleural, peritoneal) 2) Hipotensiune 3) 2 sau mai multe dintre urmtoarele: Insuficien renal (creatinina>2mg/dL sau valori de 2 ori mai mari dect n mod normal la pacienii cu boal renal) Coagulopatie Enzime hepatice crescute ARDS (adult respiratory distress syndrome) Rash maculo-eritematos Necroz de esut moale. Introducerea vaccinurilor antivaricel a sczut incidena TSS de la 27% n 1993-1995 la 2% 19952001. Utilizarea de medicamenteantiinflamatorii nesteroidiene (AINS) se pare c favorizeaz TSS. Un articol din 1995 a Chuang si colab. arat c 92% din pacienii cu TSS folosiser anterior AINS. Mai mult, AINS pot masca simptomatologia ocului toxico-septic. Diferenierea ntre TSS stafilococic i steptococic este greu de fcut. Pacienii cu infecie stafilococic pot prezenta diaree, vom, eritrodermie generalizat, insuficiena conjunctival, 218

mialgie sever. Pacienii cu infecie streptococ pot prezenta necroz de esut moale (celulit, fasciit, abces, miozit), simptomatologie influenza-like, varicel n antecedente n cazul celor nevaccinai. n cazul TSS stafilococic, se pare c toxina TSST-1 este responsabil de 75% din cazuri. Pentru TSS steptococic, proteina M este responsabil de 75% cazuri iar SPEs A, B, C sunt responsabile de circa 13% (SPEs = Streptococcus pyogenes exotoxins). Specificitatea determinrii Ac anti TSST-1 este de 90%, n timp ce pentru determinarea titrului proteinei M nu exist teste fiabile. Se poate folosi n schimb titrarea ASLO n dinamic. n ciuda ambiguitii privind etiologia, tratamentul rmne acelai: cristaloizi i ageni inotrop pozitiv contra ocului hipovolemic, cu monitorizarea TA i a PVC antibiotice: penicilin, vancomicin i clindamicin (penicilin sau alte beta-lactamine pentru streptococ; vancomicin sau peniciline sintetice pentru stafilococ; clindamicina s-a introdus pentru c are un efect mai ndelungat dup administrare, faciliteaz fagocitoza bacteriei, inhib liza celulelor bacteriene cu eliberarea consecutiv suplimentar de citokine n circulaie). terapii adjuvante (nc n stadiu de cercetare): =imunoglobuline administrate intravenos, O2 hiperbar, Ac antiTNF. Evoluia pacientei: Statusul respirator s-a mbuntit, cu detubare la 48 de ore. Titrul Ac anti TSST-1 s-a pozitivat dup 2 sptmni, ASLO a rmas normal. S-a trecut pe antibiotice orale, funcia renal i WBC au revenit uor la normal, s-au efectuat radiografii toracice zilnice, care au confirmat i rezolvarea ARDS. Pacienta a fost externat dup 14 zile de spitalizare. Diagnosticul final: oc toxico-septic stafilococic, probabil post-pneumonic.

16. 5. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0014374 Analogii alfa-galactozil ceramidului - candidai pentru terapia antiinflamatorie http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0015225 Antigenele cuplate cu lipozomi - posibile aplicaii n fabricarea vaccinurilor http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21178114 Eliberarea de oxid nitric n cadrul infeciilor virale poate influena funcia de prezentare antigenic ulterioar http://www.biomedcentral.com/1746-6148/6/57 Modificrile genetice i antigenice H5N2 - impactul asupra supravegherii epidemiologice http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0015227 Injectarea unor antigene ale E. coli n celulele umane, cu scop curativ

16. 6. Verificai-v cunotinele 219

La ntrebrile urmtoare, alegei rspunsul corect. 1. Care dintre urmtoarele microorganisme au toxicitate dar nu i invazivitate? a) Klebsiella pneumoniae i Vibrio cholerae b) Corynebacterium diphteriae i Vibrio cholerae c) Escherichia coli i Salmonella typhi d) Corynebacterium diphteriae i Mycobacterium tuberculosis 2. Care este rspunsul corect? a) Administrarea ndelungat de antibiotice nu afecteaz flora intestinal. b) Administrarea de antibiotice fr realizarea i respectarea antibiogramei, fr a ine cont de CMI i CMB nu determin fenomenul de rezisten la antibiotice. c) Cnd flora normal este distrus pot aprea infecii cu Candida spp. sau Clostridium difficile. d) Este mai corect s administrm probiotice (de exemplu lactobacilii) i o doz foarte mare de antibiotic n cazul unei infecii localizate, dect s drenm chirurgical respectivul abces sau flegmon. 3. Ce este un granulom? a) o marc a RIC mpotriva bacteriilor intracelulare b) un tip de modificare anatomo-patologic acut c) o marc a RIU mpotriva bacteriilor extracelulare d) o marca a RIC mpotriva bacteriilor extracelulare. 4. Gsii afirmaia greit a)Haptenele reprezint Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declana activarea limfocitelor b) Tolerogenele sunt Ag care declaneaz activarea limfocitelor, ns RI este inhibat activ, imediat. c) Idiotipul se refer la un caracter propriu prilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau anticorpilor aprui dup imunizarea fa de un antigen dat d) Autoantigenele sunt substane diferite de antigenele proprii animalului imunizat, provenite de la o alt specie. 5.Iat 3 afirmaii: (1) cu ct structura chimic antigenic provine de la o specie mai ndeprtat filogenetic, cu att RI va fi mai slab; (2) structura chimic trebuie s fie ct mai simpl i (3) greutatea molecular trebuie s fie ct mai mare (de regul peste 4-5.000 Da). Alegei varianta corect dintre urmatoarele: a) (1) i (3) sunt false b) (1) i (2) sunt adevrate c) doar (3) este adevrat d) doar (2) este fals

17. Rspunsul imun umoral i celular (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)
220

n momentul n care un Ag ptrunde pentru prima dat n organism, sistemul imun nu posed dect un numr redus de limfocite T sau B specifice recunoaterii poriunilor peptidice (epitopilor) acestui Ag. Astfel, dintr-un repertoriu preexistent de limfocite, Ag le va selecta numai pe cele care sunt capabile s recunoasc i s se combine cu Ag. n acelai timp (cu mici excepii) nu exist nici o celul sau molecul capabil s elimine Ag sau microorganismul care l poart, motiv pentru care este necesar apariia limfocitelor T citotoxice, secretoare de citokine (imunitate celular) sau a plasmocitelor anticorp-secretante (imunitate umoral).

17. 1. Definiia i caracteristicile rspunsului imun Rspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc dup introducerea unui Ag, i anume: activarea limfocitelor, eliberarea a diverse molecule, multiplicarea celulelor specifice, producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili s se fixeze pe Ag i s participe la eliminarea acestuia (direct sau indirect). Dup acest prim contact (ca i n cursul imunizrii consecutive), sistemul imun produce limfocitele T i B de memorie, capabile s reacioneze mai rapid, mai amplu, cu ocazia unei reintroduceri ulterioare a aceluiai antigen. Aa cum a fost menionat anterior, principala caracteristic a imunitii este specificitatea. Pentru a sugera ct de specific este rspunsul imun, o modalitate este de a discuta despre potrivirea dintre cheie i broasc, ntre structurile Ag i Ac. Acest exemplu are un grad de sugestivitate, dar este incomplet n comparaie cu realitatea. O alt modalitate de a sugera specificitatea rspunsului imun ar fi potrivirea dintre mna aezat n faa oglinzii i imaginea din oglind. Probabil, o modalitate i mai sugestiv ar fi cea discutat la cursurile de imunologie din INCDMI Cantacuzino: rspunsul imun este att de specific, nct dac ne-am nchipui c Ag este reprezentat de o pagin dintr-un manual, dac am schimba nu o fraz, un rnd, un cuvnt ci chiar o singur liter ntr-un cuvnt de pe o anumit pagin, aceast schimbare ar fi sesizat de sistemul imun iar Ac produi se vor potrivi cu aceast pagin n care a fost schimbat o singur liter. Totui, aa cum am menionat la punctul 16. 2. 1., exist i reacii ncruciate. O alt caracteristic foarte important a RI, n condiii fiziologice, este capacitatea de a discerne ntre self i non-self i de a reaciona numai fa de moleculele care ndeplinesc definiia de antigen (vezi i MHC/CMH). Rspunsul imun poate fi de tip umoral, mediat prin anticorpi sau de tipcelular, mediat de ctre celule. n cazul antigenelor timodependente (cea mai mare parte a antigenelor), se dezvolt un rspuns imun celular specific prin LT citotoxice i unul umoral specific prin anticorpi. Diferite citokine pot activa sau inhiba, n mod preferenial, unul sau ambele tipuri de rspuns. n cazul antigenelor timoindependente, rspunsul imun este umoral. n continuare vor fi prezentate n mod schematic aceste dou tipuri de rspuns imun umoral i celular. 221

17. 2. Rspunsul imun de tip umoral Rspunsul imun umoral (RIU) const n producerea de Ac specifici i este transferabil pentru o perioad de timp (3-6 sptmni), prin ser, la un alt animal. Imunitatea umoral intervine n distrugerea bacteriilor extracelulare, neutralizarea virusurilor, inhibarea toxinelor. Natura antigenelor fa de care se dezvolt un rspuns imun umoral include poliozide, proteine, substane sintetice, rareori lipide i acizi nucleici sau anticorpi (n cazul proceselor autoimune). Unele antigene (alergenii) determin un RI cu anticorpi de tip IgE. Introducerea antigenului pe cale subcutan, intramuscular sau intravenos determin un RIU cu producerea de IgM i/sau IgG iar administrarea pe cale oral determin un rspuns preferenial cu IgA. Dup o prim administrare intravenoas, la un subiect care nu a mai venit n contact cu respectivul antigen, Ag molecular parcurge urmtoarele etape succesive: 1. descreterea cantitativ rapid, datorat difuziei n spaiile extravasculare; 2. dispariia lent, datorat catabolismului propriu al antigenului; 3. descreterea rapid dup 8-10 zile, ca urmare a eliminrii formaiunilor imune (complexele imune) rapid fagocitate. n cazul antigenelor particulate (celule, bacterii, virusuri) sau al antigenelor sub form de agregate, eliminarea este mult mai rapid, prin procesul de fagocitoz (care antreneaz o imunizare mai precoce). n cazul utilizrii cii subcutanate, antigenul rmne, n parte, la locul de inoculare. Adugarea unui adjuvant menine antigenul n acest loc i favorizeaz o stimulare imunologic de durat (eventual i formarea unui granulom inflamator). n urmtoarele ore, antigenul migreaz n sinusurile subcapsulare ale ganglionilor corespunztori anatomic, apoi n zona medular i n final (24 de ore) ajunge n regiunea cortical, la periferia foliculilor primari. n interiorul organelor limfoide, antigenul se regsete n celulele fagocitare. n prezena anticorpilor preformai i a sistemului C', unele antigene se localizeaz la suprafaa celulelor dendritice intrafoliculare din centrii germinativi. Contactul cu antigenul antreneaz importante modificri histologice ale organelor limfoide: centri germinativi se dezvolt n foliculi i persist mai multe sptmni; n paralel apar att imunoblatii i plasmocitele, ct i limfocitele de memorie; dup 3-4 zile se pot detecta limfocite cu anticorpi membranari, apoi celule care sintetizeaz anticorpi serici. 17. 2. 1. Rspunsul imun primar (RIP) naintea primului contact cu un anumit antigen, nu exist anticorpi potrivii fa de acesta. Stimulul antigenic primar selecteaz LB care au receptori pentru respectivul Ag. Dup primul contact cu Ag se dezvolt RIP, cu urmtoarele caracteristici: Latena: reprezint perioada de la contactul cu Ag pn la prezentarea structurilor Ag ctre LB (n conjuncie cu moleculele MHC); variaz n funcie de natura antigenului, calea de administrare i doza administrat; dureaz ntre 2 i 3 zile;

222

 Creterea logaritmic: (sintez activ de Ac, de ctre plasmocite) dureaz circa 3 zile; n timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacii Ag-Ac; urmeaz o faz de stagnare (cteva zile), timp n care titrul anticorpilor serici se menine relativ constant; Ulterior are loc scderea progresiv a titrului anticorpilor serici. De regul, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac dup 5-14 zile de la stimulul antigenic primar. Natura anticorpilor: examinarea claselor de anticorpi produi arat c primii anticorpi care apar sunt de tip IgM (cei din clasa IgG apar cteva zile mai trziu iar nivelul lor crete pe msur ce nivelul IgM scade); n urmtoarele 2-3 sptmni, n ser predomin anticorpii de tip IgG; n urmtoarele luni, eventualii anticorpi care persist sunt de tip IgG. 17. 2. 2. Rspunsul imun secundar (RIS) Rspunsul imun secundar apare dup al doilea contact cu acelai antigen (sau dup contacte ulterioare). RIS are urmtoarele caracteristici: poate aprea chiar i dup administrarea unor doze destul de mici de antigen; latena este redus la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de cretere logaritmic; anticorpii sunt de tip IgG; titrul Ac produi este mult mai nalt; persistena acestora este mai lung (Ac produi se menin timp mai ndelungat, luni de zile). Diferena dintre RIP i RIS este datorat n primul rnd existenei limfocitelor cu memorie. Dup eliminarea Ag, n organism continu s circule celule cu memorie, reacia imun la al doilea contact cu acelai Ag avnd caracteristicile de mai sus. Memoria imun se stabilete din timpul RIP i este specific. Determinarea claselor IgM i IgG are o dubl importan practic: face posibil distincia ntre o afeciune recent i una mai veche i permite recunoaterea unei infecii congenitale (cu anumite excepii). Cunoaterea caracteristicile RIP i RIS are importan practic. Ne permite s nelegem i motivul pentru care reaciile Ag-Ac trebuie fcute, de regul, n dinamic. 17. 2. 3. Succesiunea de evenimente n producerea anticorpilor Dup ptrunderea antigenului i recunoaterea acestuia ca non-self urmeaz fagocitarea i prelucrarea de ctre celulele prezentatoare de antigen care sunt reprezentate n principal de celulele dendritice foliculare, macrofage i limfocitele B. APC, prin IgM i IgD membranar, posed tot ce este necesar pentru recunoaterea epitopilor antigenici (diversitatea rearanjrii genice demonstreaz un repertoriu bogat de limfocite B, estimat la 107 posibiliti; mutaia somatic conduce la posibiliti mult mai mari de diversificare). Pentru majoritatea antigenelor (n special cele de natur proteic), activarea i etapele urmtoare ale RIU necesit prezena limfocitelor Th CD4+ (cu intervenia TCR, APC cu expunerea pe MHC II de peptide antigenice, molecula CD4 i moleculele de aderen).

223

Dup contactul cu antigenul i activarea complet, LTh se vor numi LThp (primitive), care ulterior vor ncepe proliferarea i sinteza de IL2. Prin stimulri autocrine repetate LThp se vor diferenia n LTh0 i apoi n LTh1 sau LTh2 n funcie de mediul citokinic din jur i de citokinele produse (vezi i 11.3.1.). Limfocitele Th2 sunt reprezentative pentru RIU (Figura nr. 1). LTh2 secret IL-2, IL-4, IL-5 i IL-6, care activeaz LB i stimuleaza mecanismul de switch izotipic n genomul LB. Acest switch se realizeaz prin rearanjarea ADN-ului, pentru sinteza Ac diferii structural, dar cu aceeai specificitate pentru antigen. Limfocitele B pot fi activate i direct, n cazul antigenelor timoindependente de origine polizaharidic, cu epitopi repetitivi. Aceasta se realizeaz prin formarea unor puni ntre receptorii de suprafa i determin redistribuia Ig pe suprafaa membranei celulare. n lipsa interleukinelor produse de LT, activarea LB este limitat la sinteza de IgM, fr comutarea spre IgG. Prima etap const n activarea limfocitelor B din stadiul G0 al ciclului celular spre stadiul G1 (celula sintetizeaz ARN i crete n volum); stimulul este reprezentat de contactul cu antigenul. IL-4, secretat de limfocitele Th, poate transforma limfocitele B din stadiul G0 i G1 i crete expresia moleculelor MHC. n acest stadiu LB activat exprim molecule noi: CD23, CD34 i CD40. Al doilea timp corespunde proliferrii policlonale a celulelor B activate, care trec din stadiul G1 n fazele S i M. Aceast faz necesit prezena IL-2 i IL-5. Ultima faz const n diferenierea n celule productoare de anticorpi - plasmocite; secreia de IL-6 ajut procesului de maturizare iar diferitele interleukine permit orientarea izotipic spre sinteza unei clase particulare de imunoglobuline. Aadar, exist o intens colaborare ntre LB, LTh i APC att prin contact direct cu ajutorul unor molecule de adeziune, ct mai ales prin intermediul citokinelor, adevrai mesageri (hormoni) ai imunitii. 17. 2. 4. Teoria seleciei clonale Teoria seleciei clonale a fost propus n jurul anului 1950 de ctre McFarlane Burnet. Aceast teorie afirm c la nivelul sistemului imun exist un numr imens de capi de clone de limfocite, fiecare dintre aceti capi de serie corespunznd unei structuri antigenice (unui anume epitop); n cadrul aceleai teorii, Burnet a fcut estimarea c n lume ar exista circa 100 de milioane de tipuri de epitopi diferii. Clona, aa cum se cunoate, este o populaie de celule identice din punct de vedere genetic, descendente ale unei singure celule mam. Toate celulele unei anumite clone au la suprafa, molecule identice cu structur imunoglobulinic; aceste imunoglobuline au rol de receptori pentru structurile antigenice (pentru fiecare antigen diferit exist un receptor diferit). Structurile antigenice selecteaz din acest numr imens de limfocite cap de serie pe acelea care au receptori complementari (configuraie spaial etc) i astfel determin proliferarea i diferenierea lor n celule productoare de anticorpi. Celulele unei clone au aceeai specificitate pentru structura antigenic datorit creia au proliferat. Clonele de limfocite care ar putea s produc anticorpi fa de structurile proprii (self) sunt reprimate n timpul vieii intra-uterine i numai celelalte clone pot ajunge la maturitate. n lipsa acestei represii apar boli autoimune grave, potenial fatale.

224

17. 3. Rspunsul imun de tip celular Imunitatea celular presupune n special dezvoltarea unui rspuns imun fa de celulele infectate cu virusuri, celulele infectate cu microorganisme cu multiplicare intracelular (mycobacterii, Listeria spp., Brucella spp. etc), parazii intracelulari, allogrefe, celule tumorale. Un microorganism cu dezvoltare intracelular penetreaz n diverse celule i n particular n macrofage (aflate n stare de repaus i neactivate) i se poate divide fr ca acest proces s induc o reacie imun celular natural i specific. Macrofagul care a fost infectat cu un microorganism secret o serie de citokine (IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-a i TNF-) care la rndul lor vor aciona dup cum urmeaz (Figura nr. 2): TNF-a va activa macrofagul infectat; TNF-a, TNF- vor activa macrofagele neinfectate nc; TNF-a, IL-10, IL-12 vor activa celulele NK. Aceast prim faz va pune n micare celulele imunitii celulare specifice i astfel limfocitele Th0 vor fi activate i se vor diferenia n Th1, datorit IL-12, secretat de macrofage i a IFN-g, secretat de celulele NK activate. Antigenele proteice sunt transformate de ctre APC n peptide de 12-20 aminoacizi. Acest tip de antigene induce o dubl imunizare celular i umoral. Nu a fost nc demonstrat, complet, RIC fa de antigenele ne-proteice. 17. 3. 1. Etapele rspunsului imun celular Imunitatea celular intervine n mai multe etape succesive. Rspunsul celular presupune ca antigenul prezentat limfocitelor s fie degradat n peptide i asociat cu molecule MHC II. Dintre APC menionm celulele dendritice (cele mai bune prezentatoare de antigen), celulele Langherhans, macrofagele i limfocitele B (eficiente numai dup stimulare). Recunoaterea peptidelor antigenice de ctre LT helper i activarea lor necesit contactul direct ntre APC i limfocitele Th, interaciunea fiind trimolecular: TCR, peptide antigenice i MHC clasa II. moleculele CD4 i moleculele de adeziune consolideaz aceast interaciune. Toate aceste contacte duc la activarea i multiplicarea limfocitelor T CD4+. Drept rezultat, LT CD4+ activate sintetizeaz IL-2 i lanul a cu rol de receptor pentru IL-2 (IL-2R), ceea ce permite o aciune autocrin i exocrin; multiplicarea limfocitelor T antigen-specifice duce la formarea de clone celulare specifice antigenului. Generarea limfocitelor T citotoxice LT CD8+ sunt selecionate dup specificitatea lor fa de antigen i activate de diferitele citokine (IL-2, IFN-g) secretate de limfocitele Th1 activate n prealabil. Recrutarea altor celule pentru cooperare Prin citokinele secretate, imunitatea celular permite recrutarea i activarea unor celule care nu sunt specifice antigenului: IL-2 - produs numai de LT (n principal CD4+ i numai ntr-o mic msur de ctre CD8+), are o aciune autocrin asupra LT dar i asupra monocitelor, macrofagelor, LT CD8+ i a celulelor NK; 225

 IFN-g - produs n principal de LT (CD8+ i mai puin din CD4+) dar i de celulele NK, activeaz macrofagul, crete sinteza de molecule MHC II, recruteaz celule NK i le activeaz funcia citotoxic sub efectul TNF-a i mpiedic infectarea celulelor cu virusuri (aciune antiviral).

17. 4. Povestire adevrat 17.4.1. Tratamentul n imunosupresie n stabilirea i aplicarea tratamentului unui anumit pacient, nu trebuie niciodat uitat rolul rspunsului imun (nici n plus i nici n minus). De exemplu, pacientului imunodeprimat trebuie s-i administrezi antibiotice bactericide i nu bacteriostatice. Pacientul imunodeprimat, fiind sub tratament etiologic eficient, dar la care din diverse motive se restaureaz imunitatea, poate face reacii cu impact fatal asupra evoluiei. O infecie cronic cu VHB la un pacient cu tratament imunosupresor n diverse situaii, nu ridic probleme deosebite hepatice. Reducerea imunosupresiei, creterea rspunsului imun, gsete pacientul ntr-o situaie n care viremia este nalt. Reacia imun, recent restaurat, poate induce leziuni hepatice severe, hepatit fibrozant colestatic cu mortalitate uneori pn la 90%. Un alt exemplu ar fi pacientul cu infecie HIV, aflat la debutul unui tratament antiretroviral. Acesta, datorit aceluiai proces de restaurare imun, poate s dezvolte afeciuni nemanifeste pn atunci, numite sindrom de reconstrucie imun, cu mortalitate foarte mare. Aadar, este necesar o atenie deosebit att n ceea ce privete imunodepresia ct i n cazul revenirii imunitii. 17.4.2. Stresul i rspunsul imun Stresul este cunoscut ca avnd efect inhibitor al rspunsului imun, crescnd astfel susceptibilitatea la infecii i cancer. Paradoxal, stresul este nvinuit pentru exacerbarea astmului i a bolilor inflamatorii i autoimune, dei astfel de boli ar trebui s fie ameliorate de un anumit grad de imunosupresie. Mai mult, rspunsul de tip fight-or-flight este unul dintre mecanismele naturale de aprare care prin activarea aparatelor cardiovascular si musculoscheletal promoveaz supravieuirea, i de aceea este puin probabil ca acest rspuns la stres s suprime funcia imun, n momentul n care este esenial pentru supravieuire. Fr acest rspuns un tigru nu poate prinde o cprioar, n timp ce cprioara nu ar avea nici o ans de supravieuire. Aceste observaii sugereaz c stresul poate suprima funcia imun n anumite condiii i o poate ntri n altele. Aadar, efectele stresului pot fi att benefice ct i duntoare. Studiile au demonstrat c o serie de factori influeneaz direcia efectelor stresului: 1. durata stresului (acut vs. cronic): stresul acut exprimat n timpul activrii imune stimuleaz att imunitatatea nnscut ct i pe cea adaptativa; stresul cronic suprim rspunsul imun scznd numrul celulelor i/sau potennd mecanismele imunosupresoare (limocitele T reglatorii). Stresul cronic poate perturba RI i prin promovarea rspunsului proinflamator. 2. distribuia leucocitelor: compartimentele cu un numr crescut de leucocite n timpul stresului acut determin imunostimulare; 226

3. concentraia fiziologic vs. farmacologic a glucocorticoizilor i structura endogen vs. sintetic a acestora: hormonii endogeni n concentraie fiziologic au efect imunostimulant, n timp ce hormonii endogeni n concentraii farmacologice i hormonii sintetici au efect imunosupresor. 4. corelaia timp de aciune al agentului stresor timp de activare a rspunsului imun: imunostimularea se observ cnd agentul stresor acioneaz n stadii incipiente ale activrii imune, iar imunosupresia este asociat cu stadiile tardive ale RI. Se consider c stresul pe termen scurt induce o redistribuie a celulelor imune n organism, funcia imun fiind semnificativ stimulat n organe pe unde leucocitele trec n timpul stresului acut. Un exemplu interesant este cel al unor parautiti crora li s-au msurat nivelul plasmatic al cortizolului i al celulelor LT i NK cu 2 ore nainte, i la 1 or dup sritur. Rezultatele arat o cretere semnificativ n numrul celulelor imune nainte de sritur, urmat de o scdere dramatic la 1 or dup, modificri concomitente cu creterea catecolaminelor, respectiv creterea cortizolului plasmatic. (2) Aadar, imediat dup debutul unui stres (minute) sau n timpul unui stres de intensitate uoar, sau efort fizic catecolaminele determin ieirea soldailor (leucocite) din tranee (splin, plmni) i intrarea pe bulevarde (vase sangvine i limfatice). Ulterior, cortizolul induce trecerea leucocitelor din snge la locurile de lupt (piele, plmni, tract gastrointestinal, mucoase, ganglioni limfatici). Stresul cronic, numit i distres are drept mecanism fiziopatologic persistena RI dup ncetarea aciunii agentului stresor sau activarea repetat. Rspunsul la stresul acut are rol critic n adaptarea organismului, hormonii de stres pregtind sistemul imun pentru eventuale provocri (ex. rnire, infecie). 17.4.3. Interaciunea somn rspuns imun Dei deprivarea de somn este considerat un factor de risc pentru sntate, asocierea consecinelor a fost dificil, ntruct semnele clinice msurabile, specifice acesteia, lipsesc. S -a constatat ns c peste 64 de ore fr somn la persoane sntoase au consecine cognitive marcate, dar numai cteva semne fiziologice i neurologice minore. Similar, 9 zile de deprivare de somn au ca rezultat colapsul iarspitalizarea devine obligatorie. Se tie c exist o relaie ntre somn i sistemul imun, ns natura acesteia nu este foarte clar. Unele studii au sugerat c deprivarea de somn determin un dezechilibru cronic energetic, deteriorarea gradual a sntii, cu scderea activitii rspunsului imun, accelerarea catabolismului, malnutriie putnd conduce la deces, n cele din urm. Cauza morii obolanilor deprivai de somn (3 sptmni) a fost sepsisul cu bacterii facultativ anaerobe, prin multiplicare excesiv (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae i Corynebacterium jejikum). Translocarea bacteriilor i a toxinelor extraintestinal, sangvin, reprezint trigger-ul unei stri hipermetabolice i inflamatorie sistemice avnd ca rezultat sepsisul fr a se putea pune n eviden un focar septic. Semnele care certific prezena unui status de imunosupresie includ absena abceselor n ciuda colonizrii cu S. aureus, absena febrei i bacteriemia primar indus de microorganisme oportuniste, similar cu patogenia sepsisului la pacienii imunocompromii.

227

17. 5. Tipuri de imunitate Imunitatea poate fi motenit (trstur de specie, se transmite ereditar) i dobndit. Imunitatea poate fi dobndit activ, dup contactul cu un anumit antigen (ex. bacterian). Evenimentul imunologic poate aprea dup o infecie (natural) sau dup administrarea unor vaccinuri (artificial). Avantajul imunitii dobndite activ este faptul c, de regul, protecia este de durat. Dezavantajul principal este reprezentat de faptul c instalarea rspunsului imun are loc lent, mai ales n cazul RIP. Imunitatea poate fi dobndit i pasiv, prelund anticorpi produi de ctre o alt gazd. Spre exemplu, administrarea de anticorpi anti toxin difteric / tetanic / botulinic (artificial) pune la dispoziia gazdei infectate, imediat, o cantitate important de antitoxin, n vederea neutralizrii ct mai rapid a toxinei implicate patogenic. n mod natural, ftul i nou nscutul beneficiaz de protecie prin intermediul anticorpilor (IgG transplacentar, IgA prin colostru, lapte) provenii de la mam. Avantajul imunitii dobndite pasiv este rapiditatea, n tim p ce dezavantajul este reprezentat, pe de o parte, de timpul scurt pentru care este oferit protecia iar pe de alt parte, de riscurile unei hipersensibilizri, atunci cnd sunt utilizai anticorpi provenind de la o alt specie (ex. n cazul administrrii de ser recoltat de la cal hiperimunizat). Exist i posibilitatea dobndirii unei imuniti activ - pasiv, atunci cnd se administreaz concomitent (dar n locuri diferite) ser imun i un vaccin (ex. n suspiciunea infeciei cu Clostridium tetani). Mult timp s-a considerat c cele 2 tipuri de imunitate acioneaz independent, imunitatea nnscut oferind prima linie de aprare mpotriva microbilor invadatori, iar imunitatea dobndit intervenind mai trziu, pentru a elimina infecia. ns, interaciunea dintre cele 2 tipuri de imunitate este evident: imunitatea adaptativ profit de abilitatea imunitii nnscute de a distinge ntre agenii patogeni, microbii benefici i factorii de mediu. Cele 2 tipuri de imunitate sunt complementare, n strns colaborare (un adevrat exemplu pentru studeni, medici sau orice membru al sistemului sanitar). Existena celulelor NK ntrete aceste considerente. Conform unor descoperiri recente, celulele NK au o proprietate esenial, atribuit numai celulelor imunitii memoria; n plus, au fost identificate celule NK n locuri atribuite n mod clasic imunitii adaptative: timus i ganglionii limfatici. (4)

17. 6. Definiia vaccinurilor Pornind de la observaiile i experimentele lui Edward Jenner, Louis Pasteur a fundamentat tiinific vaccinurile alctuite din corpi microbieni. Gaston Ramon a pus la punct metodele de neutralizare a toxinelor i a identificat utilizarea lor ca anatoxine. Vaccinul este 1. o suspensie de microorganisme (bacterii, virusuri) vii atenuate sau inactivate sau 2. cuprinde fraciuni din microorganisme (subuniti), n vederea stimulrii mecanismelor de rspuns imun, de regul pentru prevenirea apariiei unor infecii.

228

Vaccinarea este definit drept o metod profilactic, care urmrete creterea rezistenei specifice a unei gazde, printr-o imunizare activ, cu stimularea rspunsului umoral sau celular, dup caz. De fapt, vaccinrile incluse n programele naionale de vaccinare (conform recomandrilor Organizaiei Mondiale a Sntii, OMS) reprezint metodele profilactice cu cel mai bun raport ntre cost i eficien, n comparaie cu orice alt metod cunoscut. Strategiile de vaccinare au n vedere mai multe aspecte, inclusiv statusul imun al gazdei respective (imunocompetent sau imunodeprimat). Unele vaccinuri se pot administra i n timpul unei izbucniri epidemice (outbreak) sau a unei epidemii, pentru prevenirea apariiei de cazuri noi i scurtarea duratei epidemiei. Exist i posibilitatea administrrii unor vaccinuri n scop curativ, gazda fiind deja infectat n momentul inoculrii (ex. vaccin HBV la persoanele cu hepatit cronic, cu HBV).

17. 7. Clasificarea vaccinurilor n funcie de infecia care se dorete a fi prevenit, vaccinurile pot fi bacteriene sau virale. n funcie de modul de preparare exist: Vaccinuri corpusculare (bacteriene, virale), incluznd, dup caz, corpi vii atenuai sau distrui (inactivai) prin aciunea unor factori fizici (ex. cldur) sau chimici (ex. mertiolat de sodiu). Vaccinul BCG conine bacterii vii atenuate, stimuleaz RIC i se administreaz pentru a preveni tuberculoza. Vaccinurile poliomielitic (Salk) sau hepatitic A includ virusuri omorte. Vaccinurile poliomielitic (Sabin), rujeolos, rubeolos conin virusuri vii, atenuate i stimuleaz RIU i rspunsul imun la poarta de intrare. Vaccinurile subunitare, preparate prin inginerie genetic, au un grad superior de siguran (vaccin hepatitic B, vaccin pertussis acelular). Vaccinurile care conin anatoxine bacteriene, purificate i adsorbite pe suport mineral (DTP conine anatoxin tetanic i difteric plus corpi de Bordetella pertussis omori, DT, dT, ADPA, ATPA/VTA). n funcie de numrul componentelor antigenice exist: Vaccinuri monovalente (rujeolos/VVR, rubeolos, hepatitic A, hepatitic B, pertussis acelular, BCG etc), Vaccinuri asociate, care conin amestecuri de antigene (DTP, DT, dT, rujeolos-rubeolos etc). Date privind schema de vaccinare aflat n uz n ara noastr la acest moment, precum i cteva informaii privind substanele imuno-modulatoare (ex. Cantastim) sunt prezentate n anexa nr. 4.

17. 8. Povestire adevrat Ianuarie 1993 ... un articol semnaleaz faptul c difteria, o boal practic eliminat n Europa de Vest, capt proporiile unei epidemii, n Rusia.

229

Situaia a fost de asemenea periculoas n Ucraina, unde mai mult de 1.300 de cazuri au fost raportate n primele zece luni ale anului 1992. Ameninarea extinderii n alte state, foste membre URSS, a fost real. Eforturile uriae de a vaccina att copiii ct i adulii au fcut, pn la urm, posibil controlul epidemiei. Totui, n perioada 1990-1998, peste 150.000 de cazuri de difterie au fost raportate, din toate statele foste membre ale URSS, nregistrndu-se i un foarte mare numr de decese. Dar care a fost motivul i de ce a aprut o epidemie de difterie dup 1990 ? Incidena difteriei n Rusia era foarte mare n prima jumtate a secolului 20; peste 750.000 de cazuri au fost raportate doar n Rusia n anii 50 (imunizarea mpotriva difteriei a nceput n anumite zone ale Uniunii Sovietice n 1920, ns abia n 1958 a fost statuat imunizarea universal a copiilor, n toat Uniunea Sovietic). Este adevrat c n 1977, au nceput s fie din nou raportate cazuri de difterie, n URSS, atingnd o valoare maxim n 1984 (1.609 cazuri). Din 1978, pentru prima dat, majoritatea cazurilor au aprut la aduli. Mass-media a avut un rol extrem de negativ prin atitudinea advers fa de imunizare. Multe dintre bolile prevenite de vaccin aveau o inciden sczut i n acest context a aprut o micare anti-imunizare n pres, n contextul unei perioade (1985-1990) de profund nencredere n guvern. Dup 1990, prinii nu mai erau de acord s permit imunizarea copiilor cu vaccinuri produse n Rusia fiind fcui s cread c acestea le fac ru i i mbolnvesc. Chiar i membri ai comunitii medicale au avut ieiri n pres n care au exprimat prerea c aceste vaccinuri duneaz. n plus, o parte din prini considerau c amnarea (nerespectarea schemelor de vaccinare, neprezentarea la medic atunci cnd erau invitai s o fac) sau evitarea vaccinrii copiilor sunt o nou-descoperit libertate, n cadrul democraiei instaurate odat cu dizolvarea URSS. Epidemia aprut n anii 90 a ngrijorat comunitatea medicala internaional n legtur cu vaccinul produs n Rusia. Contrar opiniilor anecdotice, studiile realizate au demonstrat c vaccinul era eficient [este totui posibil ca vaccinul s fi fost transportat n condiii improprii i astfel s fi avut, n mod real, o eficacitate mai mic (presupunere care nu a fost demonstrat)]. Este adevrat c i schemele de vaccinare din URSS au suferit n anii '80 unele modificri, diferind de schemele recomandate de OMS (ex. coninut mai mic de antigen, creterea intervalului ntre vaccinri, renunarea la administrarea DT la intrarea n coal) iar preocuparea pentru sntatea public a sczut, din diverse motive. Rata vaccinrii la copii a sczut n anii 80, la mai puin de 70% (mult sub recomandrile OMS). Reacia fa de aceast epidemie s-a concentrat iniial asupra vaccinrii a ct mai multor copii dar i a adulilor din grupele de risc. Vaccinarea tuturor adulilor a fost aprobat abia n 1993. S au fcut vaccinri la locul de munc dar i vizite la domiciliu pentru vaccinarea omerilor. Pentru a crete rata imunizrii la copii s-a diminuat lista contraindicaiilor i a nceput s se foloseasc schema complet de vaccinare. n octombrie 1994, s-a reintrodus vaccinarea copiilor la intrarea n clasa I. n 1995 - 1996, epidemia a nceput s fie controlat. Dar care au fost pierderile umane i materiale, reale, probabil c nu vom cunoate, vreodat. n timp ce apariia epidemiei a fost unul dintre cele mai spectaculoase exemple ale interveniei negative a mass-media n problemele de sntate public, controlul epidemiei de difterie a fost unul dintre cele mai spectaculoase succese ale interveniei de sntate public n secolul 20.

17. 9. Direcii de cercetare 230

Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. 1. The open window of susceptibility to infection after acute exercise in healthy young male elite athletes; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kakanis%20MW%22 2. New strategies of mammary cancer vaccination: based on the administration of tumor cells genetically modified to express major histocompatibility complex (MHC) class II gene products; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21050309 3. Receptor tyrosine kinase signaling favors a protumorigenic state in breast cancer cells by inhibiting the adaptive immune response; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20924104 4. Replacement of dietary fish oil by vegetable oils affects humoral immunity and expression of pro-inflammatory cytokines genes in gilthead sea bream Sparus aurata; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20817101 5. Model systems to the rescue: The relationship between aging and innate immunity; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21057627 6. Innate Immune Response to Mycobacterium tuberculosis Beijing and Other Genotypes; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21049036 7. Skin Commensals Amplify the Innate Immune Response to Pathogens by Activation of Distinct Signaling Pathways; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21048787 8. An Effective HIV Vaccine: A Combination of Humoral and Cellular Immunity? http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20636279

17. 10. Verificai-v cunotinele Alegei rspunsul corect. 1. Principala caracteristic a imunitii este: A. selectivitatea B. memoria C. specificitatea D. unicitatea 2. RIU reprezint o cooperarea intercelular, n care rolul principal revine: A. macrofagelor B. NK C. LT B D. LTc 3. Pe parcursul RIC intervin: A. IL 2, IL 4 B. TNF-a, TNF- ,IFN-g C. IL 12, IL 2 D. IL 4, IL 5 231

4. Urmtoarele afirmaii despre imunitatea dobndit sunt adevrate, cu excepia: A. apare n urma infeciilor B. cea activ se dezvolt rapid C. vaccinurile au o contribuie important n dezvoltarea imunitii dobndite D.cea pasiv se dezvolt rapid 5. Vaccinul DTP este: A. monovalent B. viu C. corpuscular D. un amestec de antigene

Bibliografie 1. Firdaus SD, 2009, Enhancing versus supressive Effects of Stress on Immune Function: Implications for Immunoprotection and Immunopathology, Neuroimmunomodulation, 16(5), 300-317 2. Schedlowski M, Jacobs R, Stratmann G et al., 1993, Changes of natural killer cells during acute psychological stress, J. Clin. Immunol., 13(2), 119-126 3. Everson CA, Toth L, 2009, Systemic bacterial invasion induced by sleep deprivation, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol., 278(4), R905-R916 4. Cooper MA, Colonna M, Yokoyama WM, 2009, Hidden talents of natural killers: NK cells in innate and adaptive immunity, EMBO Rep., 10(10), 1103-30

232

18. Reaciile de hipersensibilitate (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)

18. 1. Definiie, clasificare

Reacia imun este un rspuns normal fiziologic fa de microorganisme sau celule tumorale. Totui, RI poate mbrca i aspecte patologice, de tipul hipersensibilitii (HS) sau al autoimunitii. Primele observaii privitoare la reaciile de hipersensibilitate au fost fcute de Charles Richet n urm cu un secol, observaii care vor acoperi tipul I din clasificarea Gell i Coombs de mai trziu. Pornind de la diferite tipuri de reacii observate, Gell i Combs (1968) au propus o clasificare folosind termenul de hipersensibilitate de tip I-IV. n 1974, Roitt adaug hipersensibilitatea de tip V, stimulant (pornind de la anticorpii stimulani ai funciei tiroidei, prezeni n hipertiroidia primitiv, boala Basedow). n mod clasic, HS reprezint o stare de reactivitate crescut a organismului, pe baza unui mecanism imunologic, indus de expunerea (repetat) la anumite structuri antigenice (sau haptene). Cuvntul alergen a fost pentru prima oar utilizat de Riquet; desemneaz un antigen care d natere unei reacii de hipersensibilitate. HS este specific i include un contact sensibilizant, o perioad de laten i un nou contact, contactul declanator, cu acelai antigen care a fost implicat n contactul sensibilizant. HS se poate clasifica n funcie de tipul de rspuns imun n: HS mediat prin mecanism imun umoral (rol primordial LB i anticorpii) -HS de tip I (anafilactic, atopic), aa cum se nregistreaz n cazul ocului anafilactic, edemului Quincke, conjunctivitelor sau rinitelor alergice, astmului alergic, urticariei, eczemei atopice etc; -HS de tip II (citotoxic), aa cum se ntmpl n liza celular prin anticorpi, complement dependent sau n citotoxicitatea anticorp dependent, complement independent (mecanisme ce pot fi implicate de ex. n patogenia reumatismului articular acut, n anemii hemolitice inclusiv dup infecii cu Mycoplasma pneumoniae, reacii posttransfuzionale, sindromul Goodpasture etc); -HS de tip III (prin complexe antigen-anticorp), aa cum se nregistreaz n reacia Arthus, boala serului, boala plmnului de fermier, glomerulonefrita extramembranar, lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixt, glomerulonefrita i periarterita poststreptococic etc. HS de tip IV mediat prin mecanism imun celular (rol primordial LT i citokinele), spre exemplu n -HS tuberculinic sau -HS n testrile intradermice care utilizeaz lepromin, candidin, histoplasmin, tricofitin etc i -HS n multe dintre infeciile virale.

233

18. 2. Hipersensibilitatea de tip I (anafilactic) Reacia imun anafilactic se poate instala rapid (n mai puin de 15-30 minute) dup un nou contact cu un antigen la care organismul este sensibilizat. n aceast reacie intervin celulele (mastocite, bazofile) acoperite de reagine (n principal IgE), care elibereaz mediatori chimici (histamina fiind cel mai important i cel mai cunoscut dintre acetia). Anafilaxia este un fenomen general, obinut ca rspuns la antigene variate: toxine, proteine, medicamente, alloantigene de transplant. Codeina, morfina, vancomicina i substanele de contrast folosite n imagistic pot determina oc anafilactoid, cu aceleai manifestri ca n ocul anafilactic, ns fr participarea IgE. Anticorpii anafilactici (reaginele) sunt anticorpi care se fixeaz prin fragmentul lor Fc pe receptorii specifici exprimai la suprafaa bazofilelor i mastocitelor. Controlul producerii de IgE este realizat de LT. LTh2 stimuleaz producerea IgE (sunt implicate IL-4, IL-5, IL-10). LTh1 inhib producerea IgE (fiind implicate IFN i IL-12). Th2 (Figura nr. 1) are o aciune autocrin, secret IL-4 cu aciune att asupra LB ct i asupra celulei secretoare. Sinteza de IgG4 i sinteza de IgE se afl sub controlul acelorai citokine i se realizeaz de aceeai populaie celular. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulin sunt situate foarte apropiat una de cealalt, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine independent de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare c un rol l-ar putea juca Il-10. Efectele diferite induse de cele 2 tipuri de imunoglobuline se datoreaz structurii diferite. IgE prezint fa de IgG4 un domeniu constant suplimentar, o zon balama diferit i zone de recunoatere pentru ambele tipuri de receptori: FcRI (afinitate nalt) i FcRII (afinitate joas). IgE au un timp de via mai scurt (<2 zile) comparativ cu 21-23 zile pentru IgG, iar concentraia acestora este foarte sczut n serul individului normal. Ataarea IgE de mastocite i bazofile (ca dimeri cuplai cu alergenul) duce la creterea duratei de via a IgE de la mai puin de 2 zile la 10 zile. IgE nu trec de bariera feto-placentar datorit faptului c placenta nu conine FcR. n sngele fetal se pot gsi IgE n cantiti sub 1UI/ml prin ataare de FcRI de pe macrofagele fetale. FcRI pot semnaliza pentru degranulare i dup cuplarea cu alte molecule (ex. lectine, Ac anti lant FcRI). Bazofilele i mastocitele se caracterizeaz prin prezena unor granule metacromatice, roii dup coloraia cu albastru alcyan, datorit histaminei i heparinei. Mediatorii mastocitari sunt reprezentai de histamin, leucotriene, prostaglandine, factorul activator plachetar (PAF), adenozin, factori chemotactici pentru eozinofile (ECF) i neutrofile (NCF) i o serie de citokine proinflamatorii (IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF-a, TGF-1, IFN-g). La suprafaa bazofilelor i mastocitelor sunt exprimai diveri receptori, dintre care cei mai importani sunt FceRI, FceRII (CD23) i C3aR i C5aR (CD88). Legarea reaginelor de receptorii FceRI, FceRII iniializeaz semnalizarea spre interiorul celulei, ducnd la activarea celular. Activarea bazofilelor i mastocitelor se realizeaz prin mecanisme mediate imun i necesit prezena unui mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc). Procesul de activare const dintr-o serie de reacii biochimice n trepte, cu participarea fosfolipidelor membranare, activarea PKC, fosforilarea tirozinei, toate ducnd la creterea influxului de Ca2+ extracelular alturi de mobilizarea rezervelor de Ca2+ intracelular. Rolul Ca2+ este de a iniia eliberarea mediatorilor preformai i sinteza de novo a mediatorilor lipidici. Exemplificm efectele acestor mediatori prin histamin care produce: bronhoconstricie prin aciune direct pe receptorii H1 ai musculaturii netede traheobronice, 234

 vasodilataie arterio-capilar prin contracia fibrelor musculare netede din peretele venulelor postcapilare, creterea permeabilitii capilare, creterea motilitii intestinale i reacie urticarian la nivel cutanat. Mastocitele elibereaz histamin i LTD4, care vor determina edem, hipersecreie de mucus i bronhoconstricie, cu scderea FEV1, ns elibereaz i IL-5, TNF, care vor atrage eozinofile, limfocite, neutrofile i macrofage. Aceste celule inflamatorii vor determina modificri cronice la nivelul plmnului: hiperplazie a celulelor secretoare de mucus, depunere de colagen la nivelul membranei bazale i hiperplazie muscular neted. Aceste modificri vor determina o hiperreactivitate bronic, dar de data aceasta, nespecific (hiperreactivitate bronic la aer rece, efort). Activitatea inflamatorie care are loc la nivelul bronhiilor se coreleaz cu valoarea NO expirat (inducere iNOS la nivelul macrofagelor), cu un numr crescut de eozinofile i cu valori mari ale ECP (eozinophil cationic protein) n sputa indus. Aceste teste nu au valoare diagnostic, nsa pot fi utilizate orientativ pentru aprecierea severitii astmului. Faptul c mastocitele intervin n ambele faze, imediat i tardiv, o demonstreaz efectul benefic pe care l are cromoglicatul (stabilizator de membran, se opune degranulrii) n tratamentul astmului bronic. Corticosteroizii acioneaz numai pe rspunsul tardiv. Ei nu pot face discriminarea ntre implicarea mastocitelor i LT n inflamaia cronic datorit faptului c inhib ambele celule. Dintre manifestrile clinice sistemice care pot aprea n cazul unei stri de HS de tip I, sunt de reinut: - ocul anafilactic, care la om se manifest prin colaps cardio-vascular i bronhospasm; n lipsa tratamentului poate evolua ctre deces. Principalele antigene care pot declana ocul anafilactic sunt nepturile de himenoptere (albine, viespii), injectarea unor medicamente (penicilina, miorelaxante, ACTH etc), latexul (la infirmiere, chirurgi) i - edemul Quincke care cuprinde faa, gura i uneori faringele i laringele, ducnd la asfixie i deces. Dintre manifestrile clinice localizate ar fi de amintit: - manifestrile localizate la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii, avnd drept principali ageni declanatori polenul, acarienii, praful de cas, sporii de ciuperci (conjunctivite alergice, rinite alergice inclusiv febra de fn, traheita spasmodic i astmul alergic); - manifestrile cutanate (urticarie, dermatite sau eczema atopic) i - manifestrile digestive (diaree, vomismente n caz de alergie la laptele de vac, ou, pete, fructe, elin etc).

18. 3. Povestiri adevrate 18. 3. 1. Anafilaxie sau atac astmatic sever? O tnr de 19 ani ajunge la camera de urgen din cauza unui atac acut de dispnee, respiraii uiertoare (wheezing), nroire (erupie eritematoas) generalizat la nivelul tegumentelor i vrsturi. Era cunoscut ca suferind de astm bronic, inut sub control cu tratament 235

medicamentos. Din antecedentele din copilrie, avea notat n carnetul de sntate o reacie alergic (dermatit atopic i urticarie) dup ingerarea de unt de arahide. Dup spusele colegilor care au nsoit-o la spital, nainte de a-i aprea simptomele, a mncat o ciocolat de la un tonomat din cmin. Pe ambalaj nu apreau notate alunele ca ingredient. Totui ... Iat cteva elemente privind alergiile la diferite alimente Reaciile de hipersensibilitate aprute dup ingestia anumitor alimente afecteaz aproximativ 68% dintre copiii mai mici de 4 ani i aproape 2% din populaia SUA cu vrsta mai mare de 10 ani. Alergia la produsele alimentare reprezint una dintre cele mai importante cauze pentru reaciile anafilactice tratate n departamentele de urgen din SUA i din multe state occidentale. n fiecare an sunt raportate circa 30.000 reacii anafilactice, 2.000 de spitalizri i 200 de decese din cauza reaciilor de sensibilitate la diferite produse alimentare. Reaciile n urma consumului de arahide i alune de pdure conduc la un procent important de reacii anafilactice fatale sau foarte grave. n SUA, de unde putem obine date statistice privind aceast situaie, 3 milioane de oameni sufer astfel de alergii. Dei exist numeroase programe de informare (tot n SUA) cu privire la alergiile alimentare, majoritatea pacienilor nu tiu cum s acioneze i cum s se salveze n cazul unei reacii anafilactice. Cum s-ar putea pune diagnosticul? La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, n absena unor semne recente de astm, trebuie s ridice ntotdeauna suspiciunea anafilaxiei. Anafilaxia indus de produse alimentare poate fi confundat de ex. cu un atac astmatic sever. Cu alte cuvinte, anamneza i examenul clinic pot contribui la orientarea diagnosticului. Tratamentul alergiei la alune n primul rnd i cel mai important este ca reacia de hipersensibilitate (HS) de tip I s fie prevenit i msurile includ educarea pacienilor i a familiilor acestora cu privire la modul n care s evite ingestia accidental de alune, cum s recunoasc primele semne i simptome ale unei reacii alergice i cum s reacioneze n primele stadii ale unei reacii anafilactice. Spre deosebire de imunoterapia tradiional (pentru reaciile de HS la nepturi de insecte etc) n cazul HS la alune sunt investigate metode de tratament neconvenionale precum injectarea lunar de anticorpi anti-IgE (care, prin scderea nivelelor de IgE, pot preveni activarea rspunsului la alergenul proteic din alune) sau obinerea prin inginerie genetic a unor proteine de alune recombinante (prin substituirea unor aminoacizi critici se poate preveni activarea reaciilor mediate de IgE). Tratamentul reaciei anafilactice Pacienii care au HS de tip I la alune trebuie s primeasc urgent adrenalin (injectat intramuscular), antagoniti ai receptorilor histaminici H1 i H2 (administrai oral, intramuscular sau intravenos), oxigen, albuterol (pe cale inhalatorie) i corticosteroizi (injectabil). Datorit faptului c pot aprea reacii bifazice (definite ca o agravare simptomelor, ce necesit o nou terapie dup tratarea iniial a reaciei anafilactice) i deoarece circa 90% din rspunsurile

236

bifazice apar n primele 4 ore de la reacia anafilactic iniial, pacienii trebuie inui sub observaie cel puin 4 ore nainte de a fi externai din camera de urgen. Se recomand continuarea tratamentului timp de 3 zile (prednison i antihistaminice), cu toate c nu a fost demonstrat c aceast recomandare ar reduce riscul simptomelor recurente. 18. 3. 2. Dar cum s-ar putea modula secreia IgG4/IgE? Pentru a bloca interaciunea Th2 - IL-4 se pot folosi Ac anti IL-4 sau receptori solubili pentru IL-4. Utilizarea receptorilor solubili IL-4 s-a ncercat terapeutic, cu rezultate bune in vitro (administrare inhalatorie), dar nu i in vivo (probabil datorit contracarrii aciunii acestora prin intervenia altor citokine implicate n sinteza de IgE). Sinteza de IgG4 i sinteza de IgE se afl sub controlul acelorai citokine i se realizeaz de aceeai populaie celular. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulin sunt situate foarte apropiat una de cealalt, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine independent de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare c un rol l-ar putea juca Il-10. Copii care triesc n cas cu o pisic e posibil s nu dezvolte hipersensibilitate la alergenii aceasteia, prin modificarea raspunsului Th2 va crete sinteza de IgG4 i va scdea sinteza de IgE. Cercettorii ncearc s gseasc un mod de a induce Th2 s sintetizeze numai a IgG4, cu blocarea produciei de IgE, cu scopul de a induce tolerana la venin de insecte, proteine diferite, alergeni alimentari, pr de animale etc. Merit menionat faptul c imunizrile antitetanos i antidifterie nu induc producerea de IgE, n timp ce imunizrile repetate antipertussis cu adjuvant Freund incomplet induc o sintez crescut de IgE (e foarte interesant faptul c exist variaii mari n funcie de tulpina utilizat pentru fabricarea vaccinului). Cteva exemple de alergeni O descriere orientativ a alergenilor implicai n HS de tip I ar fi cea de proteine hidrosolubile cu greutate molecular ntre 10 i 40kDa, chiar dac structura, proveniena i calea pe care o urmeaz aceste proteine poate fi extrem de diferit. Cloning a descoperit o anumit secven de aminoacizi omoloag pentru o parte din alergeni i diferite enzime. Pentru polen sau prul de pisic nu exist nici omologia structural cu enzimele i nici capacitatea enzimatic, deci nu acetia sunt factorii eseniali. Pentru acarieni, n schimb, s-a dovedit o strns corelaie ntre activitatea proteazic i imunogenitate (Der p 1 taie CD23 sau CD25 de pe limfocite, intensificnd rspunsul imun; de asemenea, distruge jonciunile dintre celulele epiteliale, ceea ce le faciliteaz acarienilor ptrunderea n organism). 18. 3. 3. Testarea HS de tip I

237

Testele cutanate, prick-test, reprezint metoda cel mai des utilizat n diagnosticul HS de tip I. Se introduc cte 0,1l din fiecare preparat antigenic de testat intradermic (de obicei se testeaz 25 de astfel de preparate), un martor pozitiv (histamina), i unul negativ (soluie salin fiziologic). Modificrile cutanate apar n 5-15 min i dureaz 30 minute sau mai mult. Vor fi 2 tipuri de rspuns: macul, determinat de descrcarea de histamin, cu prurit i edem i papul, cu aspect eritematos i dimensiuni mai mari i care are ca mecanism reflexul de axon. Alt tehnic ar include dozarea IgE, ns testul este mai puin sensibil dect testele cutanate. Un test cutanat pozitiv nu inseamn neaprat c persoana prezint HS de tip I, ci c exist o mare probabilitate s fie aa. Numai un test cutanat pozitiv de mari dimensiuni (>10mm diametru) este urmat i de un rspuns tardiv, caracterizat prin eritem i induratie. Rspunsul tardiv apare la 2-3 ore dup injectarea intradermica a antigenului, ine pn la 24 ore i este sugestiv pentru inflamaie cronic la nivelul foselor nazale, plmnului, pielii, datorndu -se: efectelor directe ale prostaglandinelor, leucotrienelor i citokinelor eliberate de mastocite, infiltrrii cu limfocite, eozinofile, bazofile i neutrofile i produilor de secreie ai acestor 4 tipuri de celule. Rspunsul tardiv se ntlnete n cazul administrrii de tuberculin, candidin i tricofitin.

Testele patch reprezint aplicarea cutanat a 10g alergen i realizarea unei biopsii din zona respectiv dup 24 sau 48 ore. Exist 3 moduri de aplicare a antigenului n cazul patchtest: injecii intradermice locale, plasture sau godeu. Ultima metod are avantajul c se pot lua probe repetate fr traumatizarea suplimentar a pielii la fiecare prelevare. Un test patch pozitiv nseamn prezena eczemei cu spongioliza epidermului (formarea de vezicule pline cu lichid ntre cheratinocite) la nivel macroscopic i prezena unui infiltrat celular dermic la nivel microscopic (eozinofile, bogate n MBP-major basic protein, bazofile, limfocite). S-a reuit clonarea de LT specifice mpotriva acarienilor din pielea persoanelor cu eczem (produs n mod natural, nu prin aplicarea unui patch), lucru care nu este posibil i din pielea persoanelor alergice dar care nu dezvolt eczem, ceea ce sugereaz nu doar rolul de helper, ci 238

chiar pe cel de celul efectoare, al LT in hipersensibilitatea tip I. Se pare c rolul LT ca efector n HSI nu se limiteaz doar la nivel cutanat, dar i la nivelul mucoasei nazale i conjunctivei n rinita alergic i a epiteliului bronic n astm. Un alt test care se poate folosi este testul de provocare prin nebulizarea antigenului, cu rspuns rapid n 20 minute constnd n bronhospasm i cu un raspuns tardiv n 4-8 ore, constnd n eliberare de mediatori de novo i infiltrat celular. Rspunsul tardiv pozitiv se poate pune n eviden prin LBA (lavaj bronho-alveolar), cnd se identific nu celulele, ci produi ai acestora (histamina, prostaglandine, leucotriene, MBP, ECP) sau prin biposie, cnd se pot identifica toate modificrile patologice care pot s apar n astm (celule inflamatorii, depunere de colagen, subierea peretelui broniolelor), reunite sub denumirea de remodelare bronic. Pentru demonstrarea hiperreactivitii bronice nespecifice se fac teste de provocare cu histamin, metacolin sau aer rece. Teoriile spun c evaporarea crescut de ap, care va rci epitelilul, ori stimuleaz direct terminaiile nervoase, ori stimuleaz eliberarea de mediatori din celulele locale (histamin din mastocite). Pe frotiul de snge periferic se remarc eozinofilie, iar n secreiile nazale ale unui astmatic, titrurile de ECP i CXCL8 (IL-8) vor fi crecute. pH-ul vaporilor de ap n criz va fi acid. Examenul CT al sinusurilor nazale poate arta opacifierea acestora, situaie ntlnit la o treime din astmatici. Ca i n cazul oricrei alte patologii nu se poate rmne doar la stadiul de observare, nici la cel de diagnostic, ci trebuie s se mearg la urmtorul nivel, identificarea unui tratament. Imunoterapia sau hiposensibilizarea prin injectarea alergenului n cantiti mici pentru o perioad de cteva luni, a fost ncercat n 1911 de Noon i Freeman. Acum se folosete mpotriva reaciilor fa de veninul de albine, viespi i pentru tratamentul rinitei alergice. Doza iniial este de 1-10ng i crete progresiv cu cte 10g alergen/doz. O form mai nou de imunoterapie e cea folosind, nu structura natural a alergenilor, ci un fragment coninnd numai primii 20 aminoacizi din structura primar a alergenului. De asemenea, se pot sintetiza forme recombinate genetic, cu o capacitate de legare de IgE sczut. ns i acestea ar putea provoca oc anafilactic aa c administrarea lor se va face dup luarea tuturor precauilor necesare. Sunt n studiu i vaccinuri ADN, cu introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vectorin celulele gazdei, cu modificarea rspunsului imun al acesteia. Experimente s -au facut pe oareci, unde expresia tisular de CpG a facut s creasc activitatea TH1 i s scad cea a TH2. Anticorpii monoclonali anti-IgE umanizai se ataeaz de Fab a IgE circulani, i astfel i ndeprteaz din circulaie. ns, pot i scdea producia de IgE prin ataarea de receptorii situai pe LB, care nu vor mai semnaliza pentru producerea de reagine (Ac anti-IgE). i-au dovedit eficacitatea n cazul astmului alergic i al rinitei alergice, i urmeaz s se stabileasc dac au efect benefic n cazul alergiei alimentare, dermatitei atopice sau alergiei la medicamente.

18. 4. Verificai-v cunotinele

239

Alegei rspunsul corect. ntrebarea 1 1). Anafilaxia apare dup un contact nou cu un antigen la care organismul nu era sensibilizat. 2). n HS de tip I intervin mastocite, bazofile cuplate cu Ac anafilactici care se mai numesc i reagine. 3). mediatorul mastocitar principal este histamina, care este un mediator sintetizat de novo. Dintre cele 3 afirmaii de mai sus, care este adevrat/care sunt adevrate? A) 2 B) toate C) nici una D) (1) si (3) ntrebarea 2 Alegei afirmaiile care sunt amndou corecte i se afl n relaie de cauz-efect. a). Activarea bazofilelor i mastocitelor se realizeaz prin mecanisme mediate imun pentru c necesit prezena unui mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc). b). Histamina determin bronhoconstricie la nivelul plmnului pentru c acioneaz pe receptorii H1 ai musculaturii netede traheo-bronice c). ocul anafilactic la om se manifest prin colaps cardio-vascular i bronhospasm pentru c n lipsa tratamentului poate evolua ctre deces d). Polenul, acarienii, praful de cas, sporii de ciuperci nu pot determina leziuni la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii deoarece ei nu pot declana un raspuns imun. Intrebarea 3 Care dintre urmtoarele nu reprezint un test diagnostic al hipersenibilitii tip I a). prick-test b). dozarea IgE c). patch test d). dozarea IgG Intrebarea 4 Nu se folosete ca tratament al hipersensibilitii tip I a). hiposensiblizarea prin injectarea alergenului n cantiti mici pentru o perioad de cteva luni b). un fragment antigenic coninnd numai primii 20 aminoacizi din structura primar a alergenului caruia i s-a crescut i capacitatea de legare de IgE c). introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vector n celulele gazdei, cu modificarea rspunsului imun al acesteia d). anticorpii monoclonali anti-IgE umanizai Intrebarea 5 Pentru a gsi afirmaia corect ajutai-v de povestirea adevrat a).La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, n absena unor semne recente de astm, nu ar trebui s ridice niciodat suspiciunea anafilaxiei. b). Cel mai important este ca reacia de hipersensibilitate (HS) de tip I s fie prevenit c). n cazul HS tip I se evit adrenalina, antagonitii receptorilor histaminici H1 i H2, oxigenul, albuterolul i corticosteroizii d). Pentru c aproximativ 90% din rspunsurile bifazice apar n primele 4 ore de la reacia anafilactic iniial, pacienii pot fi externai din camera de urgen nainte de atingerea a 4 ore de la prezentare.

240

18. 5. Hipersensibilitatea de tip II (citotoxic) Reacia imun citotoxic reprezint unul dintre mecanismele importante de aprare a organismului gazd fa de microorganisme. Rolul acestei reacii este multiplu: distrugerea bacteriilor extracelulare i intracelulare, eliminarea celulelor infectate cu virusuri dar i distrugerea unor parazii sau fungi. Pentru ndeplinirea acestor funcii sunt utilizate mecanismele imunitii naturale (implicnd PMN, macrofage, celule NK). Imunitatea specific completeaz imunitatea natural, adugnd aderena celulelor fagocitare i a celulelor NK la antigene prin intermediul anticorpilor i complementului. Un rol aparte n imunitatea specific l dein limfocitele Tc cu efect litic fa de celulele infectate viral. HS de tip citotoxic apare dup cuplarea anticorpilor cu antigene fixate pe membrana celular. Spre deosebire de hipersensibilitatea de tip I, Ac implicai n acest tip de rspuns imun sunt IgG sau IgM. Ei sunt ataai celulelor gazdei sau se gsesc n matricea extracelular (n HS III, Ac sunt n ser, cu formarea de complexe circulante care se vor depune nespecific n esuturi). (Figura nr. 10) Se cunoate faptul c un neutrofil recunoate i fagociteaz fagocita bacteria opsonizat cu Ac, formeaz fagolizozomi urmnd distrugerea produsului fagocitat.Receptorii pentru complement sunt necesari pentru c bacteria poate fi opsonizat i de fragmente ale sistemului complement. A fost demonstrat experimental (pe oareci) c rolul esenial nu revine C3R, ci FcR. n loturile cu deficit de sintez a lanului al FcR, HS de tip II nu apare, n timp ce la oarecii cu deficit al componentelor sistemului complement, nu s-a constatat nici o diferen fa de lotul de control. n cazul HS de tip II, n locul endocitozei bacteriei, are loc o exocitoz a enzimelor lizozomale asupra celulei/matricei tapetate cu Ac. Dup formarea complexului antigen-anticorp este activat sistemul complement, se genereaz complexul de atac al membranei cu lezarea membranei celulare. Odat cu liza celulei gazd are loc eliberarea de tromboxan, precursor al prostaglandinelor i leucotrienelor. Alturi de neutrofile participi macrofagele, trombocitele, celulele K, eozinofilele datorit prezenei FcR pe membrana lor. Macrofagele, eozinofilele i neutrofilele au un rspuns mai puternic datorit prezenei i a C3R pe membrana celular. Amplitudinea fenomenelor la nivel celular depind de cantitatea de Ac dar i de rezistena celulelor int la liz. De exemplu, n cazul eritrocitelor este suficient un singur MAC, n timp ce pentru celulele nucleate exist o capacitate mai mare de a se reechilibra ionic precum i mecanisme de aprare anti-complement. Liza mediat de C' este implicat n anemiile hemolitice, reaciile postransfuzionale n incompatibilitatea ABO sau Rh etc. Leziunile membranare sunt accentuate de atragerea fagocitelor i eliberarea local a enzimelor litice. Organismul uman posed n mod normal n snge anticorpi fa de Ag sistemului ABO pe care nu le deine. n aceste condiii, Ac nu se vor ntlni niciodat cu fr o intervenie din afar. n cazul unei transfuzii cu snge incompatibil simptomele vor fi reprezentate de febr, hipotensiune, vomismente, dureri la nivelul toracelui (anterior i posterior), datorit hemolizei intravasculare. Este de menionat c o femeie nsrcinat poate pstra sarcina n cazul unui ft cu o alt grup de sngepentru c Ac formai mpotriva Ag eritrocitare sunt de tip IgM (pentameri) care nu vor trece bariera fetoplacentar. Sistemul Rh, ns, poate provoca sindromul hemolitic al nou-nscutului. Mama, sensibilizat mpotriva Ag Rh fetale, produce Ac anti Rh fetal de tip IgG, care vor trece bariera fetoplacentar. Manifestrile sindromului hemolitic al nou-nscutului constau n hepatosplenomegalie, icter i peteii aprute de exemplu la nivel facial. Primul copil Rh incompatibil cu mama sa, nu va suferi, ns, urmtorii, da. Situaia caracteristic este: mama, Rh- iar ftul, Rh+. Ac anti Rh+ rmn in amonte de placent. Pornind de la aceste constatri s a imaginat un tratament care i-a dovedit eficiena. Se administreaz mamei imediat postpartum Ac anti RhD, care vor distruge hematiile Rh+ materne. 241

Alte sisteme sangvine implicate n reaciile posttransfuzionale, n afar de sistemele ABO i Rh, sunt MN, Duffy i Kell. Formarea de IgG vor induce o reacie hemolitic mai puin accentuat. Eritrocitele transfuzate vor fi preluate de fagocitele de la nivelul ficatului i splinei, i nu vor da o hemoliz intravascular sistemic. ns poate aprea i n acest caz necroza acut tubular datorit eliberrii masive a componentelor eritocitare. Pot aprea reacii postransfuzionale ndreptate i mpotriva altor componente celulare sangvine, ns consecinele nu sunt la fel de pregnante ca n cazul eritrocitelor. Reaciile de respingere de gref se manifest la nivelul esuturilor vascularizate direct (un exemplu de esut care nu sufer reacii de respingere este corneea). Cele mai severe manifestri se datoreaz tot sistemului ABO, cu activarea complementului, liza eritrocitelor, recrutare de neutrofile i trombocite. ns frecvente sunt i manifestrile datorate incompatibilitii MHC. Alte exemple: - anemia hemolitic dup ataarea de proteinele de suprafa a hematiilor a unor medicamente (penicilin, fenacetin, chinidin etc) i iniierea producerii i cuplrii unor anticorpi de tip IgG. HS de tip II la medicamente se poate produce n 3 modaliti diferite: prin ataarea medicamentului la membranna celular cu producerea ulterioar de Ac (cazul penicilinei, quininei, sulfonamidelor), prin formarea de complexe imune circulante medicament-anticorp care se ataeaz pe membrana celular i prin inducerea producerii de autoanticorpi (alfa metildopa). (Figura nr. 11) - trombocitopenia i tendina la hemoragie dup administrarea de chinin, care se ataeaz de trombocite i stimuleaz producerea de autoanticorpi; - apariia unui sindrom asemntor lupusului eritematos dup administrarea de hidralazin care stimuleaz producerea de autoanticorpi anti-ADN; - anemia hemolitic dup infecii cu Mycoplasma pneumoniae, datorit stimulrii producerii de anticorpi care se fixeaz pe hematii; - cardita reumatismal din reumatismul articular acut (anticorpii fa de streptococul betahemolitic de grup A reacionnd ncruciat cu esutul cardiac); - sindromul Goodpasture (dup apariia de Ac care se fixeaz pe membrana glomerular renal sau la nivel pulmonar, se activeaz C', rezultnd leziuni grave ale membranelor celulare). Studiul mecanismului de producere a HS de tip II a stat la baza imaginrii unor tratamente ce folosesc Ac citotoxici: Trastuzumab (antihuman epidermal growth factor receptor 2) n terapia cancerului de sn; Infliximab (Ac anti-TNF) n boala Crohn; Rituximab (Ac anti-CD20) n limfoamele non-Hodgkin, trombocitopenie autoimun, artrit reumatoid i lupus eritematos sistemic; Alemtuzumab (Ac anti CD25) n leucemii i pentru inducerea imunosupresiei la pacienii ce sufer un transplant de celule stem. 18. 6. Povestire adevrat (Cardita reumatismal, entitate a hipersensibilitii tip II ce nu trebuie subestimat) n urm cu 30-40 de ani, reumatismul articular acut (RAA) (febra reumatic) reprezenta un subiect foarte frecvent dezbtut n publicaiile tiinifice, mai mult chiar dect infarctul miocardic acut, de ex. Atunci existau att de muli copii cu aceast boal, nct spitale ntregi erau dedicate tratamentului RAA. n prezent, majoritatea medicilor din rile dezvoltate nu au mai vzut cazuri de RAA (profilaxia primar i secundar a atacului reumatismal realizndu-se n mod corespunztor); experiena n rile occidentale este astzi limitat la constatarea prezenei leziunile de valv mitral la pacieni care au fost afectai de RAA n tineree. 242

n rile dezvoltate, populaia cumulat este mai mic de 20% din populaia globului; pentru restul populaiei (peste 80%), RAA i cardita reumatismal continu s reprezinte o problem important. Se estimeaz c la nivel mondial exist 15,6 milioane de persoane cu RAA, n fiecare an apar peste 450.000 de cazuri noi, iar circa 230.000 decese sunt provocate fie de RAA fie de diferitele complicaii ale RAA. Este posibil ca numrul real de cazuri s fie mai mare. O consecin negativ a scderii interesului fa de RAA n rile dezvoltate este reducerea cercetrii n acest domeniu i singurele progrese din ultima jumtate de secol au fost realizate n domeniul tratamentului medical i chirurgical al RAA. Principala modalitate de control al RAA rmne tratamentul corect al faringitelor cu streptococ -hemolitic de grup A i administrarea de injecii cu penicilin retard (varianta depozit cu intervalul cel mai lung ntre 2 administrri poate fi administrat la 3-4 sptmni), de-a lungul unei perioade lungi de timp, la persoanele cu o istorie de RAA pentru a preveni episoadele recurente (profilaxie secundar). Ambele strategii au fost publicate nc din anii 50, n SUA. n prezent se ncearc i obinerea unui vaccin, pentru profilaxie primar (se estimeaz c n 10-20 ani va putea fi obinut un vaccin sigur i eficient). n lipsa unor cercetri realizate n rile dezvoltate, se ncearc obinerea unor date n statele n care RAA are o frecven crescut. Spre exemplu, studii realizate n Mozambic, Cambodgia, Frana i Australia, au demonstrat utilitatea ecocardiografiei n detectarea pacienilor cu boal cardiac reumatic (copii cu vrst colar), detectndu-se astfel cu 90% mai multe cazuri dect prin metoda clasic, de diagnostic clinic. S-a descoperit c 2-3% dintre copii cu vrst colar din Cambodgia i Mozambic sufereau de boal cardiac reumatic, majoritatea nefiind diagnosticai n cursul acestui studiu. Aceste date confirm faptul c RAA i cardita reumatismal au o suficient de mare importan pentru a atrage atenia publicului internaional i a comunitilor de cercetare.

18. 6. Verificai-v cunotinele Alegei rspunsul corect. ntrebarea 1 Printre rolurile hipersensibilitii de tip II se numr: a). distrugerea bacteriilor extracelulare i intracelulare b). eliminarea celulelor infectate cu virusuri c). distrugerea unor parazii sau fungi d). toate cele de mai sus ntrebarea 2 Care dintre urmtoarele afirmaii este incorect? a). n HS de tip II limfocitele Tc cu efect litic fa de celulele infectate viral. b). n HS de tip II sunt utilizate att mecanismele imunitii naturale (implicnd PMN, macrofage, celule NK) ct i ale imunitii specifice. c). Imunitatea specific presupune, printre altele, formarea de Ac care vor forma ulterior complexe imune circulante. d). Complexele imune circulante sunt rapid epurate din organism, ele neavnd posibilitatea de a se depune la nivelul esuturilor.

243

18. 7. Hipersensibilitatea de tip III (prin complexe imune circulante) Fenomene experimentale Patologia uman HS de tip III se poate datora: - unei infecii persistente (ex. lepr, malarie, hepatit viral, endocardit stafilococic); - unei boli autoimune (ex. artrit reumatoid, lupus eritematos sistemic, polimiozit); - inhalrii de material antigenic (ex. actinomicete n cazul plmnului de fermier, antigene aviare n cazul plmnul cresctorilor de psri). Complexele imune activeaz o serie de ci ale rspunsului imun. Aminele vasoactive eliberate n cadrul activrii acestor ci determin retracia celulelor endoteliale, ceea ce are ca efect creterea permeabilitii vasculare, depunerea complexelor imune, dar i expunerea colagenului, care va stimula agregarea trombocitelor i formarea de microtrombi. Se intr ntr-un cerc vicios deoarece complexele imune depuse pe membrana bazal continu s genereze C3a i C5a (anafilatoxine). Astfel, complementul, iniial cu rol protectiv, determin ulterior creterea suplimentar a permeabilitii capilare. Polimorfonuclearele sunt atrase i i exociteaz coninutul n loc s endociteze complexele imune (acestea nu pot fi desprinse de pe membrana bazal vascular). Enzimele inhibitoare serice mpiedic enzimele lizozomale s acioneze la nivel sistemic, ns nu i local, de aceea se vor genera leziuni tisulare locale. Eritrocitele primatelor conin receptori pentru C3b, importani pentru preluarea complexelor imune i transportul lor ctre splina i ficat, unde vor fi fagocitate. n HS de tip III, sistemul este suprasaturat, ceea ce i scade eficiena. Complementul menine complexele Ag-Ac solubile pe calea clasic i resolubilizeaz complexele Ag-Ac agregate pe calea altern, de aici putndu-se deduce rolul depleiei de componente ale complementului sau a unor boli ereditare (deficit C2) n patologia HS de tip III. Este important i dimensiunea complexelor imune. Cele mari sunt repede preluate de ficat i eliminate, n timp ce complexele mici rmn n circulaie o perioad mai lung de timp. Un defect genetic ce determin sinteza de Ac cu afinitate joas, va favoriza producerea de complexe Ag-Ac mici i deci, leziunile caracteristice HS de tip III. Depunerea complexelor imune Administrarea de metilsergida sau clorfenilamina (antagoniti ai aminelor vasoactive) reduce considerabil depunerea complexelor imune prin scderea permeabilitii vasculare. Depunerea complexelor mai este dependent de regimul presional crescut i de prezena turbulenelor. n capilarele glomerulare presiunea sngelui este de 4 ori mai mare dect n restul capilarelor. Turbulene se ntlnesc n zonele de bifurcaie a arterelor i n zonele de filtru vascular (plexurile coroide i corpii ciliari). Preferina pentru un esut sau altul poate fi dependent de sarcina electric a complexului imun, de gradul de glicozilare a Ac. Fenomene experimentale Reacia Arthus a fost descris n 1903 de Maurice Arthus i Nicholas Breton, dup injectarea subcutanat de ser de cal la un iepure hiperimunizat. Leziunile au fost maxime dup aproximativ 6 ore. Boala seric acut, descris n 1911 de von Pirquet, a fost studiat din nou n anii 1960, descriindu-se zece modele de glomerulonefrite experimentale (Dixon). Deoarece complexele imune circulante (CIC) se depoziteaz n esuturi, apare conceptul de antigen in situ. Dup ce complexul imun se formeaz n locul respectiv sau este fixat secundar, se iniiaz (aa cum am menionat anterior) o cascad de evenimente: activarea complementului i a factorilor anafilactoizi chimiotactici C3a i C5a; afluxul de neutrofile, care produc leziuni prin enzimele lizozomale i 244

 afluxul de trombocite, cu generarea fenomenelor de tromboz. Fenomenul Arthus a fost observat la iepure, cobai, oarece etc, dar i la om. Experimentul a fost efectuat pe iepure prin injectarea de antigen netoxic (ex. albumin) de la alt specie, asociat cu un adjuvant imun. Dup unele rapeluri, necesare uneori pentru obinerea de anticorpi circulani IgG precipitani, reacia Arthus poate fi obinut prin injectarea subcutanat a antigenului. Manifestrile apar dup 2 ore, atingnd maximum la 6 ore i dispar dup 24-48 ore. Constau n edem, eritem indurat, peteii i uneori purpur necrotic sau chiar necroz. Leziunile de la locul injectrii antigenului duc la fixarea de igG i C3b cu sediul perivascular sau n peretele vascular. Boala serului a) Boala serului acut. naintea erei antibioticelor, multe boli infecioase erau tratate prin injectarea de ser de cal hiperimunizat. n 1911, von Pirquet descrie complicaiile acestei terapii sub termenul de boal seric (febr, artralgii, vasculit cutanat), survenit la unii bolnavi dup 8-12 zile de la prima injecie. Injectarea unic, pe cale intravenoas, a unei substane netoxice, ca serumalbumina bovin (BSA), n cantitate mare, la animalul neimunizat (iepure), este urmat de apariia bolii serice acute (experimental) cu 3 faze: 1. faza anterioar imunizrii (dureaz 5-8 zile. BSA marcat radioactiv, scade, iniial brutal prin difuziune n spaiile extravasculare, apoi dup 24 de ore, lent, corespunztor propriului catabolism); 2. faza complexelor imune (corespunde prezenei concomitente de BSA i a anticorpilor anti-BSA); este boala seric cu glomerulonefrit. n jurul zilei a 5-a, concentraia sangvin de BSA scade rapid. Anticorpii anti-BSA liberi nu sunt decelabili dect dup dispariia BSA liber. Detectarea complexelor imune corespunde acestei perioade, ca i scderea complementului seric. Manifestrile patologice nu sunt datorate anticorpilor antiBSA liberi i nici complexelor imune circulante. Ca i n reacia Arthus, leziunile sunt datorate aciunii complementului, care este urmat de un aflux de neutrofile. La animalul fr complement apare o simpl albuminurie fr glomerulonefrit); 3. faza de restitutio ad integrum (nu mai exist antigen liber sau conjugat decelabil; anticorpii anti-BSA sunt crescui; manifestrile clinice, n special glomerulonefrita, regreseaz rapid). b) Boala seric cronic. Este dificil de reprodus la animal. Totui administrarea repetat a antigenului (din 2 n 2 zile), permite producerea unei glomerulonefrite cronice extramembranare proliferante. Patologia uman Principalele afeciuni umane sunt: bolile comparabile cu reacia Arthus (n care antigenul induce o reacie local prin difuziunea anticorpilor IgG precipitani); un exemplu este boala plmnului de fermier [dup contactul n timpul zilei cu fnul mucegit (Actinomyces thermophylus), apare la nceputul nopii (dup 6 ore) o stare de asfixie care dispare n urmtoarele ore]; manifestri mai generale, cu atingerea rinichiului, articulaiilor, pielii i uneori a creierului; apar leziuni de tipul glomerulonefritei extramembranare, uneori proliferative. Afeciunile mai frecvente sunt lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixt, glomerulonefritele i periarteritele poststreptococice etc. n 2/3 din cazurile de anemie hemolitic imuno-alergic medicamentoas se formeaz anticorpi IgM anti-medicament. n aceste cazuri apar adesea manifestri generale: febr, frison, mialgii cu dureri lombare i uneori anurie tranzitorie, prin necroz tubular acut.

18. 8. Povestiri adevrate Vasculit necrozant aparut n cadrul glomerulonefritei difuze postinfecioas Vor fi prezentate dou cazuri de glomerulonefrit i evoluia lor clinic i anatomopatologic. Biopsiile efectuate au evideniat aspectul de glomerulonefrit difuz acut postinfecioas, 245

asociat cu necroz fibrinoid i infiltrat inflamator leucocitar n peretele arteriolelor i arterelor interlobulare. Au fost observate proliferri celulare. n ambele cazuri a aprut insuficiena renal acut (IRA) sever (n cazul celui de al doilea, evoluia a fost nefast, spre deces). Primul caz Un copil de sex masculin, 11 ani, a fost internat n spitalul din oraul de reedin. Motivele internrii au fost reprezentate de inapeten, edem facial, diaree, vom i hematurie macroscopic, constatate n ultimele 2 zile. La internare s-a constatat c pacientul era febril (38C) i prezenta hipertensiune arterial (TA = 220/120 mmHg). Dup o sptmn, n timpul internrii, a aprut oligurie i a fost trimis la un spital de un nivel superior. A evoluat spre anurie i a necesitat dializ peritoneal. Dup 4 sptmni de la internare, anuria a continuat s persiste, asociindu-se cu episoade de vom; TA a putut fi controlat medicamentos. A fost transferat la spital de nivel superior. Examenul clinic la internare a artat o stare general relativ bun, edem prezent n ptrimea distal la nivelul membrelor inferioare, greutate = 78,4 kg, nlime = 157 cm, TA = 100/70 mmHg, 26 respiraii/minut, 76 bti cardiace/minut. A fost meninut n dializ peritoneal continu. Rezultatele analizelor de laborator la aceast internare au fost urmtoarele: hematocrit 28%, hemoglobin 9,2 g / dl, proteine totale 8,2 g%, albumin 2,9 g%, Na = 138 mEq/l, K = 4,3 mEq/l, Ca = 8,4 mg%, P = 8,6 mg%, Mg = 1,5 mg%, uree = 172 mg%, creatinin = 18,3 mg%; factor antinuclear negativ. Ecografia renal a fost n limite normale pentru vrsta lui. Datorit prezenei vrsturilor, s-a indicat efectuarea endoscopiei digestive (n a doua zi de la ultima internare), evideniindu-se hernie hiatal i duodenit (la examenul microbiologic nu s-a identificat H. pylori). A primit tratament cu domperidon i omeprazol, n urma cruia greaa i vrsturile au disprut. n a 5-a zi de la internare s-a efectuat o biopsie renal, iar diagnosticul a fost: glomerulonefrit proliferativ difuz endocapilar exsudativ, cu 17% proliferri celulare. La examenul n imunofluorescen s-au observat depozite granulare difuze de C3 n structura capilarelor i arteriolelor. Prin examenul cu ajutorul microscopului electronic s-au observat depozite electronodense mezangiale, subendoteliale i subepiteliale. n ziua a 14-a de la internare s-a iniiat tratament (puls-terapie / doze mari administrate pentru perioade scurte) cu metilprednisolon 1g i.v. i prednison, pe cale oral, 40 mg/zi. Dup a 3-a zi de corticoterapie s-a continuat cu prednison 40 mg/zi. n a 20-a zi de internare, datorit unei HTA acut, pacientul a primit propanolol i minoxidil. Abia din a 26-a zi de internare, pacientul a prezentat diurez de 10 ml/zi, iar dup nc trei zile diureza a ajuns la 120 ml/zi (cu hematurie macroscopic). Rezultatul analizelor de laborator n a 4-a sptmn de la ultima internare au fost: uree = 80 mg%, creatinin = 3,5 mg% (o valoare nc foarte mare, dar de circa 5 ori mai mic dect n momentul internrii), clearance-ul creatininei = 13ml /min /1,73 m2 (suprafaa corporal), ASLO = 974 UI/ml, C3 = 48,4 mg% (Normal = 0,5 - 1,5 mg%). n a 29-a zi de la internare diureza a ajuns la de 900 ml iar TA era fost inut sub control. n aceste condiii, pacientul a fost externat, i s-a recomandat s revin la control, sptmnal. Dup nc dou sptmni diureza s-a meninut la de 900-1000 ml/zi, valoarea pentru uree a fost de 50 mg% iar pentru creatinin de 2,1 mg%; nu a mai fost necesar dializa, dar s -a meninut tratamentul antihipertensiv. Al doilea caz O pacient de sex feminin, n vrst de 66 ani, a fost internat n spitalul Facultii de Medicin din localitatea de reedin. Motivele internrii au fost reprezentate de: anorexie, diurez sczut i hematurie macroscopic. La internare s-a vzut c pacienta este apatic i prezint tuse cu expectoraie spumoas. 246

Prin anamnez s-a aflat c n urm cu circa o lun, pacienta a fcut o infecie orofaringian, pentru care a primit tetraciclin. Examenul clinic la internare a relevat o stare general bun, absena temperaturii, greutate = 63 kg, nlime = 147 cm, TA = 140/80 mmHg, 80 bti cardiace / minut, 20 respiraii / minut, jugulare turgescente, raluri ronflante la nivelul bazelor pulmonare, ficat palpabil la 5cm sub rebordul costal. Au fost nregistrate urmtoarele valori pentru analizele de laborator efectuate: hematocrit 40,2%, hemoglobin 13,5 g/dl, numr leucocite = 15.600/mm3. Examenul de urin a artat o densitate de 1025, pH = 5, proteinurie = 4+, fr glicozurie, hematurie = 3+, hemoglobinurie = 3+, leucocite, hematii i cilindri numeroi n sedimentul urinar iar urocultura a fost negativ. Dup 12 ore de la internare, proteinuria a crescut. Iar celelalte analize de laborator au avut urmtoarele rezultate: proteine totale = 6,4 g%, albumin = 3,6 g%, globuline = 2,8 g%, glicemie = 156 mg%, Na = 136 mEq/l, K = 4 mEq/l, Ca = 10 mg%, P = 8,2 mg%, acid uric = 10,6 mg%, uree = 174 mg%, creatinin = 1,84 mg%, proteina C reactiv = 100 mg%, C3 = 8,3 mg% (Normal = 0,5 1,5 mg%), C4 = 42,9 mg% (Normal = 400-500 g/ml), ASLO = 833 UI/ml. Factorul anti-nuclear a fost absent. Examenul ecografic renal a fost n limite normale. Funcia renal s-a deteriorat progresiv, i n aceste condiii, la 20 de zile de la internare, ureea a ajuns la valoarea de 223 mg%, creatinina la valoarea de 8,3 mg%, clearance-ul creatininei la 5,34 ml/min, iar proteinuria la 3,9 g/24 h. S-a efectuat o biopsie renal care a evideniat o glomerulonefrit proliferativ difuz endocapilar exsudativ, cu necroz tubular acut (25% proliferri celulare). La imunofluorescen s-au observat depozite granulare difuze de C3 n capilare i mezangiul arteriolelor. Prin ME s-au observat depozite voluminoase mezangiale i subepiteliale. n acest context s-a pus diagnosticul de glomerulonefrit acut post-infecioas. Pacienta a primit un tratament n urma cruia funcia renal s-a ameliorat progresiv, iar la 6 zile ureea a ajuns la valoarea de 122 mg%, creatinina = 2,85 mg% i clearance-ul creatininei = 14 ml/min, moment n care a fost externat (la cerere). Dup aproximativ dou sptmni, pacienta a revenit, iar la acel moment valoarea diurezei era sczut, prezenta proteinurie = 9,2 g/24 h, uree = 180 mg%, creatinin = 3,17 mg, clearance-ul creatininei = 9 ml/min; din punct de vedere clinic pacienta era dispneic i prezenta fatigabilitate intens. A doua biopsie a demonstrat nrutirea tabloului anterior, cu 80% proliferri celulare i 42% scleroz glomerular i necroz fibrinoid pe arterele mici, cu depozite de C1q, C3, IgG i fibrin. Pacienta a evoluat foarte rapid ctre IRA. Dup 3 sptmni s-a nceput dializa. Dup 9 sptmni, a prezentat erizipel la membrul inferior drept i oc septic, urmat de deces.

