Sedimentarea şi centrifugarea

I. Noţiuni teoretice
1. Sedimentarea
Sedimentarea - Este o tehnică de separare ce se bazează pe diferenţa de densitate dintre
componentele amestecului. În practica medicală se utilizează nu numai ca tehnică de separare
dar şi ca o metoda de analiză (VSH - viteza de sedimentare a sângelui).
Pentru o înţelegere mai bună a procesului se poate modela comportarea unei hematii în
câmp gravitaţional.
Să consideram o suspensie de particule sferice de rază R şi densitate p aflate într-un lichid
de densitate ⍴0 (⍴<⍴o)- Asupra particulelor acţionează următoarele forţe:

-forţa de greutate: G = m • g = • π • R 3 • ⍴ • g

- forţa Arhimedică: FA = m0 • g = • π • R3• ⍴0 • g

- forţa de frecare cu moleculele lichidului - forţa de vâscozitate; pentru particule sferice şi

viteze mici de deplasare, forţa de vâscozitate este dată de legea lui Stokes:

Fv = 6 • π • ɳ • R • v
unde: v este viteza, ɳ coeficientul de vâscozitate iar R raza particulei.
La echilibru dinamic rezultanta acestor forţe este nulă şi particula coboară cu viteză
constantă (figura 5.1)

Figura 5.1. Forţele ce acţionează asupra unei particule de rază R şi

densitate ⍴ aflată într-un lichid de densitate ⍴0 ( ⍴ > ⍴ 0).
 • π • R3• ⍴ • g = • π • R 3 • ⍴0 • g + 6 • π • ɳ • R • v ⇒ v = • R 2 • g ( ⍴ - ⍴0) • ɳ -1 (1)

Considerând v = unde L este spaţiul parcurs în mişcare rectilinie şi uniformă iar t

timpul de sedimentare, obţinem:

t = • ɳ • L • R - 2 • g - 1 ( ⍴ - ⍴0) 1

După cum se constată din relaţia (1) viteza de sedimentare depinde atât de mărimea
particulelor (R) cât şi de interacţiunea acestora cu lichidul în care se află, prin coeficientul de
vâscozitate ɳ .
Sedimentarea poate fi deci folosită nu numai ca tehnică de separare a unor particule de
interes dar şi ca metodă de cercetare în vederea obţinerii unor informaţii legate de aceste
particule.
De mare importanţă clinică este determinarea vitezei de sedimentare a eritrocitelor. În
tabelul următor sunt prezentate valorile normale obţinute prin metoda Westergreen.

Subiect 1 oră 2 ore

bărbat 2 - 8 mm 5 - 18 mm
femeie 4 - 10 mm 6 - 20 mm
nou - născut 1 - 2 mm -
sugar 5 - 10 mm -
copil mic 7 - 12 mm -

2. Centrifugarea
Centrifugarea - reprezintă o tehnică de separare a componentelor unui amestec cu
densităţi diferite sub influenţa unui câmp centrifugal.
Deoarece viteza de sedimentare pentru particule de mărimea hematiilor, sau mai mici, este
deosebit de scăzută, este necesară o metodă care să crească forţa activă (greutatea în cazul
sedimentării). Astfel, în cazul centrifugării, rolul forţei de greutate îl joacă forţa centrifugă.
 Figura 5.2. Forţele ce acţionează asupra unei particule de raza R şi
densitate p aflată într-un lichid de densitate ⍴0 ( ⍴ > ⍴ 0).

Fc f = m • a c = • π 3 • R3• v2 • ⍴• x

Neglijând forţa de greutate şi considerând că migrarea duce la creşterea razei traiectoriei

circulare, avem următoarele relaţii:

