0

^joVVjJL

Q^QTto -

b hjX>-*Slxs

JVWLILO^ -QS^O-S
c

& CkXosa ouu,

A<3

8156-77-7

&

ISBN 973

T,

**V

.'t

2 7 APR 2004

1. INTRODUCERE
1.1 SCURT INTRODUCERE

N GENETICA UMAN
Genetica studiaz ereditatea i variaiile
organismelor biologice. Acest lucru se poate
considera fe la nivel individual, cum ar f motenirea
unor caractere particulare de la prin la copii, fie la
un nivel mai general, cum ar f, urmrirea micrii
unor markeri genetici ntr-c populaie. Ambele
concepte integreaz utilizares ADN- ului n
investigaiile din medicina legal.

1.1.1 BAZELE FIZICE ALE EREDITII

S considerm pentru nceput mecanismul
transmiterii informaiei genetice de la o generaie la
alta. Toate organismele vii sunt formate din celule,
cele mai mici unitii ale vieii. O celul are
diametrul de 1/10 din grosimea unui fir de pr, iai
corpul uman conine aproximativ trei mii de
miliarde (3x10) de celule. Practic, toate celulele

3corpului (cu excepia globulelor roii din snge) conin n

interiorul lor un nucleu, care este centrul de organizare
al celulei. Informaia genetic este inclus n nucleul
celular i este organizat n

/V

structuri fizice numite cromozomi. In general, cromozomii se

transmit de la prini la copii, ca uniti intacte. Astfel,
markerii dispui pe acelai cromozom, se motenesc
mpreun, fapt pentru care se spune c ei sunt genetic
nlnuii (genetic linkage).

Spre deosebire de acetia, markerii situai pe

cromozomi diferii se motenesc, n general,
independent unul de cellalt. Acest principiu se
numete asortare ntmpltoare (random assortment).
Markerii care sufer asortarea ntmpltoare nu se
motenesc mpreun sau asociai unul cu cellalt, ntr-o
populaie dat, dect att ct aceasta este posibil prin
ntmplare. Caracterele care manifest asortarea
ntmpltoare sc spune c se afl n echilibru de
nlnuire (linkage equilibrium). Altfel, markerii care
sunt genetic nlnuii, cum ar fi cei situai unul lng
cellalt pe acelai cromozom, se spune c sunt n
dezechilibru de nlnuire (linkage disequilibrium);
ntr-o populaie ei sunt asociai (mpreun) mult mai
frecvent dect sc poate previziona aceasta prin ans.

1.1.2 ALLELE- VARIAII

PE ACEEAI TEM
Celulele umane conin 23 de perechi
cromozomi. Fiecare persoan are dou copii
aceluiai cromozom, unul de la tat i cellalt d
mam. Astfel, noi motenim jumtate din cantit
de material genetic de la mam i jumtate d tat.
Dup cum am menionat anterior, diferen dintre
indivizi sunt determinate de mici variat ADN- ul
fiecruia. Diferitele forme ale acele gene sau
marker se numesc alele. Cel mai sin exemplu al
diferitelor alele a fost observat n 1 de ctre
Gregor Mendel, considerat astzi, prin geneticii
modeme. El a observat, de exemplu boabele de
mazre pot fi verzi sau galbene, nei sau zbrcite,
i astfel i-a propus s urmre transmiterea
acestor caractere de-a lungul multor generaii.
Verde i galben sunt alterna (alele) ale aceleiai
gene; neted i zbrcit : al Ielele altei gene.
Grupele sanguine ABO sun alt exemplu de
diferite alele ale unei aceleeai la om. Dac
allelele cu o localizare particu (,locus) n genom
sunt aceleai pe ambii cromoz pereche, individul
este homozigot pentru ac alele. Pe de alt parte,
dac aceste alele prez mici diferene, ceea ce
face ca pe cromozc pereche s fie dou alele
8

diferite, individul heterozigot pentru aceste

alele. Aceste difen

pot sau nu s se manifeste fizic. Cnd se formeaz

grneii (ovulul sau spermatozoizii), fiecare primete
cte un exemplar din perechea de allele, ntr-o
manier ntmpltoare. Cromozomii sunt distribuii
astfel c fiecare gamet conine cte un exemplar din
cele 23 de perechi de cromozomi de la individul
respectiv. Aceasta face ca, dac printele este
heterozigot pentru un anume marker, la fiecare gamet
s fie distribuit una din cele dou allele posibile. De
aceea se spune c allclele unei aceleiai gene segreg
una de cealalt. Astfel, descendentul celor doi prini,
care ia natere n urma fecundaiei la care particip un
gamet feminin i unul masculin, motenete cte un
9

cromozom din fiecare pereche, de la fiecare printe;

nu este posibil ca ambii cromozomi dintr-o pereche s
fie motenii de la un singur printe. Acest principiu
se numete segregare independent. Acesta este
motivul pentru care descendenii unui cuplu vor
conine ntotdeauna 23 de perechi de cromozomi. Att
segregarea
independent,
ct
i
asortarea
ntmpltoare contribuie la diversificarea genetic
continu a speciilor.

Una din cele 23 de perechi de cromozomi conine

informaia care determin sexul individului. Aceast
pereche de cromozomi este notat cu litere i nu cu
numere, respectiv X i Y; brbaii au un cromozom
X i unul Y (XY), iar femeile au doicromozomi X
(XX). Astfel, ovulele feminin (grneii) nu pot
1
0

conine dect un cromozom X, p< cnd

spermatozoizii conin n proporie de 50/
cromozomul X i 50% cromozomul Y. Astfel, sexu
este determinat de componena parental a unu
cuplu. Informaia coninut n cromozomii sexual
este att de diferit, nct ea poate fi evideniai
vizual. Sexul poate fi determinat prin teste ADN,
uneori, este de mare valoare pentru investigaiili
medicinii legale.
1.2 INDIVIDUALITATEA
GENETIC A UNEI PERSOANE
S considerm o demonstraie NON- ADN J
principiilor de mai sus. S presupunem c <
persoan posed patru fragmente scurte de a, ia
dou din ele sunt identice, fiind pictate cu doui
benzi, una verde i una galben; celelalte dou sunt
de asemenea, identice i difer de prima perech<
pentru c au benzile colorate n rou i albastru. Ii
cadrul fiecrei perechi, uneia i se face un nod pentn
a putea fi distins de perechea sa. Dac inen
perechea verde/galben ntr-o mn i perechea rou
albastru n cealalt mn, este evident c bucih de
a nu sunt legate fizic ntre ele n nici un fel. r
continuare, s aruncm bucile de a n aer i si le
1
1

lsm s cad liber. Ceea ce apare foarte eviden este

c benzile verde i galben de pe aceeai ai

rmn apropiate, deoarece sunt conectate fizic; la fel sc

ntmpl i cu benzile rou i albastru. Aceasta
demonstreaz principiul nlnuirii genetice (genetic
linkage). n al doilea rnd, s observm relaia dintre
bucile de a care conin culori diferite: ct de
frecvent se afl aproape una de cealalt dou buci de
a cu culori diferite? ntr-o situaie se pot asocia cele
dou buci de a cu benzi de culori diferite cu un nod
(respectiv cele fr nod). O alt posibilitate' este
asocierea a dou buci de a cu benzi de culori
diferite, dar una cu nod i una fr nod. Dac executm
manevra descris mai sus, vom remarca faptul c nu
exist o preferin de asociere pentru o anume
1
2

combinaie. Acest experiment demonstreaz principiul

asortrii independente, asocierea n perechi a dou
buci de a cu culori diferite este ntmpltoare.
1.3 GENETICA POPULATELOR

Fiecare din markerii genetici au o frecven

particular n cadrul unei populaii. Este foarte bine
cunoscut c grupele sanguine ABO prezint diferite
frecvene. In populaia caucazian, de exemplu, grupa
sanguin B are o frecven de aproximativ 10%.
Fiecare allel a unui marker utilizat n analizele ADN
are, de asemenea, o frecven populaional particular.
Determinarea acestei frecvene este important n
1
3

scopul determinrii semnificaiei markerului pentru un

tip genet particular. Dac un anume lip genetic are o
frecven de 50% n populaie, proba recoltat dc la locul
un crime nu prezint semnificaie. Dac ns tip genetic
este foarte rar, de exemplu 1 la un milio rezultatele
determinrilor genetice sunt foar semnificative.

n investigaiile de medicin legal, de obic se

testeaz mai muli markeri diferii. Cel m obinuit mod
de a exprima semnifica concordanei genetice este de
a nmuli frecven markerilor diferii. Cu fiecare marker
nou adug semnificaia concordanei genetice cret
Bineneles c asemenea calcule sunt valide do dac
markerii sunt analizai genetic i statistic, primul rnd
populaia n cauz trebuie s se afle echilibru HardyWeinberg. Aceasta presupune i
1
4

allelele unui locus nu se afl una cu cealalt-

corelaie a priori. In caz contrar, se poate ntmp ca

semnificaia concordanei genetice s fie m crescut
dect n realitate. Condiiile acestei le sunt atinse n
populaiile mari n care fenomen natural al ncrucirii
este ntmpltor distribuit n care sunt absente
modificrile prea mari produ: de migraie, selecie
natural sau mutaie. In doilea rnd, genotipurile de la
diferii loci nu trebu s se afle n corelaie, adic trebuie
s existe i echilibru de nlnuire (linkage
equilibrium).

1
5

modalitate prin care populaiile pot devia de la echilibrul HardyWeindberg i / de la echilibrul de linkage este prezena n populaie a
unor substructuri sau subpopulaii. Aceasta se poate ntmpla n
comunitile mici din cadrul unor populaii mari, comuniti n care
ncrucirile se fac preferenial n interiorul lor. Acest fenomen
creeaz un grup relativ izolat din punct de vedere reproductiv. De
exemplu, n cadrul populaiei oraului New York, unele grupri etnice
prezint o rat ridicat de intra-mariaj. Frecvena allelelor n
asemenea grupuri poate devia, de cea obinut, cnd se analizeaz o
populaie mare i omogen. Cu alte cuvinte, ana a doi indivizi din
cadrul subpopulaiei (subgrupului) de a fi purttori ai unui marker
genetic poate fl mult diferit de cea preconizat prin utilizarea
frecvenei adelelor raportat la toat populaia. Dac adele n cauz se
dovedesc a fi ntr- o frecven mai mare n subpopulaie, semnificaia
modelelor genetice similare poate fi supraestimat.

