Determinarea titrului antitoxinei tetanice in ser prin reactia de

seroneutralizare pe soarece (testul Ehrlich )

Materiale necesare:
1. serul de testat
2. toxina tetanica Lt/200
3. ser antitetanic subetalon 18UI/ml
4. tampon fosfat pH 7.6 ≈ 100ml
5. pipete gradate 1ml (4 buc), 10ml (1buc)
6. 6 tuburi 16/160 pentru dilutie ser si dilutie toxina
7. 5 sticlute de penicilina
8. Seringi de 1ml cu ace 23GX1” 0.6X25mm, pentru fiecare dilutie cate o seringa.

Se pregatesc:
 Pe un stativ 6 tuburi 16/160
4 tuburi pentru dilutie ser antitetanic si
2 tuburi pentru dilutie toxina. Pe fiecare tub se scrie dilutia.
 4 sticlute pentru dilutiile serului de testat . Pe fiecare sticluta se scrie dilutia.
 1 sticluta pentru martor ( M)
 1sticluta pentru ceea ce se arunca la diluarea serului de testat

Se repartizeaza tamponul:
In cele 4 sticlute pentru diluarea serului de testat : 0.3ml in prima sticluta iar in
celelalte 0.9ml ; vom avea dilutiile 1/2, 1/ 20, 1/200, 1/2000
4.5ml(2.25ml), 4.5ml, 4.5ml, 2.6ml, in tuburile pentru dilutiile 1/10,1/100, 1/1000,
1/3600 ale serului antitetanic
4.5ml(2.25), 9.5ml,in tuburile pentru diluarea toxinei 1/10, 1/200
Se efectueaza:
1.Dilutia serului de testat (1/2,1/20,1/200,1/2000)
1/2 ( 0.3ml ser de testat + 0.3ml tampon ).Se barboteaza, se iau 0.1ml si se pun in
sticluta a doua, pentru dilutia 1/20. Se barboteaza apoi se iau 0.5ml din care 0.1se pun
pentru dilutia1/200 si 0.4 se arunca. Se barboteaza, se iau 0.5ml din care 0.1ml se
adauga pentru dilutia 1/2000, si 0.5 se arunca.
In fiecare sticluta vom avea 0.5ml..Se vor adauga la fiecare dilutie cate 0.5ml toxina
tetanica diluata 1/200.
In cazul in care avem o cantitate mica de ser de bolnav , se fac urmatoarele dilutii:
Titrul
1/10 ( 0.1ml ser de bolnav +0.9ml. tampon ) 0.005UI/ml
1/20 ( 0.5ml din dilutia 1/2 +0.5ml. tampon) 0.1UI/ml
1/200 (0.1ml din dilutia 1/20+0.9ml tampon ) 1UI/ml
1/2000 ( 0.1ml din dilutia 1/200+0.9ml tampon) 10 UI/ml

2.Dilutia serului antitetanic 1/3600 (1/10, 1/100, 1/1000, 1/3600)

1/10 (0.5ml ser antitetanic + 4.5ml) tampon sau ( 0.25ml + 2.25ml)
se barboteaza bine,
se iau 0.5ml si se trec in tubul al doilea (se obtine dilutia 1/100), se barboteaza, se iau
apoi 0.5ml si se trec in tubul al treilea ( se obtine dilutia 1/1000),se barboteaza, se ia
1ml si se trece in al 4lea tub, obtinandu-se astfel dilutia 1/3600. Se pune 1ml in sticluta
pentru Martor (M)

1/10 0.5ml ser + 4.5ml tampon sau 0.25ml + 2.25ml

1/100 0.5ml ser + 4.5ml tampon
1/1000 0.5ml ser + 4.5ml tampon
0/3600 1ml ser + 2.6ml tampon

3.Dilutia toxinei 1/10,1/200

F. Important!!! Toxina nu se barboteaza. Se inctiveaza foarte repede! Nu se tine
prea mult la temperatura camerei . Se scoate din frigider doar in momentul in
care se face diluarea ei apoi se pune imediat la loc!!!
1/10 1+9 (0.5+4.5) sau ( 0.25 + 2.25) pentru a face economie de toxina tetanica.
0.25 este cea mai mica cantitate de toxina ce se poate folosi.
1/200 1+19 sau (0.5+9.5); facem 1+19 cand este nevoie de o cantitate mai mare de
toxina.

1/10 ( 0.25ml toxina+2.25ml tampon)

1/200 (1+19) sau (0.5+9.5)

4. Martorul
1ml ser antitetanic diluat 1/3600 + 1ml toxina diluata 1/200
Incubare 45min la 37ºC
Se inoculeaza cate 1 soarece pentru fiecare dilutie a serului de testat cu 0.4ml,
subcutatnat, in regiunea femurala, aproape de coloana. Soarecii inoculati se coloreaza
pentru fiecare dilutie altfel. De obicei se foloseste fuxina ( rosu), stabilindu-se inainte de
inoculare cum se vor colora.
Pentru martor se inoculeaza 2 soareci. Martorul se coloreaza cu galben.
Pentru un ser de testat se face comanda de 8 soareci.
Timp de observatie : 4 zile, cand se noteaza gradele de tetanizare si moartea
animalului cu intoxicatie tetanica.
Martorul ( de toxina) ar trebuie sa moara a 4a cu tetanos generalizat. Daca nu moare
martorul este o problema cu toxina tatanica. Va trebui retitrata.
Titrul serului este dat de dilutia de ser unde animalul moare a 4 a zi cu intoxicatie
tetanica sau prezinta tetanos generalizat ca si martorul.

1/2 0.01UI / ml (unitati internationale)( pragul imunologic de protectie )

1/20 0.1UI / ml
1/200 1UI / ml
1/2000 10 UI / ml
Cand mor toti soarecii inoculati - neprotejat
Cand mor doar martorii- titrul este >10 UI/ml