Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de fungi din genul

Epidermophyton

Dermatofitii sunt micromiceti filamentosi keratinofili incadrati taxonomic in ordinul Onygenales,

familia Arthrodermataceae si sunt potentiali agenti patogeni ai omului si animalelor. Ei produc
micoze superficiale cutanate (tinea) care afectează stratul cornos keratinizat, astfel ca infecţia
este limitată la nivelul stratului superficial al pielii, parului si unghiilor. Principalii agenti
etiologici implicati in producerea dermatomicozelor apartin genurilor Epidermophyton,
Microsporum si Tricophyton.

O caracteristica fiziologica importanta, exploatata in demersul de izolare si identificare a

dermatofitilor este toleranta lor la cicloheximida (Actidione) inglobata in mediile de cultura.
Acest agent inhibitor al majoritatii fungilor contaminanti permite izolarea in cele mai bune
conditii a suselor de dermatofiti din prelevatele clinice.

Potrivit originii lor, fungii dermatofiti sunt impartiti in 3 categorii:

• specii antropofile, care se transmit direct prin contact interuman sau indirect prin lenjerie sau
obiecte contaminate;
• specii zoofile, care se transmit la om prin contactul cu un animal infectat;
• specii telurice, care se transmit prin contactul solului cu leziuni cutanate;

In conditii naturale , dermatofitii au capacitatea de a descompune keratina. Aceasta proprietate

metabolica le permite supravietuirea in mediul ambiant si uneori, producerea unor afectiuni
superficiale cu localizarea mentionata anterior.
Termenul phyton deriva din cuvantul grec/latin planta.

Caractere epidemiologice. Sursele de contaminare si modul de transmitere reprezinta caractere

epidemiologice deosebit de importante in demersul de identificare al speciei implicate in
producerea unei leziuni dermatofitice si de asemenea, in preventia reinfectarii pacientului.
Contactul cu mamifere salbatice sau cu animale de companie poate sta la baza bontractarii unor
dermatofitiii produse de specii de portaj. Pe de alta parte, contactul interuman sau desfasurarea
unor anumite activitati sportive pot predispune la aparitia unor infectii cu specii de dermatofiti
predominant antropofile.

Precizarea de catre clinician in referintele destinate medicului de laborator a unor date

anamnestice cu caracter epidemiologic, nu este doar recomandabila ci si obligatorie, ea asigurand
un grad de acuratete a identificarii speciei de dermatofit in cauza.

Aspecte clinice.

Fungii dermatofiti se individualizeaza prin cel putin doua caractere cu impact direct asupra
identificarii lor in laboratorul clinic:

• folosesc keratina ca element nutritiv (sursa de azot), ceea ce explica tropismul lor pentru
epiderma, par si unghii; sunt de obicei incapabile sa penetreze tesutul subcutanat;

• prezinta caractere morfologice particulare: hife in forma de candelabru, de coarne de cerb,

uneori spiralate si macroconidii caracteristice, complet diferite de ale altor fungi
Genul Tricophyton este capabil sa invadeze parul, epiderma si unghiile, in timp ce genul
Microsporum doar parul si epiderma iar genul Epidermophyton afecteaza epiderma si unghiile.
Principalele specii de dermatofiti izolate din probe clinice sunt in ordinea frecventei: Tricophyton
rubrum, Tricophyton mentagrophytes, Epidermophyton flocossum, Tricophyton
tonsurans, Microsporum canis si Tricophyton verrucosum1.
Micozele cutanate sunt probabil cele mai frecvente infectii fungice la om si sunt de obicei
denumite cu termenul latin tinea (“vierme inelar”). Macroscopic, leziunea are un aspect inelar,
marginea sa constituind zona de infectie activa, progresiva; vindecarea se produce in zona
centrala a inelului. Pentru a indica zona corpului afectata se folosesc de asemenea termeni
latini: tinea corporis (corp), tinea cruris (zona inghinala), tinea capitis(scalp, par), tinea
barbae (barba), tinea unguium (unghii)3,4.

