PARTEA IV: DE LA LEZIUNEA TOXIC LA MOARTEA CELULAR

CAPITOLUL 21 NECROZA I APOPTOZA: MECANISME DE BAZ I RELEVANA LOR PENTRU TOXICOLOGIE 21.1. Dou t !u" #$ %o&"t$ '$(u(&": )$'"o*& + &!o!to*&
Necroza este o moarte celular accidental sau patologic care survine datorit unei agresiuni severe i brutale. Ea poate fi provocat de cauze toxice, fizice sau chimice, agenii infecioi sau situaii fiziologice extreme, cum ar fi anoxia care inhib mecanismele de aprare i adaptare celular. Necroza evolueaz n mai multe faze care sunt evideniate morfologic n figura 2 . .

, -u"& 21.1 S'.$% 'o%!&"&t / & 0$'/$)1$ %o# 2 '" (o" %o"2o(o- '$ 0!$' 2 '$ )$'"o*$ + &!o!to*$

!aza iniial este caracterizat prin asocierea modificrilor citoplasmatice i nucleare. "odificrile citoplasmatice, care sunt mai frecvente, se caracterizeaz printr#o dilatare i un edem al organitelor intracelulare$ reticulul endoplasmic i mitocondria %fig.2 .2&. 'n nucleu, cromatina se disperseaz i devine picnotic. 'n sf(rit, membrana plasmatic se deformeaz pentru a da natere la vezicule

citoplasmatice de talie din ce n ce mai mare care fuzioneaz unele cu altele. )ac modificrile acestei faze iniiale sunt nc reversibile, cele ale fazei urmtoare, care corespund morii celulare propriu zise, sunt ireversibile. Ele debuteaz prin creterea rapid a volumului celular i ruperea veziculelor citoplasmatice. *re loc o pierdere a integritii membranare, care se manifest mai ales prin dispariia gradientelor ionice transmembranare i pierderea enzimelor citosolice. )intre aceste enzime, *+*, i -)., sunt utilizate n practica clinic ca indicatori ai necrozei celulare. /rocesul necrozei celulare induce o reacie inflamatorie local, care permite degradarea i eliminarea celulelor necrozate. 0nducia acestei reacii inflamatorii contribuie de obicei la agravarea degradrilor tisulare declanate de agresiunea iniial.

, -u"& 21.2. 3$!&to' t !$ '&($ #$ )$'"o*. +e observ$ dispersia cromatinei nucleare %N&, dilataia reticulului endoplasmic %capete de sgei&, edemul mitocondriei %m&, ruptura membranei plasmatice %sget& % 21112&

+ubstanele toxice, n special medicamentele, i metaboliii reactivi pot induce moartea celular prin mai multe mecanisme dintre care menionm$ # inhibarea funcional a mitocondriilor i diminuarea produciei de *,/ ca urmare a pierderii enzimelor mitocondriale, inhibarea transporturilor ionici
2

prin peretele mitocondrial sau alterarea fizico#chimic a membranei mitocondriale3 # inducia stresului oxidativ, dup eliberarea n celul a radicalilor oxidativi produi prin metabolismul substanei toxice3 # consumul glutationului intracelular, utilizat pentru detoxifierea numeroilor ageni chimici3 # creterea concentraiei intracelulare a calciului. *desea, la aceste procese se asociaz mai multe mecanisme. 0nducia unui proces de tip necrotic sau de tip apoptotic %fig.2 . & depinde de tipul substanei toxice, de doza sa i de durata expunerii. Necroza i apoptoza sunt adesea asociate, mai ales c(nd doza substanei toxice este important i expunerea este prelungit. 4ele dou procese pot s evolueze n paralel, sau s se succead n cursul timpului, apoptoza preced(nd atunci necroza.

21.2. A!o!to*&4%o&"t$& '$(u(&" !"o-"&%&t

5 lung perioad de timp moartea celular a fost privit ca o eroare catastrofal, degenerativ, incontrolabil a homeostaziei celulare aprut ca rspuns la leziunile suferite de celul, aceast catalogare a sa, i n special lipsa controlului asupra acesteia, diminu(nd interesul tiinific pentru acest fenomen celular. 4u toate acestea, descoperirile din ultimele dou decenii care au artat c toate celulele, parte component a organismelor pluricelulare, posed capacitatea de a activa un fenomen de moarte celular programat denumit apoptoz au ridicat nivelul de interes tiinific pentru acest fenomen i, au avut drept consecin, reconsiderarea i reevaluarea tuturor domeniilor cuprinse n biologie incluz(nd imunologia, carcinogeneza, i mai nou, toxicologia. ,oxicologii au evideniat, nc de acum muli ani c, celulele pot fi 6 ucise7 de ctre o larg varietate de substane toxice ori condiii patologice. 'n general atunci c(nd toxicul atinge o concentraie suficient de ridicat pentru a induce leziuni celulare importante sau o perturbare important a mediului celular se produce moartea celular86uciderea celulei7, iniiindu#se necroza. 4u toate acestea, de cele mai multe ori, celulele afectate sunt nlturate prin apoptoz, aa#
9

