RECEPTORI NUCLEARI ORFANI

STUDENTI: ANTINIEA IOANA LOREDANA OMUORU DIANA U N G U R E A N U T E FA N I A FA C U LT AT E A D E B I O L O G I E MASTER ANUL II GENETIC MOLECULAR

CUPRINS:
1. Generaliti 2. Structura i domeniul funcional al receptorilor nucleari 2.1. Clasificare 2.2. Activarea receptorilor nucleari 2.3. Dimerizarea RXR i raspunsul heterodimerilor la liganzii RXR 3. Receptorii nucleari orfani 3.1. Receptorii orfani care heterodimerizeaza cu RXR 3.2. Receptorii orfani care se leag ca homodimeri 3.3. Receptorii orfani care se leag ca monomeri 3.4. Receptorii nucleari atipici 4. Ci de semnalizare hormonale 5. Concluzii

Generaliti- receptori nucleari

Receptorii nucleari sunt o clas de proteine intracelulare responsabile

de detectarea hormonilor steroizi i tiroidieni precum i al altor molecule.

Receptorii nucleari sunt clasificai drept factori de transcripie

O proprietate unic a receptorilor nucleari este capacitatea acestora de a

interactiona direct cu ADN-ul i de a controla expresia ADN-ului genomic. homeostazieie organismului adult

Joac un rol cheie att n dezvoltarea embrionar ct i n meninerea

Generaliti- receptori nucleari

Suprafamilia

receptorilor

nucleari

are

ca

pari

componente:
- Familia receptorilor nucleari hormonali (NHR) - Familia receptorilor orfani
NHR sunt receptori pentru care au fost identificai liganzii

hormonali, n timp ce pentru receptorii orfani, liganzii nu sunt cunoscuti

Suprafamilia receptorilor nucleari

Structura i domeniul funcional al NR

Regiune A/B, domeniul de reglare N-terminal

secven i mrimea cea mai variabil, include funcia de activare a transcripie AF-1 care activeaz genele int prin interacia cu componente ale mecanismului transcripional
Cu AF-1 depinde de tipul celular i de

promotor
Lipirea are de obicei loc n aceast

regiune

Regiune A/B, domeniul de reglare N-terminal

Acest domeniu este responsabil pentru

aciunea specific-celular a receptorilor nucleari

Aceast regiune poate fi fosforilat de

diferite kinaze implicate n transducia semnalului (MAPK, kinaza ciclindependenta), care regleaz activitatea receptorilor.

Regiunea C- Domeniul de legare a ADN-ului

Domeniul cel mai conservat, confer

capacitatea de a recunoate secvena int specific i de a activa genele

Conine

dou componente zinc finger, divizate de fragmente de 6070 aminoacizi n fiecare zinc finger, patru cisteine coordoneaz un ion de zinc.
Secvena de la baza primului zinc

finger (P box) recunoaste ADN-ul, intruct secvena de la baza celui deal doilea zinc finger(D box), este implicat n dimerizarea receptorilor

Regiunea principal - domeniul D

Este

un domeniu cu o conservare moderat, are rolul de a lega DLA (domeniul de legare a ADN-ului) i DLL (domeniul pentru legarea ligandului), permite schimbarea conformaei receptorului (rotirea DLA).
Adeseori

include localizare nuclear

un

semnal

de

Mutaiile din aceast regiune anuleaz

interactiunea cu corepresorul receptorului nuclear.

Regiunea E- Domeniul de legare a ligandului (LBD)

Leag liganzii i mediaz homo i

heterorodimerizarea i interactioneaz cu proteinele heat shock.

Regiunea este alcatuit din 12 regiuni

- elicoidale. A 12-a regiune conine domeniul AF-2 (funcia de activare-2), responsabil pentru transactivarea dependenta de ligand.
Acest domeniu include deasemenea i

alte secvene necesare pentru transactivare, dispersate n receptorul de repaus dar localizate aproape una de cealalt dup legarea ligandului.