2. INTRODUCERE
N BIOLOGIA
MOLECULAR A ADN
ADN este deseori considerat c reprezir macheta vieii.
Informaia pentru aceast machc este codificat prin patru uniti
chimice care ini n alctuirea ADN -ului: Adenina (A), Timina f

Guanina (G) i Citozina (C). Aceste uniti, num baze, se nir liniar,
la fel ca mrgelele pe o a Secvena specific a acestor patru tipuri de
ba determin toate atributele genetice ale un persoane. Proprietile
unei molecule de ADN si direct determinate de structura sa fizic.

n natur (n celulele animale sau vegetal ADN -ul are forma

unui dublu helix. Dou lan lungi de nucleotide, fiecare nucleotid
coninnc baz, se nfoar unul n jurul celuilalt. Se spu c
molecula de ADN este dublu-calenar, ea fii format din dou lanuri
sau monocate nucleotidice. Fiecare nucleotid dintro caten leag
de un nucleotid din catena paralel nsumnduse, astfel, fore
suficiente pentru ca cele dou monocatene s fie meninute laolalt.

echerea dintre bazele a dou nucleotide de pe cele dou catene

paralele este ns extrem de specific, n sensul c un nucleotid cu A
se mperecheaz numai cu un nucleotid cu T, i respectiv G numai cu
C. Aceast mperechere obligatorie, numit mperechere
complementar de baze, este exploatat n toate sistemele de tipizare
a AND -ului. Cnd dublu helix este intact, se spune c AND -ul este
dublu catenar, iar cnd cele dou catene se despart, n natur sau n
eprubet, se numesc monocatenare.

In natur, mperecherea complementar a bazelor este

responsabil pentru capacitatea moleculelor de ADN de a se replica
(copia) foarte exact, ceea ce asigur transmiterea informaiei

genetice de-a lungul generaiilor. In cursul replicaiei dublul helix

este desfcut n cele dou catene (la fel ca un fermoar) de enzime
specifice, iar unitile noi (nucleotidele) se ataeaz una cte una pe
cele dou monocatene dup principiul mperecherii specifice (A-T
sau T-A i respectiv G- C sau C-G). Astfel, utiliznd o caten ca
matri, se sintetizeaz cealalt caten, perfect complementar la
prima, rezultnd dou molecule dublucatenare de AND, identice cu
originalul. Ordinea bazelor dc pe catena nou este determinat de

catena veche

t proces poate fi reprodus, astzi, n epru i constituie baza reaciei de

polimerizare n (polymerase chain reaction - PCR).

Este imposibil a se discuta despre rcaciil

biochimice, fr a ne referi la enzime. Enzimele sun
substane de natur proteic i sunt capabile si
catalizeze
formarea
sau
descompunere!
componentelor bilogice. Dac aceste enzime
s( izoleaz n condiii corespunztoare, ele i
pstreazi activitatea i n eprubet, numai dac li se
asigur aic anumite condiii asemntoare cu mediul
lor naturalEnzimele care catalizeaz adiia de
nuclcotide ntr-o molecul de ADN se numesc
polimeraze. Cel mai important exemplu este Taq
polimeraza, folosit n tehnica PCR pentru c
posed o nsuire remarcabil, aceea de a-i pstra
activitatea, adic de a nu fi degradat, la temperaturi
mari.

Enzimele de restricie sunt o alt clas de

enzime care posed proprietatea de a mpe moleculele

de ADN n fragmente mai scurte. n natur, ele exist

la bacterii pentru a le proteja de infeciile virale.
Enzimele de restricie recunosc secvenele scurte
specifice de AND viral, la acest nivel, acesta fiind
rupt n fragmente. ADN -ul bacterian nu poate fi
atacat de aceste enzime datorit unui mecanism de
protecie. Specialitii de biologie molecular au izolat
aceste enzime (sunt cunoscute deja cteva sute) i le
folosesc pentru ruperea moleculelor de ADN de orice
tip la nivelul secvenei pe care o recunoate enzima
respectiv. Fapt foarte important, fiecare enzim
poate rupe o molecul de ADN numai la nivelul
secvenei pe care ea o poate recunoate. De exemplu,
enzima HaelII rupe molecula dublucatenar de ADN
doar acolo unde exist secvena de baze CCGG,
exact ntre C i G. Astfel, un genom particular poate
fi fragmentat n mod reproductibil n fragmente de
aceeai mrime i numr. Numrul i mrimea
acestor fragmente variaz la diferite genomuri, care
provin de la diferii indivizi, dac intervine
polimorfismul.

Enzima de restricie cea mai utilizat n

analizele ADN n Statele Unite este haeiii, iar n
Europa, hinfi.

16

3 SISTEME DE
TIPIZARE ALE ADN
3.1 ANALIZELE RFLP
Primya metod care a fost adaptat pentru

analizele ADN din medicina legal se numete RFLP

(Restriction Fragment Length Polymorphism).
Aceast tehnic determin variaiile n lungime ale
unor fragmente definite dc ADN, RFLP, dup cum se
numete, i pemiite un nalt grad de discriminare a
unui locus. Dac dou probe provin din surse diferite,
RFLP permite diferenierea lor foarte exact. La
naltul grad al puterii de discriminare (Pd) al RFLP
contribuie dou aspecte. In primul rnd, pentru
analizele RFLP au fost stabilii mai muli loci; cu ct
se analizeaz mai muli loci, cu att ansa de a
identifica diferenele ntre doi indivizi este mai mare.
Laboratoarele de analiz ADN au acces, astzi, la
studiul a cel puin 15 loci. n al doilea rnd,
specialitii care folosesc aceast metod au ales acei
loci care prezint sute de variante n populaie, ceea
ce crete foarte mult probabilitatea ca probele
individuale s fie uor difereniate.

Cnd este complet, cu toate variantele

determinate, un locus RFLP are aspectul unui cod de
bare folosit pe ambalajele produselor puse n vnzare
ntr-un supermarket. Analiznd dou probe, se
compar modelul de benzi al fiecreia cu codul de
bare martor, ce conine toate variantele posibile
pentru locusul respectiv. Se poate, astfel, evidenia
foarte uor dac cele dou probe provin de la aceeai
surs sau nu. RFLP este o metod foarte bun pentru
a evidenia dac ntr-o singur prob exist ADN
provenit de la mai multe persoane. La citirea final
pot fi uor detectai ambii contributori.

RFLP prezint un dezavantaj serios pentru

investigaiile de medicin legal. Tehnica are nevoie
de ADN de bun calitate, spre deosebire de tehnicile
PCR, care pot folosi i ADN vechi, degradat i de
calitate limitat.

Este important s specificm c diferitele

laboratoare efectueaz determinri RFLP, ns cu
mici variaii. O asemenea variaie o reprezint
enzima de restricie folosit (bisturiul molecular
folosit pentru fragmentarea ADN). Dac se utilizeaz
diferite enzime, pot Fi analizai loci diferii, ceea ce
ofer date suplimentare. Dac ns acelai locus este
analizat cu diferite enzime, datele obinute nu sunt
identice pentru c enzimele pro< fragmente de ADN
diferite. Cele mai des utiliz enzime sunt Hinfl i
Hae111.
3.2. AMPLIFICAREA PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) est
tehnic prin care este posibil creterea cantit unei
seciuni specifice de AND existent ntr-o prc
Procedura este de mare actualitate, invcntatoru
primind premiul Nobel fn anul 1993. Dese* tehnica
PCR este denumit ca fiind o copiere Xe

molecular. In general tehnica permite copierea milioane de

exemplare, a unor fragmente scurte ADN, iar aceast
copiere se face cu foarte m fidelitate. Astfel, se poate,
obine informaia dini prob aflat n cantiti extrem
de mici sau care e foarte degradat.

Probele de ADN preparate prin tehnica P1 sunt

analizate n variate moduri, dar nu prin RF
Fragmentele de ADN generate prin RFLP sunt p mari
pentru a putea fi amplificate prin PCR. prezent,
pentru analizele ADN se folosesc loci c prezint
variabilitate n populaie. Avantajul tehn const, n
primul rnd, n faptul c poate folosi AJ n cantiti
foarte mici i de calitate slab

.4.

PRINCIPIILE GENERALE
ALE REACIEI DE
POLIMERIZARE
N LAN (PCR)

4.1 CONSIDERAII GENERALE

Principiul reaciei de polimerizare n lan
(PCR) se bazeaz pe posibilitatea reproducerii
fenomenului natural de replicare a ADN-ului n
eprubet. Acest proces de replicare, copiere, a
macromoleculelor informaionale de ADN se produce
n flecare celul nainte ca ea s se divid.

2
7

Moleculele de ADN sunt lanuri lungi,

neramificate, polimerice, formate din 4 tipuri de
subuniti. Subunitile sunt dezoxiribonucleotidele
care conin bazele azotate adenina (A), citozina (C),
guanina (G) i timina (T). Nucleotidele sunt legate
prin legturi fosfodiesterice dintre carbonul 5 al unei
dezoxiriboze i carbonul 3 al dezoxiribozei
urmtoare din lan. Molecula de ADN este format
din dou lanuri antiparalele care sui complementare
n ceea ce privete secvena de ba; deoarece
mperecherea bazelor din cele dou lanu se poate
realiza doar dup modelul A-T (T-A) i C G (G-C).

nainte ca o celul s se divid, ea trebuie s; i

produc o nou copie a informaiei genetic Astfel,
diviziunea celular este precedat de o fa; special a
2
8

ciclului vieii celulare, n care s sintetizeaz aceast

copie. Duplicarea informai implic copierea
moleculei lungi de ADN. Procesi de copiere fidel a
succesiunii de nucleotide di moleculele de ADN, deci
a informaiei genetice, i scopul transmiterii acesteia
de-a lungul generaiih celulare, se numete replicaia
ADN. Procesul, c fapt, o reacie de polimerizare, are
loc cu o rat c 500 de nucleotide/secund la bacterii i
de 5 nucleotide/secund la celulele de mamifer*
Enzimele de replicaie trebuie s fie foarte exac i
rapide. Viteza i acurateea sunt asigurate de main
replicativ complex.

Secvena de nucleotide a ADN-ului esi duplicat prin

mperecherea complementar de ba; (A-T sau T-A i
G-C sau C-G). Procesul presupur recunoaterea
2
9

fiecrui nucleotid i implic, n mc obligatoriu,

separarea tranzitorie a celor dou lanu
complementare ale dublului helix de AND, astfi ca
bazele azotate de pe un lan s apar expuspentru
mperechere. Replicaia este catalizat de o enzim de
polimerizare a nucleotidelor, descoperit n anul
1957, care a fost denumit AND-polimeraza.
Materia prim folosit de aceast enzim este
reprezentat de dezoxiribonucleotid-trifosfaii celor
patru baze azotate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), ei
fiind polimerizai ntr-un singur lan polinucleotidic
pe baza modelului catenei care are rol de matri.