18. 9. Verificai-v cunotinele Alegei rspunsul corect. ntrebarea 1 Este corect afirmaia: a). Pentru HS de tip III apare conceptul de Ac in situ b). Complexul imun se formeaz n esuturi sau este fixat secundar c). Reacia Arthus a fost descris dup injectarea subcutanat de ser de iepure la un cal hiperimunizat. 247

d). Boala seric se caracterizeaz prin febr, artralgii, vasculit cutanat survenit imediat dup injectarea de ser de cal hiperimunizat ntrebarea 2 Care dintre urmtoarele nu este faz a bolii serice acute? a). faza leziunilor vasculare b). faza anterioar imunizrii c). faza de restitutio ad integrum d). faza complexelor imune ntrebarea 3 Urmtoarea afirmaie leziunile sunt datorate aciunii complementului, care este urmat de un aflux de neutrofile este valabil: a). pentru reacia Arthus b). pentru boala serului c). att pentru reacia Arthus ct i pentru boala serului d). pentru nici una dintre ele. ntrebarea 4 Printre principalele afeciuni umane datorate HS de tip III nu se numr: a). boala plmnului de fermier b). lupusul eritematos diseminat c). cardita reumatismal d). glomerulonefritele i periarteritele poststreptococice. ntrebarea 5 Depunerea complexelor imune este dependent de: a). permeabilitatea presional b). regimul presional crescut c). prezena turbulenelor d). nici una dintre meniunile de mai sus e). primele 3 afirmaii sunt corecte.

18. 10. Hipersensibilitatea de tip IV (ntrziat, mediat celular) Hipersensibilitatea de tip IV reprezint o reacie (mai) ntrziat, care apare la 48-72 de ore dup contactul cu antigenul i se datoreaz limfocitelor Th1 specifice antigenului. HS de tip IV este un tip exagerat de rspuns imun celular. HS de tip IV poate fi considerat ca un martor al mecanismelor protective fa de germenii intracelulari dar i de alte substane chimice care se leag puternic de membrana celular. Totui, corelaia protecie-hipersensibiltate nu e perfect, n sensul c se poate ca un pacient cu HS de tip IV la un anumit germen s dezvolte infecii progresive cu acel patogen (ex. situaia din infeciile cu M. leprae). Au fost descrise patru tipuri diferite de hipersensibilitate (de tip IV), dintre care ultimele trei sunt importante n patologia uman. 248

- Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote (nu are echivalent la om); - Hipersensibilitatea de contact Este o reacie epidermic, care corespunde la om cu eczema de contact / dermatita de contact. n experimentele pe animal se plaseaz pe piele diferite antigene, care penetreaz uor n epiderm i se leag solid de celule. Cel mai frecvent se utilizeaz DNCB (dinitroclorbenzen), DNFB (dinitrofluorbenzen), Oxazolina sau Clorura de picryl. DNCB este un exemplu de hapten care sensibilizeaz aproape toi contacii, i pe care o putem folosi ca s stimulm imunitatea mediat celular. Un rol important n sensibilizare l joac keratinocitele i celulele Langerhans. Reacia de hipersensibilitate de contact survine dup ce animalul a fost sensibilizat n prealabil. Dup o injecie ulterioar intradermic sau dup aplicarea antigenului pe tegument, urmeaz legarea haptenei de un carrier, complexul antigenic este fagocitat de o celul Langerhans care se va activa, matura i i va ncepe migrarea spre zona paracortical a nodulilor limfactici sub aciunea IL-1 i TNF secretai de keratinocitele agresate. Corespunde unei infiltrri dermice i epidermice, edemului epidermic i eritemului aprut dup 48-72 ore, care va persista cteva zile. Absena reaciei se datoreaz unui deficit imun celular. Sensibilizarea prealabil cu DNCB (ex. la fotografii) poate declana un oc anafilactic la IgE. Primele modificri apar ncepnd cu a 6-a pn la a 8-a or dup contactul cu alergenul; LT activate i cele cu memorie vor ajunge n circulatie i ulterior n zona inflamat, alturi de monocite, unde vor ndeprta complexul hapten-carrier. Ele nconjoar vasele sanguine, glandele sudoripare, glandele sebacee, foliculii piloi i infiltreaz epidermul. Infiltratul celular se accentueaz progresiv i ajunge maxim spre a 72-a or. Infiltratul conine celule T CD4+ (n majoritate), T CD8+, celule Langerhans, macrofage i bazofile. Aceleai keratinocite, dar i macrofagele, vor produce ulterior PGE, cu rol inhibitor al reaciei inflamatorii. LTs intervin de asemenea n terminarea reaciei de HS (la fel ca i ultravioletele), prin scderea producerii de IL-1. Ultravioletele inhib direct i celulele Langerhans. n concluzie, fenomenele apar n urmtoarea succesiune: celulele Langherhans activeaz LT CD4+ cu memorie; acestea produc diferite citokine: IL-2, IL-3, IFN-g i GM-CSF. Celelalte celule sunt recrutate i activeaz o reacie inflamatorie n care predomin celulele mononucleare. - Hipersensibilitatea de tip tuberculinic (Figura nr. 12) Persoanele infectate cu unul din germenii (M. tuberculosis, M. leprae, Leishmania tropica etc.) / sau care vin n contact cu substanele chimice (beriliu, zirconiu etc.) care pot provoca hipersensibilitatea de tip tuberculinic au LT deja activate. n laborator, pentru sensibilizare se injecteaz la un animal Ag mpreun cu adjuvantul complet Freund (pregtirea animalului prin imunodepresie cu ciclofosfamid permite i utilizarea adjuvantului Freund incomplet). Aceast faz de sensibilizare ncepe cu 2-3 sptmni nainte de testarea HS. Dup injectarea antigenului la animalul sensibilizat, LT specific sensibilizate migreaz n jurul vaselor sanguine (la 12 ore) iar activarea lor duce la secreia de interleukine care recruteaz alte celule nesensibilizate. Infiltratul desparte fibrele de colagen din derm i atinge un maxim la 48 72 ore dup injecie. Celulele observateiniial sunt LT [predomin T CD4+ (raport CD4/CD8 2/1)], ulterior ncep s se acumuleze macrofagele (atingnd un maxim spre finalul celei de a treia zi de la inoculare). Fenomenele sunt maxime la nivelul dermului dar pot atinge i epidermul; keratinocitele exprim la suprafaa lor molecule HLA DR (la 48-96 de ore dup apariia infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica rspunsul imun al gazdei), circulaia aferent i eferent a celulelor imunocompetente seamn cu cea observat n hipersensibilitatea de contact; se poate observa o infiltrare uoar cu bazofile; n timp se poate dezvolta o reacie granulomatoas. La om se practic intradermoreacia cu tuberculin (PPD, derivat proteic purificat, un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene). Citirea rezultatului se face dup 249

72 ore, asigurnd o bun iluminare a zonei examinate (de preferat lumina natural). Se identific existena unei eventuale arii intens eritemato-violacee, circumscriind urma nepturii dermice. Apoi se apreciaz tactil (prin repetate micri ntr-un sens i altul deasupra zonei de reacie) cu pulpa inelarului, limitele unei zone de induraie (perceput ca fiind reliefat) i care corespunde histopatologic infiltraiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentnd rspunsul imun fa de antigenul injectat. Se msoar i se nregistreaz diametrul maxim al zonei de infiltraie (a se vedea i anexa nr. 3). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermic de tuberculin se rezolv n mod normal n 5-7 zile; persistena acestora face ca leziunea s se transforme dintr-una tuberculinic ntr-una granulomatoas. - Hipersensibilitatea granulomatoas Este o form mai grav de hipersensibilitate (ntrziat) de tip IV care survine atunci cnd antigenul persist i nu poate fi eliminat. Se caracterizeaz printr-o acumulare i o proliferare de macrofage, care stau la originea granulomului care apare la 21-28 zile dup sensibilizare i poate s persiste mai multe sptmni. Hipersensibilitatea granulomatoas poate succeda diferite hipersensibiliti ntrziate precedente, n general dup o perioad de 3 - 4 sptmni. Elementul distinctiv al hipersensibilitii granulomatoase este formarea de celule epiteloide, celulele derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii reticulului endoplasmatic, cu rolul lor de a ntreine inflamaia prin secreia continu de TNF. Persoanele cu deficit de IFN nu dezvolt granuloame, ns nici nu se apr eficient mpotriva tuberculozei, leprei, leishmaniozei, schistosomiazei etc. Prin fuziunea celulelor epiteloide rezult celule gigante. Mai sunt denumite i celule Langhans. Atenie, sunt diferite de celulele Langerhans! Aceste celule gigante au mai muli nuclei, ns periferici, reticulul endoplasmic este puin dezvoltat, iar mitocondriile i lizozomii sunt n degradare. Se pare ca aceste celule Langhans ar reprezenta etapa final din diferenierea macrofagelor. Reaciile de hipersensibilitate de tip IV observate n patologia uman pot fi observate n trei grupe principale de afeciuni: 1. Eczema de contact care poate aprea datorit bijuteriilor care conin nichel, produselor din piele de animal, produselor cu sruri de crom, cremelor solare, compuilor chimici de cauciuc, produselor farmaceutice (penicilin, streptomicin, neomicin) etc; 2. Maladii infecioase n care agenii patogeni se dezvolt intracelular (tuberculoz, lepr, leishmanioz, listerioz, micoze profunde etc); n cazul M. tuberculosis, leziunea granulomatoas conine pe lng macrofage, celule epiteloide, celule gigante i LT dispuse centrifug, i o zon de necroz central, un fel de puroi numit cazeum. n jurul ntregului ansamblu se afl o zon de fibroz i o cantitate crescut de colagen. n cazul M. leprae, reacia granulomatoas se numete reacia Mitsuda. Apariia de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoz unei alte persoane cu sarcoidoz, constituie pozitivarea testului Kweim. 3. Alte maladii (sarcoidoz ciroz biliar primitiv, hepatitele cronice virale B i C, SIDA, infecia HIV, poliartrita reumatoid, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).

18. 11. Povestire adevrat Un tuberculom, o tumor malign sau sarcoidoz? Tuberculoza sistemului nervos central se poate prezenta ca meningit tuberculoas, sub form de tuberculoame sau, rareori, sub form de abcese. Examenul clinic este de obicei nespecific, n faza acut putnd sugera o tumor malign (25-85% dintre pacieni sunt asimptomatici). Localizrile extracerebrale trebuie investigate sistematic. 250

Cazul prezentat este cel al unui pacient de sex masculin, n vrst de 53 de ani, internat pentru slbiciune muscular la nivelul membrelor inferioare, cu deficit proprioceptiv. Investigaiile de laborator au fost n limite normale, iar testul HIV a fost negativ. Examenul tomografic (CT) cranian a revelat o leziune masiv n lobul parietofrontal drept, cu zone omogene perilezionale relativ sugestive pentru un proces malign (cancer) cu localizare cerebral; examenul RMN a confirmat existena i dimensiunile leziunii. Datorit simptomatologiei i valorilor crescute ale reactanilor de faz acut, s-a nceput terapia cu corticosteroizi, pacientul prezentnd o remisie a simptomelor. S-a efectuat biopsie din zona afectat, histologic descoperindu-se leziuni foliculare cu celule epitelioide dar fr necroz. S-au realizat frotiuri colorate Gram, Ziehl-Neelsen i PAS; nu au fost evideniate microorganisme iar decizia a fost de a nu se trimite produsele recoltate spre laboratorul de bacteriologie. Pentru a se elucida motivul apariiei acestei leziuni, au fost realizate i o serie de investigaii extracerebrale (CT toraco-abdominal, lavaj bronhoalveolar i bronhoscopie) fr a se obine date suplimentare pentru un diagnostic pozitiv. n aceste condiii, medicul curant a pus diagnosticul de sarcoidoz localizat la nivelul SNC iar pacientul a fost externat, continund la domiciliu tratamentul cu corticosteroizi, conform scrisorii medicale eliberat n spital. Dup 2 luni brbatul a fost reinternat cu deficiene motorii i febr (38,2C). S-a indicat din nou examen CT; rezultatul nu a permis explicarea simptomatologiei. Recoltndu-se produse din mai multe zone, examenul bacteriologic, complet, a permis punerea diagnosticului de tuberculoz diseminat. S-a continuat tratamentul cortizonic, dar s-a nceput tratamentul anti-tuberculos cu o asociere de 4 medicamente (izoniazid, rifampicin, pirazinamid i etambutol). Dup 4 luni simptomele au reaprut i s-a luat decizia interveniei chirurgicale, pentru excizia formaiunii. Analiza anatomo-patologic a pus n eviden structura tipic pentru granulomul tuberculos (ceea ce prin biopsia oarb efectuat cu cteva luni nainte, nu s-a reuit). Tratamentul a continuat, dar a fost adugat amikacina, penta-terapia anti-TB realizndu-se pentru o durat de 6 luni. Pacientul nu a prezentat reacii adverse. Dup un an, au fost scoase din asocierea medicamentoas 3 medicamente iar pacientul a primit pentru nc 6 luni (durata total a tratamentului anti-TB a fost de 18 luni) numai izoniazid i rifampicin. Discuii Tuberculoza cerebral are o rat de mortalitate care variaz ntre 5 i 60%. Tratamentul de elecie este cel medicamentos, cu o durat de circa 18 luni, pn la dispariia leziunilor sau pn la calcificarea acestora. O cretere paradoxal n dimensiuni a leziunii, sub tratament, poate duce la recomandarea interveniei chirurgicale de excizie a tuberculomului, aa cum s-a ntmplat i n aceast situaie.

18. 12. Verificai-v cunotinele Alegei rspunsul corect. ntrebarea 1 Alegei rspunsul greit: a). HS de tip IV reprezint o reacie imediat; b). HS de tip IV apare la 48-72 de ore dup contactul cu antigenul; c). HS de tip IVse datoreaz limfocitelor Th1 specifice antigenului; d). HS tip Jones-Motenu are echivalent la om;

251

ntrebarea 2 Alegeti dintre urmtoarele afirmaii adevrate pe cea care nu se potrivete n context (ca sens de desfurare a reaciilor imune): a). Ultravioletele inhib direct celulele Langerhans, care au un rol important n sensibilizare b). Persoanele cu deficit de IFN nu dezvolt granuloame c). Absena reaciei epidermice la contactul tegumentului cu DCNB se datoreaz unui deficit imun celular d). Keratinocitele exprim la suprafaa lor molecule HLA DR la 48-96 de ore dup apariia infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica rspunsul imun al gazdei ntrebarea 3 Alegei varianta care se potrivete pentru spaiile libere din urmtoarea afirmaie: Intradermoreacia la .................... presupune apariia unei eventuale arii intens..................., circumscriind urma nepturii dermice, ...................... si reliefate, care corespunde histopatologic infiltraiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentnd rspunsul imun fa de antigenul injectat a). tuberculin; eritemato-violacee, indurate b). bacil Koch; eritemato-violacee; indurate c). tuberculin; cianotice; retractile d). bacil Koch; cianotice; indurate ntrebarea 4 (avei de stabilit asocierea corect) 1). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermic de tuberculin se rezolv n mod normal n........... 2). Citirea rezultatului se face dup........... 3). Hipersensibilitatea de tip IV reprezint o reacie ntrziat, care apare la............... a). 5-7 zile b). 48-72 ore c). 72 ore Care este asocierea corect? a). 1-a; 2-b; 3-c b). 1-c; 2-b; 3-a c). 1-a; 2-c; 3-b d). 1-b; 2-a; 3-c ntrebarea 5 Care dintre urmtoarele tipuri de HS de tip IV nu are echivalent la om? a). Hipersensibilitatea tuberculinic b).Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote; c). Hipersensibilitatea de contact d). Hipersensibilitatea granulomatoas

18. 14. Hipersensibilitatea de tip V n cadrul acestui tip de reacie fiziopatologic, anticorpii nu se ataeaz de structurile celulare de suprafa ci de receptori membranari, mpiedic aderarea liganzilor specifici acelor receptori (mimeaz efectul ligandului). n aceste condiii, semnalizarea celular este compromis, iar funcia celulei respective este alterat sau inhibat. Acest tip de HS este ntlnit n boala Graves (Basedow) i miastenia gravis. 252

Boala Graves, o afeciune a glandei tiroide (gu exoftalmic, tegument cu aspect de coaj de portocal, hipertiroidism) a fost considerat o boal autoimun, n care organismul produce autoanticorpi anti-receptor pentru hormonul tireotrop (TSH) i autoanticorpi anti-tiroxin i anti-tireoglobulin (mecanismul nu a fost elucidat complet). Celulele foliculare tiroidiene (prezint pe suprafa receptori pentru TSH), sunt stimulate att fiziologic de ctre hormonul hipozar, ct i patologic, de ctre autoanticorpii (de tip IgG) care imit structura i funciile TSH. Aceast dubl stimulare conduce la o hipersecreie de hormoni tiroidieni (T3 i T4), putnd provoca tireotoxicoz. Simptomele din hipertiroidism pot fi, parial, explicate de ctre aceste mecanisme. De exemplu, exoftalmia poate fi explicat prin faptul c att glanda tiroid i muchii externi ai globului ocular prezint un Ag comun care este recunoscut de ctre auto-Ac; rezult un proces inflamator retroocular i protruzia globilor oculari. Aspectul de coaj de portocal al pielii se datoreaz infiltrrii de Ac subcutanat, determinnd un proces inflamator la acest nivel. Miastenia gravis este o boal neuromuscular caracterizat clinic prin hipotonie muscular intermitent (accentuat n efort, ameliorat n repaus) i oboseal muscular. Mecanismul de producere este autoimun, prin blocarea receptorilor de tip N (nicotinic) ai acetilcolinei de ctre auto-Ac circulani, care ajung la nivelul jonciunii musculare post-sinaptice

18. 15. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. http://www.pnas.org/content/107/50/21553.long Un nou ajutor n managementul terapeutic al pacienilor cu anemie Fanconi http://www.biomedcentral.com/1471-2148/10/264 Sistemul nostru imun i infeciile parazitare http://www.biomedcentral.com/1471-2431/10/61 Fumatul pasiv al copiilor http://www.biomedcentral.com/1471-2431/10/61 Un exemplu de influen a mediului asupra fenotipului http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S180637132010000300003&lng=en&nrm=iso&tlng=en Pot doze repetate de vaccin BCG s protejeze mpotriva astmului? http://www.jci.org/articles/view/43964 Colagenul endogen-terapeutic? http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0011983 Bordetella perttusis pentru inducerea bolilor autoimune n cercetarea fundamental.

253

19. Reacii antigen - anticorp utilizate n microbiologie (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)
19. 1. Mecanism general Reacia antigen-anticorp este o reacie ntre un antigen (Ag) i un anticorp (Ac) i const n legarea gruprii determinante de pe suprafaa antigenului (epitop - o proeminen) cu situsul de combinare de pe suprafaa anticorpului (paratop - o adncitur). (Figura nr. 1) Reacia Ag-Ac are 2 proprieti principale, specificitatea i reversibilitatea. Specificitatea se refer la faptul c un antigen nu este recunoscut dect de anticorpii care au fost produi n urma inoculrii respectivului antigen, iar anticorpii nu recunosc dect antigenul fa de care au aprut. Trebuie menionat c specificitatea nu este absolut, ntruct un Ag cu reactivitate ncruciat, poate reaciona cu un Ac format fa de un alt antigen (reacia ncruciat se explic prin aceea c anumite Ag posed anumite grupri determinante comune). Reversibilitatea complexului Ag-Ac se datoreaz faptului c legturile necovalente sunt reversibile la cald sau pH acid (<3). Legarea antigenului cu anticorpul este determinat de complementaritatea reciproc dintre conturul suprafeei epitopului i paratopului, care apropie la civa Angstromi gruprile chimice care le alctuiesc, permind stabilirea unor fore intermoleculare ntre epitop i paratop (hidrofobe ntre gruprile nepolare, de atracie electrostatic ntre gruprile ionizate de semn contrar). Iniial are loc cuplarea ntre Ag i Ac rezultnd complexe Ag-Ac mici, solubile, care se pot desface relativ uor. n continuare, datorit existenei mai multor situsuri de legare, complexele Ag-Ac mici se reunesc formnd structuri de dimensiuni mai mari, adevrate reele Ag-Ac, care pot fi evideniate fie direct, fie dup utilizarea unor artificii tehnice (19.4., 19.5). 19. 2. Bazele moleculare ale interaciunii Ag-Ac Reacia dintre antigen (Ag) i anticorp (Ac) necesit interaciunea determinantului antigenic (epitop) cu situsul de combinare al anticorpului (paratop). Factorii care condiioneaz interaciunea Ag-Ac sunt: - complementaritatea structural dintre epitop i paratop (reacia este specific); complementaritatea presupune adaptarea conformaional a celor dou grupri, de tipul cheie n broasc (vezi i 17. 1.); Fiecare anticorp posed, n poriunea Fab, o regiune hipervariabil care const n 3 bucle de legtur ntre pliurile adiacente ale domeniilor variabile de la nivelul lanului greu (VH) i celui uor asociat (VL). Aceste fragmente mai poart denumirea de CDR (complementarity-determining regions) sau fragmente ce determin complementaritatea n reacia cu antigenul. ns ntr-o reacie Ag-Ac, nu doar aminoacizii din CDR interacioneaz cu epitopul, ci i alte poriuni din regiunea variabil, uneori existnd posibilitatea ca o poriune CDR s nici nu fie implicat n reacie. - complementaritatea electrochimic a gruprilor care intr n reacie este o consecin a complementaritii structurale; pentru stabilizarea legturii intr n aciune fore intermoleculare, care sunt legturi necovalente, fore nespecifice cu valoare mic, spre exemplu legturi de hidrogen / energie de legare 3-7 kcal / mol; fore electrostatice (coulombiene sau ionice) / energie de legare 5 kcal / mol; legturi van der Waals / energia de legare 1-2 kcal / mol legturi hidrofobe. Complementaritatea structural sau forele intermoleculare nu sunt suficiente, fiecare n parte, pentru a forma legturi stabile; este necesar ndeplinirea ambelor condiii. Cu ct energia de legare a reactanilor este mai mare, cu att complexele Ag-Ac sunt mai stabile.

254

Fiecare determinant antigenic poate avea o structur liniar lucru posibil pentru orice tip de molecul: protein, carbohidrat, lipid, acid nucleic iar n cazul proteinelor, n plus fa de secvena liniar, un epitop poate fi determinat de conformaia proteinei structura teriar. Astfel se definesc dou tipuri de epitopi: liniari i conformaionali. Pe o protein se pot gsi ambele tipuri de epitopi, crescnd astfel ansele ca aceasta s interacioneze cu paratopul specific. Pe de alt parte, secvenele de aminoacizi cunoscute de anticorpi pot fi ascunse n cadrul proteinei, reacia Ag-Ac neputnd avea loc. Aranjamentul spaial al epitopilor pe o protein poate influena modul de legare a Ac. Astfel c atunci cnd determinanii antigenici se situeaz la o distan net unul fa de cellalt, anticorpii se pot lega fr s se suprapun. Cnd epitopii sunt foarte apropiai, ntre anticorpii specifici apar restricii de natur steric, ajungnd s se suprapun. Legarea unui anticorp de epitop poate conduce, n cazuri mai rare, la modificarea conformaional a unui alt epitop, cu consecine pozitive sau negative asupra reaciei Ag-Ac. Acest efect se numete efect alosteric, iar mecanismul este asemntor celui asociat enzimelor alosterice la care centrul activ se poate modifica dup ce enzima a interacionat cu un cofactor activator sau inhibitor. Interaciunea dintre epitop i paratop este definit de 2 parametri (afinitatea i aviditatea anticorpilor). (Figura nr. 2) Afinitatea msoar fora de legare dintre epitop i paratop. Afinitatea este rezultanta forelor de atracie i de respingere care mediaz interaciunea celor doi reactani. O interaciune cu afinitate nalt presupune structuri complementare perfecte, n timp ce complementaritatea imperfect a gruprilor reactante determin o afinitate sczut, deoarece forele de atracie sunt active numai pe distane foarte mici i sunt diminuate de forele de respingere. Afinitatea anticorpilor se poate msura prin dializ la echilibru. Afinitatea reprezint caracteristica unei singure perechi Ag-Ac i este definit printr-o constant, (Kd), care relev ct este de uor s despari un complex Ag-Ac n componentele sale. Cnd Kd este sczut, afinitatea este crescut. n serul uman, anticorpii au diferite afniti fa de antigene, lucru determinat n principal de secvenele din CDR. Aviditatea este un parametru al interaciunii Ag-Ac care rezult din multivalena Ag. Cele mai multe Ag posed mai mult dect un epitop. De exemplu, bacteriile, polizaharidele etc, au pe suprafa un numr mare de epitopi repetitivi (antigene multivalente). Ag proteice au epitopi multipli, dar diferii. Antigenele multivalente leag un numr echivalent de molecule de anticorpi. Energia total de legare a epitopilor multipli ai unui Ag, cu paratopii specifici este mult superioar n comparaie cu energia separat a fiecrei interaciuni dintre epitop i paratop. Aviditatea caracterizeaz energia medie de legare a unui Ag multivalent cu Ac specifici i msoar fora rezultant a afinitii dintre epitopii multipli ai unui Ag i paratopii complementari. Complexele Ag-Ac formate de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificil, deoarece este necesar ruperea tuturor legturilor existente. O molecul pentameric de IgM care are afinitate sczut fa de un antigen multivalent, poate s se lege ferm de Ag, reacia avnd aviditate crescut datorit nsumrii interaciunilor de joas afinitate dintre fiecare epitop i paratop. Spre exemplu, lund n considerare ceea ce se ntmpl n cursul RIP i RIS: Anticorpii din clasa IgM, care apar n RIP au afinitate mare i aviditate mic pentru Ag (se cupleaz uor cu epitopul, dar legtura dureaz puin); Anticorpii din clasa IgG, care apar n RIS au afinitate mic, dar aviditate mare pentru Ag (i legturile sunt mult mai stabile).

19. 3. Reacii ncruciate 255

n anumite cazuri pot avea loc reacii ncruciate; un Ag reacioneaz cu un Ac care a fost sintetizat fa de un alt Ag (aceste reacii pot aprea de ex. datorit faptului c anumite Ag posed anumite grupri determinante comune). Spre exemplu, serul imun anti-polizaharid capsular de Streptococcus pneumoniae aglutineaz eritrocitele umane de grup A (cu specificitate antigenic conferit de N-acetil-galactozamin), iar serul imun anti-Escherichia coli aglutineaz eritrocitele umane de grup B (cu specificitate antigenic conferit de galactoz). Persoanele alergice la diferite mncruri sau substane, pot dezvolta foarte uor alte stri de hipersensibilitate la structuri asemntoare.. De exemplu un individ alergic la alune, poate s dezvolte alergie i fa de soia, mazre sau alte semine.

19. 4. Stadiile reaciilor antigen-anticorp Interaciunea primar se datoreaz legrii efective a Ac de Ag i depinde n mod direct de cantitatea i afinitatea Ac. Din punct de vedere diagnostic, reaciile Ag-Ac n care reactanii se afl n interaciune primar pot fi puse n eviden prin nefelometrie (reacie de precipitare n mediu lichid n care folosindu-se lumina laser, se pun n eviden complexele Ag-Ac; razele laser sunt dispersate de complexele n soluie i apoi focalizate cu ajutorul unei lentile spre un fotometru; aici se prelucreaz semnalul luminos i pe baza lui se face o curb de determinare a concentraiei complexelor imune). n cazul unora dintre tipurilor de reacii care vor fi discutate n capitolele urmtoare, interaciunea primar nu devine vizibil (complexele Ag-Ac sunt de dimensiuni mici, solubile i se pot desprinde uor). In vivo aceste interaciuni sunt spre exemplu necesare i suficiente n vederea neutralizrii unor exotoxine circulante (difteric, botulinic etc), pentru inhibarea activitii unor bacterii sau virusuri, sau n declanarea unor reacii de hipersensibilitate (ex. n reacia de HS de tip I). Interaciunile secundare apar la circa 30 de minute dup interaciunile primare. Datorit faptului c Ag poate avea mai muli epitopi iar Ac are minim 2 paratopi (minim 2 pentru molecule de anticorpi izolate, precum IgE, IgD, IgG, dar n cazul IgM sunt 10 paratopi molecula stabil de IgM este pentameric, iar n cazul IgA, 4 paratopi, IgA secretorii fiind complexe dimerice) complexele primare mici, solubile, interacioneaz ntre ele formnd complexe secundare, produsul final fiind un complex Ag-Ac ca o reea tridimensional, insolubil, mult mai stabil dect complexele primare. Din punct de vedere diagnostic, reaciile Ag-Ac n care reactanii se afl n interaciune secundar pot fi puse n eviden prin tehnici care vor fi enumerate n finalul acestui capitol i discutate n capitolele urmtoare. In vivo, manifestrile interaciunilor secundare sunt dependente de natura reactanilor i de condiiile de reacie. Interaciunile teriare definesc manifestrile in vivo ale reaciilor Ag-Ac i depind n special de anumite variabile care sunt caracteristice gazdei. Interaciunile teriare pot conduce la un rezultat pozitiv (protecia gazdei) sau negativ (degradare tisular).

19. 5. Tipuri de reacii Ag-Ac n funcie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmrit exist mai multe tipuri de reacii Ag-Ac, dup cum urmeaz: reacii de precipitare o pot avea loc n gel (imunodifuzia radial simpl Mancini, dubla difuzie Ouchterlony etc) sau o pot avea loc n mediu lichid (reacia Ramon, Ascoli etc.) reacii de aglutinare 256

o o o o o o o o o o o

se pot folosi n diagnosticul bacteriologic (ex. reacia Huddleson) sau se pot folosi n diagnosticul serologic (ex. reacia Wright) reacia de fixare a complementului (RFC) n diagnosticul serologic al sifilisului (RBV Reacia Bordet-Wasserman), leptospirozei etc. n diagnosticul serologic al infeciilor virale etc. reacii de seroneutralizare reacia ASLO (n diagnosticul serologic al infeciilor streptococice) testul plcilor semineutralizate diferite intradermoreacii cu mecanism imun umoral etc. reacii n care componentele sunt marcate izotopic (radio immunoassay, RIA) enzimatic (enyzme-linked immunoassay, ELISA) fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA) chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA).

19. 6. Povestire adevrat

Utilizarea ASLO n diagnosticul infeciilor aparatului locomotor Dintre patologiile infecioase n ansamblu, infeciile aparatului locomotor sunt printre cele mai mortale i mai greu de ngrijit. Un rspuns terapeutic satisfctor depinde de abordarea multidisciplinar a afeciunii: chirurgia trebuie coroborat cu diagnosticul microbiologic corect executat. n general exist tendina de a se instaura un tratament antibiotic empiric fr un diagnostic de laborator prealabil, iar dac tratamentul nu se arat eficient, se va aborda un altul, tot empiric, cu un spectru mai larg. Administrarea antibioticului conform antibiogramei ar fi soluia cea mai buna i cea mai ieftin, dar frecvent nu se recurge la ea. Marea majoritate a infeciilor aparatului locomotor sunt produse de stafilococi (osteomielite, fasciite, miozite etc.), nsa un procent de pn la 7% au ca etiologie streptococii. ntr-un studiu retrospectiv la un spital din Geneva, a fost analizat un grup de pacieni cu infecii musculoscheletale dovedite clinic prin culturi i crora li s-a msurat i titrul ASLO n dinamic n timpul internrii. Doar 5 dintre cei 21 de pacieni urmrii aveau titrul ASLO crescut, iar agenii patogeni identificai la aceti pacieni au fost: S. pyogenes si streptococi -hemolitici din grupurile C i G. La restul de 16 pacieni care aveau titrul ASLO normal, germenii infectani au fost stafilococi, enterobacterii, streptococul -hemolitic de grup B i bacilul piocianic. Din aceste date se constat c titrul ASLO a fost crescut doar n infeciile streptococice cu streptococi de grup A, C i D i nu n alte infecii date de ali germeni. n literatura se cunoate c detectarea ASLO are drept scop identificarea aproape exclusiv a infeciilor provocate de S. pyogenes i mai ales a sechelelor post-infecioase precum reumatismul articular acut, cardita reumatismal sau glomerulonefrita poststreptococic. Se dovedete aadar c titrul ASLO nu este o metod specific pentru detectarea infeciei exclusiv cu S.pyogenes. Streptolizina O este secretata de streptococii din grupurile A, C i G i de Streptococcus canis. Msurarea n dinamic a titrului ASLO este o metod simpl i eficient pentru a diagnostica infeciile cu aceste tipuri de streptococi. Toi dintre ei sunt implicai n infecii musculoscheletale i toi au rmas sensibili la penicilin. Aadar la un pacient cu semne de osteomielit sau fasciit la care nu se pot lua probe din produsul patologic, este recomandat s se utlizeze msurarea titrului ASLO i dac acesta este foarte mare, balana se nclin ctre o 257

infecie streptococic, uor de tratat cu penicilin. Aceast abordare ar fi ideal pentru a reduce administrarea abuziv de antibiotice cu spectru larg, fiind nevoie doar de un test de laborator simplu i sensibil.

19. 7. Direcii de cercetare 1. Sudha Pottumarthy, Virginia C. Wells, Arthur J. Morris; A Comparison of Seven Tests for Serological Diagnosis of Tuberculosis; J Clin Microbiol. 2000 June; 38(6): 22272231 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC86769/) 2. Lennox K. Archibald; Rapid Diagnostic Testing of Infectious Diseases (http://www.medscape.com/viewarticle/748139) 3. Mohammad Reza Hasanjani Roushan, Mohammad Jafar Soleimani Amiri, Abolghasem Laly, Amrollah Mostafazadeh ,A. Bijani; Follow-up standard agglutination and 2-mercaptoethanol tests in 175 clinically cured cases of human brucellosis; International Journal of Infectious DiseasesVolume 14, Issue 3 , Pages e250-e253, March 2010 (http://www.ijidonline.com/article/S1201-9712%2809%2900211-2/fulltext) 4. A. Gupta, N.T. My Thanh, S.J. Olsen, S. Sivapalasingam, T.T. My Trinh, N.T. Phuong Lan, R.M. Hoekstra, W. Bibb, N.T. Minh, T.P. Danh, P.D. Cam, E.D. Mintz; Evaluation of community-based serologic screening for identification of chronic Salmonella Typhi carriers in Vietnam; International Journal of Infectious Diseases Volume 10, Issue 4 , Pages 309-314, July 2006 (http://www.ijidonline.com/article/S1201-9712%2805%2900176-1/fulltext)

19. 8. Verificai-v cunotinele ntrebrile au un singur rspuns corect. 1. Ce presupune o reacie antigen-anticorp? A. activarea sistemului complement B. interaciunea dintre determinantul antigenic (epitop) i fragmentul corespunztor din molecula anticorpului (paratop) C. pH i temperaturi extreme D. neaprat prezena unei bacterii n snge E. opsonizarea particulei patogene 2. Specificitatea reciei antigen-anticorp: A. este absolut B. este o msur a compatibilitii structurale i electrochimice ntre antigen i anticorp C. descrie ce for este necesar pentru a separa un complex imun n componentele sale D. reprezint o caracteristic prin care un antigen este recunoscut de un anumit anticorp compatibil, iar anticorpul recunoate doar antigenul respectiv E. nu permite apariia reaciilor ncruciate

258

3. Care este afirmaia fals? A. ntre epitop i paratop nu se stabilesc legturi covalente, ci fore intermoleculare B. un determinant antigenic liniar nu este recunoscut de anticorpul specific C. o reacie antigen-anticorp este reversibil deoarece ntre cei doi reactani nu se stabilesc leguturi greu de scindat D. un anticorp specific unui antigen poate s lege un alt antigen nrudit datorit fenomenului de reacie ncruciat E. epitopii conformaionali sunt determinai de structura teriar a proteinelor 4. Despre afinitate i aviditate este adevrat c: A. sunt caracteristice doar moleculelor IgG B. sunt sinonime C. sunt parametri ai interaciunii antigen-anticorp i au semnificaie diferit D. nu se pot defini n cazul unei reacii ncruciate E. aviditatea msoar fora de legare dintre epitop i paratop 5. n cursul unei reacii antigen-anticorp: A. exist 3 stadii de desfurare B. este un stadiu al interaciunilor primare care se pot pune n eviden prin reacii de precipitare, aglutinare, fixare a complementului etc. C. nu se formeaz complexe imune care pot s precipite D. toi anticorpii au aceeai afinitate i aviditate fa de antigenele implicate E. in vitro, n oricare stadiu al reaciei, complexele imune sunt vizibile cu ochiul liber

19. 9. Bibliografie recent

1. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai, 2007, Cellular and Molecular Immunology, 3rd edition, 6, 143-161 2. Jawetz, Melnick, Adelberg, 2007, Medical Microbiology, 24th edition, II-8, 128-137 3. Kayser, Bienz, Eckert, Zinkernagel, 2005, Medical Microbiology, 121-132 4. Lee Goldman, Dennis Ausiello, 2008, Cecil Medicine, 3rd edition, Section VII, 249-270 5. Strohl, Rouse, Fisher, 2001, Lippincott's Illustrated Reviews: Microbiology, 79-101, 437-455 6. Ilker Ukay, Tristan Ferry, Richard Stern, Juan Ambrosioni, Axel Gamulin, Diego Andrey, Marina Djordjevic, Louis Bernard, Pierre Hoffmeyer, Daniel Lew; Use of serum antistreptolysin O titers in the microbial diagnosis of orthopedic infections; International Journal of Infectious Diseases, Volume 13, Issue 4 , Pages 421-424, July 2009 7. http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/ab-ag-rx.htm - Immunoglobulins-Antigen-Antibody Reactions, Dr Gene Mayer

259

20. Reacii de precipitare i reacii de aglutinare (Gabriela Loredana, MI Popa)

20. 1. Reacia de precipitare Reacia de precipitare ntre Ag i Ac poate avea loc n mediu lichid sau solid i const n unirea Ag solubile cu Ac specifici, rezultnd complexe antigen-anticorp, care nu devin insolubile i stabile dect n cazul formrii unei reele tridimensionale ntre antigen i anticorp, conform teoriei reelei care presupune: un antigen cel puin trivalent pentru amplasarea anticorpilor, anticorp bivalent i condiii fizice favorabile precipitrii (ex. Ac puin glicozilai / de tip IgG cu 3% glucide superiori celor IgM cu 10% glucide). Reacia de precipitare este sensibil i specific n evidenierea prezenei Ag (pentru realizarea reelei Ag-Ac este necesar ca n reacie s intre o anumit cantitate de Ag i Ac, care s s e gseasc ntr-un anumit raport / proporie, iar Ag care particip la formarea agregatelor sunt ntr-o cantitate proporional mai mic, n raport cu Ac). n cadrul cursului se discut diferitele situaii legate de prezon (exces de Ac), exces relativ de Ac, zona de echivalen (Ag i Ac se gsesc n totalitate n precipitat), exces relativ de Ag i respectiv postzon (exces de Ag). Pentru anumite sisteme Ag-Ac va fi definit i noiunea de proporie optim.

20. 2. Clasificarea reaciilor de precipitare Reaciile de precipitare se pot clasifica dup cum urmeaz. A. Reacii de precipitare n mediu lichid Reacii de precipitare n amestec, reacii de floculare o titrarea toxinei difterice (metoda Ramon), determinarea titrului Ac antitoxici etc., o VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), USR (Unheated Serum Reagin), o RPR (Rapid Plasma Reagin) etc, n diagnosticul serologic al sifilisului Reacii de precipitare n inel o reacia Ascoli, determinarea grupului streptococic etc. Reacii de precipitare n tub capilar o determinarea prezenei proteinei C reactive, o determinarea prezenei tipului M streptococic (streptococi de grup A) etc. Dozajul nefelometric etc. B. Reacii de precipitare n mediu gelifiat Imunodifuzia radial simpl (ex. metoda Mancini) Difuzia dubl o metoda Elek, o difuzia dubl radial (Ouchterlony) C. Reacii de precipitare n care difuzia n gel este combinat cu migrarea n cmp electric Imunoelectroforeza Contraimunoelectroforeza Electroforeza urmat de imunofixare Electroimunodifuzia. 20. 2. 1. Reacii de precipitare n mediu lichid Au la baz unirea Ag cu Ac n mediul lichid, formndu-se complexe Ag-Ac, care vor precipita atunci cnd Ag i Ac se gsesc n anumite proporii. 20. 2. 1. 1. Reacii de precipitare n amestec 260

Reacia de precipitare ntre Ag i Ac se poate cuantifica i este foarte util pentru a demonstra prezena i respectiv absena precipitatului n funcie de concentraiile relative de Ag i Ac. Spre exemplu, pentru titrarea toxinei difterice (metoda Ramon) se pun n contact, n amestec n tuburi, cantiti egale din componenta care trebuie titrat (toxina difteric, Ag) cu cantiti variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Cantitatea maxim de precipitat se gsete n tubul unde exist raportul de echivalen. Pentru sistemul toxin difteric - anticorpi anti-toxin difteric (ca i n cazul sistemului toxin tetanic - anticorpi anti-toxin tetanic), raportul de echivalen se suprapune peste proporia optim, astfel nct se poate observa relativ uor tubul n care apare cantitatea cea mai important de precipitat. Cunoscnd titrul anticorpilor, se afl imediat titrul toxinei (1 Lf = 1 limes floculans = cantitatea de toxin care se combin cu o unitate de antitoxin = 1 UA = 1 unitate antitoxic). Dac spre exemplu precipitarea maxim apare n tubul n care titrul anticorpilor este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf. n mod asemntor, prin metoda Dean i Web se poate determina titrul anticorpilor anti-toxici, cunoscnd titrul toxinei. 20. 2. 1. 2. Reacii de precipitare n inel Reacia de precipitare n inel, const n punerea n contact a Ag i Ac astfel nct s nu se amestece; reacia care apare la interfaa dintre Ag i Ac se concretizeaz printr-un inel de precipitare albicios. Se utilizeaz pentru identificarea originii petelor de snge (reacia Uhlenhut, n medicina legal) i pentru identificarea provenienei unor preparate pe baz de carne (n industria alimentar). Demonstrativ, n cursul lucrrilor practice, reacia de precipitare n inel (reacia Ascoli) se poate utiliza pentru identificarea prezenei antigenului crbunos (Ag obinut de la Bacillus anthracis). Istoric, soluia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. splin) recoltate de la un animal care a decedat i pentru care se suspecta c decesul a fost produs de o infecie generalizat cu Bacillus anthracis. Fragmentul de organ se mojareaz n soluie de clorur de sodiu steril, adugndu-se ulterior cteva picturi de acid acetic, apoi se meninea la temperatura de fierbere timp de 5-10 minute. Dup decantarea i alcalinizarea cu NaOH, urma filtrarea i rezulta soluia antigenic. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru reacie i 2 tuburi martor. n primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticrbunos i 0,5 ml soluie salin fiziologic iar n al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal i 0,5 ml soluie de antigen. n ceea ce privete tubul de reacie trebuie s pipetm nti 0,5 ml din serul anticrbunos, urmnd ca soluia de antigen (n cantitate de 0,5 ml) s fie pipetat foarte lent, eventual prin scurgere pictur cu pictur pe peretele interior al tubului, n aa fel nct cele 2 soluii s nu se amestece. n cazul reaciei pozitive (prezena Ag crbunos n soluia antigenic), dup circa 5 minute, la interfaa dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare. 20. 2. 1. 3. Reacia de precipitare n tub capilar a fost utilizat pentru evidenierea prezenei proteinei C reactive (CRP). 20. 2. 1. 4. Dozajul nefelometric: n prezena unei cantiti constante de Ag sau Ac, se formeaz complexe Ag-Ac care modific intensitatea i dispersia luminii direct proporional cu concentraia de Ag sau Ac (principiul de msurare este proporionalitatea dintre cantitatea de complex antigen-anticorp format i lumina mprtiat). Cu ajutorul unui nefelometru, care utilizeaz fascicule luminoase monocromatice intense i a unei msurri a precipitatului n mediu lichid prin difracie de raze luminoase, este posibil dozarea uoar, reproductibil a antigenului sau a anticorpilor, folosind o curb de etalonare. Nefelometria se utilizeaz curent i determin cantitativ proteine specifice din ser i urin (IgG, IgA, IgM, CRP, haptoglobin, orosomucoid, fibrinogen, C3, C4, prealbumin, alfa1-antitripsin etc). 20. 2. 2. Reacii de precipitare n mediu gelifiat Utilizarea gelozei, n care pot s migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumit concentraie de agar n soluie de tampon veronal, n aa fel nct porii gelului s permit migrarea), va duce la vizualizarea reaciei Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare. 20. 2. 2. 1. Imunodifuzia radial simpl (IDRS Mancini) 261

Imunodifuzia radial simpl (Mancini) se bazeaz pe difuzia spontan i radial a Ag din proba de cercetat, ntr-un gel care conine o cantitate constant de anticorpi, determinnd apariia unui cerc de precipitare al crui diametru este direct proporional cu concentraia de antigen din prob. Pentru a obine un cerc de precipitare de mrime convenabil, concentraia Ac nglobai n gel trebuie s fie aleas n funcie de titrul acestora i de concentraia Ag care urmeaz a fi testat. Metoda permite determinareacantitativ a imunoglobulinelor (IgG, IgM, IgA), fraciunii C3 a complementului, alfa1-antitripsinei, siderofilinei etc. Sunt necesare plcue (de ex. cu diametrul de 5 cm) n care se toarn un gel care include Ac fa de structura a crei concentraie dorim s o determinm. Exist un cod al culorilor i spre exemplu, plcuele care vor fi utilizate pentru determinarea concentraiei de IgG au culoare roie, pentru IgA culoarea este albastr, pentru siderofilin culoarea este portocalie etc. n gel sunt perforate mici godeuri (3 mm diametru). Sunt necesare seruri de cercetat i un ser de referin n care se cunoate concentraia diferitelor componente (spre ex. cte 100 UI / ml pentru fiecare dintre cele 3 imunoglobuline). nainte de pipetarea serurilor n godeuri se realizeaz diluarea acestora, diluia fiind pentru IgG, IgA i siderofilin i respectiv pentru IgM, complement C3 i alfa1-antitripsin. Diluia serului de referin se face n funcie de proteina care urmeaz a fi determinat. Cantitatea de ser introdus n fiecare godeu este de 5 ml (un godeu pentru serul de referin i restul pentru serurile de cercetat). Dup 10 minute de meninere a plcuei pe masa de lucru aceasta se incubeaz la 37C, cu stratul de gel poziionat n sus, timp de 48 ore pentru IgA i IgM i respectiv 24 de ore pentru celelalte componente. Citirea se realizeaz cu ajutorul unei rigle gradate, din plastic, o rigl special pentru aceast analiz (demonstrat n cursul lucrrilor practice). Se va msura iniial diametrul cercului de precipitare din jurul godeului n care se afl serul de referin iar rezultatul obinut trebuie s corespund ateptrilor (de ex. 6 mm pentru IgG care a fost diluat i astfel are concentraia de 25 UI / ml). n cazul c rezultatul este cel ateptat, se poate face direct citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurile de cercetat; n caz contrar este necesar o corecie (dac spre exemplu diametrul este 6,5 mm n loc de 6 mm, din valoarea obinut pentru serurile de cercetat se scad 0,5 mm). Dup citirea diametrelor, se compar rezultatele cu cele puse la dispoziie n tabele iar cifra obinut se nmulete cu diluia probei (spre ex. dac obinem o valoare de 50 UI / ml pentru IgG, vom nmuli cu 4 pentru a obine rezultatul real). 20. 2. 2. 2. Imunodifuzia dubl radial (Ouchterlony) Imunodifuzia dubl se bazeaz pe difuzia Ag i Ac (unul spre cellalt) ntr-un gel. Deoarece mrimea moleculelor de Ag i Ac este mai mic dect diametrul porilor gelului, iar distana parcurs de reactant ntr-un anumit timp este direct proporional cu gradientul concentraiei sale i invers proporional cu greutatea sa molecular, migrarea reactanilor unul spre cellalt determin formarea unor linii de precipitare la locul de ntlnire Ag-Ac. n gelul transparent vor aprea linii opace, numrul lor corespunznd numrului sistemelor Ag-Ac studiate. Metoda certific prezena sau absena proteinei cercetate. Se pot evidenia alfa-fetoproteina, proteina C reactiv, beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa i lambda, produi de degradare ai fibrinogenului (PDF) etc. n micologie, prin imunodifuzie se poate identifica prezena exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezena Ac fa de Ag fungice, spre exemplu n diagnosticul serologic al unei aspergiloze invazive. Aceast metod este nc frecvent utilizat pentru determinarea specificitii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi n patologia uman. Sunt necesare lame de microscop pe care se toarn un gel de agar 1%, lama putnd fi folosit pe parcursul unei zile (dac acest lucru nu se poate ndeplini, lama trebuie pstrat n camer umed, la temperatura frigiderului, pentru maxim o sptmn). n gelul de pe lam se perforeaz 3 grupe de godeuri, cte 7 godeuri n fiecare grup (1 godeu central i 6 godeuri periferice, fiecare cu diametrul de 3 mm). Dac spre exemplu dorim s determinm prezena proteinei C reactiv (CRP) n seruri de cercetat, avem nevoie de un ser cu Ac anti-CRP, seruri de cercetat i un ser de referin care conine CRP. Numerotnd godeurile periferice, pipetm Ac 262

anti-CRP n godeul central i ser de referin cu CRP n godeurile 1 i 4. n celelalte godeuri pipetm serurile de cercetat. Incubm la 37C, timp de 24 de ore, n camer umed (ntr-o cutie Petri putem pune o bucat de vat mbibat n soluie salin fiziologic, alturi de lama respectiv). Liniile de precipitare pot deveni vizibile dup 2-4 ore dar sunt mult mai clare dup 24 de ore. Pentru citire pot fi necesare o lup i o surs de lumin. ntre godeul central i godeurile 1 i 4 (martori pozitivi) vor aprea linii (arcuri) de precipitare. n cazul n care de ex. n godeul 2 exist CRP, va aprea un arc de precipitare i ntre godeul central i godeul nr. 2. Este certificat prezena CRP n cazul n care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul central i godeurile 1 i 2) sunt una n continuarea celeilalte (imagine de genunchi ndoit). 20. 2. 2. 3. Dubla difuzie Elek Aceast metod permite depistarea capacitii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae. n cazul n care tulpina este toxigen, toxina va difuza n mediu iar dup unirea cu Ac anti-toxin, complexele Ag-Ac vor da natere unor linii de precipitare. ntr-o cutie Petri turnm mediul Elek i dup ce mediul s-a ntrit, decupm un an pe unul din diametre. n anul respectiv pipetm 0,5 ml ser antidifteric, ser care conine Ac anti-toxin difteric n concentraie de 1.000 UI / ml. Ac anti-toxin difteric vor difuza n mediu. Dup circa 2 ore nsmnm perpendicular pe anul cu Ac anti-toxin, de fiecare parte a anului, o tulpin de Corynebacterium diphteriae toxigen (martor pozitiv), o tulpin de Corynebacterium diphteriae ne-toxigen (martor negativ) i tulpini de cercetat, cte un striu (de fiecare parte a anului) pentru fiecare tulpin. Incubm la 37C pentru 48 ore, dar urmrim zilnic apariia culturii i precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor de nsmnare apare cultur bacterian. Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzeaz n mediu. Unirea dintre Ag i Ac duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipit, iar n mediu vor aprea linii de precipitare n unghiurile dintre cultur i anul cu Ac anti-toxin. n cazul n care apar linii de precipitare n unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat i anul cu Ac antitoxin, respectiva tulpin este toxigen. Reacia va fi negativ pentru martorul negativ i pentru tulpinile de cercetat ne-toxigene. 20. 2. 3. Reacii de precipitare n care difuzia n gel este combinat cu migrarea n cmp electric 20. 2. 3. 1. Electroforeza proteic n gel Electroforeza proteic n gel este folosit n laboratorul de imunochimie pentru decelarea unor proteine patologice. Deplasarea proteinelor ntr-un strat de gel care este supus aciunii unui cmp electric se va realiza difereniat, pentru fiecare structur proteic n parte, n funcie de greutatea molecular i ncrctura electric a proteinelor. Pentru vizualizare este necesar fixarea, uscarea i colorarea liniilor de precipitare care corespund fraciunilor proteice din serul normal sau unor eventuale proteine patologice (ex. o component monoclonal). 20. 2. 3. 2. Imunoelectroforeza Se asociaz electroforeza n gel cu imunodifuzia dubl (realizndu-se separarea prin electroforez a proteinelor n mediu gelozat, urmat de o imunodifuzie dubl utiliznd un antiser corespunztor). Reacia Ag-Ac se va vizualiza prin apariia unor arcuri de precipitare. Este o metod foarte util n studierea puritii unui Ag (sau Ac), ns n mod curent are indicaii didactice. Datorit faptului c n boala pneumococic prin urin se elimin cantiti destul de importante de Ag K, prezena acestuia poate fi evideniat de ex. prin imunoelectroforez. 20. 2. 3. 3. Contraimunoelectroforeza Contraimunoelectroforeza reprezint o dubl difuzie n care deplasarea unul fa de cellalt a Ag i Ac este accelerat de un cmp electric. Pe o lam de microscop se toarn un gel de agar 1% i se perforeaz 3 grupe de perechi de godeuri, fa n fa. Metoda poate fi utilizat pentru acele structuri antigenice care n cmp electric migreaz ctre anod. Lund n discuie spre exemplu doar una dintre cele 3 grupe de perechi de godeuri, n godeurile care vor fi poziionate spre catod (polul negativ) pipetm Ag iar n godeurile care vor fi poziionate spre anod (polul pozitiv) pipetm Ac cunoscui, specifici Ag pe care dorim s-l identificm. Reacia este mai rapid i mai sensibil dect dubla difuzie deoarece migrarea celor doi reactani unul ctre 263

cellalt este amplificat de cmpul electric. Reacia (apariia unei linii de precipitare ntre godeuri, n cazul n care n godeul catodic se gsete Ag presupus) poate fi citit dup numai 3090 minute n loc de 24 de ore aa cum se ntmpl n dubla difuzie Ouchterlony. Metoda a fost utilizat din punct de vedere istoric pentru identificarea prezenei Ag HBs. Se poate utiliza pentru identificarea antigenelor capsulare n lichidul cefalorahidian la pacieni cu meningit acut (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae). 20. 2. 3. 4. Electroimunodifuzia Electroimunodifuzia are la baz electroforeza probelor care conin proteina-antigen, ntr-un strat de gel, care conine o cantitate constant de anticorpi monospecifici (anti-protein antigen), rezultnd zone de precipitare n form de rachet sau conuri, a cror arie este direct proporional cu concentraia antigenului. Metoda are o sensibilitate mai mare dect IDRS.

20. 3. Reacia de aglutinare n reacia de aglutinare antigenele sunt de natur corpuscular. Reacia de aglutinare const n reacia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafaa unor particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol etc), determinnd aglutinarea acestora prin scderea forelor electrostatice de repulsie dintre particule i formarea unor puni de legtur. Aglutinareaeste mai sensibil dect precipitarea, Ag fiind o particul i nu o molecul solubil. Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinani dect Ac de tip IgG (pentru c au mai multe valene). Exist i Ac neaglutinani (incomplei / blocani) sau care aglutineaz numai la rece.

20. 4. Cteva tipuri de aglutinare Exist mai multe variante tehnice de aglutinare. Dintre acestea vom prezenta n continuare, pe scurt, aglutinarea direct, aglutinarea indirect, inhibarea aglutinrii, aglutinarea n coloan i aglutinarea mediat de Ac anti-imunoglobuline. Ulterior vom discuta reaciile de aglutinare utilizate n bacteriologie i micologie. 20. 4. 1. Aglutinarea direct Aglutinarea direct reprezint aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii, celule) de ctre Ac specifici. Se poate utiliza n a. diagnosticul bacteriologic, de ex. pentru identificarea enterobacteriilor (Shigella, Salmonella, E. coli etc) sau a altor germeni Gram-negativi (Vibrio cholerae) etc., pe baza structurii antigenice, n b. diagnosticul serologic al unor boli infecioase (febr tifoid, bruceloz etc), c. pentru determinarea grupelor sanguine (ABO) etc. 20. 4. 2. Aglutinarea indirect sau pasiv Este o reacie n care particule artificiale (globule roii formolate, particule de latex, cristale de colesterol, colodiu etc) sau naturale sunt ncrcate in vitro cu Ag sau Ac i sunt aglutinate de ctre Ac sau Ag corespondente din proba de cercetat. Se utilizeaz n principal pentru decelarea factorului reumatoid, determinarea CRP, determinarea grupului streptococic etc. 20. 4. 3. Inhibarea aglutinrii Reacia const n inhibarea aglutinrii particulelor ncrcate cu Ag, dup ce n prealabil Ac reacioneaz cu Ag corespondent. Se utilizeaz de ex. pentru decelarea mioglobinei sau n diagnosticul imunologic al sarcinii. 20. 4. 4. Aglutinarea n coloan Metoda permite o mai bun vizualizare a reaciei. Dispozitivul utilizat are 2 compartimente, partea n care se introduc reactivii (situat superior) i o coloan situat inferior, plin cu microparticule de sticl. Dup introducerea hematiilor i a serului de cercetat i incubarea 264

acestora, dispozitivul este centrifugat. n cazul unei reacii pozitive complexul Ag-Ac se va putea vizualiza la nivelul coloanei, n timp ce n cazul unei reacii negative, hematiile se depun n poriunea inferioar a coloanei. 20. 4. 5. Aglutinarea mediat de Ac anti-imunoglobuline Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule ncrcate cu Ac i vor duce la apariia unor aglutinate (prin apariia complexului imun). Se utilizeaz spre exemplu n decelarea factorului reumatoid (tehnica Waaler-Rose).

20. 5. Utilizarea reaciei de aglutinare n microbiologie Vom prezenta att exemple de utilizare a reaciei de aglutinare n diagnosticul direct ct i n diagnosticul indirect (serologic). Reamintim faptul c n cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezena (sau se va dovedi absena) Ac necunoscui, n serul pacientului respectiv, utiliznd Ag cunoscute. n diagnosticul serologic, de regul, trebuie s putem rspunde la minim trei ntrebri eseniale: exist anticorpi n serul pacientului investigat? care este titrul anticorpilor? cum evolueaz n dinamic (n timp) acest titru? n acest scop vom realiza minim dou determinri diferite la un interval de 7-10 zile (pentru majoritatea infeciilor care pot fi diagnosticate astfel). n acest capitol vom discuta att exemple de reacii serologice calitative ct i exemple de reacii serologice cantitative.

20. 5. 1. Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul de laborator microbiologic direct Tehnica de aglutinare se execut n a patra etap a diagnosticului de laborator, respectiv n etapa de identificare, pe baza caracterelor antigenice. n momentul aplicrii acestei reacii avem o serie de date pornind de la informaiile clinice, paraclinice, epidemiologice, s-a prelevat un anumit p.p., care s-a examinat din punct de vedere microscopic i a fost cultivat. Aa cum am menionat anterior, n vederea identificrii este necesar s avem colonii izolate, cultur pur. 20. 5. 1. 1. Aglutinarea pe lam Spre exemplu, n cursul identificrii unei tulpini enterobacteriene (Shigella spp., Salmonella spp., E. coli etc), dup cultivarea p.p. pe medii selectivo-difereniale se obin colonii izolate i din poriunea superioar (bombat) a coloniilor izolate facem treceri pe medii multitest (ex. TSI, MIU). n ziua urmtoare, avem deja mai multe elemente pentru ncadrarea tulpinii izolate ntr-o specie, dar, folosind spre exemplu cultura bacterian dezvoltat pe mediul TSI, putem face reacia de aglutinare. n nici un caz nu se vor utiliza pentru identificarea pe baz de caractere antigenice tulpini mai vechi de 18-24 ore. Pentru realizarea reaciei de aglutinare sunt necesare urmtoarele: cultura de identificat (colonii de tip S, de 18-24 ore), soluie salin fiziologic, Ac cunoscui fa de Ag pe care dorim s le identificm (Ac polivaleni, Ac monovaleni de grup, Ac monovaleni de tip, dup caz), lame de microscop curate, pahar Berzelius cu amestec dezinfectant etc. Iniial, pe o lam de microscop curat i degresat punem la una dintre extremitile lamei o pictur de soluie salin fiziologic, n care suspendm un fragment din colonia de identificat n aa fel nct s obinem o suspensie omogen, opalescent. n cazul n care suspensia rmne omogen, putem trece la etapele urmtoare; n cazul n care pictura se limpezete i apar grunji, tulpina este ne-tipabil prin aceast metod (apare aglutinarea nespecific), ar putea fi vorba de o tulpin care provine dintr-o colonie de tip R. n urmtoarea etap, la cealalt extremitate a lamei, punem o pictur de ser cu Ac cunoscui, de ex. polivaleni i realizm o suspensie omogen, opalescent, a coloniei de identificat. nclinm lama de cteva ori, uor, n 265

toate direciile, pentru a favoriza contactul dintre cei 2 reactani i unirea complexelor Ag-Ac mici, solubile, pentru a forma reele de complexe Ag-Ac. n cazul reaciei pozitive (coresponden ntre Ac cunoscui i Ag pe care dorim s l identificm) pictura se limpezete i apar grunji de aglutinare. Este indicat s citim reacia pe fond negru. De cele mai multe ori citirea se face cu ochiul liber ns n cazul unor aglutinate de dimensiuni foarte mici poate fi necesar s folosim o lup, un microscop sau un aglutinoscop. Pentru identificarea diferitelor microorganisme exist scheme care orienteaz etapele de urmat (tabelele i schemele respective se livreaz de ctre productori mpreun cu serurile cu Ac specifici). Lamele pe care se fac reaciile de aglutinare, dup terminarea reaciilor se introduc n amestecul dezinfectant. n cadrul lucrrilor practice vor fi discutate aglutinrile pentru identificarea E. coli, Salmonella spp. pn la nivel de specie (conform clasificrii Kauffmann-White) i respectiv a grupurilor de Shigella spp. Tot prin aglutinare direct se mai pot identifica tulpini de Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae tip b, tulpini de Brucella spp., tulpini de E. coli entero-patogen, iar n cazul leptospirelor i unor rickettsii apariia aglutinrii trebuie verificat cu ajutorul microscopului. Reacii de aglutinare indirect se pot utiliza pentru detectarea n p.p. a streptococilor de grup A sau B, pneumococilor, meningococilor, E. coli tip capsular K1, H. influenzae tip capsular b, pentru detectarea unor enterotoxine (stafilococice, clostridiene etc), pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) sau a unor virusuri. Tot prin tehnica de aglutinare indirect se pot identifica exotoxine n filtratul de cultur, streptococii de grup A-D, E. coli O:157, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes etc. 20. 5. 1. 2. Aglutinarea n tuburi Tehnica de aglutinare n tuburi se poate folosi pentru confirmarea unui rezultat pozitiv la aglutinarea pe lam sau atunci cnd rezultatul unei aglutinri pe lam nu este suficient de clar. Vom avea la dispoziie cultura pur de identificat care se va prepara difereniat n funcie de tipul de Ag pe care dorim s-l identificm. Spre exemplu, dac ncercm s identificm Ag de tip O iar bacteria ar putea s prezinte i Ag H sau Ag K (care ar putea inhiba aglutinarea cu Ag O) cultura se va menine 1-2 ore la 100C pentru inactivarea Ag de nveli, dup care se va trece la realizarea aglutinrii n tuburi (o procedur asemntoare poate fi necesar i n cazul tehnicii de aglutinare pe lam). Vom utiliza un ir de eprubete n care vom introduce Ac cunoscui, care se vor dilua succesiv, binar, cu soluie salin fiziologic. n tuburile respective vom aduga o cantitate echivalent de suspensie Ag (spre ex., la 0,5 ml Ac vom aduga 0,5 ml suspensie Ag). Incubarea se va face difereniat, n funcie de tipul de Ag pe care dorim s-l identificm (ex. 20 ore la 52C pentru identificarea Ag O). Reacia este pozitiv n cazul apariiei aglutinatelor (grunjoase - n cazul prezenei Ag O, floconoase - n cazul prezenei Ag H etc). Reacia de aglutinare n tuburi permite i verificarea titrului la care are loc formarea complexelor Ag-Ac.

20. 5. 2. Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul serologic n diagnosticul serologic, n mod obinuit, reaciile utilizate permit detectarea prezenei Ac n serul de cercetat dar i stabilirea titrului. Totui exist i cteva exemple de reacii de aglutinare calitative. 20. 5. 2. 1. Aglutinarea pe lam Reaciile de aglutinare pe lam Huddleson (n diagnosticul brucelozei) i respectiv Kudicks Steuer (n diagnosticul tifosului exantematic) au intrat n istoria medicinii. Prima dintre reacii o utilizm demonstrativ n cadrul lucrrilor practice, apariia aglutinatelor fiind clar iar tehnica de lucru foarte simpl. Sunt necesare urmtoarele materiale: lame de microscop curate, Ag brucelos inactivat (colorat n violet), ser de cercetat. Pe o lam de microscop depunem o pictur din soluia de Ag brucelos i n imediata vecintate a acesteia, o pictur de ser de 266

cercetat. Cu colul unei alte lame amestecm i omogenizm cei 2 reactani. Prin micri de nclinare a lamei n toate direciile facilitm formarea complexelor Ag-Ac, n cazul n care n serul de pacient sunt prezeni Ac anti-Brucella spp. Reacia este pozitiv n cazul n care se remarc prezena aglutinatelor. Chiar i n perioada n care aceast se utiliza n diagnostic, o reacie pozitiv pe lam trebuia s fie confirmat prin aglutinare n tuburi. Tehnica de aglutinare indirect poate fi utilizat n diagnosticul serologic al infeciilor produse de Helicobacter pylori, Treponema pallidum (hemaglutinare pasiv) etc. 20. 5. 2. 2. Aglutinarea n tuburi Tehnica de aglutinare n tuburi se poate folosi n diagnosticul serologic al brucelozei (reacia Wright), diagnosticul serologic al infeciilor produse de Cryptococcus neoformans, diagnosticul serologic al febrei tifoide etc. Denumirea de reacie Widal pentru diagnosticul serologic al febrei tifoide a intrat n istoria medicinii. Lund n discuie diagnosticul serologic al febrelor enterice, inclusiv febra tifoid, sunt necesare urmtoarele: seruri recoltate (n dinamic) de la pacienii la care se suspicioneaz acest diagnostic, tampon fosfat salin, baie de ap cu temperatur reglabil, Ag cunoscute (Ag O i Ag H). Se va lucra cu 2 rnduri de eprubete, un rnd pentru detectarea prezenei i titrului Ac antiO, al doilea pentru detectarea prezenei i titrului Ac anti-H (pentru persoanele n convalescen sau n cazul suspicionrii strii de purttor vom ncerca s identificm n serul de cercetat Ac i titrul Ac anti-Vi, de ex. prin hemaglutinare pasiv). Serul de cercetat, pentru fiecare rnd de tuburi, va fi diluat cu tampon fosfat salin, n diluii binare. Dac amestecul de ser de cercetat i diluant va fi n cantitate de 0,5 ml, vom aduga o cantitate similar de Ag, cte 0,5 ml Ag O n primul rnd de tuburi i respectiv cte 0,5 ml Ag H n al doilea rnd de tuburi. Vom proceda n aa fel nct s obinem n primul tub o diluie de 1/20, n al doilea tub 1/40 etc. Un tub va conine doar un amestec de tampon fosfat salin i soluie Ag (tub martor). Dup ce omogenizm coninutul tuburilor, vom incuba tuburile cu Ag O timp de 20 ore la 52C iar tuburile cu Ag H vor fi incubate timp de 2 ore la 52C urmat de 10 minute la temperatura camerei. Citirea se va realiza dup incubare, comparnd rezultatul din fiecare tub cu martorul pentru Ag. Pentru evidenierea reaciei vom agita uor tuburile. Aglutinarea H difer de aglutinarea O. Aglutinatul O este mai dens, mai grunjos, n timp ce aglutinatul H este mai floconos i uor de disociat prin agitare. Ultimul tub care mai prezint aglutinare vizibil permite stabilirea titrului reaciei. n capitolul 38 vom relua acest tip de diagnostic i vom discuta modalitile de interpretare.

267

21. Reacii care utilizeaz sistemul complement (MI Popa)

21. 1. Reacia de fixare a complementului (RFC) Face parte dintre reaciile al cror rezultat nu poate fi vizualizat fr un artificiu tehnic, n acest caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar acest sistem indicator se datoreaz faptului c Ag este fie sub form macromolecular fie este reprezentat de corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu devine vizibil cu ochiul liber. RFC a fost imaginat nc din anul 1901 de ctre Jules Bordet i s-a perfecionat destul de mult de-a lungul timpului. Aceast reacie este utilizat n peste 100 de sisteme Ag-Ac, prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modificri, inclusiv introducerea micrometodelor RFC. Se utilizeaz de ex. Ag cunoscute, puse n contact cu serul testat (n care cutm Ac) care este decomplementat (prin nclzire la 56C timp de 30 minute) i cu o cantitate de C' de cobai (alexin); dac n serul cercetat exist Ac, ei se vor cupla cu Ag formndu-se complexe Ag-Ac, pe care se ataeaz C', care se va consuma i nu va mai aciona n timpul doi (nu va mai produce hemoliza). ntr-un al doilea timp este adugat un sistem hemolitic (substrat indicator) compus din globule roii de oaie (acoperite cu anticorpi IgG de iepure). Dac globulele roii nu sunt hemolizate, nseamn c a fost utilizat C' n cursul primului timp i reacia este pozitiv (Ac prezeni n serul de cercetat); dac globulele roii sunt hemolizate, nseamn c nu s-a utilizat C' care a rmas disponibil pentru a se ataa de sistemul hemolitic, reacia este negativ (nu sunt prezeni Ac n serul de cercetat). Reacia de fixare a complementului se poate folosi att pentru identificarea Ag ct i n diagnosticul serologic. Pentru c nu urmeaz s discutm pe larg prima variant, vom enumera doar cteva dintre exemple, RFC permind identificarea unor Ag rickettsiene, chlamydiene, virale etc. n diagnosticul serologic, cea mai cunoscut metod rmne nc RFC BordetWasserman, utilizat nc n diagnosticul serologic al sifilisului. Subliniem faptul c RFC este o metod laborioas, n care nu se admit erori tehnice, dar fiind executat corect este foarte exact, are o mare sensibilitate i specificitate. Este de asemenea una dintre metodele cu un mare grad de reproductibilitate. Principiul RFC: RFC se bazeaz pe proprietatea sistemului C' de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac. n prima faz a reaciei se introduce serul de cercetat iar dac acest ser conine Ac specifici fa de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fixarea C', care se va activa pe calea clasic i nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator (hematii + Acantihematie). n cazul n care serul de cercetat nu conine Ac specifici fa de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac n prima etap a RFC. Dup introducerea n reacie a sistemului hemolitic indicator, hematiile i Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun iar C' liber se va fixa pe acesta. Dup fixare va urma activarea C' i respectiv liza hematiilor, hemoliza putnd fi examinat cu ochiul liber. Materiale i reactivi necesari: - serul de cercetat recoltat de la pacientul suspect sau o pereche de seruri, obinute n dinamic; - seruri de referin (martor pozitiv i negativ); - Ag cunoscut (suspensie corpuscular sau soluie coloidal, dup caz); - sistemul C' obinut din ser proaspt sau conservat recoltat de la cobai; - sistemul hemolitic indicator format din o hematii de berbec, soluie 4%, valabil timp de o sptmn la 4C i o ser hemolitic anti-hematii de berbec (obinut prin injectri repetate de hematii de oaie la iepurele de laborator, splate cu soluie salin fiziologic) titrat i conservat la 4C; - baie de ap cu temperatur reglabil; 268

- plci cu godeuri, tuburi de hemoliz, pipete diferite etc. Tehnica de lucru: Aa cum am menionat, tehnica de lucru este laborioas i nu va fi prezentat n totalitate, n cele ce urmeaz. Serul de cercetat se va menine 30 minute la 56C, n baia de ap, pentru inactivarea C' propriu. Aa cum am menionat anterior, principial, RFC are loc n 2 etape (Figura nr. 1): o n prima etap se pun n reacie C', serul de cercetat i Ag cunoscut; exist 2 posibiliti: a. n serul de cercetat exist Ac specifici, rezultnd un complex Ag-Ac pe care se va fixa C'; b. n serul de cercetat nu exist Ac specifici, nu se formeaz complex Ag-Ac, C' rmne liber; o n a doua etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac antihematie); exist 2 posibiliti: a. C' nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C' se fixeaz pe sistemul hemolitic, lizeaz hematiile i observm apariia hemolizei. Toi reactivii utilizai trebuie standardizai, respectiv se vor realiza: o omogenizarea suspensiei de hematii cu eventual etalonare prin spectrofotometrie; o titrarea serului hemolitic; o titrarea C' n prezena Ag; o titrarea bidimensional a Ag i a serului de referin. n RFC final se va proceda astfel: o se dilueaz conform indicaiilor din protocolul de lucru reactivii utilizai (serul hemolitic, serurile de cercetat, Ag, serurile de referin, C'); o se repartizeaz n godeurile corespunztoare serurile de cercetat, Ag i C'; o pe o plac separat se prepar martorii (martor pentru sistemul hemolitic, martor pentru C', martor pentru Ag, 2 martori pentru serul de referin, martor sigur negativ); o plcile se introduc pn a doua zi la 4C; o a doua zi, plcile se menin la 37C timp de 30 minute; o se adaug n toate godeurile sistem hemolitic; o plcile se menin la 37C timp de 30 minute; o se pun plcile la 4C, pn la sedimentarea hematiilor. Exist anumite diferene ntre tehnicile cantitative i cele calitative, dar principiile sunt aceleai. n RFC Bordet-Wasserman (RBW), metod calitativ, reacia se realizeaz n eprubete, 2 pentru reacia propriu-zis (una cu ser diluat 1/8, cealalt cu ser diluat 1/16), 2 pentru martori sigur pozitiv i sigur negativ i cte una pentru fiecare din ceilali martori, respectiv martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C', martor pentru serul hemolitic). (Figura nr. 2) Interpretare: Iniial se verific rezultatele aprute pentru martori (fie c este vorba de o metod cantitativ sau calitativ); spre ex. n cazul metodei calitative, n tubul martor pentru serul de cercetat trebuie s fie hemoliz, la fel ca i n tuburile martor pentru Ag, C' i ser sigur negativ. n tuburile martor sigur pozitiv i martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie s fie hemoliz. n tuburile cu serul de cercetat, dac apare hemoliza, nseamn c nu exist Ac iar testul este negativ (lichidul din tub va avea un aspect rou, limpede). Testul este pozitiv atunci cnd n tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliz, hematiile se depun formnd un buton n partea inferioar a tubului (n serul de cercetat exist Ac). Pentru a stabili diagnosticul final, este necesar ca RBW s fie confirmat prin reacii specifice (vezi capitolul dedicat genului Treponema). Control de calitate: Cu privire la controlul de calitate am menionat utilizarea martorilor, pentru fiecare reacie. n RFC utilizat n diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales n funcie de suspiciunea de diagnostic. RFC cantitativ se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infeciilor produse de 269

Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp., diferite virusuri etc. n scopul creterii sensibilitii i specificitii se aleg proprietile Ag cunoscut, o anumit temperatur de incubare (de ex. 4C n loc de 37C n RFC Kolmer) etc. Ac fixatori de C' apar precoce n cursul bolii astfel nct identificarea prezenei lor poate semnifica o infecie acut sau recent.

21. 3. Direcii de cercetare Prezentm cteva dintre posibilele direcii de cercetare pe care cititorul le poate evalua deschiznd urmtoarele link-uri: http://highered.mcgrawhill.com/sites/0072552980/student_view0/chapter16/animation_quiz_1.html http://www.cehs.siu.edu/fix/medmicro/cfix.htm http://aje.oxfordjournals.org/content/94/4/351.short http://pediatrics.aappublications.org/cgi/content/abstract/4/4/443 http://www.jci.org/articles/view/107949

21. 4. Verificai-v cunotinele 1. A. B. C. D. 2. A. B. C. D. E. 3. A. B. C. D. Legat de RFC, una din urmtoarele afirmaii este adevrat: Poate fi vizualizat doar prin folosirea unui sistem hemolitic indicator. Se folosete doar pentru identificarea Ag. Este foarte folosit n diagnosticul tuberculozei. Este o metod nou descoperit. Unul dintre urmtoarele materiale nu se folosete n RFC: Sistemul complement de la cobai Chemiluminometrul Sistemul hemolitic indicator - hematii de berbec i ser hemolitic anti-hematii de berbec Seruri de referin Ser de cercetat Legat de RFC, o afirmaie este fals: n serul de referin se inactiveaz sistemul complement propriu. Lipsa hemolizei indic prezena Ac n serul de cercetat, deci o reacie pozitiv. Lipsa hemolizei indic absenta Ac n serul de cercetat, deci o reacie negativ. Sistemul complement este recoltat de la cobai.

270

22. Reacia de seroneutralizare (MI Popa)

La fel ca i n cazul RFC, n reacia de seroneutralizare (RSN) este necesar un artificiu tehnic pentru a permite vizualizarea rezultatelor. n cazul RSN, Ag are o anumit proprietate biologic (toxic, enzimatic) care poate fi blocat (neutralizat) prin cuplarea cu Ac specific. Neutralizarea efectului biologic respectiv se poate realiza doar n cazul n care determinantul pentru toxicitate sau pentru activitatea enzimatic respectiv este acelai cu determinantul antigenic (epitop). Reaciile de seroneutralizare ar putea fi utilizate n mai multe mprejurri, spre exemplu n: diagnosticul microbiologic direct o identificarea Clostridium perfringens prin metoda plcilor semineutralizate (vezi anexa nr. 2 i capitolul 51); o testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de seroprotecie, vezi anexa nr. 2); o toxinotipia n cazul suspicionrii unei toxi-infecii alimentare cu Clostridium botulinum (vezi anexa nr. 2 i capitolul 50); diagnosticul serologic o reacia ASLO (vezi i capitolul 28); prevenirea unor boli infecioase prevenibile prin vaccinare i evaluarea eficacitii vaccinale o vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, dT, ATPA, ADPA; vezi i anexa nr. 4); o titrarea prezenei Ac anti-toxine (difteric, tetanic etc); o testarea prin IDR (intra-dermo-reacie) a susceptibilitii fa de o anumit boal infecioas care are la baz drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine. Intradermoreaciile Schick sau Dick, pentru a dovedi susceptibilitatea persoanei testate fa de o infecie difteric sau scarlatinoas au intrat n istoria medicinii. tratamentul / profilaxia unor boli infecioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe.

22. 1. Reacia ASLO Aceast reacie poate fi utilizat n diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice sau pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (mpreun cu criteriile minore i majore de diagnostic). Reacia ASLO determin titrul Ac anti streptolizin O (SLO). Principiu: Titrarea Ac anti-SLO se bazeaz pe faptul c SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. n cazul n care n serul de cercetat exist Ac anti-SLO, aciunea hemolitic a SLO este neutralizat. Combinnd diluii din serul de cercetat cu o cantitate constant de SLO vom putea determina titrul ASLO. Materiale i reactivi necesari: - ser de cercetat (sau seruri pereche, recoltate la interval de 2 sptmni); - SLO liofilizat (standardizat de ctre productor); - snge defibrinat de iepure / berbec; - soluie salin izoton, soluie de rivanol 0,3%; - eprubete, pipete gradate foarte curate; - baie de ap, centrifug etc Tehnica de lucru: Trebuie urmate toate indicaiile din protocolul de lucru, respectiv 271

- se omogenizeaz suspensia de hematii; - se ndeprteaz inhitorii SLO din serul de cercetat (utilizm soluie de rivanol i suspensie de crbune activ, realizm o diluie de 1/10 a serului care se va menine 30 minute la 56C); - se realizeaz diluiile de ser i se repartizeaz n tuburile de reacie (ser n diluii succesive) mpreun cu SLO (n cantitate constant, cte 0,5 ml / tub); combinarea serului de cercetat cu SLO reprezint prima etap a reaciei; - se agit tuburile pentru omogenizare i se menin timp de 15 minute la 37C; - urmeaz a doua etap a reaciei ASLO, respectiv adugarea suspensie de hematii (5%), cte 0,5 ml n fiecare tub; - se agit pentru omogenizare i se incubeaz timp de 45 minute la 37C; - se centrifugheaz tuburile timp de 1 minut (1.500 rotaii / minut) i se menin pn a doua zi la 4C (temperatura frigiderului). Interpretare: Pornind de la o diluie iniial a serului de 1/10, dup adugarea tuturor reactivilor titrul (numrul de uniti ASLO) va fi 12, 50 n tubul urmtor, 100, 125, 166, 250, 333 etc n tuburile urmtoare. Titrul reaciei ASLO este dat de cea mai mare diluie de ser la care lipsete complet hemoliza. Pentru zona noastr geografic se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Exist teste serologice i pentru evidenierea prezenei i titrului anticorpilor fa de alte structuri antigenice (de exemplu streptodornaz, hialuronidaz, streptokinaz). Control de calitate: Ultimele 2 tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii, n care se verific rezistena hematiilor i respectiv tubul martor pentru SLO n care se pun SLO i suspensia de hematii. Exist i posibilitatea de a realiza o micrometod ASLO, reacia efectundu-se n plci de material plastic cu godeuri.

22. 2. Utilizarea RSN n profilaxia i tratamentul unor boli infecioase 22. 2. 1. Vaccinarea n scopul obinerii unei protecii prin seroneutralizare Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) n faza I, combinat cu anatoxina difteric i tetanic. Primovaccinarea se ncepe vrsta de 2 luni a nou-nscutului, administrndu-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru meninerea imunitii se practic revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare iar revaccinarea a II-a se practic la 36 de luni de via a copilului respectiv. Datorit posibilelor reacii adverse (fa de componenta pertussis) se recomand eliminarea acesteia la nou-nscuii cu probleme ale sistemului nervos, la cei predispui la boal i la cei care au avut o reacie advers semnificativ la o administrare anterioar a DTP-ului. Se studiaz posibilitatea utilizrii pe scar larg a unui vaccin acelular n care s fie inclus toxina pertussis inactivat i care s permit obinerea unui RI eficient i de durat. Vaccinul DTPa este deja utilizat n SUA i n ri din UE. 22. 2. 2. Evaluarea eficacitii vaccinurilor Se recomand testarea strii de imunitate indus prin vaccinare, conform normativelor elaborate de autoritile de sntate public; metodele au la baz titrarea Ac anti-toxin (difteric, tetanic etc) n seruri prelevate de la copii vaccinai, prin diferite tehnici. Spre exemplu se consider c un copil este protejat (prezint rezisten specific n cazul unei infecii difterice) dac titrul Ac-anti toxin difteric este mai mare de 0,03 UAI / ml (UAI = unitate antitoxic internaional). n mod asemntor se consider c exist protecie fa de tetanos dac titrul Ac-anti toxin tetanic este mai mare de 0,01 UAI / ml. Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica dac persoana investigat este sau nu protejat fa de o eventual infecie. n acest scop se practic IDR. n istoria medicinii au 272

intrat IDR Dick, care permite testarea susceptibilitii fa de scarlatin (toxina este elaborat de ctre streptococul de grup A lizogenizat) i respectiv IDR Schick, care permite testarea susceptibilitii fa de difterie (toxina este elaborat de ctre bacilul difteric lizogenizat). o Ambele IDR se realizeaz similar din punct de vedere tehnic; o Spre ex. n cazul IDR Schick se injecteaz n treimea medie a antebraului, strict intradermic o cantitate de 0,1 ml toxin difteric diluat corespunztor. n cazul n care n sngele persoanei testate se gsete o cantitate de Ac anti-toxin mai mare de 0,03 UAI / ml, toxina inoculat va fi neutralizat i nu va aprea nici o modificare la locul inoculrii (lipsa eritemului semnific faptul c persoana testat nu este susceptibil s fac difterie, n cazul n care se infecteaz cu un bacil difteric toxigen). n cazul n care persoana respectiv nu prezint Ac anti-toxin difteric, Ag inoculat va conduce la apariia unui eritem la locul de inoculare. 22. 2. 3. Terapia sau profilaxia specific (imunoterapie pasiv) Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obinute de la persoane imunizate (natural sau artificial) fa de o anumit maladie infecioas, de ex. n imunoterapia infeciei cu Clostridium tetani (tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.000 UAI. Administrarea de seruri imune heterologe, obinute prin hiperimunizarea cailor, n tratamentul tetanosului, difteriei, botulismului etc. Terapia bolilor n care mecanismul patogenic implic exotoxine trebuie instituit ct mai rapid, deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci cnd se gsesc n circulaie. Pe de alt parte, administrarea de ser heterolog trebuie realizat numai n caz de necesitate (datorit strii de hipersensibilitate care ar putea fi indus i care ar duce la reacii adverse).

23. Reacii Ag-Ac cu reactivi marcai (MI Popa)

Reamintim c, n funcie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmrit exist mai multe tipuri de reacii Ag-Ac, i anume: reacii de precipitare reacii de aglutinare reacia de fixare a complementului (RFC) reacii de seroneutralizare. Dac n cazul primelor 2 tipuri de reacii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul liber, cu ajutorul unei lupe etc) n cazul RFC i RSN este necesar utilizarea unor sisteme indicator. n continuare vom discuta despre reaciile Ag-Ac n care pentru interpretare este necesar marcarea reactanilor, ceea ce se poate face: - izotopic (radio immunoassay, RIA); - enzimatic (enzyme-linked immunoassay, ELISA); - fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA); - chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc. n prezent aceste metode sunt extrem de folosite avnd avantajul unei mari sensibiliti, sunt automatizate i adaptabile la testri utile n toate disciplinele bio-medicale.

273

24. Inflamaia i procesul infecios (MI Popa, Andreea Bara, Milena Tocu)

24. 1. Inflamaia 24. 1. 1. Inflamaia este un proces fiziopatologic complex ce include: fenomene alterative, fenomene de tip reactiv, vasculo-exudative i proliferative (este vorba despre o reacie tisular nespecific, cu caracter de aprare local) i fenomene reparatorii. Inflamaia are drept principal scop limitarea aciunii i eventual neutralizarea agentului agresor (indiferent de natura acestuia). Cu alte cuvinte, discutm despre fenomenul inflamator i n cadrul unor agresiuni microbiene (bacteriene, fungice, parazitare, virale, prionice), dar inflamaia reprezint un concept mult mai complex (apare n mult mai multe circumstane, dect n cele infecioase). (Figura nr. 1) Inflamaia poate interesa esuturi, organe, sisteme sau chiar ntregul organism i are drept semne / simptome clasice, urmtoarele: tumor (umflare, edem), rubor (eritem, nroire local), calor(temperatur crescut n zona n care evolueaz fenomenul inflamator), dolor(durere), nsoite sau nu de functio laesa (tulburri funcionale mai ample sau mai puin ample, mergnd pn la impoten funcional, de ex. imposibilitatea deplasrii membrului inferior datorit unei inflamaii la articulaia genunchiului, n cadrul unei infecii diseminate cu Neisseria gonorrhoeae). 24. 1. 2. Exist o mare diversitate de ageni determinani ai unui proces inflamator, printre acetia putnd fi enumerai: - diferiii ageni fizici (radiaii, frig, cldur, curent electric, traumatisme etc.); - microorganismele (prioni, virusuri, bacterii, fungi, parazii); - agenii chimici exogeni, unii nc necunoscui pn n acest moment, dar exemplificarea ncearc s dea n primul rnd sensul diversitii i s explice faptul c fenomenul inflamator poate fi determinat de foarte multe substane dintre care vor fi enumerate doar cteva, exogene (ex. ulei de croton, terebentin, caolin, dextran etc) i / sau endogene (uree, acizi biliari etc.), care produc leziuni la nivelul sediului eliminrii lor din organism pe alte ci dect cele fiziologice (de exemplu n situaia apariiei unui reflux bilio-gastric). Indiferent de agentul determinant, n urma aciunii acestuia va putea aprea o afectare a vaselor mici, a esutului colagen (noiune foarte important pe care o vom rentlni n cadrul discutrii diferitelor maladii, cu sau fr o determinare precizat), a proteinelor interstiiale etc., rezultnd astfel eliberarea i de cele mai multe ori activarea unor mediatori i a unor enzime. Acestea din urm pot fi considerate mecanismelele de declanare sau trigger pentru procesul inflamator. n rezumat, inflamaia reprezint reactivitatea diferitelor structuri ale organismului, structuri care aparin diferitelor reele informaionale (de exemplu reeaua imun ce include organe ale sistemului imun, celule ale sistemului imun, substane sintetizate i eliberate n cursul reaciilor imune, inter-relaii mediate celular sau umoral etc) ce declaneaz diferite tipuri de rspunsuri care urmresc, cel puin n stadiile iniiale, s realizeze o reechilibrare i aducere la normal, la situaia anterioar intrrii n contact cu agentul agresor. Dintre variantele de posibile reacii putem s amintim:

modificri la nivelul microcirculaiei, cu creterea calibrului vascular, creterea permeabilitii vaselor mici i scderea vitezei de circulaie (staz); modificri ale hemostazei i respectiv marginaia, diapedeza, migrarea leucocitelor.