Activarea receptorilor nucleari

Activarea receptorilor nucleari

Dimerizarea RXR i rspunsul heterodimerilor la liganzii RXR

Receptorii

X retinoidic (RXR) se comport ca un partener heterodimer esenial pentru muli dintre receptorii nucleari incluznd i receptorii orfani.
Membrii non-steroizi ai receptorilor nucleari i cei care au liganzi sunt

toi heterodimeri cu RXR (de ex.: receptorul vitaminei D (VDR), receptorul tiroid (RT), receptorul acidului retinoic (RAR) )
Atunci cnd RXR formeaz heterodimeri cu receptorii orfani, este

responsabil de ligandul acestuia chiar i n absena liganzilor partenerului su.

Acesti heterodimeri (de ex.: RXR-RXF (receptorul X din ficat) ) sunt

liganzi sensibili la RXR, iar RXR este activ sau tolerant.

Dimerizarea RXR i rspunsul heterodimerilor la liganzii RXR

Capacitatea heterodimerilor RXR de a rspunde la liganzii

specifici RXR este dependent n primul rnd de partenerul su specific.

Heterodimerizarea cu RXR poate duce la proprietatea

complexului RXR-receptor orfan de a rspunde la liganzii specificii RXR-ului.

In plus fa de a fi un partener heterodimer obligat pentru

muli dintre receptorii orfani, RXR are un rol critic n generarea diversitii rspunsurilor hormonale.

Receptorii nucleari orfani

Receptorii orfani nu prezint vreun ligand cunoscut

endogen sau exogen, spre ex.:SPH (Small Heterodimer Partner) poate interaciona cu RXR hormonii tiroidieni inhibndu-le funcia transactivatoare.
Receptorii

nucleari orfani au un comportament asemntor unor proteine virale sau celulare, care prin oligomerizare, blocheaz funcia unor proteine cu rol n proliferarea celular.

Receptorii nucleari orfani

Aceti receptori se gsesc n 2 familii:

- Familia proteinelor G - Familia receptorilor nucleari

Recent a aprut terminologia receptorilor orfani adoptai. Acetia au fost

iniial descrisi ca orfani dar mai apoi liganzii lor au fost identificai. De exemplu: receptorii pentru acizii grai ai colesterolului.

Receptori orfani care heteromizeaz cu RXR CAR constitutive androstane receptor

o protein care la om este codificat de gena RN1I3 (subfamilia receptorilor nucleari 1, grupa I, membrul 3).
Este Exprimat cel mai abundent la nivelul

ficatului i al intestinului
Proteina heterodimerizeaz

cu RXR (receptorul X ritinoidic) i regleaz transcripia genelor int implicate n metabolizarea medicamentelor i curirea bilirubinei.

Model conceptual pentru starea activ-inactiv a CAR . ApoCAR (n verde) arat interaciunea C-terminal K205 care stabilizeaz AF-2 in conformaia activ. Legarea la androstenol duce la o miscare a helixului H11 ctre locul de legare generat la nodului H10-H11 i disocierea H12 din protein .

Receptori orfani care heteromizeaz cu RXR FXR farnesoid X receptor

FXR farnesoid X receptor-cunoscut

i sub denumirea de acidului biliar (RAB)

receptorul

FXR farnesoid X receptor- receptor

nuclear codificat de gena RN1H4 (subfamilia receptorilor nucleari 1, grupa H, membrul4)

FXR este exprimat la un nivel nalt

n ficat i intestine
Are ca i liganzi naturali acidul
FXR regleaz un numr mare de gene int implicate n metabolismul acidului biliar, lipoproteinelor i a glucozei. FXR se leag la ADN mpreun cu RXR ca heterodimer sau ca monomer reglnd expresia unor gene variate.

chenodeoxicolic i ali acizi biliari

Receptori orfani care heteromizeaz cu RXR FXR farnesoid X receptor

Receptorul X farnesol (RXF) formeaz

un heterodimer cu RXR i se leag la elementul de rspuns (FXRE) al lui FXR, care de obicei este o repetiie invers distanat de o nucleotid, IR1(inverted repeat DNA element with nucleotid spacing), n genele sale int pentru a induce expresia genei.