numita 6sinucidere celular7. +e crede azi c apoptoza reprezint forma ma:or fiziopatologic de moarte celular, iar necroza se produce mult mai rar, produc(ndu# se doar n cazul leziunilor celulare extinse. *poptoza este un fenomen n general dezirabil pentru organismul ca ntreg, deoarece declanaz mecanismul de nlturare a celulelor afectate de substane chimice cu potenial mutagen sau supuse iradierii, fr a perturba balana homeostatic a organismului. /e l(ng rolul su n dezvoltarea rspunsului celular la expunerea la toxice, apoptoza se poate produce i de#a lungul dezvoltrii i este de importan vital pentru sistemul imun. Exemplele relevante pentru aceast contribuie includ eliminarea celulelor interdigitale n timpul dezvoltrii embrionare a degetelor i deleia limfocitelor autoreactive , i ;, cu potenial letal la nivelul sistemului imun. "ai mult, apoptoza, :oac un rol ma:or n patogenia mai multor boli cum ar fi cancerul, +0)*, i numeroase afeciuni neurologice ca boala *lzheimer i /ar<inson. /rin urmare, o nelegere minim a mecanismelor moleculare care regleaz apoptoza ar avea implicaii multiple n prevenirea i tratarea acestor boli. *poptoza este un fenomen de interes ma:or pentru toxicologia molecular n condiiile n care se afl n centrul aciunii multor toxice i capat astfel valoare n studiul potenialului toxic al diferitelor substane. 21.2.1. Mo"2o(o- & &!o!to*$ !aza de desfurare a apotozei implic caracteristice moleculare remarcabile %=imzami i colab., >>?& dei, n prezent, faza latent a acestui fenomen a rmas nc nedetectabil. "orfologia etapelor finale ale apoptozei este extrem de similar pentru o larg varietate de esuturi3 o celul apoptotic din ficat poate fi identic cu o celul apoptotic din criptele intestinului subire. /e scurt, la celulele apoptotice se constat pierderea contactului celular cu celulele nvecinate viabile, condensarea cromatinei cu formarea unor mase dense i compacte i dezorganizarea structurii citoscheletale. "embrana celular de suprafa, care este de:a contractat, ncepe s se plieze i s formeze vezicule. *ceste
@

modificri sunt urmate de ruperea celulei n fragmente aderente la membran sau 6corpi apoptotici7. 'n contrast cu fenomenul de necroz, membrana plasmatic i organitele citoplasmatice ale celulei apoptotice rm(n intacte %fig. 2 .9&.

, -u"& 21.5 A0!$'t u(t"&0t"u'tu"&( &( u)$ '$(u($ .$!&t '$ !$ '&($& &!o!to*$ . 4elul de hepatom n cultur tratat cu ,A!B. +e observ prezena mai multor fragmente nucleare %f&, condensarea cromatinei n mase dense %capete de sgei&, retracia citoplasmei i formarea de protrusii membranare %sgei&, integritatea membranei plasmatice i a organitelor celulare% 2111 2&

4elula apoptotic este apoi rapid recunoscut, preluat i degradat de ctre fagocite specializate sau nu %macrofage, respectiv celule nvecinate&. In vitro, n absena fagocitelor, se produce o degenerare secundar, nespecific, care are drept rezultat captarea de ctre celul a coloranilor vitali cum este albastrul tripan ceea ce conduce uneori la confundarea sa cu necroza. *cest proces este numit adesea necroz secundar %vezi 4apitolul 29&. 4a un element important, ntregul proces apoptotic se produce fr dezvoltarea unui rspuns inflamator i faciliteaz prin urmare distrugerea celulelor chiar i n prezena unei minime afectri a mediului celular ncon:urtor sau a arhitecturii tisulare. 21.2.2. T"&)02o"%" 6 o'. % '$7 to8 ' )#u0$7 9) t %!u( &!o!to*$
C

'n timpul proliferrii sau diferenierii celulare, apoptoza reuete s#i menin regularitatea i consecvena etapelor. *cestea par a fi 6puncte de cotitur7 biochimice, n calea ctre apoptoz, n care se ia decizia celular de a tri sau muri %!igura 2 .@&.

S$%)&(
ex.$ substan toxic

S$)*o"
ex.$ pC9 +upresori ex ;cl#2, ;cl#2. /romotori ex.$ ;ax, ;a<

E2$'to" :
ex.$

E2$'to" : caspaze8endonucleaze

"5*D,E 4E-E-*DF

!*A540,5=F
, -u"& 21.: Et&!$($ &!o!to*$ : 0$%)&( *&"$7 "$'u)o&+t$"$ + $8$'ut&"$

Etapele biochimice ale apoptozei, detaliate n acest capitol, se conserv la nivelul ma:oritii esuturilor. Enele din acestea evenimente au loc anterior declanrii apoptozei n celul, n timp ce altele sunt ulterioare declanrii fenomenului. 4u toate acestea fenomenele care induc efectiv declanarea apoptozei celulare rm(n nc un mister. 0deea de evideniere a momentului declanrii apoptozei este totui extrem de important dac ne g(ndim la descoperirea unor situri pentru eventuale intervenii terapeutice i a unor inte moleculare relevante pentru tratamentul unor boli, n condiiile n care controlul normal al apoptozei a fost pierdut ori cnd avem n vedere substane antidot care ar putea fi folosite dup expunerea celulei la un factor toxic.
G

