Investeşte în oameni!

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
Axa Prioritară: 1. Educaţia şi formarea
profesională în sprijinul creşterii economice şi
dezvoltării societăţii
Domeniul Major de Intervenţie: 1.5. Programe
doctorale şi postdoctorale în sprijinul cercetării
Titlu proiect: "Sprijinirea tinerilor
doctoranzi cu frecvenţă prin acordarea de
burse doctorale"
Cod Proiect: POSDRU/6/1.5/S/8
Beneficiar: Universitatea de Medicină şi
Farmacie din Craiova
UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE
DIN CRAIOVA

TEZA DE DOCTORAT
Rezumat

RESERVA OVARIANA:
evaluarea markerilor de prognostic si
studiul genetic al insuficientei ovariene

Conducator de doctorat:

Prof. Univ. Dr. Liliana NOVAC

Doctorand:

Adela Ştefania DELCEA (VOICAN)

CRAIOVA 2011
Cuprins
1. Introducere........................................................................... 1

2. Generalităţi .......................................................................... 3

3. Studiul rezervei ovariene în insuficienţa ovariană primară . 5

Pacienţi şi metoda ................................................................ 6

Rezultate .............................................................................. 7

Discuţii. ............................................................................. 11

Concluzii ........................................................................... 13

4. Aspecte genetice ale insuficienţei ovariane: studiul genei

NR5A1 în insuficenţa ovariană primară .................................... 13

Pacienţi, materiale şi metode ............................................. 14

Rezultate ............................................................................ 17

Discuţii şi concluzii ........................................................... 21

5. Aspecte genetice ale hipogonadismului hipogonadotropic -

TAC3/TACR3: noi mutatii şi caracterizarea fenotipurilor
neuroendocrine........................................................................... 22

Pacienţii, materiale şi metodă ............................................ 23

Rezultate ............................................................................ 26

Discuţii .............................................................................. 32

6. Concluziile finale ............................................................... 35

Bibliografie ............................................................................ 37

Anexa: Lista de publicatii si congrese ................................... 41

 1. Introducere

Tendinţele actuale în societatea modernă se

caracterizează printr-o amanare a momentului în care
indivizii isi planifică întemeierea unei familii şi
procrearea. Cu toate acestea, este bine-cunoscut faptul că
îmbătrânirea este însoţită de o alterare a fecundităţii şi
amânarea momentului conceptiei poate duce la un proces
de procreere dificil.
Un element cheie care influenţează rezultatul de
reproducere este reprezentat de rezerva ovariană (RO), o
noţiune care cuprinde atât numărul cat şi calitatea
foliculilor ovarieni disponibili la un moment dat pentru a
produce un folicul dominant târziu, în faza foliculară a
ciclului menstrual (1). Evaluarea sa poate furniza
informaţii esenţiale în cazul femeilor prezintând alterarea
fertilităţii, dar, de asemenea, la femeile sănătoase care
intenţionează să amâne momentul iniţierii unei sarcini.
Insuficienţa ovariană primară (POI), o tulburare
caracterizată prin amenoree şi deficit al hormonilor
steroizi gonadici la femeile mai tinere de 40 de ani (2),
poate fi considerat fenotipul cel mai extrem al diminuării
rezervei ovariene la femeile tinere. Datele existente în
literatura de specialitate cu privire la caracteristicile
markeriilor RO în IOP sunt insuficiente şi informaţii
suplimentare privind rolul acestor markeri în IOP sunt
necesare. Mai mult, etiologia IOP este în prezent
insuficienr înţeleasă şi, în ciuda eforturilor importante
pentru elucidarea mecanismelor responsabile pentru
dezvoltarea acesteia, în marea majoritate a cazurilor
acestă afecţiune este clasificată ca fiind idiopatică.
1
Componenta genetică a fost frecvent sugerată ca o
posibilă explicaţie în cazul formelor nonsindromice de
IOP. NR5A1, un receptor nuclear cunoscut şi ca factorul
steroidogenic 1, a fost recentadăugat pe lista genelor
candidat pentru IOP (3).
În scopul de a evalua frecvenţa mutaţiilor
NR5A1 în IOP, precum şi impactul funcţional al
acestora, am realizat un studiu genetic pe un important
lot de de paciente diagnosticate cu IOP. Prin analiza
mecanismele genetice implicate în această boală
complexă, am urmarit aşadar, elucidarea mecanismelor
patogene evaluând astfel posibilitatea de a genera noi
strategii terapeutice pentru gestionarea acestuia.
Hipogonadismul poate fi rezultatul mai multor
mecanisme. Astfel, pe lângă disfuncţia primară a
gonadelor, situaţie prezentă în cazul IOP,
hipogonadismul poate rezulta, de asemenea, ca o
consecinţă a unei modificări în funcţionalitatea
compartimentului central al axei HPG (de exemplu:
tulburări hipotalamice sau hipofizare). În ultimii doi ani,
TAC3 şi TACR3, genele care codifică neurokinina B
(NKB) şi receptorul acesteia, NK3R, s-au dovedit a juca
un rol fundamental în fiziologia axului gonadotrop
human, mutatiile acestora fiind descrise la pacienţii
afectati de hipogonadism hipogonadotropic (4, 5-8). Într-
o încercare de a descifra rolul jucat de această cale de
semnalizare în fiziopatologia axului gonadotrop, a doua
parte a capitolului privind genetica hipogonadismului se
va concentra pe studiul mutatiilor TAC3/TACR3 la
pacienţii cu hipogonadism hipogonadotropic
nonsindromic normosmic congenital (nCHH).
2
 2. Generalităţi

De-a lungul primul capitol al părţii generale,

intitulat "Ovarul de-a lungul vieţii: un jucător cheie în
funcţia reproducătoare", voi prezenta pe scurt diferite
elemente care influenţează dezvoltarea şi funcţia
ovariană. În continuare, o analiză a consecinţelor
încetării funcţiei ovariene întâlnite în menopauză este
detaliată, alături de controversele legate în prezent de
terapia de substitutie hormonală în menopauză.
Al doilea capitol, intitulat "Rezerva ovariană-
evaluare şi implicaţii clinice", reprezintă o revizuire a
metodelor disponibile pentru evaluarea rezervei
ovariene, precum şi avantajele, dar şi limitele actuale
care caracterizează fiecare metodă.
Partea centrală a acestei secţiuni introductive
este constituită de către capitolul intitulat "Aspecte
patologice ale rezervei ovariene: insuficienţa
ovariană primară". Acest capitol se concentrează pe o
afecţiune caracterizată prin alterarea prematură a
rezervei ovariene, IOP, şi o atenţie deosebită este
acordată mecanismelor genetice implicate în
fiziopatologia ei.
În final, o prezentare detaliată a unei gene
candidat pentru POI, genaNR5A1, este inclusa în ultimul
capitol din literatura de specialitate: "NR5A1 - un
jucător cheie în reproducere".

3
CONTRIBUŢII PERSONALE
 3. Studiul rezervei ovariene în insuficienţa
ovariană primară

În pofida progreselor importante în evaluarea

rezervei ovariane, nu există încă un test care să estimeze
singur, cu exactitate poolul de foliculi ovarieni. Mai
mult, datele cu privire la caracteristicile sau markeri RO
la pacienţii IOP sunt insuficiente. În acest context, având
în vedere necesitatea unor dovezi cu privire la valoarea
markerilor rezervei ovariene in IOP, studiul nostru s-a
concentrat pe evaluarea rezervei ovariene la femeile
internate în clinica noastră pentru investigaţii pentru
infertilitate.
Ne-am axat pe evaluarea parametrilor cel mai
frecvent utilizaţi, sau consideraţi a oferi cele mai bune
rezultate: :
- Hormonul foliculostimulant (FSH): cel mai frecvent
utilizat biomarker în practica clinică actuală (9);
- Hormonul Anti-műllerian (AMH): biomarker
considerat a oferi o mai bună estimare a rezultatelor
ART, comparativ cu alti markeri serici (10);
- Inhibina B: acesta este considerat ca un marker de
oogeneză şi poate astfel oferi o imagine mai clară a
funcţiei ovariene;
- Numărul de foliculi antrali (AFC): acest test ecografic
este considerat un test de prima alegere în estimarea
cantitativa a rezervei ovariene înainte de FIV (11).