Receptori orfani care heteromizeaza cu RXR LXR liver X receptor

LXR (liver X receptor) sunt reglatori importani ai colesterolului, ai acizilor grai i a

homeostaziei glucozei.
Acest receptor a fost adoptat dup descoperirea oxisterolilor ca liganzi endogeni ai

acestuia.
Prezint 2 izomorfi: LXR LXR Distribuia acestora n esuturi difer:

- LXR este exprimat n ficat, rinichi, intestin, esut gras, plmni i splin - LXR este exprimat n aproape toate esuturile i organele

Receptori orfani care heteromizeaz cu RXR LXR liver X receptor

Receptorul X al ficatului (LXR) formeaz un heterodimer obligat cu receptorul X retinoidic (RXR 9cis-acid retinoic) care se fixeaz la DR4 (direct repeat sequences de 4 nucleotide) LXRE (element de raspuns al LXR) n regiunile de reglare ale genelor int, astfel reprimnd expresia genelor. n urma legrii ligandului de LXR sau RXR, conformaia heterodimerului se modific, ceea ce conduce la eliberarea de corepresori i la recrutarea de co-activatori. Acest lucru duce la transcripia genelor int

Receptori orfani care heteromizeaz cu RXR PXR pregnane X receptor

Este o protein care este codificat de ctre gena NR1KI2. Este exprimat la un nivel nalt n ficat i intestin, iar ntr-o proporie mai mic n rinichi i stomac Cunoscut pentru senisbiliatea sa n detectarea steroizilor i al medicamentelor (SXR- steroid and xenobiotic receptor) Funcia sa primar este de a detecta prezena substanelor toxice i ca rspuns activeaz expresia proteinelor implicate n detoxifierea i n nlturarea acestor substane din organism.

Proteina codificat este un reglator al transcripiei genei citocrom P450 3A4 ( pe scurt CYP3A4 ), care se leag la elementul de rspuns al promotorului CYP3A4 ca un heterodimer cu RXR
Formeaz un heterodimer- obligat cu RXR

PXR este un factor de transcripie care regleaz expresia genei CYP3A (n galben), din ficat i intestin. mpreuna cu RXR actioneaz ca un heterodimer. Medicamentul A se leag la PXR i induce expresia enzimei CYP3A (roz) accelernd metabolismul medicamentului B care este un substrat pentru CYP3A4.

Receptori orfani care se leag ca homodimeri GCNF- germ cell nuclear factor
Este o protein codificat de gena NR6A1. n absena ligandului acesta este un represor al transcripiei. n timpul dezvoltrii embrionare acesta este exprimat ntre stadiul de gastrul i etapa

neural. Este un factor critic pentru dezvoltarea embrionar

Lipsa acestuia duce la moartea embrionului La aduli

exprimat n principal la nivelul celulelor germinale ale gonadelor i este implicat n reglarea embriogenezei i n diferentierea celulelor germinale
GNFC se leag preferential la ADN ca un homodimer la elementele DR0 (direct repeat

sequences 0) iar n absena unui presuspus ligand reprim transcripia.

Rolul fiziologic potenial n gametogeneza a acestuia este n prezent necunoscut.

Receptori orfani care se leag ca homodimeri GCNF- germ cell nuclear factor

n absena ligandului, GNFC reprim transcripia genelor, aceast funcie de reprimare fiind mediat de interaciunea cu N-CoR co-represor. Represiunea poate afecta att funciile transcripionale ct i cele de amplificare. Ligandul putativ se poate lega la domeniul de legare al ligandului (DLL) cauznd disocierea co-represorului i pierderea represiunii.

Receptori orfani care se leag ca homodimeri HNF-4 hepatocyte nuclear factor

Factorul nuclear hepatocitic 4 este o protein exprimat n ficat, rinichi, intestin i

n celulele pancreatice
La organismul uman exist dou izomorfe ale sale: si codificate de dou gene

separate HNF4A si HNF4G.

Aceasta controleaz genele implicate n metabolismul glucozei, a colesterolului i a

acizilor grai, metabolismul aminoacizilor precum i n dezvoltarea i diferenierea celulelor hepatice.