Rezultatul acestei reactiviti este reprezentat de ex. de apariia exsudatului inflamator (care poate fi examinat prin metode de laborator). 274

Aa cum am menionat mai sus, toate aceste fenomene sunt declanate pentru neutralizarea activitii agentului determinant (al inflamaiei). Fenomenele vasculo-exsudative, la fel ca i exsudatul inflamator, ncearc s limiteze efectele produse de agentul pro-inflamator i s mpiedice extinderea procesului inflamator spre zonele nvecinate sau la nivelul ntregului organism. n cazul n care aceste activiti au succes, alte fenomene vor conduce la asanarea focarului inflamator. Aceste fenomene, n ansamblu, pot determina: - vindecarea anatomic n totalitate (restitutio ad integrum), - vindecarea nsoit de cicatrizare sau - cronicizarea inflamaiei. Aa cum am aminitit, procesul inflamator este un proces fiziopatologic. Cel mai frecvent exist tendina ctre vindecarea esuturilor lezate. Inflamaia devine un fenomen patologic n cazul n care sistemele de control sunt dezorganizate sau atunci cnd procesul inflamator se cronicizeaz. Modificrile fiziopatologice apar independent de cauza inflamaiei sau, cu alte cuvinte, indiferent de agentul determinant. Chiar dac acesta este reprezentat de un traumatism prin compresiune, o neptur sau o tietur (de ex. cu un instrument chirurgical), o arsur (indiferent de procentul de tegument afectat), de bacterii, virusuri, parazii, sau este vorba de o necroz (mortificare) tisular care apare n cursul dezvoltrii unui neoplasm (cancer) sau n urma apariiei metastazelor tumorii primare, n cursul procesului inflamator va rezulta sinteza i eliberarea reactanilor de faz acut (RFA). Diferitele particulariti structurale ale organismului gazd sau ale unui anumit esut ar putea explica (parial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de ctre acelai agent etiologic. Spre exemplu, Salmonella enteritidis serotipul typhimurium produce inflamaii proliferative la nivelul sistemului limfatic i respectiv inflamaii exsudative n parenchimul pulmonar. Mycobacterium tuberculosis, agentul etiologic al tuberculozei, produce inflamaii alterative (la nivel pulmonar), inflamaii exsudative (la nivel pleural) sau inflamaii proliferative (la nivel dermic). 24. 1. 3. Din punct de vedere didactic, etapele inflamaiei sunt urmtoarele: 1.Etapa de declanare, n care agentul determinant produce modificri la nivelul esutului interstiial i n celulele parenchimatoase. Rezultatul detectabil prin metode de laborator este eliberarea unor factori chemotactici, a unor proteaze i kinaze. Factorii eliberai conduc la apariia rspunsului inflamator acut, respectiv: - vasodilataie capilar (eritem, nroire), - exsudare de proteine plasmatice (edem, umflare) i - acumulare de leucocite PMN. Principalele proteine care apar n aceast etap sunt componentele sistemului complement, dar i diferite citokine. Elementele celulare importante n realizarea procesului inflamator sunt reprezentate de sistemul monocit-macrofag (sistemul mononuclear fagocitar), colagenul vascular i celulele endoteliale. Este de menionat i subliniat rolul important al ficatului. Acumularea de celule inflamatorii la locul unde se afl agentul determinant este esenial n declanarea inflamaiei. Dorim s menionm c examinarea prin metode de laborator a prezenei acestor celule (de ex. ntr-o inflamaie de natur infecioas aprut la nivel faringian, realizm un frotiu colorat i n primul rnd cutm s identific prezena leucocitelor PMN, astfel avnd o informaie care susine ipoteza unei infecii bacteriene) poate fi foarte util. PMN i macrofagele sunt atrase de moleculele chemotactice i migreaz direcionat de aceste molecule prin procesul de diapedez, iar la locul inflamaiei fagociteaz, endociteaz, secret enzime lizozomale i genereaz anioni superoxid. Pe de alt parte, leucocitele PMN i macrofagele prezint receptori specifici de suprafa pentru componenta C5a a sistemului complement, pentru CCF (crystal-induced chemotactic factor) i LTB4 (leucotriena B4), precum i pentru peptidele din factorii chemotactici. Aceste peptide servesc cuplrii PMN-factor chemotactic i astfel fagocitele se ndreapt spre locul unde acesta a fost produs. Ajungnd la nivelul respectiv, 275

PMN sau macrofagele i pierd configuraia rotund, devin oarecum triunghiulare, cu baza spre factorul chemotactic. Pentru ca modificarea de form s fie posibil, are loc o rearanjare a elementelor din citoschelet, microtubulii genereaz o polarizare fa-spate, filamentele de actin se acumuleaz n faa i n spatele celulei. Se asigur astfel forele necesare deplasrii (motilitatea celular depinde de polimerizarea monomerilor de actin n filamente de actin). (Figura nr. 2) Fagocitarea agentului determinant al procesului inflamator (de ex. o structur bacterian) este favorizat de opsonizare. Materialul fagocitat este inactivat la nivelul fagolizozomilor (atunci cnd acest lucru este posibil) i / sau transformat n superantigen cu rol n declanarea unor cascade de reacii imune. Pn n acest moment, sistemul complement a reprezentat elementul esenial, fie c a fost activat pe cale direct sau pe cale altern. Fragmentele rezultate n cascada complementului particip la stimularea secreiei macrofagice (mediatori ai rspunsului inflamator acut). Activitatea leucocitelor PMN este facilitat i de prezena unei ntregi game de proteine active de tipul moleculelor de adeziune celular (selectine, integrine, ICAM-1 (intercellular adhesion molecule), ELAM-1 (endothelial cell leucocyte adhesion molecule), GMP-140, adezine, LECAM-1 (leucocyte endothelial cell adhesion molecule), ISCOM (immunostimulating complex), PAF, MAC (membrane atack complex), MACIF (MAC inhibitory factor), precum i o serie de proteine sintetizate i eliberate de ficat drept reactani de faz acut (RFA). Dintre RFA am putea meniona: proteina C reactiv (PCR este secretat n mod predominant de ficat i esuturile adipoase ca rspuns la stresul inflamator i este reglat, n mare parte, de interleukina-6. Valoarea semnificativ pentru prezena inflamaiei este de 1mg/dl sau mai mult. Fiind de ncredere i uor de dozat, este foarte utilizat n practica medical ca metod de screening i monitorizare a inflamaiei, ns nu trebuie s uitm ca PCR poate fi crescut i n sarcin sau n arsuri etc). (1) Ali RFA sunt:a2-macroglobulina, a1-antitripsina, a1-antichimotripsina, fibrinogenul, haptoglobina, hemopexina, ceruloplasmina, componenta C3 i amiloidul P seric. Am subliniat cu caractere speciale RFA care se testeaz mai frecvent n practic, n ara noastr. Aceste proteine de faz acut mediaz procesul inflamator, n cursul cruia se i consum. Majoritatea sunt glicoproteine sintetizate de ficat (mici cantiti sunt sintetizate i de ctre macrofage). Rolul RFA nu este pe deplin elucidat. Se cunoate, totui, c o serie de RFA sunt implicai att n procesele de necrobioz ct i n cele de remaniere tisular. Informaii cu privire la existena unui proces inflamator putem obine i verificnd valoarea VSH. n continuare, evoluia procesului inflamator este determinat de tipul agentului agresor, agresivitatea acestuia i momentul declanrii conflictului imun. Acesta din urm corespunde de regul apariiei semnelor clinice (de ex. febr). n completare la rspunsul celular, citokinele sintetizate de ctre diferitele celule stimulate specific, antigene, mitogeni, endotoxine etc. vor influena / stimula i activitatea celulelor productoare de citokine, rezultnd sinteza i eliberarea de noi tipuri de citokine. Se constituie anse de tip feed-back endocrine i autocrine, care sporesc sinteza de citokine de ctre o singur celul, n timp ce o singur citokin poate aciona asupra mai multor celule. (Figura nr. 6) Spre exemplu, IFN-g(sintetizat i eliberat de limfocitul T) are cel puin trei aciuni importante i anume: deviaz sinteza la nivelul mduvei osoase hematopoietice spre linia monocitomacrofagic, activeaz exprimarea Ag HLA de clasa a II-a la nivelul membranei macrofagelor i crete puterea de fagocitoz a sistemului MM n vederea fagocitrii att a actualelor antigene, ct i a viitoarelor complexe imune ce se vor constitui n cursul procesului inflamator. Aproape simultan, celulele endoteliale reacioneaz elibernd diferii produi de secreie, precum endotelinele (ET) i EDRF (endothelium-derived relaxing factor). Jocul dintre cele dou 276

proteine vasoactive condiioneaz pentru un timp aportul local de oxigen i nivelul acidozei. Iniial se elibereaz local factorii vasodilatatori (EDRF) i NO, care au drept scop creterea fluxului sanguin local, cu creterea atraciei de celule ale rspunsului imun la locul impactului cu agentul determinant al procesului inflamator. EDRF este rapid inactivat de hemoglobin i de substane antioxidante (care apar n urma stimulrii activitii PMN dar i datorit prezenei eritrocitelor). Pe msur ce debitul sanguin local crete (determinat de sistemul kinin / bradikin), crete i sinteza de EDRF (EDRF are ns o via de numai 6-10 secunde). Vasodilataia local se dezvolt pn n momentul n care celulele endoteliale, fiind comprimate de edemul perilezional, ncep s sintetizeze i s elibereze local endoteline (ET), n special ET1. Aceast endotelin (care are de asemenea o via foarte scurt) induce vasoconstricie brutal i foarte intens, tocmai pentru scderea debitului sanguin i limitarea amplitudinii rspunsului inflamator local (endotelina este considerat cel mai puternic vasoconstrictor din organism). Rezultatul etapei de declanare este reprezentat de rspunsul inflamator acut, manifestat prin vasodilataie capilar (eritem, nroire), exsudarea proteinelor plasmatice (edem) i acumulare de leucocite PMN. 2.Etapa efectoare, care la rndul ei se submparte n trei subetape: A) Subetapa molecular, n care se activeaz: - cascada complementului; - sistemul de coagulare-fibrinoliz; - diferitele ci de metabolizare ale acidului arahidonic (care provine din peretele bacterian n urma scindrii date de fosfolipaz), respectiv: a) calea ciclooxigenazei prin care rezult prostaciclin (PGI) care determin vasodilataie, inhib agregarea trombocitelor i aderarea PMN, prostaglandin (ex. PGE2) i tromboxan (TxA2) care determin agregare plachetar, are efect vasoconstrictor i de cretere a permeabilitii capilare); b) calea lipooxigenazei, care duce la apariia leucotrienelor, de exemplu LTD4, LTG4(care determin bronhoconstricie, vasoconstricie sistemic, vasodilataie la nivelul microcirculaiei) i c)calea epooxigenazei; (Figura nr. 7, Cile ciclooxigenazei si liopooxigenazei) - sistemul kinin-bradikinin; - familia citokinelor; - superfamilia interferonilor; - sistemul extracelular gunoier al actinei. Actina este o protein care se gsete n cantiti mari i este responsabil pentru motilitatea celular, schimbarea formei i mrimii celulelor (care depinde de proprietatea monomerilor de a polimeriza). Dup apoptoz, actina eliberat are tendina de a polimeriza, ducnd la apariia de filamente de actin n vase, cu un rezultat catastrofal (de exemplu n ocul septic, necroza hepatic etc). Exist ns i un mecanism homeostatic ce are la baz dou proteine plasmatice, gelsolina i proteina Gc (care sunt depite ns din punct de vedere funcional n distrugerile masive). B) Subetapa vascular, n care au loc modificri ale calibrului vaselor mici, ale vitezei de circulaie a sngelui, ale permeabilitii vaselor mici din aria tisular lezat. Iniial se produce vasoconstricie, n decurs de secunde / minute (are loc un aflux masiv de celule sanguine proinflamatorii - neutrofile, monocite, eozinofile - sub aciunea unor mediatori solubili eliberai din zona tisular afectat, care produc dou categorii de efecte: a) vasculare (dilataie arteriolocapilar cu creterea numrului de capilare active, hiperemie, stimularea expresiei pe celulele endoteliale din zon a unor receptori de adeziune intercelular astfel nct celulele sangiune recrutate vor adera la endoteliul vascular prin cuplaj receptorial i n final o faz de staz vascular pasiv, cu hipoxie i creterea permeabilitii vaselor mici) i b) chemotactice (celulele proinflamatorii sunt atrase ctre esutul lezionat i activate metabolic).. C) Subetapa exsudativ, n care se formeaz exsudatul inflamator (plasma exsudat, bogat n proteine i LDH) la care se adaug elementele figurate extravazate, elementele celulare mobilizate local i produi rezultai din diferite modificri locale. Prin constituenii si celulari i 277

moleculari, exsudatul asaneaz focarul inflamator i tinde s blocheze procesul infecios la poarta de intrare, constituind bariera fibrino-imuno-leucocitar. 24. 1. 4.Consecinele activrii mecanismelor implicate n procesul inflamator n funcie de cascadele activate poate rezulta un anumit tip de inflamaie. Putem lua n discuie diferitele forme clinice evolutive (acut, subacut, cronic) precum i formele anatomoclinice. 24. 1. 4. 1.Evoluia spre cronicizare se datoreaz agenilor inflamatori care au proprietatea de a stimula n special sistemul efector timodependent, autoantigenelor sau persistenei stimulului inflamator. Inflamaia cronic este din ce n ce mai mult privit nu numai ca o consecin a unui risc infecios continuu, dar i ca o parte integrant a multor boli neinfecioase, cum ar fi disfunciile autoimune, diabetul sau bolile cardiovasculare etc. Astfel, nu este surprinztor c unele sisteme hormonale, cum ar fi sistemul renin-angiotensin (SRA), care a fost descris prima dat n contextul bolilor cardiovasculare, s-a dovedit a fi factorul major de reglare a rspunsului inflamator. (4) (Figura nr. 8) 24. 1. 4. 2.Evoluia spre vindecare presupune: - asanarea focarului inflamator (ncepe concomitent cu constituirea barierei fibrino-leucocitare i cu ndeprtarea resturilor celulare i a eventualelor microorganisme care sunt ageni determinani); devine maxim dup acumularea de leucocite PMN i macrofage. - vindecarea propriu-zis ncepe relativ rapid n cursul procesului inflamator; vindecarea ncepe aproape concomitent cu fenomenele distructive, pe care tinde s le nlocuiasc pentru a conduce la una dintre variantele evolutive menionate anterior. Varianta cea mai favorabil este reprezentat de vindecarea complet, anatomic (numit i restitutio ad integrum). Cealalt posibilitate este reprezentat de evoluia spre apariia unei cicatrici (cicatrizarea). Cicatrizarea apare n cazul unor inflamaii nsoite de fenomene lezionale ntinse, pierderi de esut i eventual de infecii i cronicizarea infeciei. 24. 1. 4. 3.Aspecte anatomo-clinice: - inflamaii alterative n care predomin procesele distrofice i necrobiotice (de exemplu n miocardita difteric sau n miozita produs de Clostridium spp.); - inflamaii exsudative n care predomin procesele exsudative i care se pot submpri n inflamaii: a) seroase (3-5% proteine, numr sczut de leucocite, cu eozinofile), de exemplu n pleurezia sau meningita produse de Mycobacterium tuberculosis; b) fibroase, destul de frecvent rezultate n urma unui proces infecios, cu acumulare de fibrinogen care determin apariia fibrinei i formarea de depozite care se organizeaz i duc la apariia aderenelor, care se organizeaz (de ex. n pneumonia cu Streptococcus pneumoniae, n dizenteria bacterian, n miocardita difteric etc.); c) purulente, produse de exemplu de coci piogeni, precum Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis etc., de ex. cu formarea de abcese; d) hemoragice, de exemplu n cium (produs de Yersinia pestis) sau n pneumonia hemoragic produs de Bacillus anthracis (extrem de grav, nsoit de hemoptizie i asociat frecvent cu pleurezie hemoragic i adenopatie mediastinal important). - inflamaii proliferative, avnd ca form particular granulomul, de aspect nodular (de ex. aprute dup infecii cu Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, diferite specii de Brucella sau datorate prezenei unui corp strin). (Video nr. 1, Inflamaia acut http://www.youtube.com/watch?v=yQwxHmn6tvw); (Video nr. 2, Rspunsul inflamator http://www.youtube.com/watch?v=aIzE-XsBrcg-)

Febra 278

Febra (pyrexia) este un semn i simptom medical caracterizat de creterea temperaturii corpului o anumit valoare (ex. peste 37,8C; ns este important de cunoscut valoarea temperaturii bazale, pentru fiecare subiect) datorit stabilirii unui alt punct de echilibru la nivelul centrului reglator din hipotalamus. Se acompaniaz de creterea tonusului muscular, tremurat (frison) i paradoxal, de senzaia de frig. Senzaia de cald apare odat ce noua temperatur de echilibru este atins. Etimologia termenului este dubl: din grecescul pyretos (foc)i din latinesculfevris (febr). Febra este o dovada funcionrii sistemului imun, deoarece prin aceast modificare de temperatur, organismul ncearc s distrug bacteriile i virusurile. Dar infeciile nu sunt singurul mecanism declanator al febrei. De obicei nu este nevoie de tratament antipiretic. Acesta se administreaz doar n cazurile n care temperatura crete foate mult sau pentru confortul pacientului. Hipertermia, spre deosebire de febr, nu presupune un nou punct de echilibru, ci depirea capacitii de termoreglare (ex. o zi n soare nnbuitor fr consum adecvat de lichide) sau supranclzirea (ex. dup un efort fizic foarte intens). Temperatura se msoar clasic la nivel anal, la nivel axilar, n cavitatea bucal, sau la nivel auricular. Vorbim despre febr dac temperatura intrarectal depete 37,5-38,3C i/sau cea din cavitatea bucaldepete 37,7 C (n mare vorbim de subfebr ntre 37-38C i de febrpeste 38C). Persoanele main vrsta au o abilitate sczut de a genera caldur, astfel c i o temperatur nu foarte crescut poate fi expresia unei afeciuni grave. Cauze posibile de febr ar fi: hemoragia intracranian, administrarea anumitor medicamente, boli ale esutului colagen, distrucii tisulare de diverse cauze (traumatisme, intervenii chirurgicale, iradieri, arsuri, infarcte), neoplazii, hemopatii maligne,reacii alergice, conflicte de ordin psihologic, probleme neurologice, endocrine, metabolice sau pot fi de cauz iatrogen (de cauz medical). Infecia este ce mai comun cauz de febr. Febra infecioasse instaleaz n: infecii generalizate acute i cronice fr semne de localizare (n viroze, bacteriemii, rikettsioze, spirochetoze etc.); infecii generale cu semne de localizare (tuberculoza pulmonar ganglionar, endocardita septic etc.);infecii localizate superficiale (celulite, plgi infectate) sau profunde (flegmon, abces subfrenic, abces apendicular, salpingite, pielonefrite, colecistite) etc. Un trigger al febrei se numete pirogen. Pirogenul determin secreia de PGE2, care acioneaz la nivelul hipotalamusului (aria preoptic), determin un rspuns sistemic (simpatic) de cretere a temperaturii (prin vasoconstricie, secuse ale muchilor, catabolism crescut i creterea activitii diferitelor organe endocrine. Aceste modificri duc i la creterea TA. n cazul nou nscuilor, se mai obine cldur n principal prin consumarea grsimii brune perirenale. Reversul presupune vasodilataie i transpiraie. PGE2 provine din acidul arahidonic, sub aciunea PLA2, COX-2 i PGE2-sintetaza. Pirogenii pot fi endogeni sau exogeni. LPZ-ul din peretele bacteriilor Gram - (precum i alte superantigene) reprezint exemplul clasic de antipiretic exogen. Pirogenii endogeni sunt citokinele. Il-1; Il-6; TNF-sunt pirogeni majori. Ali pirogeni: Il-8, macrophage inflammatory protein-, IFN , si . Febra evolueaz n 3 stadii: a) stadium incrementi: stadiul de cretere a temperaturii, de la cteva minute la cteva ore, zile sau sptmni. b) stadium fastigium: stadiul de temperatura maxim reprezint perioada de apogeu a temperaturii. c) stadium decrementi stadiul de scdere a temperaturii, de declin sau defervescen se caracterizeaz prin creterea termolizei. Iat tipurile de febr, fiecare patologie caracterizndu-se prin una din urmatoarele: Febra prelungit. Orice stare febril care persist mai mult de trei sptmni reprezint o febr 279

prelungit. Febra continueste o febr ridicat n care diferena dintre temperatura matinal i cea vesperal timp de mai multe zile nu depete 1 grad C. Ea este ntlnit n pneumonia franc lobar, febra tifoid (n perioada de stare a bolii), tifosul exantematic, osteomielit etc. Febra remitenteste febra ce se caracterizeaz prin aceea c diferena dintre temperatura matinal i cea vesperal depete 1 grad C. Ea apare n septicemii, supuraii pulmonare, tuberculoza pulmonara grav, n perioada a doua a febrei tifoide. Febra intermitentse caracterizeaz printr-o alternan n timp de 24 de ore a temperaturii normale cu febr mult ridicat. Cnd oscilaiile devin foarte mari (ex. 3-5 grade C pe parcursul a 24 de ore) febra foarte ridicat oscilnd cu temperatura normal sau chiar subnormal vorbim de febr hectic. Ea apare n supuraiile pulmonare, infecii urinare i unele septicemii etc. Febra recurentevolueaz cu febr ridicat i continu timp de 5-8 zile alternnd cu perioade afebrile. Ea apare n limfogranulomatoza malign, tuberculoza pulmonar, infecii urinare sau biliare, leptospiroze etc. Febra recidivanteste o variant de febr recurent caracterizat prin faptul c ascensiunile termice survin la intervale foarte variate i mbrac caracter de puseuri (o ntlnim n colangite, pielite, carcinom i unele forme de tuberculoz etc.). Febra ondulanteste caracterizat prin ascensiuni termice ce se repet periodic. Ridicarea temperaturii este progresiv, iar defervescena este lent pn la afebrilitate sau subfebrilitate urmat de cicluri repetate. Febra de tip inverseste febra n care temperatura matinal este mai ridicat dect cea vesperal. Apare n tuberculoza pulmonar grav, supuraii profunde i inflamaii cavitare etc. Febra neregulatse refer la febra care nu poate fi ncadrat n nici unul din tipurile descrise i care nu poate fi descris aa cum s-a menionat mai sus. (3) Febra de origine necunoscuteste luat n consideraie atunci cnd, dup 1 sptmn de ncercri n a pune diagnosticul i a stabili etiologia febrei (clinic, paraclinic, alte metode de laborator), nu am reuit s identific o cauz pentru creterea temperaturii.

VSH-ul VSH reprezint rata la care sedimenteaz hematiile dintr-o prob de snge cu anticoagulant, ntr-o or. n mod normal hematiile dintr-o prob de snge sedimenteaz lent datorit ncrcturii de suprafa negative a acestora, care face ca celulele adiacente s se resping cnd distana intercelular scade sub un nivel minim. n anumite afeciuni care determin creterea proteinelor de faz acut (alfa-globuline, fibrinogen) sau creterea valorii imunoglobulinelor, proteinele plasmatice se ataeaz pe suprafaa hematiilor i reduc potenialul de suprafa determinnd agregarea hematiilor i creterea sedimentrii acestora. Care sunt recomandrile efecturii acestui test? VSH poate fi folosit ca test screening n suspiciunea unor reacii inflamatorii, infecii, boli autoimune, discrazii plasmocitare, dar i pentru monitorizarea evoluiei i tratamentului n anumite boli (ex. arterit temporal, polimialgie reumatic, artrita reumatoid, reumatism articular acut, lupus eritematos sistemic, boal Hodgkin, tuberculoz, endocardit bacterian). De reinut: VSH nu este un test diagnostic pentru o anumit boal i nu trebuie utilizat pentru screening-ul pacienilor asimptomatici. Sngele se recolteaz a jeun (pe nemncate) sau postprandial (dup mas) pe anticoagulant (vacutainer cu dop negru cu citrat de sodiu 3,8 % tamponat). Dup prinderea venei se desface garoul pentru a nu liza hematiile. S nu uitm c o mas lipidic poate determina alterri 280

plasmatice i modific i VSH-ul. Se va recolta ct permite vacuumul; raportul snge/anticoagulant trebuie s fie 4/1. Pentru citire se folosesc 2 metode: 1. metoda Westergren: se aeaz tubul n poziie vertical ntr-un suport gradat milimetric i se citeste nivelul de sedimentare a hematiilor n mm dup 1 or; n unele teste este citit rezultatul i dup un interval de 2 ore, dar aceasta nu furnizeaz informaii suplimentare. (Figura nr. 3) 2. Metoda automat (cititor automat de VSH) Proba este stabil timp de 2 orela temperatura camerei (18-26o C): testul ar trebui efectuat la cel mult 2 ore dup recoltare. Dac este ratat citirea la 1 or, sngele nu poate fi remixat i refolosit pentru VSH. Testul trebuie efectuat la temperatura camerei. La 2-8o C i menine stabilitatea 12 ore; dac sngele a fost refrigerat, trebuie reechilibrat la temperatura camerei naintea efecturii testului. 1. Variaii fiziologice: a. n menstruaie: VSH crete n timpul ciclului menstrual, atingnd nivelul maxim n faza premenstrual i scznd n timpul menstruaiei. b. n sarcin: VSH-ul crete continuu ncepnd cu a 4-a sptmn de sarcin pn n a 3-a sptmn postpartum i atinge un nivel maxim de pn la 45 mm/h n prima sptmn postpartum. c. la nou-nscui: VSH-ul este sczut datorit hematocritului crescut i nivelului sczut de fibrinogen. d. la femei vrstnice (70-89 ani) aparent sntoase VSH poate atinge valori de pn la 60 mm/h. 2. Factori care determin creterea VSH: a. Refrigerarea sngelui; b. Anemia: datorita numrului sczut de eritrocite; n anemia feripriv creterea VSH nu corespunde numrului de eritrocite deoarece microcitoza concomitent ncetinete sedimentarea hematiilor; c. Macrocitoza.; d. Medicamentele: contraceptive orale, dextrani (datorit absorbiei pe suprafaa eritrocitelor), anticonvulsivante, carbamazepin, cefalotin, ciclosporin A, dexametazon, etretinat, fluvastatin, hidralazin, indometacin, isotretinoin, sulfametoxazol, ofloxacin, lomefloxacin, metisergid, misoprostol, procainamid, propafenon, quinin, zolpidem etc. 3. Factori care determin scderea VSH: a. Temperaturi >20-24o C; b. Hiperglicemia; c. Hiperlipoproteinemia (n special chilomicronii); d. Hipofibrinogenemia; e. Policitemia; f. Leucocitoza; g. Prezena de eritrocite anormale: microcite, drepanocite, echinocite, poichilocite, stomatocite, acantocite, sferocite (prin scderea suprafeei necesare pentru agregarea hematiilor); h. Caexia; i. Medicamentele: aspirin, aur, corticotropin, ciclofosfamid, glucocorticoizi, hidroxiclorochin, metotrexat, antiinflamatorii nesteroidiene, penicilamin, sulfasalazin, tamoxifen, trimetoprim etc. Concomitent, macrofagele dezvolt o serie de activiti i anume: pregtesc superantigenul, elibereaz n circulaie monokine i i expun (la suprafaa membranei) Ag HLA de clasa a II-a (vezi i capitolul 11). (Figurile nr. 4 i 5)

281

24. 2. Procesul infecios

Infecia reprezint un tip particular de relaie ntre microorganismele condiionat patogene i patogene pe de o parte i organismul gazd pe de alt parte. Pentru ca s se declaneze un proces infecios i s apar infecia, microorganismele trebuie s ptrund n organismul gazd, s depeasc barierele i mecanismele de aprare, s-l colonizeze, s se multiplice i eventual s intre ntr-un lan de transmitere prin intermediul cruia poate contamina o nou gazd. Procesul infecios definete ansamblul relaiilor stabilite ntre microorganism i gazd, aprute dup infecie. Starea de boal (manifest clinic sau fr ca modificrile aprute s fie exteriorizate i constatabile de ctre medicul clinician) se datorete interaciunii dintre microorganism (bacterie, parazit, virus, fung, prion) - gazd i este urmat de apariia unor simptome (de ex. temperatur peste 39C, cefalee, eliminarea unor scaune diareice etc.) i de reacii funcionale din partea gazdei (de ex. stare general modificat, senzaie de febr, frisoane, creterea numrului de respiraii pe minut, creterea numrului de bti cardiace pe minut etc). Infecia nu este urmat obligatoriu de starea de boal, putnd fi inaparent, subclinic sau latent. Poate aprea i starea de purttor i / sau eliminator de germeni. Datorit infeciei pot aprea, sau nu, manifestri foarte variate n funcie de: - agentul infecios (factori de patogenitate, gradul de virulen); - organismul gazd (rezistena specific i nespecific); - mediul extern (factori geografici, climatici, sociali, economici etc). Manifestri subclinice a) Infecia inaparent nu se asociaz cu semne sau simptome i ar putea fi decelat numai prin examene de laborator. Spre deosebire de infecia latent, infecia inaparent este limitat n timp i poate contribui la crearea unei stri de imunitate (ex. infecia cu Neisseria meningitidis, infecii cu Haemophilus influenzae etc). b) Boala subclinic se deosebete de infecia inaparent prin apariia unor tulburri funcionale (febr, transpiraii, dureri etc) i chiar a unor leziuni organice (de multe ori fr o simptomatologie distinct / specific, dar exist i situaii n care nu este decelat nici un simptom, de exemplu n formele subclinice de hepatit viral acut). c) Infecia latent este asimptomatic, agenii patogeni putnd persista timp ndelungat n esuturile gazdei. Dup un timp variabil, infecia latent poate deveni evident clinic, de obicei n urma aciunii unor factori favorizani externi sau interni, proprii organismului (de exemplu infecia cu Mycobacterium tuberculosis care este un microorganism condiionat patogen, infecteaz circa o treime din populaia globului dar produce tuberculoz la circa 8 milioane de persoane, pe an). d) Starea de purttor de germeni se refer la bolnavul cu o stare infecioas, la persoana aflat n convalescen, nainte de eradicarea infeciei suferite dar i la persoanele aparent sntoase care adpostesc germeni patogeni (de exemplu Salmonella typhi la nivelul veziculei biliare, microorganismul putndu-se cantona la acest nivel dup o febr tifoid). Starea de purttor reprezint atingerea unui echilibru relativ ntre cele dou verigi, de multe ori fiind nsoit de eliminarea n mediu a germenilor care au produs infecia i se afl n diferite focare latente (precum n exemplul de mai sus, situaie n care starea de purttor se elimin doar prin extirparea veziculei biliare). De exemplu, n ara noastr apar din cnd n cnd izbucniri epidemice (outbreak) de febr tifoid, dup inundaii, dac n zona respectiv exist un purttor de S. typhi, iar condiiile igienico-sanitare pentru prevenirea transmiterii pe calea fecaloral nu sunt respectate. n cursul strii de purttor exist teste biologice i imunologice care pot certifica prezena microorganismelor (direct, de ex. dup cultivare sau amplificare genic i 282

/ sau indirect). Manifestri clinice a) Infecia local, n care agenii patogeni rmn cantonai la poarta de intrare i n vecintatea acesteia, unde se multiplic (de exemplu n furunculul stafilococic, infecia amigdalian produs de streptococul piogen). b) Infecia de focar este o form particular a infeciei locale. Evolueaz cronic, cu manifestri locale minime (acestea putnd chiar lipsi), adesea ns cu tulburri la distan (subfebrilitate, mialgii, artralgii etc.) a cror apariie nc nu a fost complet explicat. c) Infecia regional cuprinde un teritoriu mai extins, de obicei aferent porii de intrare, prin afectarea vaselor limfatice i a ganglionilor limfatici regionali (de exemplu, infecia tuberculoas, cu producerea de manifestri anatomo-clinice i paraclinice relativ caracteristice). d) Boala infecioas cu manifestri clinice la nivelul ntregului organism (sistemice), n care germenii patogeni disemineaz pe cale circulatorie (bacteriemie) n diferite esuturi i organe, la distan de poarta de intrare sau de focarul infecios primar. Se descriu dou forme: - boala infecioas ciclic, cu evoluie regulat, n mai multe etape care se succed ntr-un timp limitat, de exemplu febra tifoid produs de S. typhi. - septicemia (conform nomenclaturii mai vechi) are evoluie clinic neregulat, de obicei foarte grav, fiind definit prin existena unei pori de intrare, a unui focar septic (detectat sau suspectat), bacteriemiei i a unor metastaze septice care pot deveni focare secundare; din focarele secundare au loc descrcri secundate de germeni n circulaie. Drept bacteriemie definim prezena pasager de germeni viabili n snge. Bacteriemia nu duce, de regul, la apariia de metastaze septice i nici la apariia unui tablou clinic manifest. Bacteriemii pot apare de ex. dup extracii dentare sau intervenii chirurgicale pe focare septice, ca i n multe dintre bolile infecioase (exemplu n pneumonia cu pneumococ, meningita cu meningococ etc; se explic astfel utilitatea recoltrii de snge pentru hemocultur, cu toate c produsul patologic principal este reprezentat de sput n primul caz i lichid cefalorahidian n al doilea caz). n momentul de fa, s-a decis utilizarea noiunii de sepsis, entitate care reunete existena unui proces infecios i respectiv existena rspunsului inflamator sistemic. Starea de sepsis include prin definiie dou sau mai multe din urmtoarele elemente:

febr (peste 38C) i frisoane, sau hipotermie (sub 36C); tahicardie (bti cardiace peste 90/minut); polipnee (peste 20 respiraii / minut) cu hiperventilaie sau Pa CO2sub 32 mmHg; leucocitoz peste 12.000 / mm3sau leucopenie sub 4.000 / mm3, cu forme tinere n circulaia periferic (peste 10%), respectiv deplasarea la stnga a formulei leucocitare.

Sindromul septic reunete sepsisul i modificrile circulatorii i funcionale la nivelul diferitelor organe i sisteme, care conduc la hipoxemie, oligurie, alterri psihice etc. ocul septic evolueaz cu hipotensiune (presiunea sistolic scade cu peste 40 mmHg fa de nivelul bazal) i sepsis sever. Sindromul de disfuncie multiorganic (MODS, Multiorgan Dysfunction Syndrome) reprezint ultimul i cel mai grav stadiu evolutiv, cu letalitate mai mare de 80%; este un sindrom clinic, cu apariia insuficienei la 2 sau mai multe organe sau sisteme. Agresiunea microbian declaneaz un rspuns inflamator sistemic, care aa cum a fost prezentat anterior, din mecanism de aprare poate deveni un fenomen de autodistrugere. Dup aspectul evolutiv, bolile infecioase pot fi: - acute i - cronice (persistente), atunci cnd agentul patogen persist i acioneaz vreme ndelungat n 283

esuturile gazdei, de exemplu n bruceloz. Poarta de intrare Pentru a produce infecia (dup parcurgerea etapelor menionate anterior privind definiia infeciei) i a invada organismul gazd dup multiplicare sau prin intermediul unor produse toxice specifice (ex. exotoxine), fiecare microorganism patogen utilizeaz una sau mai multe ci de ptrundere. Spre exemplu, vibrionul holeric (Vibrio cholerae) ptrunde pe cale digestiv (ex. consum de ap contaminat), se multiplic i produce manifestrile caracteristice la nivel intestinal (rolul esenial revenind toxinei holerice) etc. Difuzarea n organism a microorganismului patogen de la poarta de intrare se realizeaz n diferite moduri i pe mai multe ci: - extindere local n suprafa, ex. n cazul erizipelului produs de streptococul beta-hemolitic de grup A; - extindere n profunzime, ex. n miozita produs de Clostridium spp. (C. septicum, sporogenes, histolyticum etc.); - extindere regional; - diseminare sanguin, de exemplu n febra tifoid (produs de Salmonella typhi); - diseminare pe cale nervoas, de exemplu n infecia cu virusul rabic. Perioadele bolii infecioase: - Incubaia reprezint intervalul de timp din momentul infectrii pn la apariia primelor semne i simptome ale bolii; durata incubaiei variaz n limite relativ stabile (ex. 1-5 zile n dizenterie, circa 14 zile n febra tifoid); - Invazia este de obicei concomitent cu debutul bolii, care poate fi brusc (n plin stare de sntate) sau lent progresiv; n momentul invaziei este posibil s surprindem prezena bacteriemiei (recoltm snge pentru hemocultur); - Perioada de stare se caracterizeaz prin manifestrile eseniale i deseori caracteristice ale bolii; - ncheierea evoluiei bolii, care se poate face prin: 1. convalescen, n care boala clinic a ncetat i organismul i recapt treptat capacitatea de aprare i revine la starea anterioar bolii infecioase respective; 2. vindecare, urmat de stabilirea unui grad de imunitate; n unele cazuri imunitatea este de durat, chiar i pentru tot restul vieii; instalarea rspunsului imun, precum i statusul imun n relaie cu un anumit microorganism / produs al acestuia, pot fi dovedite prin teste de laborator (reacii antigen-anticorp); pentru unele entiti este stabilit nivelul de protecie (de ex. prezena anticorpilor n valoare de 0.01 UAI/mLasigur protecie fa de apariia tetanosului); 3. cronicizare (uneori prin atingerea unui echilibru microorganism i gazd; n alte situaii cronicizarea poate crea probleme importante) sau 4. exitus, fie datorit agresivitii (virulenei) particulare a tulpinii bacteriene implicate, fie datorit incapacitii organismului de a reaciona n mod eficient.

24. 3. Povestiri adevrate 24. 3. 1. Artrita gonococic O pacient n vrst de 21 ani se prezint la camera de gard cu durere la nivelul articulaiei minii drepte evolund de circa 36 de ore. Anamneza nu a identificat existena unor traumatisme sau a unui efort fizic deosebit, care s justifice prezena acestor dureri. Medicul de gard a indicat efectuarea unei radiografii a articulaiei minii. Rezultatul radiografic nu a pus n eviden aspecte patologice. Concluzia medicului examinator a fost c este vorba de o entors (chiar i n lipsa datelor anamnestice), a aplicat o fa gipsat i a indicat tinerei s ia un 284

medicament antiinflamator (diclofenac), pe cale oral (2 50 mg / zi, timp de 5 zile) i s revin, la nevoie, pentru reevaluare. La circa 48 de ore de la debutul durerii n articulaia minii drepte, pacienta a decis s revin la camera de gard pentru c prezenta lipsa poftei de mncare, ameeli i senzaie de febr. Termometrizarea a artat c pacienta are, ntr-adevr, febr (38,3C). Discuia cu pacienta i examenul clinic au permis nregistrarea urmtoarelor date: pacienta nu a avut greuri, vrsturi, tulburri de tranzit intestinal i nici semne care s poat fi ncadrate ntrun sindrom meningean; erau prezente edem (umfltur) de culoare uor eritematoas (roiatic) al articulaiei minii drepte, cldur la nivelul acestei articulaii (n comparaie cu articulaia simetric), dificultate n utilizarea minii; la nivel palmar, bilateral, a fost pus n eviden o erupie cu mai multe elemente de culoare violacee, dureroase spontan i la palpare. De aceast dat, medicul clinician a luat n considerare mai multe variante de diagnostic. Totui, o parte dintre supoziii au putut fi eliminate relativ uor (reumatism articular acut, lupus eritematos diseminat) n timp ce datele obinute n cadrul unei anamneze mai riguros realizate (dar i n contextul n care pacienta, ngrijorat de condiia fizic personal, a fost de acord s ofere date suplimentare) au permis restrngerea ipotezelor la o reacie n cadrul unei infecii care a fost transmis pe cale sexual. Examenul ginecologic a evideniat congestie i eritem la nivelul colului uterin i leucoree (secreie abundent la nivel vaginal, cu aspect purulent). S-a recoltat secreia vaginal dar s-a realizat i o recoltare cu un tampon fin, de la nivelul endocolului (tamponul a fost introdus n endocol pe o distan de circa 1,5-2 cm). S-a administrat tratamentul minut recomandat n unele dintre infeciile cu transmitere sexual, respectiv ceftriaxon (o doz, 250 mg, injectabil, intramuscular). Examenul microscopic a relevat numeroase leucocite PMN n secreia genital i un numr mai mic de PMN pe frotiul din produsul recoltat de la nivelul endocolului. Pacientei i s-a recomandat o internare de scurt durat, ceea ce a acceptat. Dup 36 ore, medicul de gard din laboratorul de microbiologie clinic, examinnd cultura din secreia vaginal a realizat frotiuri, a executat textul oxidazei i testul superoxol i a nceput testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice. Diagnosticul microbiologic a fost infecie cu Neisseria gonorrhoeae, iar diagnosticul final a fost cel de artrit gonococic. Rezultatul testrii sensibilitii la antibiotice (antibiograma difuzimetric standardizat) a demonstrat o tulpin cu sensibilitate la majoritate antibioticelor i chimioterapicelor testate, inclusiv la penicilin. Pentru mai mult siguran, dei n literatur a fost descris faptul c tratamentul minut este eficient, s-a prescris penicilin G, 1 doz la 12 ore, timp de 10 zile. n a treia zi de la internare, starea general a pacientei era bun, durerea articular diminuase semnificativ, edemul i erupia erau abia perceptibile, curba febril a nregistrat valori normale iar pofta de mncare a revenit. Comentarii cu privire la caz Exist statistici n literatura de specialitate internaional care consider c artrita gonococic reprezint una dintre cele mai frecvente cauze de artrit inflamatorie localizat la o singur articulaie, la tineri. Nu exist date statistice relevante la nivel naional. n aceste condiii, trebuie s lum n seam datele puse la dispoziie cu generozitate de CDC (Center for Diseases Control and Prevention); pe site-ul CDC se discut c 3% dintre cazurile de infecie gonococic sunt nsoite de diseminarea N. gonorrhoeae, mai frecvent la femei dect la brbai. Infecia gonococic se poate nsoi de diseminare, indiferent de calea de ptrundere. Ca i n cazul meningitei produs de meningococ, un factor de risc este reprezentat de deficiene ale sistemului complement. Sindromul infeciei gonococice diseminate include n mod clasic: dermatit, sinovit, artrit migratorie (prinznd eventual mai multe articulaii). n funcie de localizare, diagnosticul microbiologic se poate pozitiva dup cultivarea unor produse recoltate de la nivel genital, de la nivel articular sau poate fi vorba de snge. 285

O problem care poate aprea este legat de tulpinile de gonococ rezistente la antibiotice i chimioterapice, ceea ce nu a fost constatat n aceast situaie. 24. 3. 2. Antibioterapia n unele afeciuni fr etiologie microbian - o eroare discutabil? n anumite circumstane, abilitatea de a institui antibioterapia n scop profilactic poate fi considerat salutar. Un astfel de exemplu l constituie administrarea de antibiotice locale n afeciunile oculare acute de natur neprecizat (infecioas sau inflamatorie) care necesit intervenire de urgen, acest tratament salvnd, de multe ori, vederea pacientului. Totui, de cele mai multe ori, antibioticele locale (topice) sunt folosite n scop preventiv sau profilactic n terapia ocular primar, fr ca acest lucru s fie necesar. Este demonstrat statistic faptul c aproape toate keratoconjunctivitele la aduli sunt de origine inflamatorie i nu infecioas. Prin urmare, tratamentul local cu corticosteroizi reprezint alegerea adecvat. n comunitatea medical exist tendina de a limita prescrierea antibioticelor topice, n sperana ncetinirii apariiei fenomenului de rezisten la medicamentele antimicrobiene. n prezent, cea mai frecvent indicaie pentru prescrierea unui antibiotic ntr-o afeciune ocular acut este reprezentat de ctre secreia mucopurulent la acest nivel, cu recomandarea recoltrii secreiei respective i realizarea diagnosticului microbiologic direct, nainte de administrarea oricrui alt medicament. Trebuie menionat faptul c marea majoritate a presupuselor ulceraii corneene nu sunt altceva dect infiltrate leucocitare sterile, care n nici un caz nu justific administrarea de medicamente antimicrobiene. Este uimitor ns faptul c tratamentul cel mai frecvent al acestora se face cu antibiotice locale! 24. 3. 3. Urmri ale unei inflamaii n legtur cu sepsisul bacterian Este luat n discuie situaia unei paciente cu endocardit infecioas n antecedente, la care, n urma unei intervenii stomatologice (moment n care a primit profilaxie cu antibiotice) a aprut o osteit la nivel mandibular. Aceast descriere are relevan pentru mai multe aspecte care pot fi luate n discuie, pornind de la sepsisul cu germeni Gram-negativi i continund cu utilizarea corect a antibioticelor i chimioterapicelor, inclusiv situaia n care gestul chirurgical reprezint alegerea optim. De asemenea, este exemplificat o urmare a fenomenului inflamator. O pacient n vrst de 59 de ani s-a aflat n supravegherea unei clinici cu specific de boli infecioase datorit unei afeciuni valvulare pe care s-a grefat n urm cu civa ani un proces infecios. ntr-o perioad de civa ani, pacienta a necesitat mai multe controale sau intervenii stomatologice i n cteva dintre aceste cazuri a primit antibiotice, datorit faptului c interveniile au fost sngernde. Cu toate acestea, n urma uneia dintre aceste intervenii (timp n care a primit o cefalosporin cu spectru lrgit), la cteva zile de la intervenie pacienta a nceput s prezinte febr (38,8C), transpiraii, oboseal i dureri la nivelul toracelui. Numai dup nc o sptmn a decis s se adreseze spitalului (necjit datorit prea multelor spitalizri din ultimii ani), iar la camera de gard i s-a propus internarea, ceea ce pacienta a acceptat. Atitudinea a fost corect i susinut de datele anamnestice, pentru c n urm cu circa 3 ani pacienta mai fusese internat n spitalul de profil, iar diagnosticul la acea dat a fost cel de sepsis cu Enterobacterspp., ca urmare a unei extracii dentare (i de acea dat pacienta a primit antibiotice, dar tulpina izolat s-a dovedit a fi rezistent la toate medicamentele beta-lactamice care au fost testate prin antibiogram difuzimetric standardizat, inclusiv la medicamentele administrate profilactic). La internare, tensiunea arterial era n limite normale, dar auscultator medicul de gard a detectat suflu sistolic att n focarul mitral ct i n focarul tricuspidian, iar dup cteva ore de la internare, la contravizit, au putut s fie auscultate frecturi pericardice. Datele de laborator obinute n regim de urgen au relevat leucocitoz (15.850/l) cu neutrofilie (10.900 PMN/l), valori crescute ale reactanilor de faz acut (protein C reactiv 6mg/l, VSH 112 mm/or, fibrinogen 526 mg/dl) i anemie (nr. hematii 3,1106/l). A fost recoltat snge pentru trei 286

hemoculturi incubate att n aerobioz ct i n anaerobioz. Prima hemocultur a fost recoltat imediat dup internare. n dou dintre cele trei hemoculturi a fost izolat Enterobacterspp., tulpin care s-a dovedit sensibil la ampicilin, gentamicin, amikacin, ciprofloxacin, carbenicilin i asocierea piperacilin-tazobactam. S-a decis instituirea unui tratament cu ampicilin plus gentamicin, pentru o durat de 3 sptmni. Nu a fost utilizat ampicilina n monoterapie, fiind cunoscut faptul c ntr-o astfel de eventualitate ar fi fost posibil dezvoltarea rezistenei nu numai fa de acest antibiotic dar i fa de alte antibiotice (ex. piperacilin). Temperatura a rmas ridicat, iar pacienta a menionat c simptomele nu se amelioreaz, n cursul primelor dou sptmni de terapie. Reactanii de faz acut au diminuat ca valoare, meninndu-se ns peste valorile normale. Examenul clinic realizat (repetat) de ctre medicul stomatolog al unitii nu a revelat o afeciune care s par a fi n legtur cu evoluia insuficient de favorabil, sub tratament. Totui, dup ce mandibula a fost examinat radiologic, cu foarte mult atenie, a fost remarcat o situaie patologic i s-a presupus existena unui granulom care nu era cunoscut anterior. Lund n calcul aceste noi informaii i solicitnd un examen de specialitate la o clinic universitar cu profil stomatologic, s-a decis extracia dintelui situat n vecintatea granulomului respectiv, chiuretarea zonei i asanarea presupusului focar de infecie. Intervenia stomatologic a avut rezultate foarte bune, dup 14 ore de la aceasta constatndu-se diminuarea temperaturii. n urmtoarele 2-3 zile simptomele s-au ameliorat semnificativ. S-a decis continuarea tratamentului antibiotic n aa fel nct durata total s fie de 4 sptmni. Dup a treia sptmn de tratament probele biologice au revenit la valori normale, starea general a fost considerat ca fiind bun iar dup patru sptmni de tratament pacienta a fost externat, vindecat. 24. 3. 4. Rspunsul tegumentului la injurii Cnd pielea este rnit, un Ag necunoscut i gsete expresia n keratinocitele deteriorate. Celulele gamma-delta T nvecinate se grupeaz i contribuie la vindecarea rnii prin producerea, pe plan local, de factori epiteliali de cretere i citokine inflamatoare. n absena celulelor gamma-delta T ale pielii, vindecarea rnilor este mpiedicat (5). n mod tradiional, keratinocitele au fost considerate drept constitueni ineri ai epidermului cu mai multe straturi. Conceptul actual s-a modificat n mod fundamental. Keratinocitul este recunoscut azi ca un juctor activ n rennoirea epidermului i avnd funcii cheie n aprarea imun a pielii. n condiii homeostatice, se presupune c celulele generatoare de keratinocite se divizeaz n mod simetric sau asimetric, ceea ce nseamn c ele continu s prolifereze sau continu s se diferenieze n form definitiv constituind epiderma de suprafa. Procesul fin de rennoire a epidermului se bazeaz pe o reea extraordinar de cascade semnalizatoare care sunt guvernate de interaciunile receptorului keratinocitului cu mediul nconjurtor prin circuitele paracrine si autocrine. Opuse acestui proces homeostatic coordonat sunt semnalele de rnire i inflamare. Ele modific soarta keratinocitului i rspunsul su la mediul nconjurtor prin alterarea moleculelor de adeziune i receptorii de suprafa, prin completarea declanrii unui rspuns inflamator imediat al keratinocitului, prin secreia de citokine, chemokine i peptide antimicrobiene. Dac nu sunt controlate, modificrile fundamentale impuse de rnire i inflamare asupra programului homeostatic, pot conduce la leziuni severe ale pielii inclusiv disfuncii inflamatorii cronice (6). De asemenea Factorul de cretere a hepatocitului (HGFA) este cunoscut a avea importan major n morfogeneza esuturilor, n regenerare i n progresul tumorilor, prin receptorii si, MET. n vivo, HGFA activeaz, de asemenea, proteina stimulatoare de macrofage, care prin receptorii si RON, are roluri n recrutarea macrofagelor, declanarea procesului infecios, supravieuirea celulelor i vindecarea rnilor. Prin urmare, activitatea pericelular a HGFA poate constitui un factor important de reglare a activitilor citokinelor multifunctionale n vivo. (7)

287

24. 3. 7. Posibile terapii n ocul septic ocul septic determin imunosupresie. De aici usurina unor suprainfecii cu germeni condiionat patogeni sau cu tulpini multirezistente, precum: Stenotrophomonas spp., Acinetobacter spp., Candida spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp, citomegalovirusuri etc. Mecanismele prin care conduc la imunosupresie sunt variate: induc depleia celulelor sistemului imun prin apoptoza acestora, suprim exprimarea MHC II, induc supraexpresia citokinelor antiiinflamatorii i a moleculelor co-stimulatoare negative, cresc numrul de LTs. Privind din acest unghi, prevenia imunosupresiei induse de sepis devine o prioritate n tratamentul acestei entitati. Vom parcurge acum cteva terapii propuse de oamenii de tiin. PD-1 (programed death 1) este o protein de origine macrofagic, co-stimulatoare negativ, a crei sintez creste n infecia HIV, concomitent cu a ligandului su, PDL-1. PD-1 scade capacitatea de aprare a organismului prin inducerea apoptozei, prin creterea sintezei de IL-10 (antiinflamatoare), prin impiedicarea proliferrii LT, pe care le face neresponsive. S-a ncercat blocarea PD-1 cu rezultate promitoare n cazul infeciilor fungice i a sepsisului bacterian (n experimentele pe oareci). i-au dovedit eficiena i imunostimulatoarele, precum: IFN (interferon), GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor)i G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor). Au fost rezerve n legtura cu posibilitatea inducerii unei boli autoimune sau a hiperinflamaiei. Acest lucru se pare c nu se produce pentru c rezervele organismului sunt mult prea sczute. Il-7 i Il-15 sunt citokine antiiapoptotice i imunostimulatoare care i-au demonstrat eficiena pe animale de laborator. Il-7 restaureaz funcia limfocitelor i mbuntete migrarea limfocitar prin creterea activitii integrinelor. Folosirea IL-7 ca medicament este deja n faz de trialuri clinice pentru cancer i infecie cu VHC i HIV. S-ar putea folosi flow-citometria pentru cuantificarea moleculelor co-stimulatoare sau proba de stimulare total a secreiei citokinice (rapid whole-blood stimulation assays of cytokine secretion). (8) 24. 3. 6. Farmacogenomic? Ai mai auzit termenul acesta? Dar farmacogenetic? Credei c exist vreo diferen? Si dac da, ce legtur au ele cu inflamaia? S vedem. S-a estimat c genele sunt responsabile de 20-95% din variabilitatea interpersonal cu privire la rspunsul la medicamente. Primele investigaii pe aceast latur au fost fcute n 1950, constituind baza farmacogeneticii, iar mai apoi, a farmacogenomicii. Termenii sunt parial sinonimi. Farmagenomica studiaz efectul unui medicament n relaie cu ntregul genom, n timp ce farmacogenetica, n relaie cu o singur gen sau cu un anume set de gene. Principala ocupaie actual a farmacogenomicii i a farmacogeneticii este detecia unui profil de risc, ce va permite probabil, 2 eventualiti:

identificarea precoce a indivizilor susceptibili la o boal, cu aplicaii n prevenie i tratament dezvoltarea unor metode care s amelioreze progresia bolii.

S lum un caz ... alegem... boala Alzheimer. Bine, bine....dar Alzheimer-ul acesta nu e o boal neurologic? Da, foarte bine. ns, ca i n situaia multor altor boli, astzi i se recunoate i o component inflamatorie. Iat cteva argumente pentru a susine componenta de inflamaie cronic a bolii degenerative Alzheimer: Unii se bazeaz pe dovezi terapeutice, respectiv pe faptul c AINS amelioreaz evoluia (n special AINS de tipul ibuprofen, indometacin, sulindac) Alii se bazeaz pe markeri biologici, artnd c PCR este crescut, cu valori n cele 3 quartile superioare ale valorilor, cu 25 ani naintea diagnosticului bolii. 288

Sunt luate n discuie i teste genetice, spre exemplu mutaia genei M694 pentru gena Pyrin, care reprezint un factor de risc pentru boala Alzheimer pentru populaia reprezentativ >65 ani din Italia. i se pare c este factor de risc i pentru alte boli, cum ar fi infarctul miocardic. Iat i cteva exemple concrete ale farmacogeneticii/farmacogenomicii n cadrul bolii Alzheimer, luate ca exemplu (nu poate fi o abordare exhaustiv). Asocierea dintre genotipul ApoE i boala Alzheimer reprezint una din ntrebrile tiintifice ridicate de dezvoltarea farmacogenomicii. Dar genotipul nu este numai profil de risc, ci i indiciu terapeutic. Tacrina (inhibitor de acetilcolinesteraza) se pare c ncetinete progresia bolii pentru cei care nu sunt homozigoi pentru ApoE4. Pe de alt parte, exist i studii cu rezultate negative privind valoarea predictiv a genotipului ApoE. Un al doilea exemplu relevant este cel al promotorului sintezei 5-LO. n urm cu civa ani s-a observat c inhibitorii cii lipooxigenazei aveau efect numai pentru unii pacieni, variabilitate n strns legatur cu polimorfismul 5-LO. S-a tras concluzia c putem stabili un tratament diferenial, n funcie de genotipul pacientului, concluzie extrapolat de la astm la boala Alzheimer. Un alt exemplu se refer la polimorfismul TLR4, receptor ce se pare c este implicat in fiziopatologia bolii Alzheimer i care ar putea fi folosit pentru nelegerea rolului profilaxiei cu antibiotice n acest caz. (9)

24. 4. Verificai-v cunotinele Alegei A dac 1, 2, 3 sunt adevrate; B dac 1, 3 sunt adevrate; C dac 2, 4 sunt adevrate; D dac 4 este adevrat, E dac toate sunt adevrate (meniunea este valabil pentru primele 2 ntrebri) ntrebarea 1: Urmtoarele evenimente au loc n cazul declanrii unui rspuns inflamator: 1).Modificri la nivelul microcirculaiei, cu creterea calibrului vascular. 2).Creterea permeabilitii vaselor mici i scderea vitezei de circulaie (staz). 3).Modificri ale hemostazei i respectiv marginaia, diapedeza, migrarea leucocitelor. 4).Creterea vitezei de circulaie i scderea riscului trombotic. ntrebarea 2: Sunt false urmtoarele afirmaii: 1).Febra este o dovad a alterrii sistemului imun. 2).Diferitele particulariti structurale ale organismului gazd sau ale unui anumit esut ar putea explica (parial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de ctre acelai agent etiologic. 3).Rezultatul detectabil prin metode de laborator al etapei de vindecare este eliberarea unor factori chemotactici, a unor proteaze i kinaze. 4).Modificrile fiziopatologice apar independent de cauza inflamaiei sau, cu alte cuvinte, indiferent de agentul determinant. Alegei doar un rspuns corect: ntrebarea 3: A).Hipertermia, spre deosebire de febr, nu presupune un nou punct de echilibru, ci depirea capacitii de termoreglare. B).Persoanele mai n vrst au o abilitate sczutde a genera caldur, astfel c o temperatur nu foarte crescutne pune n situaia de a sta linitii, vrstnicul respectiv nu are sigur nici un 289

proces inflamator n derulare n organism. C).n mare, vorbim de febr ntre 37-38C i de subfebr peste 38C. D).Cel mai fidel loc de preluare a temperaturii corporale este axila. E).Infeciile generalizate superficiale nu pot genera febr. ntrebarea 4: A).Fibrinogenul va fi mereu normal ntr-o inflamaie de orice etiologie. B).PCR este secretat de ctre adipocite i ficat n mod fiziologic, ns valori mai mari de 1mg/dL indic existena unui proces inflamator. C).VSH-ul este un test diagnostic pentru infecie localizat sau generalizat. D).VSH-ul reprezint rata la care sedimenteaz hematiile dintr-o prob de snge coagulat, ntr-o or. E).Ceruloplasmina i amiloidul P seric nu sunt RFA (reactani de faza acut). ntrebarea 5: A).Coccii piogeni, precum Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis nu pot provoca inflamaii exsudative purulente. B).Inflamaiile fibroase, care reprezint acumularea de fibrinogen, cu apariia fibrinei i formarea de depozite care se organizeaz i duc la apariia aderenelor, nu apar n pneumonia cu Streptococcus pneumoniae, n dizenteria bacterian, n miocardita difteric. C).Vindecarea propriu-zis ncepe tardiv n cursul procesului inflamator. D).Inflamaii proliferative, avnd ca form particular granulomul, de aspect nodular, apar n infecia cu Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, infecia cu diferite specii de Brucella sau datorate prezenei unui corp strin. E).n miocardita difteric sau n miozita produs de Clostridium spp predomin procesele distrofice i necrobiotice, care corespund inflamaiei seroase.

24. 5. Direcii de cercetare Pentru o cunoatere suplimentar a acestei problematici, putei examina i urmtoarele articole: (1) Cum poate inflamaia influena strategiile terepeutice i vindecarea http://www.medscape.com/viewarticle/557490 (2) Terapii n inflamaie care au drept int celulele dendritice http://www.journal-inflammation.com/content/7/1/37 (3) Models of Infectious Disease Study (MIDAS)...Ghiduri, ghiduri, ghiduri http://www.nigms.nih.gov/News/Reports/midas_processeval.htm

24. 6. Bibliografie 1.C-reactive protein: risk factor, biomarker and/or therapeutic target? http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20386760 2.http://www.sfatulmedicului.ro/analize/viteza-de-sedimentare-a-hematiilor-sau-a290

25. Tolerana imun (A Muntean)

25. 1. Introducere Definiie: Tolerana imun reprezint lipsa rspunsului imunologic indus de prezentarea unui antigen la celulele imunologic competente. Tolerana imunologic reprezint un proces complex, nc incomplet studiat, ce este intricat cu procesul de maturare a celulelor imunitii adaptative. Pentru a menine homeostazia imunologic, indivizii trebuie s fie aresponsivi fa de antigenele proprii (numite self). Limfocitele activate de auto-antigene se distrug (inducia apoptozei proces cunoscut i sub numele de "moarte celular programat"), sunt inactivate (inducia anergiei) sau i schimb specificitatea (Figura 1.)

291

Figura 1. Schem general reprezentnd posibilile mecanisme de inactivare a limfocitelor autoreactive, la nivelul organelor limfocitare centrale ct i n periferie. Celulele sistemului limfocitar provin dintr-o populaie su (stem), comun limfocitelor T i B, ce i are sediul n 292

mduva hematogen. Limfocitele T migreaz n timus pentru a continua dezvoltarea. Ambele seturi limfocitare sunt expuse la antigene self, pentru care unele din aceste celule prezint receptori. Acestea au potenial auto-reactiv, astfel nct, fr mecanisme de reglare, ar putea duce la apariia unor boli autoimune. Mecanismele implicate n reglarea rspunsului limfocitar sunt: apoptoza, anergia, editarea de receptori, generarea de limfocite reglatorii i supresia de ctre acestea a rspunsului imunitar. Toi indivizii motenesc, n mare, aceleai gene care codific receptorii antigenici. Rearanjarea acestor gene duce la generarea unui imens repertoriu imunologic ce permite organismului s rspund fa de o palet foarte larg de antigene. Pentru a ajunge la acest nivel de variabilitate, rearanjarea genelor codante are loc la ntmplare. (NB: Doar genele codante pentru receptorii antigenici sufer procesul de rearanjare, nu ntreg genomul limfocitar.) Invariabil, unii din receptorii generai vor recunoate auto-antigene. Celulele ce poart aceti receptori trebuie eliminate, sau organismul risc s iniieze un rspuns mpotriva propriilor esuturi. Rreactivitate fa de auto-antigene se numete autoimunitate. Imunogenitatea antigenului este dictat de caracteristicile fizico-chimice ale antigenului ct i de condiiile n care acesta este prezentat sistemului imun. Deducem de aici c nu toate antigenele sunt capabile s induc un rspuns imun. Dup acest criteriu, putem clasifica antigenele ca fiind: Antigene imunogene - antigene capabile s induc un rspuns imun. Antigene tolerogene - antigene capabile s induc toleran imunologic. Calitile antigenice care dicteaz statul tolerogen sau imunogen sunt rezumate n Tabelul 1: Factor Cantitate Persisten Modul de ptrundere Prezena adjuvanilor Favorizeaz stimularea rspunsului imun Cantitatea optim difer n funcie de antigen De scurt durat Subcutan, intradermic; Absena n organele limfoide primare* Adjuvanii stimuleaz celulele TH Favorizeaz tolerana imunologic Doze nalte Prelungit Intravenos, oral; Prezena n organele limfoide primare* n lipsa adjuvanilor, antigenele sunt nonimunogene sau tolerogene Nivel sczut de costimulare sau citokine n focar

Proprietile APC Nivel ridicat de costimulare

TH: T Helper. APC: Celul Prezentatoare de Antigen (Antigen Presenting Cell)

25. 2. Mecanisme generale ale toleranei

293

Tolerana rezult din recunoaterea antigenelor de ctre subseturi limfocitare specifice. Aceste limfocite, prezente i la indivizii sntoi, recunosc antigene proprii de pe APC, dar reacioneaz ntr-o manier care induce tolerana i nu un rspuns imun. Tolerana poate fi indus n limfocite imature n organe limfoide centrale (toleran central), sau n limfocite mature n organe periferice (toleran periferic). Tolerana central reprezint un proces intricat cu maturarea limfocitar. n cadrul acestuia, limfocitele imature din organele limfoide centrale devin incapabile sa rspund la auto-antigene prezentate. Aceasta se refer la: - antigene exprimate ubicuitar - antigene circulante prin expunerea acestora pe celule specializate n timus (antigenele poart numele de timodependente) sau captate direct de LB n mduva hematogen (antigene timo-independente). Tolerana central nu este un mecanism perfect i necesit consolidare prin mecanismele toleranei periferice (unele antigene sunt exprimate numai n esuturile periferice). Caracteristicele limfocitelor sine-tolerante sunt rezumate n Tabelul 2: Caracteristic Limfocite T Limfocite B Mduva hematogen; Periferie

Locul principal al Timus (cortex); Periferie inducerii de toleran Faza de maturare Limfocite T CD4+CD8+ (dublu pozitiv) sensibil la toleran Central: aviditate ridicat a recunoaterii antigenelor n timus Periferic: prezentarea antigenic de ctre APC ce nu prezint molecule costimulatoare

Limfocite B imature (IgM+IgD-) Central: recunoaterea antgenelor multivalente n mduva hematogen Periferic: recunoatere antigenic n absena semnalelor de la LT sau costimulrii Toleran central: deleia (apoptoz), editarea receptorilor Toleran periferic: anergie, excludere folicular, apoptoz

Stimuli ce induc tolerana

Toleran central: deleia (apoptoz), Mecanismele pricipale dezvoltarea limfocitelor T reglatorii ale toleranei Toleran periferic: anergie, apoptoz, supresie

25. 3. Tolerana Limfocite T Procesul de distrugere a limfocitelor T imature reactive la auto-antigene este nc incomplet elucidat. Informaiile disponibile momentan sunt n principal bazate pe dovezi in vitro.

25. 3. 1. Tolerana LT Central

294

Pe parcursul maturrii n timus, limfocitele T trebuie s posede dou caracteristici eseniale, care stau la baza funcionrii sistemului imun. Astfel, reamintim conceptul de dubl selecie necesar pentru maturarea LT i migrarea lor din timus: - selecie pozitiv trebuie s recunoasc receptorul MHC II, prezentat pe timocite - selecie negativ nu trebuie s recunoasc antigene expuse n timus n timpul dezvoltrii, toate limfocitele ce se dezvolt n organele limfoide centrale trec printr-o faz n care sunt expuse doar la auto-antigene. Astfel c, n timus, limfocitele T care recunosc cu afinitate crescut un astfel de auto-antigen sunt distruse. Pentru a asigura o selecie ct mai bun a limfocitelor, este necesar ca n aceast etap limfocitele s ntlneasc ct mai multe antigene self. Pentru a facilita acest deziderat, timocitele exprim antigene "periferice" dup inducia factorului de transcripie AIRE AutoImmune REgulator. Trebuie reinut c (aproape) toate celulele din organism conin molecule identice de ADN. Astfel, sub aciunea promoterilor coreci, celulele pot exprima orice antigen prezent n organism. n cazul n care limfocitele CD8+ nu satisfac condiiile de selecie, se induce fie apoptoza, fie anergia. Aceste mecanisme vor fi detaliate n cadrul seciunii urmtoare, ele fiind comune toleranei centrale i periferice. Ca o consecin a recunoaterii de antigene self, limfocitele CD4+ sunt transformate n limfocite reglatoare. Acestea i schimb fenotipul imunologic (markerii de suprafa) i funcional (devin supresoare). n periferie, limfocitele reglatoare vor interaciona cu limfocitele T, contribuind la supresia rpunsului imunologic prin secreia citokine anti-inflamatorii (ex: IL-10).

25. 3. 2. Tolerana LT Periferic Tolerana LT Periferic reprezint procesul prin care limfocitele mature, n organe limfoide periferice devin incapabile s rspund la auto-antigene. Importana clar este reprezentat de tolerana fa de antigenele specifice esuturilor periferice ce nu sunt abundent exprimate n timus. Consolideaz tolerana indus central. Am menionat n alte capitole ale acestei cri, rolul critic al semnalelor costimulatoare pentru declanarea rspunsului imun. (vezi capitolul 13. Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi.) Expunerea LT CD4+ la antigene, n absena costimulrii APC, poate induce anergie. Astfel este posibil ca antigene periferice prezentate subseturilor LT autoreactive, n lipsa reaciei imunitii native (inflamaiei) s induc tolerana. Experimentele au artat ca n lipsa co-stimulrii de ctre cuplul molecular B7-CD28, semnalul transmis de TCR nu este suficient pentru a induce rspunsul imun i induce tolerana prin anergie sau apoptoz (Figura 2).

295

Figura 2. Rspunsul n urma interaciunii celulelor sistemului imun aflate n diferite stadii de activare. n lipsa unor semnale de activare date de inflamaie, macrofagele i limfocitele imature imunologic vor conduce la toleran.Celulele APC mature sunt caracterizate de prezena pe membrana lor a ligandului costimulator numit B7. Celulele LT mature prezint pe membran receptorul CD28, iar din interaiunea lor, se transmit semnale stimulatoare, rezultnd n activarea i proliferarea LT. n absena uneia dintre cele dou molecule, se induce anergia. LT imature prezint, n loc de CD28, o molecul inhibitoare, numit CTLA4. Funcia moleculei CTLA4 este de fosfataz, cu rolul fiziologic de a contra-regla rspunsul imun. Anergia reprezint o stare caracterizat de incapacitatea limfocitelor de a nu rspunde la stimuli. Aceasta este indus n urma interaciunii cu un auto-antigen i inducerea toleranei. Sau descris o serie de factori epigenetici i morfologici (markeri de suprafa) caracteristici limfocitelor anergice, dar ne vom opri asupra caracterelor funcionale: - scderea expresiei de molecule TCR, creterea turn over-ului acestor molecule - recrutarea tirozin fosfatazelor cu rolul de a diminua semnalizarea TCR - semnale inhibitorii de la molecule de tip CTLA4 care competiioneaz cu CD28 pentru legarea 296

moleculelor stimulatoare B7. Este posibil ca celulele dendritice rezidente n organe limfoide sau organe periferice s se afle ntr-un stadiu imatur, exprimnd puine molecule B7. n lipsa semnalului costimulator, LT devin anergice. LT Reglatoare (LTR) au fost extensiv caracterizate fenotipic (CD4+, CD25+, foxP3+) i totui incomplet funcional. Sunt formate prin recunoaterea antigenelor self in timus. Aciunea lor este periferic, unde au rolul de a completa tolerana central. Acioneaz prinsecreia de IL-10 si TGF-, cu rol anti-inflamator. - secreia acestor molecule blocheaz activarea i functia celulelor LT efector i a macrofagelor. - unele experimente demonstreaz inhibarea APC prin contact direct a LTR Dei acest subset este cel mai bine studiat, s-au descris mai multe fenotipuri reglatoare. Se caut defecte de dezvoltare a LTR in boli autoimune precum DZ1 (Diabet Zaharat tip I) i SM (Scleroz Multipl). Apoptoza reprezint, ntr-o definiie simplist, moartea celular programat. Acest proces este rezultatul activrii unor pachete enzimatice complexe care duc la fragmentarea ADN-ului i digestia proteinelor celulare, cu meniunea important c membrana citoplasmatic rmne intact. Limfocitele T care recunosc molecule antigene proprii sau sunt expuse pentru lung timp la un anumit antigen mor prin apoptoz. Cile biochimice care induc apoptoza sunt: - Calea Mitocondrial (Bim) Limfocitele T care recunosc antigene fr costimulare sau n absena inflamaiei activeaz un rspuns pro-apoptotic, prin proteina Bim (membr a familiei Bcl-2). Molecule aflate in membrana mitocondrial, regleaz stabilitatea acesteia. Aceste molecule au diverse roluri, fiind pro- si anti-apoptotice, ct i molecule senzor pentru diveri stresori. Citocromul C este sechestrat n mod normal n interiorul mitocondriei, iar eliberarea sa n citoplasm este mediat de canale sensibile la moleculele pro-apoptotice de tip Bax/Bak. Citocromul C joac un rol important, ca marker al destabilizrii membranei mitocondriale i activator al caspazelor. Molecule precum Bcl i Bcl-XL au rolul de a stabiliza canalele mitocondriale, avnd astfel rol anti-apoptotic. - Calea Receptorilor Morii (Fas-FasL) Stimularea repetat a LT conduce la co-expresia unor receptori care, activai, induc apoptoza. n LT CD4+, receptorul implicat n inducerea apoptozei este numit Fas (CD95). Acesta este membru a familiei TNF i conine, n poriunea intracelular domenii specializate care traduc semnale pro-apoptotice. De menionat c FasL este o molecul cvasi-ubicuitar exprimat, contribuind la meninerea toleranei interaciunea LT CD8+ cu MHC I de pe esuturi, n lipsa citokinelor de la LT CD4+ duce la dominana relativ a semnalelor transmise de Fas. Trimerizarea Fas duce la inducerea programului pro-apoptotic prin activarea unor serinproteaze numite caspaze. Acestea induc degradarea proteinelor intracelulare i fragmentarea ADN. Dei caspazele pot induce apoptoza separat, cele doua mecanisme se autopoteneaz. Caspaza 8 activeaz molecula Bid care activeaz i calea mitocondrial de apoptoz. (Figura 3)

297

Figura 3. Schema reprezint cascadele intracitoplasmatice care conduc la activarea programului apoptotic i punctul de intersecie reprezetat de Caspaza 8 i Bid.

25. 4. Tolerana Limfocitelor B

25. 4. 1. Tolerana LB Central Asemntor LT, tolerana central a LB este indus atunci cnd limfocitele imature, recunosc cu afinitate mare un antigen. Diferena const n faptul c aceste antigene sunt de obicei circulante n snge i se leag direct de BCR (B Cell Receptor). Editarea BCR reprezint un mecanism specific de toleran a limfocitelor B. Mecanismul implic reactivarea unor enzime (RAG1 i RAG2) ducnd la rearanjarea genelor VJD i formarea imunoglobuline cu o nou specificitate. Acest proces este cu att mai intens cu ct semnalul este mai puternic (legare multivalent). Procesul de editare BCR este un important mecanism de prevenire a apariiei de clone LB auto-reactive. Dac editarea d gre i LB continu s recunoasca un antigen propriu, se induce apoptoza. Un semnal mai putin putenic duce la instalarea anergiei.

298

Figura 4. Schem a mecanismelor implicate n tolerana limfocitelor B, central i periferic. Scopul unui rspuns imun bine-reglementat este s apere gazda de patogeni, fr a cauza distrugeri esuturilor organismului.

25. 4. 2. Tolerana LB Periferic Mecanismele implicate sunt asemntoare, fiind reprezentate de: - Anergie - Apoptoz interaciunea Fas - FasL de pe LTh antigen-specifice - Excluzie folicular un alt mecanism LB-specific. Limfocitele B care recunosc un antigen propriu au puine molecule CXCR5, care n mod normal ghideaz limfocitele B n zona folicular a nodulului limfatic. n mediu extrafolicular, LB nu primesc suficiente semnale de supravieuire. Scopul unui rspuns imun bine-reglementat este s apere gazda de patogeni, fr a cauza distrugeri esuturilor organismului.

25. 5. Tolerana imunologic n sarcin O condiie special o reprezint inducerea toleranei n cadrul perioadei gestaionale. S-a demonstrat c, n trimestrul second, 20-25% din LT din splin au un fenotip TLR, iar nivelul de TGF- este crescut. Aceste populaii Treg revin la normal la scurt timp dup ncheierea sarcinii. Controlul acestui status imun pare sistemic, ntruct pierderea sarcinii duce la revenirea la statusul imun normal [1]. Incubarea culturilor splenice cu alo-antigeni, a dus la o activare slab [2]. n timpul sarcinii, timusul produce cantiti mari de limfopoietin, ce face ca celulele

299

dendritice placentare s transforme LT CD4+ n fenotip CD25+ foxP3+, capabile de secreia IL-10 [3].

25. 6. Oprirea rspunsului imun Pn acum am discutat despre mecanismele prin care sistemul imun devine neresponsiv fa de auto-antigenele expuse de esuturile proprii. Meninerea relativ constant a numrului de limfocite n faa numeroaselor stimulri antigenice ntmpinate de individ este o component vital pentru meninerea homeostaziei. (Figura 5)

Figura 5. Schem a fazelor rspunsului imun, cu expansiunea clonal i contracia limfocitar. Rspunsul imun este auto-limitat, scznd n intensitate pe msur ce antigenele implicate n declanarea sa sunt eliminate. Astfel, se revine la un status de baz al sistemlui imun, care devine pregtit de o nou ncercare antigenic. Apoptoza i inactivarea limfocitelor sunt mecanismele principale implicate n homeostazia rspunsului imun, astfel nct organismul poate s fa la generarea expansiunea clonal din cadrul stimulrii rspunsului imun. Proliferrile anarhice ale limfocitelor sunt ntlnite n cadrul limfoamelor, cu consecine grave. n urma eliminrii antigenelor, limfocitele sufer o faz de contracie, n care majoritatea celulelor care rspund la stimulul antigenic sunt pierdute. Faza de contracie este n principal datorat morii programate a limfocitelor, care, n lipsa semnalelor de supravieuire din mediu, activeaz un program apoptotic. Antigenele, semnalele costimulatoarea i citokinele dezvoltate n focarul inflamator au ca funcie blocarea semnalelor pro-apoptotice i permit supravieuirea limfocitelor atta timp ct provocarea antigenic exist. Se consider c majoritatea clonelor generate n faza de expansiune sunt sortite a deveni limfocite-efector, cu via scurt. Spre deosebire de limfocitele-efector, n cadrul rspunsului imun se genereaz i limfocitele-memorie. Acestea sunt silenioase din punct de vedere funcional i au o via lung, fiind capabile s rspund repede n cazul ntlnirii antigenului fa de care sunt sensibile. CLTA-4 ncepe s fie exprimat n cantiti mari dup 3-4 zile de la activarea limfocitar. Astfel, este posibil ca CTLA-4 s joace rolul unui stimul fiziologic de oprire a sistemului imun. Aceast 300

molecul competiionz direct cu CD28 pentru a se lega de B7 de pe APC (blocarea semnalului costimulator). Un alt mecanism de aciune l reprezint recrutarea de fosfataze, care defosforileaz regiunile ITAM ale CD3 i , blocnd semnalul TCR. Alte molecule de inhibare a rspunsului imun au fost descrise, dintre cele mai studiate fiind PD-1. (Figura 6)

Figura 6. Inhibiia semnalelor B7 i TCR prin exprimarea n numr mare a CTLA4 la cteva zile de la activarea limfocitar. Antibody feedback Anticorpii IgG inhib activarea limfocitelor B prin formarea de complexe antigen-anticorp (CAA) cu antigene polivalente. CAA se cupleaz, prin poriunea Fc a anticorpilor cu receptorul specific de pe limfocite B, FcRIIB (sau CD32). Aceti receptori conin secvene care, odat fosforilate, recruteaz fasfataze (SHIP). Prin legarea simultan

Figura 7. Inhibiia semnalelor activatoare prin complexele antigen-anticorp formate de interaciunea anticorpilor cu antigene polivalente i receptori Fc speciali.

301

Una din consecinele inflamaiei este fibroza tisular. n lipsa unei controlri judicioase a semnalelor ce ntrein inflamaia i rspunsul imun, organismul ar suferi leziuni induse de aceste mecanisme de aprare. Ca urmare a citokinelor secretate n focarul inflamator, fibroblastele devin active metabolic, ducnd la producia i secreia de colagen. n cazul inflamaiei moderate, ca cea ntlnit ntr-o stimulare normale a sistemului imun de ctre un agent patogen comun, fibroza este minim iar citoarhitechtura i fiziologia tisular rmne fr consecine un astfel de grad de fibroz este fiziologic; n cazul inflamaiei severe sau cronice, fibroza este important i duce la disfuncii organice profunde. Unul din mecanismele care rmn nc mult investigate sunt translaia epitelio-mezenchimal prin care, tot sub influena produilor inflamatorii, celulele epiteliale trec n fibroblati sau miofibroblati care sunt responsabile de fibroz [4]. Este lesne de neles c aceste modificri sunt cu att mai importante n organele parenchimatoase ca plmnul, rinichiul i ficatul n care epiteliile naltspecializate au rol foarte important. Pierderea masei epiteliale induce disfuncii severe ale funciei acestor organe. 25. 7. Povestire adevrat Dei nu reprezint o metod terapeutic utilizat n tratamentul bolilor infecioase, trebuie recunoscut importana terapiei .Reelele imunoreglatoare dezvoltate n decursul ontogenezei organismului sunt rezultatul unei istorii complexe, marcat de repetate interaciuni cu factori microbiali, rezultnd n comensalism de scurt/lung durat, sau infecie acut/cronic/latent. Aceast istorie a fost numit biografia sistemului imun, jucnd un rol n sntate i boal. microclimatul tumoral are efect de supresie asupra sistemului imun. Totodat, tumorile care declaneaz un rspuns limfocitic pronunat au un fenotip mai blnd i un prognostic mai bun. Interaciunile celulelor neoplazice cu sistemul imun sunt extensive. Trebuie readus n discuie efectul carcinogen pe care l poate avea inflamaia cronic dar i anergia pe care o prezint pacienii cu neoplasm activ. Cile reglatoare care inhib rspunsul imunologic n cancer sunt caracterizate din ce n ce mai bine, iar studiul lor a dus la descoperirea unor noi inte terapeutice. Ipilimumab este un anticorp IgG1 monoclonal uman, care, datorit inhibrii CTLA-4, are rol n activarea imunitii antitumorale. Studii de faza 2 au fost deja efectuate, folosind Ipilimumab att n monoterapie ct i mpreun cu ali ageni (inclusiv alte vaccinuri anticanceroase). Un studiu multicentric, randomizat publicat de curnd, a implicat trei brae de tratament Ipilimumab+Gp100 / Gp100 monoterapie / Ipilimumab monoterapie. Gp100 este o protein menlanosomal, ce i-a dovedit eficacitatea prin mbuntirea rspunsul n pacienii tratai cu doze mari de interleukin-2. S-a demonstrat astfel, pentru prima oar ntr-un studiu randomizat, c Ipilimumab, singur sau n combinaie cu Gp100, a mbuntit supravieuirea pacienilor cu melanom malign metastatic, comparnd cu cei ce au primit monoterapie cu Gp100. Este pentru prima oar cnd o terapie mbuntete supravieuirea pacienilor cu melanom metastazat. Datorit efectelor de derepresare a sistemului imun, aceast terapie poate prea relativ nespecific. Efectele adverse serioase (inclusiv necroza hepatic fulminant), dei pot fi tratate cu doze mari de corticosteroizi, pun probleme. Succesul nregistrat de Ipilimumab dezvolt un cadru conceptual pentru continuarea studiilor folosind imunomodulatoare (de orice form) n boala neoplazic. Vaccinarea cu celule neoplazice ntregi, sau antigene specifice, cu DC-uri ncrcate cu antigene specifice sau autotransfuzia cu limfocite T anti-melanom activate i expansionate in vitro, toate au potenial de a fi folosite n arsenalul mpotriva melanomului malign.

302

26. Diagnosticul n bolile infecioase prima parte (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)

26. 1. Introducere. Relevana diagnosticului n bolile infecioase n bolile infecioase (numite de ctre unii autori i boli transmisibile; transmisibile sunt ns i maladiile genetice, fr a fi n acelai timp i infecioase) diagnosticul are o importan considerabil (uneori decisiv, influennd n mod direct prognosticul). De stabilirea corect i precoce a diagnosticului pot depinde

att salvarea/vindecarea/mbuntirea strii de sntate a bolnavului, ct i succesul msurilor de prevenire/profilaxie care trebuie iniiate ct mai rapid posibil, pentru a prentmpina dezvoltarea unui eventual focar epidemic (izbucnire epidemic, outbreak) sau chiar a unei epidemii. De exemplu, ignorarea primului caz al unei boli infecioase grave (holer, febr tifoid, difterie, meningit meningococic etc.) poate avea consecine clinice i epidemiologice foarte importante.

n prima parte a manualului am prezentat datele de baz, necesare oricrui diagnostic microbiologic (direct sau indirect). Avnd la baz aceste cunotine, n partea special vom aborda fiecare gen n parte, urmrind o serie de noiuni pe o schem asemntoare (de menionat c acest stil poate fi util indiferent de etiologia bacterian, fungic, parazitar sau viral, cu anumite particulariti). Dorim s subliniem c n viaa real, pe msura acumulrii cunotinelor i experienei n practica de zi cu zi, fiecare va putea s ajung la o modalitate de abordare optim. n fiecare capitol vom exemplifica modul n care se poate face diagnosticul de laborator, folosind o schem general de diagnostic (prezentat n capitolul 27) pentru infeciile produse de principalele microorganisme studiate. Considerm c utilizarea n mod repetat a unei scheme clare permite o mai bun fixare a cunotinelor precum i atingerea obiectivului stabilit: reinerea unor principii utile, indiferent de specialitatea care a fost / va fi aleas ulterior. Microbiologia este, dup prerea noastr, o tiin cu foarte mare aplicabilitate practic. Elementele de baz ale microbiologiei sunt necesare i utile pentru toi cei implicai n sistemul sanitar; cunoaterea acestor elemente de baz ar putea preveni o serie de anomalii i erori care uneori sunt dezastruoase (aa cum s-a ntmplat spre exemplu ntr-o maternitate n care o serie de nou-nscui au decedat datorit unor infecii de spital/nosocomiale).

26. 2. Contextul actual Dac n urm cu circa 40 de ani, la nivel internaional a nceput s se considere (n mod absolut eronat) c problemele legate de bolile infecioase sunt din ce n ce mai puin importante (eroare carea creat inc mai creeaz probleme n sntatea public la nivel naional i internaional), n ultimii 13-14 ani (n special ncepnd cu anul 1998) s-a dovedit, concret, c bolilor infecioase trebuie s li se re-acorde importana cuvenit. n opinia noastr, referina n domeniu este reprezentat de ctre DECIZIA 2119/98/CE A PARLAMENTULUI EUROPEAN I A CONSILIULUI din 24 septembrie 1998, de creare a unei reele 303

de supraveghere epidemiologic i control al bolilor infecioase/transmisibile n Comunitate, a crei traducere n limba romn poate fi examinat la http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CONSLEG:1998D2119:20071228:RO:PDF Pornind de la aceast DECIZIE au fost elaborate numeroase acte normative n domeniu iar fondurile alocate au sporit substanial, ncercnd s se vindece situaia la care se ajunsese datorit erorilor fcute anterior. i n ara noastr, preocuparea fa de sntatea public n general i fa de microbiologia n sntatea public n mod particular a crescut ncepnd cu anul 1997, chiar nainte ca primele decizii i directive ale UE s apar i s fie publicate n documentele oficiale. Astfel, activitatea desfurat n domeniul reformelor pentru sntatea public n Romnia a fost n acea perioad, din acest punct de vedere, destul de aproape de reforma care a avut loc n restul UE. Diferitele proiecte i programe iniiate n special n perioada 1997-2000 (iniial n colaborare cu CDC, Atlanta, GA i OMS, Copenhaga sau OMS, Geneva) i-au gsit concretizarea n aplicarea unor msuri cu mare importan la nivel naional:

reabilitarea centrelor de referin pentru microbiologie, reforma sistemului de supraveghere a tuberculozei, adaptarea la standarde internaionale a sistemului de diagnostic, prevenire i control pentru bolile cu transmitere sexual, meninerea la un nivel corespunztor a imunizrilor pentru a preveni bolile prevenibile prin vaccinare, includerea Romniei n sistemul de pregtire n scopul supravegherii bolilor infecioase la nivel european etc.