5
 Pacienţi şi metoda
În acest studiu am inclus 43 de femei care s-au
prezentat pentru evaluarea unei infertilităţi la Spitalul
Municipal din Craiova, între 2000-2010. Următoarele
criterii de includere au fost aplicate în studiul nostru:
femei mai tinere de 40 de ani, cu niveluri crescute ale
FSH (FSH > 30 UI/l), prezenţa ambelor ovare (evaluate
prin ecografie), nici o dovadă de tulburări endocrine (de
exemplu, sindromul ovarelor polichistice, hipotiroidism,
hipertiroidism sau hiperprolactinemie), care ar putea
interfera cu măsurarea hormonală a rezervei ovariene,
absenţa endometriozei, permeabilitatea trompelor uterine
(evaluată prin histerosalpingografie) şi excluderea unor
cauze de infertilitate masculina în cazul unui cuplu
infertil (analiza lichidului seminal normal). Studiul a fost
efectuat în conformitate cu protocolul care a fost aprobat
de către Comitetul de etică al Universitatii de Medicină
şi Farmacie din Craiova şi consimţămantul scris informat
a fost obţinut de la pacienţii recrutaţi.
Evaluarea hormonală
FSH, LH, E2, PRL si TSH plasmatic au fost
evaluaţi cu ajutorul unui immuno assay
electrochemiluminescenţă (ECLIA), în timp ce AMH şi
Inhibina B au fost determinaţi cu ajutorul unui test
enzimatic-immunosorbent legate (ELISA). În scopul de
a asigura o reprezentare coerentă a profilurilor
hormonale gasite in randul pacientilor nostri, toate
măsurătorile serice hormonale au fost efectuate de către
acelaşi laborator

6
 Evaluarea ecografică a ovarelor.
Evaluarea ecografică a volumului ovarian şi a
prezenţei de foliculi ovarieni a fost realizată prin tehnica
transvaginala folosind un aparat Voluson Expert 730TM
(GE Medical Systems), echipat cu un traductor
transvaginal de 7,5 MHz. Evaluarea a fost efectuată de
acelaşi specialist
Analiză statistică
Variabilele calitative au fost exprimate ca numere
(procente), în timp ce variabilele cantitative au fost
exprimate ca medie de ± SD. Semnificaţia statistică a
fost asumată atunci când o ipoteza nulă poate fi respinsă
la P <0,05. Analiza statistică şi grafică a fost realizată
utilizând versiunea Prism 3.02 (GraphPad Software Inc,
SanDiego, CA).

Rezultate
43 de paciente care s-au prezentat pentru
infertilitate în departamentul de Ginecologie au fost
incluse în studiu. Varsta lor medie a fost de 32,3 (21-40
ani) şi majoritatea au prezentat amenoree secundara (41
de pacienţi, reprezentând 95% din grupul de
studiu).Nivelul FSH mediu a fost de 83.4 MUI / ml
(41.3-196.5 MUI /ml), în timp ce media E2 a fost de
24.8 pmol / L (10 - 136.4 MUI / ml). Cum era de
asteptat, nivelul seric al celor doi markeri hormonali ai
rezervei ovariene, AMH şi Inhibina B, a fost redus:
0.76µg / L şi 12,4 ng / L. Inhibina B a fost sub pragul de
detectare la 25 de pacienţi (58%), în timp ce nivelul
AMH nu a fost detectabil la 27 de pacienţi (62%). La 9
din 16 pacienţi care prezintă un nivel detectabil AMH,
7
acest nivel a fost inferior limitelor normale pentru grupa
de vârstă respectivă (1-8µg /L). Măsurătorile ecografice
transvaginale au inclus OVVOL şi AFC .Volumul
ovarian mediu în studiul nostru a fost de 3,6 cm3, în
timp ce valoarea medie a AFC a fost de 1,8.
Am evaluat ulterior corelaţiile existente între
markerii hormonale ai RO,vârsta pacienţilor şi numărul
de foliculi antral determinati ecografic (Tabelul 3.1).

Varsta FSH E2 Inh B AMH AFC

Varsta 0.056 0.650 0.113 0.993 0.160
FSH 0.293 0.754 0.051 0.935 0.099
E2 0.070 0.049 0.350 0.873 0.432
InhB 0.245 0.298 0.145 0.465 0.001
AMH 0.001 0.012 0.025 0.114 2.72E-06
AFC 0.217 0.254 0.122 0.462 0.647
Tabelul 3.1. Matrice de corelare între vârstă, markerii
hormonali ai rezervei ovariene şi numărul de foliculi ovarieni.
Celulele din stânga jos conţin coeficientul de corelaţie (coeficientul
Pearson), celulele de sus drepta reprezintă valoarea corespunzătoare
aP
Vârsta pacienţilor nu s-a corelat cu niciunul
dintre markerii RO studiaţi (FSH, Inhibina B, AMH sau
markeri ecografici). În plus, nici o corelaţie nu s-a gasit
între FSH şi cealalţi markeri studiaţi, sugerând că în IOP
nivelul de FSH nu este un factor predictiv pentru gradul
de alterare al RO. Inhibina B a fost semnificativ corelată
cu numărul de foliculi ovarieni (R: 0,46, P: 0,001 Figura
3.3.B), şi o reprezentare grafică a nivelului de inhibina B
în funcţie de numărul foliculilor este redată în figura 3.1.
În funcţie de numărul de AFC, pacienţii au fost împărţiţi
în trei grupe: fără foliculi, 1-5 foliculi si mai mult de 5
8
 foliculi. Cel mai bun factor predictiv pentru prezenţa
AFC în studiul nostru a fost reprezentat de AMH (R:
0,64, P <0,0001) - a se vedea Figura 3.2 şi 3.3.C.
100

80
Inhibin B (pmol/L)

60

40

20

0
0

-5

>5
1

Number of ovarian follicles

Figura 3.1. Nivelul seric al inhibinei B în funcţie de numărul foliculilor
antrali. 8

6
AMH level (µ g/L)

0
0

-5

5
>
1

Number of ovarian follicles

Figura 3.2. Nivelul seric al AMH în funcţie de numărul foliculilor antrali.

9
 10 10

8 8

6 6
AFC

AFC
4 4

2 2

0 0
0 50 100 150 200 250 0 20 40 60 80 100
FSH InhibinB(pmol/L)

10

6
AFC

0
0 2 4 6 8
µg/L)
AMH(µ

Figura 3.3. Corelaţia dintre AFC şi trei markeri ai RO: FSH (A),
Inhibina B (B) şi AMH (C).

10
 Discuţii.
În teorie, produsul direct al celulelor granuloase
reflectă cel mai bine capacitatea secretorie ovariană şi
numărul de foliculi. Inhibina B şi AMH sunt două
exemple de astfel de produşi. Inhibina B reglează
secreţia de FSH printr-un proces de feedback negativ în
timp ce AMH are un efect inhibitor asupra populaţiei de
foliculi primordiali, limitând numărul de foliculi
recrutaţi şi semnalizând pool-ul de foliculi inactiv.
Printre markerii ecografici ai RO, volumul
ovarian este acceptat ca util pentru pronostic, chiar dacă
rolul său principal a fost evidenţiat la pacienţii cu
sindromul ovarului polichistic. Pacienţii participanţi in
studiu au prezentat un volum ovarian redus, cu o valoare
medie de 3,6 cm3, sugerând o rezervă ovariană redusă în
grupul nostru de studiu. AFC este considerat un test de
screening important pentru predicţia unui răspuns
ovarian nefavorabil la cuplurile candidat pentru ART.
Am luat în considerare rezultatele AFC, după cum
urmează: evidenţierea unui număr inferior a 5 foliculi a
fost considerată o rezervă alterată, între 5-7 foliculii o
rezervă redusă şi între 8-12 foliculi o rezervă uşor
redusă. Majoritatea pacienţilor incluşi în studiul nostru
au prezentat o rezervă slabă şi o valoare superioară la 5
foliculi a fost găsit doar la 4 pacienti.
Massin et al. au demonstrat anterior că nivelurile
plasmatice de E2 şi inhibina B sunt de o valoare limitată
în estimarea rezervei ovarian la pacientii cu IOP (12). În
studiul nostru, atât inhibina B cât şi AMH au fost
corelate cu AFC. Cu toate acestea, inhibina B, a
prezentat o corelaţie mai puţin importantă în comparaţie
11
cu AMH, sugerând că AMH are o valoare predictivă
superioară pentru prezenţa de foliculi ovarieni. Nu s-a
evidenţiat nicio corelaţie a markerilor rezervei ovariene
cu vârstă sau cu nivelul seric al FSH în IOP, contrar a
ceea ce a fost raportat în cadrul studiilor privind markerii
RO la femeile care nu prezintă o IOP.
Limitările studiului. Având în vedere numărul
relativ mic de pacienţi care au participat la acest studiu,
aceste rezultate trebuie considerate ca analize
preliminare şi studii suplimentare pe grupuri mai largi de
paciente sunt necesare pentru a confirma aceste date. În
plus, prezenţa de foliculi ovarieni a fost evaluată
ecografic, şi nu prin biopsii ovariene, această metodă de
evaluare putând subestima eventual prezenţa foliculilor
ovarieni (12). Cu toate acestea, realizarea biopsiei
ovariene presupune o tehnică invazivă, cu o valoare
limitată în practică, nefiind recomandată în clinică la
femeile cu IOP (13)
Pe lângă impactul manifestat de prezenţa
foliculilor ovarieni în strategia terapeutică a pacienţilor
cu IOP, estimarea RO ar putea fi chiar mai importantă în
evaluarea etiologiei IOP. Strategia de testare pentru
diferitele anomalii genetice responsabile pentru IOP
poate fi adaptată în funcţie de fenotipul ovarian. Astfel,
pacienţii la care prezenţa de foliculi a fost evidenţiată
ecografic, sunt buni candidati pentru studii genetice ale
genelor implicate în foliculogeneză, in timp ce pacientii
la care nu s-au găsit foliculi ar trebui să fie testati pentru
defecte ale genelor implicate în dezvoltarea ovariană sau
la începutul procesului de dezvoltare foliculară (14).