Studiile arat c pierderea HNF-4 funcional conduce la deficiente de expresie a

mai multor gene implicate n transportul i metabolismul glucozei

Regleaz transcripia factorului de transcripie HNF1A (OMIM 142410) care este

gen cauzatoare a MODY3 (maturity-onset diabetes of the young)

Receptori orfani care se leag ca monodimeri ERR , - estrogen-related receptor and

ERR acioneaz ca factori de transcripie activai de estrogen (17-estradiol/E2). n

absena estrogenului , acetia nu se leag la ADN

ERR i leag E2 cu afinitate mare i au afiniti similare pentru legarea de elementele

de rspuns la estrogen
ERR inhib proliferarea celular hormon-dependent n timp ce ERR inhib

proliferarea celular hormon-independent. Acetia au localizare diferit pe cromozomul 6q subbanda 25.1 respectiv pe cromozomul 14
ERR este capabil s activeze transcripia elementului de rspuns care conin promotori

independent de ligand
ERR are o ditribuie larg n esuturi dar cea mai nalt exprimare o are n esuturile

care folosesc acizii grai ca surs de energie: rinichi, inim, cerebel, intestin i muchi scheletici. A fost detectat i n esuturile cortexului suprarenalei, n care exprimarea sa este posibil legat de dezvoltarea suprarenalei cu un rol posibil n funcionarea suprarenalei fetale.

Receptori orfani care se leag ca monodimeri ERR , - estrogen-related receptor and

Activarea implic difuzia estrogenului n celula int i legarea de receptor n citoplasma sau nucleu Legarea estrogenului de receptor prin inelul aromatic determin desprinderea acestuia de Hsp (proteina heat shock) i induce schimbarea conformatiei ceea ce faciliteaz dimerizarea, translocarea nucleara i legarea complexului format de elementele ADN specifice Ca urmare se produce reglarea transcripiei genelor prin interaciunea cu proteine coreglatoare Activarea receptorilor este influenat de fosforilare

Calea clasic de aciune a receptorului pentru estrogen n celul

Receptori orfani care se leag ca monodimeri SF-1 steroidogenic factor

Factorul steroidogenic SF-1 controleaz dezvoltarea sexuala n embrion i la pubertate Este codificat de gena NR5A1 Regleaz reproducerea , prin reglarea transcripiei genelor cheie implicate n dezvoltarea sexual i n reproducere Are ca obiective gene din axa hipotamamo- hipofizo-gonadal, precum i multe din genele implicate steroidogeneza gonadala i suprarenalelor. Mutaiile la nivelul genei NR5A1 pot duce la apariia organele genitale intersexuale, la lipsa pubertii i la infertilitate

Receptori orfani care se leag ca monodimeri NGFI-B nerve growth factor induced gene B
Este o protein codificat de gena NR4A1 Este exprimat n numeroase esuturi: timus, suprarenala i hipofiz, la aduli n celulele cerebrale Se crede ca este implicat n diferenierea i funcionarea neural Este implicat n medierea ciclului celular, inflamare i apoptoz

Are un rol cheie n medierea rspunsului imun iar n plus localizarea intracelular joac rol n supravieuirea celular i n programarea morii celulare

Receptori nucleari atipici DAX-1 dosage-sensitive sex reversal-adrenal hypoplasia congenita critical region on the X chromosome

Este codificat de gena NR0B1, gen localizat pe braul scurt (p) al cromozomului X Aceast gen codific o protein creia i lipsete domeniul de legare al ADNului Proteina codificat acioneaza ca un reglator dominant-negativ al transcripiei al altor receptori nucleari inclusiv pentru FS-1 (factorul steroidogenic)

Joac un rol importanat n dezvoltarea multor tipuri de esuturi: glandele suprarenale, pituitar i hipotalamus Joac un rol importanat n dezvoltarea multor tipuri de esuturi: glandele suprarenale, pituitar i hipotalamus Controleaz activitatea anumitor gene din celule care formeaz esutul n timpul dezvoltrii embrionare.

Receptori nucleari atipici SPH small heterodimer partner

Este o protein codificat de gena NR0B2 Este diferit de ceilali receptori deoarece nu are domeniul de legare de ADN (DLA) Este clasificat ca i receptor datorit omologiei sale cu ali receptori nucleari (DAX-1) prin aceea c are o dimerizare putativ i domeniu de legare de ligand. Rolul su principal pare a fi reprimarea altor receptori nucleari prin asociere pentru a produce heterodimeri neproductivi Interactioneaz cu receptorii hormonilor retinoizi i tiroidieni inhibnd activarea transcripiei ligand-dependent a acestora Pare s actioneze ca un reglator negativ al cilor de semnalizare receptor-dependente

FXR / RIP14: Cile de semnalizare ale farnesoidului i a retinoidului

FXR (receptorul x farnesoid) poate juca un rol n semnalizarea retinoid, acionnd ca

un nou receptor al acidului retinoic.

