LABORATORUL DE

ANATOMIE-PATOLOGICA
STRUCTURA, ELEMENTE DE TEHNICA, APLICATII CLINICO-
PATOLOGICE

Dr. Florinel Pop

Patologie chirurgicala
UMF CAROL DAVILA BUCURESTI
 STRUCTURA

• PROSECTURA
• LABORATOR DE CITOPATOLOGIE
• LABORATOR DE HISTOPATOLOGE
• LABORATOR DE HISTOCHIMIE
• LABORATOR DE MICROSCOPIE
ELECTRONICA
• LABORATOR DE DIAGNOSTIC
MOLECULAR
 LABORATOR DE CITOPATOLOGIE
CITOLOGIA CLINICĂ

•metodă de diagnostic rapidă, ieftină, efectuată cu

•disconfort minim pentru pacient şi cu o largă acceptabilitate şi
aplicabilitate
•specimenele citologice pot fi obţinute din:
1. fluide - spută, lichide pleurale, ascita, urină, lichid
cefalorahidian (LCR), lichid sinovial
2. din puncţii biopsii cu ac fin (fine needle aspiration, FNA) a
maselor solide,
3. frotiuri şi raclaje ale leziunilor superficiale (exemplu, frotiul
Babes-Papanicolau)
4. în urma exciziilor chirurgicale (amprente)
 AVANTAJELE CITOLOGIEI

•morbiditatea pacienţilor aproape inexistentă

•conservare citologică excelentă

•se pot eşantiona arii largi

•celulele şi nucleii rămân intacte (avantaj pentru studii speciale)

•recoltarea, prepararea şi examinarea pot fi realizate într-o perioadă

scurtă de timp
•permite arhivarea materialului patologic pentru studii moleculare
(citobloc)
 TEHNICI DE RECOLTARE

Citodiagnosticul se bazează pe patru categorii de tehnici de

recoltare:
•Citologia exfoliativă
•Colecție de celule obținute prin periaj sau alte tehnici
abrazive similare
•Biopsia aspirativă (FNA) sau obținerea de celule de la
nivelul unor mase palpabile și profunde, cu ajutorul unui
ac, cu ghidaj imagistic
•Citologia intraoperatorie
 CITOLOGIA EXFOLIATIVĂ

Descuamarea spontană a celulelor de tapetare ale unui organ, atunci când

acestea pot fi îndepărtate prin metode neabrazive.
•domenii de aplicare: tractul genital feminin (frotiul cervico-vaginal),
•tractul respirator (sputa),
•tractul urinar (urina eliminată spontan),
•efuziuni (pleurale, peritoneale, pericardice),
•alte fluide (LCR, lichid sinovial)
 CITOLOGIA ABRAZIVĂ (PERIAJUL) ȘI
TEHNICI DE LAVAJ

•citologia abrazivă are ca scop îmbogățirea frotiului cu celule obținute direct de

pe suprafața organului țintă
•domenii de aplicare:
- tractul genital feminin (frotiu cervico-vaginal, vulvar, endometrial),
colecții și lavaje peritoneale,
- tractul respirator (periaj bronșic, lavaj bronhoalveolar),
- cavitatea orală și organe adiacente (frotiu abraziv),
- tractul urinar (lavaje),
- tractul gastrointestinal (balon gastric sau esofagian cu suprafață
abrazivă, colon),
- ducte biliare și pancreas (aspirația sucului pancreatic, periaj)
BIOPSIA ASPIRATIVĂ CU AC FIN (FNA)

Puncţia este o manoperă efectuată cu un ac subţire, iar produsul

rezultat reprezintă materialul aspirat provenit din masa tumorală puncţionată:
• lichidă (chisturi) sau
• solidă (cazul tumorilor propriu zise: fibroadenom, carcinom, ganglion)
• materialul obţinut prin aspiraţie cu ac fin se etalează (întinde) pe o lamă
sub forma unui frotiu, ulterior colorată printr-o tehnică citologică de colorare
şi apoi interpretată la microscopul optic de către medicul anatomo-patolog
sau citolog