Etapele biochimice ale apoptozei toxic induse sunt prezentate n figura 2 .@ i ar putea fi sumarizate astfel$ % & inducia leziunii de ctre substana toxic, %2& detectarea leziunii impus de ctre toxic, %9& cuplarea leziunii cu inducerea apoptozei i %@& 6execuia7/moartea celulei i eliminarea resturilor. !iecare din aceste etape vor fi descrise pe r(nd n paginile care urmeaz. /e l(ng apoptoza indus de o substan toxic aceasta poate de asemenea s fie determinat de absena aa numitelor semnale de supravieiure %vezi subcapitolul 2 .2.2.@& sau prin transmiterea unui semnal letal pe calea activrii membrilor unei familii de receptori ai morii celulare incluz(nd receptorul !as %4)>C8*/5# &%vezi seciunea 2.2.2.2&. 21.2.2.1. I)#u'1 & ($* u) '$(u(&"$ #$ 't"$ u) to8 ' *poptoza poate fi indus de o larg varietate de substane toxice care au diferite mecanisme de aciune ce includ ageni care pot deteriora *)N#ul dar i ageni fr aciune genotoxic. 21.2.2.2. D$t$'t&"$& ($* u) )#u0 #$ to8 '

4um monitorizeaz celulele leziunile toxic induseH *ceast ntrebare extrem de important ateapt nc un rspuns complet n special n ceea ce privete agenii cu aciune nongenotoxic. Exist ns mai multe date referitoare la rspunsul celular consecutiv lezrii *)N#ului. )in moment ce *)N#ul conine toate informaiile necesare funcionarii celulare i implicit cele referitoare la viitoarele populaii celulare, integritatea sa trebuie pstrat n cel mai mic detaliu. 5rice mutaie, leziune sau pierdere a integritii *)N#ului poate conduce la pierderea funciei celulare sau la posibilitatea dezvoltrii unui potenial neoplazic. /rin urmare, esutul elimin celulele care au suferit leziuni ireparabile ale *)N#ului sau posed un potenial mutagenic, eliminarea fc(ndu#se prin intermediul apoptozei. -eziunea poate aprea la una sau la ambele catene *)N i poate fi cauzat de o varietate mare de ageni
I

cum ar fi radiaiie ionizante sau nitrogenul mustard cu potenial de alchilare a *)N# ului %prin leziune direct asupra *)N#ului&, sau poate aprea ca rezultat al aciunii unor ageni cum este etoposidul, cu efect asupra topoizomerazei 00 %inhibitor ce lezeaz indirect *)N#ul celular&. Exist multe clase de proteine care sunt cunoscute pentru rspunsul generat de leziunile *)N precum poli %*)/#riboza& polimeraza %/*D/&, *)N protein<inaza %*)N /J&, *,", c#abl tirozin<inaza i gena supresoare tumoral pC9. )ar cu excepia poate a pC9, rolurile lor n detectarea leziunilor *)N i cuplarea lor la procesul reparator, n limitarea procesului lezional sau n desfurarea apoptozei rm(n nc subiectul cercetrilor. Gena supresoare tumoral p53 . Aena pC9 codific o fosfoprotein nuclear care se comport ca un factor transcripional i ca un 6senzor7 al leziunilor *)N. 'n mod normal, proteina pC9 se pstreaz la o concentraie celular bazal destul de sczut n special datorit timpului su relativ redus de n:umtire. 'n plus, proteina pC9 exist probabil n form latent, inactiv din punct de vedere al transcripiei. Expunerea celulelor la ageni cu potenial duntor asupra *)N#ului conduce la creterea concentraiei de protein pC9, ceea ce se presupune c rezult din combinarea at(t a fenomenului de cretere a timpului de n:umtire a pC9, prin creterea stabilizrii post#translaionale, c(t i din creterea translaiei proteinei pC9. *ceast cretere a concentraiei pC9 are drept rezultat la nivelul celulei, activarea pC9 ca factor transcripional. *ctivarea unei copii 6slbatice7 a pC9 conduce la stoparea creterii celulare n A i8sau la inducerea apoptozei. /rin urmare pC9 funcioneaz la nivelul ciclului celular ca un punct important, de grani, ntre fazele A i +, prevenind progresia celulelor lezate i a celor cu potenial de dezvoltare tumoral. 5prirea creterii ofer timp pentru repararea leziunii naintea replicrii, sau dac leziunea este ireparabil, permite inducerea apoptozei. !uncionarea pC9 ca supresoare tumoral a fost evideniat pe oareci pC9#nuli %cu gena pC9 absent&, care dei au cunoscut o dezvoltare normal sunt predispui la dezvoltarea unor tipuri variate de afeciuni tumorale spontane n primele G luni de via. 4uplarea lezrii *)N cu inducerea proteinei pC9 i apoptoza este specific celulelor at(t in vivo c(t i in vitro. *cest fapt este demonstrat de ctre studii care evideniaz efectul iradierii
?