Activarea FXR de ctre farnesol, (izopren intermediar n aceast cale), a fost primul

exemplu de receptor reglat de metaboliii intracelulari, sugernd existena unui sistem de semnalizare potenial nou la vertebrate.
Agonistul RAR sintetic (TTNPB) este de asemenea un activator, dei ambii compui

activeaz la concentraii suprafiziologice i ntr-un mod dependent de timp, sugernd c un metabolit retinoid sau un nou terpenoid poate fi un ligand pentru FXR RIP14.

LXR si SF-1: Cile de semnalizare ale oxisterolului

LXR (receptorul x din ficat) are doua izoforme: si , care se leag n regiunea promotor a genelor int i formeaz heterodimeri cu receptorul retinoid X (RXR). LXR este activat de ctre o clas specific de oxisteroli: 22 (R) hidroxicolesterol (OHC), 24(S) OHC si 24, 25(S)- epoxicolesterol, care acioneaz ca intermediari n cile de producere a acidului biliar i n biosinteza hormonului steroid.

Activarea LXR de ctre aceste molecule duce la inducerea genei sale int CYP7a, care codific rata - limitarea enzimei n producia de acizi biliari. Prin urmare, LXR joac un rol important n conversia colesterolului n acizi biliari.
Activarea LXR normalizeaz glicemia i sensibilitatea la insulin, mbunteste rezulatatele n diabetul zaharat tip 2 i ofer rezisten la insulin

LXR si SF-1: Cile de semnalizare ale oxisterolului

SF-1 (factorul steroidogenic 1) este un receptor orfan exprimat n esuturile steroidogene,cu un rol esenial n reglarea biosintezei hormonilor steroizi i n metabolismul colesterolului , acionnd n multiple puncte de control a cii steroidogene.

Promotorii genei specifice StAR (proteina reglatoare acut steroidogenic), ale cror produse actioneaz n etapele critice ale metabolismulului colesterolului, sunt activai de ctre oxisterolii 25 -, 26 -, i 27 - (OHC) prin intermediul SF-1. Activarea SF-1 prin oxisteroli amplific transcrierea genei int SF-1 i "blocarea" celulei ntr-un mod steroidogenic, acionnd ca "senzori" i controlnd etape cruciale n cile metabolice cheie.
Aceste rezultate sugereaz un mecanism nou pentru o steroidogenez crescut.

PXRSXR: Ci de semnalizare a steroidelor i xenobioticelor

Activitatea murin PXR (mPXR) este modulat de un numar de steroizi naturali i sintetici, inclusiv pregnani naturali. Unii dintre aceti steroizi, numii steroizi catatoxici, sunt cunoscui pentru capacitatea lor de a induce expresia genelor citocromului P450, care confer protecie nespecific sau rezistena fa de o serie de medicamente i compui xenobiotici. Pe lang activarea genei CYP450, influenteaz homeostazia colesterolului prin reglementarea biosintezei, depozitarea i secreia acestuia. Activarea mPXR prin aceti steroizi poate duce la eliberarea lor n ficat prin aciunea CYP3A1, o gen int mPXR.

PXRSXR: Ci de semnalizare a steroidelor i xenobioticelor

PXR-ul uman (hPXR) sau SXR este, de asemenea, activat de un numr mare de steroizi agonisti i antagonisti (estrogen i tamoxifen), de medicamente (rifampicina i nifedipina), compui xenobiotici i compui alimentari bioactivi (fitoestrogeni). Muli dintre aceti compui induc catabolismul enzimelor CYP450, inclusiv CYP3A4, care metabolizeaz un numar de steroizi i xenobiotice, inclusiv 60% din medicamentele relevante clinic la om.

Rifampicina este implicat n interaciunile medicamentoase prin inducerea CYP3A4 i modificarea metabolismului altor medicamente. Administrarea pe termen lung de rifampicina la pacienii cu tuberculoz duce la eliberarea crescut de steroizi. Aceasta poate n unele cazuri duce diagnosticarea greit a sindromului Cushing, din cauza unei creteri de steroizi la nivel urinar.

