ANALIZA SECVENELOR DE ADN CLONATE

Apariia ingineriei genetice ca stiin a facut posibil manifestarea artificial a informaiei genetice a organismelor vii, deschiznd calea apariiei biotehnologiilor moderne. Identificarea i descifrarea structurii diferitelor gene prin metodele biologiei moleculare, a dus la stabilirea unor corelaii ntre genotipuri i anumite nsuiri calitative i cantitative ale produciilor, rezistenei la boli i la duntori. Prin utilizarea unor tehnici specifice, bazate pe analiza A !"ului #P$%, %&'P, %AP , A&'P, (!P, etc.) se pot identifica i seleciona n populaii, indivizi cu genotipuri dorite la nivelul locilor genelor ce codific caracterele de interes. *ermenul de A ! recombinant se refer la combinaiile noi de A ! obinute ntre anumite secvene de A ! de la diferite organisme i molecule de A! bacterian #sau de la alte specii), capabile s se replice indefinit #formnd clone) sau s e+prime, ntr"o gazd, informaia genetic pe care o conin. *ehnicile A! recombinant se pot grupa n dou mari categorii, Clonarea ADN sau amplificarea selectiv a unei gene-secvene de A !, bazat n esena pe multiple runde de replicare a A !"ului, care vor produce un numr mare de copii ale fragmentului respectiv. clonarea poate fi celular, in vivo, cnd se folosete mecanismul natural al replicrii A ! sau acelular, in vitro, bazat pe reacia de polimerizare n lan #P$%). Analiza ADN sau detecia specific a unei secvene de A ! sau A%!, bazat pe hibridizarea molecular #prin complementaritate ) a unei sonde marcate de acid nucleic, cu secvena respective.

Rolul practic al tehnicilor de analiz a sec en!elor de ADN clonate" $ercetarea" secvenierea A !, formarea bibliotecilor de gene, studiul e+presiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinelor multaiilor. epistarea persoanelor purttoare de mutaii"prenatal sau postnatal, cu scopul de prevenire a naterii copiilor cu anomalii genetice sau manifestrii unor patologii severe. *erapie genic # alegerea genei int, construirea vectorilor de gene, etc.). epistarea A ! strin #viral sau bacterian) n diagnosticarea bolilor infecioase. Identificarea polimorfismelor individuale n analiza filiaiei, n criminalistic. (tudiul molecular al genelor poate fi realizat pe mai multe ci n strns legtur cu scopul propus, /. (ecvenierea A ! pentru determinarea structurii primare a genei. 0. *ehnica (outhern 1 blot pentru identificarea poziiei genei n genom. 2. *ehnica !orthen 1 blot pentru determinarea e+presiei genelor # analiza A%!m). 3. *ehnica 4estern 1 blot pentru determinarea produsului proteic al genei. 5. *ehnica P$% pentru identificarea genei normale sau mutante. 6. 7ibridizarea in situ; 8. *ehnica %&'P #%estriction &ragment 'ength Pol9morphism) up realizarea clonrii i selecia clonelor recombinate urmeaz analiza fragmentului de A ! de interes. Pentru analizarea sa pot fi folosite mai multe metode, " folosirea unor enzime de restricie care s realizeze clivarea A !"ului clonat, dupa care fragmentele de interes sunt analizate prin electroforez n gel de agaroz.
2

" gena de interes este amplificat prin tehnica P$%, subclonat ntr"un vector specific i introdus ntr"o gazd nou. " gena poate fi modificat prin mutageneza :in vitro; iar funciile sale putnd fi studiate ulterior. upa izolarea i amplificarea unui fragment de A ! #gen), etapa principal de analiz genotipic este determinarea secvenei nucleotidice, deci a informaiei genetice a fragmentului respectiv. Aceast aciune este decisiv pentru a stabili structura genei precum i secvena de aminoacizi a proteinei codificat de gen #n cazul n care ea nu a fost identificat). e asemenea se poate identifica tipul de mutaie care a produs o boala genetic. (tabilirea secvenei nucleotidice este util
i pentru sinteza oligosondelor specifice pentru o alel #A(<) i a amorselor folosite n P$%, ambele fiind larg utilizate n diagnosticul molecular.