• Necesita experienta.
 AVANTAJELE FNA

•metodă rapidă, simplă, economică (cost mult mai scăzut comparativ cu

biopsia)
•abordabilă pentru diferite localizări şi uşor tolerată de pacient: glanda
mamară, tumori cutanate, glanda tiroidă, ficat
•rezultatul poate fi obţinut într-o zi
•nu necesită spitalizare, putându-se efectua în sala de operaţie sau într-un
simplu cabinet al serviciului de policlinică sau ambulator
•nu lasă cicatrici, spre deosebire de biopsii
•oferă confort psihic mai bun decât o intervenţie chirurgicală, fiind mai puţin
traumatizantă decât o biopsie
 CITOLOGIA INTRAOPERATORIE

•frotiurile se obțin prin presarea forțată a unei lame de sticlă pe suprafața de

secțiune a țesutului, prin răzuirea suprafeței de secțiune a biopsiei sau prin
strivirea unor mici fragmente tisulare între două lame și tragerea lor în afară (în
cazul leziunilor SNC)
•aplicabilă tuturor organelor și țesuturilor: biopsii mamare, paratiroidă, colul
uterin, limfoganglionul santinelă în cancerul
•mamar și melanomul malign
•avantaje: frotiurile sunt mai ușor, mai rapid și mai ieftin de preparat
(diagnostic rapid)
•coloratie cu albastru de toluidina, H&E.

•Necesita experienta
 CITOLOGIA EXFOLIATIVA CERVICO - VAGINALĂ

•1927 - 1928 - Aurel A. Babeș și Constantin Daniel - au arătat că diagnosticul

precoce al cancerului cervical poate fi realizat pe frotiuri, prezentând
criteriile citologice de malignitate ale celulelor tumorale şi indicând totodată
modelul de studiere al acestora pe frotiuri vaginale colorate prin metoda
Giemsa
•1943 - Papanicolaou a avut meritul de a perfecționa metoda
citodiagnosticului exfoliativ, enunțată anterior de Aurel Babeș, prin
clasificarea frotiurilor în cinci clase (clasele I - V Pap), metodă pe care
ulterior a aplicat - o în screeningul cancerului colului uterin în marile
colectivități.
•1947 -J. Ernest Ayre – inlocuieste frotiul vaginal cu un specimen celular
•obtinut direct din col sub control vizual
•1948 –Lombard–introducerea conceptului frotiului vaginal ca test screening
pentru cancerul de col uterin
 RECOLTAREA FROTIURILOR CERVICO-
VAGINALE

•Recoltarea a două frotiuri (exocervical și endocervical)

•Recoltarea a trei frotiuri (vaginal, exocervical, endocervical)
•Frotiu unic/triplu frotiu VCE (vagin, exocol, canal cervical –pe aceeași lamă)

RECOLTAREA DE LA NIVELUL ALTOR ZONE ALE TRACTULUI GENITAL

FEMININ
•de la nivel vulvar
•de la nivel vaginal
•de la nivelul cavității uterine:
- aspirația fluidului cervical
- frotiul endometrial descris de Isaacs
- lavajul endometrial
 FIXAREA FROTIURILOR

•scopul fixării în citologie este păstrarea caracteristicilor citomorfologice cât mai

apropiate de cele in vivo şi menţinerea elementelor citochimice esenţiale
diagnosticului citologic
•Condiţiile unui fixator optim:
- penetrarea rapidă în celule
- minimalizarea retracţiei celulelor
- menţinerea integrităţii morfologice
- inactivarea enzimelor autolitice
- să înlocuiască apa intracelulară
- să permită pătrunderea coloranţilor în celule
- să permită aderarea celulelor la suprafaţa lamei de sticlă
- să corespundă metodei de colorare care va fi folosită ulterior
- să fie bactericid
- să fie reproductibil
 CRITERII DE RESPINGERE A FROTIURILOR