PXRSXR: Ci de semnalizare a steroidelor i xenobioticelor

Eliminarea de hormoni steroizi este important n meninerea homeostaziei hormonale, unde ligand-ul poate fi eliminat din snge la nivelul ficatului, dup medierea efectului sau asupra esuturilor int cu ajutorul receptorilor specifici. Astfel, PXR - SXR este un nou senzor steroid i xenobiotic care actioneaz ca un receptor cu o larg specificitate implicat n eliminarea i detoxifierea unui numar de natural de compui bioactivi ingerai.

Reprezentarea schematic a mecanismelor prin care cafestolul crete nivelul de colesterol in vivo, prin PXR i FXR
1) Cafestolul este consumat sub form de cafea nefiltrat, trece n stomac i apoi n intestinul subire.
2) n intestin, cafestolul activeaz PXR i FXR. La activarea PXR, cafestol induce expresia genei Cyp27A1 i ABCA1, ducnd la o cretere a efluxului de colesterol n circulaie. Cafestol induce i expresia genelor Cyp3A11 i GST1 , conducand la o cretere n detoxifiere. Cafestolul actoneaz prin intermediul att FXR i PXR prin inducerea genei FGF15, care semnaleaz reprimarea sintezei acizilor biliari. 3) n ficat, Cyp7A1, Cyp8B1, i expresia NTCP este reprimat prin FXR, reducnd astfel sinteza acizilor biliari. Reglementarea direct a genelor int de ctre FXR i PXR n intestin combinat cu efectele indirecte la nivelul ficatului, contribuie la efectul de cretere al colesterolului la om.

CAR: Calea de semnalizare a androstanului

CAR este un receptor steroid nou care particip la dezactivarea ligand-

dependent, ca rspuns la steroizi.

Prezint activitate semnificativ atunci cnd este combinat cu RXR, dar ca rspuns la metaboliii androstan, androstenol i androstanol aceast activitate este oprit. Aceti liganzi exist n mod natural i functioneaz ca agoniti inveri datorit capacitaii lor de a inversa activarea transcripionala efectuat de receptori nucleari. Prin urmare, CAR definete o cale de semnalizare a androstanului, care functioneaz ntr-o manier opus cii convenionale de semnalizare a receptorilor nucleari.

Receptorul PPAR

Membrii subfamiliei PPAR formeaz heterodimeri cu RXR. Exist trei subtipuri PPAR menionai ca PPAR , , i .

Aceti receptori difer n distribuia lor n esut, precum i n capacitatea lor relativ de a fi activai printr-o varietate de diferii liganzi. PPAR este foarte exprimat n esuturi, cum ar fi ficatul i rinichii.

Receptorul PPAR

Activarea PPAR reglementeaz transcrierea mai multor enzime cheie implicate n metabolismul acizilor grai, inclusiv oxidarea acizilor grai i enzimele bifuncionale.

Astfel, medicamente specifice PPAR precum gemfibrozil i fenofibrat funcioneaz prin reglarea metabolismului acidului gras care duce la scderea lipidelor la om.

Concluzii
Receptorii

nucleari, incluznd receptorii nucleari orfani, reprezint cea mai mare familie de factori transcripionali. Studiul asupra acestor proteine a avut un impact major asupra cunotintelor despre reglarea fiziologic i metabolic. Studii structurale prin metode diferite cum ar fi cristalografia cu raze X, au adus informaii privind mecanismul de funcionare al receptorilor orfani. De asemenea, aceste studii au condus la o cunoatere mai peofund a domeniului de legare a liganzilor, sugernd c ar fi posibil descoperirea sau crearea unor liganzi pentru receptorii orfani.

Bibliografie

Li Shan et colab, Molecular Cell, vol 16, p- 907-917, 2004 Vincent Giure, Endocrine Reviews 20(5), p-689-725, The Endocrine Society, 1999 Pierre Val, Anne-Marie Lefranois-Martinez, Georges Veyssire, Antoine Martinez, Nuclear Receptor, 2003 Constantin Muntean, Horia Lzrescu, Diana Munteanu, Rolul esterogenului n cardioprotecie, Edit. Balnear, 2011 Bruce Blumberg i Ronald M Evans, Orphan nuclear receptors- new ligands and new posibilities, Genes Dev., 1998 P. Michael Conn, Anthony R. Means, Principles of Molecular Regulation, Aumara Press, 2000 Biologia Moleculara a medicamentului, Univ. de Vest Vasile Goldies, Arad, 2009 https://biotka.mol.uj.edu.pl