Deoarece tratamentul dermatomicozelor este indelungat, costisitor si cu potential toxic, este

necesar ca mai intai sa se stabileasca cu certitudine diagnosticul pe baza examenului micologic.
Acesta se impune cu necesitate deoarece exista numeroase afectiuni asociate cu leziuni
dermatologice similare celor induse de dermatofiti:
– psoriazis;

– eczeme (vulgara, atopica sau de contact);

– intertrigouri de diverse etiologii;

– onicodistrofii in cadrul unor afectiuni: psoriazis, insuficienta venoasa cronica a membrelor

inferioare, genodermatoze;

– streptococia scuamoasa a scalpului

Diagnosticul de laborator :

Recoltarea si transportul probelor – joaca un rol important in acuratetea diagnosticului, orice

intarziere in procesarea probelor poate duce la scaderea sanselor de a izola agentul etiologic.

Viabilitatea levurilor poate fi afectata de caldura excesiva sau de frig, fiind recomandat ca
transportul probelor sa se faca la temperatura ambianta, iar procesarea lor in cel mai scurt timp
(aproximativ 2 ore).

Desi aproape orice tesut sau fluid poate fi supus izolarii si identificarii fungice, cele mai
importante specimene sunt reprezentate de: folicul pilos, tegument, raclat unghial, secretie
genitala, exudat faringian, sputa, aspirat transtraheal si lichid pleural, tesuturi din plagi, lichid
cefalorahidian, sange, urina si materii fecale

Examenul microscopic direct

Are valoare diagnostica intrinseca deoarece permite confirmarea rapida a suspiciunii de infectie
dermatofitica si informarea timpurie a clinicianului, cu mult timp inainte de pozitivarea culturii.
Tehnica: cateva fragmente din prelevatul recoltat de la pacient se depun pe o lama de sticla, intr-
o picatura de lichid clarificant (lactofenol sau solutie 10-20% KGH) care prin "digerarea"
keratinei va permite observarea la microscop a filamentelor dermatofitilor- septate, mai mult sau
mai putin regulate, adeseori ramificate. Dupa un contact de cca.10-15 minute (eventual mai
indelungat in cazul fragmentelor unghiale), lama se acopera cu o lamela si se examineaza la
microscop, cu obiectivul 20. Actiunea lichidului clarificant poate fi intensificata prin incalzirea
lamei la flacara unui bec de gaz fara insa a-l aduce la fierbere. In general, lama se poate examina
cand opacitatea preparatului s-a diminuat vizibil. Decelarea filamentelor dermatofitice in
prelevate este mult ameliorata
daca la solutia clarificanta se adauga un colorant - negru clorazol, cerneala Parker sau o
substanta fluorescenta cu afinitate pentru glicanul din peretele fungilor (Blankophor,
Calcofluor - 0,1%). Utilizarea substantelor fluorescente incumba examinarea preparatului
la un microscop cu fluorescenta.

In cazul firelor de par se pot observa hife si artrospori rezultati prin fragmentarea hifelor.
Localizarea acestor elemente dermatofitice care invadeaza tija pilara ofera indicii privind
etiologia afetiunii. In functie de modul de afectare a tijei pilare deosebim trei tipuri de parazitare:

• tipul endo-ectotrix, la care mirosporii rezultati in um1a fragmentiirii filamentelor

miceliene apar atat in interiorul, cat si la exteriorul firului de par

• tipul endotrix, la care artrosporii rezultati prin segmentarea filamentelor miceliene din interiorul
tijei pilare, vor determina fragmentarea firului de par .In aceste fragmente de mici dimensiuni
sunt observabili la microscop numerosi spori de forma rotunda care inlocuiesc practic medulara
pilara.

• tipulfavic, la care filamentele miceliene intrapilare sunt numeroase si formeaza adevarate

galerii in interiorul firului de par, galerii ce devin vizibile microscopic sub forma unor benzi de
culoare bruna, cu traiect rectiliniu, uneori cu ramificare dicotomica.