ADN - polimeraza catalizeaz adiia treapt

cu treapt a dezoxiribonucleotidelor, la captul 3 al
unui lan polinucleotidic preexistent (lanul primer)
3
0

care se afl mperecheat la lanul matri. Astfel,

lanul nou sintetizat crete n direcia 5.
4.2 PROTOCOLUL PCR
Principiul care st la baza reaciei de
polimerizare n lan const n posibilitatea obinerii in
vitro (n eprubet) a replicrii ADN, conform
mecanismului existent n condiii naturale n toate
celulele vii. Pentru ca aceast reacie complex s se
desfoare n condiii artificiale este necesar s
asigurm existena n mediul de reacie a tuturor
ingredientelor necesare. Aceste ingrediente sunt:

3
1

 un mediu de reacie format dintr-o soluie

tamponat cu un pH i o concentraie ionic bine
definit;

molecule dublucutanare de ADN matri;

3
2

 molecule de ADN-primer care au rolul a

asigura iniierea replicrii;

cele patru dezoxiribonucleotide (dA dCTP,

dGTP, dTTp);

3
3

 ADN - polimeraz.

3
4

In principiu, reacia se desfoar n trei eta Denaturarea.

Declanarea reaciei replicare presupune, n primul
rnd, desface moleculei dublucutanare de ADN
matri n c dou catene complementare. Acest
proces numete denaturare i se desfoar la
temperatur de 94C. n aceste condiii, soli conine
dou catene complementare de ADN cror secven
de baze azotate se afl nscrii secvena de interes
care urmeaz a fi amplificai Ataarea primerilor.
AND-polimen iniiaz replicarea doar dac i se ofer
o seu secven dc ADN dublu-catenar. Pentru aceai
soluia conine dou categorii de probe genetii
numite primeri, reprezentate de secvene scurte 20-30
de nucleotide, sintetizate artificial, care si
complementare cu o secven care marchei nceputul
informaiei de pe cele dou catene mai ce trebuie
amplificate. Astfel, primerii identif regiunile de pe
ADN-matri pentru care au f sintetizai i se leag la
acestea. Ataarea primeri nu se poate face, ns, la
temperatura denaturde aceea temperatura trebuie
sczut la o valoare cuprins ntre 40-60C.

Extensia. Dup ce primerii s-au asociat la

secvenele complementare de pe cele dou catene ale
ADN-matri, ADN-polimeraza poate ncepe
replicarea. Polimeraza ncepe acest proces la captul
3 al primerilor, adugnd nucleotid cu nucleotid
pn a convertit lanul monocatenar ntr- unul
dublucatenar. Procesul se numete extensie. Punctul
start i orientarea replicrii sunt determinate de
primeri.

Acest ciclu format din cele trei etape

(denaturarea, asocierea primerilor i extensia), poate
fi repetat de mai multe ori n aceeai soluie.
Secvenele de ADN nou sintetizate vor constitui
matriele pentru urmtorul ciclu. Fiecare nou ciclu
dubleaz cantitatea de ADN. Un ciclu produce 2

copii, apoi 4, 8, 16, 32, 64, 128 i aa mai departe.

Pentru obinerea unui milion de copii sunt necesare
aproximativ 25 de cicluri.

Deoarece metoda de amplificare se desfoar

n cicluri repetate, ea poate fi autorizat. In
ncercrile de automatizare, un impediment major l-a
constituit folosirea polimerazei de la bacteria
Escherichia coli. Dezavantajul folosirii acestei
polimeraze const n faptul c, la fel ca majoritatea
celorlalte enzime, ea funcioneaz la temperatur de
37 C. ns, conform principiului prezentat mai sus,
amestecul de reacie este expus la temperatur mari
(94 C) necesare denaturrii, ceea ce produci
degradarea enzimei. Aceasta nseamn c reaci n
lan este ntrerupt la fiecare ciclu, trebuind s se
adauge polimeraz proaspt. Pentru a se evit acest
neajuns, s-a introdus n tehnica automatizat o
polimeraz termorezistent, izolat de la o bacteri
care triete n apele termale (Termus aquaticus\ deci
la o temperatur mult superioar cele fiziologice.
Temperatura optim pentru activitate polimerazei de
Termus aquaticus (numit polimeraz Taq) este de 72
C. Utilizarea acest polimeraze a permis
automatizarea tehnnicii PCI Astfel, ciclurile reaciei
se succed n aceia: recipient i procesul nu trebuie
ntrerupt penti adugarea de polimeraz proaspt.
Reacia s desfoar ntr-un aparat care modific cicf
temperaturile necesare pentru cele trei etape a reaciei
(termal cycler). Aparatul nclze amestecul de
3
8

reacie la 94 C pentru a produ< denaturarea ADNului dublu-catenar, o rcete o temperatur cuprins

ntre 40-60 C penti ataarea primerilor i
renclzete soluia la 1\ C, pentru a declana reacia
de extensie cataliza de polimeraz Taq.

Un ciclu dureaz mai puin de trei minul astfel

c intr-o or se obin aproximativ un mili< de copii
de ADN n acelai amestec de reacie.

3
9

Principalele avantaje ale tehnicii PCR sunt:

simplitatea, sensibilitatea i specificitatea.

Automatizarea a simplificat la maximum

reacia de replicare a ADN in vitro. Pentru realizarea
amplificrii unui segment de ADN prin tehnica
clasic, se folosesc microorganisme n care se inser
plamide recombinate care conin fragmentul de
interes ce urmeaz a fl amplificat. Pentru obinerea
unor cantiti suficiente de secvene ADN este
necesar folosirea tehnicilor de culturi bacteriene
care sunt mai costisitoare, necesit un volum mare de
lucru i timp. n plus, purificarea fragmentelor de
interes din materialul genetic al bacteriei sunt foarte
laborioase.

4
0

Metoda PCR este foarte sensibil, practic

amplificarea poate avea ca origine o singur
molecul de AND-matri. De asemenea, se pot
folosi chiar i probe contaminate sau parial
degradate, cu condiia, bineneles, ca segmentul de
ADN de interes s fie intact.

Specificitatea metodei poate fi controlat prin

selecia riguroas a temperaturii de ataare a
primerilor. n principiu, reacia se deruleaz doar
dac primerii s-au ataat la AND -ul monocatenar, cu
alte cuvinte, numai dac polimeraza i gsete
segmentul de strat dublucatenar. Ataarea primerilor
se face la o temperatur optim, n funcie de
lungimea i secvena n baze a acestora. Dac
temperatura este prea mic, primerii nu se leaj
4
1

suficient, ei atandu-se i la secvene care nu sunt

perfect complementare. Prin gsin temperaturii
optime de ataare, specificitatea poa fi crescut la
maximum, astfel nct ea s nu : realizeze chiar dac
secvena int difer printr-i singur nucleotid.
4.3 SEMNIFICAIA INTRODUCERII

TEHNICII PCR N
DOMENIUL BIOMEDICAL
Aplicabilitatea metodei de sintez a AND-ul
prin reacia de polimerizare n lan este aproa
nelimitat. In cercetarea fundamental din domeni
4
2

geneticii moleculare, tehnica PCR este folosi pentru

decodificarea, compararea i modificri informaiei
genetice. Ne vom referi n continua numai la dou
exemple.

Cu aproximativ 10 ani n urm, a fost inii pe

plan internaional un proiect amplu de descifra a
genomului uman, numit Human Genome Proje>
(HUGO).

4
3

Prima etap a acestui proiect const i

descifrarea i alctuirea hriigenetice umane, c
alte cuvinte, n determinarea secvenei i iocalizr
genelor umane, al cror numr total a fost estim ca
fiind de ordinul a 50.000 - 100.000. Aceas presupune,
n primul rnd, determinarea secvenei, baz cu baz.
Volumul de munc pentru aceasta este enorm dac se
folosesc metodele clasice. Tehnica PCR scurteaz
considerabil acest proiect, deoarece prin folosirea sa
este posibil amplificarea unei regiuni specifice din
ADN ntr-un timp foarte scurt. Prin obinerea unei
cantiti relativ mari de secvene identice se poate
apoi realiza secvenierea precis a acestora.

PCR se utilizeaz, de asemenea, n

mutageneza experimental, pentru producerea de
4
4

muiaii punctiforme, adic de modificare a unei

singure perechi de baze din secvena de ADN luat n
studiu. De exemplu, asemenea mutaii punctiforme
sunt foarte utile pentru elucidarea corelaiei dintre
structura i funciile proteinelor naturale. Dei uneori
este cunoscut secvena exact de baze care codific
o protein i, deci, i secvena de aminoacizi a
proteinei respective, acest fapt nu d informaii
suficient de amnunite cu privire la relaia dintre
structura acestei proteine i funciile sale. Dac, ns,
gena pentru proteina respectiv a suferit o mutaie, ea
va produce o protein anormal, a crei structur este
diferit de cea a proteinei naturale. Tehnica PCR
permite producerea mutaiilor punctiforme. Pentru
aceasta nu este necesar dect sinteza UHr primeri
care s conin n secvena lor de ba2e modificarea
dorit. Se stabilete, apoi, o temperatur mai sczut
pentn ataarea primerilor. Temperatura mai sczui
permite hibridizarea primerilor cu o specificiti mai
mic, adic la secvene la car< complementaritatea
bazelor nu este absolut identic Aceste mici erori
de recunoatere a secvene corecte sunt tolerate de
temperaturile mai sczute O asemenea secven
dublucatenar de star declaneaz reacia de
polimerizare n lan producnd fragmente de ADN
(gene) care conii primeri modificai, astfel c
mutaia punctiformi este amplificat. Dac genele
modificate s< insereaz n bacterii, acestea din urm
4
5

vor produc proteina modificat, deoarece au primit

informaii greit. Astfel, se poate studia efectul
mutaie asupra funciei acestei proteine.