#$Sec en!ierea ADN Analiza secvenei bazelor azotate din structura primar a A ! poate fi realizat prin dou ci, a. calea chimica #%a&a'( )il*ert), n care se folosesc reaciile chimice de clivare a A !"ului, dar fiind o metod complicat i laborioas, nu mai este utilizat n ultimii ani. b. calea enzimatic #San+er) n care A !"ul este sintetizat in vitro pe baza matriei A ! studiat, n aa fel ncat reacia se termin specific n poziia care corespunde unei baze anumite. a$ %etoda %a&a' ,)il*ert #degradare chimic) presupune utilizarea unui anumit segment de A ! monocatenar care este mai nti tratat cu fosfataz alcalin pentru a elimina radicalul 5= fosfat, apoi se adaug A*P, marcat cu 20p, i polinucleotid">inaz care ataeaz 20p la nucleotide de la captul 5=. Probele marcate astfel obinute sunt supuse unor tratamente care asigur clivarea specific a secvenei de A !, la nivelul unor situsuri cunoscute # sunt :rupte; legturile fosfodiesterice dintre dou nucleotide, dintre care una este cunoscut).
3

?+ist diferite modaliti de tratament ale probei de interes care asigur realizarea mai multor variante de clivare, clivarea guanine presupune ca A ! de studiat s fie tratat, fie cu dimetilsulfat ce determin metilarea guaninei n poziia 8 i a adenine n poziia 2, fie, mai rar, cu ageni chimici care distrug guanina. Apoi molecula de A ! metilat este supus la aciunea piperidinei care determin ruperea legturilor fosfodiesterice alturi de poziia ocupat de guanin. clivarea guaninei" adeninei care presupune tratarea A ! metilat cu dimetilsulfat cu piridin"formiat. Aceasta face ca tratarea ulterioar cu piperidin s determine clivarea legturilor fosfodiesterice ori de cte ori n segmental de A ! apare A sau @. clivarea timinei"citozinei presupune ca A ! de interes s fie mai nti supus aciunii hidrazinei care interacioneaz specific cu timina i citozina, iar apoi, amestecul obinut, este tratat cu piperidin care cliveaz legturile fosfodiesterice din secvena de A ! ori de cte ori apar nucleotide de tip d**P sau d$*P. clivarea citozinei se realizeaz n aceleai condiii ca i cele descrise mai sus, cu e+cepia faptului c prima reacie, cea cu hidrazina, se face n prezena !a$l 5A care inhib aciunea acesteia la nivelul timinei. Bn acest fel, tratarea probei de A ! cu piperidin determin clivarea legturilor fosfodiesterice doar la nivelul citozinei.

(ecvenierea A ! prin clivarea chimic #Aa+am"@ilbert)

*$%etoda San+er #enzimatic) utilizeaz sinteza enzimatic a unei catene, complementar cu o matri clonat. In cadrul acestei proceduri sinteza este stopat prin ncorporarea unui dideo+inucleozid trifosfat 1 un analog al dezo+iribonucleotidelor. ideo+inucleozidtrifosfaii conin n poziia 2= grupa 17, dar nu grupa 1<7 care mpiedic polimerizarea nucleotidelor. &olosind patru analogi dedeo+i n timpul sintezei catenei noi de A !, se poate identifica fiecare nucleotide normal din catena matria. ?lectroforeza fragmentelor obinute permite stabilirea ordinii nucleotidelor n molecula de A !. -rincipiu (e sintetizeaz o caten A ! complementar fragmentului cu secvena necunoscut, utiliznd A ! 1polimeraza i o amors radiomarcat #fi+at la e+tremitatea 2= a fragmentului). %eacia poate fi inhibat n dreptul unui anumit nucleotid, prin folosirea unor analogi nucleotidici de tipul dideo+inucleotidelor #care au pierdut gruparea 2=" <7). A ! polimeraza poate aduga un astfel de nucleotid, dar dup ce acesta a fost ncorporat, reacia se oprete datorit absenei gruprii 2=" <7 din dideo+inucleotid, necesar polimerizrii. (e realizeaz astfel
fragmente cu o lungime egal distanei dintre amors i locul unde s"a ncorporat un anumit dideo+inucleotid.