ntregului corp asupra diferitelor esuturi la oareci3 dei ntreg corpul a fost iradiat, i a primit o doz de radiaii cu potenial de a induce leziuni la nivelul *)N#ului, apoptoza a fost evideniat la nivelul intestinului subire, timus i splin dar nu n plm(n, ficat sau muchi. -ipsa apoptozei din timus i splin, consecutiv iradierii oarecilor pC9#nuli, confirm necesitatea exprimrii pC9. *poptoza consecutiv leziunilor *)N a fost considerat iniial complet dependent de pC9 la nivelul epiteliului intestinului subire, dar cercetri mai amnunite, folosind oareci pC9# nuli, au demonstrat prezena unei apoptoze nt(rziate comparativ cu oarecii care au prezentat copii 6slbatice7, indic(nd deci i existena unor mecanisme pC9 independente. 'n ma:oritatea sistemelor experimentale apoptoza pC9 dependent este legat de transcripia mediat de pC9, dei acest fapt ram(ne nc controversat. /roteinele care s#a demonstrat a fi reglate de ctre pC9 includ membrii ai familiei ;cl#23 s#a demonstrat c reglarea are loc n sensul creterii sintezei proteinei pro#apoptotice ;ax, i al scderii nivelul factorului ;cl#2 antiapoptotic. )in moment ce s#a constatat c balana intracelular a membrilor familiei ;cl#2 proapoptotici i a celor antiapoptotici regleaz apoptoza ntr#o mare varietate de tipuri de celule, pC9 ar putea induce moartea celular prin implicarea familiei ;cl#2 ca factorii declanatori ai apoptozei. 5 alt gen care a fost recent asociat cu apoptoza indus de leziunile *)N i depedent de pC9 este fas %4)>C8*/5# &. !as este membru al superfamiliei de receptori ai factorului de necroz tumoral %,N!#D&. -a legarea de ligandul su %!as-& !as trimerizeaz i un complex intracelular de legare a receptorului este asamblat. *cest complex de semnalizare care induce moartea celular %)0+4& activeaz la r(ndul su o cascad a caspazelor. /e l(ng acestea exist de asemenea forme mutante ale pC9, dependente de temperatur, care pot crete nivelul !as. *poi, ,D*0- %ligandul inductor al apoptozei ,N! relaionat& receptorul C Knumit de asemenea i Jiller%uciga&8)DC&L, un alt membru al superfamiliei ,N!D este indus ntr#o manier pC9 dependent consecutiv

>

expunerii unei mari varieti de celule care conineau copii 6slbatice7 ale pC9 la ageni cu capacitate de lezare a *)N#ului %4ruce i colab., 211@&. )e asemenea pC9 regleaz, din punct de vedere transcripional, i +. p2 M*! 840/ care acioneaz ca un potenial inhibitor al <inazelor dependente de cicline %4)Js& determin(nd oprirea ciclului celular la limita dintre A /2 M*! 840/ poate implicit s :oace el nsui un rol n reglarea apoptozei, printr# un mecanism pC9 independent i specific contextului celular. pC9 particip i la reglarea, tot n sens cresctor a proteinei ")"2 care intervine ntr#o relaie reglatoare de tip feedbac< negativ prin legare pC9 i blocarea transactivrii sale. *ceasta ar conduce la scderea genelor pC9 dependente, cum sunt cele implicate n apoptoz. )up ce leziunile *)N au indus prin pC9 o blocare mediat a ciclului celular n A , exist trei posibiliti de evoluie a celulelor lezate$ rm(nerea n A n ateptarea reparrii leziunilor, repararea *)N#ului i reluarea ciclului celular ori moartea prin apoptoz. )ecizia de stopare a ciclului celular, de reparare sau de iniiere a apoptozei depinde de tipul celulei, gradului de lezare al *)N#ului i de mediul celular. +pre exemplu, pC9 este prezent n ficat dar se pare c nu se acumuleaz consecutiv lezrii *)N indus de radiaii sau administrrii medicamentului citotoxic, etoposid %Aill i colab., >>?&. )e asemenea, dac oarecii sunt iradiai, proteina pC9 este puternic exprimat la nivelul criptelor intestinului subire dar nu i la nivelul criptelor intestinului gros. *cest fapt ar putea explica de ce tumorile sunt mai comune, la oameni, la nivelul intestinului gros comparativ cu cel subire. Dolul proteinei pC9 poate fi de importan ma:or pentru toxicologie n special n ceea ce privete stabilirea riscului. +pre exemplu, la doze crescute de ageni chimici genotoxici, celulele vor declana cile apoptozei. -a doze mai :oase, sub nivelul prag, celule pot bloca ciclul celular, pot supravieui i prin urmare cresc riscurile de apariie a mutaiilor. 4u toate acestea existena unor ci pC9 independente care leag lezarea *)N#ului cu apoptoza trebuiesc luate de asemenea n consideraie.

Mecanismele de detectare a leziunilor ADN p53 independente. "ecanismele pC9 de detectare a leziunilor *)N exist cu certitudine. +pre exemplu la oarecii pC9#nuli, s#a produs apoptoza consecutiv iradierii, dar cu nt(rziere fa de tipul de oareci cu copii 6slbatice78 Nild tOpe ale pC9. Ena dintre moleculele implicate n calea de rspuns la leziunile *)N, independent de pC9, este factorul de reglare al interferonului %0D!# & n condiiile n care blocarea ciclului celular n A i apoptoza nu au mai avut loc la nivelul fibroblastelor cu leziuni *)N cu 0D!# nuli, respectiv la nivelul limfocitelor , mature derivate splenic cu 0D!# nuli. *genii cu potenial de lezare a *)N#ului activeaz tirozin<inaza nuclear c#*bl, considerat un senzor al apoptozei determinat de leziunile *)N care este corelat cu cuplarea leziunilor *)N i apoptoza. 4elulele care sunt c#*bl nule sunt mai rezistente la dezvoltarea apoptozei indus de lezarea *)N#ului dec(t cele care prezint copii 6slbatice7 ale acesteia. c#*bl se leag de pC9 i, cel puin in vitro, pare s aib o funcie pro# apoptotic n prezena dar i n absena pC9. 21.2.2.5. Cu!(&"$& ($*" '$(u(&"$ 'u #$'(&)+&"$& &!o!to*$ )up ce leziunea celular a fost detectat aceast informaie trebuie procesat i cuplat cu rspunsul celular la in:urie, i decizia de a supravieui sau muri trebuie luat. +e cunosc foarte puine despre modalitatea n care aceste procese celulare se produc dar moleculele i mecanismele implicate sunt detaliate mai :os. !venimente produse la nivel mitocondrial. "itocondria :oac un rol central n medierea apoptozei i pare a fi locul de recepie ale semnalelor induse de in:urie. ,impuriu exist o pierdere de potenial electric de#a lungul membranei mitocondriale interne %Pm& , n procesul de desfurare al apoptozei %figura 2 .C& fenomen denumit permeabilitate mitocondrial de tranziie %/,&. Eliberarea de citocrom c de la nivelul mitocondriei a fost de asemenea evideniat ca eveniment central n reglarea apoptozei. 5dat eliberat din mitocondrie citocromul c %numit de asemenea *paf#2, factorul 2 de activare al proteazelor apoptotice& se leag de un adaptor al proteinei *paf# . *cesta este omologul de la mamifere al genei morii ced" # de la nematode care acioneaz prin creterea caspazei ced"3 i scderea