4
6

Tehnica PCR a fost rapid acceptat r cercetrile aplicate din

medicin, inclusiv pentn diagnostic. Cu ajutorul
reaciei de polimerizare r lan pot fi diagnosticate o
serie de infecii virale bacteriene, parazitare sau
fungice. La oricare dir aceste microorganisme trebuie
cunoscut o secven specific de informaie genetic,
secven care ni1 este prezent n genomul uman.
Secvena poate f detectat cu ajutorul primerilor
sintetizai special pentru ea i apoi poate fi
amplificat prin reacia de polimerizare n lan. n
urma amplificrii PCR, secvena de ADN specific
agentului patogen,sintetizat n milioane de copii, se
evideniaz uor, dei aceasta se afl iniial n cantiti
infime n organismul infectat. Pn nu demult,
prezena unui agent patogen n mediile interne ale
organismului a putut fi detectat doar prin metode
imunologice, adic prin determinarea anticorpilor
sintetizai de sistemul imun mpotriva agentului
strin. Rspunsul imun apare ns doar dup ce
infecia a proliferat suficient pentru a produce
stimularea celulelor imunologice. Prin tehnica PCR,
prezena virusului sau a bacteriei poate fi detectat
practic i atunci cnd reacia imun nu s-a declanat
nc.

Un exemplu bun pentru a demonstra utilitatea

metodei PCR este idetificarea precoce a infeciei cu
virusul HIV 1. Acest virus poate exista mult timp n
leucocite, n form latent, fr a declana boala.
Testele SIDA clasice evideniaz prezena virusului
doar pe baza detectrii anticorpilor. ntre momentul
infeciei i posibilitatea determinrii anticorpilor
virali pot trece sptmni sau chiar luni. n acest
interval de timp testul convenional imunologic,
pentru persoanele infectate, este negativ. Detectarea
timpurie a infeciei este ns foarte important
deoarece persoanele infectate cu HIV, fr ca s aib
cunotin de aceasta, pot transmite virusul la alte
persoane sntoase.
,

Testul SIDA bazat pe metoda PCR (de exemplu

cel elaborat de firma Roche) poate detecta virusul
HIV ntr-o singur celul infectat d

10.0 de leucocite, stadiu n care teste

imunologice
sunt
negative.
El
este
comercializat s form de kituri standardizate,
este rapid i foai sensibil, fiind foarte util, de
exemplu, pent detectarea virusului la nounscuii a cror mar este HIV pozitiv. n acest
caz, este tiut c placer este permeabil pentru
anticorpii anti HIV, iar no nscutul poate da
reacie pozitiv din cau: anticorpilor materni,
dei este posibil ca el s 1 fie purttor de virus.
4
9

Testul este efectuat cu ADN extras d leucoc'te

obinute dintr-o prob de snge (dac avut loc infecia
cu virus HIV, aceste celule con ADN-ul viral inserat
n genomul propriu). ADN- purificat se introduce n
aparatul PCR (therm cycler) mpreun cu mixtura
complet de reaci Dac secvena specific pentru
ADN viral es prezent, se declaneaz reacia de
polimcrizare cicluri succesive, pn la obinerea a
aproximat 100 milioane de copii. Dup amplificare,
ADN vir trebuie identificat. Majoritatea testeb
convenionale folosesc izotopi radioactivi ca
marcheaz specific moleculele de ADN vira Deoarece
aceast procedur necesit o dota: special, dei este
foarte sensibil, a fost nlocui astzi cu o metod ce
utilizeaz marke neradioactivi care dau o reacie de
culoare.

5
0

Un alt exemplu, privind valoarea tehnicii PCR

n medicin, este diagnosticul tuberculozei. Tehnica
obinuit presupune identificarea agentului patogen
{Mycobacterium tuberculosis) prin microscopie i
executarea culturilor pentru acest microorganism.
Procedeul este de lung durat (3-4 sptmni), ceea

A.

ce constituie un dezavantaj serios. In plus, exist pacieni la

care nu se manifest simptomele caracteristice ce
sugereaz tuberculoza i de aceea, pn la
identificarea bacilului Koch, ei trebuie s urmeze
preventiv un tratament cu antibiotice, dei agentul
patogen nu a fost identificat. Toate aceste probleme
de diagnostic pot fi rezolvate, prin folosirea tehnicii
5
1

PCR, n cteva ore.

Pentru demonstrarea prin tehnica PCR a bolilor

ereditare, gena mutanta responsabil pentru o anumit
boal ereditar este amplificat. Apoi, secvena de
baze a fragmentelor de ADN sintetizate este
comparat cu secvena aceleiai gene provenite de la
indivizi sntoi. Materialul biologic folosit pentru
iniierea reaciei poate fi sngele sau orice alt esut,
deoarece defectul genetic se afl n toate celulele
bolnavului. Singurul lucru care trebuie cunoscut este
localizarea precis i tipul modificrii genetice pentru
a fi posibil sinteza primerilor corespunztori. Astzi,
se cunosc aproximativ 4.000 de boli genetice cauzate
de mutaia unei singure gene. 400 au fost Elucidate
biochimic i doar aproximativ 100 sunt cunoscute i
5
2

n termenii geneticii moleculare. Pe msur ce su:

caracterizate noi boli genetice, va fi posibil
diagnosticarea lor prin PCR, iar cercetarea n ace
domeniu este foarte intens astzi (vezi proiect
HUGO).

Prima boal diagnosticat cu tehnica PCR fost

anemia cu hematii n secer (sikle ce anemia).
Alte boli genetice care pot diagnosticate, astzi, cu
reacia polimerizrii n lai sunt: hemofilia, fibroza
cistic, distrofia muscula]

5
3

i o form ereditar de leucemie.

Un exemplu particular al aplicabilit

5
4

tehnologiei PCR este diagnosticul prenatal s bolilor

ereditare. Specialitii pot realiza aceasi prin utilizarea
unui numr mic de celule di lichidul amniotic, celule
care sunt de provenienj fetal. Acest diagnostic se
practic la femeii nsrcinate care prezint un risc
crescut, cum ar cele cu sarcin la o vrst de peste 35
de ani sau 1 cele care provin din familii n care este
prezent boal ereditar. Tehnica clasic presupun
cultivarea celulelor fetale i evidenierea bol genetice
prin microscopie. Aceasta nu permit ns, dect
identificarea afeciunilor n care sur implicate
fragmente mari de ADN. Tehnica PCI a crescut foarte
mult sensibilitatea acestor metod pentru a permite
identificarea mutaiilo punctiforme, n care este
implicat modiifteare unei singure perechi de baze.

5
5

Probabil c n nici o boal diagnosticul precoce

nu este att de important ca n cancer. Majoritatea
formelor de cancer nu pot fi detectate ns dect n
momentul n care s-a dezvoltat tumora. De cele mai
multe ori acest moment este ns tardiv. S-a semnalat
c unele forme de cancer debuteaz cu modificri ale
informaiei genetice, aceasta fiind cauza care
determin proliferarea necontrolat a celulelor
afectate. Este cazul, de exemplu, al leucemiilor,
cancerului pulmonar, de colon i cancerului de sn.
Perioada dintre apariia modificrii genetice i
manifestarea clinic a bolii poate fi uneori foarte
ndelungat (pn la cinci ani n cancerul de colon). n
acest domeniu se ntreprind, astzi, cercetri foarte
intense. Odat modificarea genetic elucidat,
diagnosticul precoce al formei respective de cancer
devine posibil prin identificarea acestei modificri
prin tehnica PCR.

5
6

Tehnica PCR este foarte util astzi n

transplantul de organe pentru studiul complexelor
HLA implicate n fenomenul de reacie. Aceste
complexe difer de la un individ la altul, iar succesul
ujui transplant de organ depinde de multe ori de
compatibilitatea complexelor HLA de la donator i de
la primitor. Cu ct sistemul de antigene HLA este mai
asemntor, cu att ansa succesului unui transplant
este mai mare. Testele PCR standardizate, accesibile
comercial, permit detectarea secvenelor specifice de
HLA. Prin compararea acestor secver amplificate,
provenite de la donator i de la recept se poate stabili
cu exactitate compatibilitat

esuturilor la doi subieci.

5
7

In medicina legal, tehnica PCR este extre de

valoroas pentru probarea vinoviei s; nevinoviei
unui suspect. O pictur de sng cteva fire de pr sau
fragmente de esuturi preleva de la locul crimei pot
constitui o prob biologi* extrem de valoroas pentru
stabilirea amprent genetice a presupusului infractor.
ADN-ul extr: din asemenea probe poate fi amplificat
prin reac polimerizrii n lan i analizat. Identificri
provenienei acestui ADN se bazeaz pe analii unor
secvene ale acestuia care sunt foarte variabi n
populaie i virtual, nu pot fi identice la d< indivizi.
Pentru aceasta se pot analiza complexei de gene HLA
sau secvenele de ADN repetitiv, cror lungime difer
de la un individ la altul. Dac asemenea secvene de
ADN de origine necunoscut sunt comparate cu cele
ale unui subiect cunoscu rezultatul este ntotdeauna
neechivoc. Se poat stabili j astfel cu mare certitudine
dac prob biologic provine de la acest subiect sau
nu. Metod este foarte util i n testele de paternitate,
deoarece de exemplu, genele HLA se transmit pe baza
legilo ereditii. Identificarea i compararea acesto
secvene probeaz cu exactitate descendena patern;
sau matern a unui copil.

5
8

5 .RECOLTAREA I
CONSERVAREA PROBELOR
5.1 PROBE BIOLOGICE CARE
CONSTITUIE SURSE DE AND
Dup ce o prob bilogic a fost recoltat, ca
trebuie transportat n laborator. Acest fapt nu este
att de banal pe ct pare. Condiiile n care exist
moleculele biologice n organism sunt foarte strict
controlate i specifice. Din momeniul n care
materialul biologic ajunge n afara organismului, el se
afl ntr-un mediu strin i ncepe s se modifice.
AND-ul este foarte strns mpachetat n momentul
cromozomii celulari; despachetat, fiecare cromozom
are o lungime de aproape un

5
9

.A

metru. In afara mediului lor natural, protejate, aceste

molecule foarte lungi pot fi deosebit de fragile. ANDul este, astfel, supus degradrilor, fiind rupt n
fragmente mai mici, iar aceast degradare poate avea
efect asupra posibilitii de obinere a rezultatelor
utile pentru tipizarea ADN, n particular prin tehnica
RFLP. Cu ct degradarea este ma accentuat, cu att
fragmentele devin mai scurte Astfel, lungimea unui
fragment degradat poate fi mai mic dect lungimea
unui locus RFLP. De exemplu, mrimea fragmentelor
unui locus RFLP particular poate fi mai mare de
20.000 baze perechi (bp). Dac mrimea moleculelor
de ADN dintr-o prob este de 10.000 bp, nu se pot
detecta benzi pentru molecule mai mari i astfel
analiza este compromis.