12
 Concluzii
Studiul de faţă arată că la femeile cu IOP,
inhibina B şi AMH sunt pozitiv corelate cu numărul de
foliculi antrali estimaţi prin ecografie, AMH prezentând
o valoare predictivă superioară. Chiar dacă nici unul
dintre markerii existenţi în prezent nu prezintă o valoare
predictivă absolută, evaluarea rezervei ovariene la
pacienţii cu IOP poate ghida atât strategia de diagnostic
etiologic cât şi strategia terapeutică în IOP.

4. Aspecte genetice ale insuficienţei

ovariane: studiul genei NR5A1 în
insuficenţa ovariană primară
Insuficienţa ovariană primară (IOP) este o afecţiune
definită prin amenoree, deficit de hormoni sexuali şi
două determinări ale nivelului seric al FSH superioare la
40UI la femeile mai tinere de 40 de ani (2). Aşa cum am
menţionat anterior, etiologia IOP reprezintă o provocare
pentru clinicieni, şi, în ciuda cercetărilor intense
efectuate în acest domeniu, în marea majoritate a
cazurilor aceasta este clasificată ca "idiopatică". NR5A1
este o genă inclusă recent pe lista genelor posibil
asociate cu IOP (3).
Scopul central al studiului nostru a fost de a
evalua frecventa mutaţiilor NR5A1 în IOP idiopatică.
Mai mult, printr-o analiză detaliată a fiecarui variant
identificat, ne-am propus să oferim dimensiunea
implicaţiilor clinice ale NR5A1/SF-1 în IOP. În plus,
având în vedere diversitatea actuală a fenotipurilor
13
asociate cu mutaţii NR5A1, am evaluat, de asemenea,
posibilitatea de a determina o relaţie genotip – fenotip la
aceşti pacienţi.

Pacienţi, materiale şi metode

Un grup de 357 de pacienţi diagnosticaţi cu IOP
a fost disponibil pentru efectuarea studiului nostru. Un
consimţământ informat scris pentru studii genetice a fost
obţinut de la toţi pacienţii înainte de efectuarea unor
investigaţii suplimentare. Cariotipul şi testarea genetică a
cromozomului X-fragil au fost efectuate la toţi pacienţii
care au participat la studiul nostru şi, prin urmare,
NR5A1 a fost analizată numai la pacienţii cu cariotip
normal şi fără premutaţii ale genei FMR1 (Fragile X
Mental retardation). Grupul control a fost format din 82
de subiecţi din populaţia generală.
Teste de laborator. Nivelurile plasmatice de
FSH şi LH au fost măsurate prin RIA convenţional,
inhibina B a fost măsurată în ser printr-un test
immunometric enzimatic, în timp ce concentraţiile serice
ale AMH au fost măsurate printr-o metodă ELISA de tip
sandwich.
Extracţia şi secvenţierea ADN-ului. ADN-ul
genomic a fost extras din leucocite printr-o procedură
standard. Întreaga regiune de codificare (exonii 2 la 7) a
genei NR5A1 a fost amplificată si produşii de
secvenţiere au fost analizati pe un secvenţiator automat
(ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer, Applied
BiosystemsTM, Foster City, CA). Electroforegramele
rezultate au fost comparate cu referinţa NCBI
NM_004959.4.
14
 Reproducerea mutatiilor in vitro. NR5A1
conţinând mutaţiile S54R, P198L precum şi două
variante ale genei anterior descrise G35E şi P129L, au
fost generate prin Site-Directed mutagenesis
(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit,
Stratagene), folosind ADN complementar al NR5A1
non-mutant uman, într-un vector pCMX. Secvenţa
NR5A1 de codificare a fost verificată prin secvenţiere
completă înainte de efectuarea studiilor functionale.
Cultura celulară. Celulele Hek293T au fost
cultivate la 37°C în 5% CO2, 48 de ore înaintea
transfecţiilor în high-glucose Dulbecco’s minimal
essential medium suplimentat cu 2mM glutamina, 100
UI / ml de penicilină, 100 g / ml streptomicină şi 10%
serum fetal inactivat
Transfecţie. Celulele au fost transfectate
tranzitor în OptiMEM, folosind Lipofectamine 2000, cu
pCMX NR5A1 wild type sau mutant, un plasmid
conţinând un responsive element al NR5A1 într-un
promotor al unei gene ţintă pentru NR5A1 legat de
luciferază (Cyp11a luciferase-construct) şi un vector al
beta-galactozidazei ca şi control al eficienţei transfecţiei.
Luciferase Assay. După 24 de ore de la debutul
transfecţiei celulele au fost clătite cu PBS rece şi
recoltate folosind un tampon de liză pasivă (Promega).
Supernatantul rezultat a fost utilizat pentru luciferase şi
beta-galactozidase assay. Activitatea luciferazei a fost
normalizată faţa de activitatea galactozidazei şi
exprimată ca procente de unităţi relative ale luciferazei,
comparativ cu controlul.

15
Studiul interacţiunii dintre wild-type şi mutant.
Studiul existenţei unei posibile interacţiuni de tip
dominant negativ între wild-type şi NR5A1 mutant au
fost efectuate prin transfecţia în celulele HEK293T a
unor cantităţi succesive de vectori de expresie conţinând
NR5A1 wild-type sau mutant, împreună cu o cantitate
fixă fie a unui vector vid fie a unui vector conţinând WT
NR5A1 şi Cyp11a1reporter. Cantităţile de ADN
transferat s-au menţinut constante prin adăugarea
vectorului vid.
Electrophoretic mobility-shift assay. Extractele
nucleare utilizate în experiment au fost preparate din
celule HEK293T transferate cu NR5A1 wild type sau
mutant. Oligonucleotidele sintetice corespunzătoare a
elementelor de răspuns 3’-SF1 din promotorul minim
Cyp11a au fost produse. Sonda a fost etichetată cu [32p]
dCTP prin utilizarea polimerazei Kleanow. Complexele
ADN-proteine au fost separate pe geluri de
poliacrilamidă, care au fost uscate în vid şi expuse pe un
film pentru raze X la -80° C. In experimentele de
concurenţă s-a folosit un excedent molar de 125 ori de
sondă nemarcată.
Confirmarea transfecţiilor: detectarea ARN şi
proteinelor NR5A1/SF-1. În scopul de a confirma faptul
că celulele HEK293T folosite în experimentele noastre
nu exprimă nativ NR5A1 precum şi pentru a testa
expresia NR5A1 în urma transfecţiei vectorului pCMX
NR5A1, extractele ARN-ului si proteinelor obţinute atât
din celule transfectate cât şi din cele non-transfectate au
fost analizate prin Reverse transcription polymerase

16
chain reaction (RT- PCR) şi Western Blot (WB),
folosind kit-ul High Capacity cDNA Reverse
Transcription (Applied Biosystems) pentru RT-PCR şi
un anticorp NR5A1/SF1 (Santa Cruz Biotechnologies)
pentru experimentele de WB. Detectarea complexelor
rezultate în WB a fost efectuată cu ajutorul Odyssey
Infrared Imaging System (LiCor Biosciences) şi
imaginile au fost analizate cu ajutorul aplicaţiei software
Odyssey, versiunea 1.2 (LiCor Biosciences).