Insamantarea pe medii de cultura

Mediul de electie pentru izolarea dermatofitilor este Agarul Mycobiotic (Agar Sabouraud
aditivat cu cloramfenicol si cicloheximida) ; prezenta cloramfenicolului suprima dezvoltarea
bacteriilor care pot contamina prelevatul iar cicloheximida (Actidione) inhiba multiplicarea
fungilor contaminanti facilitand izolarea dermatofitilor.
Se recomanda ca primocultura sa se efectueze in placi Petri si nu in tuburi, deoarece
atat insamantarea cat si manoperele ulterioare sunt mult facilitate. Materialul patologie
se insamanteaza in mai multe puncte pentru a creste probabilitatea izolarii dermatofitilor
si a putea acorda semnificatie clinica tulpinii izolate. Cu cat numarul punctelor de insamantare
pozitivate este mai mare, cu atat implicarea clinica a tulpinii izolate este mai sigura. Este posibila
si insamantarea prin inglobarea prelevatului in mediul de cultura insa interpretarea semnificatiei
clinice devine mai dificila.
lncubarea se realizeaza la 25°-30°C, timp de cca. 4 saptamani. Cand se suspicioneaza
o infectie cu T. verrucosum, placile se vor incuba la 3TC (crestere accelerata). In cazul absentei
sporularii in primocultura, tulpinile se pot pasa pe medii speciale care favorizeaza producerea
macroconidiilor si pigmentogeneza: mediul Lactrimel (Borelli), PDA, geloza peptonata 3%.
Se recomanda observarea culturilor de 2 ori/saptamana pentru a surprinde in dinamica aspectele
caraeteristice coloniilor de dermatofiti. Importante din punet de vedere diagnostic sunt viteza de
crestere, caracterele morfologice macro- si microscopice. La unele specii de dermatofiti apar asa-
numitele "formatiuni ornamentale" care reprezinta de fapt hife cu aspect modificat, al caror rol
nu este inca elucidat: hife "in racheta" sau cu aspect de "tija de bambus", candelabre favice, hife
spiralate (vrile), celule osiforme (aspect de "gantera"), organe nodulare, hife pectinate.

Genul Epidermophyton . Se caracterizeaza prin prezenta a numeroase macroconidii alungite, cu

aspect clavat si perete neted. Tipic, microconidiile sunt absente. E. floccosum este singura specie
a acestui gen.

Caractere de cultura. Pe SDA sau Agar Mycobiotic, cresterea coloniilor este rapida:
ele apar in 4-5 zile si devin caracteristice dupa 10-12 zile. Aversul coloniilor are aspect
catifelat, uneori pulverulent, de culoare alba, galben-ocru, galben-kaki sau verde-olive. Reversul
are culoare galben-bruna .Prin invechire, coloniile capata un aspect plisat, cutat, iar pe suprafara
se observa adeseori zone de pleomorfism (zone cu aspect floconos, nepigmentate, constituite din
miceliu steril).
Aspecte microscopice. Genul Epidermophyton se caracterizeaza prin absenta
microconidiilor, trasatura ce-l diferentiaza de celelalte genuri de dermatofiti: Microsporum si
Trichophyton. Macroconidiile sunt numeroase, aranjate de obicei in "buchet”. Au forma de
maciuca, perete subtire si neted, posedand 2-5 lojete. Lungimea macroconidiilor variaza intre 20-
40 micrometri, iar diametrul intre 6-12 micrometri.
Clamidosporii sunt comuni in culturile mature.
Rar, unele tulpini pot produce un pigment brun-rosiatic difuzibil in geloza.
Forma teleomorfli (sexuata): nu este cunoscuta.
Patogenitate: tinea pedis (uneori cu caracter epidemic, cand contaminarea se
realizeaza prin frecventarea salilor de sport, piscinelor, dusurilor comune), tinea cruris,
tinea corporis, rar onicomicoze.

Teste fiziologice
Demlatofitii prezinta o serie de insusiri metabolice si ecofiziologice care pot fi utile in demersul
de identificare a speciei, in special pentru discriminarea intre specii cu caractere culturale si
aspecte microscopice similare. Evaluarea prezentei sau absentei acestor insusiri se realizeaza prin
punerea in practica a unor teste cum ar fi:
- testul de perforare a firului de par in vitro (pune in evidenta eventuala prezenta a "organelor
perforatoare" ale dermatofitilor)
- testul de hidroliza a ureei
- testul de depistare a necesihltilor nutritive speciale
-cultivarea pe Agar BCP-lapte-glucoza (depisteaza modul de crestere, eventualele
modificari de pH si digestia cazeinei)
- cultivarea pe boabe de orez
- testul de termotoleranta / termostimulare
Aceste teste sunt necesare mai ales in cazul suselor nesporulate sau cu morfologie atipica.