6
0

Factorii implicai n degradarea ADN cuprind:

timpul, temperatura, umiditatea, lumina (att cea
vizibil, ct i UV), precum i contaminarea chimic
i biologic. Combinaii variate ale acestor factori pot
s apar n mediu. Pentru determinarea efectelor
acestor condiii, au fost ntreprinse numeroase studii
care au demonstrat, cu puine excepii, tendina
principal de degradare a probelor n fragmente mai
mici.

O important concluzie a acestor cercetri este

aceea c factorii de mediu nu modific moleculele de
ADN dintr-un tip, n alt tip; cu alte cuvinte, mrimea
unui fragment RFLP din orice locus nu se poate
modifica de la 7000 la 4000 bp, sau tipul HLA DQ&
nu se schimb din forma 1.1. n forma 1.2. Adic,
6
1

degradarea doar modific AND-ul dintr-o prob care

poate fi tipizat, ntr-o prob care nu mai poate fi
tipizat. Aceast problem consituie o parte foarte
important n validarea oricrui sistem de tipizare
genetic, n sensul c o component biologic a
sistemului s nu produc rezultate pozitive false. Cu
alte cuvinte, din cauz c un profil nu se poate
modifica n alt profil, nu exist pericolul ca n urma
degradrii s se produc un model complet nou de
ADN. Se spune, n acest sens, c sistemul este robust.
Degradarea poate limita utilitatea tipizrii AND, dar
nu o poate invalida, ceea ce constituie un avantaj
considerabil al acestor tehnici.

O serie de studii au artat, de asemenea, c

ADN este mult mai stabil dect markerii genetici
6
2

convenionali utilizai n medicina legal. Proteinele

convenionale i markerii enzimatici se degradeaz
ntr-o perioad de 2-3 luni, iar ADN, n condiii de
mediu normale, rmne stabil i tipizabil timp de ani
de zile. Acest fapt este important mai ales pentru
sistemele PCR, care pot tolera un grad mare de
degradare. O atenie special trebuie ns acordat
situaiei n care este identificat o singur allel a
unui locus particular, care de obicei posed cel mai
frecvent dou allele. n aceste situaii se pune*
ntrebarea dac proba provine de la un homozigot
adevrat sau allela evideniat provine de la un
heterozigot la care una din allele este degradat.
Explicaia celei de-a dou situaii poate fi gsit n
faptul c degradarea a survenit doar n cazul allelei

6
3

mai mari, iar allela mai mic este intact. Ace

este unul din motivele pentru care este importa
determinarea calitii probei, pentru interpreta
corect a rezultatelor.

Un scop important n colectarea i

prezerva probelor biologice, este oprirea,
blocarea procesi degradativ i limitarea
degradrilor ulterioare, general, procesele
biologice sunt ncetinite p scderea temperaturii
i prin deshidratare. De ace prima sarcin a
investigatorului este aceea d deshidrata proba i
de a conserva la rece ct r repede posibil.
5.1.1 CONTA MINAREA

6
4

La fel de important ca procesul de prezerv

a integritii probelor este i luarea n considen a
unei posibile contaminri care poate interfera
rezultatul n cadrul analizei. Exist mai multe tip
de contaminare, iar efectul final asupra probe
difer. Contaminrile ne-biologicc (de ex. colora
spunuri sau alte chimicale) pot afecta pro
interfernd cu rezultatele n procedurile analitk

Contaminrile biologice neumane si

produse de materiale fiziologice i/sau ADN de
alte organisme. Dei tipizarea ncruciat e
observat ocazional n anumite sisteme, aceasta
se interfereaz cu interpretarea final a rezultate)
O atenie special trebuie acordat contaminrii

6
5

microorganisme. Probele folosite n medicina legal, cum

sunt sngele i sperma, reprezint un mediu fertil
pentru dezvoltarea bacteriilor i ciupercilor
unicelulare.
In
timpul
creterii,
aceste
microorganisme secret substane biochimice care pot
degrada ADN-ul uman din prob. Chiar i n aceast
situaie, eventual ADN-ul nu poate fi folosit pentru
tipizare, dar nu se transform ntr-un alt tip. AND-ul
degradat parial trebuie interpretat cu foarte mare
atenie de un specialist calificat; dac proba este de
calitate slab, i exist posibilitatea ca o parte a
determinrii s fie obscur, cea mai recomandabil
concluzie a determinrii este relevana.

Cel mai semnificativ tip de contaminare este

cea care provine de la o surs uman. n acest sens,
6
6

contaminarea este definit, fiind determinat de

adugarea inadverten a unui material fiziologic /
ADN individual pe parcursul colectrii probei. Este
important s facem distincia dintre proba
amestecat i o prob contaminat. O prob
amestecat este aceea care conine ADN de la mai
muli indivizi, amestecare ce s-a produs nainte sau n
timpul producerii crimei. Proba contaminat este
aceea n care materialul a fost contaminat n cursul
colectrii, prezervrii, manipulrii sau analizei.
Precauiile necesare pentru determinarea posibilitii
ca un al doilea tip de ADN s fie detectat, depind de
tipul de teste implicate. De exemplu, n testele PCR,
n care ADN din probe este copiat n milioane de
probe, precauiile trebuii s fie mult mai mari dect n
cazul RFLP. Aceast; face ca n testele PCR s fie mult
mai probabil a si detecta urme de ADN de alt tip
dect al sursei.

6
7

Dei de rutin, precauiile trebuie ntotdeaun;

luate n considerare, n realitate materialul umai strin
nu interfer att de uor cu cel din prob Aceasta se
ntmpl din cauz c ADN nu s< disemineaz liber
prin atmosfer, iar celulele car< sunt eliminate de
ctre o persoan sunt relativ puin la numr i nu pot
conine ADN strin. Aceasta ni nseamn c nu
trebuie luate precauii pentri evitarea contaminrii.

Dup ce probele au fost deshidratate

refrigerate, ele pot fi contaminate de alte probe daci
prelucrrile se fac n acelai timp. Aceasta se poat<
ntmpla dac gradul de calificare, antrenament
meticulozitate a analistului nu este corespunztor S-a
constatat c cel mai grav motiv pentru care s( dau
rezultate incorecte n tipizarea ADN est< schimbarea
6
8

probelor ntre ele de ctre analist.

5.1.2 COLECTAREA PROBELOR
Exist, n general, dou metode de colectri a
probelor destinate analizelor n laborator: (1
colectarea direct a urmelor, sau (2) transferu urmelor
pe un substrat mai bun sau mai uo: manevrabil.

Este preferat ntotdeauna prima metod

pentru c aceasta nu presupune pierderi prin
manipulare i se bazeaz pe prelevarea probei,
mpachetarea ei n mod corespunztor i transportul
acesteia n laborator pentru conservare i analiz. Este
cea mai potrivit pentru probele depuse pe haine sau
pe orice alt material, care poate fi introdus ntr-o cutie
6
9

sau pung. ndeprtarea de pe suport este lsat pe

seama analistului, care se afl ntr-o situaie mult mai
bun pentru a evalua i a procesa corect proba.

A doua metod const n a transfera materialul

biologic pe un substrat mai bun (de ex. transferul unei
picturi de snge de pe asfalt pe un tampon de vat).
Aceasta implic fe rzuirea probei cu un sclapel steril
sau un forceps, fie rehidratarea probei cu ap sau
soluie fiziologic i apoi absobia ei pe un tampon de
vat. Rzuirea nu implic rehidratarea probei i prin
urmare, este mai puin probabil degradarea acesteia.
Totui aceast modalitate presupune pierderea unei
pri din prob. Rehidratarea i transferul pe un
substrat de vat are avantajul c micoreaz cantitatea
de prob ce se poate pierde i permite prelucrarea mai
7
0

uoar n laborator. Totui, dezavantajul const n

faptul c n prob se introduce o soluie, care trebuie

7
1

ndeprtat ct de repede posibil. In mod uzual aceasta se

face prin introducerea suportului cu probantr-o
eprubet deschis, ceea ce permite uscar rapid. Dac
proba este lsat umed mai mult tim atunci procesele
degradai ve se accelereaz.

Fiecare din aceste metode i are utilizri sale i

alegerea uneia sau alteia depinde de opium
investigatorului. Ambele sunt utile dac su aplicate
corect.

Amintim cteva indicaii generale cu privi la

modul de recoltare, ambalare i trimitere probelor
ADN la laboratoarele de specialitate :

din cauza marii sensibiliti a probei

biologice la condiiile de mediu (umezeal, cldui
mucegaiuri) i la trecerea timpului, prelevarea
transportarea trebuie s aib loc ct mai rapid;

 se evit ambalarea suporturilor purttoa de

probe biologice n pungi de plastic;

fiecare suport se ambaleaz separat n hrl

alb, cu etichet, pe care se specific coninut
ambalajului i locul din care a fost prelevat prob

 adresa care nsoete coletul va preci;

laboratorul destinat examinrii, data prelevr
condiiile n care s-a produs infraciunea, ntrebri la
care trebuie s rspund expertul de laboratt Organul
de anchet trebuie s formuleze ntrebri nc de la
nceput clar i concret, deoarece probe sunt de regul
n cantiti mici, uor i rap degradabile, nct
problemelor ridicare ulterior 1 i se mai poate da
rspuns.

Urmele biologice ce conin AND ( snge,

sperm, fir de pr, oase etc.) se pot gsi pe suporturi
conservante sau neabsorbante ( metal, lemn lcuit,
materiale plastice etc. ) i absorbante sau
neconservante (textile, pmnt, tencuial, crmid
etc.)

Toate probele, indiferent pe ce suport se gsesc,

se ridic i se conserv dup toate regulile
criminalistice cunoscute, inndu-se cont de cele
expuse mai sus.

n continuare vom reda normele internaionale

de recoltare, conservare i trimitere a probelor
( dovezilor ) biologice n vederea analizrii ADN.
I. INTRODUCERE
Exist sute de varieti de doVezi fizice care
sunt aduse la laboratoarele de medicin legal de ctre
organele juridice. Dovezile care ar putea fi supuse
analizei ADN n general sunt limitate la produse

biologice.