Rezultate
Grupul de studiu iniţial a inclus 357 de paciente
diagnosticate cu IOP cu o varsta medie la momentul
diagnosticului de 26,5 ± 7,8 ani (11-39), cu mediana
nivelului seric al FSH de 78.0 UI/l, (30.3-284; limitele
normale: 3-9 UI/l), o mediană a inhibinei B de 5 pg / ml
(5-381; N: 60-200 ng / l) şi un AMH seric sub pragul de
detectare (0,4 ng / ml) la 113 femei (77%), detectabil dar
inferior intervalului normal la 27 de femei (18%) şi în
limitele normale la doar 7 femei (5%). Valorile serice ale
AMH au fost corelate negativ cu vârsta pacienţilor (r=-
0.23, p=0,005). E2 seric s-a corelat cu nivelurile
inhibinei B (r=0,43, P<0,001). Nicio corelare, fie
pozitivă sau negativă, nu a fost gasită intre AMH,
Inhibin B, si FSH. De asemenea, nici o diferenţă
semnificativă nu a fost observată între FSH, inhibina B şi
nivelul de AMH la pacienţii care se prezintă cu
amenoree primară sau secundară.
Frecvenţa mutaţiilor NR5A1 în insuficienţa
ovariană primară. După excluderea altor cauze de IOP,
secvenţa genei NR5A1 a fost verificată la 188 de
17
paciente. Frecvenţa globală a mutaţiilor rezultată din
studiul nostru a fost de 1,59% (interval de încredere
95%: 0-3.4%). Variantele missense identificate în grupul
nostru de studiu au inclus două variante originale
(p.S54A şi p.P198L) şi două variante raportate anterior
(p.P129L şi p.G123A) (3, 15). Aceste patru substituţii
nonsinonime au fost găsite într-o stare heterozigotă la 3
pacienţi. Toate cele trei paciente erau de origine
caucaziană şi prezentau amenoree secundară şi o
dezvoltarea sexuală normală.
Studiul funcţional al mutaţiilor NR5A1.
Impactul funcţional al variantelor identificate, S54R,
P129L si P198L, a fost testat prin electrophoretic
mobiliy shift assay şi prin luciferase assay. Varianta
G123A, deja descrisă ca având o activitate similară cu
cea a NR5A1 wild-type (3), nu a fost inclusă în
caracterizarea funcţională. O mutatie cunoscută deja ca
loss-of-function fiind prima mutaţie NR5A1descrisă la
om, G35E (c.104G> A şi c.105C> A, p.G35E), a fost
folosită ca un control pentru experimente (16).
Legarea la ADN a celor trei variante a fost testată
folosind o sondă Cyp11 (S54R, P129L si P198L),
capacitatea acestora de legare fiind similară cu cea a
WT-NR5A1 (Figura 4.1). În plus, nu au existat diferenţe
semnificative în activitatea de transcriptie a celor trei
variante comparativ cu WT în testele de tip luciferase
assay în care am utilizat un raportor Cyp11a-luciferase
(Figura 4.2A).

18
72 KDa
55 KDa NR5A1

Figura.4.1. Evaluarea capacităţii de legare la ADN prin EMSA.

A. Nu există diferenţe semnificative între WT şi NR5A1 mutant.
Sonda folosită pentru aceste experimente a conţinut elementul de
răspuns 3’SF-1 din promotorul genei Cyp11A. B. Concentratia de
proteine SF1 pentru fiecare variantă evaluata prin Western blotting a
fost folosita pentru normalizarea rezultatelor. EMSA.

Deoarece toate cele trei mutaţii missense

analizate au fost prezente într-o stare heterozigotă la
pacientele noastre, am testat în continuare posibilitatea
unei interacţiuni de tip WT/mutant şi al existentei unui
efect negativ dominant exercitat de alele mutante asupra
celei WT. Prin cotrasfectarea unor concentraţii crescânde
ale variantelor mutant ale NR5A1 (0, 2, 4, 10 ng), în
prezenţa unor cantităţi constante, fie de plasmidă WT fie
de plasmida vida, nu am identificat un efect dominant
negativ care ar putea împiedica alela WT sa-si exercite
funcţia sa normală (Figura 4.2B).
19
 -- - -++++-- - -++++-- - -++++ -- - -++++ -- - -++++

Figura 4.2. Caracterizarea functională a variantelor missense

NR5A1 identificate în grupul nostru de paciente cu IOP. Evaluarea
prin testul luciferazei a activitatii transcriptionale a NR5A1 (A) şi al
posibilului efect dominant negativ exercitat de variantele NR5A1
mutante asupra WT (B). A. Transfectia unor. cantităţi egale ale
vectorului de expresie vid (-), WT, sau mutant (G35E, S54R,
P129L, P198L). Rezultatele sunt exprimate ca procent din
activitatea WT-NR5A1. B. Transfectia unor cantităţi succesive de
vector vid (-), sau care contine NR5A1 WT sau mutant (0, 2, 4, 10
ng), cu 2 ng vector vid (-) sau 2 ng vector ce contine WT-NR5A1 şi
cu un raportor promotor Cyp11a (100 ng). Cantitatea de ADN
transfectat a fost menţinuta constant prin adaugarea vectorului vid.
Toate experimentele (A, B) au fost efectuate prin utilizarea unui
promotor Cyp11 legat de gena luciferazei şi transfectie în celulele
HEK293T. Datele reprezinta media ± SEM a trei experimente
independente, fiecare efectuate în quadruplicat. RLU: relative light
units (unitati relative de lumina).

20
 Discuţii şi concluzii.
Secventierea genei NR5A1 la 188 de pacienţi cu
IOP şi fără alte anomalii genetice cunoscute a evidenţiat
mutaţii la trei pacienţi, rezultând o prevalenţă globală a
mutaţiilor de 1,59%, semnificativ mai mică decât cea
estimată iniţial de Lourenco et al. În plus, evaluarea
impactului funcţional a celor trei variaţii missense
identificate în grupul de studiul a aratat lipsa unei
diferenţe semnificativă între acestea şi NR5A1 wild type.
Cu toate acestea, deşi capacitatea transactivatoare bazală
a variaţiilor identificate nu diferă de cea a wild type în
sistemul nostru experimental, legătura patogenă dintre
variaţiile NR5A1 şi apariţia IOP nu poate fi exclusă.
Absenţa acestor variaţii în grupul de control sau în
dbSNP sprijină ipoteza unei legături de cauzalitate între
variaţiile NR5A1 şi IOP. Capacitatea de transactivare a
variaţiilor NR5A1 poate fi variabilă în funcţie de gena
ţintă analizată sau, în funcţie de cofactori implicaţi în
procesul de transcriptie. Astfel, evaluarea activităţii
bazale de transcriptie nu poate reproduce situaţiile
întâlnite în realitate în complexitatea mediului gonadal.
În concluzie, analiza genei NR5A1 intr-un mare
grup de pacienti diagnosticati cu IOP au arătat că
NR5A1 nu este o cauza majora de IOP idiopatică şi ne
sugerează că ancheta genetică a NR5A1 în IOP ar putea
fi redusă la un număr limitat de cazuri care prezintă
antecedente familiale de IOP şi tulburări de dezvoltare
sexuală la rudele de sex masculin.

21
 5. Aspecte genetice ale hipogonadismului
hipogonadotropic - TAC3/TACR3: noi
mutatii şi caracterizarea fenotipurilor
neuroendocrine
După analizarea rolului jucat de NR5A1/SF-1 în
IOP, o boală în care defectul primar este localizat la
nivelul gonadelor, studiul genetic al axului gonadotrop a
fost centrat pe o boală caracterizată, de asemenea, prin
insuficienta gonadică, dar de data aceasta determinată de
o afectare centrală al axului gonadotrop: hipogonadismul
hypogonadotropic. Mutatii loss-of-function ale TAC3 şi
TACR3, genele care codifica neurokinina B (NKB) şi
NK3R, receptorul acesteia, au fost descrise la pacientii
cu hipogonadism hipogonadotropic congenital
nonsindromic normosmic (nCHH), sugerând că această
cale are un rol fundamental în fiziologia axului
gonadotrop uman (4, 5-8). Prin efectuarea unui studiu
neuroendocrin detaliat la pacienţi adulţi diagnosticaţi cu
nCHH şi care prezentau mutaţii TAC3/TACR3, ne-am
propus să descifrăm rolul aceastei căi de semnalizare în
fiziopatologia gonadotropă. Am analizat iniţial structura
acestor gene la pacienţii cu nCHH pentru a identifica noi
mutatii, completând ulterior studiul prin
caracterizareafuncţională a mutatiilor nou identificate.
Prin rezultatele obţinute, studiul nostru furnizează astfel
dovezi că NKB şi receptorul său participa la controlul
frecvenţei impulsurilor secretoare de GnRH.