Testul de perforare afirului de par in vitro.

Tehnica: se utilizeaza fire de par de copil, care se cupeaza in fragmente de 0,5-1 cm si se
autoclaveaza in placi Petri timp de 10 minute la 121°C. Dupa autoc1avare, se adauga in fiecare
placa cate 25 ml apa distilata sterilizata si cateva picaturi extract de drojdie 10%. Placile astfel
pregatite se insamanteaza cu cateva fragmente din colonia dermatofitului de identificat, apoi se
incubeaza la 25°C, timp de 21 zile. La fiecare 7 zile, utilizand fragmente de par inoculate, se
pregatesc preparate extemporanee (cu lichid clarificant, intre lama si lamela).

Testul de hidroliza a ureeL

Pune in evidenta producerea de ureaza de catre dermatofiti, prin cultivare pe bulion sau agar
Christensen. In cazul producerii acestei enzime, ureea din mediu este descompusa cu generare de
amoniac care va modifica pH-ul mediului (alcalinizare), fenomen indicat de schimbarea culorii
indicatorului: astfel, culoarea mediului va vira de la galben-orange la roz-rosu. Dupa inoculare,
mediul se incubeaza la 25°-30°C, timp de pana la 7 zile. Absenta contaminarii bacteriene a
culturii dermatofitului din care se fac pasajele pe mediul Christensen este obligatorie.
Testul ureazei este:
• pozitiv pentru urmatoarele specii de dermatofiti - M. canis. M. cookei. M. gvpseum.
M. nanum, M. persicoloJ; M. praecox, T. ajelloi, T. mentagrophytes (ambele varietati) si
T. terrestre.
• slab pozitiv pentru urmatoarele specii de dermatofiti - E..floccosum si rar M. canis.
• variabil (inconstant pozitiv sau negativ, in functie de tulpina) pentru urmatoarele specii de
dermatofiti
- M. audouinii, T.rubrum , T. schoenleinii, T. tonsurans si T
violaceum .
• negativ pentru urmatoarele specii de dermatofiti – M. ferrugineum, .T concentricuill
si T verrucosum.

Testul de termotoleranta / termostimulare

Are la baza faptul ca unele specii de dennatofiti tolereaza temperatura de 37°C pentru dezvoltare
(E. jloccosum, T. mentagrophytes, T. rubrum, T. schoenleinii, T.
tonsurans, T. verrucosum, T. violaceum), altele nu (T. ajelloi, T. terrestre etc.);In plus,
pentru unele specii (T. verrucosum, T. soudanense), temperatura de 37°C actioneaza chiar
stimulativ asupra dezvoltarii coloniilor comparativ cu temperaturile mai seazute (25°C, 30°C). In
vederea studierii acestor caracteristici, se insamanteaza perechi de tuburi continand SDA
solidificat in panta cu tulpinile in cauza si se incubeaza diferentiat la 25° sau 30°C ~i 37°C.
Interpretarea testului se realizeaza in momentul cand coloniile ajung la maturitate pe mediile
incubate la 25°-30°C.

Testul de fluorescenta in lumina UV

Examinarea leziunilor cu ajutorul lampii Wood (lampa generatoare de radiatii ultraviolete eu
lungimea de unda intre 330-365 nm) ofera uneori indieatii importante asupra posibilei etiologii
dermatofitice a acestora. In plus, in cazurile de tinea capitis, prelevarea firelor de par afectate
este mult facilitata, deoarece ele emit fluoreseenta in lumina uv.
Fluorescenta, de culoare verde-galbuie sau verde-pal, este produsa de pteridina - o
substanta secretata de unii dermatofiti. Speciile care emit fluorescenta in prelevatele
c1inice sunt: M. audouinii, M. canis, M. ferrugineum ~i T. schoenleinii. Specificitatea
acestui test este redusa deoarece fluorescnta este inconstanta. In plus, sensibilitatea
testului scade dupa badijonarea cu alcool etilic a leziunilor.