Totui, dorim s subliniem faptul c prima ncercare (reuit) pentru reforma sistemului de supraveghere a bolilor infecioase a fost nregistrat n perioada 1990-1991. Echipa format atunci, echip care a nceput adevrata supraveghere pentru sntatea public, a fost din pcate distrus n anul 1992, artnd nc o dat influena negativ a politicului n sntate. Din anul 1999 Romnia face parte (ca membru fondator) din Reeaua de supraveghere a bolilor transmisibile n Balcani. n anul 2000, a fost organizat una dintre cele mai importante ntlniri cu scopul armonizrii supravegherii bolilor infecioase n Europa (Consensus Meeting on Surveillance of Infectious Diseases, Grottaferrata, Italia, 7 aprile 2000). Prezentarea pe care unul dintre coordonatorii prezentului volum a fcut-o cu acest prilej, discuiile care au urmat n ateliere de lucru, ntlnirile cu factori de decizie ai Organizaiei Mondiale a Sntii, iniiativa organizrii unei reele de supraveghere a bolilor infecioase/transmisibile n rile din Europa Central i de Est (ntlnire plenar pe care am organizat-o n decembrie 2000, la Bucureti, prima i singura de acest nivel n perioada 1990-2007, neegalat pn n prezent) au dus la construirea unui proiect de reform n domeniul supravegherii bolilor transmisibile cu sprijin european (Phare) pe care l-am gndit n perioada mai-octombrie 2000, l-am scris n perioada octombrie-noiembrie 2000 (ajutat pentru finalizare de colegii de la Direcia de Integrare European i Programe de Sntate din Ministerul Sntii) i care a fost aprobat la data istoric de 14 noiembrie 2000. Finanarea a fost de circa 5 milioane EUR (circa 4 milioane EUR fonduri nerambursabile, Phare). Implementarea fondurilor pe care le-am ctigat n anul 2000 a avut loc n perioada 2003-2004, dup opinia noastr mai trziu dect a fost cazul i cu o performan mai sczut n comparaie cu cea care ar fi fost atins de echipa condus (n perioada 1999-2000) de unul dintre coordonatorii prezentului manual, n acelai timp autorul proiectului.

304

Chiar dac reprezint msuri pentru prevenirea unor maladii virale (i nu bacteriene sau fungice), vom mai aminti, dintre msurile luate n ultimii ani, mbuntirea programului de vaccinare mpotriva infeciilor cu virusul hepatitei B, n anul 1999. Vaccinarea nou-nscuilor avea deja o vechime de 4 ani, dar n 1999, prin politica dus n domeniul sntii publice, a fost inclus i vaccinarea copiilor din clasa a III-a, vaccinarea tuturor elevilor din anul I de la colile sanitare postliceale i respectiv a studenilor din anul I din facultile de medicin i stomatologie. Ulterior, cohortele de copii vaccinai apropiindu-se, a nceput vaccinarea tinerilor aflai n clasa a XII-a i astfel, nu numai viitorii medici sau asisteni medicali au beneficiat i beneficiaz de aceast metod profilactic. Politica de vaccinare a permis ca n numai civa ani, un mare numr de generaii de copii i tineri s fie vaccinate fa de o infecie care devenise endemic la nivelul anilor 90. Dac pn n anii 2000 au existat foarte bune relaii de colaborare cu OMS i CDC, Atlanta, acum principala colaborare are loc cu ECDC, Stockholm. Bazele relaiilor cu ECDC au fost puse n perioada 2005-2007, att n misiuni comune [investigarea izbucnirilor epidemice de grip aviar, evaluarea epidemiei de rujeol (datorat acumulrii de persoane susceptibile n perioada 20012004), evaluarea sistemului de supraveghere al bolilor infecioase n general i al infeciilor cu transmitere sexual n particular etc.], ct i prin participarea experilor romni la ntruniri internaionale pe teme microbiologice sau epidemiologice. Odat cu integrarea Romniei n UE a devenit posibil i pregtirea specialitilor romni, prin includerea Romniei n sistemul de pregtire n scopul supravegherii bolilor infecioase la nivel european, participarea (ncepnd cu anul 2007) ca membru cu depline drepturi n reelele europene privind supravegherea bolilor infecioase, n reelele care discut viitorul microbiologiei sau epidemiologiei la nivel european etc. ncepnd cu anul 2007, cetenii romni pot participa i particip la modulul complet de pregtire n domeniul epidemiologiei, la nivel european (European Programme for Intervention Epidemiology Training, EPIET). Fiecare dintre aspectele menionate are o strns legtur att cu microbiologia, ct i cu sntatea public i merit a fi cunoscute att de ctre medicii ct i de viitorii medici care activeaz n sistemul sanitar romnesc sau la nivel european.

27. Diagnosticul n bolile infecioase partea a 2-a (MI Popa, Anca StreinuCercel, Oana Streinu-Cercel, Gabriela Loredana Popa)
Aa cum am menionat anterior, n privina terminologiei, n vorbirea curent se discut despre boli transmisibile (traducere a termenului anglo-saxon communicable diseases), ns mai corect este s le denumim boli infecioase.

27. 1. Recomandri cu privire la diagnosticul integrat, n bolile infecioase Cu toate c n primii ani de studiu este abordat n mod special partea microbiologic (bacteriologic, virusologic, parazitologic, micologic) a diagnosticului, este strict necesar s menionm c examenul clinic i pstreaz valoarea n totalitate. Orice investigaie de laborator este precedat de studierea elementelor clinice, ulterior discuiei cu pacientul sau aparintorii acestuia (anamnez). Fr un examen clinic aprofundat i fr evaluarea zilnic a evoluiei din punct de vedere clinic i paraclinic a bolii, nici laboratorul de 305

microbiologie modern nu poate fi utilizat la nivelul posibilitilor actuale. Dorim s subliniem faptul c n scopul diagnosticrii bolilor infecioase au fost puse la punct numeroase tehnici de laborator, metode paraclinice, precise i obiective, dar utilitatea lor este maxim atunci cnd rezultatele sunt interpretate n contextul clinic i epidemiologic. Aa cum am mai menionat i anterior, colaborarea i stabilirea unei echipe interdisciplinare reprezint un deziderat esenial, inta final fiind reprezentat de vindecarea pacientului i prevenirea apariiei unor cazuri secundare. Investigarea i documentarea bolilor infecioase ilustreaz prin excelen principiul trepiedului diagnostic, datele de anamnez servind la orientarea examenului clinic obiectiv, care la rndul su direcioneaz investigaiile paraclinice de laborator, imagistice .a. astfel nct tabloul unitar necesar demersului diagnostic poate fi realizat prin coroborarea datelor extrase prin toate cele trei metode. n diagnosticul bolilor infecioase trebuie respectate urmtoarele reguli: 1. Culegerea datelor reprezint de multe ori o urgen; trebuie realizat ct mai curnd posibil. Toate datele necesare diagnosticrii unei boli infecioase (clinice, paraclinice i de laborator) trebuie obinute ct mai rapid, chiar n prima or dup luarea n eviden a bolnavului. Anamneza i istoricul bolii trebuie s fie realizate riguros, de fiecare dat (chiar i atunci, sau mai ales atunci cnd situaia pare s fie asemntoare cu o situaie cunoscut - interpretarea datelor sub form de ablon reprezint un mare risc!). Spre exemplu, succesul sau insuccesul terapeutic n meningitele sau n endocarditele bacteriene depinde de fiecare or, ctigat sau pierdut. n cazul apariiei unui caz de holer, lipsa obinerii informaiilor necesare (anamnestice), lipsa orientrii ctre ipoteza diagnostic, lipsa recoltrii, examinrii coprocitogramei (element esenial = lipsa leucocitelor) i nsmnrii produsului patologic pe ap peptonat alcalin vor putea crea probleme att pentru pacientul respectiv (evoluia putnd fi sever n lipsa instituirii rapide a msurilor de re-echilibrare hidroelectrolitic) ct i din punct de vedere al diseminrii infeciei (1) (de ex. n cazul n care aceast situaie ar aprea n Delta Dunrii, n condiii igienico-sanitare precare). 2. Datele obinute n vederea diagnosticului trebuie privite ca un tot unitar; diagnosticul de boal infecioas trebuie s rezulte din totalitatea datelor clinice i a celor de laborator considerate i interpretate unitar. Nu pot fi absolutizate nici posibilitile clinice i nici cele ale laboratorului. Metodele de laborator, luate separat, nu permit punerea diagnosticului, dar executarea corect a manoperelor de laborator reprezint o condiie sine qua non pentru un diagnostic corect i util. Este deosebit de important ca, n momentul n care lum n calcul un diagnostic din sfera bolilor infecioase, s nu excludem i alte etiologii posibile. De exemplu, o pacient n vrst de 51 de ani se prezint pentru apariia recent a unor leziuni eritematoase (Figura nr. 1). Date din anamez (tratament cu etoricoxib) corelate cu lipsa decelrii altor leziuni similare la examenul clinic obiectiv, au condus ctre diagnosticul de eritem fix reacie advers rar la administrarea de etoricoxib (2). Acest caz ilustreaz ponderea datelor anamnestice n formularea unei ipoteze diagnostice. 3. Este indispensabil s se stabileasc diagnosticul etiologic n toate maladiile infecioase, nsoit de testarea sensibilitii la medicamentele antimicrobiene pentru tulpina izolat, avnd n vedere utilitatea i importana tratamentului antimicrobian, precum i actualitatea problematicii referitoare la rezistena la antibiotice i chimioterapice (3). Anamneza trebuie realizat cu rigurozitate; aprecierea statusului imunologic poate avea o contribuie esenial; efectuarea unui examen clinic minuios constituie o alt condiie a unui diagnostic complet. Pentru medic (dar i pentru pacient) conteaz toate datele obinute prin examenul obiectiv; nici un element nu trebuie neglijat: - faciesul bolnavului (facies = aspect caracteristic, corelat cu boala de care sufer o anumit persoan), postura i unele aspecte particulare; 306

- febra/curba termic (cu toate caracteristicile ei); trebuie folosit termometrizarea i nu senzaia de febr (vezi i subcapitolul 24.1.); - modificrile aprute la nivelul mucoaselor i la nivel tegumentar; - semnele de insuficien respiratorie acut; - semnele care relev un dezechilibru hidro-electrolitic i acido-bazic; - modificrile neurologice i psihice etc. n interpretarea curbei termice, este important s evalum urmatoarele aspecte:

magnitudinea febrei, frecvena i durata episoadelor febrile, recurena acestor episoade (cu/fr periodicitate), relaia dintre puls i temperatur i patternul de remisie a episoadelor febrile (4) etc.

Administrarea de antibiotice i/sau antipiretice poate altera aspectul curbei termice (5), dar cu toate acestea, n cazurile tipice, este important de decelat prezena unor pattern-uri febrile aazise clasice. De exemplu, febra teriar se suprapune peste ciclul de reproducere asexuat al Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale pe cnd febra cuaternar este nalt sugestiv pentru P. malariae(6). Totodat, febra continu poate fi ntlnit n patologiile de etiologie rickettsian iar un pattern bifazic poate semnala febra Dengue (5). 4. Folosirea corect a datelor care pot fi oferite de ctre laborator constituie un alt aspect foarte important. Este necesar ca fiecare medic clinician s tie ce analize s solicite, ce produse se recolteaz de la bolnav, cnd i cum s le recolteze, cum s le expedieze / pregteasc pentru expediere ctre laborator. Sunt de menionat i reinut urmtoarele reguli: - produsele se recolteaz nainte de administrarea tratamentului antimicrobian; - se trimite laboratorului o cantitate suficient de produs pentru examinat; - produsul trimis trebuie s fie reprezentativ pentru boala respectiv (de exemplu, sput i nu saliv n infeciile respiratorii inferioare); - produsul trebuie recoltat n perioada n care probabilitatea decelrii agentului etiopatogen este maxim (de exemplu, recoltarea pentru hemoculturi se face, pe ct posibil, n timpul unui episod febril); - produsul examinat nu trebuie contaminat cu ali germeni n cursul recoltrii sau al transportului (recoltare i transport n condiii aseptice) (7); - expedierea ctre laborator se face n condiiile de conservare cerute pentru fiecare produs n parte (trebuie s existe recomandri specifice, n detaliu, la ndemna medicilor); - se solicit examinarea imediat a produselor transmise ctre laborator; - se urmrete, n timp, apariia rezultatelor i se ine legtura cu colegii din laborator. ns, pentru ca datele de laborator s fie corecte este strict necesar respectarea unei anumite conduite n laborator, utilizarea judicioas a diferitelor aparate i echipamente de laborator i implementarea controlului de calitate (intern i extern) (a se vedea anexa nr. 5). 5. Trebuie s existe o colaborare strns i continu ntre clinician i specialistul de laborator. Este necesar o informare (care s includ aspecte rezultate n urma anamnezei i elemente clinice) a medicului de laborator fcut de ctre clinician (direct sau cel puin prin telefon) pentru orientarea cercetrilor n laborator i pentru alegerea celor mai bune metode de identificare a agentului etiologic. n acelai timp, laboratorul informeaz clinicianul pe parcurs n legtur cu datele preliminare obinute. n cadrul examenelor de laborator, un loc prioritar este ocupat de diagnosticul microbiologic (bacteriologic i / sau imunologic), care va fi prezentat n continuare. Pe scurt vor mai fi notate cteva alte date referitoare (examene paraclinice, utile n diagnosticul bolilor infecioase). Diagnosticul citologic: const n punerea n eviden a unor aspecte celulare caracteristice, utiliznd un material prelevat de la bolnav (ex. din leziuni tegumentare sau amprente de la nivelul mucoaselor). Spre exemplu, citodiagnosticul revrsatelor pleurale i al lichidului 307

cefalorahidian poate aduce date preioase pentru elucidarea etiologiei unei pleurezii i respectiv a unei meningite. Diagnosticul histologic: prin biopsii (recoltate prin tehnic chirurgical) sau prin puncii-biopsii ale diferitelor organe (ficat, rinichi, plmn, ganglioni limfatici, fragmente vasculare, mucoas digestiv sau respiratorie) se pun n eviden modificri structurale caracteristice, determinate de aciunea agentului patogen. Metodele de laborator nespecifice: n diagnosticul bolilor infecioase sunt utile informaiile obinute prin analiza valorii hemogramei, leucogramei (cu modificri destul de caracteristice n anumite situaii), vitezei de sedimentare a hematiilor, testelor de disproteinemie, testelor enzimatice, proteinei C reactive (beta-globulin care nu se gsete n serul normal, aprnd numai n afeciuni inflamatorii, neoplasme i n procese necrotice), altor teste de inflamaie (reactani de faz acut) etc. Alte metode paraclinice: examenul radiologic poate furniza date de valoare pentru bolile infecioase cu participare pulmonar (pneumonii virale, febr Q, pneumonie pneumococic etc). Se mai pot folosi rectosigmoidoscopia, electroencefalografia, electrocardiografia, diferite determinri biochimice, examene oftalmologice, scintigrafia, ecografia, tomografia computerizat, rezonana magnetic nuclear.

27. 2. Schema general a diagnosticului microbiologic Diagnosticul de laborator n microbiologie poate fi un diagnostic bacteriologic sau micologic (direct), un diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaie a celor dou variante menionate. Aa cum am menionat, n continuare dorim s prezentm etapele principale ale diagnosticului microbiologic (bacteriologic, micologic, imunologic), structur pe care urmeaz s discutm, concret, diferite situaii n cadrul capitolelor care urmeaz. n cellalt volum, atunci cnd vom discuta recoltarea i transportul produselor, vom sintetiza pentru unele dintre aceste produse situaiile posibile n momentul n care nu avem n fa un anumit gen sau o anumit specie ci produsul din care vom izola agentul etiologic, iniial presupus.

27. 2. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic are mai multe etape, i anume: 1. Recoltarea i transportul produsului patologic (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s i se fi administrat antibiotice sau chimioterapice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie, prelevnd un anumit produs patologic n funcie de manifestarea clinic n cazul respectiv, de exemplu urin n cazul unei infecii urinare, materii fecale n cazul dizenteriei, sput n cazul tuberculozei sau aspergilozei, scuame n cazul unei micoze cutanate superficiale etc) (vezi anexa nr. 6). 2. Examinarea macroscopic i microscopic a produsului patologic reprezint de multe ori o etap esenial, care poate orienta paii urmtori. Pentru examenul microscopic se vor realiza minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) / Giemsa i respectiv Gram. Este preferabil s avem ntotdeauna cel puin nc un frotiu (de rezerv), n special n cazul n care produsul patologic este preios (LCR, produs recoltat prin puncie308

biopsie etc). n cazul suspicionrii unei infecii mycobacteriene este necesar realizarea unui al treilea frotiu, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examineaz la microscopul optic, iniial cu obiectivul 40 pentru o analiz mai general, pentru stabilirea cmpului microscopic sau a zonei de interes, apoi cu obiectivul de imersie. Se noteaz prezena diferitelor celule (eventual modificate fa de normal, burate de microorganisme), prezena celulelor inflamatorii (dovada reactivitii organismului, ex. leucocite, surprinznd eventual fenomenul de fagocitoz), precum i eventuala prezen a microorganismelor (bacterii, levuri, pseudofilamente, micelii), care va fi interpretat cu precauie, n contextul dat. Chiar dac examenul microscopic este de cele mai multe ori un examen orientativ, trebuie realizat de fiecare dat, cu rigurozitate, n anumite situaii putnd fi foarte important i foarte util. Atunci cnd produsul recoltat este reprezentat de snge, urin sau materii fecale, de regul nu se realizeaz frotiuri fixate i colorate. Spre exemplu, n cazul materiilor fecale, se va face o coprocitogram, un preparat proaspt (nativ) ntre lam i lamel, cutndu-se n special prezena leucocitelor (dar i a unor structuri care pot da anumite informaii cu privire la funcionalitatea tractului digestiv). n cazul suspicionrii unei infecii urinare, se va realiza un sediment urinar (dup centrifugarea urinei), care se va examina ntre lam i lamel n vederea aprecierii numrului de leucocite pe cmp microscopic, n cazul n care acestea exist, n vederea aprecierii prezenei unor cilindri leucocitari precum i a altor celule normale sau patologice, a prezenei unor elemente fungice etc., date care pot fi deosebit de utile n vederea unui diagnostic corect i util pentru pacient. n cazul suspicionrii unei infecii micotice sunt utile att preparatele proaspete (ex. preparatul montat n soluie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraii negative (tu de India, nigrozin), precum i frotiurile colorate May-Grnwald-Giemsa sau Gram. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se va face n funcie de situaie (mediile i condiiile de incubare se vor alege n funcie de presupusul microorganism pe care trebuie s-l izolm; spre ex. n cazul n care infecia este produs de microorganisme strict anaerobe, n lipsa condiiilor anaerobe de cultivare este imposibil izolarea agentului etiologic). Pentru fungi trebuie utilizate mediile potrivite i o temperatur mai mic dect cea utilizat n cazul bacteriilor. Cultivarea se va realiza n aa fel nct s se poat obine colonii izolate (tehnica nsmnrii n poligon) i respectiv o cultur pur, care se va identifica. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: a) Caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolat, frotiu care se va fixa i colora Gram sau Ziehl-Neelsen, dup caz, i se va examina microscopic. Prin examinarea frotiurilor se vor evidenia numai microorganisme cu form i tinctorialitate similar (n cazul germenilor cu polimorfism important, ex. Proteus spp., pe frotiu vom observa aspecte morfologice diferite (8), de la aspecte cocobacilare pn la forme filamentoase). n cazul levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai mari. b) Caractere de cultur: se vor examina coloniile izolate aprute pe mediile de cultur solide i care pot fi de tip S pentru majoritatea germenilor studiai inclusiv pentru levuri, de tip R n cazul Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis i Bacillus anthracis, de tip M n cazul bacteriilor capsulate, de exemplu Klebsiella pneumoniae i respectiv un aspect pufos n cazul mucegaiurilor(detalii privind aspectele coloniilor microbiene sunt prezentate n capitolele dedicate fiecrui gen n parte). c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie microbian la alta i pot fi foarte utile spre exemplu n cazul diferenierii enterobacteriilor (introducerea n practic a mediilor multi-test permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, sistemele API etc). n cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma. d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazndu-ne pe structura i antigenicitatea microorganismelor i pe specificitatea reaciilor antigen-anticorp. Vom utiliza 309

anticorpi cunoscui pentru a identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin reacii de aglutinare direct, pe lam, se pot identifica antigenele i respectiv speciile i tulpinile din genul Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacii de aglutinare indirect se pot utiliza pentru detectarea n p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru detectarea unor enterotoxine, pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) etc. e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora anumite substane cu rol n patogenitate (ex. coagulaza produs de Staphylococcus aureus) sau infecia experimental a unui animal de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un pacient cu pneumonie dup inocularea sputei la oarecele alb; n cazul n care n sput exist pneumococi, animalul va muri n 24-48 de ore, iar din sngele lui se va izola o cultur pur de Streptococcus pneumoniae). f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie); g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode moderne) (vezi anexa nr. 7). 5. Antibiograma i respectiv antifungigrama (testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice antibacteriene i antifungice, n vederea stabilirii tratamentului) se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave, antibiograma difuzimetric trebuie s fie completat de determinarea concentraiei minime inhibitorii (CMI) i respectiv bactericide (CMB). n infecii grave, cu potenial fatal, poate fi necesar determinarea nivelului de eficien pentru antibioticul utilizat, respectiv stabilirea nivelul de eficien inhibitorie (NEI) i nivelului de eficien bactericid (NEB) (vezi i capitolul 7).

27. 2. 2. Diagnosticul de laborator imunologic poate fi serologic i / sau imunobiologic. 27. 2. 2. 1. n cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezena (sau se va dovedi absena) anticorpilor, n serul pacientului investigat, utiliznd antigene cunoscute. n diagnosticul serologic ne bazm pe specificitatea reaciilor antigen-anticorp i utiliznd diferite tehnici trebuie s putem rspunde la minim trei ntrebri eseniale, i anume: - exist anticorpi n serul pacientului investigat? - care este titrul anticorpilor? - cum evolueaz n dinamic (n timp) acest titru; n acest sens se vor realiza minim dou determinri diferite la un interval de 7-10 zile; aceast analiz ne va permite s difereniem situaia unei afeciuni acute (titrul anticorpilor este mai crescut la a doua determinare, n mod clasic de 4 ori), de situaia n care pacientul este deja n convalescen (titrul anticorpilor la a doua determinare va fi mai sczut) sau de situaia unui pacient cu o afeciune cronic (titrul anticorpilor va fi asemntor sau foarte apropiat la cele dou determinri succesive). n vederea identificrii unei infecii acute, o variant posibil n majoritatea situaiilor este determinarea anticorpilor specifici de tip IgM. 27. 2. 2. 2. n cadrul diagnosticului de laborator imunobiologic se va studia, de exemplu, reactivitatea pacientului fa de un anumit antigen inoculat. Intradermoreacia la tuberculin (PPD, preparat proteic purificat) (9) sau la candidin (10) reprezint exemple clasice, n acest sens. Tehnica intradermoreaciei este folosit n mai multe scopuri i trebuie s avem n vedere c n funcie de scopul urmrit i respectiv n funcie de antigenul inoculat (i de mecanismul implicat), modul de citire al rezultatelor va fi diferit (vezi anexa nr. 3). Considerm c pentru orice medic, indiferent de specialitate, multe dintre principiile microbiologiei sunt foarte utile, merit s fie nelese i aplicate corespunztor. Pentru cei care se dedic microbiologiei sau bolilor infecioase, aceste noiuni reprezint o baz 310

obligatorie, care poate fi completat utiliznd pe de o parte diferitele tratate medicale n domeniu dar i experiena personal dezvoltat att din punct de vedere teoretic ct i practic.

27. 3. Direcii de cercetare Importana real a promptitudinii i a corectitudinii diagnosticului microbiologic este confirmat prin cercetri extensive n domeniu. Astfel, evaluarea performanei actualelor metode de diagnostic i elaborarea de noi tehnici de laborator constituie prioriti n cadrul cercetrii n domeniul microbiologiei i al bolilor infecioase. Supravegherea epidemiologic, un proces de o importan colosal, depinde direct de efectuarea unui diagnostic microbiologic prompt i corect. n acest domeniu, bacteriofagii sunt din ce n ce mai utilizai n laboratoarele epidemiologice de referin, servind la aa-numitul tipaj fagic (11). Un mecanism central al patogenezei endocarditei infecioase este considerat a fi reprezentat de legarea bacteriilor la trombocite. De exemplu, o variant mutant (SF100) de Streptococcus mitis ader la trombocite prin intermediul unei lizine codificate de SM1, un bacteriofag lizogenic. Aceast lizin este o protein multifuncional ce aparine unei clase recent descoperite de proteine ce leag fibrinogenul (12). Precocitatea diagnosticului este unul dintre factorii de care depinde prognosticul unei boli. Astfel, un domeniu prioritar pentru cercetarea medical este reprezentat de punerea la punct a unor noi teste diagnostice, care s poat fi utilizate ct mai precoce dup momentul ptrunderii agentului patogen la nivelul organismului uman.De exemplu, un deziderat ar fi realizarea unui test urinar pentru identificarea antigenelor specifice bolii Lyme (cauzate de Borrelia burgdorferi). Pn de curnd, acest lucru nu a fost posibil din cauza concentraiilor mici ale antigenelor la nivel urinar, sub limita de detecie a testelor clasice. Recent, Douglas i colaboratorii au demarat un studiu asupra rolului unui nou biomaterial (microparticule de tip hidrogel: N-izopropilacrilamida-acid acrilic) n capturarea i implicit concentrarea biomarkerului urinar pentru Borrelia burgdorferi. Rezultatele preliminare au artat c aceste microparticule au capacitatea de a concentra de 100 de ori biomarkerul de la nivel urinar, crescnd sensibilitatea testelor antigenice urinare (13).

27. 4. Povestiri adevrate 27. 4. 1. Despre diagnostic i tratament n infeciile urinare Problema luat n discuie este a unei colege mai tinere, student ntr-un an mare la medicin, dar de fapt, ca i urmtoarea, poate fi considerat o problem care poate fi a unui sistem i nu a unui caz particular. n urm cu mai mult de un an, colega noastr primete diagnosticul de litiaz renal i recomandarea de eliminare a calculilor prin litotripsie [manevr care const n mrunirea calculilor urinari, fragmentele fiind apoi eliminate n mod natural prin urin; accesul la calculi se face pe cale endoscopic i sub control endoscopic; pulverizarea calculilor poate s fie realizat cu ajutorul unei pense (litotripsie mecanic), cu ajutorul ultrasunetelor (litotripsie ultrasonic), prin unde de oc repetate (litotripsie electrohidraulic) sau cu ajutorul unei fibre laser (litrotripsie cu laser)]. Manevra este executat, cu succes (conform protocolului operator). Dup 5 luni, n anul urmtor, semnele clinice i analizele de laborator (n special urocultura 311

nsoit de testarea sensibilitii la antibiotice) permit punerea diagnosticului de infecie urinar (ITU) cu Escherichia coli. Viitorul medic primete norfloxacin, timp de 10 zile. Pentru c la 3 sptmni de la primul diagnostic simptomatologia persist, primete un nou tratament, de aceast dat cu amoxicilin + acid clavulanic. La ncheierea celui de al doilea tratament, simptomatologia persist i colega ni se adreseaz solicitnd un sfat, menionnd i c medicul urolog i-a recomandat s nceap un tratament cu cefuroxim (cefalosporin de generaia a II-a) i Uro-vaxom, timp de 20 de zile, apoi s refac analizele. Tulpina de E. coli identificat la ultimul examen bacteriologic prezenta sensibilitate la: acid nalidixic, ceftazidim, cefuroxim, cotrimoxazol, fosfomicin, gentamicin, rezisten la: amoxicilin i la amoxicilin + acid clavulanic i era intermediar la norfloxacin (cu alte cuvinte, putem remarca evoluia sub tratament a tulpinii, iniial sensibil la norfloxacin i amoxicilin + acid clavulanic, rezisten ctigat n trepte). La recomandarea noastr, colega se prezint din nou la un control ecografic, conform cruia se pun n eviden elemente litiazice. Este cunoscut faptul c litiaza renal reprezint unul dintre factorii de risc pentru apariia i persistena ITU. Opinia noastr a fost ca, n acest caz, analizele de laborator s se realizeze n INCDMI Cantacuzino i pentru c era nc vacan iar reedina nu era n capital, colega noastr a respectat recomandarea n a doua jumtate a lunii septembrie. Din discuiile pe cale electronic am aflat c medicul urolog a afirmat c este vorba de o boal de tub renal i c n aceste condiii trebuie s evite ITU, care pot fi factor de agravare. Colega noastr era deja ngrijorat datorit rezistenei la tratament a infeciei cu E. coli. Dup administrarea de Uro-vaxom, urocultura realizat la Bucureti n luna septembrie a fost steril, situaie conform cu statusul clinic (lipsa semnelor sau simptomelor). Totui, dup circa 2-3 sptmni, semnele i simptomele revin i colega ni se adreseaz din nou, pentru un sfat, menionnd i rezultatele obinute la testarea sensibilitii la antibiotice pentru tulpina de E. coli (menionate mai sus) i cernd s i recomandm unul dintre antibioticele din list pentru a ncepe un nou tratament. Aa cum nici diagnosticul i prescrierea tratamentului la telefon nu reprezint un bun exemplu n medicin, nici utilizarea cii electronice nu poate s substituie examenul clinic i analizele de laborator. Avnd n minte aceste recomandri pe care le-am nvat, la rndul nostru, n vremea studeniei sau n timpul rezideniatului, singurul sfat pe care l-am putut exprima a fost: refacerea analizei de laborator, tot la INCDMI Cantacuzino. Sfatul a fost urmat iar diagnosticul a fost ITU cu Klebsiella pneumoniae, ceea ce a contrariat-o pe colega noastr (totui, rezultatul nu a fost surprinztor). Pentru c toat aceast discuie se purta, din nou, pe cale electronic (colega noastr se ntorsese n localitatea de reedin) i pentru c nu tiam unde fusese realizat ultimul examen de laborator, n primul rnd am solicitat aceast informaie. Aflnd att laboratorul ct i medicul care a pus diagnosticul, aceasta a reprezentat pentru noi o certitudine c ultimul diagnostic este i el corect i, n context, existau dou posibiliti de prim intenie:

infecie cu un alt germen din flora proprie, n condiiile litiazei renale; infecie dubl, att la nivel urinar ct i n alt sediu, care trebuie tratat simultan, urmnd ca situaia litiazei renale s fie rezolvat ulterior.

Recomandarea a fost de realizare a unui nou examen bacteriologic. Apelnd la unul dintre cei mai experimentai colegi, unul dintre puinii i adevraii profesori din catedra de microbiologie, n final a fost dovedit o dubl infecie, ITU i la nivel genital, cu Klebsiella pneumoniae. Tratamentul infeciei la nivelul ambelor sedii a dus la vindecarea infeciei, dispariia semnelor i simptomelor i primirea mulumirilor de rigoare, prin email. 27. 4. 2. Cu privire la lipsa diagnosticului microbiologic i urmrile acestei lipse Un alt coleg mai tnr, de aceast dat n primii ani de studiu, a relatat dup momentul n care 312

am discutat i rezolvat o situaie particular, medical, c n vremea copilriei a primit de foarte multe ori antibiotice, de regul n cadrul unei auto-medicaii stabilit n familie. Cele mai frecvente probleme, ca i la muli ali copii (dac nu chiar la toi) erau legate de nasgt-urechi (ORL), iar medicamentele antimicrobiene primite s-au repetat anual i de mai multe ori pe an pn spre vrsta de 13-14 ani. Se pare c un moment important a fost legat de o infecie de acelai tip, cu manifestri ceva mai serioase, care au determinat familia s se prezinte mpreun cu tnrul nostru la medicul de familie; acesta, analiznd auto-medicaia propus a concluzionat c respectivul medicament n cantitatea propus reprezenta un risc pentru pacient i n acest context, pacientul a neles c nu trebuie s mai accepte medicaia ca atare (chiar dac era minor, la acea dat). Totui, colegul nostru a concluzionat: oricum a fost suficient de mult timp s iau pastile aiurea. ns, toate aceste probleme s-au artat a fi minore, fa de ceea ce a urmat. ntr-o toamn, la nceput de liceu, ntr-o vineri (majoritatea problemelor importante/grave se pot petrece vinerea, n week-end, noaptea, la sfrit de program etc), tnrul coleg a revenit acas cu dureri foarte mari n zona articulaiei coxo-femurale, dup o lovitur aparent minor, n cursul unui meci de fotbal. Una dintre erori a fost, probabil, faptul c prima reacie acas a fost o baie fierbinte (dar realmente fierbinte). Dup 36-48 de ore durerile s-au intensificat foarte mult i copilul (avea totui numai 15 ani) nu s-a mai putut deplasa fr ajutorul unuia dintre prini sau a unui cadru metalic. Au nceput peripluri prin uniti sanitare, iniial la un spital cu profil de urgene copii, ulterior la un spital de urgen pentru aduli, la o secie de ortopedie (imaginile radiologice nu sugerau nimic, se pare). La cel de al doilea spital s-au administrat medicamente calmante, s-au efectuat noi radiografii plus recomandarea de a reveni luni, pentru noi analize. n timpul weekend-ului durerile s-au intensificat i a fost nregistrat febra (peste 38,5C); copilul nu mai putea pune pe pmnt membrul inferior drept. La recomandarea unor cunotine, familia s-a ndreptat iniial ctre cel de al treilea spital (cu profil de copii). La acest spital, n tot cursul dimineii respective, nimeni nu a gsit timpul necesar pentru a l consulta pe copil care menioneaz, din amintiri: nimeni nu s-a uitat la mine, eu m ineam de perei i mama alerga..., motiv pentru care au plecat de la al treilea spital i s-au ndreptat spre cel de al doilea, cel cu profil de aduli. Analizele efectuate au fost remarcabile prin intensitatea inflamaiei (tradus prin valorile nalte ale reactanilor de faz acut) i sugerarea unei infecii. Medicul a luat legtura cu un coleg de la un al patrulea spital (cu profil de copii), suspicionnd, se pare, un proces tumoral localizat osteo-articular. Din amintirile de copil am putea remarca ntre timp trecuser cam 5 zile, poate chiar o sptmn, urlam de durere cnd ncercam s merg, abia mai puteam s m dau jos din pat i daca eram ajutat urlam de durere pentru c nu mai suportam s fiu atins; devenise un chin s merg la baie pentru c oricum dura mult i acolo nu prea mai puteam s stau ... mi s -au fcut analize, radiografii; analizele indicau o infecie care cretea" n comparaie cu analizele trecute ... radiografiile nu spuneau nimic. Medicii, dup un timp, au indicat tratament cu oxacilin, 12g/zi, iar ntre diagnosticele difereniale luate n discuie s-au aflat: cancer osos (cel mai frecvent discutat), tuberculoz osoas, reumatism i ... n cel mai bun caz, o infecie (copilul, actualul nostru coleg, i amintete c dup mult timp a aflat de la prini c a existat i suspiciunea de cancer, dar prinii au tiut acest lucru de la nceput; i i mai amintete i alte aspecte, pe care nu le putem discuta n materialul de fa). Dup circa 1 sptmn de la internare, pacientul se deplasa cu mare greutate, circa 15 metri n 30 de minute, ca s ajung la baie (noroc cu nite biei care stteau cu mine n salon i m ajutau). A primit n continuare oxacilin 12 g/zi, a fost examinat repetat, radiologic (se pare c s-au executat 20-25 de radiografii de bazin de la nceput i pn n timpul acestei internri), semnele de laborator (reactanii de faz acut) au nceput s stagneze sau s evolueze pozitiv; durerile au continuat, la fel i impotena funcional. La sfaturile unor prieteni, prinii au decis s transfere pacientul n al cincilea spital, cu profil de 313

aduli, transfer care nu a fost realizat cu foarte mult uurin, dar se pare c acest ultim transfer a fost salutar. Actualul nostru coleg poart i astzi un deosebit respect celor care s -au ocupat de el n clinica de ortopedie a spitalului, att efului de clinic dar i unui coleg, care la acea vreme era mai tnr i pe care avem plcerea s l cunoatem i noi. Datorit suspiciunii de cancer osos, au urmat alte analize, o tomografie computerizat i o scintigrafie osoas (din fericire infirmnd respectiva suspiciune); tratamentul anti-infecios a fost continuat iniial cu oxacilin 2g/zi n asociere cu gentamicin 2mg/kg/corp (de 2 ori pe zi) timp de 2 sptmni, urmat de tratament cu oxacilin 2g/zi. Tnrul nostru coleg i mai amintete c, nainte de transferul la al cincilea spital tratamentul a fost administrat intra-venos cnd am plecat de la ... deja artam ca un drogat; aveam pe mini foarte multe vene sparte, cheaguri pe branule ... iar n momentul n care a auzit pentru prima dat c a existat suspiciunea de cancer osos a slbit circa 4 kg n 2 zile. n final, pacientul a fost externat, vindecat, dup o lung perioad de suferin. Din discuia cu tnrul nostru coleg i din amintirile acestuia, nu am remarcat vreo ncercare de diagnostic microbiologic, vreo recoltare de produs patologic care s fie transmis spre analiz (nainte de administrarea antibioticelor sau chimioterapicelor), vreo recoltare de snge pentru hemoculturi. Nu putem meniona toate impresiile pe care copilul, pacientul, tnrul coleg le-a acumulat pe parcursul acestei experiene de via. Totui, amintim o dorin exprimat de acesta de fiecare dat cnd trebuie s merg la spital, m rog s dau de un OM. 27. 4. 3. Despre unele teoreme din timpul facultii sau rezideniatului Foarte mult timp, la cursuri n timpul studeniei sau n timpul rezideniatului am fost nvai c IDR cu PPD (vezi i anexa nr. 3) nu are nici o valoare, n Romnia, pentru c toi copiii sunt vaccinai la natere, pentru c tuberculoza este endemic etc.; n aceste condiii toi cetenii romni au IDR pozitiv i o nou testare nu va aduce nicio informaie util. Am suspicionat de mult timp c aceast teorem nu are acoperire real. n ultimii patru ani, prin colaborare cu o serie de studeni entuziati (sigur, studiile trebuie continuate i este necesar realizarea unor observaii pe un lot semnificativ statistic), am nceput infirmarea acestor supoziii, transmise, din pcate, multor generaii de studeni, rezideni etc. Din cei peste 60 de studeni care au dorit s participe la studiu, n 40,9% dintre cazuri valoarea citirii la 48 i 72 de ore a fost 0 (zero) milimetri n timp ce n 19,7% valoarea induraiei a fost de peste 10 i pn la 22 milimetri. ntr-un caz, consultul cu medicul de specialitate pneumo-ftiziolog a dus la recomandarea administrrii de hidrazid a acidului izonicotinic, pentru prevenirea unei tuberculoze manifeste, ceea ce probabil a fost salutar pentru respectivul, mai tnr, coleg.

27. 5. Verificai-v cunotinele La urmtoarele ntrebri se pot alege unul sau mai multe rspunsuri corecte (dup caz): 1. Care dintre urmtoarele afirmaii sunt corecte: A. anamneza este cea mai important component a demersului diagnostic B. anamneza, examenul clinic obiectiv i investigaiile paraclinice compun trepiedul diagnostic C. anamneza poate orienta examenul clinic obiectiv D. examenul clinic obiectiv poate suplini anamneza n cazul pacienilor contieni i cooperani E. testele paraclinice se rezum la tehnici de investigaie imagistic 2. Urmtoarele afirmaii sunt false, CU EXCEPIA: A. n bolile infecioase, diagnosticul etiologic este doar un deziderat, necontribuind semnificativ 314

la demersul terapeutic B. antibiograma nu mai este de actualitate n demersul diagnostic i terapeutic n bolile infecioase, cazurile de rezisten la antibiotice i chimoterapice fiind din ce n ce mai rare C.recoltarea produselor patologice trebuie efectuat nainte de administrarea tratamentului antimicrobian D. saliva poate nlocui cu succes sputa ca i produs patologic recoltat n infeciile respiratorii inferioare E.n cadrul examenelor de laborator, diagnosticul microbiologic are doar semnificaie istoric 3. n interpretarea curbei termice, este important s evalum urmtoarele aspecte: A.periodicitatea episoadelor febrile B.relaia dintre puls i temperatur C.administrarea de antibiotice i/sau antipiretice D.pattern-ul de remisie a episoadelor febrile E.frecvena i durata episoadelor febrile 4. n recoltarea produselor patologice trebuie inut cont de urmtoarele elemente: A.recoltarea pentru hemoculturi se face n timpul unui episod febril B.se solicit examinarea produselor transmise ctre laborator n termen de 7-10 zile de la recoltare C. este important alegerea momentului ideal pentru recoltare D.diagnosticul microbiologic ocup un loc prioritar n cadrul examenelor de laborator E. n cursul recoltrii, evitarea contaminrii cu ali germeni are doar caracter de recomandare, nefiind criteriu indispensabil 5. Urmtoarele afirmaii legate de examinarea microscopic a produsului patologic sunt adevrate, CU EXCEPIA: A. se vor realiza minim dou frotiuri din produsul patologic, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) / Giemsa i respectiv Gram B. n cazul suspicionrii unei infecii urinare, sedimentul urinar se va examina ntre lam i lamel C. prezena celulelor inflamatorii este un element frecvent decelat i ca atare poate fi trecut cu vederea D. n cazul suspicionrii unei infecii mycobacteriene este necesar realizarea unui frotiu colorat Ziehl-Neelsen E.atunci cnd produsul recoltat este reprezentat de snge, urin sau materii fecale, de regul nu se realizeaz frotiuri fixate i colorate

27. 6. Bibliografie 1. Wong CS, Ang LW, James L, Goh KT, 2010, Epidemiological characteristics of cholera in Singapore, 1992-2007. Ann Acad Med Singapore, 39(7):507-6 2. Thirion L, Nikkels AF, Pirard GE, Etoricoxib-Induced Erythema-Multiforme-Like Eruption, 2008, Dermatology 216:227-228 (doi: 10.1159/000112930) 3. Gandhi TN, DePestel DD, Collins CD, Nagel J, Washer LL, 2010, Managing antimicrobial resistance in intensive care units. Crit Care Med., 38(8 Suppl):S315-23 4. Burke A. Cunha MD, The clinical significance of fever patterns, 1996, Infectious Disease Clinics of North America - Volume 10, Issue 1

315

28. Prezentare general a principalelor microorganisme studiate; necesitatea studierii microbiologiei (MI Popa)
Lumea microbian este alctuit dintr-un mare numr de ordine, familii, genuri, specii, subspecii, tipuri, subtipuri i tulpini microbiene a cror prezentare face subiectul unor importante tratate n domeniu. n lucrarea de fa vor fi incluse informaiile considerate eseniale i care sunt organizate utiliznd un stil, pe care l considerm folositor. O prezentare exhaustiv, a tuturor amnuntelor, ar putea conduce la neglijarea aspectelor care chiar nu trebuie s fie uitate, indiferent de specialitatea n care ne desfurm activitatea. Considerm c materialul redactat este util nu numai n scopul pregtirii unui examen (care nu ar trebui n nici un caz s fie considerat un scop n sine) ci este (ar trebui s fie) util reinerii unor noiuni i principii microbiologice care pot permite ulterior (indiferent de specialitatea aleas) o abordare corect, tiinific a procesului infecios. Microbiologia medical reprezint o specialitate care poate asigura (n condiiile n care colaborarea ntre clinic i laborator funcioneaz) date foarte precise, oferind suportul stabilirii unor atitudini, uneori decisive pentru evoluia ulterioar a pacientului. n acest sens se pot da numeroase exemple, dar ne vom opri asupra a trei dintre acestea. n cazul n care un pacient se prezint la medic i afirm c are o infecie urinar, medicul va putea, prin efectuarea n mod corect a anamnezei (ex. discuia cu pacientul respectiv) i a examenului clinic, s realizeze un prim pas ctre diagnostic i stabilirea tratamenului. ns certitudinea diagnosticului i stabilirea tratamentului corect vor rezulta numai prin examenul de laborator. ntr-o suspiciune de infecie urinar, urocultura cantitativ trebuie precedat de examenul microscopic al sedimentului urinar care necesit o dotare minim (eprubete, centrifug fr pretenii, lame, lamele, microscop optic nesofisticat i mai ales, dorina medicului de a face ct mai mult i ct mai bine pentru pacienii si). Urina recoltat corect (adic aa cum se cunoate nc din facultate) trebuie examinat macroscopic, centrifugat iar sedimentul urinar trebuie examinat microscopic. n circa 20 de minute (sau mai puin) se va putea observa eventuala prezen a leucocitelor n sediment, amnunt care va permite (n contextul clinic respectiv) aprecierea corespunztoare a situaiei i adoptarea atitudinii celei mai potrivite. Utilizarea corect a datelor de laborator va permite nu numai o diminuare a risipei de medii de cultur i reactivi (nu n ultimul rnd a timpului celui / celor care proceseaz probele) ci i o posibil direcionare spre un alt diagnostic dect cel al unei eventuale infecii urinare, interpretat n mod mecanic sau la indicaia / solicitarea pacientului. Un studiu pe care nu l-am publicat a artat c ntr-unul dintre spitalele din Bucureti, din peste 10.000 de uroculturi efectuate, s -au pozitivat mai puin de 20%; examinarea sedimentului urinar ar fi putut contribui la selectarea situaiilor n care urocultura merita s fie fcut. n cazul prezenei unor dureri de cap intense (cefalee), a apariiei fotofobiei, vrsturilor fr efort, poziiei caracteristice (antalgice) se ridic ipoteza unei meningite a crei etiologii nu se poate preciza fr diagnosticul de laborator. Acest diagnostic va permite diferenierea unor meningite n funcie de cauz [exist meningite neinfecioase i meningite infecioase (virale, bacteriene, parazitare sau fungice), iar examenul biochimic la LCR mpreun cu diagnosticul de laborator microbiologic vor putea arta care este etiologia]. Acest lucru este de maxim importan att pentru evoluia ulterioar, ct i pentru prognosticul pacientului implicat deoarece este bine cunoscut faptul c n cazul meningitei exist i posibilitatea unei evoluii nefavorabile, cu persistena unor sechele sau chiar apariia decesului. n cazul unei meningite (inclusiv a unei meningite meningococice), recoltarea i transportul lichidului cefalo-rahidian 316

este esenial. Este de preferat ca medicul s tie care sunt manevrele necesare pentru a procesa produsul patologic "la patul bolnavului". Realizarea i examinarea corect a frotiurilor va permite nu numai ca n maxim 20 minute s se pun diagnosticul de meningit meningococic (prezena leucocitelor i a cocilor Gram-negativi intra i extra-leucocitari) dar i s se instituie tratamentul (de ex. cu penicilin). n cazul n care pacientul prezint febr, tuse i expectoraie nu este recomandat administrarea unor antibiotice doar pe baza existenei acestor semne. Administrarea unui antibiotic cu spectru larg (ex. tetraciclin) ar putea crea probleme suplimentare. Dac dorim s procedm corect, dup anamnez trebuie s urmeze examenul clinic complet, revenind cu minuiozitate asupra examinrii semnelor i simptomelor n relaie cu aparatul respirator. Dintre examenele paraclinice se realizeaz de obicei radiografia cardio-toraco-pulmonar. Alte examene de laborator (aa cum am menionat n capitolul precedent) sunt necesare i trebuie efectuate. Din punct de vedere microbiologic, recoltarea corect i transportul sputei reprezint elementul esenial. n laborator sputa va fi prelucrat, vom realiza cel puin trei frotiuri pe care le fixm i colorm cu AM / Giemsa, Gram i Ziehl-Neelsen. Din momentul recoltrii produsului patologic i pn la obinerea primelor informaii prin examinarea frotiurilor, pot trece nu mai mult de 20-30 minute. n cazul n care nu parcurgem aceste etape i de ex. administrm direct tetraciclin, evoluia pacientului ar putea fi nefavorabil, chiar i ctre deces, iar frotiurile realizate i examinate post-mortem (pe produse recoltate anatomo-patologic) ar putea demonstra prezena de hife i levuri, semnificnd o infecie fungic. Continund cu etapa de identificare am putea stabili, de ex., c a fost vorba de o pneumonie provocat de Candida albicans. Decesul a fost precipitat de utilizarea iraional a tetraciclinei, medicament care distrugnd flora de asociaie a permis multiplicarea n voie a fungului respectiv. Dac am fi examinat sputa recoltat de la bolnav am fi putut detecta prezena elementelor fungice i am fi ales medicaia corespunztoare. Bacteriile studiate pot fi grupate dup mai multe criterii, dar o variant util este cea n care avem n vedere structura peretelui bacterian i respectiv afinitatea acestuia fa de diferii colorani. Un prim grup important este cel care include cocii cu importan medical, Gram-pozitivi (stafilococi, streptococi, pneumococi etc) i respectiv Gram-negativi (meningococi, gonococi etc). ntre bacteriile Gram-negative care au dimensiuni pe baza crora nu pot fi ncadrate drept coci sau bacili se afl parvobacteriile, cocobacilii Gram-negativi (H. influenzae, B. pertussis, Brucella spp. etc). Bacilii Gram-pozitivi care vor fi inclui n prezentrile din acest manual se pot grupa n bacili nesporulai (Corynebacterium diphteriae, Listeria spp.) i respectiv bacili Gram-pozitivi sporulai (Bacillus anthracis, Clostridium spp.). Totui, nu trebuie s uitm c exist i ali bacili Grampozitivi. Bacilii Gram-negativi studiai fie aparin familiei foarte numeroase a enterobacteriilor (E. coli, Salmonella spp., Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Yersinia spp . etc), fie sunt inclui n genuri separate precum V. cholerae din genul Vibrio sau Ps. aeruginosa din genul Pseudomonas. Microorganismele din genul Mycobacterium se pot colora (cu destul de mare dificultate; uneori nu se coloreaz i apar sub aspectul unor zone necolorate, fantome bacteriene) prin metoda Gram, dar n mod caracteristic se coloreaz prin metoda Ziehl-Neelsen. O adaptare a tehnicii Ziehl-Neelsen este medoda de colorare Kinyoun. Specia principal studiat este M. tuberculosis. Exist i alte specii de mycobacterii dar i bacterii aparinnd altor specii i genuri, care se pot colora prin aceste tehnici. O serie de bacterii spiralate (Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp.) nu se coloreaz prin metoda Gram datorit structurii particulare a peretelui. Pot fi studiate microscopic fie n 317

preparate proaspete (utiliznd tehnici microscopice speciale) fie utiliznd coloraii particulare (ex. impregnarea argentic). Pn n urm cu o perioad de timp microorganismele aparinnd genurilor Rickettsia, Chlamydia i Mycoplasma erau incluse n categoria virusurilor. Totui, proprietile lor fundamentale fac s le studiem astzi ntre bacterii. n obiectul de studiu sunt ncadrai i fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici aparte. Noiunile legate de micologie sunt reluate n cadrul dermatologiei iar diagnosticul micologic este prezentat mai pe larg n diferite tratate de specialitate. Pentru fiecare microorganism studiat am abordat aspecte legate de ncadrarea ntr-un anumit gen, caracterele generale mai importante (habitat, caractere morfo-tinctoriale, caractere de cultur, caractere biochimice, rezistena fa de factori fizici i chimici, structura antigenic i rspunsul imun realizat n organismul gazd, precum i caracterele de patogenitate). Legat de caracterele distinctive ale microorganismului studiat am prezentat, n general foarte succint, date cu privire la patogenia principalei afeciuni clinice produse (cu enumerarea mai multor entiti clinice, de la caz la caz). Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganismele avute n vedere este axat pe datele microbiologice (diagnostic bacteriologic i respectiv diagnostic imunologic) urmnd schema care a fost deja prezentat. Utilizarea n mod repetat a unei scheme clare permite o mai bun fixare a cunotinelor precum i atingerea obiectivului stabilit: reinerea unor principii de ctre mai tinerii colegi, indiferent de specialitatea care va fi aleas ulterior, sau de ctre medici. Microbiologia este, dup opinia noastr, o tiin cu foarte mare aplicabilitate practic. Elementele de baz ale microbiologiei sunt necesare i utile pentru toi partenerii implicai n sistemul sanitar. Cunoaterea acestor elemente de baz ar putea preveni o serie de anomalii i erori care uneori pot avea consecine dezastruoase (aa cum s-a ntmplat de ex. ntr-o maternitate n care o serie de nou-nscui au decedat datorit unor infecii nosocomiale contractate dup natere, n anul 2004). n final vom oferi, pe scurt, unele noiuni legate de tratament, modalitile de transmitere i respectiv de prevenire a transmiterii germenului discutat. n privina datelor epidemiologice, pentru unele dintre microorganisme / boli vor fi prezentate date concrete (n cazul acelor maladii pentru care exist un sistem de supraveghere i datele sunt disponibile). Exemplele vor fi redactate comparativ, pentru sistemul de sntate american i cel romnesc. Motivaia alegerii datelor din USA este reprezentat de faptul c sistemul american de sntate public i supraveghere epidemiologic pentru sntatea public poate fi privit ca un model, iar aceste date sunt publicate n mod periodic, fiind puse la dispoziia autoritilor sanitare, unitilor sanitare, medicilor i oricrei persoane care dorete s obin aceste informaii (http://www.cdc.gov). Recomandm, de asemenea, consultarea site-ului http://ecdc.eu.int, site al Centrului European de Prevenire i Control al Bolilor Infecioase (communicable diseases), mai recent nfiinat, dar cu o evoluie rapid i pozitiv. n ceea ce privete tratamentul, este util s reinem c pentru majoritatea situaiilor este necesar izolarea microorganismului implicat, identificarea acestuia i testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice (de ex. utiliznd cel puin antibiograma difuzimetric).

318

29. Genul Staphylococcus (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Anca StreinuCercel, Oana Streinu-Cercel)

29. 1. Definiie. ncadrare Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulai, catalazpozitivi. Genul Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical (unele dintre aceste grupuri incluznd mai multe specii). S. aureus este i specia recunoscut cel mai de mult (Rosenbach, 1884), n timp ce una dintre speciile recunoscute mai recent, S. succinus, se estimeaz c ar avea o existen de mai multe milioane de ani. Numrul speciilor din acest gen a ajuns la 35, ns numrul este i mai mare dac lum n consideraie i subspeciile (de ex. S. aureus subspecia aureus i S. aureus subspecia anaerobius). Cele mai cunoscute specii sunt reprezentate de: - S. aureus; - S. epidermidis (produce un pigment alb); - S. saprophyticus (produce un pigment citrin). S. aureus reprezint specia cel mai frecvent implicat n clinic, n timp ce celelalte dou specii sunt de obicei nepatogene. n funcie de capacitatea de a elabora coagulaz, toi stafilococii coagulazo-pozitivi sunt grupai ca S. aureus.

29. 2. Caractere generale

29. 2. 1. Habitat S. aureus se poate multiplica la nivelul tegumentelor i mucoaselor (n special n zonele piloase i la nivelul vestibulului nazal). Exist o serie de factori care determin i/sau influeneaz starea de purttor pentru S. aureus. O parte dintre aceti factori sunt legai de aprarea la nivel de gazd, o parte sunt corelai cu anumite proprieti ale bacteriei. Dintre acestea, menionm formarea de biofilm (caracteristic tulpinilor care se preteaz portajului nazal, dar nu i celor care nu determin stare de portaj) (1), care pare s faciliteze nu numai creterea supravieuirii bacteriilor n contextul tratamentului antibiotic, dar i evitarea mecanismelor de aprare specifice gazdei, care pot fi de tip peptide antimicrobiene precum: lizozimul, lactoferina, SLPI (secretory leukoprotease inhibitor), catelicidine, alfa i beta defensine (2), inclusiv beta defensina uman 3 (HBD-3), cea mai eficient dintre beta defensine n ceea privete rolul n infeciile cu S. aureus (3). Deoarece unele studii arat c circa 20% dintre persoanele sntoase sunt purttoare n mod permanent de S. aureus iar n circa alte 50-60% dintre cazuri este discutat situaia portajului temporar, s-a intuit c exist un anumit grad de influen genetic privind starea de purttor de S. aureus. ntr-un studiu transversal recent la care au participat n mod voluntar colegii tineri aflai n finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studeni au fost purttori de Staphylococcus aureus, nazal i/sau faringian. Un studiu similar, transversal, efectuat n 2010 n Brazilia, pe un lot comparabil de voluntari (incluznd studeni aflai n finalul 319

anilor 1 i 2 de facultate n domeniile: farmacie, medicin dentar i medicin general), a decelat un procent de portaj nazal de 40,8% (102/250), un CMI (50) la meticilin de 0,5 g/mL i un CMI (90) de 1 g/mL. Datele obinute de noi n Romnia sunt comparabile cu cele obinute n Brazilia, cu att mai mult cu ct exist similitudini i la nivelul loturilor de voluntari incluse n studiu. Stafilococii coaguloaz-negativi (SCN) formeaz microcolonii la nivelul foliculilor piloi (4) i la nivelul glandelor sebacee. Habitatul principal pentru S. epidermidis este reprezentat de vestibulul nazal. Deoarece au un tropism special pentru derm, stafilococii pot fi implicai n infecii la nivelul tegumentelor i anexelor pielii (infecii nsoite de puroi), dar pot fi implicai i n infecii localizate la nivelul oricrui alt esut sau organ.

29. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm. Pe frotiul realizat din cultura pe medii solide se poate remarca o dispoziie n grmezi neregulate. n frotiurile realizate din culturi pe medii lichide sau din produse patogene, se pot dispune n lanuri scurte, perechi sau coci izolai. n culturile cu o vechime mai mare de 2 zile, stafilococii pot aprea ca i Gramvariabil sau chiar i Gram-negativi la limit.

29. 2. 3. Caractere de cultur Se dezvolt n general pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Coloniile au aspect de tip S, au diametrul cuprins ntre 1-3 mm i sunt pigmentate n funcie de specia izolat. Pigmentarea devine mai pronunat dup meninerea plcii cu mediul de cultur nc 24-48 ore la temperatura camerei. Pe mediul geloz-snge, n jurul coloniilor poate aprea o zon de hemoliz clar (-hemoliz), dar S. aureus poate produce mai multe tipuri de hemolizine. Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolernd o concentraie de 7-10% NaCl (exemplu mediul Chapman).

29. 2. 4. Caractere biochimice Stafilococii au un metabolism glucidic att respirator ct i fermentativ. Fermenteaz glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului coninnd manit este utilizat ca test de difereniere ntre S. aureus (manit-pozitiv) i SCN (manit-negativ). Stafilococii sunt catalaz-pozitivi.

29. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Stafilococii sunt relativ rezisteni fa de agenii din mediul extern. n culturi (bulion, geloz), rezist la temperatura frigiderului cteva luni; n puroi uscat pot supravieui 2-3 luni. 320

Sunt relativ rezisteni la anumite antiseptice i dezinfectante (de exemplu, rezist peste 30 minute la alcool 70i peste 10 minute n fenol 2%). Sunt distrui n 60 minute la o temperatur de 60C.

29. 2. 6. Structur antigenic 29. 2. 6. 1.Structuri antigenice legate de corpul celular a). Capsula este prezent la un numr mic de tulpini de S. aureus; este alctuit din acid glucozaminuronic. In vivo pare a fi mai frecvent dect s-ar crede (examinnd la microscop tulpinile cultivate). Tulpina ncapsulat prototip de S. aureus (tulpina Smith) d natere spontan la variante necapsulate. b). Polizaharidul A a fost identificat la S. aureus, n timp ce la S. epidermidis s-a pus n eviden un polizaharid B. Ambii sunt acizi teichoici. Astzi se cunoate structura ambilor acizi teichoici, precum i a gruprilor rspunztoare de specificitatea antigenic a fiecruia. c). Proteina A apare ca o component de suprafa la toate tulpinile de S. aureus (proteina Cowan). Are o greutate molecular de 42 kDa i poate induce apariia de anticorpi specifici (este imunogen). Este de menionat faptul c proteina A interacioneaz nespecific cu poriunea Fc a imunoglobulinelor de la practic toate speciile de mamifere. Ca urmare a interaciunii dintre proteina A i fragmentul Fc, apar o serie de efecte biologice precum: anafilaxie local i sistemic la animale, reacii urticariene la om, activarea complementului pe calea clasic i alternativ urmat de generarea de factori chemotactici, inhibarea activitii opsonizante a anticorpilor (prin competiie cu receptorii pentru Fc de pe fagocite), proliferarea limfocitelor B umane etc. Proteina de suprafa A este unul dintre factorii determinani ai virulenei i ai formrii de biofilm (5), iar un studiu recent (2) a sugerat i o asociere a statusului de purttor nazal de S. aureus cu un nivel crescut al expresiei acestei proteine. d). Majoritatea tulpinilor necapsulate de S. aureus aglutineaz atunci cnd sunt suspensionate n plasm sau n soluii de fibrinogen. Factorul rspunztor de aceast reacie este o coagulaz legat (clumping factor; factor de aglutinare/agregare) la nivelul suprafeei celulei bacteriene. Acest factor poate fi prezent i la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius. n cazul n care n testul coagulazei pe lam se folosete plasm uman, rezultatul poate fi pozitiv i pentru S. lugdunensis i S. schleiferi (subspecia schleiferi). e). Adezinele sunt proteine de suprafa specifice, prin care stafilococii se fixeaz pe proteinele matriciale de la suprafaa celulelor gazdei (ex. laminin, fibronectin, elastin, colagen, proteina A etc). Par a fi implicate n colonizarea matricei intercelulare, n invazia esuturilor i n rezistena la fagocitoz. 29. 2. 6. 2.Structuri antigenice extracelulare produse de stafilococi a). Stafilococii, mai ales S. aureus, produc o mare varietate de exoproteine imunogene. Majoritatea sunt proteine accesorii care, n condiii de cretere optime, sunt sintetizate la sfritul perioadei de cretere exponenial sau la nceputul fazei staionare. n condiii suboptime (de exemplu deficit de Mg2+), condiii care se pot ntlni i n esuturile infectate, aceste proteine pot fi sintetizate n tot cursul fazei exponeniale. b). Filtratele culturilor de S. aureus coaguleaz plasma recoltat de la o serie de specii animale sub aciunea coagulazei, care este cel mai important marker pentru S. aureus. S-au descris mai multe coagulaze antigenic distincte. Exist totui i tulpini de stafilococ implicate patogenic care sunt coagulaz-negative. Unele tulpini coagulaz-negative produc o metaloproteinaz care are o activitate asemntoare cu cea a coagulazei, ceea ce poate crea probleme n identificare. Coagularea necesit prezena unui factor coagulazo-reactant (FCR), care este probabil un derivat de protrombin. Complexul coagulazei realizat cu FCR convertete fibrinogenul n 321

fibrin. Procesul difer de coagularea normal prin faptul c nu sunt necesari o serie de factori (ex. Ca2+) iar cheagul care se formeaz este mai friabil i nu se retract. Studii recente demonstreaz c TFPI (inhibitorul cii factorului tisular), prin secvena sa C-terminal, joac un rol antimicrobian mpotriva S. aureus i mpotriva altor bacterii Gram-pozitive (Bacillus subtilis), Gram-negative (Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa) i chiar mpotriva fungilor Candida albicans i Candida parapsilosis (6). c). Stafilococii pot produce o serie de hidrolaze cu structuri antigenice diferite, precum: - stafilokinaza, care determin liza cheagului (prin convertirea plasminogenului n plasmin) sub controlul unui material genetic fagic; - nucleaza (termonucleaza), cu activitate endo- i exonucleazic asupra ADN i ARN, genernd 3'-nucleotide; - diferite lipaze evideniabile prin opacifierea agarului cu glbenu de ou sau prin scindarea substanei numit Tween; contribuie la supravieuirea stafilococului la nivel dermic; - hialuronidaza; - ureaza; - diferite proteaze (serin proteaz, cistein proteaz, metaloproteaz). d). n momentul se fa se cunosc patru hemolizine produse de stafilococi. O tulpin anume poate produce mai multe hemolizine. Unele dintre hemolizine distrug i alte celule, ducnd la o necroz local i pot avea efecte letale asupra animalelor de experien. Principalele caractere ale hemolizinelor sunt urmtoarele: 1. a-hemolizina (a-toxina) este principala hemolizin produs de S. aureus. Are activitate maxim asupra hematiilor de iepure; hematiile de om nu sunt susceptibile. Afecteaz trombocitele i celulele umane n cultur. Are efect dermonecrotic asupra animalul de experien (injectat local) i efect letal (injectat intravenos). Efectul ei principal este reprezentat de producerea de spasme ale muchilor netezi vasculari. S-a identificat receptorul de pe suprafaa membranei eritrocitului, o sialoglicoprotein. Este secretat sub forma unui monomer hidrosolubil de 34.000 Da, care se rearanjeaz n contact cu un receptor de membran, formnd un hexamer cilindric care strpunge membrana celulei i proemin la suprafaa ei, genernd un por cu un diametru de 23 nm (exist asemnri cu complexul litic C5b-C9 al C'). 2. -hemolizina este produs de majoritatea stafilococilor identificai la animale, dar numai de 10-20% dintre stafilococii umani. Produce o hemoliz de tip cald-rece. Este de fapt o sfingomielinaz C, activat de Mg2+, nu ns i de Ca2+. Efectul (n ordine descresctoare) se exercit asupra hematiilor de oaie, om, cobai (ceea ce corespunde cu concentraia de sfingomielin a hematiilor). Este citotoxic pentru diferite culturi de celule. n doze mari, este toxic pentru animalele de experien. 3. g-hemolizina este un complex de dou proteine bazice care acioneaz n cooperare. Hematiile susceptibile sunt cele de iepure, om, oaie, nu i cele de cal sau pasre. Efectul ei este inhibat de agar i de diferii polimeri sulfatai. Nu are efect atunci cnd se utilizeaz plci cu agar-snge. Aciunea este inhibat de colesterol i de alte lipide. 4. d-hemolizina este produs de majoritatea tulpinilor umane de S. aureus. Const din agregate heterogene de subuniti de circa 5.000 Da. Acioneaz pe diferite celule (hematii, leucocite, celule de mamifere cultivate) i nu are specificitate de specie. e). Stafilococii pot produce o serie de exotoxine piretogene, un grup de toxine cu mai multe activiti patogene, spre exemplu cu efecte imunosupresoare, cu un efect mitogen mai pronunat la nivelul limfocitelor T supresoare (au capacitatea de a activa policlonal toate celule 322

T); cresc toxicitatea endotoxinelor germenilor Gram-negativi (blocheaz funcia de clearance a sistemului reticuloendotelial); produc eritrodermie prin mecanisme de hipersensibilitate de tip ntrziat. Efectul piretogen se realizeaz cel puin n parte prin stimularea producerii de IL-1. Din acest grup fac parte exotoxinele piretogene A i B, enterotoxinele stafilococice (cu cinci tipuri serologice) i respectiv TSST-1, cauza sindromului de oc toxic stafilococic. Circa 50% din tulpinile de S. aureus izolate produc una sau mai multe enterotoxine. Aproximativ 15% produc TSST-1. Mai rare sunt tulpinile care produc exotoxine piretogene A i B. f). Leucocidina este produs de majoritatea tulpinilor de S. aureus i acioneaz numai asupra polinuclearelor i macrofagelor de om i iepure. Are dou componente, F i S. Componenta S se fixeaz pe gangliozidul GM1 (receptor pentru toxina holeric) i activeaz o fosfolipaz endogen, legat de membran. Produii acesteia se fixeaz apoi pe componenta F, inducnd apoi un canal ionic pentru K+i conducnd astfel la citoliz. g). Exfoliatina (toxina epidermolitic) produce o varietate de leziuni dermatologice. Este o protein termolabil i acid-labil, cu greutatea molecular de 24.000 Da, produs de circa 5% din tulpinile de S. aureus. S-au descris dou variante antigenice, ETB (codificat de un plasmid) i respectiv ETA (codificat cromozomial). Multe tulpini produc ambele exfoliatine. Toxina acioneaz prin clivarea stratului granular al epidermului, probabil prin scindarea desmosomilor care unesc celulele acestui strat. 29. 2. 6. 3.Bacteriocine S. epidermidisproduce epidermina (stafilococina 1580) i Pep5, care sunt lantibiotice. S. gallinarum produce galidermina. Aceste lantibiotice au efecte n special asupra bacteriilor Gram-pozitive, chiar i asupra unor tulpini de stafilococi din alt specie dect cea productoare.

29. 2. 7. Rspuns imun Imunitatea postinfecioas este specific fa de produii extracelulari (toxine, enzime) i fa de antigenele legate de corpii bacterieni. Titrul anticorpilor antistafilococici este sczut (crete, eventual, n cursul unor infecii generalizate, dar nu influeneaz evoluia spre vindecare) i nu are utilitate practic n diagnostic. Exist un nsemnat potenial de producere a unui vaccin stafilococic care s poat fi acceptat n Uniunea European (deocamdat nici un astfel de produs nu are licen la nivelul UE). S. aureus are posibilitea de a i modifica fenotipul, prezentndu-se sub forma de SCV (small colony variants), pentru a scpa sistemului imun i pentru a genera o infecie cronic. Un studiu pe modele celulare a artat c printre tehnicile de persisten se afl modificarea expresiei factorilor de virulen, auxotrofismul (inabilitatea unui microorganism de a sintetiza un compus organic necesar procesului de cretere) dar i aceast diversitate fenotipic, care s-a dovedit a fi un proces extrem de dinamic, fenotipurile SCV transformndu-se rapid napoi n fenotipurile slbatice complet virulente n momentul prsirii localizrii intracelulare (7).

29. 2. 8. Caractere de patogenitate Att S. aureus ct i o parte dintre SCN sunt inclui n categoria microorganismelor condiionat patogene.

323

S. aureus apare mai frecvent implicat n producerea unor infecii, de obicei la nivelul tegumentelor i mucoaselor, nsoite de formarea de puroi, dar cu potenial de generalizare. Tulpinile de S. aureus au capacitatea de a adera la mucoase, epitelii, endotelii, n special datorit prezenei acidului lipoteichoic, proteinei A i altor adezine. Dup aderare i multiplicare, n cursul infeciilor pot fi produse o serie de substane cu rol n patogenitate (enzimele i toxinele elaborate au fost prezentate la punctul 29. 2. 6). De menionat i faptul c stafilococii reprezint unele dintre primele microorganisme pentru care s-a descris fenomenul apariiei rezistenei la antibiotice. Rezistena la penicilin (mediat de o -lactamaz) a fost evideniat nc din anul 1947. Ulterior, pe msura utilizrii n infeciile stafilococice a unor diferite antibiotice (inclusiv a penicilinelor penicinilazo-rezistente), s-au selectat tulpini rezistente la meticilin, oxacilin, tetraciclin, cloramfenicol, macrolide, aminoglicozide etc. Un studiu recent a evaluat prevalena portajului de MSSA i de MRSA n departamentele de urgen din SUA, la pacieni n principal fr manifestri sugestive pentru infecia stafilococic. Prevalena portajului MSSA a fost estimat la 39% iar prevalena colonizrii cu MRSA a fost de 5%. Dintre pacienii colonizai MRSA, 80% au prezentat i cel puin o colonizare extranazal, pe cnd 45% au prezentat colonizare exclusiv extranazal (8). Pn n anul 1996, vancomicina reprezenta tratamentul de elecie al infeciilor cu S. aureus rezistent la alte antibiotice i chimioterapice. Au fost raportate tulpini stafilococice intermediare sau rezistente la vancomicin. n privina sensibilitii/rezistenei la vancomicin au fost descrise trei variante de S. aureus, respectiv:

S. aureus cu un nivel intermediar de rezisten la vancomicin (VISA), S. aureus cu hetero-rezisten la vancomicin (hVISA) i S. aureus rezistent la vancomicin (VRSA).

n mod clasic era considerat c o tulpin de S. aureus intr n categoria VISA n cazul n care CMI este 6 g/ml (determinare prin E test) i n categoria VRSA n cazul n care CMI este 32 g/ml. Conform EUCAST (2010), o tulpin de stafilococ este rezistent la vancomicin n cazul n care CMI este > 2 g/ml. Opiunile de tratament n infeciile cu VRSA sunt limitate. O clas de antimicrobiene care poate fi utilizat n tratamentul VRSA este reprezentat de streptogramine (quinupristin/dalfopristin, pristinamicina, virginiamicina, NXL 103, etamycin). Cu toate acestea, a fost identificat rezisten i la streptogramine (9), existnd totui posibilitatea tratrii S. aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalena acestui fenotip fiind ns redus, de 60,3%, spre deosebire de prevalena de 92,8% a tulpinilor rezistente constitutiv la macrolide, lincosamide i streptogramina B (10).

29. 3. Patologie specific i principalele afeciuni produse Stafilococii pot deveni patogeni i se pot manifesta ca atare fie prin multiplicare i invazivitate, fie prin multiplicare i toxinogenez (fiind posibil i mbinarea acestor mecanisme). Determinanii patogenitii stafilococului includ produsele toxice i enzimatice, care au fost prezentate la punctul 29. 2. 6. Spre exemplu, a-toxina are rol n generalizarea infeciilor i respectiv apariia sepsisului; d-hemolizina i leucocidina explic de ce S. aureus este mai dificil de distrus prin fagocitoz n comparaie cu SCN; lipaza este important n mecanismul de 324

producere a furunculelor; coagulaza contribuie la localizarea i persistena infeciei; hialuronidaza contribuie la invazivitate etc. Ar fi de menionat c tulpinile izolate de la nivelul unor furuncule sunt mai bogate n lipaz i mai srace n hialuronidaz fa de cele izolate din impetigo bulos. Tulpinile capsulate sunt mai virulente (mpiedic fagocitoza); frecvena lor pare a fi mai mare in vivo, deci rolul capsulei pare a fi mai important dect se credea anterior. Datorit faptului c nici unul din caracterele enumerate nu pare a fi decisiv n virulena stafilococilor, tulpinile de S. aureus nu pot fi clasificate net n patogene i nepatogene, aa cum se poate face de ex. n cazul tulpinilor de Corynebacterium diphteriae, tox+sau tox-. S. aureus este implicat ca agent etiologic ntr-o mare varietate de infecii supurative (cu puroi), ncepnd cu infeciile superficiale ale tegumentelor i mucoaselor i continund cu panariii, furuncule, abcese profunde, infecii ale diferitelor organe interne cu sau fr generalizarea infeciei. Pe de alt parte, ar fi de menionat toxinozele (datorate n special toxinelor elaborate) i anume toxiinfeciile alimentare, necroliza toxic a epidermului, sindromul de oc toxic etc. Toxiinfeciile alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente n alimente n care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni. Simptomele principale sunt reprezentate de greuri, crampe abdominale, vrsturi, diaree care apar la 1-4 (1-6) ore dup ingestia alimentelor contaminate. Se vindec n general n circa 24 de ore. Alimentele sunt contaminate n general de ctre cei care le manipuleaz (de exemplu buctarul prezint un panariiu). Alimentele mai frecvent incriminate sunt cremele, brnza, ngheata, carnea i produsele din carne (acestea pot constitui adevrate medii de cultur pentru bacterii). Enterotoxinele stafilococice sunt termostabile (rezist 30 minute la 100C), ceea ce impune pstrarea alimentelor la frigider, att nainte ct i dup preparare. Dermatitele exfoliative includ dermatita exfoliativ generalizat (boala Ritter) care poate aprea la nou nscut; epidermonecroza toxic (ntlnit la copii i eventual la aduli); impetigo bulos i scarlatina stafilococic (spre deosebire de cea streptococic, nu afecteaz limba i palatul). Leziunile aprute sunt extinse, de multe ori impresionante, dar este posibil vindecarea fr cicatrici deoarece sediul leziunilor este n stratul granular al pielii (sub ele rmnnd un strat suficient de gros pentru evitarea unor pierderi masive de lichid i pentru a proteja straturile profunde de infecii supraadugate). n mod frecvent, stafilococii care au produs toxinele implicare patogenic nu sunt izolai de la nivelul leziunii. Sindromul de oc toxic cuprinde un complex de simptome provocat ca urmare a unor infecii locale cu S. aureus productor de TSST-1 (toxina 1 a ocului toxic). Principalele semne i simptome sunt reprezentate de apariia strii de oc, febr mare, greuri, vrsturi, diaree, trombocitopenie, insuficien renal i hepatic acut, rash (erupie) scarlatiniform urmat de descuamare (mai ales a palmelor i plantelor). Mortalitatea n cazurile necomplicate este de circa 2%. n formele complicate, mortalitatea poate ajunge la 50%. Un procent important (circa 80%) dintre cazuri apar la femei. Unele mrci de tampoane destinate igienei intime feminine sau dovedit a stimula producia de TSST-1 de ctre tulpini proprii de stafilococ. Deoarece s-a demonstrat c TSST-1 crete toxicitatea endotoxinei germenilor Gram-negativi, cazurile cele mai grave au aprut atunci cnd infecia stafilococic local s-a asociat cu o infecie cu germeni Gram-negativi. Stafilococii coagulaz-negativi sunt implicai n infecii aprute dup manevre medicochirurgicale care penetreaz bariera cutaneo-mucoas (cateterisme, implante, protezri intravasculare etc). Ar mai fi de amintit infeciile tractului urinar i genital cu S. saprophyticus (la femeile tinere). O infecie grav produs de SCN este enterocolita postantibiotice a nou nscutului (mai ales a prematurului, situaie n care administrarea necontrolat / abuziv a antibioticelor poate produce disbacteriemii cu consecine grave). n etiologia enterocolitei postantibiotice sunt recunoscute mai multe specii de stafilococi, S. aureus ocupnd primul loc. 325

29. 4. Diagnostic de laborator Diagnosticul de laborator n infeciile produse de stafilococi este doar bacteriologic (direct) i respect etapele clasice ale acestui tip de diagnostic, ncepnd cu recoltarea i transportul produsului patologic, de obicei reprezentat de puroi (fie dintr-o leziune deschis, superficial, fie din leziuni nchise, profunde). Cultivarea n vederea obinerii de colonii izolate se continu cu identificarea n care pe lng caracterele morfologice, de cultur i biochimice se face testul coagulazei pe lam i/sau n tub. Antibiograma completeaz n mod necesar diagnosticul de laborator al unei infecii stafilococice. Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de stafilococi vom alege drept reprezentative infeciile purulente ale tegumentelor i mucoaselor i ne vom referi numai la Staphylococcus aureus. Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu urmtoarele etape. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n funcie de maladia provocat se pot recolta urmtoarele produse patologice: secreii purulente (din foliculite, abcese, celulite, fistule, infecii ale plgilor i arsurilor), lichide (de puncie sinusal, otic, mastoidian, articular, peritoneal, pleural, pericardic), exsudat nazal sau exsudat faringian, snge, LCR, sput, urin, secreie vaginal, tampoane vaginale, lichid de vom, materii fecale, alimente, prelevate de pe suprafaa cateterelor i a inseriilor iv. ale acestora. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de puroi (vezi anexa nr. 6; A. 6. 1.). De menionat c din anul 2002 a fost pus la punct o tehnic PCR pentru identificarea S. aureus rezistent la meticilin, direct n produsul patologic (vezi Direcii de cercetare). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate fa de normal), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena cocilor Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate. Cocii se pot situa intra sau extraleucocitar. Se are n vedere locul de unde a fost recoltat p.p. (puroiul poate fi necontaminat, dac se recolteaz de ex. prin puncie-aspirare dintr-o colecie purulent profund i este foarte probabil contaminat cu flor de asociaie dac a fost recoltat dintr-o leziune superficial). 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz ct mai rapid (pentru a diminua riscul modificrilor ce ar putea aprea n structura microbian) i n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i anexa nr. 2). Stafilococii se dezvolt n general pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Coloniile au aspect de tip S, diametrul cuprins ntre 1-3 mm i sunt pigmentate n funcie de specia izolat (ex. pigment auriu). Pe mediul geloz-snge, n jurul coloniilor poate aprea o zon de hemoliz clar. Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolernd o concentraie de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman). n cazul n care produsul este recoltat de la nivel nazal (existnd certitudinea c produsul conine mai multe specii de microorganisme) este recomandat utilizarea mediilor hiperclorurate. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:

326

Caractere morfotinctoriale: sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,6-1,5 mm, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate. Caractere de cultur: produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu snge pot produce hemoliz. Caractere biochimice: stafilococii au un metabolism glucidic att respirator ct i fermentativ. Fermenteaz glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharozaetc. cu producere de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului coninnd manit este utilizat ca test de difereniere ntre S. aureus (manit-pozitiv) i SCN (manit-negativ). S. aureus este catalaz-pozitiv (vezi anexa nr. 2) (la fel ca i ceilali stafilococi). De importan egal taxonomic i recomandat drept al doilea test de confirmare a apartenenei la specia S. aureus este testul dezoxiribonucleazei termostabile. Se poate face i testul fosfatazei (poate fi pozitiv i la unele specii coagulaz-negative). Exist sisteme multitest care se pot procura comercial (API, Micro Scan, Minitek, Vitek etc). Caractere antigenice: Pentru diferenierea S. aureus de SCN se pot utiliza teste comerciale care includ fibrinogen i IgG care cupleaz coagulaza legat i proteina A (tehnici de aglutinare indirect). Se pot utiliza i truse cu anticorpi monoclonali fa de endo--N-acetil-glucozaminidazei stafilococice. Caractere de patogenitate: o Trebuie efectuat testul coagulazei (vezi anexa nr. 2); factorul care produce coagularea pe lam poate fi prezent la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius. n cazul n care n testul coagulazei pe lam se folosete plasm uman, rezultatul poate fi pozitiv pentru S. lugdunensis i S. schleiferi (subspecia schleiferi). o Pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnic de tip ELISA sau aglutinarea pasiv inversat (vezi i capitolele 20 i 23). Sensibilitatea la bacteriofagi: Susceptibilitatea la aciunea litic a bacteriofagilor a fost sistematizat pentru tulpinile de S. aureus ntr-un sistem care se poate utiliza la nivelul centrelor de referin. Exist un set de baz de bacteriofagi, care permit ncadrarea S. aureus n unul din grupele I, II, III sau V. Lizotipia este actualmente evaluat comparativ cu capacitatea discriminatorie a testelor care au ca mecanism biologia molecular (ex. ribotiparea). Alte caractere / teste utilizate n identificare: Se pot utiliza (n centre de referin) teste care se bazeaz pe proprieti fenotipice moleculare (studiul acizilor grai celulari, al unor enzime sau al unor polipeptide totale) sau genotipice (fragmente de restricie ale materialului genetic, hibridarea molecular, ribotiparea etc.). S-au dezvoltat tehnici rapide utiliznd truse de identificare i instrumenteautomatizate pentru evidenierea unor elemente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza legat), a enzimelor elaborate n aliment sau lichidul de hemocultur (testul pentru termonucleaz) i a toxinelor (enterotoxine, TSST1, exfoliatine). Exist metode care utilizeaz markeri moleculari pentru evidenierea prezenei MRSA (stafilococ rezistent la meticilin, de ex. amplificarea genic, PCR pentru gena mecA, dar i pentru genele femA, femB) i/sau pentru diferenierea intraspecific la S. aureus i SCN.

5. Antibiograma (testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 7). Pentru a identifica tulpinile rezistente la meticilin (MRSA) se poate detecta prezena genei mecA (dup amplificare genic, prin PCR).

29. 5. Tratament 327

Multe persoane sunt purttoare de stafilococi la nivel tegumentar, nazal sau faringian. Chiar dac stafilococii ar fi eliminai complet de la nivelul vestibulului nazal, recolonizarea s-ar produce foarte rapid (4). Totui, n anumite situaii (ex. pacieni supui dializei peritoneale sau hemodializei, pacieni infectai cu HIV sau la personalul medical care lucreaz de ex. n secii de ari) ncercarea de eliminare a strii de purttor are justificare. Se poate utiliza tratamentul local cu mupirocin. Este nc n studiu utilizarea lizostafinei n acest scop (lizostafina este o enzim litic produs de o tulpin de S. simulans; atac puntea pentaglicinic de la nivelul lanurilor de peptidoglican ai S. aureus; au fost fcute experimente pe animale de laborator obinndu-se rezultate promitoare) (11). Tratamentul unei stafilococii, n cazul n care este necesar antibioterapia, se va face conform antibiogramei. Principial, dac un stafilococ este sensibil la penicilin (majoritatea tulpinilor au devenit rezistente prin producerea de beta-lactamaz, dar nu toate), atunci tratamentul ar trebui s includ acest antibiotic. Din experiena centrului de referin din INCDMI Cantacuzino, procentul tulpinilor sensibile la penicilin este de circa 5%. Datorit rezistenei la penicilin au fost produse peniciline rezistente la aciunea beta-lactamazelor (penicilinele M de la meticilin), de ex. oxacilina, cloxacilina i derivaii acestora. Tulpinile meticilino-rezistente pot deveni destul de rapid multi-rezistente. Ca i principiu de tratament, MRSA rspunde potenial la tratamentul cu vancomicin. VRSA poate rspunde la streptogramine (de exemplu etamycin). Cu toate acestea, a fost identificat rezisten i la streptogramine (9), existnd totui posibilitatea tratrii S. aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalena acestui fenotip fiind ns redus, de 60,3%, spre deosebire de prevalena de 92,8% a tulpinilor rezistente constitutiv la macrolide, lincosamide i streptogramina B (10). n cazul coleciilor purulente reamintim i considerm c este de reinut ca fiind de prim importan utilizarea inciziei i drenajului, fr de care antibioterapia nu are nici un sens. De multe ori, incizia i drenajul sunt suficiente.

29. 6. Epidemiologie Stafilococii sunt ubicuitari. Sursa de infecie cea mai comun este reprezentat de leziunile stafilococice de la nivelul tegumentului. De menionat posibilitatea rspndirii infeciei cu stafilococi rezisteni la antibiotice (de spital), atunci cnd persoanele purttoare sunt reprezentate chiar de personalul medical i auxiliar. Referitor la sindromul de oc toxic stafilococic (SSTS), n SUA s-au raportat 157 de cazuri n 1997, 138 de cazuri n 1998 i 113 cazuri n 1999, cu o inciden anual de 0,050/0000. n anul 2005 au fost raportate numai 90 de cazuri (incidena fiind 0,040/0000). Tot n anul 2005 s-au raportat 2 cazuri de infecie cu S. aureus cu sensibilitate intermediar la vancomicin (VISA) i 3 cazuri de infecie cu S. aureusrezistent la vancomicin (VRSA). n Romnia nu sunt disponibile (la nivel naional) date privind SSTS sau rezistena la vancomicin a tulpinilor de S. aureus. Din datele laboratorului de referin pentru stafilococ din INCDMI Cantacuzino, inclusiv cele provenite din supravegherea microorganismelor izolate din infectii invazive pe baza protocoalelor EARSS (2002-2009), respectiv EARS.Net (din 2010), n Romnia 328

nu au fost semnalate tulpini de S. aureus rezistente la vancomicin. Laboratorul de referin pentru stafilococ din INCDMI Cantacuzino poate detecta prin metode moleculare prezena genelor pentru enterotoxine, leucocidina Panton Valentine, TSST1, n culturi de S. aureus.

29. 7. Profilaxie Prevenirea transmiterii infeciei are la baz metodele de igien, asepsie i antisepsie. n spital, seciile cu risc sunt cele de neonatologie, terapie intensiv, slile operatorii i saloanele unde se afl pacieni cu cancer aflai sub chimioterapie / sau cu alte cauze de imunodepresie. n aceste situaii, personalul medical trebuie investigat prin metode de laborator i este de preferat ca persoanele purttoare de stafilococi coagulaz-pozitivi s nu aib acces n aceste incinte i s nu aib contact direct cu pacienii n cauz. Ca alternativ trebuie s se pun accentul pe proceduri adecvate, care s evite contaminarea pacienilor. Utilizarea substanelor antiseptice i ncercarea de eradicare cu ajutorul antibioticelor a portajului nazal (ex. lizostafin, mupirocin) ar putea fi utile. (11) Utilizarea vaccinului stafilococic poate s amelioreze starea clinic n anumite situaii, de ex. la pacieni care necesit hemodializ, prezena de catetere etc. Din pcate la nivel internaional (EU) nu exist un vaccin stafilococic care s fi primit autorizaie de utilizare. n ara noastr vaccinul stafilococic produs de INCDMI Cantacuzino a avut autorizaie de utilizare pn n anul 2010.

