LP.

24 Identificarea micobacteriilor
Diagnosticul de laborator al tuberculozei pulmonare

Obiective: La sfârşitul lucrării practice studenţii trebuie să cunoască:

1. Etapele identificării micobacteriilor
2. Etapele efectuării coloraţiei Ziehl Neelsen
3. Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei pulmonare
4. Particularităţile testării sensibilităţii la antituberculoase
5. Particularităţile testelor de eliberare de interferon gama

1. Identificarea micobacteriilor: Mycobacterium tuberculosis

 Identificare preliminară
- Caractere microscopice: bacili fini, granulaţi, uneori ramificaţi, aşezaţi în litere unghiulare,
acido-alcoolo-rezistenţi (BAAR), imobili, nesporulaţi, necapsulaţi. Pe frotiul de cultură în mediul
lichid pot fi dispuşi paralel sau în corzi flexuoase.
- Caractere de cultură: sunt bacterii pretenţioase nutritiv (cultivă pe mediul Lőwenstein Jensen,
mediul Middlebrook), cu creştere lentă (primocultura apare după 2-4 săptămâni), aerobi sau
microaerofili. Forma de cultură R: coloniile sunt conopidiforme, rugoase, uscate, grunjoase, de
culoare crem bej.
 Identificare de certitudine:
- Identificare biochimică
- Identificare antigenică: detecţie de antigene specifice M. tuberculosis prin imuncromatografie
- Identificarea acizilor graşi din peretele bacterian prin gaz cromatografie
- Identificare genotipică prin tehnici de biologie moleculară (sonde de acizi nucleici/PCR)

2. Coloraţia Ziehl Neelsen (coloraţie diferenţială: împarte bacteriile în acido-alcoolo-rezistente

şi ne-acido-alcoolo-rezistente)
 Etape:
1. Colorarea - fucsină fenicată Ziehl; se încălzeşte lama până colorantul emite vapori. Se repetă
încălzirea cu intermitenţă timp de 3-5 minute; după răcire se spală cu apă.
2. Diferenţierea: soluţie alcool etilic - acid clorhidric; se decolorează până când frotiul rămâne
alburiu după spălare cu apă.
3. Recolorare: albastru de metilen, 30 secunde, apoi se spală.
 Rezultate: BAAR sunt roşii iar bacteriile neacido-alcoolo-rezistente şi leucocitele sunt
albastre.
 Controlul de calitate: se colorează Ziehl Neelsen şi se examinează două frotiuri: unul dintr-o
suspensie de bacili neacido-alcoolo-rezistenţi iar celălalt dintr-o suspensie de bacili acido-
alcoolo-rezistenţi. Pe primul frotiu vedem numai bacili albaştri iar pe al doilea numai bacili
roşii.

3. Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei pulmonare

A. Prelevarea şi transportul produselor patologice.
- Se prelevă, de regulă, spută (3 probe consecutive, recoltate la 8-24 ore interval, cel puţin una
fiind prima proba matinală).
Alternative: aspirat traheo-bronşic, lichid de spălătură bronşică sau spălătură gastrică, lichid
pleural (pleurezie tuberculoasă).

1
- Se transportă la laborator în mai puţin de o oră.
- Refrigerarea probelor care nu sunt examinate într-o oră.
B. Decontaminarea chimică a sputei se face cu o soluţie de NaOH 4% .
C. Examenul microscopic:
 Examinarea unui frotiu de spută colorat Ziehl Neelsen (se examinează 100 câmpuri, obiectiv
100X).
Rolul examenului microscopic:
- Identifică genul bacteriilor, dar nu şi specia;
- Depistează rapid bacilii tuberculozei;
- Depistează BAAR care nu cultivă în condiţiile oferite.
Interpretare:
- Bacterioscopia pozitivă are întotdeauna semnificaţie clinică de infectant;
- Bacterioscopia negativă nu exclude diagnosticul de tuberculoză dată fiind sensibilitatea redusă
a microscopiei.

