Variaţiile individuale în

secv.nucleotidică ADN
Normale =
polimorfisme Mut. patologice

Neutre markeri
!!! Determină boli
Identificarea p/u o genă /sindroame genetice
persoanelor patologică Determină
predispoziţia la boli
suscept. la
infecţii
r. adverse la
medicamente
 Testarea genetică
 Testarea (screening-ul) nou-născuţilor -
 P/u identificarea afecţiunilor congenitale corijabile
 Ex: fenilcetonuria, hipotiroidizmul,...
 Teste de diagnostic
 p/u confirmarea unui diagnostic stabilit prin metode clinice şi paraclinice (semne şi
simptoame)
 Prenatal sau postnatal
 Testarea purtătorilor
 p/u identificarea heterozigoţilor Na, purtători de gene recesive patologice
 În familiile cu risc, în cuplurile consanguine
 Testarea prenatală
 p/u depistarea modificărilor genetice în familiile cu risc
 Testarea preimplantativă (PGD)
 p/u prevenirea unor modificări genetice ce pot apărea în timpul asistenţei tehnice a
fertilizării
 Teste predictive şi presimptomatice în patologia adultului
 p/u identificarea genelor de risc la rudele sănătoase a unor eventuali bolnavi
 p/u iniţierea unor măsuri de prevenire a manifestării bolii
 Forensic test
 Secvenţierea ADN pentru depistarea polimorfismelorr individuale în situaţii legale
 Criminalistică
 Catastrofe
 paternitate
 Analiza genelor

ADN ARN Proteine

Secvenţiere Northern-blot Western-blot

PCR RT–PCR Secvenţiere

Southern-blot Hibridare in situ Analiza funcţiei

Hibridare in situ Analiza

histochimică
 Elemente necesare pentru manipularea
ACIZILOR NUCLEICI
- Cum se izolează ADN sau ARN dintr-o celulă?
- Cum se obţin fragmente de ADN de cercetat?
- FR (ER, SR, RFLPs, hărţi de restricţie)
- ADNc (ADN complimentar unei mol. ARNm)
- Fragmente identice de ADN amplificate (primeri
specifici, PCR)
- Cum se separă fragmentele de AN şi cum se apreciază
lungimea → compararea ADNului diferitor persoane?
- Cum se vizualizează ADN, având dimensiuni
submicroscopice?
- Principiile clonării ADN in vivo (vectori de clonare,
gazde de clonare) şi clonării ADN in vitro;
- Denaturarea ADN in vitro
- Hibridizarea mol. ADN (ADN/ADN; ADN/ARN)
Tehnici de analiză a genelor
 PCR
 Southern – blot  RFLPs
 Secvenţierea ADN

 Principii de bază
 Etapele principale
 Componente necesare (la general)
 Indicaţii şi limite
 Tehnici de analiză a genelor

PCR Secvenţiere
Southern-blot
 Amplificare dideoxi  Analiza PLFR
selectivă a unei  Secvenţierea unei mol (RFLPs)
gene ADN
 Clivarea enzimatică
 Prin replicare  Prin sinteza repetată a ADN de cercetat
repetată ciclic de ADN, dar stopată
 Analiza ADN-ţintă
 Cu ajutorul într-o anumită poziţie
după EF, bloting -
ap.replicare dependentă de
prin hibridizare cu
artificial incorporarea ddNTP
sonde
 Taq-  4 serii de reacţii cu complementare
polimeraza ddNTP diferiţi marcate
 2 primeri  Separarea
 dNTP fragmentelor obţinute
 termociclor
la EF
1. Extragerea ADN 2. Pregătirea 3. Amplificarea ADN-ţintă
componentelor pentru PCR

4. Colorarea şi 5. Vizualizarea 6. Autoradiografia şi

Electroforeza interpretarea rezultatelor
produşilor PCR
produşilor PCR
 Analiza Southern-blot

Extragerea ADN Restriţia ADN Electroforeza ADN

Denaturarea şi Hibridare cu sonda Autoradiografia

transferul ADN
pe membrane Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
 RFLPs şi analiza genotipului

Alela Normală cu 3 SR Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2

C (mm)

B (Nm)

A (NN)

Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C

 Tehnica Northern-blot

1. Extragerea
ARNm
Electroforeza ARN

Hibridare cu sonda Autoradiografia

transferul ARN
pe membrane Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
 Secvenţierea ADN