Descrierea 'etodei Aolecula de A ! ce trebuie secvenializat este separat n cele dou catene. &iecare caten este clonat ntr"un vector monocatenar #fagul A/2), fiind inserat #cu capatul 2=) ntr"un anumit situs, dup o secven #primer) cunoscut i marcat radioactiv sau fluorescent, ce are rolul de amors. Aceste monocatene de A ! servesc ca matri pentru sinteza unei catene noi, complementare, folosind A ! polimeraza i nucleotidele necesare sintezei. %eacia se desfoar concomitent n patru eprubete, n fiecare se va stabili localizarea unui anumit nucleotid folosind ca analog inhibitor, un anumit dideo+iribonucleotid. e e+emplu n eprubeta ce va stabili localizarea @ se va aduga dd@*P. atunci cnd dideo+iribonucleotidul respective este ncorporat n catena n curs de formare, sinteza se oprete. $nd polimeraza ntlnete urmtorul nucleotid $ fenomenul se repet i rezult un fragment cu 3 nucleotide i respectiv C nucleotide. Apoi proba este analizat prin electroforez n gel. se observ o serie de benzi la poziiile ce corespund localizrii fiecrui nucleotid cu @. %eacii similare pentru nucleotidele cu A, *, i $ vor furniza serii corespunztoare de fragmente # fiecare prob ntr"un :canal; al gelului de poliacrilamid). Ansamblul celor 3 reacii poate fi citit pe o :scar; poziional direcionat de la fragmentele cele mai mici la cele mai mari. astfel se poate determina secvena de nucleotide a fragmentului analizat. Aetoda de sintez enzimatic descris de (anger este din ce n ce mai mult folosit fiind perfecionat continuu. &olosind ca vectori, pentru secvena de determinat, plasmide de generaia III"a se pot secvenia molecule de A ! bicatenar. AarcaDul radioactiv a fost nlocuit cu marcaDul prin fluorocromi specifici fiecrui nucleotid. Informatizarea a deschis drumul automatizrii i sunt deDa folosite primele secveniatoare automate. eterminarea secvenei unui acid nucleic este e+trem de rapid, n aceste condiii fiind posibil determinarea secvenei cvasi"integrale a genomului uman. Pentru a identifica i studia o gen dintr"o colecie #bibliotec-banc) de fragmente de A ! clonate este necesar o sond genotipic adecvat care s permit recunoaterea direct a genei fie a unor mar>eri genotipici #secvene necodante) situai n vecintatea genei.
6

Aceast metod se bazeaz pe principiul hibridizrii moleculare a acizilor nucleic. Bn funcie de scopul urmrit pentru separarea acizilor nucleici se pot utiliza, a. electroforeza. b. cromatografia. c. centrifugarea.. Electro.oreza acizilor nucleici ?lectroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcin ntr"un cmp electric. Aigrarea moleculelor se realizeaz print"o matrice specific. Aetoda este aplicat pentru analiza proteinelor i a acizilor nucleici. $a matrice pentru vizualizarea acizilor nucleici pe primul loc se utilzeaz gelul de agaroz. (e mai poate utiliza i gel de poliacrilamid care ofer o rezoluie foarte bun a separrii fragmentelor de A !, mai ales n cazul fragmentelor mici, dar acest metod se folosete mai rar deoarece este foarte laborioas. ei electroforeza n gel de agaroz ofer o rezoluie inferioar fa de cea realizat pe poliacrilalamid, ea este utilizat cu succes deoarece este mai simpl. Aoleculele de acizi nucleici sunt ncrcate negativ datorit gruprilor fosfat, fcnd posibil migrarea moleculelor de A ! i A%! ntr"un cmp electric de la catod la anod. Amestecul de molecule nu se va deplasa n cmpul electric cu aceeai viteza. Aoleculele mici se vor deplasa mai repede prin porii matricei, iar cele mai mari vor avansa mai lent, separarea moleculelor fiind dependent de masa lor molecular. Pentru estimarea apro+imativ a mrimii fragmentelor n acelai gel, dar n godeu separate se va migra un amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. Acest amestec de molecule fiind mar>er"ul molecular A !. eoarece A !"ul nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este necesar utilizarea unui colorant, cel mai folosit fiind bromura de etidiu, care fi+at de A ! n lumin EF devine fluorescent i are o culoare portocalie.

Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz.A- imaginea gelului la expunerea n U ; B- fotografia aceluia!i gel

Gromura de etidiu se intercaleaz ntre bazele azotate din molecula dublu catenar de A !. 'ungimea de und a luminii ultraviolete #EF), la care este e+pus gelul trebuie sa fie cuprins ntre 06Hsi 2HHnm. ?lectroforeza n gel de agaroz este utilizat pentru vizualizarea i purificarea A !. Fizualizarea ne ofer informaii despre integritatea A !, rezultatul digestiilor enzimatice, estimarea cantitii de A ! obinut n reaciile P$% sau de e+tracie. %etoda centri.u+rii ofer posibilitatea obinerii de A%! n cantiti considerabile i de nalt puritate. in cadrul 'etodelor cro'ato+ra.ice, pentru separarea acizior nucleici se utilizeaz cromatrografia gel filtrare, cromatografia de schimb ionic i metoda d7P'$. 0i*ridizarea 'oleculara a acizilor nucleici 7ibridizarea molecular se bazeaz pe capacitatea unor molecule monocatenare de acid nucleic de a forma, pe baz de complementaritate, molecule bicatenare. *ehnicile standard folosesc o sond monocatenar de acid nucleic #cu o structur cunoscut), pentru a identifica o secven similar ntr"un amestec comple+ i heterogen de molecule de acid
8

nucleic :int; # de obicei imobilizat pe suport solid). ac inta este o molecul de A ! dublu"catenar atunci catenele trebuie mai nti separate #prin nclzire sau tratament alcalin). Bn condiii adecvate, sonda genotipic se fi+eaz specific i stabil pe secvena sa complementar din int. Pentru a identifica i izola hibridul molecular sonda este marcat cu un trasor radioactiv sau cu un compus fluorescent. Aceasta va permite detectarea secvenei-genei ce posed o secven de A ! omoloag sondei folosite. &ragment A ! I* * A T A C ) ) T C A T $ @ * $ @ $ A * @ $ * A @ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 A T2) C C A2) T A (onda oligonucleotidic marcat cu 20P #J) &enomenul este de o specificitate deosebit pentru c o sond este capabil s recunoasc o secven unic printre milioane de alte secvene. Aai recent s"a introdus i se folosete mai frecvent hibridizarea invers care se deosebete de hibridizarea standard a acizilor nucleici prin faptul c sonda nemarcat este fi+at pe un suport solid iar acidul nucleic :int; este marcat i se afl ntr"o soluie apoas. 3$Analiza ADN +eno'ic prin 'etoda de trans.er Southern <biectivul principal al metodei descris de ?d (outhern #/C85) 1 cunoscut sub numele de (outhern blot 1 este de a evidenia, cu aDutorul unei sonde specifice prezena sau absena unui fragment de A ! omolog #:int;), obinut din A ! genomic, cu o anumit enzim de restricie. Pentru aceasta A ! e+tras din nuclei celulari este digerat cu una sau mai multe enzime de restricie, fragmentele sunt separate dup mrime prin electroforez n gel de agaroz, denaturate i apoi transferate #prin :sugere;-blotting) i imobilizate pe o membran solid de nitroceluloz, pentru a fi hibridizate cu o sond monocatenar specific, marcat radioactiv. (onda se va fi+a numai pe secvena
9