Prezentm n continuare o list de materiale

biologice din cae ADN a fost izolat i analizat:

 snge pete de snge:

sperm i pete de sperm;

 esuturi i celule;

oase i organe;

 pr cu foliculi;

urin i saliv ( cu celule nucleate );

Alte materiale biologice cum sunt lacrimile

transpiraia, serul, materiale iar celule nucleate ni pot fi

supuse analizei ADN.
II. MODALITATEA PRIN CARE

DOVEZILE BIOLOGICE AU FOST

TRANSFERATE
Tipurile de dovezi biologice, enumerate mai
sus, pot fi folosite pentru a conecta o persoan de alta,
de un obiect, sau de un loc. Acestea pot fi, de
asemenea, folosite pentru a asocia sau a disocia c
persoan cu o crim. Dovezile biologice sunt r
general transferate prin una sau dou modaliti
(direct sau secundar).
A. Depozitarea direct
Sngele, sperma, esuturile, oasele, prul, urina
i saliva, pot fi transferate de pe corpul sau hainele
unei persoane sau de pe obiecte de la locul faptei.
Dup ce materialele biologice au fosl depozitate, ele
devin pete i ader la o suprafa sau la un substrat.
Dovezile biologice care nu sunt lichide, cum ar fi
esuturi, oase sau pr, pot fi de asemenea transferate
prin contact direct i depozitate. Transferul i
depozitarea direct pot fi ntlnite n una din
urmtoarele situaii:

 ADN suspectului, depozitat pe victim (corp

sau haine);

ADN suspectului, depozitat pe un obiect;

 ADN suspectului, gsit la locul faptei;

ADN victimei, depozitat pe suspect (corp

sau mbrcminte);

 ADN victimei, depozitat pe un obiect;

ADN victimei, aflat la locul faptei;

ADN martorilor, aflat pe victim sau pe

suspect;

 ADN martorilor, aflat pe un obiect;

ADN martorilor, aflat la locul faptei.
B. Transferul secundar
Sngele, sperma, esuturile, prul sau urina pot
fi transferate de pe victim, suspect, martor, obiect,
sau de la locul faptei printr-un mediu intermediar. n
cadrul transferului secundar nu exist contact direct
ntre sursa original (donor de ADN) i suprafaa
int. Transferul intermediar ar putea fi o persoan sau
un obiect. Transferul secundar nu furnizeaz dovezi
pozitive despre legtura direct a unui individ cu
crima.

III. RECOLTAREA I CONSERVAREA

DOVEZILOR BIOLOGICE
Capacitatea de a efectua analize succesi de
ADN din dovezile biologice de la locul fapt depinde
foarte mult de tipul de material biolog i de felul n
care acesta a fost conservat. Astft tehnica folosit
pentru a recolta asemem dovezi, cantitatea i tipul
materialului biolog care trebuie recoltat, modalitatea
prin ca materialul trebuie mpachetat i modul <
conservare al acestuia reprezint puncte sensibile ale
programului medico-legal de testa a AND-ului. Pe de
o parte, dac material biologic nu este recoltat corect,
activitatea biologic se poate pierde, i nu va ndepli
condiiile tiinifice i legale pentru a fi adir n justiie.
Pe de alt parte, dac acesta nu es corect furnizat,
originea sa poate fi pus si semnul ntrebrii, deoarece
fiind transport incorect, poate aprea contaminarea
secundai In cazul n care, materialul biologic cu ADN
i este conservat corect, acesta poate s deterioreze.
Toate aceste efecte vor afecta seri analiza ADN.

Prezentm n continuare un ghid pent furnizarea, transportul

i conservarea dovezilor AD

A. Ghid pentru furnizarea dovezilor ADN

Fazele iniiale ale examinrii dovezilor fizice
presupun activiti care se desfoar att la locul
faptei, ct i n laboratoarele de medicin legal. n
medicina legal, documentarea este important din
dou puncte de vedere : tiinific i legal.

Nu trebuie deteriorat nimic pn cnd poziia

sa iniial nu a fost nregistrat.

Sunt valabile cteva modaliti diferite de

furnizare. In general, se recomand folosirea mai multor

metode. Fiecare pies major a dovezilor trebuie
nregistrat.
1. Dovezi la locul faptei
1. Fotografierea i filmarea dovezilor nainte
de a fi atinse, deplasate sau recoltate;

2. Observarea poziiei i condiiilor n care

se afl dovezile;

3. Observarea i schiarea distanelor dintre

dovezi i alte obiecte de la locul faptei;

4. Observarea i schiarea condiiilor dovezilor

biologice.
2. Dovezi la laboratorul de medicin legal
1. Observarea
sigilrii probelor;

mpachetrii

etichetrii

2. Pachetul iniial cu mrci unice de

I '

identificare, numrul cazului i data;

3. Verificarea numrului i compararea c\

forma admis pentru a se asigura c a fost primi
articolul corect;

4. Observarea,
articolului primit;

schiarea

fotografiere

5. Verificarea articolului dac ndeplineti

condiiile de admitere i dac descrierea lui est<
corect;

6. Fotografierea, schiarea i notare; localizrii

dovezilor biologice nainte d< eantionare;

7. Dac a fost efectuat o testare preliminar se

va nregistra felul testului i rezultatele obinute
ntotdeauna trebuie purtate mnui pentru a preven
contaminarea.
B. Recoltarea, transportul
i conservarea dovezilor
Dup ce dovada biologic a fost transferat
direct sau secundar, aceasta va rmne pe suprafa;

inut prin absorbie sau prin aderen. In general

materialele biologice lichide vor fi absorbite iar cel
solide vor adera. Metoda de recoltare depinde d starea
n care se afl materialul biologic. Prezentr n
continuare cteva noiuni generale despr recoltarea
dovezilor biologice pentru analiza ADTS

t. Snge i pete de snge

Eantioanele de snge lichid

Snge de la o persoan
1. Sngele lichid de la o persoan trebuie
recoltat de personal medical calificat;

2. Se recolteaz n dou eprubete dc cte 5 ml.

Fiecare, folosind EDTA ca anticoagulant;

3. Fiecare eprubet trebuie etichetat cu data,

ora, numele persoanei, numele celui care recolteaz,
numrul cazului i numrul de expunere;

4. Probele de snge se introduc n frigider (nu

ngheate) i trebuie date n lucru ct mai curnd
posibil.
Snge lichid de la locul faptei
1. Sngele lichid se recolteaz cu o sering
curat (de preferin steril) sau cu o pipet i se
transfer ntr-o eprubet curat (de preferin steril);

2. Un cheag de snge poate fi transferat ntr- o

eprubet curat cu spatul curat;

3. O bucat de bumbac curat poate fi folosit

pentru a absorbi sngele lichid sau cheagul de snge;

4. Eantioanele vor fi etichetate cu numrul

cazului, numrul articolului, data ora i numele celui
care recolteaz;

Dac sunt recoltate eantioane de snge uscat, acestea

trebuie s fie conservate pe unanticoagulant, pstrate
la frigider i aduse ct m curnd posibil la laborator.
Eantioane de snge lichid
din zpad sau din ap
1. Eantioanele de snge gsite pe zpad s< n
ap trebuie recoltate imediat, pentru a preve diluarea;

2. Se recolteaz o cantitate ct mai mare, d

aceste eantioane, ntr-un recipient curat, pentru
preveni contaminarea;

3. Eantioanele se eticheteaz aa cum s artat

anterior;

4. Se nghea;

5. Se aduc la laborator ct mai curnd posib

Pete de snge umede
mbrcmintea cu pete de snge umede
*

1. mbrcmintea care are pete de sn umede

trebuie pus pe o suprafa curat i lsa s se usuce;.

2. Aceasta nu va fi niciodat pus ntr-un

plastic sau ntr-un recipient nchis ermetic;

SJ

de

3. Lucrul
acesta
ar
putea
determir
contaminarea si nmulirea bacteriilor i implic
deteriorarea probei;,

4. Dup ce mbrcmintea i petele s-au usc

trebuie mpachetate ntr-un recipient de hrtie ca va fi
etichetat corect.

Obiecte cu pete de snge umede

1. Obiectele mici cu pete de snge umede
trebuie uscate i apoi recoltate;.

2. Trebuie pstrat integritatea petelor de

snge n timpul mpachetrii i transportului;.

3. Ta locul faptei pot s existe obiecte mari cu

pete de snge umede. Acestea trebuie transferate pe o
bucat de bumbac curat;

4. Respectiva bucata de bumbac trebuie lsat

s se usuce nai nte de a fi mpachetat ntr- un
recipient de hrtie;

5. Fiecare dintre obiecte i recipiente trebuie

etichetate corect.

Pete de snge uscate

Pete de snge uscate
de pe articole transportabile
1. Petele de snge uscate de pe arme,
mbrcminte i alte obiecte transportabile trebuie
recoltate separat;

2. Fiecare articol s fie plasat individual ntrun recipient de hrtie care trebuie sigilat i etichetat.

Petele de snge uscate pe suprafee solide

ne-absorbante ale obiectelor netransportabile
1. Modelul petelor de snge trebuie s fie
documentat i schiat pentru necesarul respectiv;

2. Pata poate fi recoltat prin rzuire pe <

bucat de hrtie curat;

3. Respectiva bucala de hrtie trebuie pus; ntrun plic i sigilat;

4. Fiecare prob trebuie etichetat corect.

Pete de snge uscate de pe obiecte mari sai
netransportabile, de unde petele nu pot fi rzuit*
i de pe obiecte care nu pot fi tiate
1. Modelul petelor de snge trebuie s fi
documentat i schiat pentru necesarul respectiv;.

2. Pata de snge poate fi dizolvat ntr-<

soluie salin sterilizat, prin frecarea bucii d<
bumbac pe zona ptat;

3. Bucata este lsat s se usuce i este pui

apoi ntr-un pachet de hrtie;

4. Apoi pachetul este pus ntr-un plic care' si

sigileaz i se eticheteaz;

5. Acest procedeu poate f controlat prii

recoltarea unei pete dintr-o zon adiacent, da
neptat.
Pete de snge de pe covoare, tapierii i alt
obiecte care nu pot fi tiate
1. Ariile ptate trebuie pregtite aa cum
descris anterior;

S-

2. O poriune din obiect pe care se afl pet< de

snge poate f ndeprtat cu un instrumen ascuit
curat;

3. Fiecare bucat decupat trebuie mpachetat

separat i etichetat;

4. Pentru control trebuie recoltat i o poriune

fr pete de snge.
Picturi de snge mici, uscate
1. Adesea este difcil de recoltat picturile de
snge. Este posibil, ca acestea s fie recoltate folosind
metoda benzii adezive;

2. Dup pregtirea corespunztoare, poate fi

folosit metoda benzinei adezive pentru picturile de
snge de pe anumite suprafee;

3. Fiecare
etichetat;

pies

trebuie

mpachetat

4. Apoi se pune ntr-un recipient de plastic;

5. Se suspend banda cu picturile de snge la

mijlocul recipientului;

6. Se sigileaz i se eticheteaz recipientul.

2.Sperma i petele de sperm
Probele de lichid spermatic gsite
la locul faptei
1. Se catalogheaz dovezile de sperm prin
observare, nregistrare video i desenat;.