•frotiurile sunt sparte sau lipsesc datele de identificare ale pacientei

•mai mult de 75% din celule sunt acoperite de exudat inflamator sau sânge

•număr mic de celule pe frotiu (mai puţin de 1000)

•frotiul conţine mai ales celule scuamoase exocervicale/vaginale şi nu este

reprezentată zona de tranziţie

•fixare necorespunzătoare a celulelor

 FACTORI CARE REDUC ACURATEȚEA
FROTIULUI PAP

•contaminarea frotiului cu sânge sau lubrefianţi

•istoric clinic neadecvat
•recoltare inadecvată de la nivelul zonei de tranziţie
•frotiu etalat prea gros sau care ocupă mai puţin de 10% din suprafaţa lamei
•(material insuficient)
•recoltarea testului Pap în ciuda infecţiei evidente
•confundarea frotiurilor sau a numelor pacientelor
•neidentificarea celulelor displazice
•interpretare greşită a diagnosticului clinic
•prelucrare tehnică deficitară
 METODE DE FIXARE IN CITOLOGIE

Există trei metode de fixare:

•Fixarea umedă – prin introducerea imediată a frotiurilor proaspăt recoltate
într-o soluţie fixatoare; rămân în această soluţie până ajung în laborator;
celulele nu sunt expuse la aer;
•Fixarea umedă cu uscare în aer ulterioară - frotiurile se introduc imediat
într-o soluţie fixatoare o anumită perioadă de timp, după care se scot din
fixator, se usucă şi apoi se transportă la laborator; odată ajunse aici, se
reintroduc în etanol 95% soluţie înainte de colorare;
•Fixarea cu spray - se realizează prin pulverizarea frotiurilor proaspete cu un
spray fixator
 FIXATORII ALCOOLICI

•etanol 95% - acţionează rapid şi nu e toxic

•izopropanol 80%
•metanol 100% e toxic, se foloseşte mai ales pentru frotiurile uscate în
aer
•alcool denaturat 95% (90 parţi etanol 95%; 5 părţi etanol absolut;
5 părţi izopropanol absolut)
•alcool pentru analiză (metanol absolut, izopropanol 80%, acetonă
90%)
Sursa rezultatelor fals negative

Periuta endocervicala/ spatula Ayre –

colecteaza aprox. 0.56 mil. de celule
Pe un frotiu conventional se regasesc
aprox. 0.22 mil. de celule.
 Interpretare dificila datorita mucusului,
sangelui, material necrotic celular,
agregatelor celulare.
Sursa rezultatelor fals negative
 Erori de screening – celule anormale
neraportate de citolog

 Erori de tehnica
- erori de recoltare;
- erori de prezervare a celulelor
Limitele examinarii CBP pe frotiuri
conventionale

 Rezultate fals negative (1,5 – 55%) – leziunea existenta

pe col nu este detectata de examenul citologic
 Rezultate neconclusive ( 5 – 20%)
 Specimene inadecvate (10%)

 Statistici din UK.

1. Hutchinson et al., AJCP, Vol101-2; 215-219

2. Schiffmanet al., JLGTD 1998 2:3;165-169

Frotiuri etalate conventional
Aspectul unui frotiu conventional
 Frotiu etalat in monostrat dupa
recoltare se prelucrare in mediu lichid
 Cellslide ®

AUTOMATED COMPUTER-CONTROLLED
THIN-LAYER SLIDE PROCESSOR
Liquid-based cytology (LBC)
or
Thin-layer
HSIL