omoloag de A ! #dac este prezent) iar poziia ei pe membran va permite evaluarea mrimii sale. *ehnica (outern 1blott are urmtoarele etape, e&tra+erea de ADN +eno'ic cu greutate molecular mare dintr"o surs accesibil. di+estia 4.ra+'entarea5 ADN +eno'ic, prin clivarea cu diferite enzime de restricie, fiecare producnd fragmente de lungime diferit. aceasta presupune cunoaterea prealabil a hrii situsurilor de restriie pentru domeniul genomic e+plorat i alegerea celui mai adecvat cuplu enzim de restricie"sond. separarea .ra+'entelor, pe baza mrimii lor prin electroforez n gel de agaroz, n care fragmentele mai mici migreaz mai repede dect cele mai mari. pentru separarea fragmentelor mai mari de A ! #3H >b K0"2 Ab) se folosete electroforeza n cmp pulsatil. denaturarea #n mediu alcalin) a fragmentelor bicatenare, pentru separarea celor dou monocatene complementare. trans.erarea moleculelor de A ! monocatenar de pe gelul de agaroz fragil pe un suport solid #filtru din nitroceluloz sau na9lon), prin capilaritate sau sugere #:blotting;). de aici deriv i numele metodei :(outhern blot; sau :(outhern transfer;. fragmentele monocatenare de A ! vor fi imobilizate pe membrane n poziia I care s"au gsit, dup migrare, n gel. hi*ridizarea fragmentelor de A ! de pe filtru cu o sond monocatenar specific unei gene sau a unui mar>er genotipic, marcat radioactiv. sonda se va mperechea-asocia numai cu secvena complementar dintr"unul sau dou fragmente de A ! genomic. splarea,asocierea format din fragmentul de A ! i sond este puternic fi+at pe filtru i deci rezintent la o splare intens #care ndeprteaz frgamentele nehibridate de pe filtru).
10

 punerea 6n e iden! 4autoradio+ra.ia5 pentru vizualizarea hibrizilor A ! cercetat- A ! sond. Analiza poate determina prezena sau lipsa unor situsuri de restricie caracteristice genei analizate care se asociaz cu anumite mutaii. Astfel se pot identifica dou tipuri de mutaii, d. deleii sau inserii genice de mai mult de 5H"/HHpb, detectate prin modificarea lungimii fragmentelor realizate de enzima de restricie. dac deleia este total atunci gena dispare i sonda nu d nici un semnal e. mutaii punctiforme, ce afecteaz o singur baz i creaz sau distrug un situs de restricie intragenic pentru o anumit enzim, antrennd o modificare a lungimii fragmentelor de restricie.

?+tagerea A !

%estricia A !

?letroforeza A!

enaturara i trasferul A ! pe membrane

7ibridarea cu sond

Autoradiografia

vizualizarea i interpretarea rezultatelor

11

$u toate c rezultatele obinute prin aceasta tehnic par reduse ca informaie #semnal prezent sau absent. situs prezent sau absent) analiza genotipic cu aceast tehnic are o valoare practic, deoarece permite diagnosticul prenatal sau presimptomatic al unor mutaii genice morbide, precum i identificarea heterozigoilor. *ehnica (outhern nu permite evidenierea unor modificri mici din structura A ! #microdeleii, mutaii punctiforme ale unui pb). Bn aceste cazuri, sonda A ! nu va putea face distincie ntre gena normal i gena cu alterri minime ale secvenei nucleotidice. *ehnica (outhern are i unele dezavantaDe, este laborioas, comple+, costisitoare i prezint numeroase dificulti de interpretare. 7$Analiza ARN' prin tehnica Northern *lot !orthern blot este o variant a metodei (othern blot n care acidul nucleic int este A%!m. Aceast metod const n transferul moleculelor denaturate de A%! pe filtru de na9lon sau nitroceluloz, urmat de hibridarea cu sonde marcate. A%!m e+tras i purificat nu este supus scindrii cu enzime iar electroforeza decurge n condiii de denaturare. Aceast tehnic permite identificarea transcripilor genelor analizate i stabilirea lungimii lor. Punerea n eviden a unui anumit A%!m se bazeaz pe hibridarea molecular a A%! cu o sond complementar #A !c denaturant. oligonucleotide A ! antisens). Aoleculele de A%!m, de diferite lungimi #n funcie de gena transcris), sunt separate prin electroforez n gel de agaroz denaturant #care suprim structura secundar ce ar Dena migrarea i hibridizarea). Apoi ele sunt transferate pe un filtru de nitroceluloz i hibridate cu o sond de A ! marcat. Pe autoradiagram se observ una sau mai multe benzi a cror lungime, numr i intensiate sunt indicaii preioase. Absena unei benzi ce ar fi trebuit evideniat de sond indic faptul c gena nu este e+primat-transcris datorit unei mutaii. ?+istena unei mutaii #de e+emplu o deleie), poate fi relevat printr"un fragment de A%!m cu o lungime anormal.
12