22
 Pacienţii, materiale şi metodă
Dintr-un grup de 352 de pacienţi cu
hipogonadism hipogonadotropic congenital am selectat
173 de pacienţi cu nCHH normosmic la care genele
TAC3/TACR3 au fost secventiate. Prezenţa deficitului
gonadotropic a fost definit de următoarele elemente (17):
pubertate absenta sau incompleta la vârsta de 18 ani;
nivel scazut al testosteronului plasmatic la barbati şi la
niveluri E2 scăzute sau la limita inferioară a normalului
la femei, asociate unor niveluri serice reduse sau normale
ale gonadotropinelor; funcţie hipofizară altminteri
normală; concentraţii normale ale feritinei serice; aspect
normal RMN al regiunii hipotalamo-hipofizare, lipsa
alterărilor olfactorii la oftalmometrie, şi lipsa unor
antecedente familiale de anosmiei/hiposmiei.
Consimţământul informat pentru analizele genetice a fost
obţinut de la toţi participanţii la studiul care a fost
aprobat de Comitetele de etică ale Facultatii de
Medecină Paris-Sud si ale Spitalului BICETRE.
Profilului neuroendocrin al pacienţilor cu
mutaţii TAC3/TACR3 a fost estimat prin evaluarea
secreţiei subunitatea alfa libere, care este considerat cel
mai bun surogat pentru a evaluare secretia de GnRH la
pacienţii care prezintă nCHH şi un profil de secreţie LH
apulsatil (18, 19). Studiul raportului FSH / LH a fost
efectuat la 11 pacienţi cu mutatii bialelice TAC3/TACR3
si rezultatele au fost comparate cu cele ale pacienţilor cu
CHH de diferite origini genetice (de exemplu, mutatii in
GPR54/KISS1R, GNRH1, GNRHR, KAL1, FGFR1 sau
PROK2 /PROKR2).

23
 Studiul profilului hormonal. Am masurat
nivelurile serice ale FSH, LH, inhibinei B, nivelurile de
testosteron şi E2, prin metoda imunoradiometrica,
ELISA sau RIA. LH endogen şi secreţia subunităţii alfa,
analizate prin algoritmul Thomas, au fost evaluate peste
noapte la intervale de 10 minute (20-23). Nivelul seric al
subunităţii alfa libere (Free alpha subunit-FAS) a fost
măsurate printr-o tehnica imunoradiometrica (IRMA),
utilizând doi anticorpi monoclonali (Immunotech,
Marsilia, Franţa).
Analiza ADN. ADN-ul genomic a fost extras din
leucocite prin intermediul unor proceduri standard.
Studii de modelizare al proteinelor. Modelul de
NK3R a fost generat prin omologie, folosind ca model
structura cristalizată a rodopsinei, o proteina cu şapte
domenii transmembranare (7DTM), utilizând Modeller
package (version 9.8) (24). Buclele NK3R ale căror
lungime era diferită faţă de cea a rodopsinei au fost
reconstruite cu ajutorul bancii structurale a proteinelor
(rotamer library), inclusă în O package (25).
Mutageneză dirijată. Mutantii NK3R au fost
reproduşi prin Site-directed mutagenesis (Stratagen
QuickChange II Kit, Stratagene , La Jolla, CA) folosind
o plasmida pcDNA3.1+ în care exista inclusă gena
TACR3 umană şi care este marcată cu hemaglutinina
(HA) la nivelul extremităţii N-terminale extracelulară a
NK3R (Missouri S & T, cDNA Resource Center).
Luciferase assay. Căile de semnalizare ale
receptorilor tachykininei cuplaţi cu proteina G includ
printre altele fosfo-inozitolul si calea MAP kinazei (ERK
1/2) (26). În studiul nostru am folosit plasmida
24
luc2P/SRE/Hygro (Promega), care poate induce
producţia luciferazei ca răspuns la activarea MAP
kinazei într-un sistem de gena raportor. Celulele HEK
293 au fost folosite în experimentele noastre de
transfecţie. După transfectare, celulele au fost tratate cu
şapte diluţii diferite (între 10-10M şi 10-6M) ale
neurokininei B şi incubate timp de 5-6 ore. Ulterior
celulele au fost lizate şi activităţile β-galactozidazei şi
luciferazei au fost determinate folosind un luminometru
(Victor, Perkin Elmer). Pentru a standardiza eficienţa
transfecţiei, unităţile relative ale luminii (RLU) obţinute
în testul luciferazei au fost normalizate faţă de densitatea
optică obţinută în testul β-galactozidazei. Maximul
activităţii a fost considerat la concentraţia NKB de 5x10-
7 M. Toate experimentele au fost efectuate în cel puţin
trei exemplare.
Analiza statistică. Programul Prism versiunea
3.02 (GraphPad Software Inc, SanDiego, CA) a fost
utilizat pentru ajustarea curbelor rezultate din cel puţin
trei experimente independente efectuate fiecare în trei
exemplare.
Imunocitochimie. După transfecţia vectorului de
expresie ce codifică HA-TACR3, celulele au fost tratate
şi incubate peste noapte la 4 °C, cu un anticorp anti-HA
(clona 3F10, Roche Applied Science), urmat de un
anticorp secundar anti-şobolan cuplat cu un fluorocrom
(Dylight 549, Jackson ImmunoResearch Laboratory)
pentru 30 min. Contramarcarea nucleară a fost efectuată
cu 0,5 g/ml DAPI (4 ", 6"-diamidino-2-phenylindole).
Celulele fluorescente au fost observate cu un microscop
Provis Olympus AX70. Imaginile au fost achiziţionate
25
cu Qcapture Pro versiunea 5.1 (Q Imaging Inc). Pentru
marcarea celulelor vii, un microscop confocal laser
scanning Zeiss LSM-510 (Carl Zeiss,Thornwood, NY) a
fost utilizat pentru a achiziţiona serii Z de planuri focale
cu ajutorul unui obiectiv cu imersie Plan Apochromat
63.

Rezultate
Studiul mutaţiilor genelor TAC3/TACR3: studii
de analiza moleculara, modelare şi analiză funcţională.
Nu au fost gasite mutaţii ale GNRH1, GNRHR, KISS1,
KISS1R şi FGFR1 la cei 173 de pacienţi.
Variaţii ale genelor TAC3/TACR3 au fost
prezente la 9 (o varianţie a genei TAC3 şi 8 ale genei
TACR3) din cei 173 de pacienti (5,2%) (Figura 5.1).

Figura 5.1 Reprezentarea schematică a variaţiilor NK3R gasite

intr-o cohorta de 173 pacienţi cu CHH normosmic. Reziduurile
mutante sunt indicate prin cercurile roşii.

26
 Modelizarea şi studiul funcţional al mutatiilor
missense. Modelizarea a fost folosită pentru a prezice
impactul potenţial al mutaţiilor punctiforme asupra
organizării tridimensionale a NK3R. Am constatat că
reziduul hidrofob Tyr267 este situat în mijlocul celui de-
al cincelea segment transmembranar fiind orientat către
bistratul lipidic. Introducerea Asn în poziţia 267 (mutaţia
Y267N) plasează un reziduu polar într-un mediu extrem
de hidrofob. Astfel, este posibil ca acesta să inducă o
reorganizare transmembranară (torsiune sau rotaţie) şi
prin urmare este probabil ca mutatia Tyr267Asn să
determine misfolding-ul si disfunctia NK3R.

Figura 5.2. Localizarea subcelulară a NK3R exprimat în celule

non-permeabilizate şi permeabilizate. Celulele au fost transfectate
cu vectorul de expresie indicat. Nucleele sunt contramarcate cu
DAPI (albastru). Panoul superior: Z-stack de proiecţie a distribuţiei
NK3R in celulele non-permeabilizate, obţinute prin microscopie
confocală. Panou inferior: micrografii fluorescente ale celulelor
fixate şi permeabilizate. A se notă lipsa mutantului Y267N de la
membrana (imaginea superioara), în ciuda expresiei celulare
eficiente (imaginea inferioară), în timp ce NK3R wild type este
localizat la membrana.
27
 Această ipoteză a fost testată prin studii de
imunocitochimie, în scopul de a analiza localizarea
subcelulară a proteinei mutante Trp275stop. Studiile de
imunocitochimie efectuate în celule non permeabilizate
au arătat locaţia membrana a moleculei NK3R de tip
wild type (Figura 5.2, panoul superior). În schimb,
proteina mutanta Tyr267Asn nu a fost detectată la
membrana, sugerând un defect de trafic (27). În scopul
de a se asigura că Tyr267Asn a fost eficient exprimat,
am efectuat experimente de imunocitochimie în celulele
permeabilizate. Comparativ cu wild type, mutantul
NK3R a fost localizat în regiunea perinucleara, sugerand
un proces de misfolding (Figura 5.2, panoul inferior).
Astfel, înlocuirea Tyr267 prin asparagina afectează
direcţionarea corectă a receptorilor la suprafaţa celulei.
Pentru a cuantifica si compara efectul de stimulare al
neurokininei B wild type şi mutante, am realizat curbele
doză-răspuns pentru analiza activitatii luciferazei în
celulele HEK 293. În concordanţă cu studiile de
imunocitochimie şi modelare, analiza funcţionala a arătat
în mod clar că NK3R mutant, spre deoasebire de wild-
type, nu a reuşit să stimuleze gena raportor SRE (Serum
responsive element) sensibila la p44/42 MAP-SRE
(Figura 5.3).