29. 8. Direcii de cercetare 29.8.1 Tratamentul infeciei cu S. aureus Antibioticele convenionale acioneaz n general pe bacteriile aflate n cursul ciclului de multiplicare (12). n cursul evoluiei clinice a unei infecii, acestea coexist cu cele aflate n afara ciclului de multiplicare, motiv pentru care este aproape imposibil ca ntreaga populaie bacterian s fie distrus simultan. Astfel, rmn viabile o serie de bacterii care au fost deja expuse antibioticului i care au avut timpul necesar pentru dezvoltarea mutaiilor de rezisten. Terapia intit pe bacteriile non-multiplicative este un concept nou, existnd o serie de astfel de antibiotice n curs de dezvoltare i cercetare. Unul dintre acestea este HT61, un derivat quinolonic, a crui eficacitate a fost demonstrat (pe culturi celulare i pe modele murine de colonizare cutanat) mpotriva MSSA, MRSA i chiar i MRSA rezistent la mupirocin. Acest medicament acioneaz prin depolarizarea membranei celulare i prin distrucia peretelui bacterian, n decurs de 2 ore. Pe parcursul unui an de studiu, n cadrul a 50 de culturi seriate, nu a fost decelat niciun fenotip de rezisten la HT61. Acest tip de terapie reprezint promisiunea unui tratament de durat mai scurt, eficien mai ridicat i cu un risc sczut de instalare a rezistenei. Un antibiotic cunoscut din clasa streptograminelor B, etamycin, i-a demonstrat recent eficiena asupra MRSA (att tulpinile comunitare ct i cele spitaliceti) pe modele murine cu infecie sistemic letal MRSA (13). Etamycin a fost izolat de la actinomicete marine descoperite recent (CNS-575), ceea ce a atras atenia asupra mediului marin privit ca potenial surs pentru 329

identificarea altor antibiotice eficiente asupra tulpinilor rezistente ale diverselor specii bacteriene. Etamycin a demonstrat de asemenea o eficien experimental asupra mai multor patogeni Gram-pozitivi sau Gram-negativi, fiind ne-citotoxic la concentraii de 20 de ori mai mari dect CMI-ul (care a fost de 1-2 mg/L pentru MRSA comunitar sau spitalicesc). 29.8.2 Detecia direct a rezistenei la meticilin Printre metodele de detecie direct a rezistenei la meticilin a S. aureus se numr i testele de latex aglutinare. Un tip particular de astfel de test a fost descris n 2010, de Qian et al. (14) n Journal of Clinical Microbiology. Ei propun efectuarea acestui test de latex aglutinare (pe mediu de tip geloz-snge) prin utilizarea unei proteine de legare a penicilinei (Penicillin Binding Protein 2a). Acest test (PBP-LA) i-a demonstrat o sensibilitate de 94,1% i o specificitate de 97,5%, valori doar cu puin mai sczute fa de sensibilitatea i specificitatea efecturii tehnicii PCR. Dintre avantajele utilizrii acestei metode menionm: obinerea de rezultate rapide, tehnic uor de utilizat, preuri sczute ale reactivilor utilizai. n vederea creterii sensibilitii testului, acesta poate fi utilizat n combinaie cu alte teste de identificare rapid, precum: DNA-aza termostabil, API Rapidec, i FISH (peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization).

29. 9. Povestire adevrat Super-bug ... Acesta este numele dat de U.S. Department of Health S. aureus meticilino rezistent (MRSA). Aceast denumire a fost preluat de reprezentanii mass-media i n momentul de fa acest nume a devenit de notorietate n Statele Unite i nu numai. Avnd n vedere faptul c numai pe o perioad de un an s-au raportat n SUA circa 20.000 de pacieni care au fost internai cu acest diagnostic, definiia i numele par a fi potrivite i este strict necesar ca sistemul de raportare s se ocupe cu atenie de aceast situaie. Din pcate, i n acest caz, trebuie s ne bazm n special pe datele din literatura de specialitate internaional, datele publicate n Romnia fiind fie puine, fie irelevante. Din evenimentele care au avut loc recent (octombrie 2007) n legtur cu acest subiect, amintim decizia luat de Guvernatorul Statului Virginia, care a promulgat n regim de urgen o lege, prin care toate unitile sanitare erau obligate s raporteze cazurile suspecte i confirmate de infecie cu Staphylococcus aureus meticilino rezistent (MRSA), contribuind la stabilirea unui sistem activ de raportare, pentru a se putea astfel demonstra care este evoluia infeciilor cu MRSA n contextul unei campanii speciale de control a acestor infecii. Toate aceste reacii, inclusiv msura fr precedent de nchidere a peste 20 de uniti de nvmnt pentru dezinfecie i sterilizare au fost instituite n contextul n care un tnr de 17 ani a decedat prin sepsis stafilococic. Decesul lui O.R. a condus la o campanie n care au participat n colaborare unitile de nvmnt, elevii din aceste uniti, sistemul medical (inclusiv centrul de prevenire i control al bolilor, mass-media, reprezentanii autoritilor locale i o serie de politicieni). Dup cum am discutat n prezentul capitol, dar i n alte capitole ale acestui manual, stafilococii sunt prezeni n mod normal pe tegumente i mucoase. Totui, stafilococii pot fi implicai i n patologie. Pot fi vizate persoane imuno-competente, copii, adolesceni, tineri. De suficient de multe ori, cei care consider c nu sunt vulnerabili sau cred c au un risc foarte sczut de mbolnvire, de ex. sportivii (mai ales cei care practic sporturile mai dure, nsoite de contact direct i care se consider indestructibili) pot fi printre cei mai expui la infecie i chiar la o evoluie grav a acesteia. La universitatea din Virginia, ntreg lotul de lupte greco330

romane s-a infectat venind n contact cu o saltea de lupt contaminat de un coleg care s-a rnit n timpul antrenamentului. De multe ori, simpla respectare a unor reguli de igien general i personal pot contribui semnificativ la prevenirea apariiei infeciilor stafilococice. Pentru restul cazurilor studiul individual, cercetarea bazelor de date i experiena ctigat cu fiecare caz consultat, investigat, analizat i discutat ne ajut s ajungem la cea mai bun ipotez diagnostic, la cel mai bun diagnostic diferenial, la cel mai potrivit tratament n vederea celui mai bun prognostic pentru pacientul sau pacienii pe care i vom examina de-a lungul ntregii cariere medicale sau medicochirurgicale.

29. 11. Bibliografie 1. Quinn, G. A.; Tarwater, P. M.; Cole, A. M., 2009, Subversion of interleukin-1-mediated host defence by a nasal carrier strain of Staphylococcus aureus. Immunology, 128, (1 Suppl), e222-9. 2. Muthukrishnan G, Quinn GA, Lamers RP, Diaz C, Cole AL, Chen S, Cole AM, 2011, Exoproteome of Staphylococcus aureus reveals putative determinants of nasal carriage. J Proteome Res., 10(4):2064-78. 3. van Belkum, A.; Melles, D. C.; Nouwen, J.; van Leeuwen, W. B.; van Wamel, W.; Vos, M. C.; Wertheim, H. F.; Verbrugh, H. A., 2009, Co-evolutionary aspects of human colonisation and infection by Staphylococcus aureus. Infect Genet Evol., 2009, 9, (1), 3247. 4. Ten Broeke-Smits NJ, Kummer JA, Bleys RL, Fluit AC, Boel CH., 2010, Hair follicles as a niche of Staphylococcus aureus in the nose; is a more effective decolonisation strategy needed? J Hosp Infect., 76(3):211-4. 5. Merino, N.; Toledo-Arana, A.; Vergara-Irigaray, M.; Valle, J.; Solano, C.; Calvo, E.; Lopez, J. A.; Foster, T. J.; Penades, J. R.; Lasa, I., 2009, Protein A-mediated multicellular behavior in Staphylococcus aureus. J Bacteriol, 191, (3), 832-43. 6. Papareddy P, Kalle M, Kasetty G, Mrgelin M, Rydengrd V, Albiger B, et al, 2010, Cterminal peptides of tissue factor pathway inhibitor are novel host defense molecules, J Biol Chem., 285(36):28387-98. 7. Tuchscherr L, Medina E, Hussain M, Vlker W, Heitmann V, Niemann S, et al., 2011, Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection, EMBO Mol Med., doi: 10.1002/emmm.201000115. [Epub ahead of print] 8. Schechter-Perkins EM, Mitchell PM, Murray KA, Rubin-Smith JE, Weir S, Gupta K., 2011, Prevalence and Predictors of Nasal and Extranasal Staphylococcal Colonization in Patients Presenting to the Emergency Department, Ann Emerg Med., [Epub ahead of print] 9. Ho PL, Lai EL, Chan MY, Chow KH., 2011, Distinctive patterns of macrolide-lincosamidestreptogramin resistance phenotypes and determinants amongst Staphylococcus aureus populations in Hong Kong. Int J Antimicrob Agents, 37(2):181-2. 10. Saderi H, Emadi B, Owlia P., 2011, Phenotypic and genotypic study of macrolide, lincosamide and streptogramin B (MLSB) resistance in clinical isolates of Staphylococcus aureus in Tehran, Iran. Med Sci Monit., 17(2):BR48-53. 11. Maria do Carmo de Freire Bastos, Bruna Gonalves Coutinho, Marcus Lvio Varella Coelho, 2010, Lysostaphin: A Staphylococcal Bacteriolysin with Potential Clinical Applications,Pharmaceuticals 2010, 3(4), 1139-1161; doi:10.3390/ph3041139

331

30. Genul Streptococcus. Streptococcus pyogenes (Gabriela Loredana Popa, Marina Pan, MI Popa, Maria Ghi)

30. 1. Definiie. ncadrare Streptococii sunt coci sferici Gram-pozitivi care formeaz perechi sau lanuri n cursul diviziunii celulare. Sunt larg rspndii n natur. Unii fac parte din flora uman normal; alii sunt asociai cu afeciuni umane importante datorate parial infeciei streptococice i parial rspunsului imun al gazdei. Nu exist nc un sistem perfect pentru clasificarea tuturor speciilor de streptococi. Totui, pentru a contura o imagine legat de numrul acestora, NCBI a creat un browser taxonomic unde putem gsi speciile cunoscute pn n acest moment. (1) Dintre numeroasele specii, unele au importan medical (n patologia uman) i dintre acestea amintim Streptococcus pyogenes (grup A), S. agalactiae (grup B), S. viridans (care aparine florei normale), S. pneumoniae (pneumococul) etc. Streptococii sunt imobili, nesporulai i pot avea sau nu capsul. n anul 1906 a fost descris Streptococcus faecalis iar n 1919, Streptococcus faecium. mpreun cu o a treia specie, S. durans (foarte asemntoare cu S. faecium), n 1937 a fost definit grupul enterococilor, inclui n grupul D al genului Streptococcus. Din 1984, pe baza studiilor de hibridizare molecular s-a decis c aceste specii fac parte dintr-un gen separat, genul Enterococcus (vezi 30. 9). Enterococii pot fi izolai din flora enteric normal. Sunt nonhemolitici (ocazional alfa-hemolitici); dau o reacie pozitiv la bil-esculin. Tolereaz NaCl n concentraie de 6,5%. Sunt rezisteni la multe antibiotice i chimioterapice. Tratamentul infeciilor cu enterococi poate reprezenta o problem foarte serioas.

30. 1. 1. Sisteme de clasificare O perioad de timp, clasificarea streptococilor s-a bazat pe o serie de observaii privind: a). Morfologia coloniilor i hemoliza produs pe agar snge; b). Specificitatea antigenic a substanelor specifice de grup (clasificarea Lancefield) i de tip; c). Reaciile biochimice; d). Rezistena la factori fizici i chimici; e). Diferite caracteristici ecologice. Dup 1980 s-au introdus teste biochimice adiionale precum i studiile de genetic molecular. n funcie de hemoliza produs pe agar snge, streptococii se mpart n trei grupe: cei care produc hemoliz, hemoliz i streptococii hemolitici. (Figura nr. 1, Fotografia nr. 1) Clasificarea Lancefield mparte streptococii n grupe serologice (A-H i K-U), n funcie de polizaharidele din compoziia peretelui, n timp ce proteina M submparte streptococii din grupul A n tipuri serologice. (Tabelul nr. 1) Specificitatea antigenic a polizaharidelor capsulare este folosit pentru a clasifica S. pneumoniae n peste 90 de tipuri i pentru tipizarea streptococilor de grup B (S. agalactiae).

30. 1. 2. Streptococi de interes medical

332

30. 1. 2. 1.S. pyogenes. Cei mai muli dintre streptococii care conin antigenul de grup A sunt streptococi piogeni. Ei sunt beta-hemolitici (produc n mod caracteristic zone largi de hemoliz clar n jurul unor colonii de dimensiuni mici, punctiforme). S. pyogenes este principalul microb asociat cu invazia local sau sistemic i cu tulburri imunologice poststreptococice. De regul streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracin. Structura de tip capsular pe care unele tulpini o prezint este chimic similar cu esutul conjunctiv al organismului gazd (acid hialuronic), fiind ca atare neantigenic. Membrana sa citoplasmatic are antigene similare cu miocardul, muchii scheletici i muchiul neted, fibroblatii valvelor cardiace i esutul nervos. 30. 1. 2. 2.S. agalactiae. Face parte din flora normal a tractului genital feminin i poate reprezenta o important cauz de sepsis i meningit neonatal. Sunt beta-hemolitici i produc zone de hemoliz care sunt doar puin mai extinse dect coloniile (1-2 mm n diametru). Streptococii de grup B hidrolizeaz hipuratul de sodiu i dau o reacie pozitiv n testul CAMP (folosind discuri impregnate cu toxin stafilococic) (2). 30. 1. 2. 3.Grupele C i G. Aceti streptococi sunt izolai uneori din nazofaringe i pot cauza sinuzit, bacteriemii sau endocardit. Deseori formeaz colonii asemntoare cu cele ale streptococilor piogeni i sunt beta-hemolitici. Sunt identificai prin reacii cu antiser specific pentru grupele C sau G. 30. 1. 2. 4.S bovis. Face parte din streptococii de grup D. Aparine florei normale. Ocazional produce endocardit sau bacteriemie la pacienii cu carcinom de colon. Nu produce hemoliz i d o reacie pozitiv la bil-esculin. 30. 1. 2. 5.S. pneumoniae.Pneumococii sunt alfa-hemolitici, creterea lor este inhibat de optochin iar coloniile sunt distruse de bil i sruri biliare (vezi capitolul 31). n continuare reprezint o cauz important de morbiditate i mortalitate (prin pneumonie comunitar). 30. 1. 2. 6.S. viridans. Fac parte din flora normal la nivelul tractului respirator superior. n mod caracteristic sunt alfa-hemolitici, dar pot fi nonhemolitici. Creterea lor nu este inhibat de optochin. Pot ajunge n torentul sanguin ca urmare a unei traume i reprezint o cauz important a endocarditei care survine la pacieni cu valve cardiace patologice. Unii streptococi viridans (exempluS. mutans) sintetizeaz polizaharide care contribuie la geneza cariilor dentare. 30. 1. 2. 7.Peptostreptococii. Cresc numai n condiii anaerobe sau microaerofile i produc n mod variabil hemolizine. Fac parte din flora bucal normal, flora tractului respirator superior, intestinal i genital feminin. Particip, adesea n asociere cu alte specii bacteriene, n infeciile anaerobe polimicrobiene abdominale, pelviene, pulmonare sau cerebrale.

30. 2. Caractere generale 30. 2. 1. Habitat Streptococii piogeni se pot gsi la nivelul tractului respirator superior uman. Condiiile n care ar trebui eliminai se stabilesc de la caz la caz. O parte dintre speciile de streptococi colonizeaz exclusiv suprafaa dentar i devin detectabile numai dup erupia dentar. Pentru alte specii de streptococi, datele referitoare la habitat au fost prezentate mai sus.

333

30. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1m, imobili, nesporulai. Se divid ntr-un plan perpendicular pe axa lor lung i sunt aranjai n lanuri (de pn la 50 elemente bacteriene). Lungimea lanurilor variaz i este condiionat de factori de mediu. Unii streptococi elaboreaz o capsul polizaharidic comparabil cu cea pneumococic. Cele mai multe din speciile de grup A, B i C produc capsul din acid hialuronic. Capsulele sunt mai evidente n culturile tinere i mpiedic fagocitoza. Pilii streptococici sunt acoperii de acid lipoteichoic i au rol n aderen. 30. 2. 3. Caractere de cultur Cei mai muli streptococi cresc pe medii solide i formeaz colonii discoide, de tip S, cu diametrul de 1-2 mm. Streptococul piogen beta-hemolitic de grup A formeaz colonii punctiforme. Speciile care produc material capsular adeseori dau natere unor colonii mucoide (de tip M). Cei mai muli streptococi sunt aerobi, facultativ anaerobi. Peptostreptococii sunt strict anaerobi. Necesitile nutritive variaz mult n funcie de specie. Streptococii implicai n patologia uman sunt n general germeni pretenioi, necesitnd o varietate de factori de cretere. Un mediu de cultur util (att ca mediu mbogit ct i ca mediu diferenial) este mediul geloz-snge. Pe acest mediu streptococii se pot diferenia n funcie de capacitatea de a produce hemoliz. Distrugerea complet a eritrocitelor cu eliberarea de hemoglobin poart numele de betahemoliz i reprezint un caracter util n identificarea streptococilor piogeni (colonii mici, de tip S, nconjurate de o zon clar de hemoliz, cu un diametru mult mai mare dect diametrul coloniei). Liza incomplet a eritrocitelor cu formarea de pigment verde se numete alfahemoliz (sau hemoliz viridans). Hemoliza incomplet fr o nuan verzuie poart numele de hemoliz alfa prim. n cazul n care streptococii nu produc hemoliz sunt clasificai drept streptococi gama. n funcie de producerea hemolizei, mai frecvent implicai n patologia uman sunt streptococii beta-hemolitici, iar dintre acetia n mod special streptococii beta-hemolitici din grupul A. Streptococul piogen beta-hemolitic de grup A elaboreaz dou hemolizine: 1) streptolizina O, o protein antigenic avnd greutatea molecular de 60.000 Da, hemolitic activ n stare redus (grupri SH disponibile), dar inactivat rapid n prezena oxigenului i 2) streptolizina S care nu este imunogen. 30. 2. 4. Caractere biochimice Unul dintre caracterele biochimice importante este reprezentat chiar de producerea hemolizei. Streptococii piogeni sunt germeni pretenioi care necesit pentru dezvoltare adugarea n mediul de cultur a vitaminelor, aminoacizilor, glucozei sau cel puin utilizarea ca mediu de cultur a gelozei-snge sau a bulionului nutritiv. Streptococii degradeaz glucoza pe calea glicolitic. O mare parte dintre specii pot fermenta i alte tipuri de zaharuri i alcooli zaharai utiliznd o serie de enzime inductibile (sintetizate doar n prezena carbohidratului respectiv i n absena glucozei). n mod uzual streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracin. Sunt catalaz negativi. 30. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Streptococul piogen este distrus n 30 de minute la 56C, dar poate supravieui n secreii uscate, la temperatura camerei i ntuneric timp de cteva sptmni. Deoarece nu este sensibil

334

la aciunea coloranilor de tipul trifenil-metan, cristalul violet poate fi utilizat n mediile de cultur selective. 30. 2. 6. Structur antigenic Streptococii hemolitici pot fi divizai n grupe serologice (peste 18 grupe serologice notate cu literele mari ale alfabetului, A-U), pe baza carbohidratului C, prezent n structura peretelui multor streptococi (grupele Lancefield). Specificitatea serologic a carbohidratului specific de grup este determinat de un zahar aminat, care pentru streptococii de grup A este ramnoz-Nacetil-glucozamin, pentru grupul B ramnoz-glucozamin-polizaharid etc. Cele mai importante sunt grupele A, B, C, F i G (includ streptococi -hemolitici). Streptococii beta-hemolitici din grupul A prezint la nivel parietal proteina M, cel mai important factor de patogenitate pentru acest grup streptococic. Anticorpii fa de proteina M confer imunitate specific de tip. Deoarece exist mai mult de 100 de tipuri de protein M (dar nu toate au i proprieti de prevenire a fagocitozei), o persoan poate face infecii repetate cu S. pyogenes de grup A, de diferite tipuri. Proteina M a fost identificat i la streptococi din grupul G. Alte structuri antigenice sunt reprezentate de ctre: - proteina asociat proteinei M (MAP); - substana T care permite diferenierea anumitor tipuri de streptococi prin aglutinarea cu antiser specific; - peptidaza C5a (care cliveaz fragmentul C5a al sistemului complement); - proteina R, care este un antigen de suprafa; - proteina F, cu rol de adezin, ce interacioneaz cu fibronectina; - nucleoproteine (substane P) care probabil alctuiesc cea mai mare parte din corpul streptococic; - diferite toxine i enzime: 1. streptokinaza (fibrinolizina) care transform plasminogenul n plasmin; poate fi util n tratamentul administrat intravenos n embolia pulmonar, tromboza arterial i venoas i n infarctul miocardic acut; este o structur antigenic; 2. streptodornaza (dezoxiribonucleaza) depolimerizeaz ADN-ul; dup infecii streptococice, n special dup infecii ale pielii, apar anticorpi anti-Dn-az; 3. hialuronidaza scindeaz acidul hialuronic, o component important a substanei fundamentale din esutul conjunctiv; 4. toxina eritrogen solubil, distrus prin fierbere ntr-o or, st la originea rash-ului (erupiei caracteristice) care apare n scarlatin; toxina eritrogen este elaborat numai de streptococii lizogenizai; exist un singur tip de toxin eritrogen; 5. difosfopiridin nucleotidaza este o enzim elaborat i eliberat n mediu de unii streptococi; 6. hemolizinele (streptolizinele); Semnificaia biologic a streptolizinei O este nc neclar. Se tie c administrat intravenos duce la animalele de laborator la deces n cteva secunde prin aciunea sa direct la nivel cardiac. Totui, nu este cert c streptolizina S ar fi produs i in vivo. (2) n momentul de fa se studiaz modul n care SGB activeaz sistemul imun pe o alt cale, cale descoperit n ultimii ani i nc insuficient studiat, inflamazomul NLRP3. S-a descoperit, prin studii efectuate pe oricei, c celulele dendritice rspund la SGB prin secreia de IL-1 i IL-18. IL-1 necesit pentru a se forma pro- IL-1 i clivaj proteolitic dependent de caspaza 1. Aici intervine inflamazomul. Acesta, la rndul lui, pentru a fi activat are nevoie de secreia de hemolizin de ctre SGB. S-a determinat i faptul c atunci cnd inflamazomul cu toate compomentele sale lipsete, oriceii sunt mai susceptibili la infecie. (Figura nr. 2) (3)

335

30. 2. 7. Rspuns imun Rezistena mpotriva infeciei streptococice are specificitate de tip. Imunitatea fa de infecia cu streptococi de grup A este legat de prezena anticorpilor specifici anti-protein M. Pentru c exist mai mult de 80 de tipuri de protein M, o persoan poate face infecii repetate cu S. pyogenes de grup A, de tipuri diferite. Structura i funcia proteinei M au fost mult studiate. Molecula are o structur de tij ncolcit care separ domeniile funcionale, permind astfel schimbarea unui numr mare de secvene n timp ce funcia este meninut. Au fost identificate dou clase majore (I i II) de protein M. Anticorpii anti-protein M pot fi identificai serologic. Deoarece exist un singur tip de toxin eritrogen, n cazul infeciei streptococice care duce la scarlatin imunitatea dup boal este durabil, meninndu-se eventual chiar i pentru toat viaa. n cursul infeciilor streptococice apar anticorpi anti-streptolizin O; acetia pot fi identificai prin teste serologice (ex. reacia ASLO). Titrul anticorpilor poate fi util n diagnosticarea bolilor streptococice i poststreptococice. 30. 2. 8. Caractere de patogenitate Proteina F are rol de adezin (se leag de fibronectina celulelor gazdei) i are un rol n invazivitate. Proteina M reprezint cel mai important factor antigenic i de patogenitate pentru streptococul beta-hemolitic din grupul A. Proteina M apare ca o excrescen la nivelul peretelui celular. Proteina M formeaz structuri fibrilare care se extind cu 50-60 nm n afara celulei bacteriene, fiind ancorate cu cealalt extremitate n membrana citoplasmatic (exist un grad de omologie cu proteina A stafilococic). S-a dovedit experimental c atunci cnd proteina M este prezent, streptococii sunt viruleni. n absena anticorpilor specifici de tip anti-protein M, streptococii sunt capabili s reziste fagocitrii de ctre leucocitele polimorfonucleare. Proteina M este implicat i n aderarea la celulele epiteliale ale gazdei. Streptococii de grup A lipsii de proteina M sunt aviruleni. Se pare c proteina M i probabil i alte antigene streptococice au un rol important n patogeneza febrei reumatice (reumatismului articular acut). Domeniile antigenice conservate din proteinele de clas M (n special clasa I) reacioneaz ncruciat cu structuri ale muchiului cardiac uman. Alte tipuri M au similariti cu miozina, keratina sau -tropomiozina. Unele tulpini de S. pyogenes formeaz o structur capsular compus din acid hialuronic i produc colonii mucoide pe geloz-snge (materialul capsular nu este imunogenic); poate avea rol n virulena anumitor tulpini. Hialuronidaza faciliteaz rspndirea microorganismelor infectante. Difosfopiridin nucleotidaza este o enzim elaborat i eliberat n mediu de unii streptococi; aceast substan permite microorganismului s distrug leucocitele. Toi streptococii piogeni produc C5a peptidaz, o serin-proteaz care scindeaz componenta C5a (rezultat n cascada sistemului C). C5a este unul dintre principalii factori care atrag PMN la sediul procesului infecios. Toxina eritrogen, elaborat numai de ctre streptococii beta-hemolitici din grupul A lizogenizai, este implicat n patogenia erupiei din scarlatina streptococic.

30. 3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produse Streptococii sunt potenial implicai ntr-o mare varietate de boli. n principal patogenitatea lor se datoreaz multiplicrii i capacitii de invazivitate. 336

Proprietile biologice ale microorganismelor infectante, natura rspunsului gazdei i poarta de intrare a infeciei au o mare influen asupra tabloului clinic. Infeciile streptococice ar putea fi grupate astfel mai multe categorii.

30. 3. 1. Boli invazive datorate streptococilor piogeni Tabloul clinic este determinat de poarta de intrare. n fiecare caz poate aprea o extindere rapid i difuz a infeciei de-a lungul cilor limfatice, nsoit de o supuraie minim. Infecia se poate extinde la nivel circulator. n aceast categorie se pot include

Erizipelul- apare atunci cnd poarta de intrare este reprezentat de tegument (form particular de celulit); este caracterizat prin leziuni lucioase, eritemtoase, indurate, sub forma unei plci cu margini distincte; adesea este cauzat de streptococii de grup A i mai rar de grupurile C sau G. (Fotografia nr. 2) Febra puerperalse dezvolt n cazul unei infecii streptococice intrauterine. Sepsisul streptococic - n 1992, American College of Chest Physicians i Society of Critical Care Medicine (ACCP/SCCM) au elaborat cteva criterii care pot orienta medicul spre a pune diagnosticul de sepsis, criterii care au fost revizuite n 2001. (Tabelul nr. 2) (4) Infeciile osoase i articulare; Fasciita necrotizant- inocularea poate fi de la nivelul pielii sau de la nivel intestinal. Prevalen este mai ridicat la persoanele ce folosesc droguri pe cale intravenoas. Este cunoscut i drept gangrena streptococic, streptococul primind (n mass-media) numele de bacteria mnctoare de carte. Aceast entitate clinic poate avea determinare polimicrobian, cu flor aerob i anaerob, incluznd i Clostridium perfringens, Bacteroides spp. Cnd infecia se localizeaz la nivelul perineului se numete gangrena Fournier. Tabloul clinic include: febr, durere foarte intens, eritem, tromboz la nivelul microvascularizaiei care conduce la necroz, gangren, oc si insuficien renal. n multe dintre cazuri evoluia este nefast, spre exitus. (Fotografia nr. 3) Meningita etc.

30. 3. 2. Boli localizate n acest grup sunt incluse:

Faringita streptococic care este cea mai obinuit infecie datorat streptococilor betahemolitici. Streptococii viruleni de grup A ader la epiteliul faringian prin intermediul acidului lipoteichoic. Fibronectina glicoproteic de la nivelul celulelor epiteliale servete probabil ca ligand pentru acidul lipoteichoic. Extinderea la nivel amigdalian i eventual la nivelul altor structuri poart numele de angin streptococic. Boala se manifest cu durere n gt, rinofaringit, amigdalit roie i purulent (pultacee), ganglioni limfatici cervicali mrii i dureroi, febr (39-40C). Poate avea loc (n special la copiii mici) extinderea infeciei ctre urechea mijlocie, mastoid i meninge. De menionat c circa 10-20% din infecii pot fi asimptomatice. (Figura nr. 4) Impetigo streptococic reprezint o infecie localizat la nivelul straturilor superficiale ale pielii, n special la copii. La majoritatea pacienilor nu se gsete o leziune 337

predispozant. Totui, amintim ca factori de risc generali mediul umed i igiena deficitar. Clinic avem de-a face cu vezicule, pustule sau bule ce se rup i formeaz o crust glbuie, durere uoara sau disconfort i prurit. (Figura nr. 5) Celulita streptococic (aa cum tim, poate fi i stafilococica) este o infecie acut a pielii i esutului subcutan. Clinic, pacientul se prezint cu durere, eritem ce se extinde rapid, edem, febr, limfadenopatie regional. Cel mai adesea este cauzat de S. pyogenes (infecie difuz, rapid progresiv datorat enzimelor secretate) dar la pacienii diabetici este ntlnit i S. agalactiae. Infecia apare mai des la nivelul membrelor inferioare, tipic unilateral. Peteiile sunt adesea ntlnite, se pot dezvolta vezicule i bule ce se pot rupe. (Figura nr. 6) Pneumonia poate fi rapid progresiv i sever; de obicei apare ca o complicaie, n urma unei infecii virale (de exemplu grip, pojar etc.; infecia cu virusul sinciial respirator la copilul mic poate fi urmat de asemenea de o pneumonie streptococic). Endocardita infecioas poate fi acut sau subacut. n cazul endocarditei acute, n cursul bacteriemiei streptococii pot coloniza valvele cardiace normale sau lezate anterior. Distrugerea rapid a valvelor, n lipsa tratamentului antibiotic corespunztor i uneori a protezrii valvulare, evolueaz frecvent spre un deznodmnt fatal n zile sau sptmni. Endocardita subacut implic mai frecvent valvele anormale (malformaii congenitale, leziuni reumatice sau aterosclerotice).

30. 3. 3. Boli datorate producerii de toxine

Sindromul de oc toxic streptococic, foarte asemntor celui produs de ctre S. aureus, aprut datorit eliberrii de toxine. Mortalitatea este mai ridicat ca n cazul sindromului stafilococic. n majoritatea cazurilor duce la sindrom de detres respiratorie acut i mai rar la o reacie cutanat cum este cazul S. aureus. Are un debut brusc, febr 39-40,5C, hipotensiune, eritem difuz macular, coagulopatie, leziuni hepatice. Atunci cnd streptococii sunt lizogenizai (infectai cu un bacteriofag specific), produc toxin eritrogen. Dac pacientul nu are imunitate antitoxic apar erupia caracteristic i scarlatina. Antitoxinele fa de toxina eritrogen previn apariia rash-ului (dispare la presiune, apare mai ales pe abdomen i torace lateral, iniial ca papule mici apoi ca linii ce dureaz 2-5 zile), dar nu interfer cu infecia streptococic.

30. 3. 4. Bolile poststreptococice Bolile poststreptococice includ reumatismul articular acut (RAA), cardita reumatismal i glomerulonefrita acut poststreptococic (GNA). Dup o infecie acut cu streptococi beta-hemolitici de grup A urmeaz o perioad de laten (circa 1-4 sptmni), dup care se pot dezvolta bolile poststreptococice. Perioada de laten sugereaz faptul c boala poststreptococic nu se datoreaz efectului direct al diseminrii bacteriene, ci reprezint un rspuns n cadrul unei stri de hipersensibilitate care urmeaz unor infecii repetate, netratate sau tratate necorespunztor, cu streptococi piogeni, beta-hemolitici, din grupul A. 30. 3. 4. 1.Glomerulonefrita acut poate aprea la circa 3 sptmni dup infecia streptococic (adesea tegumentar), n special dat de tipurile 12, 4, 2, 49, 59-61. Glomerulonefrita se datoreaz unui mecanism de hipersensibilitate de tip III, prin producerea n 338

exces de complexe imune antigen-anticorp, care circul i se depun la nivelul membranei bazale glomerulare. Toi glomerulii sunt afectai, mari i infiltrai cu PMN, monocite i eozinofile. n nefrita acut apar hematurie microscopic i macroscopic, proteinurie pna la sindrom nefrotic, edeme la nivelul feei (ex. periorbitale), hipertensiune arterial, retenie de uree, oligurie i anurie, ascit, congestie sistemic (dispnee, tuse, staz n jugulare, cardiomegalie, galop, edeme); nivelul complementului seric este sczut. 30. 3. 4. 2.Reumatismul articular acut (RAA) reprezint cea mai serioas sechel a infeciei streptococice (tegumentar dar mai ales respiratorie - la care par s fie predispui cei cu grupa de snge A II), deoarece duce la afectarea valvelor i a muchiului cardiac. Anumite tipuri de streptococi de grup A conin antigene care reacioneaz ncruciat cu structuri din esutul cardiac uman sau cu structuri de la nivelul ganglionilor bazali. RAA este precedat de o infecie streptococic. n patogenia RAA sunt incluse toate tipurile de hipersensibilitate, n special cele de tip II (citotoxic) i de tip IV (mecanism celular / ntrziat), dar i fenomene autoimune. Semnele i simptomele specifice din RAA includ febr, poliartrit migratorie i semne legate de inflamaia la nivel cardiac (cardita reumatismal). (Tabelul nr. 3) Nu dorim s intrm n toate detaliile care vor fi studiate n cadrul modulului de cardiologie, dar dorim s punctm cteva aspecte. RAA este o boal inflamatorie acut neinfecioas, nesupurativ. Apare n comuniti aglomerate, nivel economic sczut, igien precar, alimentaie defectuoas, tulburri de imunitate. Incidena maxim a fost nregistrat la grupele de vrst 5-15 ani. Nu exist predispoziie de sex dar leziunile cardiace sunt diferite n funcie de sex.

30. 4. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Streptococcus pyogenes Diagnosticul de laborator este n mod uzual bacteriologic (direct) i include n mod necesar recoltarea i transportul (n maxim 2 ore) produsului patologic, cu examinarea microscopic a acestuia, cultivarea de obicei pe geloz-snge i identificarea pe baza caracterelor morfologice, de cultur, biochimice i antigenice a microorganismelor din coloniile izolate. Antibiograma nu este, n general, necesar deoarece streptococii piogeni i menin sensibilitatea la penicilin. Dei cultivarea rmne metoda standard n diagnostic, datorit faptului c rezultatul este obinut abia dup circa 18 ore, au fost puse la punct teste rapide, care pot identifica antigenele streptococice n circa 10 minute (extracie enzimatic urmat de latex aglutinare n prezena anticorpilor specifici pentru grupul A). Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de streptococii piogeni alegem faringita streptococic. n vederea confirmrii unei boli poststreptococice vom discuta reacia ASLO (vezi i capitolul 22).

30. 4. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic 30. 4. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic, direct, n faringita streptococic.

339

1. Recoltarea i transportul produsului patologic, secreia purulent de la nivelul faringelui, trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie, recoltarea se face preferabil dimineaa nainte ca pacientul s mnnce i fr s se fi splat pe dini, fr s fi utilizat gargarisme cu diferite soluii, iar dac aceste condiii nu au fost respectate, recoltarea se va face dup minim 4 ore etc.) (vezi i anexa nr. 6). Produsul recoltat trebuie prelucrat ct mai repede posibil, ns n nici un caz nu trebuie s treac mai mult de 2-3 ore de la recoltare pn la cultivare (preferabil 1-2 ore). n cazul n care se estimeaz depirea acestui interval de timp trebuie folosit un mediu de transport, ex. mediul Stuart (vezi i anexa nr. 2). Chiar i n aceast situaie, nu ar trebui s treac mai mult de 24 de ore pn la prelucrarea p.p. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel faringian, prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena cocilor Gram-pozitivi aezai separat, n perechi sau n lanuri, dar i a altor tipuri de microorganisme. Examenul microscopic al p.p. are doar un rol orientativ. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i anexa nr. 2). Streptococii piogeni sunt germeni pretenioi care nu se dezvolt pe medii de cultur obinuite. Mediul cel mai frecvent folosit este agar-snge, pe care cultura apare n 18-48 ore, la 35-37C. n cazul n care nu remarcm apariia de colonii caracteristice dup 24 de ore, reincubm placa Petri pentru nc o zi. Coloniile au aspect de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, nconjurate de o zon de -hemoliz (zon clar de hemoliz, cu un diametru mult mai mare dect diametrul coloniei). n cursul nsmnrii, pe cel puin una dintre laturile poligonului descris trebuie s realizm i o nepare a mediului n aa fel nct inoculul s ajung mai n profunzime. Aceast manevr (exist i alte variante tehnice) este necesar pentru a permite activitatea hemolizinei O (hemolizina O este inactivat n prezena oxigenului). Speciile care produc material capsular, din acid hialuronic, adeseori dau natere unor colonii mucoide (de tip M). Se pot folosi pentru cultivare i medii selective (de ex. agar-snge plus trimetoprim-sulfametoxazol). 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:

Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1m. Se divid ntr-un plan perpendicular pe axa lor lung i se pot dispune n lanuri (de pn la 50 elemente). Lungimea lanurilor variaz i este condiionat de factori de mediu. Caractere de cultur: Produc colonii de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, nconjurate de o zon de -hemoliz sau colonii de tip M. Caractere biochimice:

- Streptococii piogeni produc hemoliz de tip beta. - Prin testul PYR este identificat sinteza pirolidonil-amidazei (actualmente exist i teste comerciale, rapide, pentru testul PYR). - Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibat de bacitracin (antibiotic produs de Bacillus licheniformis). Se apreciaz c dintre tulpinile de Streptococcus pyogenes, mai puin de 340

1% sunt rezistente la bacitracin (vezi anexa nr. 2). - Streptococii piogeni sunt rezisteni la trimetoprim-sulfametoxazol.

Caractere antigenice: o Se pot utiliza teste comerciale pentru detectarea rapid a polizaharidului specific de grup A al streptococilor piogeni n p.p., dup extracie chimic sau enzimatic (ex. cu pronaz). Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea indirect (latexaglutinare), coaglutinarea sau ELISA. o Prin reacii de aglutinare (latexaglutinare, coaglutinare) pe lam, sau precipitare se pot determina antigenele streptococice de grup (Lancefield) sau de tip. o S. pyogenes este mprit n serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste 100 de serotipuri) prin reacia de precipitare n tuburi capilare i T (peste 28 serotipuri) prin reacia de aglutinare pe lam. Aceste testri se fac n centre de referin. Alte teste utilizate n identificare: o Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea direct a streptococilor de grup A n exsudatul faringian. o Dup amplificare genic (PCR) pot fi identificate secvenele genetice care codific pentru diferitele tipuri de protein M (genele enm). Au fost descoperite peste 120 de secvene genetice diferite, aceast metod fiind mai discriminativ n comparaie cu metoda clasic, de tipizare a S. pyogenesi tinde s completeze i eventual s nlocuiasc aceast metod. o Relativ recent a fost propus tehnica MLST (multilocus sequence typing), accesibil unorcentre de referin.

5. Streptococii piogeni i menin sensibilitatea cunoscut la penicilin (au fost identificate n ultima perioad tulpini tolerante, care sunt inhibate dar nu distruse de ctre penicilin, 2003). Pentru pacienii cu hipersensibilitate ("alergici") la beta-lactamine se poate alege pentru tratament eritromicina, dar au fost identificate tulpini rezistente la acest medicament antimicrobian i n acest caz antibiograma devine necesar. n general antibiograma se realizeaz n scop epidemiologic, pentru supraveghere i cercetare. 30. 4. 2. Diagnosticul de laborator serologic 30. 4. 2. Diagnosticul de laborator serologic Diagnosticul imunologic al infeciilor produse de streptococii -hemolitici din grupul A ar putea consta din investigarea fie a rspunsului imun umoral (prezena i titrul anticorpilor, n cadrul diagnosticului serologic), fie a rspunsului imun de tip celular. n continuare nu vom discuta dect diagnosticul serologic, care are importan practic. Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA, GNA), identificarea unei eventuale stri de hipersensibilitate, diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice, evaluarea evoluiei clinice i eficacitii tratamentului. Pentru stabilirea diagnosticului pozitiv al RAA sau al GNA, criteriile de diagnostic sunt mai complexe, dar includ dovedirea prin metode de laborator a unei infecii streptococice n antecedente. Diagnosticul serologic se realizeaz de obicei, n Romnia, prin reacia ASLO, care identific titruri ale anticorpilor anti-streptolizin O (vezi i capitolul 22). Testarea se face n dinamic, pe seruri recoltate la interval de 7-10 zile. Pentru zona noastr geografic se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. 341

Este strict necesar realizarea controlului intern i extern de calitate. Tot strict necesar este evaluarea rezultatelor n contextul clinic. Exist teste serologice pentru determinarea prezenei i titrului anticorpilor fa de alte structuri antigenice (streptodornaz, hialuronidaz, streptokinaz). Titrul anticorpilor antistreptodornaz este crescut la pacienii cu infecii tegumentare i trebuie investigat dac se suspicioneaz prezena unei glomerulonefrite acute. Se pot determina i anticorpii anticarbohidrat (hemaglutinare pasiv) sau anti-MAP (prin latex aglutinare).

31. Streptococcus pneumoniae (Gabriela Loredana Popa, Marina Pan, MI Popa)

31. 1. Definiie. ncadrare Streptococcus pneumoniae se prezint sub form de coci Gram-pozitivi, alungii, lanceolai, dispui n general n diplo pe axul longitudinal, ncapsulai, nesporulai, imobili. Pneumococii sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloz-snge determin a-hemoliz, la fel ca Streptococcus viridans. Creterea i este favorizat n atmosfer de 5% CO2 la o temperatur de 37C. Streptococcus pneumoniae este unul dintre principalele microorganisme implicate n etiologia otitei medii i n alte infecii respiratorii, incluznd pneumonia. Meningita pneumococic reprezint ns o entitate nosologic redutabil. Una dintre marile probleme terapeutice decurgnd din dezvoltarea rezistenei la antibiotice o reprezint apariia pneumococilor rezisteni la penicilin i alte medicamente antimicrobiene. Gravitatea acestei situaii rezult din incidena crescut a pneumoniilor pneumococice (40 50% din etiologia pneumoniilor comunitare) i din valorile extrem de alarmante ale incidenei tulpinilor de pneumococi penicilino - rezisteni (20-40% din tulpinile izolate n Europa Occidental sau n America de Nord), uneori cu multirezisten la antibiotice.

31. 2. Caractere generale 31. 2. 1. Habitat Pneumococii se pot izola de la persoane sntoase, fcnd parte din flora normal a tractului respirator superior (n special bucal, nazal i faringian). Cu toate c frecvena portajului orofaringian este estimat la 30-70%, n recentul studiu la care au participat n mod voluntar colegii tineri aflai n finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), nu am identificat nici un purttor de Streptococcus pneumoniae. 31. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt coci Gram-pozitivi, alungii, lanceolai, dispui n general n diplo, ncapsulai (cu o capsul comun), imobili, nesporulai. n coloraia cu albastru de metilen, capsula apare ca un halou n jurul pneumococilor. Utiliznd anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapid inclusiv direct, pe produsul patologic (de exemplu sput), prin reacia de umflare a capsulei. 342

31. 2. 3. Caractere de cultur Pneumococii sunt germeni pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloz-snge formeaz colonii de tip S sau de tip M, nconjurate de o zon de a-hemoliz (la fel ca Streptococcus viridans). Multiplicarea este favorizat n atmosfer de 5% CO2 la o temperatur de 37C. Glucoza reprezint principala surs de energie pentru pneumococi. Acetia elaboreaz enzime zaharolitice, proteolitice i lipolitice. n mediile de cultur lichide pneumococii tulbur omogen mediul. 31. 2. 4. Caractere biochimice Glucoza reprezint principala surs de energie pentru pneumococi. Acetia elaboreaz enzime zaharolitice, proteolitice i lipolitice. Fermentarea inulinei reprezint un caracter biochimic important, util n diferenierea pneumococilor de S. VIRIDANS (ambele tipuri de streptococi producnd pe geloz-snge o hemoliz de tip viridans). Produc enzime autolitice. Autoliza este indus i accelerat de bil, sruri biliare, acizi biliari; testul este util n identificarea pneumococilor (testul bilolizei, Neufeld). Sunt sensibili la optochin (etil-hidro-cuprein), sensibilitatea la aceast substan fiind de asemenea util n identificare i diferenierea de Streptococcus viridans. 31. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Pneumococii pot supravieui cteva luni n sput uscat, la ntuneric. n mediul extern rezistena lor este sczut. n timp, microorganismele devin Gram-negative i tind s se lizeze spontan.Autoliza pneumococilor este intensificat de agenii tensioactivi de suprafa. 31. 2. 6. Structur antigenic La nivelul peretelui exist un polizaharid specific de grup, comun tuturor pneumococilor. Polizaharidul C include acidul teichoic (legat de peptidoglican). Cel mai important determinant antigenic i patogenic este capsula polizaharidic (antigenul K), ce protejeaz pneumococul fa de fagocitoz i permite invazivitatea. Structura polizaharidului capsular este specific fiecrui serotip n parte. Pn n prezent au fost identificate peste 90 de serotipuri capsulare diferite, a cror structur a fost determinat pentru majoritatea serotipurilor. Exist dou sisteme diferite folosite pentru clasificarea tipurilor capsulare. Sistemul american a numerotat tipurile capsulare n ordinea descoperirii acestora. Sistemul danez grupeaz mai multe tipuri antigenic nrudite. Spre exemplu, grupul 19 din clasificarea Statens Serum Institute grupeaz tipurile 19A-C i 19F, care n sistemul american de clasificare erau numerotate cu 19, 57, 58 i respectiv 59. Au fost produse seruri specifice anticapsulare polivalente i monovalente, utile n identificarea pneumococilor cu ajutorul reaciei de umflare a capsulei. Este descris i acidul lipoteichoic numit i antigen F (Forsman); anticorpii fa de antigenul F reacioneaz ncruciat cu polizaharidul C de la streptococii piogeni. Fosfocolina (FC) se gsete att n acidul lipoteichoic, ct i n acidul teichoic parietal. Prezena reziduurilor de FC este necesar att n diviziune, n fenomenul de autoliz, ct i n fenomenul genetic de transformare. FC are i rol de adezin (se leag de choline-binding proteins de pe suprafaa celulelor gazdei).

343

Toi pneumococii secret IgA1 proteaz (una dintre Zn-proteinazele produse de S. pneumoniae). 31. 2. 7. Rspuns imun Imunitatea fa de infecia pneumococic are specificitate de tip i depinde att de anticorpii care apar mpotriva polizaharidului capsular, ct i de funcia fagocitelor. Vaccinarea induce producerea de anticorpi fa de polizaharidul capsular. 31. 2. 8. Caractere de patogenitate S. pneumoniae este un microb condiionat patogen care, atunci cnd este implicat n patologia uman, se manifest prin multiplicare i invazivitate. Virulena pneumococilor depinde de capsul, care confer rezistena la fagocitoz. Un ser care conine anticorpi mpotriva polizaharidelor specifice de tip protejeaz mpotriva infeciei. Dac un astfel de ser este absorbit cu polizaharide specifice de tip i pierde puterea protectoare. Ali factori de patogenitate ar fi reprezentai de: - IgA1 proteaz; - hemolizina intracelular (pneumolizina), eliberat prin autoliz (inhib chemotactismul pentru PMN, inhib proliferarea limfocitelor i sinteza de anticorpi); - proteinele de suprafa (PspA) care au unele asemnri cu proteina M de la S. pyogenes; - neuraminidazele (NanA i NanB) i hialuronidaza. Deoarece circa 30-70% din oameni pot fi la un moment dat purttori de pneumococi, mucoasa respiratorie normal are un grad important de rezisten natural fa de aceste microorganisme. Printre factorii care predispun la infecie ar fi de menionat: - anomalii constituionale sau dobndite ale tractului respirator (infecii virale, alergii locale, obstrucii bronice, afectri ale tractului respirator datorate unor substane iritante etc.); - intoxicaia cu alcool sau droguri, care deprim activitatea fagocitar i reflexul de tuse; - consumul de tutun (fumatul); - malnutriia, debilitatea general, hiposplenismul sau deficienele sistemului complement.

31. 3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produse n majoritatea infeciilor pneumococice exist o faz iniial bacteriemic, perioad n care microorganismul ar putea fi izolat prin hemocultur. Pneumococul este patogen prin multiplicare i invazivitate, conducnd la apariia unor variate infecii ale tractului respirator superior i inferior, ale urechii medii, ale sinusurilor, dar i alte infecii produse prin diseminare hematogen (ex. meningit, endocardit, care pot fi foarte grave). Pneumonia pneumococic se nsoete de prezena edemului alveolar i a unui exsudat fibrinos, urmat de apariia de hematii i leucocite. n exsudat se identific prezena a numeroi pneumococi. Debutul pneumoniei este adesea brusc, cu febr mare, frison, junghi toracic. Sputa caracteristic este ruginie (semn patognomonic). Aspectul radiologic este caracteristic atunci cnd este prins un singur lob i const ntr-o opacitate cu aspect triunghiular, cu baza la periferie i vrful ctre mediastin (pneumonie franc lobar). 344

32. Genul Neisseria. Neisseria meningitidis. Neisseria gonorrhoeae (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)

32. 1. Definiie. ncadrare Familia Neisseriaceae include mai multe genuri, spre exemplu Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Kingella. n genul Neisseria, speciile importante pentru patologia uman sunt N. meningitidis (meningococul) i N. gonorrhoeae (gonococul), dar se pot aminti i N. lactamica, N. sicca, N. subflava, Neisseria bacilliformis etc. Exist i o specie (N. elongata) n care tulpinile au aspect cocobacilar i sunt oxidaz-negative (1). Pe baza studiilor filogenetice, speciile Neisseria au fost clasificate n cinci grupe i anume: N. meningitidis, N. flavescens, N. cinerea, N. pharyngis i N. elongata (12 specii n total). Anterior, Moraxella (Branhamella) catarrhalis aparinea genului Neisseria; studii de genetic molecular au demonstrat c exist diferene ntre aceste microorganisme.

32. 2. Caractere generale 32. 2. 1. Habitat. Caractere fiziologice N. lactamica a fost evideniat la nivel nazal sau faringian n cazul a 3-40% din purttorii sntoi. Studii epidemiologice arat c prezena acestei bacterii poate avea efecte favorabile (nregistrndu-se activitate bactericid seric ndreptat mpotriva N. meningitidis; studiul s-a efectuat iniial pe oricei, ulterior pe oameni). Cu toate c este improbabil realizarea unui vaccin cu tulpini vii de N. lactamica, nelegerea mecanismului inducerii unei imunitai ncruciate i a activitaii serice bactericide ar putea util pentru studiile legate de vaccin. (2, 3) Marea majoritate a speciilor din genul Neisseria sunt coci Gram negativi. n urm cu caiva ani se considera c N. elongata este singura specie de origine uman cu aspect bacilar. Totui, un studiu publicat de Journal of Clinical Microbiology n 2006 raporteaz izolarea i caracterizarea a 8 tulpini bacilare de Neisseria de la pacieni cu infecii localizate fie la nivelul cavitii orale, fie la nivelul tractului respirator. Dou dintre ele au fost izolate din snge. Din punct de vedere genetic asemnarea era de <96% cu celelalte specii din gen. Analiza acizilor grai celulari a artat o similaritate mare. Microorganismele sunt Gram negativ si msurau 0.6m /1.3-3.0m. Cresc pe geloz-chocolate. Sunt oxidaz pozitivi, indol negativi i nu produc acid la fermentarea cu dextrozei, lactozei, maltozei i sucrozei. Aceste teste au dus la concluzia c se poate descrie o specie nou, denumit Neisseria bacilliformis. (4) Moraxella catarrhalis a fost identificat n flora normal a tractului respirator superior, la 4050% din copiii de vrst colar sntoi i la circa 5% dintre aduli, dar poate fi implicat i ntro serie de infecii (bronite, traheobronite, pneumonii, sinuzite, otite, conjunctivite), n special la gazde cu deficiene ale capacitii de aprare. Exist studii care estimeaz c un procent de circa 15% din otitele medii ar fi produse de Moraxella catarrhalis. Speciile de Moraxella sunt de regul Gram-negative (totui, exist elemente care rezist decolorrii cu alcool-aceton). M. catarrhalis a aparinut iniial genului Neisseria, ulterior genului Branhamella, astzi fcnd parte 345

din genul Moraxella. Sunt coci Gram-negativi, dispui n diplo, dar pot forma i lanuri scurte. Se pot dezvolta att la 35-37C ct i la 28-30C. Pot forma colonii pe medii care conin colistin. Dac n urm cu 35 de ani prezenta sensibilitate la penicilin, actualmente se cunoate faptul c produce -lactamaz (3 tipuri enzimatice diferite); prezint, de regul, rezisten la penicilin, ampicilin, meticilin, clindamicin i vancomicin. Este unul dintre micro-organismele care, alturi de S. pneumoniae i tulpinile ne-tipabile de H. influenzae, este studiat n vederea producerii unui vaccin care s previn apariia otitei medii. N. gonorrhoeaese poate gsi la nivelul mucoaselor genitale la gazdele infectate (indiferent dac infecia este sau nu simptomatic). A fost remarcat pentru prima dat de Albert Neisser (1879): coci intra-leucocitari la examenul secreiei purulente din uretra masculin, la pacieni cu gonoree. Cultivarea a fost realizat cu 3 ani mai trziu. Cea mai recent definit subspecie de N. gonorrhoeae a fost identificat n secreii conjunctivale (N. gonorrhoeae subspecia kochii). Nivele crescute de Lactobacillus, genul dominant n microbiota vaginal, au fost evideniate n strns legtur cu un risc sczut de infectare n urma expunerii la N. gonorrhoeae. Lactobacillus scade aderena N. gonorrhoeae cu pn la 50% i inhib invazia celulelor epiteliale cu pn la 60%. Mai mult dect att, lactobacilii au posibilitatea s disloce gonococii aderai ceea ce ne poate conduce cu la ideea c ar putea ajuta la profilaxia postexpunere. (5) N. meningitidis a fost izolat la persoane sntoase de la nivel nazal sau faringian. La pacienii cu meningit meningococic, germenul se multiplic n lichidul cefalorahidian (LCR). A fost izolat pentru prima dat n anul 1887 din LCR de la un pacient cu meningit acut. n prima decad a secolului 20 meningita meningococic netratatat avea o rat a mortalitaii de 75-80%. n 1913, Simon Flexner a fost primul care a gndit o form de terapie folosind serul antimeningococic cabalin intratecal. Mortalitatea a fost redus la 31% pe un lot de 1.300 pacieni. n perioada 1928-1936 169 de copii au fost tratai n acest fel la spitalul Bellevue din New York iar mortalitatea a sczut la 20%. n 1930 odat cu introducerea sulfonamidelor mortalitatea a sczut la 5-15%. Totui, odata cu era antibioticelor a nceput i era rezistenei la antibiotice. (6) Att adulii ct i copiii pot fi colonizai de mai multe specii de Neisserii, n acelai timp (de ex. Neisseria spp. nepatogene i N. meningitidis). Neiseriile saprofite / comensale au fost descrise pentru prima dat n 1906, purtnd iniial alte denumiri. Ceea ce este relativ interesant, N. flavescens (1930) i N. lactamica (1969) au fost izolate din LCR, motiv pentru care se presupune c pot determina meningit. Ultima specie de Neisseria a fost definit n 1993, drept N. weaweri (numele iniial fiind grupul CDC M-5; de origine canin i rar izolat din rnile pacienilor mucai de cini). n continuare vor fi prezentate doar dou dintre speciile enumerate, respectiv N. gonorrhoeae i N. meningitidis, microorganisme cu necesiti nutritive complexe i care se pot dezvolta doar la 35-37C. 32. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Att meningococul ct i gonococul sunt diplococi Gram-negativi, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun, cu o structur de polifosfat sau polizaharid-polifosfat (n cazul meningococului), situaie n care capsula este mai evident. (Figura nr. 1 i Figura nr. 2) n funcie de structura capsulei exist mai multe serogrupuri. 32. 2. 3. Caractere de cultur Ambele microorganisme au nevoie n vederea izolrii de utilizarea unor medii de cultur mbogite, necesitile nutritive fiind mult mai mari n cazul gonococului (exist tulpini de meningococ care se pot dezvolta pe medii simple, cu sruri minerale, lactat i aminoacizi). Principial se pot multiplica n cazul folosirii mediului Mueller-Hinton (amintit i la antibiograma difuzimetric), la o temperatur de incubare de 35-37C i n condiiile unei atmosfere de 3-10% CO2. (Figura nr. 3, exsicatorul) Gonococul nu se multiplic n lipsa unor surse energetice (glucoz, piruvat, lactat). Coloniile apar n 24-48 de ore, mai rapid n cazul meningococului.

346

Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M, nepigmentate, transparente sau opace. Este de remarcat faptul c n aceeai plac pot aprea pn la cinci tipuri de colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita identificarea. Placa este eliminat n cazul n care nu se dezvolt colonii dup 72 de ore. Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1 mm. Tulpinile ncapsulate (A, C) pot conduce la apariia unor colonii de tip M. 32. 2. 4. Caractere biochimice Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Spre exemplu, gonococul poate metaboliza glucoza (nu i maltoza), n timp ce meningococul metabolizeaz ambele zaharuri menionate. (Figura nr. 4) Produc citocrom-oxidaz, ceea ce reprezint un test cheie n identificare; se utilizeaz de exemplu benzi de hrtie de filtru mbibat cu reactiv, respectiv tetrametil-p-fenilendiamin. Reacia pozitiv apare n circa 10 secunde (vezi i anexa nr. 2). (Figura nr. 5) 32. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Neisseriile implicate n patologia uman sunt foarte sensibile la uscciune, lumin solar i la variaii de temperatur, precum i la majoritatea antisepticelor i dezinfectantelor. Produc enzime autolitice. 32. 2. 6. Structur antigenic n cazul germenilor Gram-negativi, la nivelul membranei externe se gsete lipopolizaharidul (endotoxina). Spre deosebire de lipopolizaharidul (LPZ) din structura enterobacteriilor, care conine multiple uniti repetitive, neisseriile au lanuri zaharidice scurte, motiv pentru care denumirea corect ar fi cea de lipooligozaharid (LOZ). n funcie de structura lipooligozaharidului exist mai multe serotipuri, 6 n cazul gonococului i 12 n cazul meningococului. Gonococii pot exprima simultan mai multe structuri antigenic diferite. Lipopolizaharidul (lipooligozaharidul) a fost denumit i endotoxin, deoarece este eliberat din perete dup distrugerea germenilor. Lipooligozaharidul se fragmenteaz n lipidul A (responsabil pentru toxicitate) i respectiv n polizaharidul (oligozaharidul) O. Neisseria gonorrhoeae n cazul gonococului heterogenitatea antigenic este remarcabil. Acest microorganism este capabil s i modifice structurile de suprafa in vitro (probabil i in vivo), evitnd mecanismele de aprare ale gazdei. Ar fi de menionat i urmtoarele structuri antigenice: - pilii, cu rol n ataarea de celulele gazdei, care protejeaz gonococul fa de fagocitoz i au o structur proteic. Captul C-terminal are o structur variabil. Pilinele difer de la o tulpin la alta i chiar n cazul aceleai tulpini (exist sute de tipuri de piline posibile). Exist i pili cu rol n procesul de conjugare genetic; - mai multe tipuri de proteine, spre exemplu porinele (proteina I), care formeaz pori la suprafaa celulei bacteriene. Fiecare tulpin prezint un tip de porin, dar porinele difer de la o tulpin la alta. Aceast structur este util pentru serotiparea gonococilor. Proteina II (OPA) este identificat la tulpinile care produc colonii opace i este util pentru aderarea gonococului. - proteina care leag fierul (iron binding protein) este similar ca greutate cu porinele; se exprim atunci cnd aportul de Fe este insuficient; - adezina cu greutate molecular 36 kDa; - proteina Rmp, o protein localizat la suprafaa membranei externe; are secvene care prezint omologie parial cu proteine identificate la Shigella dysenteriae sau E. coli; anticorpii anti-Rmp pot fi pui n eviden la pacieni sau convalesceni cu gonoree, la nivel sanguin sau n secreiile genitale; - IgA1 proteaza; - pseudo-capsula din polifosfat; - proteine de stres asemntoare proteinelor de oc termic Hsp60.

347

Variaia antigenic este important, cu o valoare de circa 10-3 (pentru OPA, LOZ, piline) i este util pentru eludarea mecanismelor de aprare ale gazdei. De menionat prezena anumitor plasmide implicate n rezistena la antibioticele beta-lactamice. Gonoreea apare adesea n cadrul coinfeciei cu HIV. LOZ induce imunitatea nnscut legnduse de TLR4. S-au investigat efectele LOZ din 5 tulpini diferite de Neisseria gonorrhoeae asupra infeciei HIV i a provirusului din macrofage. Macrofagele care conineau LOZ au devenit rezistente la infecia HIV i la provirus. (7) Neisseria meningitidis n cazul meningococului, pe lng LOZ mai este important de menionat structura capsular, care permite subdivizarea speciei n 13 serogrupuri. Dintre aceste grupuri serologice (notate cu litere), mai importante datorit implicrii n patologie sunt grupele: 29E, A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z i W-135. Vaccinurile conin numai o parte dintre aceste antigene. Att pilii, ct i tipurile de proteine menionate mai sus sunt prezente i n cazul meningococului (piline de clasa I i II, porine de clasa 1, 2 i 3, proteina Rmp, proteina OPA de clas 5 etc), ns fr fenomenele de variaie antigenic (genetic) menionate. 32. 2. 7. Rspuns imun n infeciile cu gonococ apare un rspuns imun, dar datorit fenomenelor prezentate mai sus, practic nu exist imunitate postinfecioas; aceeai persoan poate face infecii repetate. n cazul meningococului, imunitatea este asociat cu prezena seric a anticorpilor anticapsulari, anti-lipooligozaharid i anti-membran extern, care apar dup infecii subclinice. Nou-nscuii sunt n general protejai datorit anticorpilor de tip IgG provenii de la mam. Infeciile meningococice reprezint o problem n special pentru persoanele care au un deficit al sistemului complement (mai ales componentele C6-C9). LCR conine molecule implicate n imunitatea nnscut (ex. sistemul complement), molecule eseniale n controlul infeciei i n activarea infiltrrii cu fagocite (neutrofile, monocite). Totui, celulele epiteliale ale stratului ependimal care intr n structura tubului neural sau ale plexului coroid ar putea fi foarte vulnerabile la atacul citotoxic i citolitic al componentelor complementului. Un studiu publicat n 2006 (8) a artat capacitatea celulelor epiteliale cerebrale de a exprima la nivelul membranei receptori pentru reglarea activitii complementare (CD35, CD46, CD55, CD59). Prin studii de dubl imunofluorescen pentru markeri ai celulelor ependimale (GFAp, S100, ZO-I) i ai receptorilor pentru reglarea complementului s-a ajuns la concluzia c aceste celule au o cantitate mare de CD55 i CD59 i mai mic de CD46 i CD35. La nivel tisular s-a observat c CD55 era slab exprimat la nivelul plexurilor coroide i celulelor ependimale de control dar exprimarea era crescut n meningit. Anti-CD59 era prezent la nivelul ambelor epitelii n timp ce CD59 a fost identificat doar la nivelul plexurilor coroide inflamate. CD46 i CD35 nu au fost identificate n esuturile de control. Pe de alt parte, n meningit aceste molecule erau puternic exprimate. Acest studiu arat posibilitatea structurilor cerebrale de a raspunde i susine imunitatea nnscut mediat de complement. (8) Anumite defecte ale sistemului complement au fost asociate cu o cretere a incidenei infeciilor cu Neisseria meningitidis. S-au fcut teste n acest sens i s-a recoltat sange i ser de la pacieni aduli care aveau deficit complet de C2 sau C5. Pacienii aveau de asemenea deficit de mannose-binding lectin (MBL). Proliferarea meningococilor introdui n snge a fost evaluat prin numrul de CFU (colony-forming unit) i prin Real-time PCR. S-a investigat activitatea bactericid seric i cea opsono-fagocitic a granulocitelor incluznd ser inactivat termic postvaccinare pentru a evalua influena anticorpilor antimeningococici. Proliferarea meningococic a fost de 2log10 pentru CFU i 4 sau 5log10 copii ADN. Proliferarea a sczut moderat dup corectarea deficitului de C2, dar dup corectarea deficitului de C5 toi meningococii au fost distrui (remarcndu-se i un titru mare de anticorpi). Activitatea opsonofagocitic a fost strict dependent de C2, a aprut n serul normal i a crescut n serul

348

postvaccinare. Activitatea bactericid seric a depins doar de C2, C5 i titrul anticorpilor. MBL nu a influenat n nici un fel aceti parametri. (9) Imunitatea adaptativ este pilonul cel mai important. esutul limfoid asociat nazofaringelui (NALT) este locul principal al rspunsului imun. LTCD4+ interacioneaz n cele din urm cu LB i duc la secreie de IgA i IgG. IgA faciliteaz clearance-ul microciliar, aglutinarea patogenilor i mpiedicarea adeziunii epiteliale precum i neutralizarea toxinelor secretate. (10) 32. 2. 8. Caractere de patogenitate n cazul ambelor microorganisme, patogenitatea se datoreaz existenei factorilor care permit ataarea de celulele gazdei, multiplicrii la poarta de intrare i respectiv capacitii de invazivitate. Prezena capsulei i a lipooligozaharidului contribuie n mod difereniat (mai important n cazul meningococului) n patogenia bolilor produse. Pentru cteva detalii, lum n discuie Neisseria meningitidis unde aderarea are loc la nivelul nazofaringelui. Acest prim pas este mediat de pili. Acetia se pare c se leag de o protein reglatoare a complementului de pe membrana celular, CD46. Pilii duc la modificri posttranscripionale n cele din urm glicozilarea acestora poate accelera detaarea bacterian de pe suprafaa celulei unde deja s-au format colonii. Prin alterearea acestui mecanism, de adeziune, bacteriile scap din agregate i pot disemina i forma noi agregate n noi locuri. (11) Pentru a particulariza doar o parte din fenomenele desfurate n cursul procesului infecios, vom lua drept exemplu infecia cu N. meningitidis. n timpul invaziei, meningococul se localizeaz preferenial n capilarele cerebrale unde viteza de curgere a sngelui este redus, la fel ca n capilarele din nazofaringe, viteza creia trebuie sa i reziste n timpul colonizrii. De asemenea, el trebuie s reziste i forelor mecanice, mucusului, rspunsului inflamator i tusei. Prin intermediul anumitor structuri pe care le deine, meningococul duce la polimerizarea actinei i auto-protecie (formarea unor structuri de protecie). n plus, meningococii formeaz la suprafaa celulei biofilme alctuite din lipide i polizaharide (evitnd astfel contactul cu sistemul imun). Procesul poate continua pe 2 ci: transcelular sau paracelular. Nu doar LOZ este util n aderare, dar i de proteinele Opa i Opc. Opc se leag de proteinele matrixului extracelular, precum vibronectina. Opa se leag de moleculele de adeziune celular a antigenului carcinoembrionar, de heparan sulfat i integrine. O alt molecul cu o importan foarte mare este TspA (T-cell stimulating protein A) care duce la proliferarea LT i LB. Nu este cunoscut bine mecanismul de aciune. Lund n discuie capsula, portajul este favorizat de pierderea capsulei (aceasta inhib aderena i formarea biofilmului), n schimb, n cursul procesului infecios prezena capsulei este necesar (11).

32. 3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produse Neisseria gonorrhoeae Infeciile gonococice continu s reprezinte o problem important de sntate public inclusiv n rile cu o economie dezvoltat (vezi i 30.3.6). Acest fapt se datoreaz i apariiei / rspndirii tulpinilor de gonococ rezistente la antibiotice/chimioterapice i existenei unui numr important de infecii asimptomatice (n special la femei). Dup ptrunderea n organismul receptiv, n funcie de calea de transmitere, gonococul se ataeaz de mucoase (genito-urinar, ocular, rectal, faringian etc.) i produce, local, o supuraie acut. n timp poate aprea invazia tisular i n consecin, instalarea unor fenomene inflamatorii cronice i apariia fibrozei (n special n cazurile netratate). La brbai apare, de regul, uretrita gonococic (manifestat prin secreie galben-verzuie, cremoas, nsoit de usturimi i dureri la miciune); n lipsa tratamentului, aceasta poate afecta prin invazie epididimul i prin fibroz poate determina apariia stricturilor uretrale. 349

n cazul sexului feminin, gonoreea se localizeaz endocervical, dar se poate extinde la nivelul uretrei, vaginului, glandelor Bartholin, trompelor uterine (n ultimul caz, cu posibilitatea apariiei unor fibroze i obstrucii care conduc la sterilitate). Dac mama are gonoree i nou-nscutul se nate pe cale natural, va aprea oftalmia gonococic (prevenit de ex. prin instilaii cu soluie de nitrat de Ag 1% n sacul conjunctival). Rareori gonococul poate disemina pe cale sanguin (bacteriemie), cu apariia unor leziuni dermice, artrite, tenosinovite gonococice etc. Neisseria meningitidis Meningococul poate produce i alte infecii, dar este important de menionat c reprezint una din primele trei cauze de meningit infecioas la aduli (alturi de Haemophilus influenzae i Streptococcus pneumoniae). Contagiozitatea este mare, dar se estimeaz c meningita meningococic apare la 1/1.000 din persoanele contaminate. n producerea meningitei sunt implicate succesiv colonizarea mucoasei respiratorii (portaj = o relaie de comensalitate ntre bacterie i gazd, fr ca gazda s prezinte vreun semn sau simptom care s ne duc cu gndul la patologie), invazia local, bacteriemia (favorizat de prezena capsulei), invazia meningeal, alterarea barierei hemato-encefalice, inflamaia n spaiul subarahnoidian i creterea presiunii intracraniene. Apariia vasculitei cerebrale i scderea fluxului sanguin la nivel cerebral reprezint factori de agravare. Activarea mai multor cascade inflamatorii (n special datorit eliberrii unor cantiti importante de endotoxin) pot conduce la instalarea unui sindrom de coagulare intravascular diseminat i la o evoluie nefast spre deces.

32. 4. Diagnostic de laborator Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) att n gonoree ct i n meningita meningococic, dar trebuie s fie orientat de examenul clinic. n cazul meningitei, de mare importan este utilizarea unor examene paraclinice complementare. 32. 4. 1. n gonoree, recoltarea produsului patologic se realizeaz difereniat (ntr-o oarecare msur) n funcie de vrst, sex i de practicile sexuale ale individului infectat. n cazul gonoreei la femei, recoltarea se va face de la nivelului colului uterin. La brbai, recoltarea se va face de la nivelul uretrei, eventual utiliznd un tampon steril uretral, introdus cu blndee circa 2 cm n uretra anterioar. Transportul trebuie realizat foarte rapid (i n condiii care s permit supravieuirea microorganismului) sau pe medii speciale de transport, dar ar fi de preferat inocularea imediat pe mediul de cultur. Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct). 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). La brbat se preleveaz secreia uretral (eventual pictura matinal), iar la femeie recoltarea trebuie efectuat pe mas ginecologic de la nivelul colului uterin i glandelor Bartholin (vezi i anexa nr. 2, A. 6. 1.). Secreiile au de obicei un aspect purulent. Este de preferat cultivarea imediat, pe medii de cultur potrivite i n atmosfer de CO2. n cazul n care p.p. urmeaz a fi transportat ctre laborator, transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o temperatur apropiat de 37C). Chiar i n cazul utilizrii mediilor de transport (ex. mediul Amies plus crbune activat), acesta nu ar trebui s dureze mai mult de 6 ore. Gonococul ar putea fi izolat i prin hemocultur, cultivarea secreiilor conjunctivale, faringiene, cultivarea urinei etc. n cazul n care nu exist nici o secreie, se poate utiliza urina care trebuie centrifugat i nsmnat imediat pe medii de cultur. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de 350

metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor, a celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocilor Gramnegativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun, situai intra sau extraleucocitar. Aspectul microscopic este acelai ca i n urm cu aproape 130 de ani. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i anexa nr. 2). Gonococii sunt germeni pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii n care se include vancomicin, colistin, trimetoprim i nistatin) sau neselective (ex. mediul GC, geloz-snge sau geloz-chocolate cu diferite suplimente nutritive; se recomand utilizarea pulberii de hemoglobin i nu a sngelui proaspt). Este preferat cultivarea n dublu, pe medii selective i neselective; n cazul n care p.p. este reprezentat de secreie de la nivelul rectului sau de secreie faringian se vor folosi numai medii selective. Este necesar o atmosfer de 3-10% CO2, la o temperatur de 35-37C. Coloniile apar n 24-48 de ore. Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M, nepigmentate, transparente sau opace. Este de remarcat faptul c n aceeai plac pot aprea pn la cinci tipuri de colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita identificarea. Placa este eliminat n cazul n care nu se dezvolt colonii, dup 72 de ore. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, eventual nconjurai de o structur capsular comun, nesporulai. Se poate utiliza i coloraia fluorescent. Caractere de cultur: Coloniile de gonococ sunt de tip S sau M (vezi punctul 3). Caractere biochimice: Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Gonococul metabolizeaz glucoza dar nu i maltoza. Produc citocrom-oxidaz, un test cheie n identificare (vezi anexa nr. 2). Testul catalazei (superoxol) este intens pozitiv. Auxotipia evalueaz necesitile nutriionale ale gonococului. Exist o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatic a Neisseriilor (ex. Quad Ferm+, RIM, Minitek, Gonochek II etc). Utiliznd galeriaAPI NH(manual) putem identifica specii de Neisseria, Haemophilus i Branhamella catarrhalis, n circa 4 ore. Caractere antigenice: n funcie de structura lipooligozaharidului exist 6 serotipuri. Gonococii pot exprima simultan mai multe structuri antigenic diferite, ceea ce creeaz probleme tehnice. Aceste testri se realizeaz n centre de referin. Prezena gonococului poate fi detectat direct n produsul patologic prin coaglutinare (suspensie de S. aureus tip Cowan I stabilizat i sensibilizat cu Ac monoclonali antiprotein I din membrana extern a gonococilor) sau printr-o tehnic imunoenzimatic, ELISA (cu Ac policlonali). Se pot utiliza Ac monoclonali cunoscui, pentru identificare gonococului prin tehnica imunofluorescenei directe. Caractere utilizate n tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate sau direct pentru p.p.: Exist diferite tehnici (imunologice, biochimice, de biologie molecular) care sunt practicate numai n centrele de referin. Metodele biologiei moleculare au att o specificitate ct i o sensibilitate foarte bun; se pot utiliza fie pornind de la culturi fie de la p.p. - Sondele nucleotidice (ADN) pot hibridiza cu ARNr extras din celulele microbiene. PCR

351

LCR (Ligase Chain Reaction); aceast metod se poate utiliza pornind de la urin sau de la secreii vaginale dar are un dezavantaj - costul. 5. Antibiograma (testarea sensibilitii tulpinilor izolate n vederea stabilirii tratamentului) este recomandat i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice (mediul utilizat este GC suplimentat nutritiv dar fr pulbere de hemoglobin). Au fost identificate tulpini rezistente la penicilin (fie datorit unui plasmid care codific o -lactamaz de tipul TEM, fie datorit unor mutaii cromozomiale). Este necesar testarea producerii de -lactamaz (de ex. folosind discuri cu nitrocefin). Determinarea CMI se poate realiza prin metode clasice sau cu ajutorul testului E (vezi capitolul 7). 32. 4. 2. n meningita meningococic diagnosticul este urgent (risc de deces i evoluie cu sechele), de importan maxim fiind recoltarea i transportul rapid al LCR ctre laborator. Este de preferat realizarea unei cultivri la patul bolnavului, chiar dac pentru concentrarea germenilor este necesar centrifugarea LCR. Analiza citologic i biochimic a LCR este util n stabilirea etiologiei. Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct). 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). Aa cum am menionat, recoltarea LCR prin puncie (dup verificarea presiunii din artera central a retinei prin examinarea fundului de ochi) trebuie fcut pe ct posibil la patul bolnavului, avnd la dispoziie tot ce este necesar pentru pregtirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultur, repartizarea unei cantiti de LCR pentru examenul citologic i biochimic (vezi i anexa nr. 6). LCR poate fi purulent. n cazul n care p.p. urmeaz a fi transportat ctre laborator, transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o temperatur apropiat de 37C). Meningococul ar putea fi izolat i prin hemocultur, cultivarea secreiilor nazale sau faringiene etc. Prezena meningococului poate fi detectat direct n produsul patologic prin latex aglutinare, coaglutinare sau contraimunoelectroforez utiliznd seruri polivalente anti - A, C, Y, W-135 i respectiv seruri monovalente anti - B (care pot fi utile i n identificarea ncruciat a antigenului K1 al E. coli). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Dac LCR este franc purulent, frotiurile se pot executa direct din p.p., n caz contrar realizm iniial centrifugarea LCR. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocilor Gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun, situai intra sau extraleucocitar. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i anexa nr. 2). Meningococii sunt germeni pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii n care se include vancomicin, colistin, trimetoprim i nistatin) sau neselective (ex. Mueller-Hinton, geloz-snge sau gelozchocolate) pe care formeaz colonii de tip S sau de tip M. Este necesar o atmosfer de 3 -5% CO2, la o temperatur de 37C. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun, nesporulai. Caractere de cultur: Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1-2 mm. Tulpinile ncapsulate (ex. grupele A, C) pot conduce la apariia unor colonii de tip M. Caractere biochimice: Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Spre exemplu meningococul metabolizeaz att glucoza ct i maltoza. 352

Produc citocrom-oxidaz, un test cheie n identificare (vezi anexa nr. 2) Exist o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatic a Neisseriilor (ex. Quad Ferm+, RIM, Minitek etc). Caractere antigenice: n funcie de structura lipooligozaharidului exist 12 serotipuri. Cel mai important determinant antigenic este capsula polizaharidic. Structura capsular permite subdivizarea speciei n 13 serogrupuri. Dintre acestea mai importante sunt grupele: A, B, C, Y i W-135. Prezena meningococului poate fi detectat direct n produsul patologic prin latex aglutinare, coaglutinare sau contraimunoelectroforez utiliznd seruri polivalente anti -A, C, Y, W-135 i respectiv seruri monovalente anti-B (se pot detecta 0,02-0,05 mg de Ag / ml). De notat posibilitatea unei reactiviti ncruciate fa de Ag grupului B, respectiv Ag K1 de la E. coli. Tehnici similare se pot utiliza pentru identificarea tulpinilor de meningococ izolate n cultur. Caractere utilizate n tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate: Exist diferite tehnici (imunologice, electroforetice, de biologie molecular) care sunt practicate numai n centre de referin. Utilizarea PCR are o sensibilitate i specificitate de circa 91%; foarte util la pacienii pentru care s-a iniiat deja antibioticoterapia. 5. Antibiograma (testarea sensibilitii tulpinilor izolate n vederea stabilirii tratamentului) este recomandat i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Majoritatea tulpinilor de meningococ au rmas sensibile la penicilin. Totui, realizarea antibiogramei poate fi util, orientnd continuarea tratamentului. n cazul unor infecii grave antibiograma trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14).

32. 5. Tratament Pentru tulpinile de gonococ sensibile se putea utiliza penicilina, avnd ca alternativ spectinomicina sau ceftriaxona. n momentul actual unica atitudine corect este izolarea tulpinii i tratamentul conform antibiogramei. Ca o regul general este de reinut c este strict necesar ca tratamentul s fie aplicat tuturor partenerilor sexuali. n meningita cu meningococ pot fi utile penicilina G, ceftriaxona sau cloramfenicolul, dar nu trebuie neglijat utilitatea antibiogramei. Foarte recent (2007-2008), au fost identificate n SUA tulpini de meningococ rezistente la ciprofloxacin. n meningit tratamentul este mai complex, avndu-se n vedere posibilele complicaii.

353

33. Familia Enterobacteriaceae. Caractere generale. (Gabriela Loredana Popa)

33. 1. Definiie. ncadrare Familia Enterobacteriaceae cuprinde un numr foarte important de genuri i specii de microorganisme semnificative din punct de vedere medical. Aceast familie reprezint probabil cea mai larg reprezentat grupare taxonomic, intens studiat, att din punct de vedere al microbiologiei fundamentale ct i datorit implicaiilor practice, clinice. Numele acestei familii a fost propus n anul 1937, dar Serratia marcescens a fost descris i a primit acest nume n 1823. Este adevrat c tulpinile de S. marcescens, productoare de pigment caracteristic de culoare roie, sunt uor de identificat i n acelai sens se estimeaz c prezena lor a fost luat n discuie cu circa 3 secole nainte de Hristos. Salmonella typhi a fost descris n 1884, iar Yersinia pestis, dup nc 10 ani. Dac n 1974, familia includea 12 genuri i 36 de specii, iar n 1994, 30 de genuri i 107 specii, n momentul de fa familia Enterobacteriaceae cuprinde peste 40 de genuri de microorganisme semnificative din punct de vedere medical i peste 150 de specii (n cazul n care nu lum n considerare clasificarea genului Salmonella n peste 2.390 de specii) (vezi i A.6.5.1. i capitolele 37-42). 33. 2. Caractere generale 33. 2. 1. Habitat Enterobacteriile se pot gsi n ap, pe sol, pe plante sau pot coloniza n mod normal intestinul omului i animalelor. Totui trebuie reinut c peste 90% din flora intestinal normal uman este format de germeni anaerobi. Unele dintre genuri (Shigella, Salmonella, Yersinia) cuprind specii patogene pentru om, n timp ce altele (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus etc) cuprind specii saprofite sau condiionat patogene (cu excepia anumitor tulpini, patogene) i se gsesc n flora normal gastrointestinal, sau de ex. n flora tractului respirator superior. Cnd se utilizeaz termenul de bacterii enterice, unii autori includ i alte genuri precum Pseudomonas sau Vibrio, care nu fac parte din familia Enterobacteriaceae. 33. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt bacili Gram-negativi (multe dintre specii avnd o dimensiune de aproximativ 2-3 / 0,6m), cu capete rotunjite, care nu se pot diferenia prin microscopie optic, mobili cu cili peritrichi (ex. Salmonella spp, Proteus spp.), sau imobili (ex. Shigella spp., Yersinia pestis, Klebsiella spp.), nesporulai; unele specii pot prezenta capsul (ex. Klebsiella pneumoniae). 33. 2. 3. Caractere biochimice i caractere de cultur Sunt germeni nepretenioi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi, utilizeaz fermentativ glucoza cu sau fr producere de gaz, sunt oxidaz-negativi, catalazpozitivi, reduc nitraii la nitrii, se pot cultiva pe medii obinuite formnd colonii de tip S, R (vechi) sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta (ex. Escherichia coli, Klebsiella spp.) sau nu lactoza (ex. Salmonella spp., Shigella spp.). De altfel, caracterele biochimice sunt foarte importante n identificarea enterobacteriilor. n Tratatul de Microbiologie i Infecii Microbiene (Topley and Wilsons, 2005), nu mai puin de 11 pagini de tabele (1.319-1.329) sunt dedicate caracterelor biochimice ale enterobacteriilor (de menionat c aceast prezentare reprezint o simplificare i prescurtare privind acest subiect). 33. 2. 4. Structura antigenic 33. 2. 4. 1. Lipopolizaharidul (LPZ) caracteristic microorganismelor Gram-negative este format din: - lipidul A, responsabil pentru activitatea toxic, format din uniti dizaharidice de glucozamin fosforilat de care se ataeaz acizi grai cu lan lung de atomi de carbon (ex. acidul 354

hidroximiristic cu 14 atomi de carbon), care este prezent la toate enterobacteriile i care se gsete n natur numai n aceast structur particular, lipidul A. De lipidul A se ataeaz: - polizaharidul format dintr-un miez (core) similar la toate bacteriile Gram-negative i o serie de uniti terminale repetitive care difer de la specie la specie (antigenul O). Antigenul O este termostabil, rezistent la alcool. Poate fi detectat prin reacii de aglutinare cu antiseruri specifice. Antigenul O este asimilat cu termenul de endotoxin. Formele R sintetizeaz un LPZ care nu conine elementele repetitive ale polizaharidului O, caracteristice culturilor S. Fa de antigenul O apar n special anticorpi din clasa IgM. Fiecare gen cuprinde antigene O specifice, dar un microb poate avea mai multe structuri antigenice diferite, de exemplu: - pot exista antigene O comune la E. coli, Shigella; - pot exista reacii ncruciate ntre E. coli, Klebsiella, Providencia, Salmonella; - anumite structuri antigenice O de la E. coli reacioneaz ncruciat cu structuri antigenice izolate de la genul Vibrio, cu structuri antigenice de grup sangvin sau alte antigene de suprafa de la celulele animale. 33. 2. 4. 2. Antigenul H este de natur proteic; denaturat de alcool (50) i de temperatur (70C). Este localizat la nivelul flagelilor (nu exist la speciile imobile). Are antigenicitate mai mare dect antigenul O (dominant); de aceea, pentru a putea aprea combinaia cu antigenul O, n anumite situaii, antigenul H trebuie denaturat n prealabil. Antigenul H poate fi detectat prin reacii de aglutinare cu antiseruri specifice (n special cu anticorpi din clasa IgG). Anticorpii anti-H imobilizeaz bacteria, atenund virulena microorganismelor mobile, fiind probabil cauza apariiei variaiei de faz la Salmonella. Variaia de faz este proprietatea bacteriei de a altera exprimarea unui anumit tip de antigen flagelar. 33. 2. 4. 3. Antigenul K se situeaz extern fa de antigenul O, la bacteriile capsulate. Este un antigen polizaharidic, parial stabil la temperatur. Dac este organizat o structur capsular, aglutinarea cu antigenul O va fi inhibat. Au fost identificate i structuri asemntoare antigenului tipic capsular; spre ex. la E. coli exist antigenul K1. Antigenul K este implicat i n patogenitate, favoriznd rezistena la fagocitoz a bacteriei i contribuind la invazivitate. 33. 2. 4. 4. La Salmonella typhi exist n mod suplimentar antigenul Vi (de virulen) care face parte din antigenele de nveli ale acestei bacterii, are structur polizaharidic i este implicat n scderea complementului seric, leucopenie, capacitatea de multiplicare intramacrofagic. Poate masca antigenul O, acoperindu-l. Antigenul Vi se poate identifica prin reacii de aglutinare cu antiseruri specifice. Clasificarea antigenic a enterobacteriilor indic adesea prezena fiecrui antigen specific, de exemplu E. coli O55:K5:H21 etc. 33. 2. 4. 5. Unele enterobacterii elaboreaz i exotoxine, spre exemplu toxina SHIGA PRODUS DE SHIGELLA DYSENTERIAE TIPUL 1, VEROTOXINA PRODUS DE E. COLI O157:H7 ETC. 33. 2. 4. 6. Majoritatea enterobacteriilor prezint fimbrii, de natur proteic (exist 6 tipuri de fimbrii); unele enterobacterii prezint i proteine filamentoase (ex. E. coli) care par s aib rol n patogenitate. 33. 2. 5. Caractere de patogenitate Adezinele Practic toate bacteriile Gram-negative prezint fimbrii (pili), indispensabili pentru aderarea de mucoase, acesta fiind primul pas n vederea colonizrii i multiplicrii iniiale. Toxinele a). Exotoxinele: toxina Shiga (Shigella shiga), toxina Shiga-like (la Shigella i la unele tulpini de E. coli), toxina LT (termic labil) la E. coli (asemntoare cu exotoxina vibrionului holeric) etc. Ar mai fi de menionat existena unor citotoxine produse de E. coli care sunt alfa-hemolizine

355

(exotoxine); beta-hemolizinele rmn legate de celul i inhib fagocitoza i chemotaxia leucocitelor. b). Endotoxinele (Antigen O) sunt incluse n peretele tuturor germenilor Gram-negativi, putnd determina n cazul unei eliberri masive (distrugerea brutal a unui numr mare de bacterii) ocul endotoxic. Administrarea experimental a lipopolizaharidului la animal determin febr, leucopenie, trombocitopenie, CID (coagulare intravascular diseminat), activarea sistemului complement i eliberarea de substane vasoactive proinflamatorii. Achiziia de fier O serie de enterobacterii sintetizeaz o component care are capacitatea de a chela fierul (siderofor), complexul format fiind apoi recaptat de ctre bacterie (de exemplu, aerobactina de la E. coli). Structurile capsulare Antigenele de tip K ale E. coli au structur proteic i sunt importante n colonizare; diminu opsonizarea i fagocitoza. Antigenul K1 este un polimer al acidului N-acetil-neuraminic. Este similar cu structuri proprii gazdei i este slab imunogen. Klebsiella prezint un antigen K (i respectiv o capsul) bine reprezentat. Antigenul Vi de la Salmonella typhi acoper (mascheaz) antigenul O i are importan n invazivitate. Plasmidele Sunt importante pentru faptul c transmit att informaii genetice legate de rezistena la antibiotice (factor R) ct i pentru virulen. 33. 3. Povestire adevrat Un pacient de sex masculin, n vrst de 33 ani, este cunoscut cu diagnosticul de leucemie acut promielocitar de circa 1,5 ani; se interneaz pentru administrarea tratamentului chimioterapic i pentru realizarea unui transplant de celule stem. La circa 3 ore de la administrarea profilactic de imunoglobuline pe cale i.v., pe un cateter fixat anterior, pacientul devine febril (temperatur 39,5C). S-a recoltat snge pentru hemoculturi i dup aceasta s-a administrat o asociere ntre o cefalosporin de generaia a 3-a i gentamicin. Sngele a fost nsmnat n bulion snge, cu trecere oarb dup 18 ore, pe geloz-snge i pe un mediu care coninea eozin i albastru de metilen. Dup nc 24 ore, apar culturi (de tip S/M) pe ambele medii, se apreciaz c este vorba de colonii lactoz-pozitive, iar examenul microscopic al coloniilor izolate relev prezena unor bacili Gram-negativi. Se realizeaz teste biochimice pe medii multi test, microorganismul fiind glucoz-pozitiv i lactoz-pozitiv, hidrogen sulfurat-negativ, citrat-pozitiv, imobil, indol-negativ, ureaz-negativ. Analiza preliminar orienteaz spre o enterobacterie, dar, se face testul oxidazei care este pozitiv. Efectund i alte testri, diagnosticul final a fost: infecie cu Agrobacterium radiobacter la un pacient cu imunodepresie. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a recomandat continuarea tratamentului cu imipenem. Evoluia a fost favorabil, iar la 3 sptmni de la episodul acut s-a putut realiza tratamentul chimioterapic i pacientul a fost pregtit pentru transplantul cu celule stem. Discuie Nu orice bacil Gram-negativ, glucoz-pozitiv i lactoz-pozitiv este o enterobacterie. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a revelat o tulpin rezistent la majoritatea medicamentelor testate, prezentnd sensibilitate numai la ticarcilin, imipenem i ciprofloxacin. Avnd n vedere faptul c a fost vorba de o infecie la o gazd imunodeprimat, diagnosticul bacteriologic i testarea sensibilitii le medicamentele antibacteriene sunt strict necesare.