Fa+Fv=Fcf

F V =6• π • ɳ • R •

Fa= • π 3 • R 3 • v 2 • ⍴0 • x

dt = • ɳ • π - 2 • R - 2 • v - 2 • ( ⍴ - ⍴0) 1 •

Prin integrare obţinem timpul necesar separării:

t c = • ɳ • ( π • R • v ) - 2 • ( ⍴ - ⍴0) 1 • l n

Ultracentrifugarea - Pentru particule foarte mici cum ar fi proteinele plasmatice

sedimentarea prin centrifugarea obişnuită este practic nerealizabilă din cauza fenomenelor de
difuzie. Sunt necesare în acest caz turaţii deosebit de mari >15000rot/min.
Ultracentrifugele ce realizează aceste turaţii trebuie să fie bine stabilizate mecanic (pentru
a evita fenomenul de 'bătăi' care ar duce la ruperea axului) şi bine termostatate (pentru a
împiedica degradarea termică).
 Când sistemul este monodispers apare o limită netă de separaţie între solvent şi
particulele dispuse la fundul eprubetei.
Când sistemul este polidispers apar mai multe câmpuri şi este necesară o ultracentrifugare
fracţionată. Se centrifughează pe rând la fiecare turaţie de interes şi se recoltează sau sedimentul
sau super-natantul.

II. Parte experimentală

A. Determinarea vitezei de sedimentare a eritrocitelor
(metoda Westergreen)
Materiale necesare:
-sânge venos, 1.6 ml, recoltat pe anticoagulantul citrat trisodic 3.8%, în cantitate de 0.4 ml;
-materiale pentru puncţie venoasă;
-eprubete de hemoliză;
-hemosedimentrul Westergren, alcătuit dintr-un stativ metalic prevăzut cu pipete Westergren, de
aproximativ 300mm lungime şi 2.5-3mm diametru.
Mod de lucru:
-se aspiră cu seringa, în condiţii sterile, o cantitate de 0.4ml citrat trisodic 3.8%;
-se puncţionează vena pacientului şi se aspiră sânge până la diviziunea de 2ml;
-după omogenizare sângele se pune într-o eprubetă de hemoliză;
-se aspiră sângele în pipetele Westergren până la diviziunea zero;
-se fixează pipetele în stativ (într-o poziţie perfect verticală), apoi se notează timpul (momentul
se start) şi numele pacientului.
Citirea rezultatului se face la o oră şi/sau la două ore, valoarea fiind dată de înălţimea
coloanei de plasmă apărută în partea superioară a tubului exprimată în mm, pe unitate de timp.

B. Centrifugarea sângelui
Materiale necesare:
-seringă şi ac pentru puncţie venoasă
-eprubete de hemoliză
-stativ
-pipete gradate
-citrat trisodic 3,8%
-balanţă de echilibrare
-ser fiziologic
-eprubete de centrifugare
Mod de lucru:
-se recoltează o cantitate de 5-6 ml sânge după metoda descrisă anterior;
-se introduce în eprubeta de centrifugare 1ml citrat trisodic 3,8%, 4ml ser fiziologic şi 5ml sânge
după care se asează eprubeta pe balanţa de echilibrare;
-pe platanul opus se aşează o eprubetă identică în care se introduce apă distilată până la
echilibrarea balanţei;
-se aşează cele două eprubete în centrifugă în poziţii diametral opuse una faţă de alta, se închide
capacul centrifugii şi se reglează la 2000rotatii/min, după care se centrifughează 2 minute;
-se scoate eprubeta şi se masoară deplasarea frontului eritrocitar, apoi se continuă centrifugarea.

Probleme:
1. Cunoscând valorile fiziologice ale coeficientului de vâscozitate la bărbat
ɳB=0,047Kg/ms şi la femeie ɳF=0,043Kg/ms, densitatea eritrocitului ⍴=1095Kg/m3 şi a plasmei
⍴o=1027Kg/m3 calculaţi din formula vitezei de sedimentare cât ar trebui să fie raza eritrocitului
presupus sferic.
2. Determinaţi viteza de sedimentare a unor particule de cretă suspendate într-un lichid
şi raza acestor particule presupuse sferice cunoscând ⍴apa=1 g/cm3, ɳapa =1.05 10-3Kg/ms, ⍴creta
=1,545 g/cm3.
3. Cunoscând raza particulei de cretă determinată anterior, evaluaţi folosind modelul
matematic al centrifugării, timpul de centrifugare pentru aceste particule suspendate într-un
mediu vâscos (glicerină). Se cunosc:
-
v = 1000rot/min, (500rot/min)
-
ɳglicerina =13,93 10-3Kg/ms
-
⍴glicerina =1,26 g/cm3
-
ln(x2/x1)=0,143
Verificaţi experimental rezultatul obţinut.