28
Figura 5.3. Caracterizarea functionala a Y267N. Curba doza
NKB - raspuns al raportorului luc2P/SRE. Creşterea concentraţiilor
de NKB a condus la o creştere a activitatii luciferazei in cazul
NK3R wild type (cercuri negre), in timp ce NK3R mutant (triunghi
rosu) nu a crescut în mod semnificativ activitatea luciferazei.

Studii de modelizare şi studii functionale similare

au fost efectuate pentru a caracteriza celelalte variatii
identificate în lotul nostru. În cazul Lys286Arg,
Met306Ile şi Arg230His, nici o diferenţă semnificativă
fata de NK3R wild type nu a fost găsita, sugerând că
aceste variante nu afectează structura şi funcţia NK3R.
Prin urmare, acestea nu pot fi considerate ca factor
cauzal al bolii.
Analiza subunitatii alfa libere (FAS) şi
pulsatilitatea gonadotropinica la pacienţii cu nCHH
si mutatii bialelice TAC3 sau TACR3. Pulsatilitatea
FAS a fost analizată la 3 pacienti, unul prezentand o
mutatie homozigota a TACR3 şi doi prezentand mutatii
homozigote TAC3. Vom prezenta aici rezultatele pentru
doi dintre acesti pacienti Figura 5.4

29
Figura 5.4. Concentratia FAS. Panoul A. Concentraţiile FAS la un
pacient cu nCHH cauzat de o mutatie homozigotă TAC3 (c.209-
1G> C), înainte şi în ziua 19 de administrare a GnRH pulsatil.
Săgeţile indică bolusurile exogene de GnRH (7µg). Panoul B.
Concentratia FAS la o pacienta cu nCHH cauzata de o mutatie
TACR3, înainte şi în ziua 13 de administrare pulsatila a GnRH.
Săgeţile indică bolusuri exogene GnRH (5 micrograme).

Valoarea medie a concentraţiilor bazale FAS la

aceşti pacienţi a fost redusa, cu o frecvenţă redusa a
pulsurilor (1,2 ± 1,3 pulsuri la fiecare patru ore,
intervalul normal: 2.3 - 3.0) şi o amplitudine redusă a
impulsurilor detectate (0,2 ± 0,1 UI /L). Cum era de
asteptat, administrarea pulsatila a GnRH la acesti 3
pacienţi cu nCHH a sporit semnificativ nivelurile de
FAS şi frecvenţa şi amplitudinea pulsurilor FAS, în
conformitate cu dependenţa de GnRH a secretiei
hipofizare de FAS.
Analiza secreţiei bazale a LH si FSH in timpul
noptii la intervale de 10-min timp de 4 ore la un subiect
cu o mutatie TACR3, a aratat niveluri foarte scăzute şi
un model nonpulsatil al secreţiei LH, în timp ce
nivelurile de FSH medii iniţiale au fost semnificativ mai
crescute (Figura 5.5A). În ziua 13 de administrare
pulsatila a GnRH (90 ng / kg / puls, la fiecare min 60,

30
sc), impulsuri de LH au fost detectate, sincron cu
bolusurile GnRH (Figura 5.5 B), şi, concomitent cu o
creştere a concentraţiei de estradiol şi inhibina B şi o
scădere uşoară a FSH seric.

Figura 5.5. Secretia GnRH. A. Modelul de secreţie gonadotropinic

la o femeie cu nCHH şi o mutaţie completă a TACR3. Concentraţia
bazala de LH a fost foarte scăzută şi concentraţia FSH a fost în
limite normale. Panoul B. Pulsatilitatea LH a fost restaurata prin
administrarea pulsatila a GnRH, iar nivelul de FSH seric a scăzut
uşor în cursul administrării GnRH. E2 şi inhibina B (IB) anterior si
dupa administrarea GnRH sunt indicate, respectiv, la partea de sus a
panoului A şi B.

Raportul FSH/LH seric la pacienţii cu mutatii

TAC3/TACR3. Raporturile FSH / LH la 11 subiecţi cu
mutatii bialelice TAC3/TACR3 sunt prezentate în figura
5.6.A. Comparativ cu subiecţii cu nCHH de alte cauze
genetice cunoscute (mutaţii KISS1R sau GnRHR),
sindrom Kallmann (mutaţii KAL1, FGFR1 şi PROK2
sau PROKR2) sau nCHH fără anomalii genetice
identificate, subiecţii cu mutatii TAC3/TACR3 au avut
un raport FSH/LH semnificativ mai crescut. În schimb,
ulterior administrarii pulsatile a GnRH am observat o
reducere a raportului FSH/LH la cei trei pacienti (de la
18.4 ± 17.9 la 0.8 ± 0,2) (Figura 5.6B).
31
Figura 5.6. Raportul FSH / LH la 11 pacienţi cu nCHH cauzat
de mutatii bialelice TAC3/TACR3. Panoul A. Raportul FSH/LH.
Scara Log pe axa Y. A fost realizata o analiză a variantei, prin testul
Kruskal-Wallis (p <0,0001), urmată de comparatia multipla post-hoc
prin testul Newman-Keuls; *indică o diferenţă semnificativă între 2
grupuri (p <0,001). Pragul de separare al raportului FSH / LH la
pacientii cu mutatii TAC3/TACR3 fata de cei cu alte forme genetice
de CHH este indicat printr-o linie orizontală. Panoul B. Reducerea
raportului FSH / LH la un pacient cu mutatie TAC3 si la doi pacienti
cu mutatii TACR3 în timpul administrării pulsatile de GnRH. Notă:
scara Log pe axaY.

Discuţii
Am identificat mutatii TAC3/TACR3 la 5,2% din
populaţia noastră de pacienti diagnosticati cu nCHH, o
prevalenţă similară cu cea descrisă de către Gianetti et al
(7). În această serie, toţi subiecţii cu nCHH şi mutaţii
bialelice TAC3/TACR3 s-au născut din părinţi sănătoşi,
heterozigoţi. Acest lucru confirma transmiterea
autozomal recesiva a nCHH la aceste două forme
genetice, fapt deja raportat de Topaloglu et al. şi de
echipa noastră (4, 6).

32
 Analiza concentraţiilor gonadotropinelor la
pacienţii cu mutatii bialelice TAC3/TACR3 au evidentiat
un nivel seric redus si un model de secretie apulsatil al
LH, în contrast cu concentraţiile FSH care au fost
conservate. Acest profil indica existenţa unei secretii a
GnRH endogen de joasă frecvenţă (şi, probabil, de
amplitudine redusă) (6). Secreţie lenta a FAS observata
la toti cei trei pacienţi studiaţi susţine cu tărie această
ipoteză. În plus, administrarea pulsatila a GnRH la o
frecvenţă fiziologica restabiliteste pulsatilitatea LH şi
secreţia FAS, reducand raportul FSH / LH. Acest model
de raspuns la administrarea pulsatila a GnRH este diferit
de cel raportat la pacienţii cu CHH de cauza
hipotalamica, unde administrarea GnRH conduce la o
creştere a valorilor FSH-ului seric, uneori atingand
niveluri suprafiziologice (28), subliniind originalitatea
fenotipului neuroendocrin al pacienţilor nCHH cu
mutatii TAC3/TACR3. Datele noastre sugereaza ca
deficitul gonadotropic la subiecţii cu mutatii
TAC3/TACR3 este legate de o incetinire a frecvenţei de
secreţie endogena a GnRH. Prin urmare, este probabil ca
neurokinina B, prin intermediul receptorului NK3R,
actioneaza asupra hipotalamusului moduland, fie direct,
fie indirect (prin intermediul neuronilor
kisspeptin/dynorphin/NKB) (29, 30), frecvenţa de
eliberare a GnRH în sistemul port hipotalamo-hipofizar.
Existenţa unui raport FSH / LH crescut înainte de
orice tratament într-un număr semnificativ de pacienţi cu
mutatii bialelice ale TAC3/TACR3, contrar pacientilor
cu alte cauze genetice ale CHH, sugerează că acest
raport ar putea servi ca un marker de diagnostic pentru
33
pre-screeningul mutatiilor TAC3 / TACR3. Acest lucru
ar reduce numărul de subiecţi la care secventierea
acestor gene este necesara si ar reduce astfel costurile
studiilor genetice, desi un numar mai mare de studii sunt
necesare inainte de a recomanda această abordare de
diagnostic.
La toti cei 11 pacienţi cu mutatii bialelice ale
TAC3/TACR3 analizati până în prezent, nCHH a
persistat pana la varsta adulta (de la 18 ani până la 46
ani). Aceste rezultate, în conformitate cu datele raportate
de către Topaloglu et al. (4), Guran et al. (5) şi Fukami et
al.(8), indică faptul că NKB şi NK3R sunt esentiale
pentru secretia fiziologica a GnRH după pubertate, şi nu
numai în timpul vieţii fetale cum a fost sugerat de către
Gianetti et al. (7). Mai mult, existenta unui singur caz
documentat de nCHH reversibil la un pacient cu mutatii
bialelice ale TAC3 raportat până în prezent, indică faptul
că acest fenomen este izolat în această formă genetică de
CHH.
În concluzie, mutatiile TAC3/TACR3 sunt o
cauza genetica importanta de nCHH, care ar trebui
evaluate indeosebi la pacienţii care prezinta un raport
FSH/LH crescut. Pacienţii cu nCHH şi mutaţii bialelice
TAC3/TACR3 reprezintă un model util pentru
descifrarea rolului fiziologic al NKB şi NK3R în
functionarea axului gonadotrop.