356

34. Genul Escherichia. Escherichia coli (Gabriela Loredana Popa, Codrua Usein, MI Popa)

34. 1. Definiie. ncadrare Genul Escherichia, considerat genul tip pentru familia Enterobacteriaceae, cuprinde germeni comensali care se gsesc ubicvitar (n ap, pe sol, etc). La nivelul intestinului uman au rol n sinteza unor vitamine (simbioz). Sunt bacili Gram-negativi mobili sau imobili, aerobi facultativ anaerobi, lactoz pozitivi. Sunt grupai n ase specii: E. coli, E. blattae, E. fergusonii, E. hermannii, E. vulneris i E. albertii. Cu excepia speciei E. blattae, izolat de la insecte, toate celelalte specii de Escherichia au fost izolate din prelevate umane. Specia tip, reprezentat de Escherichia coli, i-a cptat numele n 1919, n memoria lui Theodor Escherich care, studiind flora intestinala copilului, a izolat-o din materii fecale denumind-o Bacterium coli commune.

34. 2. Caractere generale 34. 2. 1. Habitat E. coli se gsete n intestinul animalelor homeoterme, inclusiv al omului, fiind considerat component a florei intestinale normale. Acest rezervor primar a fcut ca E. coli s fie selectat de Organizaia Mondial a Sntaii ca indicator de poluare fecal (1). Studii ntreprinse n ultimii ani indic ns o mult mai mare complexitate a populaiei genului Escherichia, ai crui membri pot circula i persista autonom, n afara tractului gastrointestinal, fiind prezeni n rezervoare secundare din mediul ambiant (2). 34. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt bacili Gram-negativi drepi sau uor incurbai, cu capete rotunjite i dimensiuni cuprinse ntre 2-5m / 0,5-1m (pot avea uneori aspect filamentos, pot exista i forme cocobacilare). n majoritate sunt mobili, prin prezena flagelilor (n preparatele native). Unele tulpini prezint capsul (antigene capsulare de tip K). 34. 2. 3. Caractere de cultur Se dezvolt bine pe medii simple de cultur; pe geloz se pot dezvolta colonii de tip S, lactoz pozitive, convexe, umede, cu suprafa lucioas, margini netede, uor emulsionabile n soluie salin fiziologic sau colonii de tip R, uscate, cu marginile crenelate, care se emulsioneaz greu i neuniform n soluie salin fiziologic; exist forme intermediare ntre coloniile S i R, dup cum exist i colonii mucoide de tip M. 34. 2. 4. Caractere biochimice Germenii sunt aerobi, facultativ anaerobi, se dezvolt n limite largi de temperatur i pH. Asemenea celorlalte enterobacterii, specia E. coli este catalaz pozitiv, oxidaz negativ i fermenteaz glucoza. Capacitatea majoritii tulpinilor de E. coli de a fermenta lactoza este util n diferenierea de alte enterobacterii (ex. Salmonella, Shigella). Tipic, tulpinile de E. coli testate pe medii de identificare biochimica precum TSI, MIU si/sau MILF nu produc H2S, produc indol i lizindecarboxilaz, dar nu ureaz si fenilalanindezaminaz. n plus, E. coli nu poate crete pe un

357

mediu care are ca unic surs de carbon citratul (caracter metabolic important pentru diferenierea de alte enterobacterii). Tulpinile EHEC/VTEC, de regul, nu fermenteaz sorbitolul. 34. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Germenii supravieuiesc n mediul extern (sol, ap) luni de zile. E. coli este distrus prin expunere la 60C n 30 minute. Este sensibil la aciunea antisepticelor i dezinfectantelor uzuale. 34. 2. 6. Structur antigenic Ca i n cazul celorlalte enterobacterii, diversele structuri antigenice situate la suprafaa tulpinilor de E. coli servesc aa numitei serotipizri, metod util n epidemiologia infeciilor cauzate de aceste microorganisme. Cele trei tipuri de antigene detectate prin reacii serologice antigen-anticorp (ex. reacia de aglutinare) sunt: antigenul O (somatic), antigenul H (flagelar) i antigenul K (capsular). Antigenul O (LPZ) a fost descris la caracterele generale ale enterobacteriilor i definete serogrupul (numerotarea grupului antigenic este de utilitate epidemiologic; ex. serotipurile O55 i O111 sunt implicate n izbucniri epidemice de meningit neonatal). Exist peste 170 de variante de Ag O. n cadrul unui serogrup O, pe baza diversitii antigenelor H (prezente numai la tulpinile mobile, care posed flageli) i K (prezente la tulpinile care posed capsul) se definesc serotipuri. Serogrupurile i serotipurile se noteaz printr-o combinaie de litere i cifre (ex. O55:K59:H6). Structurile de suprafa pot masca prezena antigenului somatic O. n majoritatea cazurilor, tipizarea serologic a tulpinilor de E. coli se rezum la identificarea antigenelor O i H (ex. O157:H7). Anumite serotipuri sunt asociate frecvent cu sindroame clinice bine definite, dar trebuie menionat c nu antigenele de suprafa confer virulen bacteriei. Cu toate acestea, definirea serotipului poate fi sugestiv pentru identificarea unor clone virulente (ex. serotipul E. coli O157:H7, marker pentru subgrupul EHEC din patotipul VTEC). Datorit faptului c au fost identificate peste 170 de variante de antigen O, peste 50 de tipuri de antigen H, peste 90 de tipuri de antigen de tip K i o serie de tipuri antigenice fimbriale (antigene F), prin combinaiile acestora rezult peste 1.000 de tipuri antigenice de Escherichia coli. Unele dintre tulpinile de E. coli elaboreaz exotoxine (vezi 37.2.8 i 37.3). Acestea pot fi, la rndul lor, structuri antigenice identificate in vitro prin reacii antigen-anticorp. 34. 2. 7. Rspuns imun Apare un rspuns imun umoral care nu are semnificaie nici n ceea ce privete protecia fa de boal i cel mai adesea nici n diagnostic. De reinut ns c, un titru nalt al anticorpilor anti O157, detectat la pacienii cu sindrom hemolitico-uremic (SHU), poate fi util pentru diagnosticul indirect (imunologic) al infeciei cu E. coli O157:H7 (3). 34. 2. 8. Caractere de patogenitate Tulpinile de E. coli domin microflora facultativ anaerob a colonului la individul sntos, marea majoritate ntreinnd cu aceasta relaii de simbioz benefice ambilor. Ele pot produce infecii n condiiile n care gazda este imunodeprimat sau cnd depesc bariera intestinal i ajung n zone normal sterile. Exist ns i tulpini de E. coli care au o virulena intrinsec, putnd declana variate procese infecioase la indivizii imunocompeteni. Tulpinile patogene de E. coli sunt clasificate n aa

358

numite patotipuri. Ele genereaz simptomatologii similare prin mecanisme de patogenitate comune. n prezent sunt descrise ase patotipuri de E. coli implicate n sindromul diareic (patotipuri intestinale) (4) i un patotip implicat n infecii extraintestinale (ex. infeciile tractului urinar, meningite, septicemii, etc.) i denumit E. coli cu patogenitate extraintestinal (ExPEC) (5). Patotipurile intestinale sunt: E. coli enteropatogen (EPEC), E. coli enterotoxigen (ETEC), E. coli enteroinvaziv (EIEC), E. coli productor de verotoxine (VTEC), E. coli enteroagregativ (EAEC) i E. coli cu aderen difuz (DAEC). n cadrul patotipului VTEC se distinge, pentru a se sublinia n principal asocierea cu manifestri clinice severe (ex. colita hemoragic), subgrupul de tulpini de E. coli enterohemoragic (EHEC), care are ca prototip serotipul O157:H7. Tulpinile patogene de E. coli produc factori de virulen, care afecteaza variatele procese desfurate la nivelul celulelor gazdei (ex. sinteza de proteine, funcia citoscheletului, diviziunea celular, secreia de ioni, funcia mitocondriilor, apoptoza etc.). Aceti factori de virulen sunt codificai de structuri genetice localizate n cromozom sau pe plasmide i intervin n mecanismele de patogenitate folosite de bacterie pentru a nvinge sistemele de aprare ale gazdei. Adezinele sunt structuri de aderen aflate pe fimbrii/pili (ex. fimbriile P din tulpinile de E. coli uropatogene, factorii de colonizare CFA din tulpinile de ETEC, etc.) sau la suprafaa membranei externe (ex. adezinele afimbriale Afa din tulpinile de DAEC) bacteriene. Ele reprezint factori de virulena importani, care permit bacteriei s colonizeze zone din organismul uman (ex. intestin subire, tract urinar, vagin), in care nu rezid n mod normal. Toxinele sunt o alt categorie de factori de virulen. Endotoxinele fac parte din structura membranei externe (lipidul A din complexul LPZ) i sunt invariabil prezente la toate bacteriile Gram negative, nu numai la E. coli, indiferent de potenialul lor de patogenitate. Eliberate n urma distruciei peretelui bacterian i manifest efectele toxice, fiind implicate n apariia febrei i ocului toxic din septicemii. Exotoxinele sunt sintetizate i secretate n cursul metabolismului bacterian, fiind specifice nu numai speciei, ci diverselor patotipuri de E. coli. n prezent se cunosc structura si funciile a numeroase toxine responsabile de patogenitatea tulpinilor de E. coli (ex. enterotoxina termolabil i termostabil produse de tulpinile ETEC, verotoxinele 1 i 2 sintetizate de tulpinile VTEC, enterotoxina termostabil enteroagregativ 1 a tulpinilor EAEC, etc.). Multe dintre tulpinile ExPEC implicate n producerea meningitei neonatale sau a infeciilor urinare prezint capsul, o alt component important pentru patogenitatea speciei. Rolul principal al capsulei este de a inhiba aciunea complementului seric i fagocitoza, conferind astfel rezisten bacteriei. Antigenul polizaharidic capsular K1 este prezent n 80% din tulpinile de E. coli izolate din cazuri de meningit neonatal (6).

359

35. Genul Klebsiella. Klebsiella pneumoniae. (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, A Muntean)

35. 1. Definiie. ncadrare Microorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate, caracterizate printr-o intens activitate metabolic asupra hidrailor de carbon pe care i hidrolizeaz cu producerea de acizi i uneori de gaz. Glucoza este degradat cu producere de gaz. Specia tip a fost descris n 1885 sub numele de Bakterium lactis aerogenes. Numele actual dateaz din 1954 fiind atribuit n onoarea microbiologului german Edwin Klebs. Klebsiella pneumoniae este cunoscut i sub numele de Bacillus Friedlnder. Exist mai multe specii de exemplu K. pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis iK. oxytoca, aceste tulpini fiind i cele mai des implicate n patologia uman. n ultima perioad se consider K. ozaenae i K. rhinoscleromatis drept subspecii ale K. pneumoniae. Recent, civa membri ai genului Klebsiella au fost reclasificai pentru a forma un nou gen, Raoultella, pe baza informaiilor din studii genetice. Membrii acestui nou gen pot fi implicai i n patologia uman, iar denumirea a fost adoptat la nivelul comunitii tiinifice internaionale [1].

35. 2. Caractere generale 35. 2. 1. Habitat Klebsiella pneumoniae este larg rspndit n natur (sol, ap), dar i n intestinul omului i animalelor; n mediul spitalicesc se selecteaz tulpini multirezistente ce pot coloniza tractul urinar sau respirator la adult sau tractul intestinal la copil, mai ales dup terapia prelungit cu antibiotice cu spectru larg. Mai multe studii au urmrit pattern-ul de colonizare cu cu Klebsiella pneumoniaea indivizilor, cu scopul de a determina factorii de risc pentru infecii. S-a demonstrat astfel c aproximativ o treime din persoanele testate prezint portaj de Klebsiella n fecale. Spitalizarea i folosirea de antibiotice a crescut numrul celor colonizai de bacterii din genul Klebsiella, ct i numrul acestor bacterii per gram de fecale. Personalul medical prezint Klebsiella pe mini dup ce ngrijesc pacieni (ntr-un studiu, 17% din asistentele unei secii de terapie intensiv; rate i mai mari au fost nregistrate n cursul unui focar epidemiologic activ 30 % [2]). 35. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Klebsiella pneumoniae cuprinde bacili Gram-negativi, capsulai (capsula are dimensiuni de 2-3 ori mai mari dect diametrul bacteriei), imobili, nesporulai. Se pot dispune n diplo, n special n organismul uman. 35. 2. 3. Caractere de cultur Se cultiv cu uurin pe medii uzuale fr cerine nutritive speciale. Pe medii gelozate s-au descris mai multe tipuri de colonii cel mai frecvent fiind tipul mucos (M): colonii mari, opalescente, uneori cenuii, cu suprafaa umed care dup o incubare prelungit prezint tendin la confluare i curgere pe suprafaa mediului. Pe medii lactozate sunt lactozpozitive. Klebsiella pneumoniae nu se dezvolt pe medii nalt selective i este parial inhibat pe 360

cele moderat selective. S-a raportat apariia unor tulpini ce dezvolta colonii hipermucoide, aceste tulpini avnd i o virulen crescut [3]. 35. 2. 4. Caractere biochimice Pe mediile multitest germenii au urmtorul comportament enzimatic: pe mediul TSI sunt glucoz-pozitivi i uneori fermenteaz glucoza cu producere de gaz, sunt lactoz-pozitivi, nu produc hidrogen sulfurat; pe mediul MIU sunt imobili, indol-negativi i ureaz-pozitivi; pot crete pe medii avnd citratul drept unic surs de carbon. Sunt germeni catalaz pozitivi, oxidaz negativi. 35. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Sunt puin rezisteni la cldur (distrui n 5-7 minute la 100C); pe sol, n alimente rezist un mare numr de zile. Dezinfectantele obinuite i distrug n intervale de timp cuprinse ntre 30 de minute i 2 ore. 35. 2. 6. Structur antigenic Particularitile morfologice ale klebsiellelor se reflect n structura antigenic. Au fost descrise antigene somatice O (LPZ) specifice de grup i antigene capsulare polizaharidice K, specifice de tip. Exist peste 80 de tipuri antigenice, identificabile de ex. prin reacia de umflare a capsulei i (prin analize serologice sau de microbiologie molecular). 35. 2. 7. Caractere de patogenitate Klebsiella pneumoniae este un microorganism condiionat patogen, care poate fi implicat n patologia uman prin multiplicare i invazivitate. Factorii de patogenitate sunt reprezentai de capsula (antigenul K) care i confer rezisten fa de fagocitoz i de endotoxina (antigenul O) eliberat dup distrugerea bacteriei. Sideroforii membranari sechestreaz Fe2+ n focarul infecios, pentru a asigura un nivel adecvat creterii bacteriene. Dei nu reprezint un rol central n patogenitate, ntr-un model murin de peritonit, s-a demonstrat creterea virulenei tulpinilor de Klebsiella prin introducerea genei care codific sideroforul aerobactin. Biofilmul reprezint o matrice extrem de bine organizata ce nconjoar bacteriile. Ele favorizeaz aderarea bacterian pe suprafaa cateterelor. Adezinele cele mai ntlnite la tulpinile de Klebsiella pneumoniae sunt fimbriile de tipul 1 i 3. Exist o interrelaie ntre adezinele exprimate i cantitatea de biofilm produs [4].

35. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse Considerat iniial ca fiind agent etiologic al pneumoniilor, s-a dovedit c numai 1-3 % din pneumonii sunt produse de Klebsiella pneumoniae, dar aceste pneumonii pot fi extrem de grave (pneumonii necrotice i hemoragice), n special la pacieni cu un sistem de aprare deficitar. Klebsiella pneumoniae poate fi implicat ntr-o mare varietate de boli precum toxiinfecii alimentare de tip infecios, infecii ale tractului respirator superior, infecii urinare etc. Din ce n ce mai frecvent acest microorganism apare n infecii nosocomiale (de spital), la fel ca i Klebsiella oxytoca. Klebsiella ozaenae a fost izolat din mucoasa nazal a pacienilor cu ozen (atrofie progresiv a mucoasei cu pierderea mirosului) iar Klebsiella rhinoscleromatis s-a izolat de la pacieni cu rinosclerom (granulom distructiv al nasului i faringelui). Tulpini aparinnd serotipurilor 1-5 au fost izolate din abcese la nivel pulmonar, hepatic, cerebral. Dintre acestea o tulpin de Klebsiella pneumoniae deosebit de virulent a fost izolat n special n rile asiatice, aceast tulpin produce majoritatea abceselor hepatice primare bacteriene [5-7]. ntr-un model murin, secvena de evenimente ce a condus la constituirea unui abces bacterian primar dup inoculare oral a fost: colonizare intestinal (la 12 ore), diseminare extraintestinal (ntre 12 i 24 ore), 361

replicare hepatic (la 36 ore), metastazare septic (dup 48 ore). S-a tentat identificarea unor gene care favorizeaz producerea abcesului hepatic [8-10]. n ultima vreme tulpini de Klebsiella productoare de -lactamaze sunt tot mai des responsabile de infecii nosocomiale mai ales la pacieni iimunocompromii. De o importan particular sunt enzimele cu activitate -lactamazic cu spectru extins (Extended Spectrum Beta Lactamaze, ESBL); tulpinile de Klebsiella productoare de ESBL sunt recunoscute n patologia uman datorit dificultii tratamentului curativ. Tratamentul de prim linie pentru tulpinile de K. pneumoniae productoare de ESBL a fost reprezentat de carbapeneme. n 1996 s-a identificat pentru prima oar n SUA o tulpin productoare de carbapenemaze (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase - KPC).

35. 4. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Klebsiella Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct). Cu toate c nu este cea mai reprezentativ entitate clinic pentru acest gen, vom discuta n continuare diagnosticul pneumoniei produse de Klebsiella pneumoniae. Diagnosticul complet include elemente clinice, paraclinice (ex. examenul radiologic) i de laborator; diagnosticul bacteriologic fiind util n stabilirea etiologiei i tratamentului antibiotic corespunztor. Diagnosticul bacteriologic (direct) include etapele cunoscute. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientul s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie, etc.). n infeciile produse de Klebsiella pneumoniae se pot recolta materii fecale, urin, snge, puroi, etc. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de sput (vezi i anexa nr. 6). Din punct de vedere macroscopic, sputa poate avea un aspect mucoid, de culoare rou nchis, n jeleu de coacze. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel alveolar (ex. macrofage alveolare), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena bacililor Gram-negativi, de dimensiuni relativ mari, ncapsulai (nconjurai de o capsul voluminoas). Examinarea microscopic trebuie s demonstreze calitatea produsului patologic i s realizeze o identificare prezumtiv a microorganismului implicat (vezi i anexa nr. 6). n coloraia cu albastru de metilen, capsula apare ca un halou n jurul klebsielelor. Utiliznd anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapid inclusiv direct, pe produsul patologic, prin reacia de umflare a capsulei (vezi i anexa nr. 2). 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i anexa nr. 2). Klebsiella pneumoniae se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Se prefer utilizarea unor medii de cultur slab selective (ex. MacConkey). Klebsiella pneumoniae nu se dezvolt pe medii nalt selective i este parial inhibat pe cele moderat selective. Pe mediile solide Klebsiella pneumoniae formeaz colonii lactoz-pozitive, mari, de tip M bombate, cremoase, n pictur de miere, care dau aspectul de curgere pe suprafaa mediului de cultur, cu tendin de confluare. Se poate realiza i inocularea la animale de laborator sensibile, oarecele alb (vezi i anexa nr. 2). Exist medii de cultur selective/difereniale care pot ajuta n diagnosticul rapid al infeciilor cu Klebsiella sau aducnd informaii epidemiologice de valoare (izolarea de tulpini productoare de ESBL, datorit rezistenei la o doz de antibiotic inclus n mediu). Valorile de sensibitilitate i 362

specificitate a acestor metode sunt foarte bune, dar trebuie s fie folosite cu pruden, pentru a nu oferi rezultate fals-negative prin limitarea altor germeni posibili implicai n procesul patogenic. [11] 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni mari, capsulai, capsula fiind voluminoas, dispui n lanuri scurte, perechi sau izolai. n mediul de cultur pot pierde capsula. Caractere de cultur: produc colonii lactoz-pozitive, de tip M, mari (2-3 mm la 24 de ore, peste 4 mm la 48 ore), bombate, vscoase, cremoase, n pictur de miere, care dau aspectul de curgere pe suprafaa mediului de cultur, cu tendin la confluare. Pe mediul MacConkey coloniile apar roii (fermenteaz lactoza, cu producerea de gaz). Caractere biochimice: Klebsiella este un microorganism lactoz-pozitiv, ceea ce se poate evidenia nc din etapa de izolare pe mediul MacConkey (vireaz culoarea mediului n rou); alte caractere biochimice se studiaz dup repicarea unor colonii pe medii multi- test (TSI, MIU), pe mediul Simmons sau n sisteme multi-test comerciale de tip API; Klebsiella pneumoniae este glucoz-pozitiv (cu producere de gaz), lactoz-pozitiv, nu produce H2S, imobil, ureaz-pozitiv, indol-negativ, care se dezvolt folosind citratul ca unic surs de carbon; K. oxytoca e indol-pozitiv acesta fiind un caracter ce poate fi folosit n schema de diagnostic de laborator diferenial. produce acetoin din glucoz, caracter evideniat prin reacia Voges-Proskauer (adugarea de hidroxid de potasiu duce la virarea n rou a unei culturi bacteriene n care se afl acetoin, n prezena unui indicator de pH precum alfa-naftol). Caractere antigenice: se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Klebsiella, prin tehnici de aglutinare, coaglutinare, ELISA [12], Western Blot sau latex aglutinare. Exist peste 80 de tipuri de antigen K la Klebsiella pneumoniae. Aceste reacii se practic n laboratoare de referin. Caractere de patogenitate: se poate utiliza inocularea la oarecele alb (vezi i anexa nr. 2). Alte caractere / teste utilizate n identificare care se pot utiliza (n centre de referin): testarea sensibilitii la bacteriofagi (unele dintre scheme au fost stabilite n Institutul Cantacuzino); gruparea n funcie de rezistena la antibiotice i chimioterapice; bacteriocinotipie; caractere testate prin metode ale biologiei moleculare (stabilirea spectrului plasmidic, cu identificarea plasmidelor implicate n virulen etc.). 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Determinarea CMI i CMB poate fi necesar (vezi capitolul 7). Klebsiella pneumoniae reprezint unul dintre microorganismele cu o rezisten remarcabil fa de antibiotice i chimioterapice. Cnd sunt detectate, tulpinile productoare de -lactamaze i carbapenemaze necesit teste moleculare pentru a determina cu exactitate substratul rezistenei.

363

36. Genul Proteus (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

36. 1. Definiie. ncadrare Genul Proteus este format din germeni pleomorfi, foarte mobili, Gram-negativi, care nu fermenteaz lactoza, produc ureaz, sunt nesporulai, necapsulai. Exist 2 specii principale, Proteus mirabilis i Proteus vulgaris (P. morganii a devenit Morganella morganii, iar P. rettgeri a devenit Providencia rettgeri); celelalte 3 specii sunt P. myxofaciens, P. penneri i P. hauseri. Majoritatea tulpinilor din genurile nrudite (Proteus, Morganella, Providencia) au anumite caractere comune (ex. mobilitatea, rezistena la KCN, producerea de indol).

36. 2. Caractere generale 36. 2. 1. Habitat Germenii din genul Proteus sunt rspndii n natur ubicvitar, se pot identifica n materiile organice n putrefacie, n alimente. Fac parte din flora intestinal uman. 36. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt bacili Gram-negativi cu un accentuat polimorfism (de unde i numele, derivat din mitologia antic), pe frotiu putndu-se observa bacili, cocobacili, forme filamentoase de pn la 50-80 m. Prezint un mare numr de cili peritrichi care le confer mobilitatea caracteristic (dar exist i tulpini aciliate). Sunt necapsulai i nesporulai. 36. 2. 3. Caractere de cultur Cresc pe medii simple, inclusiv pe medii peptonate lichide, cu degajarea unui miros caracteristic de putrefacie. Suport mari variaii de temperatur i de pH. Pe mediile difereniale (cu lactoz) nu se pot obine colonii izolate, descriindu-se fenomenul de invazie (migrare). Cultura se ntinde pe toat suprafaa plcii (sau tubului) n strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate fi inhibat prin incorporarea n mediu de sruri biliare, tiosulfat de sodiu, sulfit de bismut, sulfonamide, neomicin, crbune activat etc. Dac pe o plac cu mediu solid se cultiv 2 tulpini diferite, n 2 puncte opuse, acestea se vor dezvolta invadnd pn la un punct n apropierea liniei de ntlnire, unde se va crea o linie de demarcaie ntre cele 2 tulpini (fenomenul liniei de demarcaie). Cultivarea unui produs patologic n lichidul de condens al unui tub cu geloz nclinat incubat n poziie vertical, va conduce (n cazul n care n produsul patologic exist o tulpin de Proteus spp.) la obinerea n 24 ore a unei culturi pure de Proteus, datorit mobilitii acestor microorganisme (fenomenul de crare). 36. 2. 4. Caractere biochimice Sunt aerobi, facultiv anaerobi. Pe medii slab i moderat selective pe care fenomenul de migrare a fost inhibat, speciile de Proteus dezvolt colonii de tip S, lactoz-negative (vezi 36. 4.). Microorganismele din genul Proteus sunt glucoz-pozitive, lactoz-negative, produc H2S, sunt ureaz-pozitive, indol-pozitive (exceptnd P. mirabilis i P. myxofaciens) iar pe mediul MIU se poate constata mobilitatea. 36. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Are o rezisten relativ crescut n mediu, n alimente etc i poate rezista n soluii antiseptice sau n detergeni, ceea ce poate crea probleme deosebite n mediul de spital. Rezist mai multe luni la temperaturi joase, inclusiv n alimentele congelate. Rezistena la antibiotice i chimioterapice este considerabil. 364

36. 2. 6. Structur antigenic Prezint antigenul O (LPZ, endotoxina) specific de grup. Dup constatarea c serul bolnavilor de tifos exantematic aglutineaz cu o tulpin de proteus s-a demonstrat c genul include o serie de tulpini (OX-2, OX-19, OX-K) care au nrudiri antigenice cu microorganisme aparinnd genului Rickettsia. Antigenul flagelar, proteic, H este comun la mai multe tipuri. 36. 2. 7. Rspuns imun Postinfecios apare un rspuns imun umoral care ns nu are utilitate practic. 36. 2. 8. Caractere de patogenitate Proteus poate deveni patogen prin multiplicare i invazivitate, n condiii speciale (prsirea habitatului natural, colonizarea unor gazde cu deficiene ale sistemului imunitar). La fel ca i ceilali germeni Gram-negativi, elibereaz de la nivel parietal, dup distrugere, endotoxina (antigenul O, LPZ). Mobilitatea deosebit i permite invadarea tractului urinar. Producerea de ureaz alcalinizeaz urina i favorizeaz formarea de calculi (de ex. de struvit). Existena calculilor favorizeaz apariia altor infecii urinare sau cronicizarea acestora. Rezistena la antibiotice i chimioterapice este remarcabil.

36. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse De regul microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic n afeciuni ce apar n afara tractului digestiv. Exist totui i toxiinfecii alimentare de tip infecios n care aceti germeni au reprezentat agenii cauzali. n mod frecvent se discut despre infeciile cu proteus la nivelul tractului urinar, dar sunt posibile mai rar i alte infecii (genitale, pleurezii, alte localizri n cursul unei bacteriemii) de regul la pacieni cu status imun deficitar sau n spital (infecii nosocomiale).

365

39. Genul Salmonella (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

39. 1. Definiie. ncadrare Importana clinic a microorganismelor din genul Salmonella a fost cunoscut cu mult nainte de studiile omologiei ADN sau de realizarea secvenelor ARNr 16S. Pe baza unei omologii ADN-ADN de aproximativ 90%, Salmonella i E. coli ar fi s fac parte din acelai gen, dar protestul microbiologilor i clinicienilor obinuii cu vechile denumiri a mpiedicat acest lucru. Una dintre clasificrile acceptate la ora actual grupeaz genul n 3 specii (Ewing): - S. typhi patogen numai pentru om; - S. choleraesuis, patogen la porc i ocazional la om (numit ulterior S. enterica), cu 1.416 serotipuri; - S. enteritidis, cauz de diaree la om i la animal. Serotipurile nu se scriu cu litere italice. De ex. S. typhimurium ar putea fi scris actual Salmonella ser. Typhimurium, sau Salmonella Typhimurium sau pe scurt Typhimurium. Sunt autori care consider c serotipul corespunde speciei i n acest caz, n genul Salmonella ar putea fi luate n considerare peste 2.390 specii. Salmonella, ca i E. coli, a reprezentat un subiect de studiu, servind ca model pentru metabolismul bacterian, genetica bacterian sau studii de virulen. Este de asemenea un indicator al gradului de siguran al conductelor de ap, dar relativ de curnd a aprut rolul ei n a onora o persoan public cum ar fi S. mjordan (cu referire la baschetbalistul american).

39. 2. Caractere generale 39. 2. 1. Habitat Salmonelele sunt foarte larg rspndite n natur i prezente la toate speciile de animale, psri, peti, erpi, insecte. Pentru S. typhi omul este unicul rezervor. Veriga alimentar este esenial n infectarea uman. 39. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni de 2-4 mm / 0,4-0,6 mm, mobili cu cili peritrichi (cu excepia S. galinarum pullorum), necapsulai, nesporulai. 39. 2. 3. Caractere de cultur Se multiplic pe medii de cultur simple i formeaz colonii de tip S sau R (prin mbtrnire). Salmonella ser. Paratyphi B poate produce colonii de tip M. Pe mediile selective cu lactoz dau natere unor colonii lactoz-negative. Pe geloza Wilson-Blair formeaz colonii caracteristice, opace, cu suprafaa rugoas i margini neregulate, prezentnd un halou negru i luciu metalic. 39. 2. 4. Caractere biochimice Fermenteaz glucoza cu formare de gaz (nu i S. typhi), nu fermenteaz lactoza, formeaz hidrogen sulfurat (exist i excepii), nu formeaz indol, nu produc ureaz, cresc pe mediul cu citrat ca unic surs de carbon (Simmons pozitiv), sunt aerobi, facultativ anaerobi. 39. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Se pot multiplica ntr-un interval larg de temperatur (7-48C) i la un pH ntre 4 i 8. Sunt puin rezistente la cldur (spre exemplu sunt distruse n 5-7 minute la 100); pe sol (puni) rezist circa 200 de zile, n alimente rezist 10-180 de zile (rezist 4 ani n pulberea de ou, a crei utilizare n alimentaie este contraindicat). Dezinfectantele obinuite le distrug n intervale de timp cuprinse ntre 30 de minute i 2 ore. 39. 2. 6. Structur antigenic 366

Modul n care o tulpin este definit din punct de vedere antigenic cuprinde 3 pri (antigenul O, faza 1 de la antigenul H i faza 2 de la antigenul H). Antigenul O este caracteristic tuturor microbilor Gram-negativi. Exist peste 60 de structuri antigenice O diferite care definesc 46 de serogrupuri O; unul sau mai muli factori asociai determin formula antigenic a unei anumite grupe serologice care este notat cu literele mari ale alfabetului sau doar cu cifrele respective (AZ, O51O67) (1 ... 51 ... 67). A fost descris fenomenul de variaie genetic n legtur cu antigenul O. Antigenele de nveli includ de exemplu antigenul Vi la S. typhi i Salmonella ser. Paratyphi C; structurile antigenice Vi reprezint substratul de fixare a bacteriofagilor, acoper antigenul O i nu permit reacia de aglutinare; se asociaz virulenei i invazivitii (determin leucopenie, nu permit legarea componentei C3b i n acest mod inhib fagocitoza i determin capacitatea de multiplicare intrafagocitar). Antigenul H este de natur proteic, se gsete la nivelul cililor peritrichi, este determinant de tip, cu posibilitatea unei variaii de faz. Majoritatea serotipurilor de Salmonella pot exprima alternativ dou tipuri de flageli cu specificiti antigenice diferite. Din 1986 s-a vzut c unele tulpini de Salmonella pot exprima trei sau mai multe tipuri de flageli cu antigenicitate distinct. Variaia antigenic se poate realiza de ex. prin transducie existnd mai multe posibiliti: pot pierde antigenul H i devin imobile; pot pierde antigenul O, coloniile S se transform n colonii R; pot pierde parial sau total antigenul Vi (homopolimer de acid N acetil-galactosaminuronic). Exist antigene i la nivelul fimbriilor. Apariia anticorpilor anti fimbrii de tipul 1 la pacieni cu febr tifoid sau la persoane care au fost vaccinate, poate duce la apariia unor reacii falspozitive n cadrul analizei serice cantitative (reacia de aglutinare n tuburi). Schema de clasificare Ewing a fost prezentat anterior. Schema de identificare serologic Kaufmann-White submparte genul Salmonella n foarte multe grupe i specii, spre ex. n grupul A, S. paratyphi A; n grupul B, S. paratyphi B, S. typhimurium; n grupul C, S. paratyphi C; n grupul D, S. typhi, S. enteritidis etc. Conform schemei Kaufman-White exist S. dublin, care n schema Ewing poart numele de S. enteritidis serotipul dublin. Exist i alte scheme de clasificare. 39. 2. 7. Rspuns imun Apare rspuns imun umoral detectabil n special dup infeciile extraintestinale. Este cert apariia rspunsului imun dup infecii produse de S. typhi i paratyphi (Paratyphi), cu punerea n eviden a anticorpilor circulani anti O, anti H i anti Vi. Anticorpii anti O i anti Vi au rol protector. Apariia anticorpilor din clasa IgA secretorii pot mpiedica ataarea la nivelul epiteliului intestinal. 39. 2. 8. Caractere de patogenitate Salmonella spp., devine patogen prin multiplicare i invazivitate. Primul pas, obligatoriu, este reprezentat de colonizare, realizat cu ajutorul unor structuri de aderare, adezinele i fimbriile, care induc modificri la nivelul membranei celulare. Studii de fiziopatologie fundamental au reprezentat prima dovad a existenei unui receptor hormonal afectat prin ataare i invazie bacterian. De menionat faptul c la genul Salmonella a fost pus n eviden un grup de gene (genele de invazivitate), unele din ele fiind asemntoare cu gene identificate la genul Yersinia. Salmonella spp., supravieuiete intrafagocitar datorit prezenei unor structuri de suprafa precum i prin sinteza unor proteine (peste 40 de proteine diferite) care apar ca rspuns la fagocitare. Antigenul Vi contribuie (pentru S. typhi i Salmonella Paratyphi C la rezistena la fagocitoz i rezistena dup fagocitoz). Endotoxina (antigenul O, LPZ) eliberat dup distrugerea germenilor, are un rol important n patogenitate. Tulpinile care produc toxiinfecii alimentare secret enterotoxine cu proprieti antigenice i biologice asemntoare toxinei holerice.

367

39. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse Principial infeciile produse de salmonele se pot mpri n salmoneloze minore (enterocolite) i salmoneloze majore (febra tifoid). Enterocolita (gastroenterita, toxiinfecia alimentar de tip infecios, salmoneloza) apare dup ingestia a 105-108 salmonele. Dup ingestie are loc ataarea i adsorbia la nivelul celulelor epiteliale n poriunea terminal a intestinului subire, apoi penetrarea prin celule i migrarea n lamina propria, n regiunea ileocecal. La acest nivel are loc multiplicarea n foliculii limfoizi determinnd hipertrofia i hiperplazia SRE (sistemului reticulo-endotelial). Acumularea de PMN determin o reacie inflamatorie cu eliberare de prostaglandine care duc la stimularea secreiei intestinale, urmat de diaree (nesanguinolent), grea, vrsturi; mai pot aprea febr, dureri abdominale, mialgii, dureri de cap (cefalee). Persoana infectat poate fi contagioas timp de circa 3 luni. Simptomele sunt mai severe la copiii mai mici de 10 ani i la bolnavii imunocompromii (ex. infectai cu HIV / SIDA). Febra tifoid (febra enteral) poate aprea dup ingerarea a circa 103 salmonele. Dup ingestie are loc ataarea i trecerea S. typhi prin i printre celulele epiteliale de la nivelul ansei ileocecale, urmat de multiplicarea activ n submucoas i de fagocitarea de ctre macrofage. Aici bacilii rmn vii i se multiplic (n macrofagele din formaiunile limfoide intestinale), apoi trec n ganglionii mezenterici, apoi n canalul toracic, producnd bacteriemia iniial (care reprezint debutul clinic al bolii), urmat de invadarea altor organe i formaiuni limfatice. Multiplicarea crescut mai ales n organele SRE (ficat, splin) este urmat de o a doua bacteriemie masiv i de eliminarea prin bil i / sau urin. La sfritul primei sptmni de boal, salmonella se elimin din foliculii intestinali i prin bil n materiile fecale, excreia prelungindu-se mult timp n convalescen. Pot aprea angiocolit, colecistit; bolnavul poate deveni purttor (portaj de Salmonella) dup vindecare. Simptomatologia general (afectarea strii generale, febr, stare de oc) este determinat n special de endotoxin care activeaz diferite cascade inflamatorii i producerea de citokine, iar simptomatologia digestiv (anorexie, dureri, constipaie sau diaree) este consecina agresiunii intestinale, hepatice i asupra vezicii biliare.

368

40. Genul Shigella (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)

40. 1. Definiie. ncadrare Genul Shigella include bacili Gram-negativi, imobili, nesporulai, necapsulai, oxidaz-negativi, lactoz negativi. Shigella spp. nu aparine florei normale intestinale. Genul Shigella ar trebui s fac parte, conform studiilor de biologie molecular, dintr-un gen care s includ i Escherichia spp., genul Escherichia-Shigella. Cu toate acestea, este n continuare acceptat tratarea separat a celor dou genuri nrudite. Exist mai multe specii. Pe baza structurii antigenice au fost difereniate patru subgrupe (A-D) respectiv Shigella dysenteriae (serotipuri), S. flexneri (6 serotipuri care se pot subdiviza n sub-serotipuri), S. boydii (18 serotipuri) i S. sonnei (1 serotip cu 2 faze sau variante, respectiv R i S).

40. 2. Caractere generale 40. 2. 1. Habitat Germenii se pot gsi n intestinul i scaunul omului bolnav. n funcie de anumite condiii, shigellele se pot izola din ap, alimente sau de pe obiecte. Pot fi transmise prin intermediul mutelor. 40. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt bacili Gram-negativi, imobili, cu dimensiuni de 2-3 m / 0,5-0,8 m, necapsulai, nesporulai. 40. 2. 3. Caractere de cultur Cresc pe medii simple i produc colonii de tip S. Pe mediile cu lactoz (ex. ADCL, AABTL) formeaz colonii de tip S, lactoz-negative. Pentru izolare din materiile fecale sunt utilizate medii difereniale (cu lactoz i indicator de pH) i / sau medii selective (mediul ShigellaSalmonella cu sruri biliare etc). 40. 2. 4. Caractere biochimice Sunt germeni aerobi facultativ anaerobi, glucoz-pozitivi fr producere de gaz, lactoz-negativi, nu produc H2S, ureaz-negativi, indol-negativi, imobili. Subgrupele A-D se pot diferenia pe baza fermentrii manitei (subgrupul A este manit-negativ). 40. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Shigellele sunt inactivate n 10 minute la 50-60C. N PRAF USCAT REZIST CIRCA 10 ZILE, PE LENJERIE POT SUPRAVIEUI PESTE 2 SPTMNI. N APE, LA O TEMPERATUR DE 7-10C POT SUPRAVIEUI CIRCA 9 ZILE, N ALIMENTE CIRCA 1-2 SPTMNI, IAR N GHEA PN LA 2 LUNI. 40. 2. 6. Structur antigenic Subgrupele sunt divizate pe baza structurii antigenului O (LPZ). Subgrupul A (Sh. dysenteriae) include 10 serotipuri dintre care cel mai patogen este tipul 1, Shigella shiga. Subgrupul B (Sh. flexneri) include mai multe tipuri i subtipuri serologice. Subgrupul C (Sh. boydii) cuprinde 15 serotipuri iar subgrupul D (Sh. sonnei) cuprinde o singur specie n 2 faze distincte antigenic (S i R). Exist tulpini care prezint la suprafa structuri antigenice de tip K. Sh. shiga elaboreaz i o exotoxin termolabil, cu structur proteic. 40. 2. 7. Rspuns imun

369

Infecia cu Shigella spp. duce la stimularea rspunsului imun umoral, cu apariia de anticorpi care ns nu confer protecie. Apariia de anticorpi locali de tip IgA (eventual dup administrarea de vaccinuri vii atenuate) ar putea avea o utilitate n prevenirea infeciei. 40. 2. 8. Caractere de patogenitate Shigella este patogen prin multiplicare i invazivitate. n cazul serotipului 1 din subgrupul A (Sh. shiga) este implicat i toxigeneza. La fel ca toate microorganismele Gram-negative, shigellele elaboreaz lipopolizaharidul parietal, care se elibereaz ca endotoxin, dup distrugerea bacteriei. Endotoxina (antigenul O) este implicat n patogenia dizenteriei, avnd o aciune iritativ la nivel intestinal. Exotoxina shiga afecteaz att intestinul (fiind implicat n mecanismul de producere al diareei), ct i sistemul nervos central (putnd conduce la apariia unor fenomene de meningism sau chiar pierderea strii de contien, com). Fa de animalele de experien are efect letal.

40. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse Infeciile cu Shigella spp. sunt de regul limitate la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate aprea dup ingestia a numai 100 de bacterii, care se localizeaz, se multiplic i invadeaz epiteliul intestinal (pot aprea abcese la nivelul peretelui intestinului gros, la nivelul ileonului terminal, abcese care evolueaz spre ulceraie, necroz, hemoragie). Dup o perioad de incubaie de circa 2-5 zile, n cazul unei dizenterii tipice apar brusc febr, diaree apoas, dureri abdominale intense. Ulterior se elimin scaune foarte numeroase (20-40 / zi), nefecaloide, cu mucus, puroi i snge, nsoite de colici intestinale i tenesme rectale. Starea general se nrutete (mai grav n cazul unei infecii produse de Sh. shiga) i problema principal este reprezentat la fel ca i n cazul altor diarei, de pierderile hidro-electrolitice i instalarea unui sindrom de deshidratare acut. n lipsa tratamentului corespunztor (n special n lipsa reechilibrrii hidro-electrolitice) evoluia poate fi fatal. n afar de dizenterie, shigelele pot produce i toxiinfecii alimentare de tip infecios.

370

41. Genul Yersinia (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

41. 1. Definiie. ncadrare Sunt enterobacterii de dimensiuni mici, cu aspect de bacili sau cocobacili Gram-negativi, care prezint coloraie bipolar. Nu formeaz spori, pot prezenta structuri de tip capsular. Sunt aerobi facultativ anaerobi, catalaz-pozitivi, oxidaz-negativi. Majoritatea au drept gazd natural animalele i pot produce boli (uneori foarte grave) umane. Genul Yersinia include 11 specii dintre care 3 sunt patogene pentru om: Yersinia pestis (cauza ciumei), Y. pseudotuberculosis i Y. enterocolitica. Numele Yersinia a fost dat n onoarea lui Alexander Yersin, care a izolat bacilul pestei, n Hong-Kong, n anul 1894.

41. 2. Caractere generale 41. 2. 1. Habitat Microorganismul poate fi identificat numai la animale (ex. roztoare - obolani) sau la omul bolnav. Se poate transmite prin plgi mucate, de la o roztoare la alta sau ocazional la om prin intermediul purecilor. Rezult infecii grave, posibil mortale. n USA, ultimul caz de transmitere interuman a fost raportat n 1924. 41. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Y. pestis este un bacil Gram-negativ, imobil, care prezint o coloraie bipolar. Pe frotiuri bacilii pot apare att izolai ct i dispui n lanuri scurte i sunt nesporulai. Exist i forme cocobacilare. n organismele vii i n culturile tinere, prezint un nveli pseudocapsular. 41. 2. 3. Caractere de cultur Aerob facultativ anaerob, se dezvolt mai rapid pe medii ce conin snge sau fluide organice i la 30C dar se poate multiplica i pe medii simple. n culturi pe geloz-snge la 37C coloniile pot fi foarte mici i apar dup circa 24 ore. O inoculare a unor microorganisme virulente recoltate direct din esutul infectat conduce la apariia unor colonii de tip S, sau cu aspect mucoid, vscoase i colorate alb-gri. Dup realizarea unor pasaje n laborator, coloniile devin neregulate i aspre (de tip R); capsula dispare. 41. 2. 4. Caractere biochimice Yersinia pestis are o activitate biochimic relativ sczut i cu un grad de variabilitate. Este un germen aerob, facultativ anaerob, fermenteaz glucoza i n mod variabil fermenteaz lactoza. Y. pestis i Y. pseudotuberculosis au caractere biochimice similare. 41. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Sunt germeni puin rezisteni fa de agenii fizici i chimici, dar n mediul extern pot supravieui pn la circa 2 sptmni n puroi sau n sput i cteva luni n cadavre. 41. 2. 6. Structur antigenic Yersiniile, la fel ca toate microorganismele Gram-negative, prezint la nivelul peretelui antigenul O (LPZ, endotoxina). Y. pestis produce mai multe antigene i toxine care acioneaz ca factori de virulen. Anvelopa conine o protein (fraciunea I, F-1) care este produs n principal la 37C, confer proprieti antifagocitare i activeaz complementul. Tipul virulent slbatic de Y. pestis elaboreaz antigenele proteice V i W care sunt codificate cromozomial sau plasmidic. Dintre toxinele produse, una este letal pentru animalele de laborator. Toxina (exotoxin) are structur proteic. 371

Y. pestis produce i o bacteriocin (pesticin). Cteva dintre antigenele Y. pestis reacioneaz ncruciat cu antigene ale altor yersinii. 41. 2. 7. Rspuns imun Exist imunitate postinfecioas. Se pot utiliza vaccinuri pentru prevenirea mbolnvirii (protecia nu este absolut). 41. 2. 8. Caractere de patogenitate Yersinia pestis este un microorganism patogen n special prin multiplicare i prin invazivitate, rolul patogenic al diferitelor structuri sintetizate n cursul metabolismului nefiind complet elucidat. Doza infectant este foarte redus, 1-10 bacili sunt suficieni pentru producerea bolii. Rolul esenial pare a reveni structurilor care confer proprietile de rezisten la fagocitoz, spre ex. fraciunea I, proteic, de la nivelul suprafeei celulare, i respectiv structurii pseudocapsulare (virulena scade n lipsa pseudocapsulei). Structurile cu rol n virulen (rol dovedit in vitro i pe animalele de experien) sunt codificate plasmidic sau cromozomial. S-a dovedit implicarea esenial a unor astfel de structuri genetice, care nu au fost identificate n cazul tulpinilor avirulente. Aceste tulpini pot fi utile n producerea unor vaccinuri. Dintre toxinele menionate mai sus, una este letal pentru animalele de laborator (doz de numai 1 mg n cazul oarecelui). Aceast protein cu GM de 74.000Da, produce blocade adrenergice i este cardiotoxic la animale. Rolul su n infeciile umane nu a fost elucidat.

41. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse n cursul prnzului, vectorul se hrnete dintr-o roztoare infectat cu Y. pestis, microorganismul ajunge n intestinul puricelui i prin intermediul unei coagulaze blocheaz peristaltismul la nivel gastric. Bacteriile se multiplic. Masa bacterian i structura fibrinoas blocheaz tranzitul intestinal, puricele nfometat muc din nou i regurgiteaz microorganismele n animalul mucat. Datorit blocajului intestinal, cu toate c aspir snge, puricele nu se poate hrni, devine i mai nfometat i pierde selectivitatea natural pentru roztoarele respective; astfel ajunge s mute gazda uman. Microorganismul inoculat la om este fagocitat, dar se poate multiplica att intra ct i extracelular. n scurt timp ajunge la nivel limfatic i apare o inflamaie hemoragic la nivelul ganglionilor care se hipertrofiaz, suferi o necroz i devin fluctueni. n cursul invaziei, Y. pestis poate ajunge n torentul sanguin i infecia se poate generaliza. Se dezvolt leziuni hemoragice i necrotice n toate organele (ex. meningite, pneumonii i pleuropericardite serosangvinolente). Aceasta este forma de pest bubonic, n care letalitatea n lipsa tratamentului este de peste 50%. Pesta pneumonic primar (forma pulmonar) poate apare prin inhalarea de nuclei de pictur (de obicei de la un pacient care tuete) sau prin embolizri septice la nivel pulmonar; se manifest prin pneumonie hemoragic, septicemie i deces n peste 90% din cazuri.

372

42. Genul Acinetobacter (Alina Negu)

42. 1. Definiie. ncadrare Genul Acinetobacter a fost descris pentru prima dat la nceputul secolului XX. n 1911, Martinus Willem Beigerinck, microbiolog olandez, descoper o bacterie aerob, gram negativ, nonfermentativ, care face parte astzi din genul Acinetobacter. n anii 70, Acinetobacter ncepe s fie recunoscut ca un microorganism implicat n infecii de spital; totui n acea perioad, putea fi distrus de ctre medicamentele antimicrobiene uzuale. n 1986, Bouvet i Grimont au definit (folosind tehnicile de hibridizare molecular) 12 grupuri n cadrul genului Acinetobacter. Ei au propus includerea a 4 specii noi, printre care i A. baumannii, (recunoscut astzi i datorit dezvoltrii rezistenei la antibiotice i chimioterapice). Acinetobacter baumannii i speciile numerotate 3 i 13TU formeaz Complexul A. baumannii. Cele 3 specii au cea mai mare importan clinic, fiind responsabile de majoritatea infeciilor; nu pot fi difereniate prin teste de rutin (ale microbiologiei clasice). n anul 2004, CDC a raportat c 80% din infeciile cu Acinetobacter sunt produse de A. baumannii. Alte genomospecii implicate n patologia uman sunt: A. lwoffii, A. haemolyticus i A. johnsonii. Diferenierea speciilor se realizeaz prin biotipare, serotipare, bacteriocino-tipare.

43. Genul Pseudomonas. Pseudomonas aeruginosa (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

43. 1. Definiie. ncadrare Familia Pseudomonodaceae are patru genuri, dintre care numai genul Pseudomonas include specii importante din punct de vedere medical. Genul Pseudomonas cuprinde pe baza omologiei ARNr cinci grupuri, o parte din speciile incluse anterior n acest gen aparinnd actualmente genului Burkholderia (B. mallei, B. pseudomallei etc). Pseudomonas maltophilia a fost redenumit Xanthomonas maltophilia i a devenit actualmente Stenotrophomonas maltophilia. Cea mai important specie a genului este Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic, bacilul puroiului albastru), specie implicat relativ frecvent n infecii la persoane cu reactivitate sczut, precum i n infecii nosocomiale (infecii de spital). Pseudomonas aeruginosa reprezint una din principalele bacterii oportuniste. n anul 1981 se considera c exist circa 800 de specii de Pseudomonas, contaminnd n special plantele. Genul cuprinde bacili aerobi, facultativ anaerobi, nesporulai, Gram-negativi, cu dimensiuni de 1-5 / 0,5-1mm, mobili datorit prezenei unuia sau mai multor flageli (polari).

43. 2. Caractere generale 43. 2. 1. Habitat

373

Microorganism foarte rspndit n natur (agent de putrefacie a materiei organice animale i vegetale), poate fi pus n eviden la circa 15% dintre persoanele sntoase, la nivel intestinal, axilar, perineal etc, prefernd zonele cu un grad de umiditate. Poate contamina obiectele din grupurile sanitare, camera de baie, chiuvetele (n special sifonul de scurgere) etc. Elaboreaz o piocin (bacteriocin), cu efect inhibitor asupra unor tulpini din aceeai specie. 43. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Este un bacil Gram-negativ subire, cu dimensiuni ntre 1-5mm / 0,5-1mm, mobil, cu 1-3 cili polari (exist i tulpini neciliate), nesporulat. Uneori prezint capsul. 43. 2. 3. Caractere de cultur Din punct de vedere nutriional sunt germeni puin pretenioi. Se pot cultiva uor pe medii simple n condiii aerobe. Unele specii din genul Pseudomonas se pot multiplica la 4C, dar cele mai multe au temperatura optim de multiplicare cuprins ntre 30 i 37C (Pseudomonas aeruginosa se poate multiplica i la 42C). Posibilitatea cultivrii la 42C permite diferenierea de celelalte specii. Pe medii solide formeaz colonii care se pigmenteaz n mod specific, nsoindu-se de pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde). De menionat c pot aprea colonii (de tip S) cu aspecte diferite, dnd impresia prezenei concomitente de bacterii diferite. Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei. Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa recoltate de la pacieni cu fibroz chistic formeaz colonii mucoide. n bulion tulbur mediul, formnd i o pelicul la suprafa, sub care se evideniaz pigmentul. 43. 2. 4. Caractere biochimice Produce diferii pigmeni, dintre care mai importani sunt piocianina (albastru) i pioverdina (galben-verzui fluorescent). Este un germen catalaz-pozitiv, degradeaz oxidativ glucoza, nu fermenteaz lactoza i este oxidaz-pozitiv. 43. 2. 5. Rezistena fa de factori chimici i fizici Este sensibil la cldur, fenol, alcool de 80, dar rezistent la aciunea compuilor cuaternari de amoniu. n spital se selecteaz tulpini rezistente la antiseptice, dezinfectante, antibiotice, tulpini care pot fi implicate n infecii de spital. 43. 2. 6. Structur antigenic Pseudomonas aeruginosa posed antigenul flagelar H (proteic) i antigenul somatic O (lipopolizaharidic). Pe baza existenei mai multor factori antigenici O i H, s-au descris mai multe serotipuri n cadrul speciei, utile n special n investigaii epidemiologice. 43. 2. 7. Rspuns imun Exist un rspuns imun umoral, manifestat prin formarea de anticorpi (opsonine, aglutinine), ns cu titruri nesemnificative i fr eficacitate protectiv. 43. 2. 8. Caractere de patogenitate Speciile genului Pseudomonas sunt ubicuitare (ntlnite n ap, pe sol, pe plante etc, sau fac parte din flora microbian uman). Pseudomonas aeruginosa a fost identificat n diferite soluii apoase, inclusiv soluii dezinfectante sau chiar soluii de antibiotice, avnd o deosebit capacitate de a supravieui n medii umede. Pseudomonas aeruginosa este un microorganism oportunist, condiionat patogen. Dintre factorii de virulen ai bacilului piocianic am putea aminti prezena pililor (care mediaz ataarea bacterian la celulele epiteliale), producerea unor proteaze (cu efecte histotoxice), a unei lipaze, sinteza de hemolizine, exotoxine (exemplu exotoxina A, de circa 20.000 de ori mai toxic dect endotoxina), precum i existena endotoxinei (lipopolizaharidul din structura peretelui). Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate de la pacieni cu fibroz chistic dein un glicocalix foarte dezvoltat care mediaz aderena la nivelul mucoaselor respiratorii i mpiedic

374

opsonizarea. n infeciile cronice, la aceti pacieni, a fost demonstrat trecerea tulpinilor din forme S n forme de tip M, datorit unor mutaii care au fost identificate recent (2008).

43. 3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produse Datorit capacitii de adaptare i supravieuire n diferite medii, precum i datorit factorilor de virulen enumerai, Pseudomonas aeruginosa poate produce infecii foarte variate, de la infecii tegumentare superficiale pn la septicemii fulminante. La persoanele cu reactivitate normal, infeciile sunt de obicei localizate (foliculite, otite, infecii oculare etc), urmnd contaminrii cu diferite soluii apoase sau dup not n piscin. Prezena piocianicului ar putea fi semnalat de culoarea albastr verzuie a pansamentelor. La nivel dermic, procesul infecios poate avea i o evoluie grav, cu apariia de vezicule care se sparg i se refac pe o baz necrotic. Procesul poate progresa n profunzime (ecthyma gangrenosum), asemntor cu patologia ntlnit la pacienii neutropenici la care infecia poate fi produs i de alte microorganisme. La persoanele spitalizate, cu reactivitate diminuat i supuse unor manevre medico-chirurgicale invazive (intubaii, cateterizri etc), precum i la persoanele cu arsuri, P. aeruginosa poate produce infecii localizate, dar potenialul diseminrii i apariiei unor complicaii grave (bacteriemie, osteomielit, meningit, endocardit, septicemie) este foarte important. n lipsa tratamentului adecvat (dificil datorit rezistenei la antibiotice), evoluia procesului infecios poate fi grav sau deosebit de grav (80% din septicemiile cu piocianic au evoluie letal). Infecia pulmonar cronic la pacienii cu fibroz chistic (mucoviscidoz) este produs de un fenotip particularal speciei Pseudomonas aeruginosa.

44. Genul Vibrio (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

44. 1. Definiie. ncadrare Speciile din genurile Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, Campylobacter, Helicobacter sunt larg rspndite n natur i fceau iniial parte din aceeai familie. Vibrionii se gsesc n apele marine i de suprafa. Aeromonas se gsete predominant n apa proaspt i ocazional contamineaz animalele cu snge rece. Plesiomonas se gsete la animalele cu snge cald, dar i la cele cu snge rece. Aeromonas i Plesiomonas au fost asociate cu boli diareice la om. Helicobacter pylori se asociaz cu gastrit i ulcer gastroduodenal. Genul Vibrio face parte din familia Vibrionaceae (1965), alturi de Aeromonas, Photobacterium i Plesiomonas. Genul Vibrio include mai mult de 48 de specii (12 dintre acestea fiind potenial patogene pentru om). Vibrionul holerei produce o enterotoxin care determin holera. Vibrionii sunt bacili Gram-negativi, drepi sau uor ncurbai, foarte mobili, necapsulai, nesporulai.

44. 2. Caractere generale 44. 2. 1. Habitat

375

Habitatul natural al vibrionilor include sursele de ap dulce i srat, unde exist liberi sau n asociaie cu diferite vieti acvatice. Vibrio cholerae se gsete n intestinul i n materiile fecale ale omului bolnav de holer. Prezena vibrionului holeric n mediul extern este explicat prin contaminarea fecal i supravieuirea vibrionilor, existnd i posibilitatea unui ciclu de via extraintestinal. 44. 2. 2. Caractere morfotinctoriale La izolarea primar, V. cholerae este un bacil Gram-negativ, curbat (forma de virgul a devenit mai mult o reprezentare istoric), lung de 2-4 mm, mobil cu ajutorul unui flagel polar. 44. 2. 3. Caractere de cultur Sunt germeni puin pretenioi i se pot dezvolta pe medii de cultur simple, inclusiv n apa peptonat, ceea ce este util n izolarea primar (formeaz un vl la suprafaa mediului). V. cholerae se dezvolt bine la un pH alcalin (9-9,5), mediile cu un astfel de pH avnd rolul de medii de mbogire. V. cholerae produce pe mediile de cultur solide colonii convexe, rotunde, de tip S cu un aspect opac. Se dezvolt foarte bine la 37C pe multe tipuri de medii, inclusiv pe medii ce conin sruri minerale i asparagin ca surse de carbon i azot. Crete bine pe TCBS (tiosulfat-citrat-bilsucroz-agar), pe care produce colonii galbene. 44. 2. 4. Caractere biochimice V. cholerae fermenteaz de obicei sucroza i manoza. Fermenteaz glucoza. n funcie de fermentarea zaharurilor vibrionii se pot submpri n grupe. Au metabolism respirator i fermentativ. Sunt aerobi, facultativ anaerobi. Testul oxidazei (pozitiv n cazul vibrionului holeric) este un test cheie n identificarea preliminar. Majoritateavibrionilor sunt halotolerani i adesea prezena NaCl le stimuleaz creterea prin alcalinizarea mediului. 44. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Vibrionii holerici sunt foarte sensibili la lumina solar i la aciunea cldurii (la 100 sunt distrui aproape instantaneu); sunt sensibili la antiseptice. N ALIMENTE TRIESC (CU UNELE EXCEPII) PN LA 7 ZILE. N AP SUPRAVIEUIESC UN NUMR DE ZILE, N FUNCIE DE EFICACITATEA TRATAMENTULUI APLICAT APELOR UZATE. N INTESTINUL BOLNAVILOR NETRATAI SE POT MENINE CTEVA SPTMNI. 44. 2. 6. Structur antigenic Vibrionul holeric prezint la nivel parietal antigenul O (lipopolizaharid). n funcie de structura antigenului somatic de grup O, vibrionii holerici au fost mprii n 6 serogrupe; vibrionul holeric clasic i biotipul El Tor fac parte din grupul O:1, ceilali vibrioni fiind non-O:1NAG (nonaglutinabili cu seruri anti-O:1); aceste microorganisme nu pot fi distinse biochimic de vibrionul holeric O:1. Abordri taxonomice au demonstrat c Vibrio cholerae O:1 i non-O:1 reprezint de fapt aceleai specii. Antigenul serogrupului O:1 are determinani care fac posibil diferenierea serotipurilor. MPRIREA VIBRIONULUI HOLERIC N SEROTIPURI I BIOTIPURI ESTE UTIL N STUDII EPIDEMIOLOGICE, DAR TESTELE SE FAC NUMAI N LABORATOARE SPECIALIZATE. Exist antigene la nivelul pililor. Fiind mobil, vibrionul prezint antigenul H la nivel ciliar. Vibrionul holeric i vibrionii nrudii produc o enterotoxin labil fa de cldur, cu masa molecular de 84.000 Da, alctuit din dou subuniti A i B (activ i de legare). 44. 2. 7. Rspuns imun Aciditatea gastric furnizeaz o oarecare protecie n cazul ingerrii unui numr mic de vibrioni. Dup holer apare imunitate fa de reinfecie, dar durata i gradul acesteia nu sunt cunoscute. La animalele de experien apar anticorpi specifici de tip IgA n lumenul intestinal. Anticorpii fa de antigenul O protejeaz animalele de laborator fa de infectare. Anticorpi similari apar n serul uman dup infecie i se consider c sunt asociai (ntr-o oarecare msur) cu protecia 376

fa de colonizarea cu vibrioni patogeni. Prezena anticorpilor antitoxin nu se asociaz cu protecia. 44. 2. 8. Caractere de patogenitate Microbiologia medical este interesat n cunoaterea urmtorilor vibrioni patogeni sau cu patogenitate condiionat, potenial periculoi pentru sntatea omului: Vibrio cholerae O:1, cu biotipurile cholerae i El Tor (fiecare din aceste biotipuri putnd fi clasificat n serotipurile Inaba, Ogawa, Hikojima); Vibrio cholerae grup non O:1; Vibrio mimicus; Vibrio parahemolyticus; V. damsela; V. furnissii; Vibrio vulnificus; V. fluvialis. Mecanismul patogen al germenilor din familia Vibrionaceae const n aderarea la epiteliul celular (adezine/pili), urmeaz colonizarea i apoi invadarea mucoasei, care permit infiltrarea germenilor cu producerea unor variate substane biologic active, incluznd enzime extracelulare, enterotoxine, citotoxine, hemolizine, factori asociai cu virulena bacterian. Capacitatea chemotactic fa de epiteliile mucoase este mai evident la formele monotriche, depinznd i de cantitatea i calitatea mucusului. Majoritatea germenilor ce colonizeaz esutul uman posed pe suprafa componente proteice numite adezine care se leag stereochimic de structurile moleculare complementare tisulare. Aceti factori de adezivitate par a fi asociai cu fimbriile sau pilii. Factorii de virulen implicai n colonizare sunt sintetizai n paralel cu producerea enterotoxinei n cazul Vibrio cholerae (toxina holeric) i sunt sub coordonarea aceleiai gene. Se presupune c pilii (proprietate important asociat virulenei germenilor din mediu) se pierd o dat cu instituirea infeciei. Prin observarea tulpinilor virulente la microscopul electronic s-a observat existena unui strat adiional S extern fa de peretele celular, care ofer protecie fa de agenii litici (bacteriofagi, proteine serice). Enterotoxina holeric este principala cauz a diareei secretorii din holer. De exemplu, la voluntarii care au ingerat mai puin de 10g de toxin purificat, n 2 zile a aprut diareea, cu un volum de peste 20 l, cu caracter exploziv. Toxina holeric (la fel ca i enterotoxina produs de E. coli) este compus dintr-o subunitate A i 5 subuniti B, totaliznd aproximativ 84.000 daltoni. Subunitile B au o mare afinitate pentru receptorii gangliozidici GM de pe suprafaa celulelor int. Dup legare, subunitile A intr n citoplasm i catalizeaz transferul ADP-ribozei la NAD, fiind astfel activat o protein reglatoare asociat membranei, numit Gs. Rezultatul este un nivel crescut al AMPc n celulele mucoase ale intestinului subire, urmat de hipersecreia clorurilor i bicarbonatului care va determina un eflux important de ap. Fiind germeni Gram-negativi, dup distrugerea acestora din peretele celular se elibereaz endotoxina.

44. 3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produse n condiii naturale vibrionul holeric este patogen numai pentru oameni. S-a dovedit c pentru realizarea infeciei i bolii este necesar ingerarea a 1081010 microorganisme. Holera nu este o boal invaziv. Germenii nu ajung n torentul circulator, ci rmn cantonai la nivelul tractului intestinal. Vibrionii colonizeaz marginea n perie a celulelor epiteliale, apoi se multiplic i elibereaz toxina holeric (iar atunci cnd sunt distrui elibereaz i endotoxina). Dup o perioad de incubaie de 1-4 zile apar brusc grea, vrsturi, diaree abundent (20-30 litri / zi) i crampe abdominale. Scaunele apoase, riziforme (ap de orez) conin mucus, celule epiteliale i un mare numr de vibrioni. Exist o pierdere rapid de fluide i electrolii care duce la deshidratare, colaps circulator i anurie. Rata mortalitii n lipsa tratamentului este 25-50%. 377

Infeciile cu Vibrio cholerae grup non O:1sunt asociate cu cazuri de gastroenterit i cu infecii extraintestinale. Sepsisul datorat grupului non O:1 a fost mai rar raportat (ex. la aduli cu imunitate deficitar). Totui, a fost raportat un caz de sepsis cu Vibrio cholerae grup non O:1 plus gastroenterit la un copil de 8 ani, pacientul prezentnd diaree cu snge, febr i deshidratare sever; vibrionii non O:1 au fost izolai din snge i din materiile fecale. (1)

45. Genul Campylobacter. Genul Helicobacter. Helicobacter pylori (Gabriela Loredana Popa, Mdlina Nodea)
45. 1. Definiie. ncadrare Microorganismele descrise n acest capitol erau anterior grupate mpreun cu vibrionii i erau cunoscute ca patogeni ai unor variate specii animale la care produceau septicemii, avorturi sau enterite (1963, vibrioni microaerofili). Ulterior s-a identificat specia Campylobacter jejuni ca agent etiologic al diareei umane iar aceti vibrioni au fost ncadrai, avnd la baz secvenierea ARNr 16S, precum i caracterele de cultur i biochimice diferite n genurile Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter i Wolinella.

45. 2. Genul Campylobacter Genul Campylobacter conine 18 specii i subspecii, iar genul Arcobacter conine 4. Pentru o list cu denumirile acestor specii putei consulta Tabelul nr. 1.

45. 2. 1. Caractere generale 45. 2. 1. 1. Habitat Habitatul natural al microorganismelor din genul Campylobacter cuprinde psrile, att cele domestice, ct i cele slbatice, acestea reprezentnd principalele surse ale infeciei pentru oameni. 45. 2. 1. 2. Caractere morfotinctoriale Bacteriile din genul Campylobacter sunt bacili gram negativi curbai, mobili, iar majoritatea speciilor au un singur flagel polar. Dup cultivarea prelungit sau dup expunerea la oxigen, microorganismele dobndesc o form cocoid (ceea ce ar putea preta la confuzii de interpretare). 45. 2. 1. 3. Caractere de cultur Sunt bacterii microaerofile, spre anaerobe. Se dezvolt cel mai bine ntr-o atmosfer srac n oxigen (5-10%) i mbogait cu CO2 (10%). n mod obinuit, sunt utilizate medii de cultur selective, de exemplu mediul Skirrow care conine vancomicin, polimixin B i trimetoprim cu scopul de a inhiba creterea altor bacterii. Temperatura optim de dezvoltare pentru C. jejuni, C. coli i C. lari este de 42C (bacterii fiind cunoscute sub numele de grupul termofil, dei nu sunt bacterii termofile n sensul strict al cuvntului, a se vedea 3. 5). Coloniile sunt incolore sau gri i pot fi convexe i rotunde sau apoase cu tendin la confluare. 45. 2. 1. 4. Caractere biochimice 378

Sunt oxidaz i catalaz pozitive. Nu fermenteaz carbohidraii. 45. 2. 1. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Sunt mult mai sensibile n comparaie cu majoritatea bacteriilor. Sunt distruse de procedeele obinuite de pasteurizare ale laptelui. C. jejuni supravieuiete n ap la 4C timp de cteva sptmni, dar acest timp este mult scurtat la temperaturi de peste 15C. 45. 2. 1. 6. Structura antigenic Structura antigenic a bacteriilor din genul Campylobacter este similar cu cea a tuturor microorganismelor Gram negative. Menionm lipopolizaharidul (de fapt un lipooligozaharid) cu activitate de endotoxin i porinele membranei externe. De asemenea, exist i antigenul flagelar. 45. 2. 1. 7. Rspunsul imun Anticorpii serici de tip IgG i IgM nregistreaz un maxim la 2-4 sptmni dup infecie, apoi scad rapid. Pacienii expui frecvent la bacterii din genul Campylobacter au concentraii crescute de IgA care sunt nsoite de imunitate. Pacienii care au infecie cu Campylobacter pot avea un test fals pozitiv pentru anticorpi anti-Legionella. 45. 2. 1. 8. Caractere de patogenitate. Caracterele de patogenitate specifice genului Campylobacter reprezint subiectul unor cercetri aflate nc n desfurare. Pe scurt, cele mai importante sunt : 1. Variabilitatea genetic caracterizeaz C. jejuni i este cauzat de mecanisme intragenomice (variaii de faz, duplicri i deleii de gene, mutaii punctiforme) precum i de schimbul genetic ntre tulpini (transfer orizontal de plasmide i de ADN cromozomial). Acest transfer are loc att in vitro ct i n timpul colonizrii psrilor. 2. Lipooligozaharidul are rol n aderena la celula epitelial i n invazivitate. Unele componente ale sale, datorit asemnarii structurale cu prti ale mielinei, declaneaz un rspuns imun ncruciat cu acestea. A se vedea 45. 2. 2. pentru detalii. Flagelul: motilitatea este important pentru colonizarea gazdei de ctre bacterie. C. jejuni prezint chemotaxie pentru aminoacizii i alte componente ale mucusului tractului intestinal. Toxina CDT (Cytolethal Distending Toxin) este produs i de alte bacterii (E. coli, Haemophilus ducreyi, Helicobacter hepaticus). Aceasta cauzeaz oprirea ciclului celular n celulele-gazd. Mecanismele precise prin care CDT ajunge la nivelul nucleului sunt nc n studiu. Molecule de adezivitate: sunt utilizate diferite proteine de adezivitate cum ar fi CadF, JlpA, Peb1.

3. 4.

5.

45. 3. Genul Helicobacter Genul cuprinde 18 specii, cum ar fi: Helicobacter pylori Helicobacter heilmannii (a fost identificat la pisici, cini, unele primate; atunci cnd afecteaz oamenii, cauzeaz doar o gastrit moderat, dei infectia cu H. heilmannii este ntlnit deseori n asociere cu Limfomul de tip MALT (Suerbaum) (1) Helicobacter fennelliae (2) Helicobacter cinaedi (2) Ultimele 2 specii se comport din punct de vedere clinic asemntor cu Campylobacter jejuni.

379

45. 3. 1. Caractere generale 45. 3. 1. 1. Habitat Helicobacter pylori colonizeaz stomacul n 60-70% din dispepsiile fr ulcer i mult mai frecvent n ulcerul peptic. Este identificat la polul luminal al celulelor epiteliului gastric, sub stratul de mucus sau n zonele profunde ale acestuia, fr a invada mucoasa gastric. Ureea reprezint un important element nutritiv, iar amoniacul produs de ureaz i asigur pH-ul optim necesar multiplicrii. ureeureazaH2O 2CO2+2NH3'> Prima cultur de H. pylori a fost obinut n anul 1982 (vezi 45.13.1). Germenii izolai de la pacienii cu gastrite i ulcer duodenal au primit iniial numele de Campylobacter like, apoi Campylobacter pyloridis, Campylobacter pylori, iar din 1989 fac parte din noul gen, genul Helicobacter cu specia tip H. pylori. 45. 3. 1. 2. Caractere morfotinctoriale Helicobacter pylori are aspect de vibrion Gram-negativ, cu o lungime de 2,5 m i o grosime de 0,5 m, cu unul sau mai muli flageli polari, mobil, cu micri caracteristice, uneori cu form de spiril, necapsulat, nesporulat. Poate prezenta i cili laterali (Figura nr. 1). S-au descris i forme cocoide despre care se crede c reprezint o form de rezisten. 45. 3. 1. 3. Caractere de cultur Se dezvolt n 2-7 zile pe medii de cultur neselective (agar-chocolate, medii cu infuzie de creier i inim sau agar-Brucella suplimentat cu 5-7% snge de cal) sau pe medii selective n care se adaug de exemplu amfotericin B i polymixin sau cefsulodin, n condiii de umiditate relativ ridicat i un procent de 5-10% CO2. 45. 3. 1. 4. Caractere biochimice H. pylori nu reduce nitraii, nu desface hipuratul de sodiu; unele tulpini produc H2S pe mediul TSI, elaboreaz ureaz i catalaz. Pe abilitatea H. pylori de a produce ureaz se bazeaz mai multe teste diagnostice (a se vedea 45. 3. 3). 45. 3. 1. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici H. pylori este foarte susceptibil la deshidratare; rezist relativ puin n mediul extern. Este dotat cu capacitatea de a supravieui i de a se multiplica la nivelul mucoasei gastrice. 45. 3. 1. 6. Structur antigenic Componentele morfologice ale H. pylori contureaz i structura antigenic, respectiv un antigen somatic O (termorezistent), antigenul H flagelar (termolabil), un antigen de colonizare (aderare) precum proteinele membranei externe. Porinele sunt printre cele mai bine caracterizate familii de proteine ale membranei externe, incluznd mai multe canale care permit difuzarea pasiv a nutrienilor. O alt protein, BabA este prezentat n detaliu n Anexa nr. 1 la fel ca i diferitele caractere de patogenitate. 45. 3. 1. 7. Rspuns imun Pacienii infectai cu H. pylori prezint un rspuns imun ce const n producerea de IgM specifici. Sunt produi de asemenea anticorpi de tip IgG i IgA, acetia persistnd sistemic i la nivelul mucoasei gastrice, cu un titru mai ridicat n cazul infeciilor cronice. O dat colonizat stomacul unui individ, ntrebarea care se impune este: cum este realizat persistena acestei infecii? De ce sistemul imun al individului respectiv nu reuete s combat infecia? Rspunsul este c de-a lungul timpului, H. pylori a reuit s evite sistemul imun prin mai multe mecanisme care vor fi detaliate n continuare. n primul rnd, dup cum am mai subliniat, H. pylori st sub stratul de mucus, fr a invada epiteliul gastric, dincolo de locul de aciune al celulelor sistemului imun. Cu toate acestea, rspunsul imun al gazdei este activat de ataarea bacteriei de celulele epiteliale. H. pylori se poate ataa de MHC II (complexul major de histocompatibilitate) de pe suprafaa celulelor epiteliale, declannd apoptoza acestora. O metod important de activare a sistemului imun 380

este descris n documentul suplimentar (Anexa nr. 1) mai precis stimularea secreiei de IL8 de ctre acidul diaminopimelic. Pentru a evita rspunsul imun nnscut, este necesar neutralizarea receptorilor Toll-like (prescurtai n continuare TLR). Acetia recunosc PAMPs (pathogen associated molecular patterns), adic recunosc anumite molecule specifice pentru o mare varietate de ageni patogeni care sunt diferite din punct de vedere structural de moleculele organismului gazd. Astfel, receptorii TLR-5 recunosc flagelina caracteristic mai multor specii bacteriene, ns nu i pe cea coninut de H. pylori. TLR-9 recunosc ADN nemetilat al majoritii bacteriilor, dar H. pylori are un ADN puternic metilat. LPS (lipopolizaharid) a suferit modificri, astfel nct este recunoscut doar de TLR-4 de pe macrofage, nu ns i de receptorii aflai pe celulele epiteliale gastrice. Unul din puinele mecanisme ale imunitii nnscute care nc este activat de catre H. pylori este calea acid diaminopimelicNOD1stimularea NFkBsecreie IL8neutrofile (NOD like receptors sunt un alt tip de pattern recognition receptors, receptori care recunosc PAMPs). Pentru imunitatea dobndit sunt necesare prezentarea antigenelor i proliferarea LT, evenimente inhibate de ctre vacA, dup am prezentat n Anexa nr. 1. n timpul rspunsului imun dobndit, limfocitele Th0 (naive) se pot diferenia fie n Th1 (care secret IL2 i IFN), fie n Th2 (care secret IL4, 5 i 10). Th2 stimuleaz LB care produc anticorpi mpotriva patogenilor extracelulari, n timp ce Th1 stimuleaz rspunsul imun celular, caracteristic pentru infeciile cu microbi intracelulari. n mod paradoxal H. pylori genereaz un rspuns predominant Th1. Studiile pe oareci au artat ca acest raspuns predominant Th1 este asociat cu apariia gastritei, n timp ce un rspuns Th2 este protector fa de inflamaia gastric (gastrita se pare c este cauzat de secreia de IFN, o citokin caracteristic rspunsului imun tip Th1). Studiile epidemiologice la om au artat o polarizare mai puin pronunat a rspunsului imun. (Tabelul nr. 3 i Figura nr. 4) 45. 3. 1. 8. Caractere de patogenitate H. pylori prezint structuri cu rol n patogenitate, respectiv antigenul de suprafa (de colonizare, aderare), antigenul somatic O (endotoxina), toxina citotoxic care iniiaz inflamaia local acionnd asupra celulelor din epiteliul gastric i duodenal i toxina care inhib secreia acidului clorhidric la nivelul celulelor parietale gastrice (Anexa nr. 1) Se pare c un rol destul de important n patogenitate l au ureaza, ca i prezena cililor.

45. 3. 2. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produse Helicobacter pylori poate fi agent etiologic al gastritei, al ulcerului gastric i duodenal, al cancerului gastric (este considerat carcinogen clasa I, adic n mod sigur cauzeaz cancer) i al limfomului MALT (Mucosal associated lymphoid tissue). S-a demonstrat relaia de dubl cauzalitate ntre H. pylori i limfom, n sensul c att infecia cu H. pylori crete riscul de limfom, ct i eradicarea infeciei cu H. pylori conduce la regresia limfomului MALT n majoritatea cazurilor. Pentru inelegerea evoluiei ulterioare a infeciei cu H. pylori, este necesar explicarea rolului bacteriei n homeostazia secreiei acide. (Figura nr. 5) Astfel, H. pylori acioneaz asupra celulelor de tip D cauznd scderea nivelului de somatostatin, ceea ce duce la creterea cantitii de gastrin. n acest moment, devine important localizarea infeciei cu H. pylori, i implicit localizarea rspunsului inflamator. n cazul gastritei, rspunsul inflamator de la nivelul celulelor parietale inhib funcia acestora cu suprimarea produciei de acid, iar secreia gastric este caracterizat de nivele crescute ale pH-ului. Hipoacidemia crete suplimentar gastrina care reprezint un stimul proliferativ pentru epiteliile gastrice. Inflamaia i proliferarea continu duc la pierderea 381

glandelor gastrice i instalarea gastritei atrofice. Atrofia gastric reprezint unul dintre cei mai importani factori de risc pentru cancerul gastric, mai multe ipoteze fiind formulate pentru a explica trecerea de la atrofie la cancer. Cea mai cunoscut dintre acestea cuprinde secvena atrofiemetaplazie intestinaldisplazieadenocarcinom. (Figura nr. 6) Gastrita predominant antral se caracterizeaz prin hipergastrinemie care de aceast dat acioneaz prin stimularea celulelor parietale care vor crete secreia de acid, rspunsul final fiind reprezentat de ulcerul duodenal. Ulcerul duodenal este asociat cu scderea pH-ului secreiei gastrice, n timp ce ulcerul gastric este asociat cu scderea mijloacelor de aprare ale mucoasei stomacului. (Figura nr. 7)

45. 3. 3. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Helicobacter pylori Avnd n vedere particularitile acestor infecii, abordarea acestui subcapitol va fi puin diferit i vom ncepe prin discutarea unor teste care par a nu avea legtur cu materia studiat n anul 2, ns trebuie avute n vedere ca atare. Este important o clasificare a metodelor de diagnostic pentru infecia cu H. pylori aa cum sunt ele utilizate de medicul clinician, n colaborare cu medicul microbiolog i medicul care efectueaz testele paraclinice. n diagnosticul infeciilor produse de H. pylori, pornindu-se de la elementele clinice, se vor realiza urmtoarele teste: 45. 3. 3. 1. Teste non-endoscopice A. Testarea serologic se refer la determinarea nivelurilor de anticorpi prin tehnici de tip ELISA. Se utilizeaz antigene cunoscute ca fiind specifice H. pylori (fie celule ntregi, fie celule sonicate sau extracte antigenice purificate) pentru a determina dac pacientul are sau nu anticorpi-anti Helicobacter. Nivelele crescute de IgG se menin pe perioade mari de timp care variaz de la o persoan la alta, din acest motiv acest tip de testare nu va fi utilizat pentru evaluarea posttratament, dei este un test care poate fi util n screeningul iniial al infeciei cu Helicobacter pylori. B. Testul respirator la uree: reprezint standardul n testarea non-invaziv a infeciei cu H. pylori. Pacientul va bea un lichid care conine uree marcat cu C13 (izotop nonradioactiv) sau cu C14 (utilizat mai rar din cauza radioactivitii). Ureaza produs de H. pylori va descompune ureea n amoniac i CO2 marcat care va fi msurat din aerul expirat de pacient. Cantitatea de CO2 din aerul expirat este un indicator al cantitii de uree aflata n stomac. Testul respirator la uree poate fi folosit att pentru diagnosticarea iniial, ct i pentru monitorizarea rspunsului la tratament. C. Testul antigenelor din materiile fecale: se utilizeaz tot un test de tip ELISA, ns spre deosebire de cel de la punctul 1 suntem n situaia invers: n kit avem anticorpii, ceea ce trebuie s determinm este prezena sau absena antigenelor din fecale. Testul antigenelor din fecale este unul care certific infecia activ (daca nu mai sunt microorganisme n stomac, acestea nu vor mai fi eliminate pe cale digestiv), deci reprezint un test eficace att pentru screeningul iniial, ct i pentru evaluarea post-terapie. 45. 3. 3. 2. Teste endoscopice Cu ajutorul endoscopiei se preleveaz biopsii de esut gastric care vor fi analizate prin una din modalitile urmtoare: A. Metode bazate pe ureaz: esutul biopsiat se plaseaz ntr-o soluie de uree i un indicator de pH. Prezena ureazei va descompune ureea i va crete pH-ul ceea ce va determina virarea culorii indicatorului de pH.

382

B. Teste care in de diagnosticul de laborator microbiologic: fragmentele bioptice obinute din corpul i antrul stomacului sunt strivite pe o lam (amprentare), fixate cu alcool metilic timp de 1 minut, uscate i apoi colorate timp de 20 de minute cu soluie Giemsa1/10 preparat extemporaneu. Se poate utiliza i impregnarea argentic Warthin-Starry (aceasta a fost metoda orginal de evideniere a Helicobacter de ctre Warren i Marshall n 1983) Apare morfologia caracteristic de vibrioni sau spirili. (Figura nr 8) Cultivarea, dei reprezint o modalitate foarte specific i prezint n plus avantajul de a putea permite testarea sensibilitii la antibiotice nu se realizeaz n mod curent din cauza unor dificulti tehnice i a sensibilitii reduse (un numr relativ mare de infecii cu H. pylori nu au fost validate utiliznd aceast modalitate de diagnostic). H. pylori este un microorganism pretenios, cu cretere lent, care are nevoie de condiii speciale pentru a se dezvolta. Totui, considerm c ar fi necesare mai multe eforturi n acest sens.

46. Bacilii Gram-pozitivi nesporulai. Genul Corynebacterium (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Cristiana Cerasella Dragomirescu)

46. 1. Definiie. ncadrare Genul Corynebacterium cuprinde o serie de specii de bacili Gram-pozitivi (se pot colora neuniform), uor ncurbai, mciucai, aezai n V, L sau n palisade, nesporulai, necapsulai, imobili, aerobi i facultativ anaerobi, catalaz-pozitivi. Speciile genului (62, dintre care 38 cu relevan medical) pot fi grupate n funcie de habitat i patogenitate. Studii recente au delimitat n cadrul genului grupul Corynebacterium diphtheriaen care sunt incluse speciile C. diphtheriae, C. pseudotuberculosis i C. ulcerans (ultimele dou fiind ureazpozitive). Cultiv mai bine pe medii mbogite (de ex. cu adaos de ser sau snge). Au capacitatea (n cazul conversiei genetice) de a elabora exotoxin. Specia cea mai important este Corynebacterium diphtheriae (bacilul difteric). C. diphtheriae include patru biotipuri: gravis, mitis, intermedius i belfanti. Difteria a fost descris nc din antichitate (Hipocrate). n 1821 difteria a fost difereniat de alte infecii ale tractului respirator, iar n 1883 n falsele membrane au fost evideniai bacili Grampozitivi. Bacteriile corineforme nu reprezint o unitate distinct din punct de vedere taxonomic, ns au primit acest nume generic datorit faptului c se aseamn din punct de vedere morfologic, sunt bacili Gram-pozitivi, nu produc spori, au form neregulat, unii prezint capete umflate i este important s fie difereniate de agentul etiologic al difteriei (pot exista confuzii de diagnostic).