Număr de bacili/câmp Rezultat

0/100 câmpuri Absenţi BAAR
1-3/100 câmpuri Se examinează 300 câmpuri
4-9/100 câmpuri Se comunică numărul
10-99/100 câmpuri Slab pozitiv (+)
1-9/câmp Moderat pozitiv (++)
>10 câmp Intens pozitiv(+++)

Fig 1. Frotiu spută colorat Ziehl-Neelsen, marire 1000x.

Categorie microscopică: Mycobacterium spp.
Legenda: rosu - BAAR; albastru - bacterii neacido-alcoolo-rezistente, leucocite
https://www.thermofisher.com/blog/proteomics/mycobacterium-tuberculosis-using-quantitative-proteomics-to-
understand-virulence/

D. Izolarea pe medii de cultură: mediu Lőwenstein Jensen, agar Middlebrook - incubare la 37ºC
şi urmărire săptămânal timp de 3 luni.
- sistemele automate de cultivare, care realizeaza detecţia fluorescentă a consumului de O2 sau
detecţia colorimetrică a CO2, scurtează timpul de detecţie a culturii.

2
Interpretare
Prezenţa culturii - confirmă diagnosticul.
Absenţa culturii - nu exclude diagnosticul, deoarece pot exista leziuni închise care elimină
intermitent cantităţi mici de bacili (de aceea se fac culturi repetate) sau tulpinile sunt mai
pretenţioase nutritiv.

Fig. 2. Cultură pe mediul Lőwenstein Jensen

https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC1310521_1476-0711-4-18-5&req=4

E. Identificarea M. tuberculosis.

Fig. 3. Detecția Ag MPT64

https://www.google.ro/search?q=antigenului+proteic+MPT64

F.Testarea sensibilităţii la antituberculoase

4. Particularităţile testării sensibilităţii la antituberculoase

- antibiograma - variantă a metodei diluţiilor care depisteaza tulpinile rezistente la un
antituberculos comparand cresterea bacteriana in prezenta antibioticului cu cea in absenta
antibioticului.
- mediul Lőwenstein Jensen suplimentat cu antituberculoase
- antituberculoase de linia I: izoniazidă, rifampicină, etambutol, streptomicina, pirazinamida
- antituberculoase de linia a-II-a: etionamida, cicloserina, capreomicina, fluorochinolone
(ofloxacina), aminoglicozide (kanamicina), rifabutin, viomicina, acid para-aminosalicilic (PAS).
- metoda automatizată

3
- metode moleculare – evidenţierea genelor de rezistenţă: gena rpoB (rezistenta la RIF), gena
inhA (rezistenta la HIN).
Tulpina MDR (multidrog rezistentă) – rezistenţă simultană la RIF şi HIN cu/fără rezistenţă la
alte antituberculoase de linia I.

5. Testele de eliberare de interferon gama (Interferon-Gamma Release Assays - IGRA):

- măsoară reactivitatea imună a gazdei la prezenta M. tuberculosis.
- sunt efectuate pe sange venos integral proaspăt
Principiu. Limfocitele T din sangele unei persoane infectate cu M. tuberculosis vor fi activate si
vor elibera interferon gama atunci când sunt puse in contact cu antigene ale M. tuberculosis.
Interpretare:
- test pozitiv: prezenta infectiei cu M. tuberculosis, dar fara a putea face diferenta intre infecția
latentă si boala tuberculoasă
- test negativ: absenta infectiei cu M. tuberculosis
Avantaje
 testul nu este pozitiv la persoane vaccinate BCG;
 rezultatele pot fi disponibile în 24 de ore.
Dezavantaje
 Datele limitate privind utilizarea IGRA pentru a aprecia evolutia către boala TB;
 Datele limitate privind utilizarea IGRA la: copii mai mici de 5 ani; persoane recent expuse la
M. tuberculosis; persoanele imunocompromise;
 Cost ridicat.

Bibliografie: Buiuc D.: Microbiologie Medicală, ed. a VI-a, Editura “Gr. T. Popa” Iaşi, 2003,
cap. 19, pag. 252-257.
https://www.cdc.gov/tb/publications/factsheets/testing/igra.htm