34
 6. Concluziile finale
Cele trei contributii majore ale acestei lucrari de
cercetare sunt următoarele:
- Studiul rezervei ovariene în insuficienţa
ovariană primară. Cunoasterea exacta a fenotipului
ovarian la pacienţii cu IOP, definit fie printr-o
persistenţă a foliculilor ovarieni, fie contrar, printr-o
lipsa completa a acestora, are un impact atât in ceea ce
priveste strategia terapeutică cat şi pe cea de diagnostic
la aceşti pacienţi. In studiul nostru am evaluat astfel rolul
diferitilor markeri ai rezervei ovariane la femeile cu IOP
şi am arătat că AMH şi inhibina B sunt singurii care se
corelează cu prezenţa foliculilor ovarieni evaluata
ecografic, AMH-ul prezentand o valoare predictivă
superioară comparativ cu inhibina
-Aspecte genetice ale insuficienţei ovariane:
studiul genei NR5A1 în insuficenţa ovariană primară
Înţelegerea etiologiei IOP este un domeniu de mare
interes şi rolul factorilor genetici este intens studiat.
Evaluarea unor gene noi candidat poate oferi elemente
cheie în înţelegerea IOP şi poate avea un impact in
dezvoltarea de noi strategii teraputice. Am studiat, astfel,
rolul NR5A1/SF-1 în etiologia POI. Prin secventierea
genei NR5A1 într-un grup mare de pacienţi cu IOP şi
realizarea caracterizarii moleculare a mutaţiilor
identificate, am arătat că aceste mutatii joacă un rol
limitat în etiologia IOP, contrar a ceea ce a fost iniţial
propus şi considerăm că ancheta genetica a NR5A1 în
IOP ar trebui limitată la cazuri izolate ce prezintă

35
antecedente familiale de IOP şi de tulburări ale
dezvoltarii sexuale la rudele de sex masculin.
- Aspecte genetice ale hipogonadismului
hypogonadotropic - TAC3/TACR3: noi mutatii şi
caracterizarea fenotipurilor neuroendocrine
Mecanismele moleculare care reglează controlul central
al funcţiei gonadale nu sunt pe deplin înţelese. Pacienţii
cu nCHH şi mutaţii bialelice ale TAC3/TACR3
reprezintă un model util pentru descifrarea rolului
fiziologic al NKB şi NK3R în axul gonadotrop. În
studiul nostru, am demonstrat că mutatiile
TAC3/TACR3 sunt o cauza genetica importanta de
hipogonadism hipogonadotropic, si a caror evaluare este
indispensabila in diagnosticul etiologic in special la
pacienţii cu un raport crescut al FSH / LH.
În general, cercetarea mea de doctorat a studiat
diferitele elemente de incertitudine existente in jurul
rezervei ovariane si a IOP, pornind de la evaluarea RO in
IOP şi a rolului markerilor de predictie actuali,
continuand cu un studiu genetic al unei gene candidat
pentru IOP - NR5A1 şi terminând cu studiul molecular
al mecanismelor centrale responsabile de alterarea
dezvoltării şi funcţiei gonadale.

36
Bibliografie
1. Roudebush WE, Kivens WJ, Mattke JM 2008 Biomarkers of
Ovarian Reserve. Biomark Insights 3:259-268
2. De Vos M, Devroey P, Fauser BC 2010 Primary ovarian
insufficiency. Lancet 376:911-921
3. Lourenco D, Brauner R, Lin L, De Perdigo A, Weryha G,
Muresan M, Boudjenah R, Guerra-Junior G, Maciel-
Guerra AT, Achermann JC, McElreavey K, Bashamboo A
2009 Mutations in NR5A1 associated with ovarian
insufficiency. N Engl J Med 360:1200-1210
4. Topaloglu AK, Reimann F, Guclu M, Yalin AS, Kotan LD,
Porter KM, Serin A, Mungan NO, Cook JR, Ozbek MN,
Imamoglu S, Akalin NS, Yuksel B, O'Rahilly S, Semple RK
2009 TAC3 and TACR3 mutations in familial
hypogonadotropic hypogonadism reveal a key role for
Neurokinin B in the central control of reproduction. Nat Genet
41:354-358
5. Guran T, Tolhurst G, Bereket A, Rocha N, Porter K, Turan
S, Gribble FM, Kotan LD, Akcay T, Atay Z, Canan H, Serin
A, O'Rahilly S, Reimann F, Semple RK, Topaloglu AK 2009
Hypogonadotropic hypogonadism due to a novel missense
mutation in the first extracellular loop of the neurokinin B
receptor. J Clin Endocrinol Metab 94:3633-3639
6. Young J, Bouligand J, Francou B, Raffin-Sanson ML,
Gaillez S, Jeanpierre M, Grynberg M, Kamenicky P,
Chanson P, Brailly-Tabard S, Guiochon-Mantel A 2010
TAC3 and TACR3 defects cause hypothalamic congenital
hypogonadotropic hypogonadism in humans. J Clin Endocrinol
Metab 95:2287-2295
7. Gianetti E, Tusset C, Noel SD, Au MG, Dwyer AA, Hughes
VA, Abreu AP, Carroll J, Trarbach E, Silveira LF, Costa
EM, de Mendonca BB, de Castro M, Lofrano A, Hall JE,
Bolu E, Ozata M, Quinton R, Amory JK, Stewart SE, Arlt
W, Cole TR, Crowley WF, Kaiser UB, Latronico AC,
Seminara SB 2010 TAC3/TACR3 mutations reveal
preferential activation of gonadotropin-releasing hormone
release by neurokinin B in neonatal life followed by reversal in
adulthood. J Clin Endocrinol Metab 95:2857-2867
8. Fukami M, Maruyama T, Dateki S, Sato N, Yoshimura Y,
Ogata T 2010 Hypothalamic dysfunction in a female with
isolated hypogonadotropic hypogonadism and compound
heterozygous TACR3 mutations and clinical manifestation in
her heterozygous mother. Horm Res Paediatr 73:477-481
9. Macklon NS, Fauser BC 2005 Ovarian reserve. Semin Reprod
Med 23:248-256
10. Hazout A, Bouchard P, Seifer DB, Aussage P, Junca AM,
Cohen-Bacrie P 2004 Serum antimullerian hormone/mullerian-
inhibiting substance appears to be a more discriminatory marker
of assisted reproductive technology outcome than follicle-
stimulating hormone, inhibin B, or estradiol. Fertil Steril
82:1323-1329
11. Hendriks DJ, Kwee J, Mol BW, te Velde ER, Broekmans FJ
2007 Ultrasonography as a tool for the prediction of outcome in
IVF patients: a comparative meta-analysis of ovarian volume
and antral follicle count. Fertil Steril 87:764-775
12. Massin N, Gougeon A, Meduri G, Thibaud E, Laborde K,
Matuchansky C, Constancis E, Vacher-Lavenu MC, Paniel
B, Zorn JR, Misrahi M, Kuttenn F, Touraine P 2004
Significance of ovarian histology in the management of patients
presenting a premature ovarian failure. Hum Reprod 19:2555-
2560
13. Nelson LM 2009 Clinical practice. Primary ovarian
insufficiency. N Engl J Med 360:606-614
14. Bachelot A, Rouxel A, Massin N, Dulon J, Courtillot C,
Matuchansky C, Badachi Y, Fortin A, Paniel B, Lecuru F,
Lefrere-Belda MA, Constancis E, Thibault E, Meduri G,
Guiochon-Mantel A, Misrahi M, Kuttenn F, Touraine P
2009 Phenotyping and genetic studies of 357 consecutive
patients presenting with premature ovarian failure. Eur J
Endocrinol 161:179-187
15. Bashamboo A, Ferraz-de-Souza B, Lourenco D, Lin L,
Sebire NJ, Montjean D, Bignon-Topalovic J, Mandelbaum
J, Siffroi JP, Christin-Maitre S, Radhakrishna U, Rouba H,
Ravel C, Seeler J, Achermann JC, McElreavey K 2010