46. 2. Caractere generale 46. 2. 1. Habitat C. diphtheriae poate fi identificat n tractul respirator superior uman (la 3-5% din persoanele sntoase), precum i la nivel tegumentar (de regul n leziuni dermice). 46. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

383

Dup cultivare pe mediu Loeffler, apar ca bacili Gram-pozitivi, mciucai (Korynee nseamn mciuc, ciomag), cu tinctorialitate inegal datorit prezenei granulelor de polifosfat (corpusculi Babe-Ernst) i cu o dispoziie care ar putea fi comparat cu literele V, L etc. sau cu nite litere chinezeti. Se poate afirma c bacilul difteric, cu o compoziie a peretelui celular care cuprinde mai puin murein (circa 50-60%), este Gram-pozitiv la limit. Pe alte medii de cultur morfologia este mai puin caracteristic. Bacilii difteroizi (de exemplu C. hoffmanni, C. xerosis etc) prezint o colorare uniform i sunt dispui n palisade. 46. 2. 3. Caractere de cultur Bacilul difteric este izolat n cultur pur pentru prima oar n anul 1884, cnd Loeffler utilizeaz un mediu cu ser coagulat de bou (mediul Loeffler). Dei este inclus ntr-o singur specie, bacilul difteric prezint variabilitate n ceea ce privete caracterele de cultur i de metabolism, deosebindu-se mai multe tipuri. Coloniile au aspect de cretere de tip R (rough). Pe mediul Loeffler (mediu electiv) coloniile se dezvolt n 8-12-18 ore, iar aspectul pe frotiu este cel caracteristic. Trei tipuri de colonii (cu grade variate de patogenitate) se evideniaz pe mediile cu telurit (de exemplu Gundel-Tietz): tipul gravis produce colonii nehemolitice, mari, cu suprafa granular, gri-negre, n margaret, cu margini crenelate; tipul mitis produce colonii hemolitice, convexe, cu margini circulare, de tip S; tipul intermedius produce colonii nehemolitice, mici, cu margini circulare, cu suprafaa granular. n cursul diagnosticului unei infecii cu bacil difteric este necesar utilizarea mediului de mbogire OCST (ou-cistein-ser-telurit), un mediu lichid. 46. 2. 4. Caractere biochimice Dei se poate multiplica pe medii simple, bacilul difteric are o dezvoltare mai favorabil pe medii mbogite cu proteine animale (de exemplu ou, ser de bou). Capacitatea de fermentare a mono i dizaharidelor permite identificarea speciei n cadrul genului, iar fermentarea polizaharidelor permite stabilirea tipului (gravis) n cadrul speciei. Bacilul difteric produce cistinaz (care descompune cistina, elibernd H2S), reduce srurile de telur i elaboreaz bacteriocine. 46. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Poate rezista n fragmente din falsele membrane. Este distrus de cldura umed (10 minute la 60), alcool sau antiseptice uzuale, precum i de antibiotice (eritromicin, penicilin etc). 46. 2. 6. Structur antigenic Exist diferene serologice ntre diferitele tulpini de Corynebacterium diphtheriae, dar nu s-a putut elabora o clasificare serologic satisfctoare. n diagnostic nu se folosesc identificrile serologice. Cea mai important structur antigenic este reprezentat de toxina difteric, un polipeptid termolabil cu greutatea molecular de 62.000 Da, care conine cel puin patru determinani antigenici diferii. 46. 2. 7. Rspuns imun Determin un rspuns imun umoral. Anticorpii antimicrobieni pot fi identificai, dar nu ofer protecie (sunt specifici de tip). Anticorpii antitoxin (care este identic la toi bacilii difterici toxigeni) ofer protecie (neutralizeaz toxina). Titrul protector trebuie s fie mai mare de 0,03 UA / ml. 46. 2. 8. Caractere de patogenitate Bacilul difteric poate fi patogen prin multiplicare (la poarta de intrare) i toxinogenez (tulpinile lizogenizate). Toxina (exotoxin) este aceeai pentru toate tulpinile toxigene. Infectarea cu bacteriofagul temperat poate duce la starea de lizogenizare. Deoarece exist fagi tox+ i fagi tox-, exist tulpini lizogene care produc i tulpini lizogene care nu produc toxin difteric.

384

n cazul producerii toxinei, s-a dovedit faptul c prezena fierului este esenial, producia optim realizndu-se la concentraii care variaz ntre 0,14-0,50 mg Fe / ml. Toxina difteric este alctuit din dou fragmente legate prin puni disulfidice. Fragmentul B (greutate molecular 38.000 Da), reprezint fragmentul de legare pe receptorii specifici ai celulelor susceptibile i faciliteaz ptrunderea fragmentului A. Fragmentul A este activ i inhib elongarea lanurilor polipeptidice n curs de formare, cataliznd inactivarea translocazei ARNt (numit factor de elongare 2) prezent numai n celulele eucariote. Factorul de elongare 2 este necesar pentru translocarea polipeptidil-ARNt de pe situsul acceptor pe situsul donor al ribozomului celulei eucariote; prin inactivarea lui nu mai are loc interacia ARNm-ARNt i se stopeaz adugarea a noi aminoacizi lanului polipeptidic n curs de formare. n mod practic, toxina difteric (fragmentul A) catalizeaz o reacie prin care se elibereaz nicotinamid i adenozin difosfat riboz, care cuplndu-se cu factorul de elongare 2 formeaz un complex inactiv (o toxin asemntoare ca mod de aciune poate fi produs de unele tulpini de P. aeruginosa). O molecul de toxin oprete sinteza proteic n celul pentru mai multe ore. Doza letal este de 0,1 mg / kg.

46. 3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produse Poarta de intrare a bacilului difteric poate fi reprezentat de tractul respirator (faringe, nas), de leziuni tegumentare sau, mai rar, de mucoasa genital. Dup multiplicare rezult o inflamaie local. n acelai timp, n cazul tulpinilor lizogene (infectate cu bacteriofagi tox+) ncepe sinteza toxinei. Toxina difteric poate afecta orice tip de celul din organism, dar are un tropism special pentru celulele de la nivel cardiac (miocardit), nervos (demielinizare), renal (necroz tubular), suprarenalian, muscular i hepatic. Cel mai probabil oprirea brusc a sintezei proteice este responsabil de efectele necrotice, neurotoxice etc. n cteva zile de la debutul infeciei (i producerii de toxin), Corynebacterium diphtheriae sintetizeaz o structur compus din fibrin la care se adaug leucocite, eritrocite, celule epiteliale respiratorii distruse, bacterii, structur care a fost numit falsa membran de culoare gri-maronie (diphtera nseamn membran). ncercarea de a ndeprta falsa membran (foarte aderent) duce la sngerri la nivelul submucoasei prin ruperi de capilare. Aceast structur se poate forma local (amigdalian, faringian, nazal, genital) sau se poate extinde, acoperind faringele, obstrucionnd arborele traheobronic (posibil cu asfixie mecanic, situaie numit crup difteric) etc. La adpostul falsei membrane, bacilul i continu multiplicarea i sinteza de toxin care difuzeaz pe cale sanguin i conduce la apariia unor tulburri la distan (tulburri de ritm cardiac, miocardit, dificulti vizuale, de vorbire, de nghiire etc). Cu ct diagnosticul este mai tardiv, cu att rata mortalitii prin difterie crete. Au fost nregistrate forme de difterie invaziv, cu tulpini netoxigene, la persoane care se drogheaz sau la alcoolici (artrit septic, osteomielit, endocardit difteric). Datorit faptului c n ultimii aproape 22 ani nu au mai fost nregistrate cazuri de boal n ara noastr, exist riscul nerecunoaterii acestei patologii de ctre medicii care nu au vzut niciodat un caz de difterie. Riscul apariiei cazurilor exist iar sistemul de sntate trebuie s fie n permanen pregtit pentru a reaciona prompt, din toate punctele de vedere (recunoatere clinic, stabilire diagnostic, instituire tratament, intervenie n focar etc).

47. Ali bacili Gram-pozitivi nesporulai de importan medical (Gabriela Loredana Popa, Alina Borcan, MI Popa)
385

49. Genul Clostridium. Clostridium tetani (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

Genul Clostridium include peste 170 de specii (fa de 83 specii listate n 1986) care se pot gsi n intestinul animalelor i se pot elimina n mediul exterior prin materiile fecale. O parte dintre aceste specii sporuleaz. Cele mai multe dintre specii sunt anaerobe. Fenomenul de anaerobioz a fost descoperit n anul 1861, de ctre Louis Pasteur, care a identificat i fermentaia butiric produs de Vibrion butyrique (numele actual fiind Clostridium butyricum). Pn n anul 1880, aceste specii erau incluse n genul Bacillus. Reprezint un grup foarte heterogen, n cazul cruia secvenierea ARNr 16S nu a condus la o clasificare suficient de clar. Se discut despre existena a 19 sub-grupuri. Spre exemplu, primul sub-grup include: Clostridium tetani, C. botulinum, C. baratii, C. butyricum etc. Trei dintre aceste sub-grupuri includ peste 70% din flora normal intestinal. Sunt bacili Gram-pozitivi (uneori la limit), de dimensiuni mari, aezai n perechi sau lanuri, mobili cu cili peritrichi (ex. cu excepia C. perfringens sau a C. butyricum). Multe dintre specii sintetizeaz exotoxine. n cele ce urmeaz vom discuta despre speciile care produc tetanosul, botulismul i gangrena gazoas. Tetanosul este produs de Clostridium tetani patogen prin multiplicare la poarta de intrare i toxinogenez (produce o exotoxin neurotrop). Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibai de ctre glicin i acidul g aminobutiric. Toxina blocheaz eliberarea acestor mediatori ceea ce determin excitarea neuronilor motori spinali, cu apariia de spasme severe i dureroase ale musculaturii striate (paralizie spastic). Contiena este pstrat. Toxina poate ajunge la nivelul SNC i retrograd prin propagare pe cale axonal de la poarta de intrare sau pe cale sangvin. Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale musculaturii din zona contaminat, apoi ale muchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se mai poate deschide) i facies de tip risus sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul extern precipit un atac de tetanos. Moartea se poate produce prin asfixie; mortalitatea este de circa 50%. Botulismul apare de obicei prin ingestia de alimente care conin toxina produs de Clostridium botulinum, fiind o toxiinfecie alimentar de tip toxic (toxin preformat n aliment). Toxina botulinic este cea mai puternic otrav cunoscut; doza letal pentru om este de circa 1-2 mg. Dup ingerare, toxina se resoarbe la nivel intestinal, ajunge n circulaie, iar pe aceast cale la nivelul plcilor neuromotorii unde mpiedic eliberarea de acetilcolin (determin paralizie flasc). Paralizia ncepe la extremitatea cefalic (ex. paralizia muchilor globilor oculari care apare la 18-24 ore de la ingestie i se manifest prin diplopie) i evolueaz descendent. Decesul poate surveni prin asfixie (datorit paraliziei muchilor respiratori). Botulismul infantil (posibil i 386

la aduli) este urmare a formrii toxinei botulinice prin germinarea la nivel intestinal a sporilor ingerai. Mortalitatea n botulismul neo-natal este foarte mare. Botulismul plgilor poate aprea la persoane care folosesc droguri injectate intravenos sau prezint leziuni contaminate cu pmnt. Gangrena gazoas este produs de dou sau mai multe dintre urmtoarele specii: C. perfringens, C. novyi (C. oedematiens), C. septicum, C. histolyticum, C. sporogenes etc. Sporii clostridieni ajung la nivel tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). n condiii de anaerobioz sporii germineaz, formele vegetative se multiplic, fermenteaz zaharuri i apare gaz. Distensia tisular, obstrucia mecanic a structurilor vasculare n conjuncie cu sinteza de toxine favorizeaz diseminarea infeciei. Enzimele (toxinele) produse contribuie i la alterarea grav a strii generale. Gangrena gazoas este caracterizat prin edeme dure, crepitante (datorit prezenei de gaz) i necroz. Necroza tisular se extinde, multiplicarea bacterian se amplific, apare anemie hemolitic, toxemie i evoluie (n 20-80% din cazuri) ctre deces. Clostridium tetani Tetanosul a fost cunoscut nc de pe vremea lui Hipocrate, sau chiar i nainte de meniunile fcute de acesta. Etiologia tetanosului a reprezentat un mister pn n anul 1884 (anul vizualizrii la microscop a bacilului tetanic); n anul 1889 au fost obinute primele culturi de C. tetani. 49. 1. Definiie. ncadrare Sunt germeni strict anaerobi, sporulai, necapsulai, mobili, cu cili peritrichi, care se poate identifica pe sol (germeni telurici). Clostridium tetani reprezint o specie patogen prin toxinele (exotoxine) neurotrope elaborate. 49. 2. Caractere generale 49. 2. 1. Habitat n stare vegetativ sunt prezeni n intestinul omului i al animalelor. Eliminai n mediul extern (pe sol), sporuleaz. Sporii sunt foarte rezisteni. 49. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt bacili mari, Gram-pozitivi, cu capetele rotunjite, mobili, cu cili peritrichi. n prezena oxigenului sporuleaz, formnd un spor terminal, mai mare dect diametrul celulei bacteriene, care confer germenului aspectul de b de chibrit. 49. 2. 3. Caractere de cultur Cresc pe medii simple, n condiii de anaerobioz, formnd colonii rotunde, de tip S, nconjurate de o zon pufoas. 49. 2. 4. Caractere biochimice Elaboreaz o hemolizin, o exotoxin neurotrop, proteaze, gelatinaze etc. 387

49. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Formele vegetative sunt distruse de expunerea timp de 15-20 de minute la temperaturi de 5560C i de substane dezinfectante. Sporii rezist la temperatura de 100C, dar sunt distrui prin autoclavare la 120C i 1 atm, timp de 30 de minute i la pupinel timp de 1 or la 180C. 49. 2. 6. Structur antigenic Prezint antigene flagelare de tip H, de perete (antigenul somatic O) i o exotoxin cu structur proteic. Toi bacilii tetanici elaboreaz un singur tip de toxin, sub control plasmidic. 49. 2. 7. Rspuns imun Apare un rspuns imun umoral, cu producere de anticorpi antitoxin, dar care nu sunt utili din punct de vedere al proteciei i nici n scop diagnostic. 49. 2. 8. Caractere de patogenitate Cl. tetani este patogen prin multiplicare la poarta de intrare (nu are capacitate de invazivitate) i toxinogenez (produce o toxin neurotrop). 49. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse Filtratul de cultur are dou componente tetanolizina, care produce liza hematiilor unor specii animale i tetanospasmina, care inhib eliberarea acetilcolinei, interfernd astfel cu activitatea sinapsei neuromusculare i inhib neuronii spinali postsinaptici, blocnd eliberarea unor mediatori inhibitori, determinnd astfel spasme musculare generalizate, hiperreflexie i convulsii. Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibai de ctre glicin i acidul aminobutiric. Toxina blocheaz eliberarea acestor mediatori, ceea ce determin excitarea neuronilor motori spinali, cu apariia de spasme severe i dureroase ale musculaturii striate (paralizie spastic). Contiena este pstrat. Toxina poate ajunge la nivelul SNC i retrograd prin propagare pe cale axonal de la poarta de intrare sau pe cale sangvin. Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale musculaturii din zona contaminat, apoi ale muchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se mai poate deschide) i facies de tip risus sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul extern precipit un atac de tetanos. Moartea se poate produce prin asfixie; mortalitatea este de circa 50%. 49. 4. Diagnostic de laborator Diagnosticul este clinic, epidemiologic i bacteriologic. Se recolteaz produsul patologic de la nivelul plgii (puroi) i se realizeaz frotiuri care se coloreaz cu albastru de metil sau prin coloraia Gram. Antibiograma nu este necesar; C. tetani este sensibil la penicilin.

388

49. 5. Tratament Tratamentul trebuie realizat de urgen, prin administrarea de ser antitetanic (cu msurile de precauie necesare n cazul seroterapiei) i eliminarea focarului tetanigen, pentru a se mpiedica formarea unor noi cantiti de toxin. La tratamentul specific se asociaz administrarea anatoxinei tetanice. 49. 6. Epidemiologie Sursa de infecie este reprezentat de om i animale (prin dejectele acestora care ajung pe sol). Transmiterea se face prin intermediul pmntului contaminat cu spori. Poarta de intrare este de obicei o plag contaminat cu pmnt ce conine spori de bacili tetanici (plag cu risc tetanigen). n anul 1998, n Romnia au fost nregistrate 23 cazuri de tetanos ceea ce corespunde unei incidene de 0,10/0000; n timp de n anii 1999-2000 au fost raportate 19, respectiv 14 cazuri de tetanos. Numrul de cazuri raportate i respectiv incidena, au avut o evoluie fluctuant n perioada 2001-2006, tendina general fiind de scdere (cel mai mare numr de cazuri a fost raportat n 2001, 24 de cazuri iar cel mai mic n 2005, 8 cazuri). n anul 2006 au fost raportate 10 cazuri de tetanos, incidena fiind 0,050/0000). n SUA au fost notificate 50 de cazuri n 1997 (inciden 0,020/0000) i respectiv 41 cazuri n 1998 i 40 de cazuri n 1999. n perioada 2000-2005 au fost raportate ntre 20 (2003) i 37 (2001) n fiecare an. n anul 2005 au fost raportate 27 cazuri (inciden 0,010/0000). Este de menionat c s-a nregistrat decesul n cazul a dou paciente (una n vrst de 94 ani care nu a fost niciodat vaccinat anti-tetanic i a doua n vrst de 73 de ani, la care nu au putut fi gsite date cu privire la vaccinri efectuate anterior). 49. 7. Profilaxie Se adreseaz plgilor cu risc tetanigen, plgilor contaminate cu alte bacterii aerobe piogene care consum oxigen i cele contaminate cu pmnt; acestea asigur condiii de anaerobioz, n care sporii trec n form vegetativ, se multiplic i elaboreaz exotoxina ce ajunge la nivelul centrilor motori bulbari. Se face profilaxia tetanic a urmtoarelor tipuri de plgi: - plgi nepate profunde, n care nu exist o suprafa de contact cu oxigenul; - plgi traumatice mari, profunde, cu margini neregulate, cu resturi de esuturi devitalizate care consum oxigenul din plag i care creeaz condiii de anaerobioz; - plgi postoperatorii (septice) sau posttraumatice. n orice situaie este obligatorie toaleta chirurgical a plgii, ce const n: - deschiderea larg a plgii; 389

- desfacerea marginilor plgii i tierea franjurilor; - ndeprtarea resturilor tisulare; - splarea cu ap i spun; - administrarea de substane oxidoreductoare (H2O2) (nu spirt medicinal). n plus, dac persoana a fost corect imunizat, se face rapel cu ATPA (anatoxin tetanic purificat i adsorbit). Anticorpii antitoxin tetanic vor aprea n aproximativ 2 zile. Dac persoana nu a fost vaccinat, atitudinea este urmtoarea: - se face vaccinare cu ATPA; - se administreaz i ser antitetanic (n alt zon dect cea n care s-a efectuat vaccinarea); - se administreaza penicilin timp de 10 zile (sau eritromicin n cazul n care exist hipersensibilitate fa de penicilin).

Profilaxia specific se realizeaz prin vaccinare DTP (vezi i 32. 7). - vaccinarea ncepe la 2 luni (3 administrri succesive), cu 2 rapeluri; - la 6-7 ani se face un nou rapel cu DT; - ulterior se fac eventuale rapeluri cu ATPA sau dT (este indicat administrarea de anatoxin tetanic, la fiecare 10 ani). 49. 8. Povestiri adevrate Cazurile de pacieni cu tetanos sunt destul de rare, ns, oriunde n lume exist posibilitatea apariiei unui astfel de caz (germeni telurici, eradicarea tetanosului nu este posibil). 49. 8. 1. Un pacient de 56 de ani, din nordul Moldovei, a prezentat dureri musculare, febr (38,5C), astenie i diferite contracturi musculare. Dup prezentarea iniial la camera de gard medical (unde s-a recoltat snge pentru analize i s-au administrat antipiretice i sedative), a fost transferat la secia de boli infecioase. Examenul clinic a revelat prezena contracturii uoare a muchilor maseteri, contracii puternice la stimuli minori a muchilor membrelor inferioare i superioare iar examinarea picioarelor a permis punerea n eviden a unor plgi, unele recente, nevindecate la nivelul tlpilor. n cursul anamnezei, medicul infecionist a aflat c pacientul lucreaz ca agricultor i de regul nu poart nclminte, motiv pentru care s-a rnit. Pacientul nu a putut s prezinte un carnet de vaccinare i nici nu a putut s menioneze cnd a fost vaccinat ultima oar i dac a mai fost vaccinat anti-tetanic n ultimii 5-10 ani. 390

Avnd n vedere datele anamnestice, datele clinice i epidemiologice, s-a decis administrarea unui rapel cu vaccin anti-tetanic (care s-a efectuat n muchiul deltoid al membrului superior drept) dar i administrarea seroterapiei (anticorpi anti-toxin tetanic) la nivelul muchiului deltoid al membrului superior stng. Cu toate acestea, a fost necesar ca pacientul s fie internat ntr-o rezerv, ferit de orice stimul (luminos, sonor etc) n msura posibilitilor, tiindu-se c reaciile i contracturile musculare pot fi extrem de puternice i, pentru o perioad de 3 sptmni a primit tratament simptomatic i i-au fost supravegheate i meninute funciile vitale. Este de subliniat faptul c vaccinarea anti-tetanic ar trebui s fie administrat din 10 n 10 ani la orice persoan, indiferent dac are sau nu o plag cu risc tetanigen. Evoluia n cazul acestui pacient a fost favorabil, fiind externat la finele celor 3 sptmni. 49. 8. 2. Situaia a fost ns dramatic diferit n cazul unui alt pacient, n vrst de 11 ani, din aceeai regiune a rii. Copilul se plimba cu bicicleta i din neatenie a czut, rezultnd o fractur deschis la nivelul membrului superior drept. Fiind transportat de ctre rude la un spital cu profil ortopedie, din punct de vedere ortopedic s-au realizat toate manevrele corespunztoare, operaia a permis repunerea oaselor la loc ns din nefericire nu s-a instituit profilaxia tetanosului. Dup operaie, membrul superior a fost pus n aparat gipsat i, probabil sub gips i pansamentul aplicat au fost realizate condiii de anaerobioz. n aceste condiii, sporii de Clostridium tetani au trecut n form vegetativ, s-au multiplicat i au produs toxina tetanic. La 12 zile de la operaie copilul a devenit febril, agitat, a nceput s prezinte contracturi spastice, iniial la nivelul membrelor superioare, apoi i la nivelul membrelor inferioare, n timp contracturile dezvoltndu-se att pe muchii flexori ct i pe muchii extensori. Copilul a fost adus la camera de gard a unui spital de urgen i transferat imediat la un spital de boli infecioase unde, tot imediat au fost administrate att serul anti-tetanic ct i vaccinul. Cu toate acestea, starea general s-a degradat, contracturile au devenit brutale, copilul a ajuns s prezinte poziia n coco de puc descris n literatur, i-a pierdut contiena i a decedat la 3 zile de la internarea n spital. Cu toate c memoria imunologic ar fi trebuit s funcioneze (cel puin teoretic, copilul fusese vaccinat cu DT la intrarea n coal; lucru menionat n fia personal) n acest caz evoluia a fost cea menionat, spre deces. O toalet corespunztoare a plgii, eliminarea mecanic a tuturor structurilor anatomice (distruse, dilacerate etc) care ar fi putut adposti spori i administrarea vaccinului tetanic n ziua n care copilul a fost adus la spital datorit fracturii, ar fi putut s previn acest deces. 49. 3. 3. i tot despre tetanos ...

391

n faa unui pacient cu trismus, nu trebuie insistat s gsim cauza la nivelul cavitii bucale, de exemplu un posibil abces dentar! Mai ales dac examinarea este chiar dificil datorita trismusului eficient, suntem tentai s administrm un antibiotic i sa reexaminm pacientul ulterior. S nu uitm ca trismusul poate fi produs i de tetanos nu numai de abcesele dentare!

50. Clostridium botulinum (Gabriela Loredana Popa)

Cu toate c informaii privind o boal cu manifestri care puteau fi determinate de infecia cu C. botulinum au fost descrise i nainte, despre botulism se discut n mod clar ncepnd cu anul 1817, n Germania, dup ce 71 de persoane (din 174) au decedat datorit asfixiei, dup ce au consumat crnai incomplet preparai termic (n snge). n urma acestei izbucniri epidemice sa stabilit numele de botulinum (botulus = crnat). 50. 1. Definiie. ncadrare Sunt germeni strict anaerobi sporulai, necapsulai, Gram-pozitivi, mobili, cu cili peritrichi. Sporii sunt foarte rezisteni. Clostridium botulinum reprezint o specie patogen prin producerea de toxine (exotoxine) neurotrope. 50. 2. Caractere generale 50. 2. 1. Habitat. n stare vegetativ se poate evidenia n intestinul omului i al animalelor. Dac sunt eliminai n mediul extern (pe sol), sporuleaz. Sporii sunt rezisteni (germeni telurici). 50. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt bacili mari, Gram-pozitivi, necapsulai, mobili, cu cili peritrichi. n prezena oxigenului sporuleaz. 50. 2. 3. Caractere de cultur Cresc pe medii simple, n condiii de anaerobioz i formeaz colonii rotunde, netede, de tip S, nconjurate de o zon pufoas. 50. 2. 4. Caractere biochimice Elaboreaz exotoxine cu neurotropism fa de sistemul nervos periferic. Toxinele A, B, E sunt mai comune la om, n zona noastr geografic. Produc i enzime proteolitice, cu formare de gaz, ceea ce se poate observa n cazul unor conserve alimentare bombate i care nu trebuie utilizate. Cl. botulinum sintetizeaz bacteriocine.

392

50. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Formele vegetative sunt distruse la expunerea timp de 15-20 de minute la temperaturi de 5560C precum i de aciunea dezinfectantelor. Sporii rezist la 100C, dar sunt distrui prin autoclavare la 120C, timp de 30 de minute, la presiunea de 1 atmosfer sau prin meninerea n pupinel timp de 1 or la 180C. 50. 2. 6. Structura antigenic Cl. botulinum prezint antigene flagelare de tip H, antigene la nivelul peretelui precum i antigene solubile (exotoxine). Exist 8 tipuri de bacili botulinici, n funcie de exotoxinele elaborate (A, B, C cu 2 variante, D, E, F, G, H). Tipul G nu a fost asociat cu afeciuni umane. n Romnia au fost identificate mai frecvent cazuri de toxiinfecie alimentar cu Cl. botulinum tipurile A i B. Relativ recent, s-a demonstrat c o tulpin poate deine concomitent gene care codific pentru sinteza mai multor tipuri de toxin. 50. 2. 7. Rspuns imun Apare un rspuns imun umoral, cu producere de anticorpi antitoxin, dar care nu sunt utili din punct de vedere al proteciei i nici n scop diagnostic. 50. 2. 8. Caractere de patogenitate Cl. botulinum nu se multiplic n organism. Se multiplic n alimente i produce o exotoxin (dac este lizogenizat), care este distrus prin fierbere la 100C, timp de 20 minute. Se discut implicarea acestui microorganism n botulismul neo-natal, n care se pare c este vorba de o multiplicare n intestinul sugarilor care consum de exemplu miere, contaminat cu spori de Cl. botulinum. 50. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse Botulismul apare, mai frecvent, prin ingestia de alimente care conin toxina, putnd fi considerat o toxiinfecie alimentar de tip toxic (toxina este preformat n aliment). Spre exemplu, unele conserve produse n gospodria proprie, n finalul prelucrrii pot asigura condiii de anaerobioz, iar sporii care au contaminat respectivul produs trec n form vegetativ i produc toxin (conservele al cror capac bombeaz pot semnifica multiplicarea i producerea de gaz datorit unui microorganism; nu trebuie consumate). Se recunosc urmtoarele forme de botulism: a. toxiinfecia alimentar; b. botulismul plgilor; c. botulismul intestinal (mai ales la sugari); d. botulismul prin inhalare de spori; e. botulismul n care sursa este necunoscut. Toxina botulinic este cea mai puternic otrav cunoscut; doza letal pentru om este de 1-2 g.

393

n prima form de botulism, dup ingerarea alimentului, toxina se resoarbe la nivel intestinal, ajunge n circulaie, iar pe aceast cale la nivelul plcilor neuromotorii (fa de care are afinitate). Aici mpiedic eliberarea de acetilcolin, determinnd o paralizie flasc. Paralizia ncepe la extremitatea cefalic (de exemplu, paralizia muchilor globilor oculari, care apare la 18-24 ore de la ingestie i se manifest prin diplopie-vedere dubl sau paralizie bulbar, manifestat prin imposibilitate de nghiire i de vorbire) i este descendent, ajungnd pn la paralizia musculaturii respiratorii. Moartea poate surveni prin asfixie (datorit paraliziei muchilor respiratori). Bolnavul rmne contient pn aproape de exitus. Rata mortalitii n aceast form de botulism este mare. Se estimeaz, n SUA, c managementul unui caz de botulism cost cteva milioane de USD (spitalizare, tratament, aciuni n justiie, solicitare de daune, campanii mass-media etc). Botulismul intestinal (mai frecvent la sugari, posibil i la aduli), este urmarea formrii toxinei botulinice prin germinarea la nivel intestinal a sporilor ingerai. Manifestrile clinice sunt similare cu cele ale toxiinfeciei alimentare cu toxina preformat (paralizie respiratorie). Mortalitatea este foarte mare. Nu se cunoate motivul pentru care cel mai mare numr de cazuri este raportat n SUA. Autoritile americane recomand evitarea ingestiei de miere la sugar (copii mai mici de 1 an). Botulismul plgilor poate fi suspectat atunci cnd apar manifestri neurologice anormale i nu pot fi implicate alimentele drept surs pentru toxina botulinic. Boala afecteaz persoanele care folosesc droguri injectate intravenos, cele cu leziuni traumatice contaminate cu pmnt sau gravidele la care s-a efectuat o cezarian. 50. 4. Diagnostic de laborator Fiind o toxiinfecie alimentar de tip toxic, nu se face diagnostic bacteriologic. Se poate ncerca determinarea a tipului (toxic) de Cl. botulinum implicat, prin toxinotipie. Din aliment se extrage structura antigenic n form solubil. Produsul se trateaz prin fierbere (toxina botulinic este inactivat prin fierbere). Produsul n care presupunem prezena toxinei, att fiert (i rcit) ct i nefiert, se inoculeaz la oareci dup o schem care va fi detaliat la lucrrile practice (vezi i capitolul 22 i anexa 2 - A.2.6.). Se investigheaz eventuala prezen a toxinelor mai frecvent ntlnite n ara noastr (A, B). n cazul n care n produs exist toxin botulinic, semnele clinice apar la circa 24 de ore iar oarecii mor dup circa 48 de ore de la inocularea produsului care nu a fost supus fierberii (apariia decesului nainte de 2 ore sau dup 48 de ore de la inoculare semnific prezena unei alte cauze). Se poate ncerca identificarea toxinei botulinice i printr-o reacie de tip ELISA. Tehnicile de biologie molecular (PCR) pentru determinarea genei care codific pentru toxina botulinic se pot efectua numai n cazul obinerii culturii de Cl. botulinum, nu i pornind de la produsul patologic (ex. un aliment).

394

50. 5. Tratament Se administreaz ser antibotulinic, preferabil monovalent (dac se cunoate tipul de toxin implicat); dac nu, se folosete ser polivalent. Se poate administra ser trivalent (A, B, E), prompt, pe cale i.v., cu precauiile seroterapiei, n condiii de ventilaie asistat. 50. 6. Epidemiologie Botulismul apare n ntreaga lume, fiind asociat n principal cu consumul de conserve preparate n cas (conserve de fructe, legume, pete). Sursa este reprezentat de alimentele care conin toxina botulinic preformat (n majoritatea cazurilor de botulism) sau de ctre solul contaminat cu spori de Cl. botulinum (ex. n botulismul plgilor). Transmiterea se poate face i prin ingestia de alimente contaminate cu spori (n botulismul infantil i cel al adultului) sau prin inhalarea acestora. Cazurile de botulism, nregistrate n Romnia n anul 1999, au fost n numr de 19, n timp ce n anul 2000 au fost raportate 29 de cazuri, inciden 0,10/0000. n perioada 2000-2005 au fost raportate ntre 14 (2002 i 2006) i 29 (2000) cazuri de botulism n fiecare an. Incidena n anul 2006 a fost de 0,060/0000. n SUA, n 1997 s-au raportat 132 de cazuri de botulism (inciden 0,050/0000), 116 cazuri n 1998 i 154 de cazuri n 1999, cu o inciden de 0,060/0000. n perioada 2000-2005 au fost nregistrate ntre 118 i 155 cazuri de botulism n fiecare an. n afar de sistemul de supraveghere de rutin, autoritile de sntate public americate menin un sistem activ de supraveghere, pentru botulism. n plus, urmresc cazurile de botulism n funcie de etiologie, respectiv cazurile de toxiinfecie alimentar (19 cazuri n 2005, cu un numr de cazuri nregistrate n perioada 1998-2005 care au variat ntre 16 i 39), cazurile de botulism la nou-nscut (85 cazuri n 2005, cu un numr de cazuri nregistrate n perioada 1998-2005 care au variat ntre 65 i 97) i botulismul rnilor sau alte condiii n care cauza nu a fost identificat. Majoritate cazurilor de botulism al rnilor a fost nregistrat la persoane care se drogheaz pe cale intra-venoas (100% n 2005). n anul 2005 s-au nregistrat 2 decese la cazurile de botulism - toxiinfecie alimentar. 50. 7. Profilaxie Este nespecific i const n prelucrarea termic adecvat a alimentelor conservate (preferabil produse industrial), prevenirea contaminrii rnilor, prevenirea consumului de droguri pe cale i.v. etc. 50. 8. Povestiri adevrate 50. 8. 1. Cazuri de botulism n Germania Departamentul de Sntate Public din unul dintre landurile din Germania a comunicat n luna iunie 2003 existena unui focar de botulism care a inclus apte cazuri. Toi cei apte pacieni au participat la o petrecere organizat la o ferm din landul respectiv; ali 22 de participani nu au acuzat nici o problem de sntate. 395

Dei experiena clinic era redus n aceast ar, orientarea spre diagnosticul real a fost foarte rapid, n baza elementelor clinice: toi cei apte pacieni au prezentat uscciune a mucoasei bucale, trei dintre pacieni au prezentat disfagie, n timp ce diplopia (vederea dubl) a fost remarcat de doi dintre pacieni. innd cont i de apariia acestei situaii n focar (date epidemiologice), s-a emis imediat suspiciunea de botulism. Diagnosticul a fost certificat de toxinotipie (folosind animale de experien) i de punerea n eviden printr-o tehnic de tip ELISA a toxinei botulinice la doi dintre pacieni. Evoluia clinic la patru dintre pacieni a fost rapid favorabil, fr a se fi administrat ser antibotulinic. Aceeai patru pacieni au fost externai dup trei zile. n cazul a trei pacieni (toi prezentnd iniial disfagie iar doi dintre ei prezentnd i diplopie) s -a administrat ser trivalent (cu anticorpi anti toxin botulinic A, B i E), iar durata spitalizrii a fost de cinci zile. Evoluia a fost favorabil n cazul tuturor pacienilor, probabil datorit faptului c au consumat o cantitate foarte mic din preparatul incriminat. Ancheta epidemiologic a permis emiterea ipotezei privind alimentul consumat i care ar fi putut s conin toxina botulinic, respectiv crnai de porc preparai la grtar; carnea fusese meninut sub vid n pungi speciale. Nici un alt aliment consumat de cei 29 de meseni nu a putut fi incriminat. Au mai fost raportate i alte cazuri de botulism, n Europa de Vest. 50. 8. 2. Arm biologic sau produs de utilitate (cosmetic, tratament)? Toxina botulinic este una dintre cele mai puternice substane cu caracter de otrav, cunoscute de om. Din acest motiv, exist temerea c toxina produs de Clostridium botulinum (unul dintre tipuri) ar putea s fie folosit ca arm biologic. n scopul prevenirii unei astfel de situaii, att n SUA ct i n alte state occidentale au fost constituite grupuri de specialiti care au drept obligaie monitorizarea oricror posibile atacuri teroriste biologice. Despre un posibil atac cu toxin botulinic, acetia spun c ar putea fi lansat fie prin aerosoli, fie prin alimente iar manifestrile clinice ar putea aprea la 12-72 ore de la expunere. Rspunsul autoritilor va depinde punerea corect (i rapid) a diagnosticului, de raportarea la timp a cazurilor i de realizarea unor anchete epidemiologice eficiente. Cei afectai trebuie s primeasc ser anti-toxin botulinic, precum i tratament complementar, inclusiv ventilaie asistat, la nevoie. Nu se va ntrzia instituirea tratamentului, n ateptarea unui diagnostic de certitudine. n ultima vreme ns, toxina botulinic i-a gsit i alte utilizri, mai panice. Dintre acestea, amintim folosirea ei n cosmetic (unde poate determina tergerea temporar a ridurilor), utilizarea n neurologie (n tratamentul strabismului i blefarospasmului asociate cu distonia cervical) precum i posibila utilizare n tratamentul transpiraiei axilare excesive

51. Clostridiile gangrenei gazoase (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

396

51. 1. Definiie. ncadrare Germenii fac parte din genul Clostridium, sunt bacili Gram-pozitivi, pleomorfi, mobili sau imobili (C. perfringens), anaerobi, care formeaz spori. Principalele specii clostridiene implicate n apariia gangrenei gazoase sunt reprezentate de C. perfringens, C. novyi (C. oedematiens), C. septicum, C. histolyticum i C. sporogenes. Prima dintre aceste specii a fost identificat de ctre Louis Pasteur, n 1877, sub numele Vibrion septique (numele actual Clostridium septicum). n 1892 a fost identificat Bacillus aerogenes capsulatum, cu numele actual Cl. perfringens, ulterior identificndu-se i alte specii (C. novyi 1894, C. histolyticum - 1916); n anul 1935 a fost sesizat prezena n flora microbian normal de la nivelul intestinului gros a speciei Clostridium difficile. Despre gangrena gazoas, numit i mionecroza clostridian, a nceput s se discute n special din timpul primului rzboi mondial. Au fost descrise cazuri de mionecroz clostridian, chiar i n urma unor operaii chirurgicale curate, sau la pacieni la care s-a injectat adrenalin sau insulin.

51. 2. Caractere generale 51. 2. 1. Habitat Clostridiile sunt ubicuitare n natur; sunt prezente n mod normal n tractul digestiv al omului sau al animalelor (ca forme vegetative), fiind apoi eliminate pe sol (prin dejecte), unde n condiii nefavorabile, sporuleaz. Sporii sunt foarte rezisteni. Sursa principal pentru contaminare este reprezentat de sol (germeni telurici). 51. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Sunt bacili Gram-pozitivi, pleomorfi, de dimensiuni mari 1m / 6-10m. C. perfringens este ncapsulat i imobil; celelalte specii menionate includ bacili care n forma vegetativ sunt mobili, cu cili peritrichi. n condiii de anaerobioz formeaz spori mai mari dect diametrul bacililor, localizai central sau terminal. 51. 2. 3. Caractere de cultur Se pot multiplica pe medii simple, n condiii de anaerobioz. C. perfringens crete mai repede (n cteva ore) la 45 C, formnd colonii de tip S sau R. Pe geloz snge produce hemoliz de tip cald-rece (prima zon de hemoliz apare la termostat i este nconjurat de o a doua zon de hemoliz mai larg, dup meninere n ghea). Celelalte clostridii formeaz colonii mai ntinse, cu aspect de grenad explodat (datorit mobilitii).

397

51. 2. 4. Caractere biochimice Toi aceti germeni elaboreaz enzime cu caracter de toxine care prezint histotropism i pot distruge orice tip de esut, cu producere de gaz. Exemple de astfel de toxine sunt: lecitinaza, care acioneaz asupra lecitinei din esutul nervos, diferite proteaze, hialuronidaze, colagenaze, sialidaza etc. Singura structur care are numai un caracter enzimatic este -toxina (lecitinaza C). Pe geloz glucozat cu glbenu de ou, tulpinile productoare de a-toxin descompun lecitina i conduc la opacifierea mediului. Cl. sporogenes i Cl. perfringens elaboreaz bacteriocine cu efect asupra Cl. botulinum. 51. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Formele vegetative sunt distruse de meninerea timp de 15-20 de minute la 55-60 C i de aciunea dezinfectantelor uzuale. Sporii rezist la temperatura de 100C, fiind distrui prin autoclavare la 120 C i 1 atm. timp de 30 de minute, precum i la pupinel, timp de 1 or la 180C. n mediu, pe sol, sporii rezist timp ndelungat. 51. 2. 6. Structur antigenic Bacilii genului Clostridium au antigene parietale (somatice), antigene capsulare de tip K (la C. perfringens), antigene flagelare de tip H (la C. novyi, C. septicum, C. histolyticum i C. sporogenes) i antigene solubile, reprezentate de exotoxine. Spre exemplu, C. perfringens poate elabora mai multe tipuri de toxine. Dac n trecut erau cunoscute toxinele notate A-D, ulterior A-F, n momentul de fa se conosc patru toxine majore (numite , , i ), nou toxine minore i enterotoxinele implicate n toxi-infecii alimentare. 51. 2. 7. Rspuns imun Apare un rspuns imun umoral cu sintez de anticorpi anti-toxici, care nu au utilitate n cursul bolii. Sinteza de anticorpi dup administrarea de anatoxine ar putea fi ns util. 51. 2. 8. Caractere de patogenitate Clostridiile gangrenei gazoase sunt patogene prin multiplicare, invazivitate i toxinogenez. Germenii se multiplic la poarta de intrare. Au proprieti invazive, naintnd din aproape n aproape, prin distrugerea esuturilor (efecte necrolitice, hemolitice i letale). Enzim ele (toxinele; vezi 51.2.6) produse contribuie la invazivitate i alterarea grav a strii generale. 51. 3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produse Infecia cu aceti germeni determin gangrena gazoas, caracterizat prin edeme dure, crepitante (cu apariia de gaz, n urma fermentrii zaharurilor), necroz i gangren (necroz). Sporii clostridieni ajung la nivel tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). n condiii de anaerobioz sporii germineaz, formele vegetative se multiplic, n cursul metabolismului fermenteaz zaharuri i apare gaz. Distensia tisular, obstruarea mecanic a structurilor 398

vasculare (scade aportul sanguin) n conjuncie cu sinteza de toxine cu efect necrotizant i sinteza de hialuronidaz, favorizeaz diseminarea infeciei. Necroza tisular se extinde, multiplicarea bacterian se amplific, apare anemie hemolitic, toxemie i evoluie (n 20 -80% din cazuri) ctre deces. De regul gangrena gazoas apare printr-o infecie concomitent cu 2 sau mai multe dintre speciile clostridiene menionate. 51. 4. Diagnostic Se face pe baza aspectelor clinice i a istoricului bolii. Diagnosticul poate fi bacteriologic, cu recoltarea i transportul produsului patologic (esuturi devitalizate, puroi), care trebuie examinat microscopic, cultivat i coloniile izolate n condiii de strict anaerobioz trebuie identificate. n continuare, vom prezenta cteva elemente privind diagnosticul de laborator n infeciile clostridiene. nainte de a ncerca aceast particularizare, dorim s menionm faptul c exist i alte microorganisme anaerobe de interes medical (bacili Gram-pozitivi nesporulai, bacili Gramnegativi, coci Gram-pozitivi i Gram-negativi precum i spirochete anaerobe). Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de germenii anaerobi este laborios, costisitor i de regul poate fi definitivat numai n laboratoare specializate. Sunt necesare dotri speciale i un personal medical cu experien. Privind diagnosticul bacteriologic n infeciile produse de microorganismele din genul Clostridium, facem urmtoarele precizri. 1. Etapa de recoltare i transport a p.p. este esenial; trebuie meninute condiiile de anaerobioz (vezi i anexa nr. 2 i anexa nr. 6). 2. Din punct de vedere macroscopic am putea meniona mirosul putrid al p.p., prezena unor fragmente de esut necrotic, a unor secreii de culoare nchis, existena de snge i puroi n plag etc. Examenul microscopic are rol orientativ. Pentru majoritatea laboratoarelor este unica activitate care poate fi realizat atunci cnd agentul etiologic este un microorganism anaerob. n rezumat, examenul microscopic direct trebuie s fie realizat, iar observaiile se vor interpreta n context. C. tetani are dimensiuni de 0,5-2 m / 2-18 mm i poate prezenta un spor rotund localizat terminal, C. botulinum are dimensiuni de 0,5-1,5 mm / 3-20 mm i poate prezenta un spor oval localizat central sau subterminal iar C. perfringens are dimensiuni de 0,5-1,5 m / 1,5-19 mm i poate prezenta un spor oval localizat subterminal. Examenul microscopic poate permite n acelai timp un control al calitii p.p. (evideniind prezena celulelor inflamatorii i a celulelor lezate) i ar putea servi la alegerea terapiei antimicrobiene (de ex. disocierea ntre ceea ce vedem la examenul microscopic i lipsa apariiei culturii, ne poate face s ne gndim la o infecie cu germeni anaerobi i s alegem pentru tratamentul de prim intenie medicamente cu eficacitate asupra acestor microorganisme). 3. Pentru cultivarea p.p. vom pregti cel puin 3 medii de cultur: bulion VF (viande-foi) cu acid tioglicolic i albastru de metilen (care testeaz digestia crnii de ctre clostridii), mediul geloz399

snge suplimentat cu neomicin 100 g / ml incubat n anaerobioz i mediul geloz-snge incubat n condiii aerobe. Pentru p.p. provenite din abcese sau din plgi care sugereaz gangrena gazoas am putea folosi i mediul Nagler (cu glbenu de ou) care permite evaluarea producerii de lecitinaz i lipaz. Pentru a distruge formele vegetative i a reine sporii putem proceda aa cum am artat n capitolul 10 (tehnici de izolare speciale). Incubarea n condiii de anaerobioz dureaz 24-48 de ore la 35-37C. nainte de a trece la etapa de identificare trebuie s ncercm s dovedim c am izolat germeni anaerobi i s verificm puritatea culturii care urmeaz a fi identificat. n condiiile n care p.p. a fost nsmnat pe 2 plci cu geloz-snge incubate aerob i anaerob, este util s realizm examenul microscopic al coloniilor. Dac apar colonii asemntoare n ambele plci iar din punct de vedere microscopic prezint caractere similare, este vorba de microorganisme facultativ anaerobe. Dac pe frotiurile din coloniile izolate pe mediul incubat n anaerobioz apar i alte tipuri morfologice, nseamn c exist microorganisme strict anaerobe. Pentru a verifica puritatea culturii obinute, nainte de a trece la etapa de identificare, repicm coloniile suspecte n bulion VF regenerat (prelevm colonia prin decupare cu geloza subiacent). Incubm timp de 24 ore la 35-37C. n cazul n care exist multiplicare bacterian procedm la a. realizarea unui frotiu colorat Gram (i comparm rezultatele cu cele obinute anterior); b. repicarea pe o pant de geloz nutritiv cu incubare n aerobioz (nu trebuie s apar cultur bacterian n cazul n care bacteriile izolate anterior sunt anaerobe). Dac rezultatele sunt corecte, trecem la identificarea microorganismelor. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere, aa cum am discutat i n capitolele precedente.

Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-pozitivi cu dimensiunile menionate mai sus; n culturi nvechite bacteriile pot fi Gram-negative i se pot detecta endosporii (care deformeaz bacilii); n cazul n care la examenul microscopic nu evideniem spori vom repica cultura pe mediul Nagler, cu incubare 48 de ore la 35-36C i apoi la temperatura camerei; urmrim sporularea pe un nou frotiu colorat Gram; putem evalua fenomenul de sporogenez i prin metode de cultur (vezi mai jos);

400

Caractere de cultur: speciile mobile (marea majoritate) formeaz la suprafaa mediului colonii de tip S, cu margini ondulate, neregulate, cu tendin de invadare a mediului (datorit mobilitii); n jurul coloniilor remarcm prezena -hemolizei; dac a avut loc inocularea i n profunzimea mediului, coloniile au aspect pufos; Clostridium perfringens (specia imobil) formeaz colonii de dimensiuni mari, de tip S, rotunde, cu margini regulate, convexe dar care pot avea i aspect rugos; majoritatea tulpinilor produc hemoliz dubl (zona intern, de -hemoliz, este mai ngust n timp ce zona extern, de -hemoliz este mai larg); exist i tulpini care produc zone foarte largi de hemoliz precum i tulpini slab hemolitice; prin cultivare putem s evalum i fenomenul de sporogenez (cunoscut fiind c sporii rezist timp de 10 minute la temperatura de 80C);

dac pe frotiul din cultur colorat Gram nu evideniem spori, pregtim 2 tuburi cu bulion pepton, glucoz, amidon i extract de levur;

repicm coloniile suspecte n cele 2 tuburi iar unul dintre tuburi n supunem unei temperaturi de 80C, 10 minute;

incubm cele 2 tuburi la 35-37C pn apare multiplicarea bacterian;

dac bacteriile se dezvolt n ambele tuburi, am dovedit existena sporilor;

401

dac dup o incubare de cel mult 10 zile nu apare multiplicare bacterian n tubul supus la temperatur crescut, nu exist spori;

Caractere biochimice:

exist foarte numeroase caractere biochimice care pot fi utile n diferenierea speciilor de clostridii (testarea este rezervat centrelor specializate);

n identificarea microorganismelor din acest gen utilizm iniial testarea producerii de lecitinaz i lipaz;

pe mediul Nagler inoculm n striu tulpina (se pot testa concomitent mai multe tulpini);

pentru aprecierea producerii de lecitinaz incubarea dureaz 48 de ore;

n cazul n care testul este pozitiv (precipitat opac n mediul din jurul striului de cultur) poate fi vorba de o tulpin de C. perfringens; testul este negativ pentru C. tetani sau pentru C. botulinum;

pentru tulpinile lecitinaz-pozitive, se mai pot testa mobilitatea, fermentarea lactozei, producerea de lipaz, ureaz, hidroliza gelatinei, digestia crnii etc.;

402

 pentru aprecierea producerii de lipaz incubarea dureaz 1 sptmn;

n cazul n care testul este pozitiv (film perlat, iridescent la nivelul striului de cultur i n mediul adiacent) poate fi vorba de o tulpin de C. botulinum; testul este negativ pentru C. tetani i C. perfringens; testul plcilor semineutralizate poate fi practicat la nivelul centrului de referin;

folosim o plac cu mediul Nagler;

pe jumtate din plac etalm anti-toxin (lecitinaz);

dup uscarea plcii inoculm n striuri o tulpin martor pozitiv, o tulpin martor negativ i cteva tulpini de testat;

incubm timp de 18-24 de ore la 35-37C n anaerobioz;

C. perfringens (ca i tulpina M+) d un rezultat pozitiv doar pe jumtatea de plac fr antitoxin; -

403

testul inhibiiei sialidazei se poate realiza n 2-6 ore; este pozitiv pentru C. perfringens i negativ pentru C. septicum; Creterea n lapte turnesolat sau cu bromcrezol purpur (C. perfringens produce cheag alveolar n laptele turnesolat); Clostridiile sunt sensibile la vancomicin i rezistente la colistin; ali autori propun testarea sensibilitii la metronidazol;

Caractere antigenice: pot fi evaluate n centrele de referin;

Alte teste care pot fi efectuate la nivelul centrelor de referin demonstrarea prezenei tetanospasminei prin seroneutralizare la oareci (un animal este protejat cu 1-2 ore nainte de test prin injectare subcutanat a 1.000 de UAI de anti-toxin tetanic; injectm la ambele animale 0,5 ml din cultura pe mediu lichid; animalul protejat supravieuiete, iar cellalt va prezenta semne tipice de tetanos); testarea (la om) a prezenei anti-toxinei tetanice n titruri protective prin ELISA sau hemaglutinare (T 0,01 UAI / ml); demonstrarea prezenei toxinei botulinice n alimente, materii fecale, ser sau n medii de cultur;

spre ex. prelevm din bulionul VF pe care am identificat multiplicarea bacterian, centrifugm iar supernatantul l mprim n 2 tuburi;

404

 unul dintre tuburi l supunem temperaturii de 100C (toxina botulinic este termosensibil);

inoculm intraperitoneal p.p. la dou loturi de oareci;

dac oarecii injectai cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba de toxina botulinic;

urmrim oarecii timp de 2-4 zile pentru a remarca apariia semnelor de botulism (reducerea mobilitii, respiraii ample, contracii ale muchilor abdominali urmate de convulsii i deces);

prezena toxinei botulinice poate fi confirmat prin seroneutralizare (protejm spre ex. un animal de laborator cu anti-toxin de tip A i un alt animal de laborator cu anti-toxin de tip B dup care i injectm cu p.p. respectiv; dac animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A supravieuiete iar cellalt animal moare cu semne caracteristice pentru botulism, n mediul de cultur a existat C. botulinum de tip A); Titrarea toxinei botulinice, prin metoda DL50 (folosind injectarea p.p. n vena cozii i curbe standard pentru interpretare, pentru fiecare serotip); Titrarea toxinei botulinice printr-o tehnic de tip ELISA (poate detecta pn la 10 picograme); Utilizarea tehnologiei de amplificare genic (PCR) pentru structurile care codific sinteza diferitelor toxine etc. 5. Antibiograma nu se realizeaz, de regul. Clostridiile sunt sensibile la penicilin, cefalosporine, vancomicin, tetracicline, metronidazol etc, ns tratamentul este mult mai complex; n unele dintre bolile clostridiene eficacitatea tratamentului cu antibiotice sau chimioterapice nu a fost dovedit. 405

51. 5. Tratament Tratamentul trebuie instituit de urgen i include n primul rnd toaleta chirurgical a plgii (debridri extinse, eliminarea esuturilor devitalizate), administrarea de penicilin, administrare de oxigen hiperbar precum i administrarea de ser antigangrenos. 51. 6. Epidemiologie Sursa de infecie este reprezentat de om i animale, care elimin germenii pe sol prin dejecte. Transmiterea se face prin pmnt contaminat cu spori; poarta de intrare n organism este de regul o plag cutanat. 51. 7. Profilaxie Se realizeaz prin tratamentul corespunztor al plgilor, n special al celor anfractuoase, contaminate cu pmnt, praf etc. Utilizarea imunoglobulinelor antitoxice poate fi util. Vaccinurile (anatoxine) sunt utilizabile, dar nu au intrat n practica curent. 51. 8. Povestiri adevrate 51. 8. 1. Gangren gazoas la un pacient traumatizat Pacientul de sex masculin n vrst de 65 de ani s-a internat pentru multiple plgi mpucate la nivelul toracelui i umrului stng, suferite n cursul unui accident de vntoare. La internare, pacientul se afla sub influena alcoolului (alcoolemia era de 2,29o/oo), n stare de oc traumatic, incontient, cu tulburri respiratorii. S-au iniiat procedurile obinuite de resuscitare. Radiografia toraco-cardio-pulmonar a evideniat (pe lng multiple fracturi costale i scapulare) un hemopneumothorax stng cu emfizem toracic subcutanat important. S -a practicat toracotomie lateroposterioar cu evacuarea hematomului pleural i suturarea esutului pulmonar dilacerat; s-a instalat drenaj aspirativ pleural. Dup intervenia chirurgical, s-a instituit antibioterapia empiric cu spectru larg, administrndu-se piperacilin cu tazobactam. Dup trei zile de tratament, starea pacientului prea s fie stabil. n a patra zi s -a observat apariia (la nivelul plgii operatorii) a unui exsudat serosanguinolent, n jurul creia esuturile erau edemaiate i hiperemice. La palparea zonei s-au perceput crepitaii subcutanate. S-a intervenit chirurgical, s-a incizat i s-a constatat prezena esuturilor necrozate; s-a realizat o excizare larg a acestor esuturi. S-au recoltat probe intraoperator i s-au utilizat sisteme de transport att n aerobioz ct i n anaerobioz. Culturile obinute, n anaerobioz i aerobioz, au fost pozitive pentru Clostridium perfringens tip A (productor de toxine alpha, theta i kappa), Staphylococcus aureus i Enterococcus spp. S-a luat decizia instituirii terapiei cu oxigen sub presiune. n urmtoarele opt zile, pacientul a fost supus unui numr de cincisprezece edine de oxigenoterapie hiperbar. Tratamentul antibiotic a fost modificat, eliminnd combinaia dintre piperacilin - tazobactam i introducndu-se n tratament penicilin G asociat cu metronidazol (ambele administrate n

406

perfuzie i.v.). S-a efectuat zilnic toaletarea plgii, chiuretarea i eliminarea esuturilor sfacelate, a tuturor zonelor care preau s prezinte necroz i s-au aplicat substane antiseptice, local. Pe parcursul tratamentului au fost recoltate din nou probe, care au fost transmise ctre laborator, pentru diagnostic bacteriologic; nu au mai fost puse n eviden specii de germeni anaerobi, ns s-a identificat contaminarea plgii cu germeni multirezisteni, de spital, respectiv cu Enterococcus faecium i Acinetobacter baumanii. n aceste condiii, tratamentul medicamentos antibacterian a fost modificat, din nou, oprindu-se administrarea de penicilin G, instituindu-se tratament cu vancomicin i netilmicin; administrarea de metronidazol pe cale i.v. a continuat. S-a continuat i examinarea zilnic a plgii, executnd excizarea esuturilor necrotice i n aceste condiii, datorit pierderilor suferite, pacientul a fost supus i la dou operaii de autotransplant tegumentar. Dup 67 de zile de spitalizare, supraveghere foarte atent, tratament agresiv combinnd o serie de medicamente cu utilizarea tehnicilor chirurgicale, pacientul a fost externat (stabil din punct de vedere al funciilor vitale, cu o stare general relativ bun, fr febr, fr alte acuze subiective, plaga nchizndu-se n condiii bune - comparativ cu situaia i riscurile iniiale). Discuii: Exist date statistice n baza crora se estimeaz c aproximativ 50% dintre infeciile cu Clostridium spp. sunt post-traumatice, circa 35% se dezvolt la nivelul marilor plgi chirurgicale, iar 15% ar putea s apar spontan (atraumatic sau metastatic). Evoluia acestor infecii este de multe ori grav, cu potenial deces. Situaia prezentat se refer la o infecie sever cu Clostridium perfringens tip A, infecie care a determinat mionecroz extins i stare toxic fa de care personalul din serviciul ATI se putea atepta la orice tip de evoluie. De regul, n astfel de cazuri, simptomele gangrenei gazoase pot s apar chiar la 6-8 ore de la momentul n care sporii bacterieni au ptruns i n condiii de anaerobioz au trecut n form vegetativ i au nceput s se multiplice i s sintetizeze o serie de factori de patogenitate (toxina , toxina ). Accentuarea rspunsului inflamator poate fi extrem de rapid; leziunea (distrugerea tisular, sfacelarea esuturilor, necrozele locale) poate avansa cu civa centimetri pe or. Incidena ocului septic i a insuficienei multi-organice n aceste cazuri este estimat la 50%, iar procentul de mortalitate la 40% (chiar i dac se instituie tratamentul potrivit). Alfa-toxina, prin activitatea ei lecithinase-like i haemolysin-like, produce lezarea membranelor celulare (cu efect letal la nivelul diverselor esuturi), produce liz, hemoliz i agregare plachetar, lezarea leucocitelor i a celulelor endoteliale. Efectul toxinei creeaz conglomerate de fibrin, leucocite i plachete care oblitereaz vasele sanguine. n plus, lezeaz celulele miocardice, cu efecte asupra funciei cardiace (aritmii, hipotensiune, bradicardie i oc cardiogenic). Alfa-toxina prezint i proprieti dermonecrotice; prin inhibiia asupra funciei PMN neutrofile, acestea pierd capacitatea de a penetra la nivelul esutului lezat (leucostazis). Teta-toxina (denumit hemolizin letal sau perfringolizina O) este responsabil pentru necroza tisular, creterea permeabilitii vaselor sanguine; are i efect cardiotoxic.

407

Cazul prezentat a avut, n final, o evoluie favorabil, implicnd resurse extrem de importante, umane, tehnice, materiale iar costurile au fost de asemenea foarte mari. Este un exemplu clar n care prevenirea ar fi putut face cu mult mai mult i mult mai la timp n comparaie cu tratamentul. 51. 8. 2. Miocardit prin infecie cu Clostridium novyi tip B n literatura de specialitate a fost prezentat un caz de miocardit clostridian, cu debut acut, la o pacient (n aparen) fr factori de risc pentru infecia cu clostridii. Pacienta n vrst de 23 de ani se prezint la camera de gard pentru dureri toracice i dispnee. Bolnava prezenta un istoric de o sptmn de afeciune la nivelul cilor respiratorii superioare, iar nainte de debutul simptomelor, aparintorii i-au amintit, ulterior, c suferise un traumatism cu plag minor la nivelul minii (probabil poarta de intrare pentru infecie). Pacienta fusese diagnosticat n urm cu cinci ani cu lupus eritematos sistemic (LES), pentru care nu primea tratament; a afirmat c nu consum alcool sau droguri. La internare a prezentat febr (38,5C), hipotensiune arterial (90 / 50 mmHg). Testele de laborator au evideniat 8.200 leucocite/ mm3 (63% neutrofile segmentate, 12% neutrofile nesegmentate). Reactanii de faz acut au avut valori certificnd inflamaia. Cu toate c examenul clinic pentru sistemul cardiovascular a fost n limite normale (cu excepiile menionate mai sus), electrocardiografia a evideniat tulburri de ritm, ritm cardiac de 130 bti / minut i tulburri de conducere. n ciuda tratamentului complex aplicat, pacienta a evoluat ctre stop cardiac i a decedat la 15 ore de la internare. Examenul anatomopatologic a permis evidenierea la nivel miocardic a unor bacili Gram-pozitivi, infiltrat inflamator i necroz miocardic, fr alte modificri patologice. Produsul recoltat a fost transmis ctre laborator pentru diagnostic bacteriologic, care a rmas negativ. Extracia de ADN urmat de amplificare genic (PCR) a permis stabilirea etiologiei, reprezentat de Clostridium novyi tip B. Discuii Fcndu-se un studiu retrospectiv, al nregistrrilor medicale i a literaturii de specialitate, s -a constatat c pe o perioad de circa 40 de ani au mai fost menionate alte 16 cazuri de miocardit cu etiologie posibil clostridian, clasificate fie ca mionecroz (n lipsa rspunsului inflamator) fie ca abces miocardic (asociat cu rspuns inflamator). n cazul prezentat nu s-au evideniat leziuni gazoase la nivelul miocardului, iar reacia inflamatorie a fost predominant limfocitar, n timp ce n toate celelalte cazuri raportate reacia a fost cu neutrofile. n infeciile miocardice se estimeaz c etiologia clostridian este dominat de C. perfringens urmat de C. septicum, C. fallax. Cu toate c la nivelul respectivului traumatism de la mn nu s-a evideniat abces sau celulit, probabil c acesta a constituit poarta de intrare pentru infecie.

408

Toate cele 17 cazuri raportate pn n momentul de fa au evoluat ctre exitus, rapid. 51. 8. 3. Cum se procedeaz corect n faa unei posibile epidemii Un exemplu n acest sens ne este oferit de Finlanda, una din cele mai dezvoltate ri de pe glob, care are i un sistem de sntate public foarte bine pus la punct, incluznd un sistem de supraveghere foarte performant. Pe 18 Octombrie 2007 s-a descoperit o tulpin de Clostridium difficile, la un pacient internat i tratat la acea dat pentru infecie urinar. Aceast tulpin fcea parte din subtipul III, ribotipul 027. Respectiv pacient a decedat din cauza colitei pseudomembranoase, afeciune care poate fi considerat tipic pentru acest microorganism. Pornind de la aceast situaie, s-a pus la punct un studiu retrospectiv pentru a se vedea dac acest caz a fost unul izolat, sau dac face parte dintr-o posibil izbucnire epidemic (outbreak). n urma acestor investigaii s-au descoperit 100 de cazuri de infecie cu Clostridium difficile, ns numai 2 alte persoane care prezentau aceeai tulpin cu cazul detectat iniial. Celelalte 2 persoane fuseser ambele persoane n vrst i decedaser datorit complicaiilor produse de infecie. Ceea ce i-a pus n alert ns pe epidemiologii finlandezi, a fost faptul c toate cele 3 persoane infectate cu aceast tulpin (identificat i subtipat recent) nu avuseser contact cu nimeni din afara comunitii i nici ntre ele. Pornind de la aceast informaie, s-a fcut presupunerea c ar mai putea exista i alte cazuri care ar putea s fac legtura ntre cele 3 victime. n aceste condiii, ancheta epidemiologic a continuat. A fost stabilit la nivel naional c infeciile cu Clostridium difficile reprezint o prioritate pentru toate laboratoarelor de microbiologice finlandeze; acestea au fost solicitate s raporteze toate cazurile ctre Registrul Naional de Boli Infecioase. n acelai scop, la nivelul clinicilor medicale s-a adoptat un protocol de urgen, stabilindu-se care trebuie s fie reacia (coordonat) n cazul n care vor mai aprea astfel de cazuri. S-a pus la punct i un curs de instruire pentru cadrele medicale, n vederea recunoaterii, diagnosticrii i tratrii persoanelor infectate cu acest patogen. Este de remarcat modul profesionist, serios, eficient, n care autoritile de sntate public au reacionat pornind de la un singur caz. A fost studiat infecia produs de un microorganism cunoscut de foarte mult vreme, dar care a crui tulpin a fost subtipat i s-a dovedit c este vorba de un subtip nou, fa de care s-a stabilit c trebuie luate msurile cele mai potrivite de prevenire i control. 51. 8. 4. i tot despre gangrena gazoas ... Inocularea anaerobilor din genul Clostridium n zone anatomice inextensibile, de exemplu ntre aponevrozele musculare, prin leziuni de contiguitate, poate duce la apariia unui aa zis 409

sindrom de compartiment. Anaerobii se multiplic la acel nivel n condiii optime, cu creterea presiunii care limiteaz mult aportul sanguin (care ar fi trebuit s favorizeze prezena celulelor necesare fagocitrii, sau a antibioticului). Pacientul prezint o tumefacie nu foarte impresionant la nivelul unei zone musculare, dar cu semne clinice de suferin sever sistemic. Puncia la nivelul leziunii musculare, va evidenia un aspect de cultur pur, fr elemente inflamatorii (lipsa PMN, macrofage ...), doar cu germeni uneori polimorfi, pe care dac nu i cultivm pe medii n anaerobioz, vom avea surpriza c ... nu cresc. n faa unui asemenea frotiu, apelm rapid la un chirurg care s intervin i s debrideze larg, deoarece mai poate salva membrul respectiv de aciunea destructiv a anaerobilor!

52. Genul Mycobacterium. Mycobacterium tuberculosis (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Henriette Stavri, D Stavri)

52. 1. Definiie. ncadrare Identificarea i tratarea infeciilor datorate mycobacteriilor a nceput s fie realizat dup descoperirea bacilului tuberculozei (numit iniial Bacterium tuberculosis) i a bacilului leprei (Bacillus leprae). Primele ncercri de clasificare s-au realizat n anul 1896, cnd s-a propus ca genul Mycobacterium s includ M. tuberculosis i M. leprae. Cu ajutorul unei clasificri bazate pe caractere morfologice (bacili, imobili) i tinctoriale (bacili acid-alcoolo rezisteni, BAAR), cele dou specii se difereniau cu oarecare dificultate de speciile aparinnd altor genuri precum: Nocardia, Rhodococcus sau Corynebacterium. Din acest motiv putem afirma c elementele minimale necesare stabilirii apartenenei la genul Mycobacterium ar putea fi reprezentate de: 1. rezistena la decolorarea cu acid-alcool; 2. prezena unor acizi mycolici care conin 60-90 atomi de carbon i care pot fi clivai prin piroliz n acizi grai cu 22 i respectiv 26 atomi de carbon; 3. un coninut procentual de G+C de 61-71%. n afar de M. tuberculosis i M. leprae, au fost descoperite o serie de alte mycobacterii considerate anterior saprofite dar care fiind condiionat patogene, sunt relativ frecvent implicate n patologia gazdelor imunocompromise. Aceste mycobacterii au fost denumite n mod diferit, fie folosind termenul de mycobacterii ne-tuberculoase (non-tuberculous mycobacteria, NTM), fie alte denumiri sinonime (mycobacterii atipice, mycobacterii altele dect M. tuberculosis, MOTT etc). Exist diferite sisteme de clasificare care ar putea fi utilizate pentru gruparea speciilor mycobacteriene. n mod clasic toate speciile de NTM sunt incluse n patru grupe, pe baza ratei de multiplicare i a pigmentogenezei. n acest sistem, elaborat de Ernst Runyon, pigmentogeneza este evaluat att dup, ct i fr expunere la lumin. Mycobacteriile cu ritm lent de multiplicare fotocromogene, ale cror colonii se pigmenteaz numai dup expunere la lumin (ex. M. kansasii, M. marinum) fac parte din grupul I. Mycobacteriile cu ritm lent de multiplicare scotocromogene, ale cror colonii se pigmenteaz la ntuneric (ex. M. scrofulaceum, M. gordonae, M. szulgai) fac parte din grupul al II-lea. Mycobacteriile cu ritm lent de multiplicare nefotocromogene (ex. complexul M. avium) fac parte din grupul al III-lea. Din 410

grupul al IV-lea fac parte mycobacteriile cu ritm de multiplicare rapid (ex. M. fortuitum, M. chelonae). n momentul de fa n genul mycobacterium sunt clasificate peste de specii diferite, multe dintre acestea fiind larg rspndite n natur. 52. 2. Caractere generale 52. 2. 1. Habitat Mycobacteriile ne-tuberculoase se ntlnesc ubicvitar. M. tuberculosis (hominis, bovis, africanum) se gsete n organismele infectate, de regul la nivel pulmonar i n cazul infecieiboal poate fi eliminat n mediul extern prin tuse (n sput sau n nuclei de pictur) sau prin lapte (dac este cazul unui animal bolnav, infectat cu M. bovis). 52. 2. 2. Caractere morfotinctoriale n esuturile animalelor bolnave bacilii tuberculoi apar ca bastonae subiri, rectilinii, cu dimensiunea de 0,4 / 3 m, acid-alcoolo rezisteni (apar roii pe fond albastru la coloraia ZiehlNeelsen), imobili, necapsulai, nesporulai. Examenul microscopic rmne o etap esenial n diagnosticul unei infecii mycobacteriene att n momentul examinrii unui produs patologic (examenul microscopic direct) ct i n momentul cnd prin microscopie se confirm (sau infirm) morfologia i tinctorialitatea microorganismelor dintr-o colonie izolat, respectiv acid-alcoolo rezistent i apartenena la genul Mycobacterium. n tabelul urmtor este ilustrat modalitatea de interpretare a rezultatelor examenului microscopic. Tabelul nr. 5 Rezultatele examenului microscopic (coloraie fluorescent i Ziehl-Neelsen)

Fluorescen (200 - 250 )

Notare semicantitativ

Ziehl-Neelsen (900- 1000 )

BAAR negativ

1-2/30cmpuri

1-2/300cmpuri

1-9/10cmpuri

1+ (+)

1-9/100cmpuri

1-9/1cmp

2+ (++)

1-9/10cmpuri

10-90/1cmp

3+ (+++) 411

1-9/1cmp

>90/1cmp

4+ (++++)

>9/1cmp

Fiecare treapt a gradaiei cantitative se refer la aceeai suprafa de frotiu examinat (cmpul vizual examinat prin metoda fluorescent este de circa 10 mai mare dect n cazul coloraiei Ziehl-Neelsen). Notaia semicantitativ este obligatorie deoarece exprim unitar densitatea BAAR pe frotiu indiferent de metoda folosit, permind comparaii ntre laboratoare diferite, ntre bolnavi diferii i pentru acelai bolnav n momente evolutive diferite. Dac rezultatul final este nedeterminat trebuie s facem nc un frotiu din acelai produs patologic i s indicm recoltarea unui nou produs patologic. 52. 2. 3. Caractere de cultur n momentul actual, la nivel mondial exist o mare varietate de medii de cultur, unele dintre acestea fiind produse n mod special pentru mycobacteriologie, mycobacteriile dezvoltndu-se n general pe medii complexe. Singura specie cu semnificaie clinic necultivabil este M. leprae. Principial, mediile de cultur utilizate n diagnosticarea unei infecii mycobacteriene se mpart n 3 grupe principale: medii de cultur lichide (bulion 7H9 etc), medii de cultur pe baz de ou (ex. mediul Lwenstein) i medii de cultur bazate pe compoziia n agar. Pentru izolarea primar a mycobacteriilor se pot folosi medii foarte variate, din fiecare grup menionat. Mediile pe baz de ou au ca ingrediente: ou sau glbenu de ou, fin de cartof, sruri, asparagin i glicerol. Mediul este solidificat prin coagulare. Aceste substane reprezint elementele de baz ale mediului clasic Lwenstein-Jensen. Dezvoltarea M. bovis, M. africanum precum i a tulpinilor de M. tuberculosis rezistente la HIN este favorizat de suplimentarea cu 0,4% piruvat de sodiu a mediului Lwenstein-Jensen. Atunci cnd ncercm s realizm izolarea primar, este necesar ca mediile de cultur s se incubeze ntr-o atmosfer de 8-10% CO2. Culturile se incubeaz de rutin la o temperatur de 35-37C. Mediile de cultur solide se vor examina zilnic n prima sptmn dup inoculare iar apoi sptmnal pn la mplinirea a 6-8-12 sptmni, deoarece mycobacteriile tuberculoase au o rat de diviziune de minim 12 ore (30 minute la E. coli). M. tuberculosis i respectiv M.. bovis-BCG formeaz colonii R, rugoase, neregulate, conopidiforme, grunjoase, greu de emulsionat. Tulpinile de M. tuberculosis rezistente la HIN pot forma colonii de tip S. M. bovis formeaz colonii de tip S, rotunde, netede, umede, uor emulsionabile. 52. 2. 4. Caractere biochimice n cazul c mycobacteria izolat este non-cromogen (nu produce pigmeni) se vor examina caracterele de cultur (colonii de tip R-rugoase pentru M. tuberculosis sau M. bovis, sau Snetede pentru M. bovis) i se va trece la identificarea speciei pe baza a cteva teste fenotipice clasice i anume: testul producerii de niacin, testul reducerii nitrailor, testul catalazei la 22C i 412

la 68C, hidroliza tween 80, susceptibilitatea la hidrazida acidului 2-tiofen-carboxilic (TCH) i susceptibilitatea la acidul p-amino salicilic (PAS). Primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M. tuberculosis (n timp ce pentru M. bovis numai al 3-lea test este pozitiv). Testul catalazei la 68C i respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative pentru ambele specii (hidroliza Tween 80 poate fi pozitiv pentru M. tuberculosis). M. tuberculosis se dezvolt pe mediul cu TCH n timp ce M. bovis (sau M. bovis-BCG este inhibat de ctre aceast substan). Testul este util n special n cazul tulpinilor de M. bovis care prezint reacii pozitive (sau slab pozitive) la primele 2 teste. 52. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici Mycobacteriile, datorit structurii particulare a peretelui celular au o rezisten mai mare att n mediul extern ct i fa de diferite substane chimice. Diferii colorani, precum verde malachit, care au efecte bacteriostatice fa de alte bacterii, pot fi incorporati n mediul de cultur fr a inhiba multiplicarea bacililor tuberculoi. Acizii i bazele pot fi utilizate n procesul de decontaminare al produselor patologice (ex. al sputei) distrugnd microorganismele din flora asociat, dar permind supravieuirea M. tuberculosis. Bacilii tuberculoi sunt rezisteni la uscciune i rezist mult timp n sputa uscat, la ntuneric. Sunt sensibili la aciunea radiaiilor UV. 52. 2. 6. Structur antigenic Constituenii peretelui celular sunt recunoscui pentru capacitatea de a induce apariia unui rspuns imun de tip celular i respectiv a unei hipersensibiliti de tip IV. Se accept faptul c aceti constitueni sunt implicai n inducerea unui grad de rezisten fa de o nou infecie (premuniie). Mycobacteriile prezint la nivelul peretelui celular o cantitate important de lipide, inclusiv acizii mycolici (cu lan lung de atomi de carbon, C78-C90), ceruri (ex. ceara D) i fosfatide. Ceara D pare a fi implicat n inducerea strii de hipersensibilitate. Lipidele sunt cuplate cu proteine i polizaharide. Numeroase polizaharide au fost identificate n structura mycobacteriilor. O parte dintre acestea reprezint antigene utilizate n identificarea prin metode imunologice a prezenei anticorpilor anti-mycobacterieni. n vederea evalurii strii de reactivitate fa de infecia tuberculoas se poate utiliza intradermoreacia la tuberculin (PPD, derivat proteic purificat) substan proteic, mai precis filtratul unei culturi de M. tuberculosis, filtrat care s-a dovedit c are n compoziie mai multe proteine elaborate n cursul metabolismului bacilului tuberculos. Fa de proteinele mycobacteriene apar anticorpi care pot fi individualizai prin metode de laborator. 52. 2. 7. Rspuns imun Apare att un rspuns imun de tip umoral (anticorpii anti-mycobacterieni pot fi evideniai prin diferite tehnici, de ex. ELISA, ns metodologia nu este nc standardizat) ct i un rspuns 413

imun de tip celular. Mecanismele imunitii celulare sunt implicate att n protecia fa de mbolnvire ct i n unele evenimente patologice care apar n cursul tuberculozei. 52. 2. 8. Caractere de patogenitate Se estimeaz c la nivel mondial, numrul persoanelor infectate cu M. tuberculosis este de aproximativ 1,7 miliarde i cu toate c aproximativ 1/3 din populaia globului este infectat, doar circa 10 milioane de persoane fac anual o form de tuberculoz clinic manifest. Cu alte cuvinte s-ar putea considera c M. tuberculosis nu este un microorganism strict patogen ci condiionat patogen. n plus, trebuie s reinem c atunci cnd este vorba de o persoan imunocompromis, nu putem folosi termenul de mycobacterii nepatogene. M. tuberculosis are capacitatea de a supravieui i de a se multiplica n macrofagele alveolare care nu sunt activate. Interaciunea iniial ntre M. tuberculosis i macrofage, determin att un rspuns din partea LT helper ct i din partea LT citotoxice. Un subset al LT helper (Th2) stimuleaz sinteza de anticorpi, dar aceti anticorpi nu au nici un rol (dovedit) n ceea ce privete protecia. Subsetul de LT helper Th1 sintetizeaz interferon (IFN-) cu rol n stimularea activitii macrofagelor i celulelor endoteliale. Este probabil c la supravieuirea intra-macrofagic s contribuie producerea unor substane numite generic, invazine. Bacteriile sunt fagocitate, sunt incluse n fagolizozomi, dar o parte dintre ele rezist i distrugnd fagolizozomul revin n citoplasma macrofagului. M. tuberculosis are capacitatea de a mpiedica acidifierea la nivel de fagolizozom, probabil prin inducerea sintezei de amoniac Lipoarabinomananul (un glicolipid) din peretele mycobacterian inhib activarea LT, acelai efect avndu-l i antigenul 85 (proteic) care are capacitatea de a lega fibronectina. Factorul cord (acid mycolic parietal, 6-6 dimicolat de trehaloz) pare a fi implicat n producerea leziunilor tisulare i n inhibarea migrrii leucocitare. Fosfolipidele sunt implicate n inducerea necrozei de cazeificare. S-a identificat la oareci o gen implicat n susceptibilitatea la infecia cu tulpina vaccinal. O gen similar se afl la om la nivelul cromozomului 2q; se presupune c prin clonarea acestei gene s-ar putea identifica grupele populaionale susceptibile la tuberculoza-boal. Totui trebuie menionat c n ciuda a numeroase studii realizate n peste 100 de ani, nu s-a stabilit de fapt care este structura implicat cu certitudine n patogenitatea mycobacterian i nici care este mecanismul exact care face ca rezultatul interaciunii microorganism-gazd s fie att de diferit de la un caz la altul. 52. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse Nucleii de pictur care au diametrul de 1-3 m au capacitatea de a ajunge dup inhalare pn la nivel alveolar. Intraalveolar chiar dac sunt fagocitate, o parte dintre mycobacterii rmn viabile i chiar se pot multiplica n interiorul celulelor. Pe cale limfatic se poate realiza diseminarea la nivelul majoritii organelor (foarte rar ns apare o multiplicare necontrolat 414

mycobacterian la nivelul ficatului, splinei sau mduvei hematogene). Microorganismele care colonizeaz lobii superiori pulmonari, rinichiul, esutul osos, etc. se pot multiplica considerabil naintea dezvoltrii imunitii specifice. Imunitatea specific este de obicei capabil s limiteze multiplicarea bacililor; gazda rmne asimptomatic i leziunile se vindec. n general, la numai aproximativ 5% dintre persoanele infectate controlul multiplicrii microorganismelor este inadecvat i tuberculoza-boal poate apare n primul an dup infecie. n alte 5% dintre cazuri diminuarea imunitii organismului la un moment mai ndeprtat de momentul infeciei face ca boala s apar. Astfel aproximativ 10% din persoanele infectate cu M. tuberculosis vor dezvolta o form de tuberculoz clinic manifest n cursul vieii. Capacitatea de aprare a organismului poate fi diminuat n cursul unor boli precum silicoza, diabetul zaharat sau boli asociate cu imunodepresie (ex. infecia cu HIV / SIDA), sau datorit corticoterapiei sau medicaiei imunosupresoare. n aceste circumstane probabilitatea dezvoltrii tuberculozei este mult mai mare. Susceptibilitatea la tuberculoz poate fi de asemenea mare n primii doi ani de via, la pubertate i n adolescen. Tuberculoza poate avea localizri extrem de variate, dar cea mai frecvent ntlnit este tuberculoza pulmonar. Pe de alt parte din punct de vedere epidemiologic, pacienii cu tuberculoz pulmonar a cror sput este pozitiv microscopic, reprezint sursa de infecie cea mai important. Tratamentul corect i complet al acestor pacieni este esenial. 52. 4. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de M. tuberculosis Tuberculoza poate avea localizri variate, dar cea mai frecvent ntlnit este tuberculoza pulmonar. Din punct de vedere epidemiologic, pacienii cu tuberculoz pulmonar (care elimin prin sput BAAR) reprezint sursa de infecie cea mai important. Diagnosticul, tratamentul corect i complet al acestor pacieni este esenial. Diagnosticul poate fi sugerat de elemente clinice, paraclinice (ex. radiologice), alte elemente de laborator, dar trebuie confirmat bacteriologic, prin izolarea i identificarea M. tuberculosis. 52. 4. 1. Diagnosticul de laborator microbiologic este n mod esenial bacteriologic, direct; se pot aduga datele obinute n cadrul diagnosticului imunobiologic i serologic. Diagnosticul de laborator bacteriologic include etapele cunoscute. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie inclusiv protecia personalului medical implicat etc). n funcie de forma clinic de tuberculoz se pot recolta urmtoarele produse patologice: sput, lichid de spltur bronic, LCR, urin, lichide recoltate prin puncie articular, peritoneal, pleural, pericardic, probe obinute prin biopsie, puroi etc. Uneori este necesar concentrarea p.p. prin centrifugare. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de sput (vezi i anexa nr. 6). Sputa trebuie decontaminat (de ex. prin tratare cu NaOH 4%) i neutralizat (ex. cu acid) n vederea baciloscopiei i cultivrii. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim trei frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu AM, Gram i 415

respectiv Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivelul tractului respirator (ex. macrofage alveolare), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena BAAR. n esuturile animalelor bolnave bacilii tuberculoi apar ca bastonae subiri, rectilinii, cu dimensiunea de 0,4 / 3 m, acid-alcool rezisteni (apar roii pe fond albastru, toate celulele i bacteriile non-AAR sunt colorate n albastru, la coloraia Ziehl-Neelsen), imobili, necapsulai, nesporulai. Se poate utiliza i coloraia fluorescent. Examenul microscopic rmne o etap esenial n diagnosticul unei infecii mycobacteriene att n momentul examinrii unui produs patologic (examenul microscopic direct) ct i n momentul cnd prin microscopie se confirm (sau infirm) morfologia i tinctorialitatea microorganismelor dintr-o colonie izolat. Rezultatele examenului microscopic (coloraie fluorescent i Ziehl-Neelsen) trebuie cuantificate prin numrul de BAAR n raport cu numrul de cmpuri examinate (10-30 n cazul coloraiei fluorescente, 100-300 n cazul coloraiei Z-N). Spre exemplu, prezena a 1-9 bacili / 10 cmpuri n microscopia cu fluorescen i respectiv a 1-9 BAAR / 100 de cmpuri n microscopia optic permite notificarea n buletinul de analiz a unui rezultat cu 1+ n timp ce prezena a 1090 bacili / 1 cmp n microscopia cu fluorescen i respectiv a 1-9 BAAR / 1 cmp n microscopia optic permite notificarea n buletinul de analiz a unui rezultat cu 3+ (maxim fiind 4+, atunci cnd se identific spre ex. peste 9 BAAR / 1 cmp la coloraia Z-N) (vezi i tabelul nr. 5). Notaia semicantitativ este obligatorie deoarece exprim unitar densitatea BAAR pe frotiu indiferent de metoda folosit, permind comparaii ntre laboratoare diferite, ntre bolnavi diferii i pentru acelai bolnav n momente evolutive diferite. Dac rezultatul final este nedeterminat trebuie s facem nc un frotiu din acelai produs patologic i s indicm recoltarea unui nou produs patologic. Baciloscopia negativ nu exclude diagnosticul de tuberculoz. Din momentul obinerii unui rezultat pozitiv la examenul microscopic direct se poate elabora strategia de diagnostic pentru stabilirea cu exactitate a speciei implicate, urmat de precizarea sensibilitii la antibiotice. n momentul de fa avem la dispoziie 2 tipuri de abordare (eventual utilizate concomitent, n msura n care exist dotarea tehnic necesar) i anume folosirea unor metode de diagnostic convenionale i respectiv folosirea unor metode de diagnostic moderne, mai rapide. Metodele rapide pot fi utile att dup izolarea M. tuberculosis (sau a unei alte mycobacterii) n culturi, ct i direct, pornind de la produsul patologic. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine o cultur pur, care se va identifica. n momentul actual, la nivel mondial, exist o mare varietate de medii de cultur. Mycobacteriile se dezvolt n general pe medii complexe. Mediile de cultur utilizate n diagnosticarea unei infecii mycobacteriene se mpart n 3 grupe principale: medii de cultur lichide (ex. bulion 7H9), medii de cultur pe baz de ou (ex. mediul Lwenstein) i medii de cultur bazate pe compoziia n agar (tip Middlebrook). Pentru izolarea primar a mycobacteriilor se pot folosi medii foarte variate, din fiecare grup menionat. Mediile pe baz de ou au ca ingrediente: ou sau glbenu de ou, fin de cartof, sruri, asparagin i glicerol. Mediul este solidificat prin coagulare. Aceste substane reprezint elementele de baz ale mediului clasic Lwenstein-Jensen la care se adaug verde malachit pentru selectivitate (n acelai scop se pot aduga antibiotice). Dezvoltarea M. bovis, M. africanum precum i a tulpinilor de M. tuberculosis rezistente la HIN este favorizat de suplimentarea cu 0,4% piruvat de sodiu a mediului Lwenstein-Jensen.

416

Atunci cnd ncercm s realizm izolarea primar, este necesar ca mediile de cultur s se incubeze ntr-o atmosfer de 8-10% CO2. Culturile se incubeaz de rutin la o temperatur de 35-37C. Mediile de cultur solide se vor examina zilnic n prima sptmn dup inoculare iar apoi sptmnal pn la mplinirea a 6-8-12 sptmni deoarece mycobacteriile tuberculoase au o rat de diviziune de 12-27 ore. Se pot utiliza i sisteme de cultivare rapid (ex. MB-Bact, Bactec) cu depistarea creterii mycobacteriene n 4-25 de zile. n Romnia aceste sisteme au nceput s fie utilizate n unele centre ncepnd cu anul 1998. Aceste sisteme permit testarea sensibilitii la medicamentele anti-mycobacteriene pentru tulpinile izolate, conform recomandrilor programului naional. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:

Caractere morfotinctoriale: n frotiul realizat din colonia izolat se evideniaz BAAR;

Caractere de cultur: M. tuberculosis i respectiv M. bovis-BCG formeaz colonii R, rugoase, neregulate, conopidiforme, grunjoase, greu de emulsionat, nepigmentate; tulpinile de M. tuberculosis rezistente la HIN pot forma colonii de tip S;

Caractere biochimice: identificarea speciei se realizeaz pe baza a cteva teste fenotipice clasice [testul producerii de niacin, testul reducerii nitrailor, testul catalazei la 22C i la 68C, hidroliza Tween 80, susceptibilitatea la hidrazida acidului 2-tiofen-carboxilic (TCH) i susceptibilitatea la acidul p-amino salicilic (PAS)]; primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M. tuberculosis (n timp ce pentru M. bovis numai al 3-lea test este pozitiv); testul catalazei la 68C i respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative pentru ambele specii (hidroliza Tween 80 poate fi pozitiv pentru M. tuberculosis);

417

M. tuberculosis se dezvolt pe mediul cu TCH n timp ce M. bovis (sau M. bovis-BCG este inhibat de ctre aceast substan); testul este util n special n cazul tulpinilor de M. bovis care prezint reacii pozitive (sau slab pozitive) la primele 2 teste;

Caractere antigenice: se pot examina n centre de referin;

Caractere de patogenitate: M. tuberculosis este patogen pentru cobai; inocularea p.p. la cobai este uneori practicat n vederea diagnosticului;

Alte caractere / teste utilizate n identificare: se pot utiliza (la nivelul unor centre de referin) teste care se bazeaz pe proprieti fenotipice moleculare (ex. studiul cromatografic al acizilor grai din peretele celular) sau genotipice (fragmente de restricie ale materialului genetic, sonde nucelotidice, PCR); exist i posibilitatea testrii sensibilitii fa de anumii mycobacteriofagi etc. 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) poate fi necesar i se realizeaz conform recomandrilor Programului Naional de Control al Tuberculozei. Se pot utiliza metoda concentraiilor absolute, metoda proporiilor, metoda rapoartelor de rezisten, metode radiometrice etc. 52. 4. 2. Diagnosticul imunobiologic are la baz un mecanism de rspuns imun de tip celular. Se utilizeaz intradermoreacia cu tuberculin (PPD, derivat proteic purificat), vezi capitolele 17-18 i anexa nr. 3. IDR cu PPD este mai frecvent folosit n scop epidemiologic dar poate avea i utilitate diagnostic, n special atunci cnd se observ virajul tuberculinic, respectiv test tuberculinic negativ, urmat de pozitivarea testului la o determinare ulterioar. 52. 4. 3. Diagnosticul serologic se bazeaz pe rspunsul imun de tip umoral (anticorpii antimycobacterieni pot fi evideniai prin diferite tehnici, de ex. ELISA). Cu toate c metodologia nu este perfect standardizat, subliniem faptul c n diagnosticul tuberculozei nici un element nu poate fi considerat ca fiind lipsit de importan ntr-un anumit context clinic, paraclinic i epidemiologic. 52. 4. 4. Dei nu am prezentat elementele necesare identificrii mycobacteriilor netuberculoase, dorim s menionm c, n cazul utilizrii unui numr redus de teste, exist riscul de a pune un diagnostic eronat i respectiv de a considera o tulpin drept Mycobacterium tuberculosis, cu toate c a fost izolat o mycobacterie atipic.