Analiza A%!m este mult mai delicat i mai dificil dect cea a A ! deoarece, " A%! este foarte vulnerabil la A%!"azele citoplasmatice. " numeroase tipuri au o e+presie celular variabil n funcie de diferenierea celular #de e+emplu, A%!m pentru fenilalanin" hidro+ilaz nu este prezent dect n hepatocite, iar cel pentru tiroglobulin numai n celulele tiroidiene). " A%!m se gsete n cantiti foarte mici.

?+tragerea A%!

?lecroforeza A%!

*ransferul A%! pe membrane

7ibridarea cu sond

Autoradiografia

Fizualizarea i interpretarea rezultatelor

13

Analiza cu sonde oli+onucleotidice speci.ice unei alele 4ASO5 Bn aceast metod, o soluie apoas de A ! genomic nefracionat este depus sub forma unei pete pe o membran de nitroceluloz #dot" blot) sau indirect printr"o fant #slot"blot). pictura este uscat i A ! imobilizat pe o membran, este denaturant #prin tratarea filtrului cu o soluie de alcali) i e+pus la o soluie ce conine sond monocatenar marcat, aceasta se va hibridiza, formndu"se heteroduple+ul int"sond ce va fi pus n eviden prin autoradiografie. Aceast metod este mai simpl i mai rapid dect tehnica (outhern"blot #nu necesit fracionarea A !), folosete sonde ce corespund unei secvene mici #0Hpb) din structura genei, sonde numite sonde oligonucleotidice specifice #A(< de la :Alele (pecific <ligonucleotides;). Aceste sonde scurte sunt mai :sensibile; la alterrile minime ale secvenei genice, putnd depista modificri ale unei singure perechi de baze, ele fiid folosite pentru depistarea unor mutaii specifice, cunoscute deDa ntr"o boal genetic. (e poate stabili dac acea mutaie este prezent sau absent ntr"o prob de A !. Analiza A(< este util numai n cazurile n care e+ist o mare probabilitate #bazat pe alte date) ca o familie sau un individ s posede o mutaie cunoscut. eci, tehnica este aplicabil, n special, pentru boli genetice caracterizate printr"un numr mic de mutaii, precis definite #de e+emplu , hemocromatoz, drepanocitoz). 8$%etoda de trans.er 9estern(*lot Aceasta metod const n identificarea unei proteine specifice din amestecul de proteine celulare. Pentru aceasta, proteinele sunt separate , pe baza lungimii lor #a mrimii), prin electroforeza n condiii de denaturare n prezena de ( ( # odecil (ulfat de (odiu). Proteinele fracionate dup greutatea molecular sunt transferate pe filtre de nitroceluloza sau na9lon i sunt supuse apoi tratrii cu anticorpi specifici marcai radioactiv sau fluorescent. Aetoda 4estern permite diferenierea ntre bolnavii cu forme grave de boal #prin absena total a proteinei) i forme medii #cantiti
14