2. Se folosete o sering curat pentru a

transfera lichidul spermatic ntr-o eprubet steril;

3. Se eticheteaz eprubet cu nr. cazului, data,

ora, localizarea i numele celui care recolteaz;.Proba
se pstreaz la frigider i se aduce laborator ct mai
curnd posibil;.

4. In mod alternativ, lichidul spermatic poa fi

transferat pe o bucat curat de bumbac pr absorbie.
Bucata de bumbac este apoi uscat mpachetat,
sigilat i etichetat.
Pete de sperm
de pe obiecte transportabile
1. Petele de sperm de pe mbrcmint

lenjerie de pat, perne i alte obiecte transportabi

trebuie recoltate, ca atare;.

2. Dac un obiect are pe el pete umed acestea

trebuie lsate s se usuce nainte de a recoltate;

3. Fiecare obiect trebuie mpachetat separ

ntr-un recipient de hrtie curat;

4. Fiecare obiect trebuie sigilat i eticheta

5. Obiectele trebuie inute la frigider trimise la

laborator ct mai curnd posibil.
Pete de sperm de pe
obiecte mari care pot fi tiate
1. Exemple de obiecte care pot s aib pe de
sperm i care pot fi tiate sunt covoarel lenjeriile de
pat i tapieriile;

2. Se catalogheaz proba aa cum am desci

mai sus;

3. Se folosete o lam sau un cuit curat

pentru a tia zona cu pete;

4. Se mpacheteaz proba pentru a o asigura i

a preveni orice contaminare;

5. Acest pachet se pune ntr-un recipient, se

sigileaz i se eticheteaz.
Pete de sperm de pe
suprafee neabsorbante
i netransportabile
1. Exemple de asemenea suprafee sunt
podelele, tejghelele i suprafeele de metal;

2. Se catalogheaz petele de sperm aa cum

am mai descris;

3. Se folosete un bisturiu curat pentru a rzui

petele de sperm pe o hrtie curat i se pun ntr-un
recipient;

4. Se cur bisturiul nainte de fiecare

folosire, pentru a evita contaminarea;

5. Fiecare recipient trebuie sigilat i etichetat.

Probele de sperm
de la victimele atacurilor sexuale
1. Victimele
atacurilor
ntotdeauna examinate n spital;

sexuale

sunt

2. Probele fizice
procedurile stabilite;

recoltate

dup

trebuie

3.

procedur standard n viol 6 reprezint

recoltarea probelor vaginale, orale i anale;

4. Fiecare prob trebuie mpachetat, sigilai i

etichetat;

5. Probele trebuie aduse la laborator ct mi

curnd posibil.
3. esuturi, organe i oase
esuturi, organe i oase proaspete
1. Fiecare
prob
trebuie
descris
documentat prin schiare, fotografiere i filmare

2. Acest tip de prob poate fi recoltat cu u

forceps curat;

3. Fiecare articol trebuie pus ntr-un recipiei

curat, fr fixatori adugai;

4. Fiecare recipient trebuie sigilat, etichet; i

depozitat ntr-un congelator;

5. Probele trebuie aduse la laborator ct m;

curnd posibil.
esuturi, organe i oase vechi
A

1. nainte de a fi recoltat, fiecare prob trebuie

fotografiat i schiat. Se noteaz mrime! forma i
distanele dintre probe;

2. Fiecare prob trebuie recoltat cu mnu:

curate;

3. Trebuie s fim ateni s nu contaminm

prob de la alta; de aceea, pentru fiecare prob
mnuile se schimb;

4. Fiecare prob trebuie pus ntr-un recipient

curat, care se sigileaz i se eticheteaz;

5. Probele pot fi depozitate la temperatura

camerei i duse la laborator ct mai curnd posibil.
4. Urina, saliva i alte
lichide ale organismului
Probe lichide
1. Urina lichid sau saliva trebuie transferate
ntr-un recipient curat ct mai curnd posibil;

2. Recipientul trebuie sigilat i etichetat;

3. Probele trebuie pstrate la frigider i duse

la laborator ct mai curnd posibil.
Pete
1. Petele de urin i saliv pot fi recoltate ca
atare sau prin rzuire;

2. Fiecare prob se pune ntr-un recipient de

hrtie curat. Petele recoltate prin rzuire se pun ntrun plic de hrtie curat care, apoi, este pus ntr-un
recipient de hrtie;

3. Probele trebuie sigilate i etichetate;

4. Probele trebuie aduse la laborator ct mai

curnd posibil.
Probele de pr
L Probele de pr trebuie recoltate cu ajutorul
unei pensete curate;

2. Fiecare prob de pr trebuie mpacheti

separat i apoi sigilat i etichetat;

3. Recoltarea trebuie fcut cu atenie, peni a

nu deteriora rdcina Firului de pr;

4. Prui amestecat cu snge, esuturi sau a

lichide ale organismului, trebuie tratate cu aten
Fiecare prob trebuie pus ntr-un recipient cur dup
care se sigileaz i se eticheteaz;

5. Probele se depoziteaz n frigider i se d la

laborator, ct mai curnd posibil.
IV. GHID DE LABORATOR PENTRU
PRELUCRAREA PROBELOR DE ADN
A. Primirea probelor la laborator
Dup ce probele au fost recoltate transportate
la laboratorul medico-legal, penti prelucrarea lor se
fac urmtoarele recomandri

1. Probele fizice trebuie admise la laborat< cu

ordonana n care este notat tipul de examina
solicitat;

2. Toate probele primite dup

standard a laboratorului respeciv.(vb.)

procedui

3. Numrului cazului trebuie verificat naini

de a fi primit;

4. Se va verifica modul n care sur

mpachetate, sigilate i etichetate. Va trebui notai
fiecare incorectitudine semnalat;

5. Se va nota orice semn de murdrie de pe

ambalaj;

6. Se va nregistra orice informaie privitoare

la tipul de test ADN i la cazul respectiv;

7. La primirea probelor se vor nota data, ora,

numele laboratorului, numele celui care primete
proba, a celui care o aduce, nr. cazului;

8. Probele fizice care vor fi supuse testrii

ADN trebuie aduse la laborator ct mai curnd
posibil.
B. Metode de laborator
pentru prelucrarea iniial
Dup ce s-a primit cazul, nainte de analiza
propriu-zis a AND-ului pentru prelucrarea iniial sc
recomand urmtoarele :

1. Se folosete o form de examinare a

probelor pentru a nregistra prelucrarea iniial a
fiecrui articol. Informaiile necesare pentru fiecare
prob sunt:

a) descrierea pachetului

b) etichetarea

c ) descrierea probei

d ) orice alt articol de prob n acelai pachet

e ) nr. cazului i al articolului

f) data i numele examinatorului

2. Se localizeaz zonele cu pete, folosind

fotografii, notie i schie;

Se nregistreaz localizarea, mrimea istarea oricrei

pete biologice;
3. Trebuie nregistrate rezultatele oricrui tei
preliminar;

4. Se vor consemna corect rezultatele testeloi

pentru fiecare articol;

5. Se va folosi o form de nregistrare a

informaiilor pentru fiecare prob care va fi supus
analizei ADN. Informaiile care trebuie incluse sunt
urmtoarele :

a ) nr. cazului

b ) descrierea articolului i nr.

c ) localizarea petei

d ) mrimea i fonna petei

e ) starea de amestec a petei cu alte lichide

f) cantitatea probei

g ) nr. eprubetei n care a fost pus;

6. Fiecare prob de ADN testat trebuie

recoltat cu grij pentru a preveni contaminarea ;

7. Se va pstrat o parte din prob pentru o

posibil analiz viitoare;

8. Fiecare prob pentru analiza ADN trebuie

pus ntr-o eprubet pachet sau recipient separat;

9. nainte de a fi extras, fiecare probtestare de ADN trebuie inventariat;

10. Pentru articolele care vor fi analizate prin

metoda PCR se va recolta o prob de control;

Poriunile nefolosite din probe trebuie

nregistrate, reambalate, resigilate, etichetate i
depozitate ntr-un congelator.nainte ca probele s fie
analizate pentru tipizarea ADN, uneori se efectueaz
teste de confirmare pentru stabilirea tipului de
material biologic. De asemenea, exist o serie de
teste de culoare pentru variate lichide biologice cum
ar fi sngele, sperma sau saliva, care se pot efectua la
locul crimei, nainte ca probele s fie recoltate.

Dup identificarea probei, prin testare sau

investigaii, se efectueaz teste preliminarii pentru
stabilirea strii ADN care se afl n prob. Este
posibil, s se efectueze teste care s releve calitatea
ADN (n ce stare de degradare se afl), ce cantitate
de AND exist n prob i ct din aceasta este de
origine uman. Electroforeza pe gel de agaroz poate
permite aprecierea cantitii de ADN i, n acelai
timp, d informaii despre starea de degradare a sa.
Cuantificarea componentei umane din totalul de
ADN se poate face prin metoda sloi blot Evaluarea
calitii ADN este esenial pentru luarea deciziei
privind investigarea unei probe individuale, i
anume, dac este posibil folosirea metodei RFLP
sau dac metoda PCR este mai indicat.Testul RFLP
necesit un minimum de Al cu o greutate molecular
relativ mare (HMW DN Acest ADN presupune
fragmente de aproxima

20.0 - 25.000 bp. (20 - 25 kb). Cu alte cuvii

degradarea nu trebuie s fi produs fragmente r
mici dect acestea. Dup cum am stabilit anten
dac ADN-ul care a fost mai pregnant degradat
e folosit pentru tehnica RFLP, exist pericolul
s poat fi evideniate benzile cu ADN cu greut
molecular mare. De exemplu, un model cu 2
bei poate fi tipizat eronat cu o singur bam
Necunoaterea gradului de degradare a probei
po duce la excluderi false.