418

52. 5. Tratament Tratamentul nespecific include repausul (fizic, psihic) i o nutriie corespunztoare. Tratamentul medicamentos se realizeaz cu anti-tuberculoase n asociere (3 sau 4 medicamente diferite n funcie de situaie). Mai frecvent utilizate sunt izoniazida (HIN), rifampicina, pyrazinamida i ethambutolul (medicamente de prim linie). Terapia este de lung durat (minim 4 luni n formele uoare, 6 luni n majoritatea cazurilor) i ar trebui s se realizeze strict supravegheat. inta operaional este vindecarea a minim 85% dintre pacienii cu tuberculoz pulmonar pozitiv la microscopie. Datorit apariiei i extinderii fenomenului de rezisten i multi-rezisten la antibiotice, pe lng medicamentele de prim linie menionate mai sus exist i anti-tuberculoase de rezerv (ex. ethionamida, prothionamida, cicloserina etc). 52. 6. Epidemiologie Pacienii cu tuberculoz pulmonar a cror sput este pozitiv microscopic, reprezint sursa de infecie cea mai important. Transmiterea se face de obicei pe cale respiratorie, fiind favorizat de contactul prelungit, intrafamilial sau n colectiviti. Transmiterea prin intermediul laptelui contaminat i netratat termic corespunztor este posibil. Apariia bolii este influenat n mod decisiv de particulariti ale gazdei, majoritatea nc neelucidate. Totui se cunoate c anumite condiii socio-economice, aglomerarea populaional, vrsta (copilrie i 16-21 de ani), o anumit structur genetic (ex. HLA BW15) i imunodepresia, se asociaz mai frecvent cu apariia tuberculozei manifest clinic. Pe lng problematica TB, cunoscut de mai multe secole, n momentul de fa se discut din ce n ce mai frecvent epidemiologia TB produs de microorganisme rezistente i multi-rezistente la antibiotice i chimioterapice. De circa 15 ani s-au luat n considerare tulpinile de M. tuberculosis numite MDR-TB / multi-drug resistant. Tulpina MDR-TB este definit drept acea tulpin de M. tuberculosis rezistent cel puin la hidrazida acidului izonicotinic (izoniazid, HIN) i la rifampicin. Din anul 2005, n limbajul medical internaional a intrat i tulpina XDR-TB (Mycobacterium tuberculosis extensiv rezistent la medicamente anti-TB). Tulpina XDR-TB este definit drept acea tulpin de M. tuberculosis rezistent att la majoritatea medicamentelor anti-TB de prim linie (inclusiv la izoniazid i rifampicin), ct i la cele mai utilizate medicamente anti-TB de linia a doua (ex. fluorochinolone i la cel puin unul din cele 3 medicamente injectabile, cum ar fi amikacina, kanamicina sau capreomicina). n Romnia incidena tuberculozei a depit la un moment dat valoarea de 1400/0000. Lund ca punct de reper anul 1985 (incidena TB fiind de 560/0000, cea mai mic valoare istoric a incidenei TB n Romnia) i respectiv anul 2002 (anul n care incidena TB s-a meninut staionar, pentru al doilea an consecutiv, valoarea incidenei pentru cazurile noi fiind 1210/0000), putem spune c n ultimii ani, numrul de cazuri raportate i respectiv incidena, au sczut, an de an. Cel mai mare numr de cazuri din ultima perioad a fost raportat n 2002 (numr total de cazuri 31.075, numr de cazuri noi 26.637, numr de recidive prin TB 4.438, numr de cazuri la copii 1.878). Numrul de cazuri noi de TB nregistrate ulterior (la aduli) a 419

fost de 25.245 (2003), 24.776 (2004), 22.860 (2005) i respectiv 20.842 de cazuri n 2006, cu o inciden care s-a ntors ctre valoarea nregistrat n anul 1994 (96,60/0000). La copii, numrul de cazuri raportate a sczut de la 1.519 (2003) pn la 1.066 cazuri n 2006. n SUA s-au nregistrat 21.337 cazuri n 1996 (inciden 8,040/0000), 19.851 cazuri n 1997 (7,420/0000), 18.361 cazuri n 1998 (6,790/0000) i respectiv 17.531 cazuri n 1999, corespunznd la o inciden de 6,430/0000. De altfel, numrul de cazuri de TB n SUA a sczut an de an n perioada 1998-2005. n 2005 au fost raportate 14.097 cazuri de TB (inciden 4,80/0000). 52. 7. Profilaxie Depistarea precoce a surselor de infecie precum i tratamentul acestora corect i complet reprezint una dintre cele mai importante msuri de prevenire i control. Vaccinarea BCG este util cel puin pentru prevenirea meningitei tuberculoase la nou-nscut (afeciune extrem de grav). Prima vaccinare se realizeaz n primele zile de via, n maternitate. Revaccinrile se pot face numai la persoane IDR negative. Pentru prevenirea TB, se recomand n anumite situaii chimioprofilaxia (de ex. administrarea HIN la membrii de familie, contaci ai unei persoane cu TB pulmonar pozitiv la microscopie). Eradicarea tuberculozei la vite i pasteurizare laptelui sunt de asemenea msuri utile profilactic. 52. 8. Povestire adevrat A cltori, sau nu, atunci cnd ai XDR-TB ... Aceasta este o istorie adevrat care arat c expunerea la microorganisme periculoase este posibil (chiar dac transmiterea nu are loc n 100% din cazuri). n acelai timp, dorim s subliniem pentru cel puin a treia oar c bolile infecioase nu recunosc i nu respect graniele stabilite de om. Odat cu apariia traficului aerian omul poate s cltoreasc i s ajung oriunde pe glob n mai puin de 24 de ore, iar dac este contagios ar putea s-i mbolnveasc pe cei alturi de care cltorete. Acetia la rndul lor, pot, n mod potenial, s transmit mai departe infecia n toate colurile lumii. Este luat n discuie situaia n care un cetean american de origine greac a decis n luna mai a anului 2007 s cltoreasc, pentru a se cstori, cu toate c tia c este bolnav de tuberculoz. Anterior plecrii, tnrul a mers la Departamentul de Sntate Public din statul american Georgia, unde locuia (este vorba chiar de statul unde se afl cel mai important centru de supraveghere, prevenire i control al bolilor, CDC, Atlanta, GA). Aici ns, dup afirmaiile cltorului (neconfirmate de autoriti) mai c nu i s-ar fi urat drum bun i ar fi fost informat c dac i ia medicamentele regulat, nu ar fi multe anse ca s infecteze i ali ceteni. n aceste condiii, tnrul A.S. a plecat spre Europa. Rezultatele testrilor de laborator au artat, ulterior, c tulpina infectant intra n categoria XDR-TB (Mycobacterium tuberculosis extensiv rezistent la medicamente anti-TB). Tulpina XDRTB este definit drept acea tulpin de M. tuberculosis rezistent att la majoritatea 420

medicamentelor anti-TB de prim linie (inclusiv la izoniazid i rifampicin), ct i la cele mai utilizate medicamente anti-TB de linia a doua (ex. fluorochinolone i la cel puin unul din cele 3 medicamente injectabile, cum ar fi amikacina, kanamicina sau capreomicina). Aadar, A.S. a cltorit din SUA pn n Europa, cu escal n Italia, ntr-un avion plin cu ceteni americani i de alte naionaliti. Datorit faptului c aceast cltorie a durat suficient de multe ore pentru ca riscul de transmitere al infeciei s fie semnificativ, dup primirea datelor privind rezistena tulpinii implicate, autoritile de sntate public au luat toate msurile posibile pentru identificarea cltorilor aflai la risc, respectnd protocolul elaborat de Organizaia Mondial a Sntii, att n USA ct i n celelalte ri. i Romnia a primit aceast informaie i a contribuit prin msuri specifice la identificarea i informarea ctorva ceteni care au cltorit mpreun cu A.S. Istoria a continuat intra-european, nainte, n timpul i dup cstorie, n cltoriile efectuate dup nunt i respectiv n cltoria spre cas. Se pare c A.S. care a fost sftuit s se interneze ntr-un spital din Italia i s primeasc tratamentul adecvat n aa fel nct s poat porni la drum numai dup certificarea strii de neinfecios. Nu a acceptat s urmeze aceste recomandri menionnd c nu are ncredere dect n spitalele americane. Pentru a evita vigilena autoritilor a preferat s se ntoarc n SUA prin Canada, cu un alt zbor de lung durat, o durat suficient de lung pentru ca riscul de transmitere al infeciei s existe. n acelai timp, am dori s mai menionm c situaia a ajuns i n atenia mass -media i a ocupat pentru un timp locul 1 la tiri, surclasnd inclusiv tirile cu privire la campania electoral american sau tirile cu privire la rzboiul din Irak. n ciuda strategiei de ntoarcere, cu plecare din Republica Ceh i aterizare n Canada, domnul A.S. a fost ateptat la grani de ctre autoriti. A fost internat forat i supus tratamentului, aceast atitudine reprezentnd o situaie cu totul deosebit (unic n ultimele 4 decade; se pare c ultima carantinare forat a avut loc, n SUA, n cazul unui pacient cu variol, n anul 1963). Ulterior, dup alerta general n sistemele de sntate, alerta mediatic i respectiv implicaiile umane (stres-ul negativ creat tuturor celor care au zburat cu cele dou avioane de lung durat, dar i altor cltori, participani la nunt etc), testele efectuate pe tulpina de M. tuberculosis izolat se pare c ar fi relevat faptul c respectiva tulpin nu ar fi fost XDR-TB ci MDR-TB (multi-drug resistant TB). Tulpina MDR-TB este definit drept acea tulpin de M. tuberculosis rezistent cel puin la hidrazida acidului izonicotinic (izoniazid, HIN) i la rifampicin. Evoluia nu a fost chiar excepional; pacientul a fost supus att tratamentului anti-TB ct i unei intervenii chirurgicale (lobectomie la nivelul plmnului drept). Dac iniial se pare c se gndea s acioneze n justiie autoritile americane (datorit internrii forate), se pare c, ulterior, a fost chiar el acionat n justiie, pentru daune morale (costisitoare) din partea unor pasageri care au cltorit n acelai avion (iar dou surori se pare c doresc s solicite plata contravalorii vacanei n Montreal pe care nu au mai putut sa o petreac n linite, datorit anxietii provocate). n plus, tnrul nu este nc vindecat complet, continu tratamentul i este supus, repetat, controlului medical i bacteriologic. 421

Dintre cele mai importante probleme legale de acest caz ar fi de amintit inexistena unei legi care s defineasc i soluioneze modul n care se poate institui carantina i respectiv efortul substanial i dificultatea cu care autoritile (din diferite ri) au putut identifica persoanele care au cltorit n aceleai avioane cu pacientul cu XDR-TB / MDR-TB. Apariia Regulamentului Sanitar Internaional (votat la nivel mondial) i despre care ne-am propus s discutm ntr-un capitol separat, probabil primul capitol de carte din Romnia care trateaz acest subiect, ar putea rezolva ntructva aceste probleme; totui mai sunt foarte multe aspecte de rezolvat.

53. Germeni spiralai. Genul Treponema. Treponema pallidum (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)

53. 1. Definiie. ncadrare Spirochetele formeaz un grup relativ mare i heterogen de microorganisme spiralate, mobile. Familia Spirochaetaceae aparine ordinului Spirochaetales i include trei genuri de microorganisme. Familia Treponemataceae include trei genuri patogene pentru om: 1. genul Treponema; 2. genul Borrelia i 3. genul Leptospira. n genul Treponema sunt cuprinse mai multe specii de interes medical, dintre care menionm Treponema pallidum agentul etiologic al sifilisului, T. reiter o tulpin de laborator, izolat de la om, care se poate cultiva pe medii de cultur i permite obinerea unor antigene de diagnostic i T. pallidum (tulpina Nichols) meninut n laborator prin inoculare intratesticular la iepure, util pentru obinerea antigenelor de diagnostic. 53. 2. Caractere generale 53. 2. 1. Habitat T. pallidum este un microorganism parazit exclusiv al omului, nu se poate identifica n mediul extern. Transmiterea sexual reprezint calea de contagiune n imensa majoritate a situaiilor. T. pallidum poate fi izolat din serozitatea recoltat din ancrul sifilitic sau din snge. 53. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Microorganismul tipic se prezint sub forma unor spirale subiri, msurnd aproximativ 0,25 -0,3 m lime i 6-15 mm lungime. ntre buclele spiralei exist o distan constant de 1m. Prezint mobilitate activ, putndu-se roti n jurul filamentului axial central, chiar i dup ce se ataeaz de celule prin capetele efilate. Spiralele sunt att de subiri nct nu se pot vizualiza dect prin imunofluorescen sau la microscopul cu cmp ntunecat (prin examinarea preparatului proaspt ntre lam i lamel). Aspectele morfologice pot fi evideniate prin colorarea frotiurilor prin metode speciale (Giemsa, Fontana - Tribondeau sau impregnarea argentic).

422

53. 2. 3. Caractere de cultur Tulpinile de Treponema pallidum patogene pentru om nu au fost niciodat cultivate pe medii de cultur artificiale. n anumite fluide i n prezena substanelor reductoare, T. pallidum poate rmne mobil 3-6 zile, la 25C. n sngele total sau n plasma pstrat la 4 C rmne viabil cel puin 24 de ore, aspect important care a dus la testarea sngelui donat i pentru eliminarea riscului prezenei T. pallidum n unitile folosite pentru transfuzii. Treponemele nepatogene (ex. tulpina Reiter) pot fi cultivate in vitro pe medii de cultur n anaerobioz. T. reiter este nrudit antigenic cu T. pallidum. Treponema pallidum (tulpina Nichols) este meninut n laborator prin inoculare intratesticular la iepure. 53. 2. 4. Caractere biochimice Datorit necultivabilitii, caracterele biochimice nu au putut fi la fel de bine precizate ca i pentru alte microorganisme. T. pallidum este un germen microaerofil. 53. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici T. pallidum este distrus de uscciune precum i de creterea temperaturii la 42C. Treponemele sunt rapid imobilizate i distruse de arsenicul trivalent, mercur i bismut. Acest efect distructiv este accelerat de ctre temperaturile nalte i este parial reversibil cu reactivarea treponemelor la tratarea cu compui coninnd gruparea -SH (cistein i dimercaptopropanol). Suspensiile de treponeme pot fi meninute timp de mai muli ani la 70 C. 53. 2. 6. Structur antigenic Primul test utilizat n diagnosticul serologic al sifilisului a fost un test avnd la baz reacia de fixare a complementului (reacia Bordet-Wassermann, RBW). Iniial antigenul utilizat a fost extras din ficatul unui fetus uman (cu sifilis congenital). Ulterior s-a descoperit faptul c acest antigen, lipoidic (difosfatidil glicerol), numit cardiolipin, poate fi extras din muchiul cardiac precum i din alte structuri. De fapt structura antigenic a T. pallidum se apreciaz a fi complex i este incomplet elucidat pn n prezent. Antigenul lipoidic este un antigen nespecific, util n testele de screening. n structura treponemelor exist antigene proteice, un antigen specific de grup, extras din T. reiter i altul specific de tip. Este descris i un antigen cu structur polizaharidic, specific de tip, diferit de antigenele extrase din T. reiter, responsabil pentru testul de imobilizare i care se poate extrage din tulpina Nichols. 53. 2. 7. Rspuns imun Rezistena la reinfecie a fost verificat att la om (voluntari) ct i la iepure i debuteaz la circa 3 sptmni dup apariia leziunilor primare. Persistena unei infecii latente previne reinfecia, 423

dar n cazul n care boala este tratat corect, gazda redevine susceptibil la infecie. n vederea obinerii rezistenei la infecie este necesar att rspunsul imun umoral ct i celular. 53. 2. 8. Caractere de patogenitate T. pallidum este patogen prin multiplicare i invazivitate. T. pallidum afecteaz numai omul i se transmite de regul prin contact sexual. Alte modaliti de transmitere posibile ar fi pe cale sanguin sau de la mam la ft. Infectarea indirect, ex. prin intermediul unor obiecte contaminate, se apreciaz c ar fi posibil n circa 0,1% din cazuri. 53. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse Infecia natural cu T. pallidum este limitat la gazda uman. Infecia se transmite de obicei prin contact sexual, iar leziunile de primoinfecie sunt cantonate la nivelul tegumentelor i mucoaselor din zona genital. Totui n 10-20% din cazuri, leziunile primare sunt localizate la nivel rectal, perianal sau oral. T. pallidum poate probabil penetra mucoasele intacte sau ptrunde printr-o soluie de continuitate de la nivelul epidermului. Spirochetele se multiplic local la poarta de intrare, iar unele se rspndesc n vecintatea nodulilor limfatici, de unde ajung n torentul circulator. n 2-10 sptmni de la infecie, la locul inoculrii se dezvolt o papul care se deprim pentru a forma o ulceraie cu baza curat, indurat (ancru dur). Inflamaia se caracterizeaz prin prezena limfocitelor i a plasmocitelor. Aceast leziune primar se vindec ntotdeauna spontan, dar dup 2-10 sptmni apar leziunile secundare, care constau n leziuni eritematoase maculopapulare localizate oriunde pe corp i papule umede, palide (condiloame) n regiunile anogenital, axilar i n cavitatea bucal. Pot fi prezente de asemenea meningita sifilitic, corioretinita, hepatita, nefrita (datorit apariiei complexelor imune) sau periostita. Leziunile secundare se remit i ele spontan. Att leziunile primare, ct i cele secundare sunt bogate n spirochete i foarte contagioase. Leziunile contagioase pot reaprea la 3-5 ani de la infecie, dar dup aceea individul nu este contagios. Infecia sifilitic poate rmne subclinic i pacientul poate trece prin stadiile primar, secundar sau prin ambele fr semne sau simptome, dezvoltnd totui sifilis teriar. n aproximativ 30% din cazuri, infecia sifilitic precoce progreseaz spontan ctre vindecare complet n absena tratamentului. n alte 30% din cazuri, infecia netratat rmne latent (evideniat n special prin teste serologice pozitive). n celelalte cazuri, boala progreseaz spre stadiul teriar, caracterizat prin dezvoltarea de leziuni granulomatoase (gome) n piele, oase, ficat, prin modificri degenerative la nivelul SNC (sifilis meningovascular, pareze, tabes), sau prin leziuni cardiovasculare (aortit, anevrism aortic, insuficien aortic). n toate leziunile teriare treponemele sunt foarte rare, iar reaciile exagerate ale esuturilor se datoreaz hipersensibilitii la antigene treponemice. n cazul sifilisului congenital, o femeie nsrcinat infectat cu T. pallidum poate transmite germenul ftului prin placent ntre sptmnile 10-15 de gestaie. n unele cazuri se produc moarte in utero i avort spontan, iar n altele apare postmaturitate. Ali fei sunt nscui vii, dar dezvolt semne de sifilis congenital n copilrie: keratit interstiial, dini Hutchinson, nas n a, periostit i diferite anomalii ale SNC. Tratamentul adecvat al mamei n timpul sarcinii previne sifilisul congenital. Titrul reaginelor n sngele copilului crete n infecia activ, dar scade cu timpul dac anticorpii au fost transferai pasiv de la mam. n infecia congenital, copilul 424

produce anticorpi antitreponemici de tip IgM. Pentru prevenirea sifilisului congenital, femeile nsrcinate trebuie s fie testate pe parcursul sarcinii, recomandarea fiind fcut de doctorul obstetrician nc de la prima vizit (recomandarea trebuie fcut de asemenea i de medicul de familie). 53. 4. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Treponema pallidum

Att leziunile primare, ct i cele secundare sunt bogate n spirochete i foarte contagioase. n cele ce urmeaz vom aborda diagnosticul de laborator n cazul sifilisului primar sau secundar. Diagnosticul pornete de la elemente clinice i epidemiologice, dar trebuie confirmat prin metode de laborator. Diagnosticul de laborator n sifilis poate fi bacteriologic (direct) sau serologic. 53. 4. 1. Diagnosticul bacteriologic Treponema pallidum nu poate fi cultivat pe medii artificiale, n laborator. Din acest motiv, diagnosticul bacteriologic cuprinde numai primele etape din structura clasic a schemei diagnosticului direct. Diagnosticul bacteriologic poate fi realizat att n sifilisul primar ct i n sifilisul secundar. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi anexa nr. 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei, avnd o serie de particulariti. Produsul patologic poate fi reprezentat de lichidul clar (serozitatea) de la nivelul leziunilor primare n funcie de localizare (penian, cervical, vaginal, perianal etc), de la nivelul leziunilor secundare (condiloma lata, rozeole sifilitice etc), de la nivelul unor leziuni umede bogate n treponeme n cazul sifilisului congenital timpuriu sau poate fi prelevat din ganglionii limfatici regionali. n cazul ancrului, vom recolta p.p. dup ndeprtarea cu grij (fr a produce sngerare) a crustelor care acoper leziunea. Ar putea fi necesar s comprimm baza leziunii pentru a stimula acumularea de lichid (clar) din care vom efectua 2-3 preparate microscopice. Prelevm lichidul fie cu ajutorul ansei bacteriologice, fie cu ajutorul unei pipete Pasteur, fie aplicnd pur i simplu lama de sticl pe leziunea umed. Acoperim cu o lamel i eliminm prin uoar apsare eventualele bule de aer. Transportul trebuie s fie realizat foarte rapid, de preferat n maxim 20 de minute astfel nct se recomand ca recoltarea s fie realizat ntr-un spaiu corespunztor, n imediata vecintate a laboratorului. Este o etap esenial. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic se poate realiza fie cu ajutorul microscopului cu fond ntunecat, fie prin imunofluorescen direct (exist i alte tehnici, care nu vor fi discutate n acest manual).

Pentru examenul microscopic pe fond ntunecat, pregtim 2 lame (preferabil 3) pentru fiecare leziune pe care dorim s o examinm. Preparatele nu trebuie s conin hematii, leucocite, fragmente de esut sau bule de aer. n timp ce examinm primul preparat microscopic vom 425

introduce celelalte 2 preparate ntr-o cutie Petri n care exist puin vat sau hrtie de filtru umezit, pentru a pstra atmosfera umed i a preveni uscarea. Preparatul microscopic trebuie examinat sistematic (minim 10 minute n cazul unui rezultat aparent negativ), iniial cu obiectivul uscat, ulterior, dup vizualizarea unor microorganisme care par s aparin genului Treponema, cu obiectivul de imersie. Este necesar ca examinatorul s aib experien n acest tip de examinare. Microorganismele caracteristice sunt foarte subiri i lungi (0,25-0,3m / 6-14 m), spiralate, prezentnd 8-14 spire (regulate, strnse, adnci i rigide), mobile (spirele nu se deformeaz), deplasarea n cmpul microscopic nu este foarte rapid dar seamn cu o micare de nurubare (exist i microorganisme care sunt imobile dar pstreaz micrile de translaie, rotaie lent, flexie uoar de la un cap la cellalt sau flexie median cu revenire ca un resort), luminoase pe fondul negru al cmpului microscopic. n cazul unui rezultat negativ putem repeta recoltarea i examinarea. n anumite situaii se poate recomanda nceperea tratamentului, iar evoluia va fi monitorizat clinic i serologic (rezultatul negativ nu elimin diagnosticul de sifilis). Rezultatul pozitiv, atunci cnd poate fi exclus prezena unor treponeme saprofite, pune diagnosticul de sifilis primar nainte ca anticorpii s poat fi detectai serologic.

Imunofluorescena direct permite diferenierea T. pallidum de alte treponeme cu ajutorul anticorpilor marcai fluorescent (reacie Ag-Ac); un alt avantaj este reprezentat de faptul c nu este necesar ca treponemele s fie mobile. n plus, pentru c reacia este specific, se poate utiliza cu succes i n cazul unor leziuni foarte probabil contaminate cu treponeme saprofite (ex. orale, rectale). n cazul n care examinarea nu poate fi realizat imediat secreia poate fi recoltat ntr-un tub capilar care se nchide la flacr i poate fi transportat la +4C; alternativ putem realiza frotiul, ateptm s se usuce n vecintatea becului de gaz i putem s l trimitem ctre laborator. Frotiul poate fi colorat:

cu Ac anti-T. pallidum obinui de la pacieni cu sifilis sau de la iepuri infectai cu T. pallidum; serul este tratat pentru creterea specificitii cu tulpina Reiter (o tulpin nepatogen de T. phagadenis) iar Ac sunt apoi marcai cu izotiocianat de fluorescein sau

cu Ac monoclonali anti-T. pallidum subspecia pallidum marcai fluorescent. Subliniem nc odat importana examenului clinic urmat de recoltarea, transportul i examinarea microscopic a p.p. n laboratoarele de referin ar mai putea fi utilizate i alte metode n scop diagnostic (mai rar) sau pentru cercetare:

426

 Inocularea p.p. la animale de laborator reprezint cea mai sensibil metod pentru detectarea T. pallidum. Pentru meninerea n laborator a unor treponeme viabile sau pentru determinarea infectivitii au fost utilizate diferite animale (hamsteri, cimpanzei etc) ns cel mai util este iepurele. Iepurele poate fi inoculat (intratesticular sau cutanat) cu orice tip de p.p. cu condiia ca ntre momentul recoltrii i inoculare s nu treac mai mult de 60 minute. n caz contrar, p.p. trebuie adus rapid la o temperatur de cel puin -70C (ex. n azot lichid) i meninut astfel pn n momentul inoculrii. Testul infectivitii la iepure (RIT) rmne metoda standard; cu ajutorul RIT se apreciaz sensibilitatea i specificitatea oricrei alte metode care este propus pentru diagnosticul sifilisului.

n centrele de referin au mai fost utilizate i tehnici ale biologiei moleculare (sondele nucleotidice, PCR). Tehnica PCR ar putea avea utilitatea diagnostic atunci cnd p.p. este reprezentat de lichidul amniotic. Treponema pallidum i pstreaz sensibilitatea la penicilin, medicament care rmne de elecie pentru tratamentul sifilisului. Exist i o serie de alternative, dar dorim s subliniem c n vederea tratamentului acestei maladii trebuie respectate recomandrile fcute de ctre comisia de specialitate a ministerului sntii, pentru fiecare form de sifilis n parte. 53. 4. 2. Diagnosticul serologic Diagnosticul serologic se realizeaz folosind antigene nontreponemice i antigene treponemice. Testele nontreponemice (nespecifice) i treponemice (specifice) sunt complementare; nu se exclud. Testele nontreponemice sunt utilizate n screening, diagnostic i monitorizarea pacienilor n cursul tratamentului. n vederea stabilirii diagnosticului vom utiliza i testele treponemice n corelaie cu cele nontreponemice (nici unul dintre cele dou tipuri nu pot acoperi din punct de vedere diagnostic toate stadiile sifilisului). Cel mai frecvent utilizm VDRL sau RPR (din prima categorie) cuplat cu TPHA sau FTA-Abs (din a doua categorie). De obicei utilizm serul provenit de la pacientul suspect, dar n anumite situaii testul este realizat folosind plasm sau LCR. 53. 4. 2. 1. Reacii serologice care utilizeaz antigene nontreponemice

Antigenele nontreponemice sunt lipide care pot fi extrase din diferite esuturi. Cardiolipina este un difosfatidil-glicerol. Pentru creterea sensibilitii, cardiolipina este cuplat cu colesterol i lecitin. Anticorpii anti - cardiolipin au fost numii reagine. Sunt depistai n serul pacienilor la 2-3 sptmni i n LCR la 4-8 sptmni de la debutul infeciei, n cazurile netratate.

427

Reacia de fixarea a complementului Bordet-Wasserman (RBW) a fost utilizat o lung perioad de timp, ncepnd cu 1906. Datorit faptului c RFC este o metod laborioas i n special datorit apariiei unor alte tehnici, RBW este discutat n prezent din punct de vedere istoric. Exist i RFC Kolmer, care se execut la 4C. Tehnica actual standard este VDRL (Veneral Disease Research Laboratories), un test de floculare. Testele de floculare se bazeaz pe faptul c particulele antigenice rmn dispersate n serul normal, dar formeaz grunji vizibili atunci cnd se combin cu reaginele. Testele se preteaz la automatizare i la folosirea pentru screening datorit costului redus. O variant economic i elegant este microreacia VDRL care se practic n plci cu godeuri.

Ag tip VDRL se prepar conform recomandrilor productorului.

Pregtirea serului de cercetat include controlul aspectului serului (se clarific prin centrifugare), inactivarea timp de 30 minute la 56C i o nou centrifugare (n cazul apariiei unor particule n suspensie). Nu vor fi testate serurile infectate sau hemolizate. n cazul n care trec mai mult de 4 ore din momentul inactivrii, serul va fi inactivat din nou timp de 10 minute la 56C.

Temperatura din camera de lucru trebuie s fie ntre 23-29C. Testul se efectueaz pe ser nediluat (pentru monitorizarea evoluiei sub tratament se pot face diluii binare). Se pot testa mai multe seruri concomitent i este necesar o notare clar a godeurilor, pentru fiecare godeu n parte. Fiecare test va include martori (seruri cu reactivitate cunoscut, martor pentru Ag). n fiecare godeu punem cte 0,05 ml ser (n godeul pentru martor Ag punem soluie salin fiziologic). Dup agitarea flaconului cu suspensia antigenic, utiliznd o sering cu ac calibrat depunem cte o pictur (1/60 ml) n fiecare godeu. Acoperim placa i o aezm pe un agitator care poate fi reglat la 180 turaii pe minut, pe o durat de 4 minute.

Citim imediat rezultatul, prin transiluminare pe fond negru, cu ajutorul unei lupe, ncepnd cu martorii (negativ, slab pozitiv, pozitiv, martorul pentru Ag) i continund cu serurile de testat.

428

Rezultatul este negativ dac lichidul nu prezint flocoane i este asemntor martorului negativ i martorului Ag. Rezultatul este slab pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane de dimensiuni mici ntr-un lichid uor turbid n timp ce rezultatul este intens pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane de dimensiuni mari iar lichidul este clar. Repetm rezultatele slab pozitive sau dificil de interpretat. n cazul n care suspicionm existena fenomenului de prozon (inhibiia total sau parial a floculrii prin exces de Ac), vom repeta testarea se va repeta pe diluii de ser.

Rezultatul negativ nu elimin diagnosticul de sifilis; pacientul se poate afla n perioada de incubaie sau poate fi cazul unui sifilis latent (evideniabil prin TPHA). n cazul unui pacient suspect pentru sifilis primar, repetm testul dup 1 sptmn, 1 lun i la 3 luni.

Vom lua n considerare un rezultat pozitiv n corelaie cu rezultatul obinut la testul treponemic, rezultatul diagnosticului bacteriologic, elementele clinice i epidemiologice. Un rezultat pozitiv n condiiile n care toate celelalte date sunt negative este de obicei un rezultat fals-pozitiv. Pot aprea rezultate fals-pozitive la persoane cu hepatit viral acut, pneumonii virale, rujeol, malarie, mononucleoz infecioas, alte infecii virale, la persoane care au fost recent vaccinate, precum i la persoane cu boli ale esutului colagen, persoanele cu lepr, persoane cu diferite neplazii, persoane care se drogheaz, la persoanele n vrst etc. Reacii fals-pozitive pot aprea i pe parcursul sarcinii.

Testul VDRL semi-cantitativ, efectuat pe 2 probe consecutive de ser este util n urmtoarele situaii: scderea de 4 ori a titrului n sifilisul recent, tratat, semnific de regul eficacitatea tratamentului; creterea de 4 ori a titrului sugereaz o infecie activ n evoluie, o reinfecie sau ineficacitatea tratamentului. VDRL-CSF, reprezint o variant a VDRL, tehnica fiind utilizat n suspiciunea de neurosifilis, pentru identificarea anticorpilor prezeni n LCR.

Alte teste de floculare utilizate n practic

429

Testul RPR (Rapid Plasma Reagin) este executat pe carduri din material plastic pe care apar mai multe cercuri de 18 mm. Antigenul este preparat dintr-o suspensie antigenic tip VDRL modificat (pentru a elimina etapa de inactivare prin cldur). Reactivul conine i particule de crbune. Antigenul RPR este amestecat cu serul de cercetat n cercul de pe card. Daca Ac anti-T. pallidum sunt prezeni, se combin cu particulele lipidice din Ag i produc aglutinarea lor. Particulele de crbune coaglutineaz cu Ac i duc la apariia unor granule negre pe fondul alb al cardului. n absena Ac rezult un aspect gri uniform. Testul se poate realiza calitativ i cantitativ (diluii de ser).

Testul RST (Reagin Screen Test)

Testul USR (Unheated Serum Reagin)

Testul TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test)

A fost pus la punct i o tehnic de tip ELISA cu acest tip de antigene.

Modul de interpretare al testelor nontreponemice depinde i de populaia care este supus testrii. 53. 4. 2. 2. Reacii serologice care utilizeaz antigene treponemice

Au fost realizate i tehnici serologice care utilizeaz antigene treponemice extrase din T. reiter (specifice de grup) de tipul RFC i CIE.

430

 De mare utilitate practic sunt reaciile serologice care utilizeaz antigene treponemice extrase din tulpina Nichols de T. pallidum, cu o mare specificitate.

Pentru o lung perioad de timp, tehnica standard a fost testul imobilizrii treponemelor (TIP). Tehnica a fost pus la punct n anul 1949. Serul de cercetat era diluat i amestecat cu complement i treponeme vii, mobile, obinute din ancrul testicular de la iepure. n prezena Ac specifici, treponemele erau imobilizate, n timp ce n lipsa acestora, mobilitatea era pstrat (examinarea se fcea cu microscopul pe fond ntunecat).

Testele de imunofluorescen indirect (Fluorescent Treponemal Antibody, FTA) au nceput s fie utilizate n 1957, serul de cercetat fiind diluat 1/5. Datorit rezultatelor fals-pozitive, ulterior s-a trecut la diluarea 1/200 a serului (FTA-200). Din 1962 a nceput s fie utilizat tehnica pe care o avem la dispoziie i astzi, FTA-Abs. Pornind de la tulpina Reiter s-a obinut prin ultrasonicare un extract antigenic, pentru a ndeprta Ac care nu sunt specifici pentru T. pallidum. Probele de ser i/sau LCR de la pacieni sunt diluate 1/5 cu un extract care conine Ag treponemice de grup (Reiter), comune treponemelor patogene i comensale. Astfel sunt nlturai Ac nespecifici. Exist lame pe care a fost fixat tulpina Nichols de T. pallidum. Probele de ser i/sau LCR absorbite i martorii corespunztori se depun pe spoturile de pe lam. Dac n ser/LCR exist Ac specifici, acetia se vor lega de treponemele fixate pe lam formnd complexe antigen-anticorp. Dup ndeprtarea materialului nelegat prin splri repetate, Ac legai se detecteaz prin incubare cu un conjugat fluorescent anti Ig umane. Dup ndeprtarea prin splare a conjugatului nelegat de complexele antigen-anticorp, lamele se examineaz la microscopul cu fluorescen (UV). n cazul n care serul de cercetat este pozitiv, treponemele de pe lam apar fluorescente (galben-verzui).

Testul de hemaglutinare (Treponema pallidum Hemagglutination Test, TPHA) a fost pus la punct n urm cu 30 de ani. n prezena unor Ac fa de Ag adsorbite pe membrana lor, hematiile aglutineaz n reele caracteristice formate din complexe imune. Ag treponemic este extras din tulpina Nichols i adsorbit pe suprafaa hematiilor de oaie sau pasre fixate (hematii sensibilizate). Drept martor sunt folosite hematii fr Ag treponemice (nesensibilizate). n cazul n care n serul de cercetat sunt prezeni Ac anti-T. pallidum, hematiile sensibilizate aglutineaz; hematiile nesensibilizate nu aglutineaz i se depun sub forma unui buton pe fundul godeului. Pentru creterea specificitii, majoritatea truselor comerciale includ n diluent un extract de treponeme nepatogene. Testul poate fi realizat calitativ sau semi-cantitativ (diluii ale serului de cercetat). Exist metode automate, utilizate pentru testarea sngelui donat.

431

 Tehnica ELISA

Tehnica ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM anti-T. pallidum; este util pentru documentarea infecie intra-uterine.

Tehnica Western blot poate detecta att Ac de tip IgM ct i de tip IgG. Aa cum am mai menionat, interpretarea rezultatelor obinute se face innd cont de contextul clinic, epidemiologic i de laborator. Lund n considerare numai rezultatele de laborator pentru testele menionate n acest capitol, ar putea rezulta mai multe variante. Spre exemplu, dac testul VDRL este negativ i testul TPHA este tot negativ, de regul infecia este exclus. Dac ne gndim c pacientul este la debutul bolii iar anticorpii sunt nc nedectabili, repetm testele dup 3 sptmni. n cazul n care testul VDRL este pozitiv iar testul TPHA este negativ, este posibil s ne aflm n situaia de mai sus, la debutul bolii i repetm testele dup 3 sptmni. Dac rezultatele rmn nemodificate, este vorba de o reacie fals-pozitiv. Pot fi luate n discuie i alte posibiliti. 53. 5. Tratament Penicilina n concentraie de 0,003 uniti / ml are activitate bactericid dovedit i continu s reprezinte tratamentul de elecie n sifilis. n sifilisul mai vechi de 1 an sau n sifilisul latent, benzatin penicilina G (2,4 milioane uniti) se administreaz de 3 ori la interval de cte o sptmn. n neurosifilis se accept aceeai terapie, dar se utilizeaz cantiti mai mari de penicilin (penicilina G apoas, 20 de milioane uniti intravenos zilnic, timp de 2-3 sptmni). La cteva ore de la nceperea tratamentului se poate produce o reacie advers (JarishHerxheimer), datorat eliberrii masive de endotoxine din treponemele distruse. La persoanele care prezint hipersensibilitate de tip I fa de penicilin se pot administra tetraciclin, doxiciclin sau ceftriaxon. 53. 6. Epidemiologie. Profilaxie n prezent, incidena sifilisului i a altor boli cu transmitere sexual a crescut la nivel mondial. Cu excepia sifilisului congenital i a expunerii profesionale la personalul sanitar, sifilisul este dobndit pe cale sexual. Incidena bolii este n mod particular crescut la brbaii homosexuali, iar reinfecia la persoane tratate este obinuit. O persoan infectat poate rmne infectat timp de 3-5 ani pe parcursul sifilisului precoce. Sifilisul tardiv, mai vechi de 5 ani, este n mod normal contagios. n consecin, msurile de control depind de: 1. tratamentul prompt i adecvat al tuturor cazurilor depistate, 2. supravegherea surselor de infecie i a contacilor, 432

astfel nct acetia s fie tratai, 3. igien sexual, 4. profilaxia la momentul expunerii. Att profilaxia mecanic (prezervative), ct i chimioprofilaxia (penicilin dup expunere) au limite. De menionat c relativ frecvent pot fi contractate simultan mai multe infecii cu transmitere sexual. De aceea, atunci cnd se descoper o infecie cu transmitere sexual trebuie s se ia n calcul i posibilitatea unei infecii sifilitice. n 1997, n Romnia, s-au raportat 7.704 cazuri de sifilis, ceea ce corespunde la o inciden de 34,20/0000. Numrul de cazuri raportate, la aduli a crescut, anual, pn n 2002 (12.702 cazuri raportate, inciden 58,280/0000). ncepnd cu 2003, numrul de cazuri de sifilis la aduli a sczut, raportndu-se 9.698 cazuri n 2003, 8.838 cazuri n 2004, 6.862 cazuri n 2005 i 5.661 cazuri n 2006, un numr istoric de mic, corespunznd la o inciden de 26,20/0000. n aceeai perioad de timp, numrul de cazuri de sifilis congenital a crescut anual, atingnd valoarea maxim de 423 cazuri raportate n 2002, ulterior raportndu-se 202 cazuri n 2003, 136 cazuri n 2004, 38 cazuri n 2005 i 16 cazuri n 2006. Comparnd tendina evolutiv a sifilisului n Romnia i SUA, ne putem ntreba dac datele raportate reprezint situaia real, la fel cum ne puneam aceast ntrebare i n cazul gonoreei. Incidena sifilisului primar i secundar n SUA, n anul 1997, a fost de 3,19 0/0000 cu 8.550 cazuri; n anul 1998 au fost declarate 6.993 cazuri, n anul 1999, 6.657 cazuri iar n anul 2000 au fost raportate 5.979 cazuri. Tendina de scdere a luat sfrit n anul 2000; ncepnd cu anul 2001, numrul de cazuri de sifilis primar i secundar, mpreun, a crescut an de an, valoarea maxim nregistrndu-se n anul 2005 (8.724 cazuri). Lund n considerare numrul total de cazuri de sifilis raportate n SUA n anul 1999 (35.628), cifra corespundea la o inciden de 13,070/0000, n continu scdere, n ultimii 12 ani. Cel mai mic numr de cazuri (indiferent de form) a fost nregistrat n anul 2000 (31.575), ns ncepnd cu anul 2001, numrul de cazuri a crescut, depind n fiecare an cifra de 32.000, cu un maxim n 2003 (34.270 cazuri) i peste 33.000 cazuri raportate n 2004 i 2005. n schimb, numrul de cazuri de sifilis congenital, n SUA, a sczut continuu, de la o valoare de 801 cazuri raportate n 1998, 441 cazuri raportate n 2001 i respectiv 329 cazuri n 2005. 53. 7. Boli nrudite cu sifilisul Toate aceste boli sunt date de treponeme care nu pot fi deosebite de T. pallidum. n toate cazurile apar reacii pozitive la testele treponemice i nontreponemice pentru sifilis, iar unele reacii ncruciate pot fi demonstrate la animalele de laborator i probabil la oameni. Nici una dintre aceste boli nu se transmite sexual; ele se transmit de obicei prin contact direct. Nici unul dintre germenii implicai nu a fost cultivat pe medii artificiale. 7. 1. Bejelul se ntlnete n Africa, Orientul Mijlociu, Asia de Sud-Est i n alte zone. n mod particular apare la copii i produce leziuni cutanate foarte contagioase; complicaiile viscerale tardive sunt rare. Penicilina este antibioticul de elecie. 7. 2. Pianul este o infecie endemic, ce apare n mod particular la copii, n rile cu climat cald i umed. Agentul cauzal este T. pertenue. Leziunea primar, o papul ulcerativ, apare de obicei pe brae sau picioare. Transmiterea se face prin contact direct la copii sub 15 ani. Nu au fost 433

raportate infecii congenitale, transplacentare. n mod obinuit se constat leziuni cutanate cu cicatrizare i distrucii osoase, dar complicaiile nervoase sau viscerale sunt excepionale. S -a discutat dac pianul reprezint o variant de sifilis cu transmitere nesexual n rile cu climat cald. Se pare c exist reactivitate imun ncruciat ntre pian i sifilis. Procedurile de diagnostic i tratament sunt similare celor pentru sifilis. Rspunsul la tratamentul cu penicilin este prompt. 53. 7. 3. Pinta este produs de T. carateum. Boala se transmite prin contact direct. n transmiterea acestei boli este incriminat i o musc vector (Hippelates). Pinta este endemic n Mexic, Filipine, unele zone din Pacific, afectnd persoane de toate vrstele. Leziunile primare sunt reprezentate de papule neulceroase care apar la nivel tegumentar. 53. 8. Povestire adevrat Orice adenopatie inghinal semnific un sifilis ? Dorim s prezentm cazul unui coleg, viitor medic, care n timpul primului an de studenie a constatat dureri la nivelul articulaiilor i limfadenopatie inghinal stng, precedate de o colic renal nsoit de transpiraii abundente. Tnrul s-a prezentat de urgen la spitalul cel mai apropiat de locuina sa, unde medicul de gard i-a fcut trimitere ctre o unitate cu profil de boli infecioase din capital. Din amintirile tnrului coleg, medicul de gard a fost aproape sigur c este vorba de sifilis, ca i cum ar fi avut deja n fa rezultatul analizelor). La clinica de boli infecioase s-a recoltat exsudat faringian i pacientul a fost trimis acas. n ziua urmtoare, s-au recoltat urin pentru urocultur i snge pentru testul ELISA (detectare Ac antiHIV), VDRL, detectare Ag HBs i alte analize, de rutin (numr leucocite, formul leucocitar, VSH, reactani de faz acut etc). Toate rezultatele au fost negative, iar valorile pentru testele bioumorale s-au situat n limitele normale. Totui, s-a indicat tratament antiinflamator (indometacin, supozitoare) i antibioterapie n scop profilactic (ciprofloxacin), timp de 7 zile. Starea pacientului nu s-a ameliorat, aprnd n plus adenopatie inghinal de parte opus (dreapt). Revenind la spital dup ncheierea tratamentului zile, medicul curant i-a spus (pe un ton destul de ridicat) c n acest caz nu mai are ce s fac i i-a recomandat un consult de specialitate, n zona psihiatriei. n perioada urmtoare, tnrul viitor medic, sigur de faptul c simptomele sale erau reale i puteau evolua, s-a prezentat la medicul de familie, care i-a recomandat o vizit la urolog, fr a-i face o recomandare concret, n acest sens. Fiind student la medicin i avnd n apropierea facultii un spital, s-a hotrt s se prezinte la cabinetul de urologie al unitii medicale, unde i s-a explicat c nu exist legtur ntre adenopatie i sistemul urinar dar, la cabinetul privat din incinta spitalului a pltit consultaia respectiv (medicamentele prescrise anterior nu au fost compensate, toate cheltuielile revenind tnrului coleg). A fost consultat i de un alt medic din acelai spital, care a cerut efectuarea ctorva analize suplimentare (radiografie cardio-toraco-pulmonar, ecografie abdominal). Acestea nu au relevat modificri patologice. n acest context s-a recomandat

434

efectuarea unor noi analize, fiind trimis din nou la spitalul cu profil de boli infecioase (tnrul coleg consider c aceste analize ar fi putut s fie fcute, local). n clinica de boli infecioase, este consultat de ctre un alt medic, care recomand internare pentru investigaii i stabilirea diagnosticului i atitudinii de urmat. Tnrul refuz internarea, datorit faptului c urma s nceap sesiunea de examene. n aceste condiii semneaz c refuz internarea i analizele nu se mai efectueaz. Astfel, primul an de facultate se ncheie, suferina se menine (exceptnd durerile de tip colicativ), fr diagnostic. Avnd n memorie periplul din anul precedent, tnrul coleg nu mai solicit sprijin medical, dar, nainte de nceperea noului an, dup ncheierea celor trei sptmni de practic de var efectuate sub atenta ndrumare a unuia dintre profesorii de la facultate, la presiunea familiei i a unor colegi apropiai, tnrul solicit sfatul medical de la respectivul profesor. Datorit faptului c nu existau semne sau simptome care s orienteze pentru recoltarea unui anumit produs i nu existau evidene c metodele de laborator ar putea rezolva problema n mod individual, profesorul de la facultate ia legtura cu un coleg i prieten, n vederea realizrii unui consult de specialitate, competent i fcut cu druirea care trebuie s fie caracteristic fiecrui medic. Pacientul s-a prezentat, a discutat n amnunime istoricul adenopatiei i al celorlalte simptome, povestind i modul n care adenopatia a interferat cu viaa sa, din mai multe puncte de vedere. n urma unui consult riguros, complet, s-a descoperit ganglioni inflamai i n zona axilar i supraclavicular stng, dar activitilor cotidiene ale pacientului. Medicul a opinat c adenopatia inghinal ar putea fi datorat microleziunilor peniene din timpul actului sexual, care ar putea permite intrarea n organism a unor germeni provenii din flora microbian vaginal.

435

54. Genul Borrelia (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

54. 1. Definiie. ncadrare Sunt treponematacee cu spire largi i inegale care produc spre exemplu febra recurent, boal transmis de artropodele hematofage. Borreliozele transmise prin cpue poart de obicei numele regiunii geografice n care se gsesc preponderent. Despre febra recurent s-a discutat n special dup un episod din Edimburgh (1843); dup 30 ani, agentul etiologic a fost numit Spirocheta recurrentis. Numele definitiv a fost stabilit n 1907, n amintirea i onoarea lui A. Borrel (Borrelia recurrentis). 54. 2. Caractere generale 54. 2. 1. Habitat Borreliile sunt germeni strict parazii, care nu se ntlnesc niciodat n stare liber n natur, existena lor nefiind posibil dect n organismele parazitate (roztoare, artropode, om). 54. 2. 2. Caractere morfotinctoriale Microorganismele caracteristice (ex. Borrelia recurrentis) au o form spiralat, neregulat i msoar circa 8-30 mm lungime i 0,2-0,5 mm lime. Distana dintre spire variaz ntre 2 i 4mm. Sunt foarte flexibile i se deplaseaz att prin rotaie ct i prin rsucire. Borreliile se coloreaz prin metode utilizate n hematologie (coloraia Giemsa sau Wright). 54. 2. 3. Caractere de cultur Microorganismul poate fi cultivat pe medii fluide ce conin snge, ser sau esuturi, dar i pierde rapid patogenitatea pentru animale cnd este transferat n mod repetat in vitro. Multiplicarea are loc rapid n embrionul de gin cnd sngele de la pacient este inoculat n membrana chorioalantoidian. 54. 2. 4. Caractere biochimice Se cunosc destul de puine date cu privire la necesitile metabolice sau activitatea biochimic a boreliilor. Sursa major de energie este reprezentat de carbohidrai (n special, glucoza). 54. 3. Borrelia recurrentis (febra recurent) 54. 3. 1. Aspecte generale i date privind boala produs B. recurrentis supravieuiete mai multe luni n sngele contaminat sau n culturi la 4C. n anumite cpue, bacteriile sunt transferate din generaie n generaie. Tulpinile de B. recurrentis izolate n diverse pri ale lumii, de la diferite gazde i de la vectori diferii (cpue sau purici) au primit denumiri variate sau au fost catalogate drept subtipuri ale speciei principale. 436

n urma infeciei apare un rspuns imun umoral, putnd fi detectai anticorpi aglutinani i anticorpi fixatori de complement. De remarcat faptul c, inclusiv n decursul unei singure infecii apar modificri antigenice, care explic recderile. Ultima vindecare (dup 3-10 recderi) este asociat cu prezena anticorpilor mpotriva mai multor variante antigenice. Imunitatea consecutiv infeciei este de obicei de scurt durat. Dup o perioad de incubaie (3-10 zile), debutul este brusc, cu frisoane i creterea rapid a temperaturii. n acest timp, spirochetele se afl n numr mare n snge. Febra persist 3-5 zile, apoi scade. Perioada afebril dureaz 4-10 zile i este urmat de un al doilea atac de frisoane, febr, cefalee intens i stare de ru. Pot apare succesiv pn la 10 asemenea recderi, a cror severitate scade n general progresiv. Puseele febrile se asociaz cu bacteriemie. Febra recurent este endemic n multe zone ale globului. Principalul rezervor este reprezentat de roztoare, surs de infecie pentru cpue. Distribuia focarelor endemice i incidena sezonier a bolii sunt n mare parte determinate de modul de rspndire al cpuelor. La aceste insecte, Borrelia poate fi transmis transovarian din generaie n generaie. Spirochetele sunt prezente n toate esuturile cpuelor, care pot transmite bacteriile prin muctur sau atunci cnd sunt zdrobite. n cazul pduchilor, infecia nu se transmite generaiilor urmtoare, iar boala la om se datoreaz contactului pduchilor zdrobii cu leziunile determinate de neptur. La populaiile infectate cu pduchi pot aprea epidemii severe, transmiterea fiind favorizat de aglomeraii, malnutriie i de climatul rece. Prevenirea febrei recurente se bazeaz pe evitarea contactului cu cpue, pduchi i prin despduchiere (curenie, dezinsecie). Marea variabilitate a remisiunilor spontane n cazul febrei recurente, face foarte dificil evaluarea eficacitii chimioterapiei. Tetraciclina, eritromicina (i alte macrolide), penicilina i cefalosporinele de generaia a 3-a sunt considerate utile. 54. 3. 2. Diagnosticul de laborator n febra recurent Diagnosticul de laborator n borrelioza recurent este bacteriologic, direct urmnd etapele cunoscute. Diagnosticul serologic poate oferi unele informaii, n context. 54. 3. 2. 1. Diagnosticul borreliozelor pornete de la elemente clinice, epidemiologice, anumite date de laborator i este confirmat prin diagnostic bacteriologic. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi anexa nr. 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de snge dar s-ar putea recolta i vectori (pduchi, cpue) sau LCR, lichid sinovial etc, n funcie de manifestarea clinic. Sngele trebuie recoltat n perioadele febrile. n cazul n care produsele nu se pot examina imediat, recomandm transportul acestora la temperatura frigiderului (+4C) sau inocularea unor animale receptive (ex. oareci albi sau obolani tineri) i transportul acestora ctre laborator. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i lamel utiliznd sngele ca p.p., cu examinare la microscopul cu fond ntunecat. Borreliile se vd ca spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30 mm), cu 437

spire largi i inegale, foarte mobile (cu micri de rotaie i rsucire), pe fondul negru al preparatului. Se pot realiza frotiuri subiri sau examenul picturii groase, colorate Giemsa prelungit, May-Grnwald-Giemsa sau Wright precum i cu acridin-orange sau cu Ac monoclonali marcai fluorescent i cu examinare la microscopul cu fluorescen. Pe frotiul colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate, situate printre hematii. Examenul microscopic realizat de ctre un medic experimentat permite identificarea borreliilor n circa 70% dintre cazuri, n condiiile respectrii normelor diagnosticului bacteriologic. Preparatele microscopice ar mai putea fi realizate pornind de la hemolimfa vectorilor infectai (pduche, cpu). De menionat faptul c n cazul acestui p.p. borreliile i menin pentru o lung durat de timp forma i mobilitatea caracteristice n timp ce n sngele recoltat de la gazda uman sufer modificri datorit prezenei anticorpilor specifici, iar n timp i pierd mobilitatea). n ultima perioad s-a introdus tehnica PCR pentru identificarea ADN-ului borrelian, pornind de la produsul patologic. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz de regul la nivelul centrului de referin, existnd mai multe tehnici care ar putea fi utilizate. Se pot inocula animale de experien sensibile (ex. oareci sau obolani), cu inoculare intraperitoneal. Animalele vor fi monitorizate zilnic clinic i prin examinarea microscopic a sngelui (p.p. se poate recolta de la nivelul venei cozii). Se mai pot inocula vectori (pduchi sau cpue) sau oul de gin embrionat (la nivel intra alantoidian sau n membrana chorioalantoidian). Se pot utiliza i medii de cultur artificiale speciale (cu ageni reductori, N-acetilglucozamin, acizi grai nesaturai cu caten lung, ser de iepure), n condiii de microaerofilie, cu incubare la 32-37C. Se recomand i utilizarea mediilor selective care includ o combinaie de ageni antimicrobieni precum rifampicin, amfotericin B i fosfomicin. Datorit faptului c mediile de cultur sunt lichide, nu se obin colonii izolate. Creterea microbian trebuie verificat prin realizare de preparate proaspete examinate la microscopul cu fond ntunecat la fiecare 3 zile, pentru o durat de 2-6 sptmni. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se poate realiza pe baza:

Caracterelor morfotinctoriale sunt spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30 mm), cu spire largi i inegale, foarte mobile (cu micri de rotaie i rsucire), pe fondul negru al preparatului; pe frotiul colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate;

438

 Caracterelor de cultur dac are loc multiplicarea borreliilor pe mediul de cultur acesta rmne limpede, fr sediment, dar i modific culoarea (ex. vireaz de la rou-portocaliu spre roz-glbui)

Caracterelor biochimice Borreliile sunt microaerofile, fermenteaz glucoza producnd bioxid de carbon i acid lactic (dar aceste teste nu sunt utilizate de regul n diagnostic);

Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin tehnici ale biologiei moleculare (PCR). 5. Nu a fost pus la punct o metod pentru realizarea antibiogramei (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice). Febra recurent se trateaz cu tetraciclin, cloramfenicol, penicilin sau eritromicin. n urma tratamentului poate aprea sindromul Jarisch-Herxheimer (frison sever, creterea temperaturii, hipotensiune, leucopenie). 54. 3. 2. 2. Diagnosticul serologic nu a fost considerat ca fiind foarte util, datorit variaiilor antigenice (care au loc inclusiv pe parcursul bolii) i complexitii fenomenului de recuren. n ser pot fi decelai anticorpi aglutinani, imobilizani i fixatori de complement. Sunt foarte puine laboratoare care practic aceste reacii, de obicei n scop de cercetare. La pacienii cu febr recurent epidemic (purttori de pduchi) pot aprea aglutinine fa de Proteus OXK i o reacie VDRL fals-pozitiv. n momentul de fa se recomand utilizarea unor tehnici de tip ELISA sau reacia de imunofluorescen. Dac aceste reacii sunt negative, rezultatul este considerat negativ. Dac reaciile sunt pozitive sau indeterminate, confirmarea se face prin Western Blot. 54. 3. 2. 3. Se poate nregistra o leucocitoz de pn la 25.000 PMN / mm3 i o cretere important a VSH-ului (de pn la 110 mm / or). 439

54. 4. Borrelia burgdorferi (Boala Lyme) Boala a fost denumit astfel dup numele oraului unde au fost identificate iniial cteva cazuri. Este determinat de spirocheta B. burdogferi care se transmite la om prin muctura unei mici cpue din genul Ixodes. Rezervorul animal principal este reprezentat de oareci i cerbi, dar pot fi infectate i alte animale precum i psri. Cele mai frecvente expuneri apar vara, atunci cnd cpuele sunt foarte frecvente. Numrul de cazuri de infecie cu Borrelia burgdorferi a fost n scdere n SUA, n 1996 raportndu-se 16.455 cazuri (cu o inciden de 6,210/0000) i n 1997 12.801 cazuri, incidena ajungnd la 4,790/0000. n 1998 i 1999 au fost raportate anual peste 16.000 de cazuri de boal Lyme. n ara noastr este n curs de organizare un sistem de supraveghere, raportare i control a cazurilor de borrelioz Lyme. Rspunsul imun este foarte complex i neelucidat n totalitate, ns reaciile autoimune se pare c joac un rol important. Structura genetic a gazdei, pare a influena reactivitatea particular ce apare n cursul bolii Lyme. Din punct de vedere clinic boala are manifestri precoce i manifestri tardive. Faza precoce este frecvent marcat de o leziune epitelial unic numit erithema cronicum migrans, la nceput este o leziune plat eritematoas n jurul mucturii cpuei, care se extinde lent i se clarific n zona central. n asociere cu leziunea tegumentar apare frecvent stare patologic asemntoare gripei, cu febr, frisoane, mialgii i cefalee. Cele mai frecvente manifestri clinice tardive (aprute dup sptmni sau luni de la momentul infectant) sunt reprezentate de: 1) artralgii i artrite ce se pot manifesta intermitent ani de zile; 2) manifestri neurologice: meningit, paralizie de nerv facial, radiculopatie dureroas; 3) afectare cardiac cu tulburri de conducere i miopericardit. Spirochetele au fost izolate din toate aceste zone ale corpului, fiind probabil ca aceste manifestri s fie datorate unui mecanism de hipersensibilitate cu depozitare de complexe antigen-anticorp. Din punct de vedere al diagnosticului de laborator, n vederea unui diagnostic bacteriologic (direct), microorganismul a putut fi izolat din snge, LCR i din leziunile tegumentare, ns obinerea culturii reprezint apanajul unor laboratoare specializate. Examinarea la microscopul cu fond ntunecat dup 3-5 zile de incubare la 32C poate fi util. Diagnosticul este sugerat de istoricul bolii (neptur de cpu) n zonele endemice i se bazeaz pe evidenierea anticorpilor serici de tip IgM care apar i se menin circa 3-6 sptmni de la instalarea bolii. n primele 2 sptmni care urmeaz contaminrii, serologia este negativ. n primul stadiu de boal, serologia devine slab pozitiv, astfel nct un rezultat negativ, nu exclude diagnosticul. Tehnicile serologice includ imunofluorescena indirect, ELISA, hemaglutinarea pasiv, etc. De menionat posibilitatea apariiei unei serologii fals-pozitive datorit unor reacii imune ncruciate cu alte infecii spirochetale (sifilis, leptospiroz, febr recurent), diferite infecii virale (varicel, mononucleoz infecioas) sau n cazul unor maladii autoimune (lupus eritematos diseminat, artrit reumatoid).

440

Tratamentul cu tetraciclin amelioreaz simptomele precoce i ajut la vindecarea leziunilor tegumentare. Tetraciclinele pot fi mai eficace dect penicilinele n prevenirea manifestrilor tardive. Artrita rspunde frecvent la doze mari de penicilin. n cazurile refractare, ceftriaxona sa dovedit eficace. 54. 5. Povestire adevrat Caz atipic de boal Lyme diseminat Un pacient de sex masculin n vrst de 80 de ani a fost internat de urgen, datorit comportamentului neobinuit, din ultimele zile. Pacientul era cunoscut cu hipertensiune arterial, avusese un atac cerebral vascular iar n antecedente avusese cteva episoade de demen moderat. Simptomatologia a debutat cu trei zile naintea momentului internrii: halucinaii, inapeten i astenie fizic, fr alte fenomene asociate (ex. grea, vrsturi, febr) . Anamneza efectuat a relevat faptul c n urm cu o lun, mpreun cu soia sa a ntreprins o cltorie ntr-un stat din nord-estul Statelor Unite. La internare, pacientul avea un comportament adecvat, ns prezenta un grad de agitaie, confuzie, iar din cnd n cnd, incoeren n vorbire. Examenul pe aparate la nivel respirator i cardiovascular nu a evideniat patologie asociat. Nu au fost evideniate semne fizice de iritaie meningeal. Nu au puse n eviden disfuncii la nivelul nervilor cranieni. Examenul fizic al membrelor superioare, a revelat o leziune cu aspect echimotic la nivelul regiunii cubitale posterioare a braului drept. Testele de laborator efectuate au evideniat anemie (hemoglobin 9,5 g/dl, hematocrit 31%) i trombocitopenie (125.000 / mm3) n timp ce numrul de leucocite a fost n limite normale. n prima zi de internare nu au fost sesizate modificri din punct de vedere clinic i de laborator. S-a recomandat consult neurologic i examen prin rezonan magnetic nuclear (leziuni constatate: cteva zone de infarctizare, vechi, la nivel temporal). Soia i-a amintit c pacientul a fost mucat de ctre o insect de culoare neagr n timpul celei mai recente cltorii, fa de care nu au avut nici o reacie. Avndu-se n vedere toate aspectele menionate, s-a indicat efectuarea unei puncii lombare i recoltare de snge pentru hemoculturi i pentru examene serologice. Au fost evideniate urmtoarele: LCR uor hipertensiv, coninut crescut de proteine (97 mg / dl), glicorahie n limite normale, 52 leucocite / mm3 (78% monocite), foarte rare hematii. Fr a se mai atepta rezultatele diagnosticului serologic, s-a instituit antibioticoterapie cu ceftriaxon, 2g/zi, n baza presupunerii bolii Lyme (relativ recent instalat). Sub tratamentul antibiotic, starea pacientului s-a ameliorat n urmtoarele 72 de ore. ELISA pentru Ac anti-Borrelia a artat prezena Ac specifici de tip IgM, nu i de tip IgG, fa de Borrelia burgdorferi. Testul Western-blot a confirmat aceste rezultate.

441

Starea pacientului s-a mbuntit considerabil n urmtoarele zile i s-a decis externarea acestuia, cu tratament antibiotic pn la o cur complet de 4 sptmni, sub strict supraveghere medical, propunere acceptat de familie i pus n practic. Cu toate c au existat numai semne i simptome n sfera neurologic (situaie rar ntlnit n boala Lyme) i nu au existat nici alte leziuni foarte sugestive pentru aceast patologie, datele obinute prin anamnez (ex. cltorie ntr-o zon endemic pentru boala Lyme) au orientat cercetrile diagnostice. Lipsa de tipicitate a tabloului clinic, dar i punerea n final a unui diagnostic care prea improbabil iniial, arat nc o dat afirmaia excepia ntrete regula. Instituirea tratamentului (empiric), avnd la baz flerul medicului curant, s-a dovedit a fi a atitudine foarte potrivit.

55. Genul Leptospira (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)

55. 1. Definiie. ncadrare Agentul etiologic al leptospirozei face parte din familia Spirochaetaceae, genul Leptospira. Se cunosc mai bine speciile L. interrogans i L. biflexa, denumirea derivnd din forma particular a extremitilor celulei bacteriene. Genul include peste 200 de serotipuri (numite serovaruri, de ali autori). Din specia L. interrogans fac parte 170 serotipuri patogene (complexul interrogans) care pot determina boala la animale i om, varietatea acestor serotipuri determinnd i numeroasele forme de manifestare a leptospirozei. Specia L. biflexa reunete peste 50 de serotipuri saprofite. Prima a fost descoperit specia saprofit (numit iniial Spirocheta biflexa, 1914), ulterior una dintre speciile patogene (Spirocheta icterohaemorrhagiae, 1915, n Japonia). 55. 2. Caractere generale 55. 2. 1. Habitat Rezervorul principal de leptospire patogene este reprezentat de obolan, oarece i de unele animale domestice bolnave sau aparent sntoase, n primul rnd porcul. Leptospirele patogene persist timp nelimitat n organismul animalelor infectate. n mod frecvent animalele domestice se contamineaz intre ele, dar transmiterea se poate realiza i de la obolan, oarece sau de la animale slbatice. 55. 2. 2. Caractere morfotinctoriale n preparatul proaspt examinat la microscopul cu cmpul ntunecat, leptospirele apar ca filamente regulat spiralate, cu diametrul mediu ntre 0,1 i 0,15 mm i lungimea medie ntre 5 i 15 m, luminiscente, foarte mobile, descriind micri de burghiu imprimate de dispoziia particular a flagelilor.

442

Pe frotiul fixat, impregnat i colorat prin tehnica Fontana-Tribondeau (impregnare argentic), examinat la microscopul obinuit, leptospirele apar ca filamente regulat spiralate cu extremitile fin ngroate sub form de buton, de culoare maro. 55. 2. 3. Caractere de cultur Leptospirele utilizeaz ca surs de carbon acizii grai i alcoolii grai cu lanuri lungi. Mediile de cultur, att cele clasice (mediul Korthof) ct i mediile mai noi care conin acizi grai, vitamine din grupul B i fraciunea 5 a albuminei bovine, necesit mbogirea cu ser normal de iepure. Utilizeaz amoniacul ca surs de azot. Deoarece sunt uor microaerofile, leptospirele necesit medii de cultur lichide i recipiente nguste pentru cultivare. n condiiile amintite leptospirele ating un nivel optim de dezvoltare n 7-10 zile. 55. 2. 4. Caractere biochimice Leptospirele dispun de un bogat echipament enzimatic (hialuronidaz, fosfolipaz, oxidaz, catalaz). Speciile patogene au o slab activitate ureazic. Serul de iepure este strict necesar pentru multiplicarea acestor microorganisme. Sunt microorganisme aerobe sau microaerofile. 55. 2. 5. Rezistena fa de factori chimici i fizici n condiii obinuite leptospirele patogene supravieuiesc greu n mediul exterior. Nu suport uscciunea, lumina solar, temperatura sub 14 C i cea peste 28 C, pH-ul acid i intens alcalin. Din cauza rezistenei sczute a leptospirelor patogene n mediul exterior, mbolnvirea omului prin intermediul apelor de suprafa (mai ales a celor stttoare) sau a solului contaminat este explicat printr-o continu alimentare cu leptospire dintr-o surs stabil (de exemplu numrul mare de animale purttoare de leptospire prin lipsa deratizrii). Leptospirele patogene sunt distruse de alcoolul alb, acizi, alcali, cloramin. Dintre antibiotice, beta-lactaminele injectabile (mai ales penicilina) au efect bactericid. 55. 2. 6. Structur antigenic Antigenele cunoscute sunt antigenul somatic specific de gen i antigenele de suprafa specifice de grup i tip. Antigenul somatic comun leptospirelor patogene i saprofite este situat n profunzimea nveliului bacterian, iar din punct de vedere chimic este un complex lipo-polizaharidopolipeptidic (structura nu este nc elucidat, complet). Antigenele de suprafa sunt reprezentate din punct de vedere chimic de un complex polizaharido-polipeptidic. Serogrupurile se deosebesc prin compoziia n monozaharide i aminoacizi i prin diferene de ordin secvenial. Antigenele de suprafa sunt imunogene in vivo. 443

Anticorpii aprui n cursul bolii confer protecie de grup i tip pentru o perioad variabil (de ordinul anilor). 55. 2. 7. Rspuns imun Antigenele de suprafa sunt imunogene in vivo. Anticorpii rezultai din trecerea prin boal pot conferi protecie pentru o perioad variabil, de ordinul anilor. Imunitatea postinfecie este specific serotipului tulpinii infectante, respectiv tulpinii vaccinale. n cursul infeciei apar anticorpi aglutinani, fixatori de complement i litici, care sunt evideniai n ser ncepnd cu zilele 4-6 de la debutul bolii, ating nivelul maxim ntre sptmnile 3-6 de boal i scad apoi progresiv. 55. 2. 8. Caractere de patogenitate Sunt proprii speciei L. interrogans, care este patogen prin multiplicare i invazivitate. Virulena este explicat pn n prezent prin mobilitate, gradul de ncovoiere a extremitilor celulei bacteriene i prin prezena factorului de virulen Vi existent la suprafaa unor tulpini. Cu ct extremitile celulei bacteriene sunt mai curbate, cu att puterea de penetrare a esuturilor de ctre leptospire este mai mare. 55. 3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produse Leptospiroza se caracterizeaz prin polimorfism, pe parcursul evoluiei modificndu-i aspectul clinic (se asociaz noi sindroame sau apar atipii clinice). Dup o perioad de incubaie de 1-2 sptmni, debutul bolii poate fi marcat de febr. Microorganismul circul pe calea torentului sanguin i se cantoneaz n organele parenchimatoase (ficat i rinichi), determinnd hemoragii, necroz tisular i disfuncii de organ (pot aprea icter, hemoragii, manifestri datorit reteniei azotate etc). Boala are destul de frecvent un aspect bifazic: dup o ameliorare iniial urmeaz faza a doua a bolii, marcat de creterea titrului de anticorpi IgM. Leptospiroza se poate manifesta ca meningit aseptic (cu lichid clar, asemntor macroscopic cu LCR recoltat de la pacienii cu meningit viral). Afectarea renal la multe specii de animale este cronic, avnd drept efect eliminarea unui numr de leptospire prin urin; acesta reprezint probabil principalul mod de contaminare la om. Urina uman poate conine spirochete n a doua i a treia sptmn de boal. Dei din leptospire nu a fost izolat un factor toxic bine difereniat toxicitatea care conduce la apariia principalelor manifestri este determinat de eliberarea unei endotoxine. Intervenia endotoxinei explic modificrile tisulare macro i microscopice de tip toxic degenerativ; eficiena mai sczut a terapiei cu antibiotice dup 7-12 zile de la debutul bolii; producerea ocului endotoxic (datorit lizei masive a leptospirelor), febra cu valori de peste 38,5C cu aspect bi i uneori trifazic (relativ caracteristic pentru leptospiroz) sau instalarea hipersensibilitii celulare de tip IV n leptospiroza acut.

444

55. 4. Diagnosticul de laborator

n infeciile produse de Leptospira

Diagnosticul pornete de la elemente clinice i epidemiologice. Diagnosticul de laborator n leptospiroz poate fi bacteriologic i / sau serologic. 55. 4. 1. Diagnosticul bacteriologic este relativ dificil, laborios, respectnd etapele cunoscute i este cel mai frecvent realizat la nivelul centrului de referin; este laborios i costisitor. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi anexa nr. 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de snge sau LCR (n primele 710 zile), urin (dup 9 zile de la debut pn la 2-8 sptmni de boal), dar s-ar putea recolta i lichid peritoneal, pleural etc. Datorit fragilitii leptospirelor i fenomenului de autoliz, transportul trebuie s fie realizat rapid, n maxim 1-3 ore, la temperatura camerei. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt (fr a folosi ns lamela). Preparatul se examineaz la microscopul cu fond ntunecat. Exist o serie de proceduri utilizate pentru pregtirea preparatului. n cazul lichidului peritoneal, LCR etc., produsul de centrifugheaz la 1.500 g pentru o durat de 30 minute, utilizndu-se sedimentul obinut. n cazul sngelui, recoltarea se face pe anticoagulant (dar nu cu citrat), urmnd o prim centrifugare la 500g pentru o durat de 5 minute. Prelum supernatantul pe care l centrifugm la 1.500 g pentru o durat de 30 minute i utilizm sedimentul obinut. n aceste condiii, un medic microbiolog cu experien ar putea stabili diagnosticul prezumtiv. Leptospirele apar ca filamente luminoase, spiralate, foarte mobile, cu micri de nurubare i flexiune, dar i cu o uoar deplasare n spaiu, pe fondul negru al preparatului. Unii autori recomand realizarea de frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare argentic (Fontana-Tribondeau), mai ales pentru preparatele histo-patologice; leptospirele apar ca filamente regulat spiralate cu extremitile fin ngroate sub form de buton, de culoare maro. A fost recomandat i colorarea imunofluorescent (IF direct) n cazul suspicionrii diagnosticului de leptospiroz. n ultima perioad, pornind de la p.p. (ser, urin, LCR etc) au fost puse la punct tehnici PCR. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz dificil, cu costuri ridicate, datorit sensibilitii n mediul extern i particularitilor de multiplicare a leptospirelor. De regul cultivarea se face la nivelul centrului de referin; utiliznd medii de cultur lichide nu obinem colonii izolate. Exist i posibilitatea inoculrii p.p. la cobai sau alt animal de laborator, intraperitoneal. Starea clinic trebuie monitorizat zilnic. Identificarea infeciei se poate face prin diagnostic serologic, prin izolarea leptospirelor (hemocultur) sau anatomopatologic i bacteriologic dup decesul sau sacrificarea animalului respectiv. n cazul utilizrii mediilor de cultur este recomandat ca toate p.p. s fie nsmnate att pe medii de cultur selective ct i neselective. Mediul de cultur cel mai cunoscut este mediul Korthof (cu acizi i alcooli grai, care conine i ser de iepure), pregtind n acest scop mai multe tuburi n care nsmnm cantiti progresive de p.p. (ex. pornim de la o pictur, continum cu 2 picturi etc). Mediile selective includ neomicin i / sau 5-fluorouracil. 445

Realizm incubarea la 28C. Multiplicarea bacterian nu determin o tulburare a mediului (apariia turbiditii reprezint cel mai frecvent o contaminare cu o alt bacterie). Dup 3 zile, respectnd cu strictee normele de asepsie, realizm preparate native pe care le examinm la microscopul cu fondul ntunecat. n cazul n care rezultatul este negativ, repetm aceast examinare la interval de circa 3 zile pentru o durat total de minim 4 sptmni, sau pn la obinerea unui rezultat pozitiv. n general creterea bacterian are loc n 3-14 zile de la momentul nsmnrii. Costul i durata diagnosticului cresc i datorit faptului c, pentru identificare sunt necesare cel puin 1-2 repicri pe un alt mediu lichid, dup detectarea microscopic a unor microorganisme care ar putea fi implicate patogenic. O alternativ (i mai costisitoare, utilizat mai ales dac presupunem contaminarea culturii cu o alt bacterie) este reprezentat de inocularea intraperitoneal a culturii respective la cobai. Dup 30-60 minute, avnd n vedere faptul c leptospirele invadeaz sistemul circulator mai rapid n comparaie cu alte bacterii, dup anestezierea animalului se recolteaz snge (prin puncie cardiac) i realizm o hemocultur. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:

Caractere morfotinctoriale: realizm un preparat proaspt (fr a folosi lamela) din mediul de cultur i l examinm la microscopul cu fond ntunecat; leptospirele, cu dimensiuni de 0,1 m / 5-15 m, apar ca filamente luminoase, spiralate, foarte mobile, cu micri de nurubare i flexiune, dar i cu o uoar deplasare n spaiu, pe fondul negru al preparatului; se pot realiza frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare argentic (Fontana-Tribondeau) precum i prin IF direct;

Caractere de cultur: leptospirele nepatogene se multiplic la 11-13C n timp ce L. interrogans nu se poate multiplica la aceast temperatur;

Caractere biochimice: leptospirele nepatogene sunt rezistente la 8-azaguanin n timp ce L. interrogans este sensibil la aceast substan chimic;

446

 Caractere antigenice: se utilizeaz seruri de referin cu anticorpi fa de serogrupurile cunoscute i tulpina de identificat izolat n cultur pur i concentrat la o densitate standard, prin reacii de aglutinare microscopic, la nivelul centrului de referin care a elaborat protocolul standard de operare; n mod similar se poate identifica i serovarul implicat;

Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: tehnici ale biologiei moleculare (amplificarea prin PCR a fragmentelor obinute prin restricie endonucleazic etc). 5. Antibiograma nu se realizeaz (nu a fost pus la punct o tehnic n acest scop). Este cunoscut faptul c leptospirele sunt sensibile la penicilin, amoxicilin, tetraciclin, doxiciclin etc dar tratamentul se stabilete n funcie de forma i gravitatea bolii. 55. 4. 1. Diagnosticul serologic Anticorpii specifici se pot evidenia n serul pacienilor ncepnd cu a 4-6-a zi de la debutul bolii, atingnd un nivel maxim ntre sptmnile 3-6 de boal, dup care scad progresiv. Tehnica de referin este reprezentat de reacia de aglutinare microscopic, realizat pe seruri pereche (primul recoltat la 1-2 sptmni de la debut, al doilea recoltat la 3-4 sptmni de la debut). O cretere de 4 ori a titrului la a doua determinare semnific un diagnostic pozitiv. Un titru 1/800 n prezena unor semne clinice de leptospiroz, este foarte sugestiv. Trebuie s menionm c pentru unii pacieni seroconversia are loc mai tardiv. O alt problem este reprezentat de faptul c se utilizeaz leptospire vii n calitate de Ag cunoscut, motiv pentru care aceast reacie nu se poate practica dect n centrul de referin. La nivelul altor uniti sanitare se pot practica reacii de tip ELISA, reacia de hemaglutinare indirect sau reacia de aglutinare pe lam utiliznd Ag preparate din tulpini saprofite (sensibilitatea i specificitatea acestor reacii este mai sczut). Tehnica ELISA de identificare a anticorpilor de tip IgM pune diagnosticul infeciei acute dar nu poate permite determinarea serogrupului implicat aa cum se reuete n cazul tehnicii de referin.

447

55. 5. Tratament Terapia cu antibiotice include n principal medicamente din grupa penicilinelor sau a tetraciclinelor (ex. doxiciclin). Cloramfenicolul i rifampicina nu au efect asupra leptospirelor. 55. 6. Epidemiologie Leptospirozele sunt, n esen, infecii ale animalelor, infecia uman aprnd accidental, de ex. prin contactul cu apa sau cu alte materiale contaminate cu excremente ale animalelor. Principalele surse de infecie sunt reprezentate de obolani, oareci, roztoare slbatice, porci, cini sau vaci. Acestea excret leptospire prin urin i fecale att n timpul bolii active, ct i n timpul evoluiei asimptomatice. Leptospirele rmn viabile mai multe sptmni n apele stttoare, omul putndu-se infecta prin mbiere, not, prin consumul acestor ape sau prin ingestia de mncruri contaminate. Persoanele cu cea mai mare probabilitate de a intra n contact cu apa contaminat de obolani (mineri, lucrtorii din canalizare, fermieri, pescari) au cel mai mare risc de infecie. Copiii se pot infecta cu leptospire de la cini, mult mai frecvent dect adulii. Cazurile de leptospiroz evideniate n anul 1998, n Romnia, au fost n numr de 557, incidena bolii fiind de 2,50/0000. n anul 1999, numrul de cazuri a crescut la 755, incidena ajungnd la valoarea de 3,40/0000 iar n anul 2000 au fost raportate 370 de cazuri. n perioada 2001-2004, numrul de cazuri nregistrate a fost mai mic, ntre 244 (2003) i 310 (2001), ns n ultimii ani au fost raportate peste 380 de cazuri / an, respectiv 451 cazuri n anul 2005 (inciden 2,090/0000) i 386 cazuri n 2006 (inciden 1,790/0000). n SUA, n 1974, au fost raportate 8.351 cazuri de leptospiroz. n perioada 1975-1994 au fost raportate ntre 31 i 110 (o singur dat, n rest numrul de cazuri a fost 100) cazuri pe an. Din 1995 leptospiroza nu mai face parte din lista de boli cu declarare obligatorie. 55. 7. Profilaxie Controlul leptospirozei const n prevenirea expunerii la apa potenial contaminat i reducerea contaminrii prin inerea sub control a roztoarelor. Doxiciclina, administrat n doz de 200 mg o dat pe sptmn n timpul expunerii, are un caracter profilactic. Cinii pot fi vaccinai mpotriva infeciilor leptospirotice. 55. 8. Povestire adevrat Diagnosticul diferenial face diferena Evoluia tiinei n domeniul medical produce noi informaii; viitorii medici i medicii ar trebui s le cunoasc i s le utilizeze, n interesul pacienilor. Pentru a ajunge un bun medic este nevoie de rezisten (fizic i psihic), de sute i mii de ore de nvat, de studiu individual, practic i de absorbit orice lucru util de la colegii mai mari, cu experien. Este nevoie de studiu, pentru c este nevoie de performan. Este nevoie s acumulm cunotine, care s consolideze o construcie care apare i se ntrete n ani i ani de munc, iar la nceput (de via n clinic) trebuie s nvm n primul rnd s punem cele mai potrivite ntrebri i s nelegem importana anamnezei. Pe aceast baz se poate aduga examenul 448

clinic, iniial pe segmente, dar care trebuie s ajung s fie complet, pn (cel trziu) n finalul celui de-al treilea an de studiu. Pentru a exemplifica cele de mai sus, din literatura internaional am extras urmtorul caz. Un pacient de sex masculin, n vrst de 35 de ani, pasionat de viaa n natur i de vntoare, se prezint la camera de gard a unui spital cu urmtoarele motive de internare: febr, stare general alterat, dureri musculare i articulare. n discuia cu pacientul, s-a putut afla c s-a simit bine pn n urm cu 4 zile, moment n care s-a simit febril (nu a pus termometrul), a avut dureri n articulaiile membrelor inferioare, dureri musculare i dureri la nivel lombar. Cu 2 zile nainte de internare a folosit termometrul i a nregistrat temperatura (39,7C). Starea general a nceput s fie mediocr, au aprut cefaleea, greaa i a vrsat de 2 ori. Dup primele faze ale anamnezei, datele aflate nu permiteau orientarea spre cauza acestui sindrom febril. Continund discuia cu pacientul, au mai fost aflate urmtoarele informaii: a avut gonoree la vrsta de 20 de ani, a consumat droguri (att pe cale oral ct i pe cale intravenoas), a cltorit recent n California, fiind vntor i lucrnd n domeniu, intr frecvent n contact cu animalele (inclusiv cele de la o ferm), a consumat frecvent carne de vnat (inclusiv n snge) i nu a avut nici o problem n a consuma lapte nefiert sau nepasteurizat. Aceste elemente, foarte variate, nu au putut s direcioneze foarte mult diagnosticul (pacientul ar fi putut s aib orice infecie cu transmitere sexual, orice infecie transmis prin injectare probabil n condiii la limita igienei, sau ar fi putut s aib orice infecie comun animalelor i care se poate transmite omului, de ex. tularemie, bruceloz, leptospiroz sau cium). i, ca ntotdeauna, chiar dac discuia noastr se poart la microbiologie, nu trebuie s uitm faptul c semnele i simptomele pot avea i cauze ne-infecioase. Examenul clinic, pe aparate i sisteme, a fost normal cu excepia hipertermiei, prezena adenopatiei axilare (ganglioni uor mrii, nedureroi, mobili cu planurile subiacente), o senzaie de duritate la nivelul hipocondrului drept (ficat la rebord), fr leziuni muco-tegumentare, dar prezentnd hemoragii subunghiale (pacientului le-a considerat ca fiind legate de munca prestat). Nici aceste date nu au orientat diagnosticul. Examenul clinic nu ofer elemente ajuttoare n stabilirea diagnosticului deoarece nu exist semne patognomonice ce ar putea fi atribuite unei anumite boli sau sindrom. Medicul curant, a apreciat c febra de peste 39C ar putea fi datorat unei infecii sistemice (chiar dac nu a exclus o cauz ne-infecioas). Avnd n vedere c semnul febr, poate s semnifice o cauz amenintoare de via, este important ca investigarea etiologiei i stabilirea unui tratament adresat cauzei, sunt foarte importante. n cadrul diagnosticului diferenial, medicul curant a luat n considerare existena unei infecii virale (virus hepatitic, virus EpsteinBarr, virus citomegalic, arbovirus, HIV) sau a unei infecii bacteriene (Francisella tularensis, Brucella spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., Leptospira spp. sau Coxiella burnetii). 449

Nici analizele de laborator (probe bioumorale) nu au fost foarte utile n diagnosticul diferenial (numr crescut de leucocite, procent de neutrofile n limite normale, VSH la limita unui rezultat crescut, transaminaze cu valori mai mari dect normal). n ambulatoriu, un medic, a recomandat i efectuat recoltarea sngelui pentru hemoculturi, care au rmas negative pn n a 5-a zi (2 zile anterior internrii i nc 3 zile, dup internare). n spital s-a recoltat snge pentru alte hemoculturi i pentru diferite examene serologice (pentru HBV, HCV, HIV, EBV, CMV, Francisella tularensis, Brucella spp., Leptospira spp., Borrelia spp. i Coxiella burnetii), un adevrat arsenal serologic. Radiografiile cardio-toraco-pulmonar i cranian nu relevat nimic patologic n schimb tomografia computerizat a sugerat existena unei adenopatii situat pelvian. Numrul crescut de leucocite a sugerat c infecia este bacterian i nu viral. S-a instituit tratament cu penicilin (injectabil) i doxiciclin. n a treia zi de spitalizare, la nivel tibial a aprut o erupie eritematoas, iar la nivelul faringian posterior i palatin, au aprut vezicule de mici dimensiuni. Prin consultarea cu ali colegi, medicul curant a aflat c au existat i alte situaii, n care pacieni cu leptospiroz au prezentat leziuni la nivel tibial; totui aspectul nu era caracteristic i s-a decis ateptarea rezultatelor de laborator (serologice). n a doua zi de la nceperea tratamentului temperatura a sczut (37,8C), iar la 4 zile leziunile au disprut. La 7 zile de la prima recoltare (pentru examene serologice), a fost recoltat o nou prob, pentru urmrirea n dinamic a rezultatelor. Anticorpii au fost prezeni, numai n a doua prob, pentru Leptospira spp. Punerea diagnosticului de leptospiroz i instituirea tratamentului antibiotic corespunztor poate fi decisiv pentru evoluia pacientului; dei exist multe cazuri n care boala este autolimitant, exist i cazuri n care rata fatalitii este foarte mare.

450