omologului ;cl#2, ced"$, ambele dependente de cldur. +#a demonstrat de asemenea c *paf# se leag de d*,/ i caspaza > %*paf#9&. *cest complex format din *paf# , #2, #9 i d*,/ se consider a fi declanatorul cliva:ului pro#caspazei 9 care la r(ndul su iniiaz o cascad a caspazelor, ce constituie 6mainria7 de execuie a morii celulare apoptotice.
MOARTE CELULAR

, -u"& 21.;. P" )' !&( "$-(&to" %o($'u(&" & &!o!to*$

"ecanismul exact prin care citocromul c este eliberat din mitocondrii n citosol nu este pe deplin cunoscut dar una dintre ipoteze este aceea conform creia membrana mitocondrial extern se rupe permi(nd eliberarea citocromului c din spaiul intra#membranar. Duperea membranei externe mitocondriale pare c se produce datorit influxului de ioni i ap /, mediate la nivelul matricei mitocondriale. 'n condiiile n care membrana mitocondrial intern are o suprafa mai mare dec(t cea extern, prima se poate extinde p(n ce pur i simplu o rupe pe cea din urm. Delaia dintre /, i eliberarea de substane apoptogenice, cum sunt citocromul c i factorul de inducere al apoptozei %*0!& de la nivelul mitocondriei n citosol, este nc neclar. /orii /, sunt insuficient de mari pentru a permite pasa:ul citocromului c. Eliberarea citocromului c din mitocondrie poate fi reglat de ctre membrii familiei ;cl#2. 5 ntrebare important rm(ne nc fr rspuns$ cum

reuete leziunea indus de o mare gam de ageni toxici, cu variate inte celulare, s induc n final fenomenele mitocondriale descrise mai susH %alciul intracelular& 5 molecul semnal care, raional, ar putea face legtura ntre diversele tipuri de leziuni celulare i evenimentele mitocondriale implicate n medierea apoptozei este calciul intracelular K4a2QL. +tudii timpurii au sugerat c alterri n homeostazia K4a2QL au fost frecvent evideniate n celule n timpul apoptozei. 4u toate acestea nu a fost niciodat clar dac aceste schimbri reprezint cauza sau consecina procesului apoptotic. Dolul K4a2QL n reglarea apoptozei a fost evideniat i susinut de observaia conform creia K4a 2QL, agenii tampon, chelatorii de 4a2Q i inhibitorii 4a2Q#*,/#azei din reticulul endoplasmic %DE& pot inhiba activarea caspazelor, fragmentarea *)N#ului i moartea celular. 'n schimb, ionoforii de calciu, care cresc K4a2QL, pot declana apoptoza n mai multe tipuri de celule. "ai multe mrturii despre implicarea influxului de 4a 2Q n declanarea apoptozei ne vin din studii care folosesc blocani specifici ai canalelor de 4a 2Q ce suprim apoptoza la nivelul prostatei aflate n regresie dup reducerea testosteronului i la nivelul celulelor R pancreatice tratate cu ser de la pacieni cu diabet tip 0. Decent tehnicile mbuntite au evideniat un rol al calciului n semnalizarea apoptozei, ns mecanismul rm(ne neclar. Epuizarea rezervelor intracelulare i influxul de 4a 2Q de#a lungul membranei plasmatice are drept rezultat creterea susinut a depozitelor de 4a2Q, care acioneaz ca semnalizatori ai apoptozei. )epleia K4a 2QL de la nivelul DE, considerat un eveniment precoce al procesului apoptotic, s#a demonstrat a fi suficient pentru inducerea apoptozei, determin(nd depleia consecutiv a 4a 2Q din depozitele mitocondriale. "embrii anti#apoptotici ai familiei ;cl#2 sunt considerai ca reglatori ai comportamentului 4a2Q at(t la nivel mitocondrial c(t i la nivelul DE. 4oncentraii eseniale ale 4a2Q mitocondrial sunt semnificativ mai sczute la nivelul liniilor de celule hematopoietice prezent(nd expresii ale ;cl#2 %92)& comparativ cu eantioanele de control, susin(nd idea c ;cl#2 regleaz 4a 2Q mitocondrial. "ecanismul exact prin care ;cl#2 regleaz 4a 2Q ram(ne nc neclar. 5 explicaie posibil ar fi aceea c ;cl#2 impiedic deschiderea canalelor ;ax induse, bloc(nd efluxul de 4a2Q din mitocondrii %Doberts, 2111&.
9