Pentru efectuarea cu succes a unei anali RFLP

este, totui, necesar o cantitate minii de AND.
Nivelul acestei cantiti minime e: oarecum dependent
de laborator i variaz funcie de metoda de marcare a
prob (radioactiv sau chemiluminescent) i tinde se
afle ntre valorile de 10 pn la 50 ng. Cu a cuvinte,
sunt necesare 10-50 ng de ADN greutate molecular
mare pentru a se obi rezultate corespunztoare prin
RFLP.5.1.5. LABORATORUL DE
IDENTIFICRI GENETICE
PRIN AMPRENTA ADN(LIGAA) CRAIOVA
Primul de acest gen din Romnia, laboratorul
i are sediul la Universitatea de Medicin i Farmacie
Craiova, lucrnd n colaborare i pe baz de contract
cu Institutul de Medicin Legal Craiova. A luat fiin
n baza adresei Ministerului Justiiei nr. AMA / 1454 /
31.08.2000, n care se precizeaz c cele dou
instituii, fostul Laborator Exterior de Medicin
Legal Craiova, actualul Institutul de Medicin
Legal Craiova i Universitatea de Medicin i
Farmacie Craiova, pot efectua, ncepnd cu data de 15
august 2000, la cererea instanelor de judecat, a
organelor judiciare i a persoanelor interesate, contra
cost, potrivit prevederilor legale n vigoare, toat

gama de investigaii asupra ADN-ului uman, utilizate

pentru stabilirea filiaiei, identificriipe baz de
fragmente de esuturi i organe, ori alte produse
biologice ce conin ADN.

Prin adresa nr. XI / C / GH / 9118 /15.12.2000

a Ministerului Sntii, Direcia Strategie, Dezvoltare
i Management, s-a aprobat funcionarea acestui
laborator.

n noiembrie 1997, Biroul Federal de

Investigaii ( FBI ) din SUA a anunat selectarea a 13
loci STR care s constituie baza de date pentru

Statele Unite i care a fost numit CODIS 13

Combined DNA Index System ). Toii locii SI din
sistemul CODIS 13 sunt formai din secver
tetramericc repetate. Laboratoarele care utilizea
acest sistem pot contribui la alctuirea bazelor date
internaionale. Corporaia Promega a fost prir
companie care a nceput s livreze sisteme detecie
pentru cei 13 loci introdui n sistem CODIS, cum
ar fi sistemul multiplex STR s sistemul megaplex
STR.

Noul sistem de tipizare ADN prin folosir

locilor STR prezint o serie de avantaje. Prim
avantaj este acela c permite amplificarea simulta a
mai multor loci (reaciile multiplex), iar cel de
doilea c allelele pot fi detectate direct i raj: prin
tehnici de fluorescen. Aceasta perm simultan
elcctroforeza i detecia a pn la 9-10 k n acelai
timp. De asemenea, utilizar fluorcscenei a permis
automatizarea deteci Astzi, sunt produse o serie
de kituri pentru detec automat. O trecere n revist
a acestei tehnolo poate fi gsit n referinele 10 i
11.

Funcia de baz a tuturor testelor, fie ele

paternitate sau de identificare, este de a exclu

numrul maxim posibil de indivizi. Aceasta impu o

serie de calcule statistice care includ frecveni
populaionale ale adelelor determinate.

Experiena personalului din Laboratorul

Identificri Genetice prin Amprentarea AND (LIGAA) care

funcioneaz n cadrul UMF Craiova, precum i
aparatura modern de care dispune acest laborator
permit stabilirea amprentei genetice a unei persoane,
prin analiza locilor STR inclui n sistemul CODIS
13, LIGAA i poate procesa simultan un numr mai
mare de probe. Analizele pot fl prelucrate n funcie
de urgena fiecrui caz i dureaz ntre dou
sptmni i o lun. Datorit acurateei metodelor
utilizate, certitudinea de paternitate sau de
provenien a unei probe este de peste 99,99 %.

Putem da astzi cteva exemple privind unele

rezultate obinute, care au fcut posibil identificarea
unor infractori, punnd pe masa justiiei probe
incontestabile :

1. Cazul V.O. de la Parchetul Satu Mare,

acuzat de viol la minore, din 05.06.2001, n care s- a
fcut n premier naional identificarea unei persoane
pe baza ADN-ului extras din fir de pr. Concluziile
actului de expertiz au precizat urmtoarele :
INTERPRETAREA REZULTATELOR: Din
firele de pr prelucrate s-a reuit extracia ADN. Acest
ADN s-a folosit pentru analiza a 9 gene (loci), folosite
n sistemul internaional de identificri genetice.

Allele determinate la probele 2 i 3 (fire de

pr pubian recoltate pe fesele victimei) coincid n
totalitate cu allelele bnuitului (proba 4), aceast
coinciden fiind de 100 %. Nu exist nici o

coinciden de allele ntre proba 1 (victima) i

probele 2 i 3.
Lund n calcul frecvenele allelelor
prezente la probele 2 i 3, respectiv 4,
probabilitatea de coinciden cu o alt prob
ntmpltoare este de 1 la 621 miliarde de
indivizi Concluzie final:
Firele de pr din probele 2 i 3 provin de la
V. O. (proba 4).
2. Cazul P.K. de la Parchetul dc pe lng
Curtea Suprem de Justiie, acuzat de omor i jaf, n
care s-a determinat amprenta genetic a unei victime
de pe o pat de snge, de pe pantaloni bnuii c ar
aparine fptuitorului.
INTERPRETAREA REZULTATELOR: Din

probele prelucrate s-a reuit extracia de ADN din probele

68A, 68B. 68D, i 68E. Acest ADN s-a folosit pentru
analiza a 9 gene (loci), folosite n sistemul
internaional dc identificri genetice, precum i pentru
determinarea sexului genetic (Amelogenina). Allele
determinate la probele 68 A, 68 B i 68 E coincid n
totalitate, aceast coinciden fiind de 100 %, fapt ce
atest c sngele care a produs aceste probe provine
de la acelai individ, care este de sex masculin.

Probabilitatea statistic de coinciden, adic

probabilitatea ca o alt prob ntmpltoare s
coincid cu amprenta ADN determinat de noi la
probele 68 A, 68 B i 68 E, este de 1 la 13,6 miliarde.

Concluzii finale:

Petele de snge de pe pantalonii bnuitului

P. K. (probele 68 A i 68 B) provin de la victima
M. V, probabilitatea de coinciden cu o alt
prob ntmpltoare fiind de 1 la 13,6 miliarde.
3. Cazul .N. de la Judectoria Craiova, acuzat
de incest asupra celor dou fiice: s-a determinat
amprenta genetic pe tampoane vaginale recoltate de
la cele dou victime i pe snge de la bnuit.
INTERPRETAREA REZULTATELOR: Din
probele prelucrate s-a reuit extracia ADN. Acest

ADN s-a folosit pentru analiza a 9 gene (loci), folosite

n sistemul internaional de identificri genetice.
Tamponul vaginal (proba 91 A), avnd n vedere c
are celule din dou proveniene (celule epiteliale
vaginale de la .L.C. i respectiv spermatozoizi de la
autorul violului), prin analiza genetic a evideniat
dou amprente ADN suprapuse. Una din aceste
amprente corespunde in proporie de 100 % cu
amprenta genetic a numitei .L.C.(proba 91 C), iar
cealalt amprent coincide n proporie de 100 % cu
amprenta numitului .N, (proba 91 B). Probabilitatea
statistic de coinciden, adic probabilitatea ca o
prob? ntmpltoare s coincid cu amprenta ADN ?
probei 91 B, este de 1 la 1484 de miliarde. Concluzii

finale:

Spermatozoizii coninui n tamponu

vaginal recoltat de la numita .L.C. (proba 91 At
provin de la numitul .N. (proba 91 B)
probabilitatea de coinciden cu o alt probi
ntmpltoare fiind de 1 la 1484 miliarde indivizi
4. Cazul P.M. de la Parchetul Iai, acuzat d<
viol i uciderea victimei, unde amprenta genetic,
(ADN) s-a fcut pe baza unui tampon vaginal de 1
victim, a sngelui recoltat de la cadavrul victime
precum i a petelor de snge gsite pe hainei
agresorului i a sngelui integral al agresorului.
INTERPRETAREA REZULTATELOR: Di
probele prelucrate s-a reuit extracia AND. Ace:
ADN s-a folosit pentru analiza a 9 gene ( loci utilizate
n sistemul internaional de identific genetice.
Tamponul vaginal (proba 87 D), cai conine celule din
dou proveniene (celui epiteliale vaginale de la P.E.
i respeci spermatozoizi de la autorul violului), prin
analiza genetic a evideniat dou amprente ADN
suprapuse. Una din aceste amprente corespunde n
proporie de 100 % cu amprenta genetic a victimei
P.C. (proba 87 B i 87 C), iar cealalt amprent
coincide n proporie de 100 % cu amprenta numitului

P. M. ( proba 87 A ). Probabilitatea statistic de

coinciden, adic probabilitatea ca o prob
ntmpltoare s coincid cu amprenta ADN a probei
87 A, este de 1 la 36,1 de miliarde. Pata dc snge din
proba 87 E provine de la victim. Concluzii finale:

Spermatozoizii coninui n tamponul

vaginul recoltat de la victima P.E. (proba 87 D)
provin de la numitul P. M. (proba 87 A),
probabilitatea de coinciden cu o alt prob
ntmpltoare fiind de 1 la 36,1 miliarde indivizi
5. Cazul cadavrului neidentificat ntr-o eav de
irigaii agricole de la I.P.J. Piteti, n care trebuia s
demonstrm dac acest cadavru este de sex feminin i

dac este rud (sor) cu 5 (cinci) persoane bnuite de

a fi frai naturali.

INTERPRETAREA
REZULTATELOR:
Din
probele prelucrate s-a reuit extracia ADN. Acest
ADN s-a folosit pentru analiza a 9 gene ( loci ),
folosite
n
sistemul
internaional
dc
identificrigenetice, precum i pentru determinarea
sexuli genetic. Pe baza amprentelor ADN
determinate 1 fraii notai cu 96P2 ... 96P6, s-a
putut deduc constituia genetic a prinilor
acestora. n toat cele 9 gene analizate reiese c
genele probei 96P ( cadavrul neidentificat ), sunt
motenite de 1 aceiai prini, probabilitatea de
paternitate fiin de 99.999 %. Probabilitatea de
coinciden cu u alt individ din populaie luat
ntmpltor, adie probabilitatea ca o prob
ntmpltoare s coincid cu amprenta ADN a
probei 96P1, este de 1 la 29 miliarde de indivizi.

1
6
7

Concluzii finale:
Cadavru! de sex feminin reprezentat d
proba 96P1 este sora persoanelor notate cu
96P'1 96P3, 96P4, 96P5, 96P6, cu o
probabilitate d 99,999 % i cu o probabilitate
de coinciden cu alt prob ntmpltoare de
1 la 296 miliarde a indivizi

1
6
8