Extragerea ADN
-

(+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-)

+
 Tehnica....................
Tehnica....................
Tehnica....................
Rezultatul:
Rezultatul:
Rezultatul: I-1 aa
+5...
I - aa I-2 Aa
V - AA II-1 aa

P - Aa II-2 aa
II-3 Aa
II-4 aa
III -1 aa
III -2 Aa
 Tehnici de analiză a genelor
PCR Secvenţiere Southern-blot
Gena RGH 2rimeri specif genei 1 primer specific genei ER (enzime de restrictie spec
RGH RGH RGH)
ADN genomic al ADN genomic al Sonda complementara genei RGH
persoanei testate persoanei testate ADN genomic al persoanei testate

Gena FBN1 2rimeri specif genei 1 primer specific genei ER (enzime de restrictie spec HBS)
FBN1 FBN1 Sonda complementara genei RGH
ADN genomic al ADN genomic al ADN genomic al persoanei testate
persoanei testate persoanei testate

Gena HBS 2rimeri specif genei 1 primer specific genei ER (enzime de restrictie spec HBS)
HBS HBS Sonda complementara genei RGH
ADN genomic al ADN genomic al ADN genomic al persoanei testate
persoanei testate persoanei testate

+Taq-polimerază; +ADN-polimeraza; +EF

+dNTP; +dNTP, ddNTP; +Filtru nailon;
+soluţie tampon +soluţie tampon +Peliculă radiosensibilă
+colorant+EF +EF
+Termociclor +Peliculă
+Transiluminator radiosensibilă
 PCR – aplicaţii practice
 Ţinta cercetrii
 ADN genic şi extragenic
 Materialul biologic cercetat
 Orice celulă nucleată a individului testat
 Scopul cercetării
 Amplificarea specifică a unei secvenţe de ADN
 Identificarea genei normale sau mutante
 Identificarea polimorfismului ADN
 Marker individual (dactiloscopie genomică)
 Marker al unei gene patologice
 Aplicaţii în medicină
 Depistarea mutaţiilor genice
 Substituţii nucleotidice
 Deleţii nucleotidice
 inserţii nucleotidice
 Diagnosticul precis şi precoce a bolilor genetice:
 Boli monogenice (ex.:
 Boli poligenice(ex.:
 Boli infecţioase(ex.:
!!!Limite
 Southern-blot – aplicaţii practice
 Ţinta cercetrii
 ADN genic şi extragenic
 Materialul biologic cercetat
 Orice celulă nucleată a individului testat
 Scopul cercetării
 Analiza RFLPs
 Identificarea genei normale sau mutante
 Identificarea polimorfismului ADN
 Marker individual (dactiloscopie genomică)
 Marker al unei gene patologice
 Aplicaţii în medicină
 Depistarea mutaţiilor genice
 Substituţii nucleotidice în SR
 Deleţii nucleotidice mari
 inserţii nucleotidice mari
 Diagnosticul precis şi precoce a bolilor genetice:
 Boli monogenice (ex.:
 Boli poligenice(ex.:
 Boli infecţioase(ex.:
!!!Limite
 Secvenţierea ADN – aplicaţii practice
 Ţinta cercetrii
 ADN genic şi extragenic
 Materialul biologic cercetat
 Orice celulă nucleată a individului testat
 Scopul cercetării
 Identificarea secvenţei nucleotidice a genei analizate
 Identificarea genei normale sau mutante
 Identificarea polimorfismului ADN
 Marker individual (dactiloscopie genomică)
 Marker al unei gene patologice
 Aplicaţii în medicină
 Depistarea mutaţiilor genice
 Substituţii nucleotidice
 Deleţii nucleotidice
 inserţii nucleotidice
 Diagnosticul precis şi precoce a bolilor genetice:
 Boli monogenice (ex.:
 Boli poligenice(ex.:
 Boli infecţioase(ex.:
!!!Limite
 Rolul practic al tehnicilor de analiză a
acizilor nucleici:
1. Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de
gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de
reglare, studiul consecinţelor mutaţiilor.
2. Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice
- prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naşterii
copiilor cu anomalii genetice sau manifestării unor
patologii severe.
3. Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea
vectorilor de gene etc.).
4. Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în
diagnosticul bolilor infecţioase.
5. Identificarea polimorfismelor individuale în analiza
filiaţiei, în criminalistică.