5 familie n expansiune de proteaze apoptotice, caspazele, sunt n general considerate a fi 6executanii apoptozei7. 5dat ce caspazele au fragmentat enzimatic componentele intercelulare, fragmentele celulare formeaz corpii apoptotici care sunt distrui de ctre fagocite. 'emnalizarea apoptozei prin intermediul ceramidei. 4eramida este un mesager secundar eliberat consecutiv hidrolizrii sfingolipidelor membranare. Aenerarea de ceramid, consecutiv unui stimul apoptotic, are drept rezultat activarea unei cascade de protein<inaze. 5 mare varietate de stimuli apoptotici induc generarea de ceramid. *ctivarea ,N!S i !as atrag activarea sfingomielinelor determin(nd producerea de ceramid i producerea morii celulare apoptotice. +#a demonstrat de asemenea c, apoptoza indus de radiaiile T implic semnalizarea prin intermediul ceramidei, fapt evideniat cu a:utorul unei linii celulare endoteliale. 'nc din primele minute ale iradierii s#a observat o acumulare a ceramidei iar, ceramidele permeabile celular sunt capabile de producerea apoptozei n aceste celule %fig. 2.G&. 'n contrast cu ,N!S, !as i radiaiile T, apoptoza indus de ctre agentul cu potenial de lezare a *)N#ului, daunorubicina se acompaniaz de inducerea ceramidei, ns fr activarea sfingomielinelor. *poptoza indus de daunorubicin se pare c implic sinteza de novo a ceramidei prin intermediul stimulrii sintezei de ceramid, fapt certificat de utilizarea inhibitorilor de ceramid#sintetaz care blocheaz apoptoza indus de daunorubicin. En alt rol al ceramidei n apoptoz a fost demonstrat de observaia conform creia rezistena la anumite tipuri de apoptoz se asociaz cu producia insuficient de ceramid %Aill, )ive, 2111&. Evenimentele care conduc la producerea de ceramid i legtura lor cu semnalizarea apoptozei sunt parial necunoscute. 4eramida activeaz at(t "*/ <inaza %protein<inaza mitogen#activat& c(t i +*/ <inaza %protein<inaza activat de stres&. 4alea care folosete "*/ <inaza pare a fi implicat n supravieiurea i creterea celular n timp ce +*/ <inaza pare s aib efecte opuse, fiind asociat cu moartea celular. /rin urmare rspunsul apoptotic al ceramidei ar putea fi rezultatul perturbrii acestor dou ci cu efecte antagonice, balana nclin(nd ctre calea +*/ <inazei, culmin(nd cu moartea celular apoptotic.
@

(amilia )cl"*. ;cl#2, acronimul pentru proteina limfomului8leucemiei cu celule ;, a fost prima oar evideniat datorit supraexprimrii sale n limfoamele foliculare i alte afeciuni maligne cu implicarea celulelor ;. +#a constatat c ;cl#2 poate aciona sinergic cu c#mOc pentru a transforma celulele %Deed, >>I&. ;cl#2 este 6membrul fondator7 al unei familii, care se extinde rapid, i care cuprinde at(t antagoniti ai morii celulare %;cl#2, ;cl#2-, ;cl#M, ;fl#0, ;rag# , "cl# i *0& c(t i agoniti %;ax, ;a<, ;cl#xs, ;ad, ;id, ;i< i .r<&. 'n consecin, vom trece n revist aici ntreaga familie ;cl#2, iar n seciunea 2 .2.2.@ ne vom ocupa n special de membrii familiei care au efecte protectoare. 0mplicarea familiei ;cl#2 n apoptoz este suinut de studii efectuate pe oareci deficieni pentru un anumit membru al familiei ;cl#2. Uoarecii care sunt nuli pentru proteina anti#apoptotic ;cl#2 sunt demonstrai a fi limfopenici, cu sindrom azotemic i hipopigmentai3 toate aceste caracteristici asociindu#se cu creterea morii celulare. Uoarecii cu deficient de ;cl#2- mor nc din perioada embrionar, datorit apoptozei crescute at(t la nivelul liniilor celulare hematopoietice c(t i neuronale. 'n schimb oarecii deficitari pentru proteina pro#apoptotic ;ax prezint un exces de limfocite, celule granuloase i spermatogonii i posed de asemenea o serie de neuroni care dovedesc rezisten crescut la factorii de privare neurotrofic. Uoarecii care au alterate genele +cl"* i +ax au numr de timocite egal cu cele ale lotului de control, demonstr(nd c scderea limfocitelor la oarecii ;cl#2 nuli depinde primordial de ;ax. !amilia posed cantiti variabile de regiuni %de al ;. la ;.@& omoloage ;cl# 2 %;.&, care dicteaz capacitatea lor de a interaciona ntre ele sau cu alte proteine nenrudite. Daportul dintre antagonitii i agonitii morii celulare poate determina dac o celul va rspunde la semnalul de inducere a apoptozei. *ceast balan via# moarte se consider a fi mediat, cel puin parial, de dimerizarea competitiv dintre perechile selective de agoniti i antagoniti. !aptul c unul dintre grupuri poate neutraliza funciile celuilalt nu este nc un fapt pe deplin demonstrat n condiiile n care membrii acestei familii pot aciona i independent unii fa de ceilali %4ruce i colab., 211@&.
C