38
 Human male infertility associated with mutations in NR5A1
encoding steroidogenic factor 1. Am J Hum Genet 87:505-512
16. Achermann JC, Ito M, Ito M, Hindmarsh PC, Jameson JL
1999 A mutation in the gene encoding steroidogenic factor-1
causes XY sex reversal and adrenal failure in humans. Nat
Genet 22:125-126
17. Brioude F, Bouligand J, Trabado S, Francou B, Salenave S,
Kamenicky P, Brailly-Tabard S, Chanson P, Guiochon-
Mantel A, Young J 2010 Non-syndromic congenital
hypogonadotropic hypogonadism: clinical presentation and
genotype-phenotype relationships. Eur J Endocrinol 162:835-
851
18. Whitcomb RW, O'Dea LS, Finkelstein JS, Heavern DM,
Crowley WF, Jr. 1990 Utility of free alpha-subunit as an
alternative neuroendocrine marker of gonadotropin-releasing
hormone (GnRH) stimulation of the gonadotroph in the human:
evidence from normal and GnRH-deficient men. J Clin
Endocrinol Metab 70:1654-1661
19. Winters SJ, Troen P 1988 Alpha-subunit secretion in men
with idiopathic hypogonadotropic hypogonadism. J Clin
Endocrinol Metab 66:338-342
20. Salenave S, Chanson P, Bry H, Pugeat M, Cabrol S, Carel
JC, Murat A, Lecomte P, Brailly S, Hardelin JP, Dode C,
Young J 2008 Kallmann's syndrome: a comparison of the
reproductive phenotypes in men carrying KAL1 and
FGFR1/KAL2 mutations. J Clin Endocrinol Metab 93:758-763
21. Bouligand J, Ghervan C, Tello JA, Brailly-Tabard S,
Salenave S, Chanson P, Lombes M, Millar RP, Guiochon-
Mantel A, Young J 2009 Isolated familial hypogonadotropic
hypogonadism and a GNRH1 mutation. N Engl J Med
360:2742-2748
22. de Roux N, Young J, Misrahi M, Genet R, Chanson P,
Schaison G, Milgrom E 1997 A family with hypogonadotropic
hypogonadism and mutations in the gonadotropin-releasing
hormone receptor. N Engl J Med 337:1597-1602
23. Bry-Gauillard H, Meduri G, Abirached F, Constancis E,
Brailly S, Chanson P, Young J 2008 Primary amenorrhea

39
 revealing an occult progesterone-secreting ovarian tumor. Fertil
Steril 90:1198 e1191-1195
24. Eswaran J, Debreczeni JE, Longman E, Barr AJ, Knapp S
2006 The crystal structure of human receptor protein tyrosine
phosphatase kappa phosphatase domain 1. Protein Sci 15:1500-
1505
25. Jones TA, Zou JY, Cowan SW, Kjeldgaard M 1991
Improved methods for building protein models in electron
density maps and the location of errors in these models. Acta
Crystallogr A 47 ( Pt 2):110-119
26. Schmidlin F, Roosterman D, Bunnett NW 2003 The third
intracellular loop and carboxyl tail of neurokinin 1 and 3
receptors determine interactions with beta-arrestins. Am J
Physiol Cell Physiol 285:C945-958
27. Conn PM, Janovick JA 2009 Trafficking and quality control
of the gonadotropin releasing hormone receptor in health and
disease. Mol Cell Endocrinol 299:137-145
28. Pitteloud N, Hayes FJ, Dwyer A, Boepple PA, Lee H,
Crowley WF, Jr. 2002 Predictors of outcome of long-term
GnRH therapy in men with idiopathic hypogonadotropic
hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab 87:4128-4136
29. Wakabayashi Y, Nakada T, Murata K, Ohkura S, Mogi K,
Navarro VM, Clifton DK, Mori Y, Tsukamura H, Maeda K,
Steiner RA, Okamura H 2010 Neurokinin B and dynorphin A
in kisspeptin neurons of the arcuate nucleus participate in
generation of periodic oscillation of neural activity driving
pulsatile gonadotropin-releasing hormone secretion in the goat.
J Neurosci 30:3124-3132
30. Rance NE, Krajewski SJ, Smith MA, Cholanian M, Dacks
PA 2010 Neurokinin B and the hypothalamic regulation of
reproduction. Brain Res 1364:116-128
31. Navarro VM, Gottsch ML, Chavkin C, Okamura H, Clifton
DK, Steiner RA 2009 Regulation of gonadotropin-releasing
hormone secretion by kisspeptin/dynorphin/neurokinin B
neurons in the arcuate nucleus of the mouse. J Neurosci
29:11859-11866

40
Anexa. Publicatii si congrese
Publicatii
Adela Voican, Bruno Francou, Liliana Novac, Nathalie
Chabbert-Buffet, Marianne Canonico, Geri Meduri, Marc
Lombes, Pierre-Yves Scarabin, Jacques Young, Anne
Guiochon-Mantel and Jerome Bouligand 2012
Pharmacology of hormone replacement therapy in
menopause, book chapter in Pharmacology, ISBN 978-
953-51-0222-9, Book edited by: Dr. Luca Gallelli

Francou B, Bouligand J, Voican A, Amazit L, Trabado S,

Fagart J, Meduri G, Brailly-Tabard S, Chanson P, Lecomte P,
Guiochon-Mantel A, Young J. 2011. Normosmic
congenital hypogonadotropic hypogonadism due to
TAC3/TACR3 mutations: characterization of
neuroendocrine phenotypes and novel mutations.
PLoS One. 2011;6(10):e25614. Epub 2011 Oct 21

Adela Voican, D. Iliescu, Stefania Tudorache, Liliana

Novac. 2011 Mecanisme genetice implicate in
insuficienta ovariana prematura. Obstetrica si
ginecologia LIX (2011): 99-106

In pregatire:
Adela Voican, Anne Bachelot, Jerome Bouligand,
Bruno Francou, Marc Lombes, Philippe Touraine, Anne
Guiochon-Mantel. NR5A1/SF-1 mutations are not a
major cause of primary ovarian insufficiency
Principalele lucrari la congrese:
The joint 15th International Congress of Endocrinology
and 14th European Congress of Endocrinology 2012
Adela Voican, Anne Bachelot, Jerome Bouligand, Bruno
Francou, Marc Lombes, Philippe Touraine, Anne Guiochon-
Mantel. Variants of the NR5A1 gene in a large cohort of
patients with primary ovarian insufficiency

ENDO 2011, Boston, June 4-7, 2011

Bruno Francou, Jerome Bouligand, Adela Voican, Larbi
Amazit, Severine Trabado, Jerome Fagart, Geri
Meduri, Sylvie Brailly-Tabard, Philippe Chanson, Pierre
Lecomte, Anne Guiochon-Mantel, and Jacques Young
Normosmic Congenital Hypogonadotropic Hypogonadism
Due to TAC3/TACR3 Mutations: Prevalence,
Characterization of Neuroendocrine Phenotypes and
Novel Mutations 2011 Endocr Rev 32: OR05-1

European Congress of Endocrinology 2011, Rotterdam

30 april - 4 May 2011
B Francou, J Bouligand, A Voican, L Amazit, S Brailly-
Tabard, P Lecomte, J Young & A Guiochon-Mantel
Normosmic congenital hypogonadotropic hypogonadism
due to TAC3/TACR3 mutations: characterization of
neuroendocrine phenotypes and novel mutations 2011
Endocrine Abstracts 26 P178

European Congress of Endocrinology 2010, Praga 24 –

28 April 2010
Adela Voican, Gabriela Niculescu, Magdalena Manolea,
Dominic Iliescu, Carmen Gheta & Liliana Novac The value
of ovarian reserve markers in assisted reproductive
technology 2010 Endocrine Abstracts 22 P497
42