mici de protein). Pot evidenia heterozigoii, purttorii sntoi de gen mutant care vor avea o cantitate mai redus #la Dumtate) de protein normal comparativ cu homozigoii sntoi. :$Tehnica -CR 6n analiza +enelor *ehnica P$% poate fi utilizat pentru multiplicarea selectiv a unei secvene dintr"o gen. $a rezultat, se obin populaii omogene de fragmente care pot fi utilizate n studiile n genetica molecular sau diagnostic. Pentru a realiza amplificarea unei secvene este necesar cunoaterea structurii genei normale sau mutante i sinteza primerilor specifici complementari capetelor fragmentului de interes. Primerii reprezint secvene oligonucleotidice monocatenare de 0H"2H baze care sunt obinute prin sinteza artificial. P$% se bazeaz pe hibridarea A ! cercetat 1 primer i replicarea semiconservativ a A !. %eacia de polimerizare n lan #P$% 1 Polimerase $hain %eaction) reprezint tehnica de amplificare in vitro a secvenelor de A ! amplificnd fenomenul de hibridare A ! i proprietatea de replicare semiconservativ. 7ibridarea se produce dup recunoaterea specific a unor fragmente nucleotidice de pe o caten a A ! 1ului de interes, de ctre nite secvene scurte de A !, numite primeri. Acetia iniiaz sinteza catenelor complementare de A ! care se realizeaz cu o A !" polimeraz termorezistent #*aL"polimeraz). AvantaDele tehnicii P$% sunt urmtoarele, " suficiena cantitilor mici de A !. " rapiditatea ei #n cteva ore se obin milioane de copii de A !). " specificitatea primerilor permite amplificarea selectiv a A !. " produsele de amplificare pot fi utilizate n calitate de sonde pentru hibridri n alte tehnici. Aplicaiile practice ale tehnicii P$%, " detectarea mutaiilor cunoscute la bolnavi i la purttori. " diagnosticul prenatal i presimptomatic al bolilor ereditare.
15

" determinarea genelor i predispoziiei la bolile comune #coronaropatii, boala hipertonic, tulburri psihice, etc.). " diagnosticul precoce i evaluarea pronosticului bolilor canceroase. " determinarea prenatal a se+ului. " identificarea agenilor patogeni #virui, bacterii). " dactiloscopia genomic #identificarea persoanelor). " analiza filiaiei #paternitate, maternitate). " tipizarea 7'A. ;$0i*ridizarea in situ a ADN Analiza A ! se poate face i prin hibridizare in situ, aceasta reprezint o tehnic molecular n care o sond specific marcat poate identifica direct pe preparatele celulare, " un A%!m ntr"o celul particular sau esut. " o gen pe un anumit cromozom sau fragment de cromozom. " numrul moleculelor de A%!m independent de perioada ontogenetic sau tip tisular. " A ! viral. " deleii cromozomiale submicroscopice. " genele responsabile de producerea cancerului, localizarea i nivelul lor de e+presie. Analiza prin hibridizare in situ se face pe preparate cromosomice n prometafaz folosind sonde marcate #radioactive sau cu molecule fluorescente 1 tehnica &I(7) Dudicious alese, n funcie de obiectivul urmrit. ac se banuiete o microdeleie pentru o anumit regiune cromosomic, la limita vizibilitii microscopice se utilizeaz o sond marcat corespunztor genelor din regiunea respectiv. absena semnalului corespunztor sondei traduce deleia regiunii. ac se urmrete localizarea unei gene se folosete o sond de tip A !c pentru o gen analoag identificat deDa la un animal de laborator. 7ibrididizarea in situ se folosete i pentru evidenierea A%! n seciuni histologice folosind o sond de A%!, marcat #robosond), complementar unui A%!m.
16

*ehnica &I7 Analiza structurii genelor normale sau anormale trebuie completat adeseori cu studiul funciei sau e+presiei acestor gene la nivel de protein. Bn cazul mutaiilor genice este important de stabilit defectul molecular al proteinelor codificate i modul n care ele produc un fenotip anormal. <$Tehnica R=L- 4Restriction =ra+'ent Len+th -ol>'rphis'5 Aceast tehnic se bazeaz pe proprietile de hibridare care e+ist ntre cele dou fragmente de A !, prezentnd un nalt grad de omologie #%&'P"bazat pe hibridare) i tehnica P$% 1 denumit P$%"%&'P, n care se evideniaz polimorfismele e+istente la nivelul situsurilor enzimelor de restricie. a."e#nica $%&' (azat pe #i(ridare cu o sond, implic parcurgerea urmtoarelor etape, e+tracia A ! din organismele ce urmeaz a fi analizate. digestia A ! cu aDutorul enzimelor de restricie.
17

