IZOLAREA SI IDENTIFICAREA MICOBACTERIILOR

Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium leprae

Produsul patologic
- în tuberculoza pulmonară–spută, aspirat bronşic, lichid pleural, spălătură gastrică
- în tuberculoza renală – urina (toată cantitatea de urină emisă dimineaţa)
- în tuberculoza genitală – secreţie vaginală, cervicală, spermă, secreţie prostatică
- în tuberculoza articulară, osoasă – lichid sinovial, puroi
- în tuberculoza ganglionară – material din puncţie ganglionară, puroi
- în meningita tuberculoasă – LCR
1. Examen direct
-au un continut crescut de lipide (acid micolic)- acest caracter confera acido-alcoolo-rezistenta acestor
bacterii
- frotiu colorat Ziehl-Neelsen – bacili lungi şi subţiri, uşor încurbaţi, nesporulati, necapsulati, imobili, roşii
(acido- alcoolo-rezistenţi), fondul preparatului fiind albastru

-1-
2. Izolare
- pe mediul Lowenstein-Jensen , care conţine săruri
minerale, asparagină sau acid glutamic, amidon,
gălbenuş de ou, glicerină şi verde malachit
- incubare la 37C, (4- 6 saptamani) până la 90 de zile
3. Identificare
- caractere morfotinctoriale
- caractere de cultură
o tipul uman are o creştere lenta, favorizată de prezenţa glicerinei
 creşte în 2-3 săptămâni
 colonii de tip R, neregulate, uscate, conopidiforme, ca firmiturile de
pâine
 coloniile se detaşează uşor de pe mediu şi se emulsionează greu în SF
 în mediu lichid formează la suprafaţă un văl gros ce se întinde mai
repede
o tipul bovin are o creştere rapid
 colonii de tip S, mici, netede
 coloniile se detaşează greu de pe mediu şi se emulsionează uşor în ser
fiziologic
 în mediu lichid formează la suprafaţă un văl subţire, friabil, cu
dezvoltare lentă
- inoculare la animale de experienţă – cobaiul
4. Caractere biochimice
Sunt germeni aerobi, au enzima catalază, se dezvoltă la un pH uşor acid,
tipul hominis este singurul care produce acid nicotinic.
Antibiograma
- se efectuează pe mediul Lowenstein în care au fost incluse tuberculostatice

5. Caract ere ant i geni ce - constituenţii peretelui celular induc apariţia

unui răspuns imun de tip celular si a unei hipersensibilităţi de tip IV:
Tuberculo-lipidele
Tuberculo-proteinele
▪induc sensibilizare de tip anafilactic
▪în asociere cu tuberculolipide induc răspuns imun predominant celular
polizaharidele
▪induc formarea de anticorpi circulanţi
 Diagnostic indirect
- Intradermoreacţia Mantoux
- se inoculează intradermic tuberculină purificată (PPD, 2 unităţi)
- este o IDR alergică
- dacă persoana nu a venit în contact cu germenele
(nu a fost bolnav, nu a fost vaccinat), atunci la locul inoculării
nu apare nici o reacţie, IDR negativ - pacientii respectivi vor avea indicatie de
vaccinare,
- daca pacientul a fost vaccinat si/sau a trecut prin primoinfectie apare o
reactie locala (eritem si edem) cu un diametru transversal al edemului < 10 mm,
- daca diametrul induratiei este > 10 mm, pacientul va fi monitorizat:
MRF si/ sau efectuarea unui frotiu colorat Ziehl-Neelsen din sputa.
▪ Caractere de patogenitate
▪ Mycobacterium tuberculosis nu produce toxine
▪ este patogen prin capacitatea sa de a se multiplica în organismul gazdă
▪ distrugerea bacteriei se soldează cu eliberarea de constituenţi antigenici care
induc o reacţie imunitară de hipersensibilitate ce stă la baza transformării
cazeoase
Tehnica de prelevare a sputei:
-în recipiente sterile de unică folosinţă,
- înainte de începerea tratamentului medicamentos.
- Se recoltează dimineaţa la sculare o cantitate de 5-10 ml, se va repeta
la 3-4 zile, se poate păstra la 4° C cu adaos de carbonat de sodiu pulvis,
50 mg la 5 ml spută; sau fosfat trisodic (2-4 ml din sol 15%).
- Se vor respecta regulile de asepsie a personalului care asistă sau
transportă probele.
-Aspectul sputei: este purulentă, nu se va lucra sputa mucoasă, care de
cele mai multe ori este salivă.
-Sputa astfel recoltată, se va transporta în laborator, se va spăla în SF în
trei băi separate, şi apoi se va recolta fragmentul purulent, se va
însămânţa pe medii selective tip Lowenstein-Jensen (L-J) şi se vor face
mai multe frotiuri.
- se vor colora albastru de metilen unde se vor pune în evidenţă PMN ,
care trebuie să fie de cel puţin 5 ori mai multe decât celulele epiteliale şi
coloraţii Ziehl Neelsen pentru a fi puşi în evidenţă bacilii tuberculoşi.
- Când numărul de germeni în produsul patologic este redus (paucibacilar), frotiul se face
după omogenizarea şi concentrarea produsului patologic.
-Omogenizarea se face într-un balon de 250 ml, cu fund plat, peste spută se adaugă o
cantitate egală sau de 2-3 ori mai mare de NaOH 0,5%, la 60°C, 30 min.
- Concentrarea prin flotare, se obţine prin adăugare de apă distilată (AD) până la jumătatea
balonului şi 2 ml de xilol sau neofalină. Se agită energic 10 min, se adaugă AD până la
jumătatea gâtului balonului, se lasă în repaus 30 min, timp în care se formează un inel
cremos în care au fost concentraţi bacilii tuberculoşi din produs.
Stratul cremos este aspirat într-o pipetă Pasteur prevăzută cu o pară de cauciuc, sau un
pipetor automat. Pe 2-3 lame degresate, care sunt aşezate pe o platină încălzită sau pe un
geam deasupra băii, se depun succesiv, picături din materialul cremos, până când acesta se
epuizează, apoi frotiul va fi uscat, fixat la flacără şi colorat Ziehl-Neelsen.
Se va examina la microscop cu imersie şi se va face o apreciere cantitativă:
- 0 baciJi/ 300 câmpuri microscopice =absentă b.a.a.r;
- 1-3 bacili/ 300 câmpuri = prezenţa b.a.a.r se solicită repetare;
- 4-9 bacili/100 U = prezenţa b.a.a.r (+);
- 10-100 bacili/100 = prezenţa b.a.a.r (++);
- peste 100 bacili/100 câmpuri mic. = prezenţa b.a.a.r (+++).
Concentraţia micobacteriilor tuberculozei în spută este totdeauna în raport direct cu
dimensiunea şi intensitatea leziunii. Alte bacterii AR posibil de întâlnit în frotiuri se
deosebesc morfologic: nocardiile şi actinomicetele sunt filamentoase, cu ramificaţii şi
extremităţi îngroşate. Apoi produsul patologic se va însămânţa pe mediile de cultură
amintite. Controlul creşterii pe mediile de cultură se face prin frotiuri colorate Ziehl-
Neelsen.
Identificarea rapidă a micobacteriilor
Se face prin colorare cu fluorocromi
(auramin-rhodamină) a sputei şi se
examinează cu microscopul cu fluorescenţă,
micobacteriile se colorează în galben
portocaliu, pe fond negru.
Reacţia de amplificare genică (PCR)
Sonde ADN identifică prin hibridare
secvenţe nucleotidice specifice unor
micobacterii.
 Genul Mycobacterium
• Din punct de vedere clinic, tuberculoza se
caracterizeaza prin:
• oboseala, astenie, subfebrilitati vesperale, tusa
cu expectoratie (hemoptizie), antecedente
personale patologice incarcate (fumator,
afectiuni respiratorii frecvente, purtator cronic,
nivel socio-economic scazut).
 Genul Mycobacterium