"a:oritatea membrilor familiei ;cl#2 posed o regiune transmembranar carboxi#terminal care acioneaz pentru ancorarea lor la membrana intern a DE, la mitocondrii i nucleu. 4u toate acestea, unii membrii ai familiei cum sunt ;id i ;ad nu posed aceast regiune hidrofobic i se localizeaz n citoplasm. -ocalizarea ;cl#2 la membrane, altele dec(t mitocondriile poate neutraliza membrii familiei bcl#2 pro#apoptotici, impiedic(ndu#i prin urmare s acioneze la nivelul mitocondriei. *ceast teorie se spri:in pe observaia c ;cl#2 init pe DE interacioneaz cu ;ax, care la r(ndul su trebuie s acioneze pe mitocondrie pentru a induce moartea celular. *lternativ efectele familiei ;cl#2 pot fi mediate prin intermediul DE i membranelor nucleare nu doar cu spri:inul mitocondriei. -a r(ndul su aceast teorie este susinut de constatarea c ;cl#2 intit pe DE este capabil de suprimarea apoptozei indus de supraexprimarea c#mOc dar nu i a celei indus de etoposid. 'n schimb ;cl#2 av(nd drept int mitocondriile reprezint un inhibitor foarte eficient al apoptozei indus de aceti stimuli, c#mOc i etoposid, suger(nd c ;cl#2 reprezint un inhibitor mult mai eficient al apoptozei atunci c(nd este ndreptat ctre mitocondrii. /roteinele anti#apoptotice ;cl#2 i ;cl#2- previn eliberarea citocromului c din mitocondrii i activarea consecutiv a caspazei 9 %.engartner, >>?&. +upraexprimarea ;ax determin localizarea sa la nivel mitocondrial i inducerea eliberrii citocromului c %Dosse i colab., >>?&. -a nivelul celulelor care prezint o supraexprimare a ;cl#2, microin:ecia citocromului c nu mai poate induce apoptoza %=hivotovs<O i colab., >>?&. -uate cumulat aceste date sugereaz c ;cl#2 poate regla eliberarea de citocrom c de la nivelul mitocondriei dar poate de asemenea interfera cu procesul de distrugere celular mediat de ;ax, independent de eliberarea de citocrom c. "ai multe ipoteze au fost emise pentru a explica aceste observaii$ ;cl#2 se poate lega direct la complexul *paf sau la citocromul c din citosol limit(ndu#i efectele %figura 2 .G.&.

, -u"& 21.<. R$!"$*$)t&"$& 0'.$%&t ' & ' (o" &!o!to*$ 7 &"t=)# "o(u( '$)t"&( >u'&t #$ '&0!&*$ 9) 2 )&( *&"$& %o"1 '$(u(&"$

)ei proteinele din familia ;cl#2 nu posed secvene smenificative de aminoacizi omologe altor proteine, structura tridimensional a ;cl#2- pare a fi similar cu domeniile formatoare de pori ale unor toxine bacteriene care se comport ca i canale pentru ioni sau proteine, cum este toxina difteric. /rin urmare familia de proteine bcl#2 poate funciona drept canale pentru ioni, proteine sau pentru ambele i at(t ;cl#2- c(t i ;cl#2 posed activitate de canale ionice la nivelul membranelor lipidice sintetice. 4u toate acestea formarea de pori are loc la un p. sczut %p. @,1 sau C,C pentru ;cl#2-, respectiv ;cl#2& ceea ce sugereaz c pentru formarea de pori este necesar protonarea acestor proteine. Decent s#a demonstrat c ;ax prezint de asemenea activitate de canale ionice in vitro ns pstrarea funciei de formare a porilor in vivo la p. fiziologic ram(ne un fenomen incert. /orii anti i pro#apototici pot avea selectivitate diferenial, oferind fie comportament, ncrcare sau direcionare specific a transportului ionilor sau moleculelor care regleaz apoptoza.
I

)ovezi circumstaniale sugereaz c supraexprimarea ;cl#2 inhib permeabilitatea mitocondrial de tranziie, n timp ce supraexprimarea ;ax o induce %4ruce i colab., 211@&. /e l(ng formare de pori, ;cl#2 i ;cl#2- s#ar putea lega la o mare varietate de proteine incluz(nd protein<inaza Daf# , protein fosfataza calcineurina, A,/#azele D#Das i .#Das, Nip# , #2, #9 i o protein numit ;*A# . -egarea de aceste proteine semnal ne ofer o a doua funcie a familiei ;cl#2 acion(nd ca adaptori de semnal sau proteine de cuplare. 0mplicarea ;cl#2 n calea !as este controversat i pare s depind de modele experimentale. Uoarecii care prezentau ;cl#2 umane la nivelul hepatocitelor au fost prote:ai mpotriva apoptozei induse de anticorpi anti#!as agoniti i reglarea, n sens descresctor a ;cl#2 poate fi primul pas n cadrul procesului de apoptoz mediat de !as la nivelul tractului reproductor al masculului de oarece post gonadectomie. )atorit importanei funcionale i rolului central al proteinelor ;cl#2 asupra controlului apoptozei, ele pot constitui inte primare pentru intervenii terapeutice n cadrul mai multor boli, a cror apariie este determinat de moartea celular anarhic. 4unoaterea modalitii de aciune a proteinelor ;cl#2 interconectate cu alte proteine, ne poate oferi informaii utile n dezvoltarea de noi tratamente i testri toxicologice, precum i despre inducerea apoptozei n celulele tumorale. 21.2.2.:. Su!"$0 & &!o!to*$ to8 ' )#u0$ 'emnale de supravieuire. *a cum ne sugereaz Daff % >>2&, celulele trebuie s recepioneze semnale de supravieuire pentru a evita apoptoza. +emnalele de supravieuire comprim legarea de receptor a factorilor de cretere solubili cum este interleu<ina 9 %0-9&, comunicarea intercelular de tipul :onciunilor gap, precum i interaciunea cu componentelor matricei extracelulare. Nu este ns clar dac diverii stimuli de supravieuire au n comun elemente semnalizatoare pentru a suprima calea apoptotic defect sau dac acioneaz ca semnalizatori proprii ai supravieuirii. "ecanismul prin care factorii de cretere permit supravieuirea celular reprezint o zon de profund interes. +#a descoperit c semnalizarea prin intermediul
?