 separarea fragentelor obinute n urma digestiei, n funcie de mrimea lor,prin electroforeza n gel de agaroz. transferul A ! sub form denaturat pe o membran de n9lon #(outhern blotting) n care poziia relativ a diferitelor fragmente de A ! din gel se pstreaz pe parcursul transferului. hibridarea A ! cu sonda marcat n prealabil, n regiunile n care prezint omologie. vizualizarea regiunilor hibridate cu aDutorul unui film sensibil la radiaii #autoradiografie) sau cu aDutorul unei reacii enzimatice, care d o coloraie specific. Bn tehnica %&'P pot fi utilizate diferite tipuri de sonde, care permit evidenierea unor tipuri diferite de polimorfism, " sonde 'ono( sau oli+o+enice care evideniaz unul sau mai muli loci, ele dau un profil simplu care include cteva benzi. Etilizarea acestora permite vizualizarea polimorfismelor de inserie-deleie, situate n situsurile de restricie. " sondele poli+enice sau 'ultilocus pot fi diriDate spre zonele care prezint variabilitate foarte mare, cum ar fi secvenele de tip micro i minisatelit, alctuite din 0 pn la/6 perechi de baze, repetate n tandem. $u aDutorul sondelor multilocus, se observ, n general un grad ridicat de polimorfism ntre genotipurile nrudite. Aceste sonde permit evidenierea polimorfismului de secven la nivelul situsurilor de restricie, polimorfismului de inserie-deleie precum i a polimorfismului determinat de numrul unitilor respective, pentru fiecare individ n parte. b."e#nica $%&' (azat pe ')$, utilizeaz enzime de restricie pentru digerarea unui produs de amplificare, obinut cu primeri specifici, iar n gelul de agaroz se vor obine benzi de dimensiuni diferite, corespunztoare celor trei genotipuri #homozigoi pe una din cele doua alele i heterozigoi). Aar>erii %&'P sunt mar>eri cu polimorfism limitat ce identific variaiile secvenei de A ! la nivelul unui situs de restricie, prin
18

analiza %&'P. < surs abundent de mar>eri genetici, utilizai n tehnicile de cartare a genomului animal au la baz modificrile unor secvene de A ! care se produc la nivelul situsurilor de restricie. e regul aceste variaii sunt cauzate de mutaii punctiforme, inserii sau deleii, n interiorul situsurilor de restricie i astfel, enzima de restricie, nu mai recunoate situsul respective i nu mai taie. Aceasta va determina obinerea unor fragmente de restricie de lungimi diferite #polimorfice) care pot fi uor vizualizate i identificate n gelul de agaroz datorit lungimii lor diferite. in aceast cauz ele se vor separa pe gelul de electroforez sub forma unor benzi situate n diferite regiuni. $u aDutorul tehnicii %&'P se pot identifica variaiile dintre indivizi doar la nivelul situsurilor de recunoatere a enzimelor de restricie, respective dintre indivizii care posed unul din cele trei genotipuri e+istente n locusul de interes #AA, Aa, aa) i nu se pot detecta variaiile la nivelul ntregului genom, care la mamifere este de ordinul de 2+ /HCpb.

19

/i*lio+ra.ie /. I. $emortan, (. $apcelea, '. *aranov, . Amoaii"$urs de Giologie Aolecular, E(A& :!I$<'A? *?(*?AI*A!E; , $hiinau, 0HHH. 0. Gernard %. @lic>, Mac> M. Pasterna>, $her9l '. Patten" Aolecular Giotechnolog9"Principles and Applications of %ecombinant !A, 4ashington $. 3. http,--NNN.scribd.com-doc-3O0O0826-@enetica"medicinala 4. http,--NNN.mansfield.ohio"state.edu-Psabedon-campbl0H.htm 5. http,--science.hoNstuffNor>s.com-dna"profiling/.htm

20