• Evolutia poate fi:

· favorabila (autolimitare, autosterilizare) sau
· nefavorabila (ramolisment cazeos, fistulizare in
bronsii si in final dezvoltarea cavernelor,
reprezentand surse majore de diseminare
sanguina si limfatica).
 Genul Mycobacterium

• Transmiterea tuberculozei se face mai ales pe

cale aerogena, favorizata de conditii insalubre,
supraaglomerarea, intuneric, umezeala
 PROFILAXIE
• Profilaxia nespecifică
• depistarea precoce a surselor de infecie
• izolarea lor
• tratarea
• educatia sanitară a populaiei
• Profilaxia specifică
• vaccinarea BCG
• obligatorie la noi în ară
• vaccinul contine o tulpină de Mycobacterium bovis
• a pierdut capacitatea patogenă rămânând imunogenă
• vaccinul BCG (bacille Calmette-Guerin) se utilizează în
profilaxia tuberculozei din 1921
Mycobacterium leprae
-Sunt bacili acid-alcoolo-rezistenţi, în coloraţia Ziehl-Neelsen apar
roşii.
-Sunt lungi de 4-5 pm şi groşi de 0,4-0,5 pm, se găsesc exclusiv
numai la oameni, sunt dispuşi intraceluar în grămezi compacte.
- Nu cultivă pe medii artificiale şi nici pe medii vii (culturi celulare
sau animale de laborator).
-Poate cultiva pe şoarecele alb
-Aceşti bacili au multiplicare strict intracelulară, unde formează
grămezi care se numesc globi leproşi (ca ţigările într-un pachet)
-Este rezistent în mediul extern, sensibil la sulfone şi rifampicină,
iar tratamentul durează 5 ani.
 Identificarea micobacteriilor
• impune competenţă, norme de securitate microbiologică, dotări şi facilităţi
particulare.
• laboratoarele implicate în Programul Naţional de Control al Tuberculozei
sunt ierarhizate pe 3 niveluri:
• Nivelul I, laboratoarele dispensarelor teritoriale de pneumoftiziologie,
efectuează microscopia pentru depistarea b.a.a.r, şi trimit prelevatele
patologice laboratoarelor de nivel II, pentru efectuarea culturilor, asimilate
acestor laboratoare sunt unele din laboratoarele clinice.
• Nivelul II, laboratoarele dispensarelor/staţionarelor judeţene de
pneumoftiziologie şi ale marilor spitale cu paturi pentru pacienţi cu
tuberculoză, trebuie să asigure izolarea micobacteriilor, identificarea M.
tuberculosis, identificarea primară a micobacteriilor non-tuberculoase cu
sau fără testare a sensibilităţii la antibiotice.
• Nivelul III, sunt laboratoarele de referinţă, asigură identificări definitive,
monitorizarea laboratoarelor de nivel I şi II, supraveghează dinamica
chimiorezistenţei primare şi deţin colecţia naţională de tulpini de referinţă
micobacteriene.