cilor Das, Daf i +rc, dei mitogenic, nu a fost suficient pentru a permite supravieuirea celular la nivelul fibroblastelor. Ena dintre moleculele implicate n semnalizarea factorilor de supravieuire, mediat de o larg gam de factori de cretere este fosfatidilinositol 9 <inaza %/09J&. ;locarea activitii /09J poate suprima capacitatea factorilor trofici de a promova supravieuirea. 5 int a /09J, definit ca central n transmiterea semnalelor de supravieuire, este serin#treonin <inaza c#*<t, de asemenea cunoscut ca protein<inaza ; %/J;&. *ctivarea *<t transmite un semnal de supravieuire care inhib apoptoza, indus de o varietate de stimuli, incuz(nd scderea factorilor de cretere, discordana ciclului celular, pierderea adezivitii celulare i lezarea *)N#ului. *ctivarea *<t are drept rezultat inhibarea activitii caspazelor, cu rolul de a prote:a celula de moartea apoptotic. En mecanism posibil prin care /09J8*<t suprim apoptoza i promoveaz supravieuirea celular se produce pe calea modulrii membrilor familiei ;cl#2. *ceast afirmaia a fost susinut de observarea activrii *<t la nivelul celulelor, care are drept rezultat fosforilarea i inactivarea membrului pro#apoptotic ail familiei ;cl#2, ;ad. *ctivarea /09J8*<t nu s#a soldat cu modificri ale nivelurilor ;cl#2, ;cl#2- sau ;ax. /rin urmare fosforilarea ;ad de ctre *<t este unul dintre numeroasele mecanisme posibile prin care semnalele de supravieuire pot determina suprimarea apoptozei %4ruce i colab., 211@&. /e l(ng factorii solubili, contactul intercelular i micromediul :oac un rol important n supravieuirea celular. -a nivelului centrului germinal, legarea antigenului celular de suprafa 4)@1 trimite un semnal celulelor ;, aflate n proces de maturizare, fapt necesar prevenirii morii acestora prin apoptoz. 4alea legat de /09J8*<t i familia ;cl#2 au fost cert corelate cu cile de semnalizare ale supravieuirii. 'n mod interesant, semnalizarea cu a:utorul 4)@1 suprim de asemenea i apoptoza indus de medicamente n limfoamele cu celul ; cresc(nd posibilitatea recderii dup chimioterapie. 4omponentele matricei extracelulare determin implicit supravieuirea celular, din moment ce celulele epiteliale ale glandei mamare supravieuiesc doar dac sunt ataate corect matricei extracelulare3 o matrice inadecvat are drept consecin moartea celualar, chiar i n prezena
>

legturilor intercelulare i a factorilor de cretere solubili. )eci, factorii de supravieuire i mediul extracelular sunt de importan ma:or c(nd se analizeaz controlul apoptozei i implicit rezultatul expunerii la ageni toxici. (amilia )cl"*. *u existat numeroase studii care au demonstrat c supraexprimarea ;cl#2 sau ;cl#2- acioneaz n direcia nt(rzierii declanrii apoptozei indus toxic. "area ma:oritate a acestor studii se concentreaz asupra apoptozei indus de ageni cu potenial de lezare al *)N#ului, evideniai n liniile celulare tumorale, i au ca rezultat faptul c ;cl#2 sau ;cl#2- confer celulelor rezistena la medicamente. 4u toate acestea ma:oritatea studiilor la care facem referire, privesc supravieuirea pe termen scurt i pierd din vedere capacitatea celular ulterioar de a forma clone, pun(nd sub semnul ntrebrii importana acestor studii pentru supravieuirea celular pe termen lung. 'n cele c(teva studii care iau n considerare i acest aspect, al formrii clonelor celulare, supraexprimarea ;cl#2 poate oferi un avanta: din acest punct de vedere ulterior leziunilor induse de medicament, permi(nd celulelor cu leziuni *)N s supravieuiasc i s prolifereze. 21.2.2.;. Co)'(u* "eninerea homeostaziei tisulare depinde de pstrarea unui echilibru fragil ntre supravieuirea i moartea celular. )in moment ce apoptoza apare ca un rspuns comun la aciunea multor substane toxice, a devenit un fenomen de extrem interes pentru muli experi n toxicologie. 4ercetri recente au identificat molecule cheie implicate n reglarea apoptozei i acestea %i altele care se afl n curs de identificare& reprezint acum adevrate puncte de interes tiinific pentru specialitii n toxicologie, care vizeaz n special interveniile terapeutice.

21