LSIL HPV

HSIL CIN2
 PRELUCRAREA REVĂRSATELOR
PLEURALE,
PERITONEALE, PRICARDICE

Centrifugarea - adăugarea în eprubeta conică cu fluid a unei cantităţi egale de

alcool etilic 95%, timpul şi viteza de centrifugare fiind diferite, în funcţie de
produs:
- revărsatele seroase – 5 - 10 minute, 1500 - 3000 rot/min
- lichidul cefalo - rahidian (LCR) – 4 - 5 minute, 1500 - 2000 rot/min
- urina – 10 minute, 2000 - 2500 rot/min
- sputa (cu fixator Carbowax) – 5 minute, 1500 rot/min
LABORATORUL DE HISTOPATOLOGIE/
IMUNOHISTOCHIMIE

Tehnologia obtinerii preparatului

microscopic permanent
 Timpi de realizare

• Recoltarea
• Fixarea
• Spalarea
• Includerea
• Sectionarea
• Colorarea
• Montarea
 Recoltarea → Orientarea

• Rezectie chirurgicala
• Rezectie endoscopica
• Biopsie de organ
• Punctie cu ac gros
• Punctie cu ac fin
• Recoltarea la necropsie
 Orientarea piesei
(workstation – ansamblu)

Hota AP cu exhaustare totala si post de lucru

 Fixarea
• Definitie:
– proces fizic prin care se blocheaza procesele biochimice,
conservandu-se forma celulei si volumul molecular
• Mecanismul:
– coagularea proteinelor
– insolubilizare prin precipitare
– formarea produsilor de aditie
• Scopul:
– conservarea tesutului impotriva putrefactiei
– prevenirea pierderii de constituenti celulari
– cresterea diferentei optice
– marirea rezistentei tesuturilor
 Fixarea
• Tipuri de fixatori:
– Fizici: aerul, caldura
– Chimici:
• Simpli: formol, acetona, alcool metilic, acid osmic
• Amestecuri fixatoare: apoase sau alcoolice
• Calitatile fixatorului:
– Stabilizeaza structurile patrunzand in tesuturi
– Nu deformeaza tesutul si nu dizolva constituentii
– Distruge microorganismele si extrage enzimele autolitice
– Nu-si modifica compozitia si confera consistenta
– Produce diferenta optica
• Tratamente postfixare (optionale):
– Decalcifiere (TCA, EDTA)
– Mordansare (substanta ce contribuie la colorare si ameliorarea
fixarii)
 Procesarea tesuturilor –
automatic spin tissue processor
Procesoare automate de
tesuturi

De tip carusel (spin processor) De tip liniar

 Includerea
• Scop:
– crearea conditiilor petru obtinerea de sectiuni tisulare subtiri, plane,
transparente
• Mecanism:
– imobilizarea componentelor tisulare, cu pastrarea raporturilor celulare

• Tipuri de mase de incluziune:

– Dupa solubilitatea in apa:
• Anhidre: parafina (se poate adauga ceara: creste elasticitatea)
• Apoase: gelatina
– Dupa modul de realizare a includerii:
• Penetrarea celulei
• Ramane in spatiul interstitial
• Etapele includerii:
– Deshidratarea in concentratii crescute de alcool
– Clarificarea in hidrocarburi aromate, alcool izopropilic
– Impregnarea = patrunderea in profunzime a parafinei topite
– Turnarea blocurilor
Aparat semi-automat de includere
la parafina cu consola de racire
 Sectionarea
• Microtom: rotativ sau culisant, manual sau semi -
automat
• Grosime: 5-7 μm (pentru IHC: 3 μm)
• Elemente:
– suport pentru cutite (lame)
– portobiectul
– capul mobil
– micrometru
• Aderarea: cu albumina Meyer, lame electrostatice
Sectionarea – microtom manual rotativ cu baie de
flotare

1 4

2
3
 Sectionarea blocurilor
Criostat

Microtom manual
rotativ

Histotrimer
 Colorarea
• Scop:
– cresterea contrastului prin modificarea indicelui de
refractie cu coloranti, care se leaga electrostatic de
preparat
• Mecanism:
– penetrarea celulei si atasarea de componentele celulare
pentru diferentierea optica. Colorantul poate contine:
• Grupari cromofore – purtatoare de culoare
• Grupari auxocrome – au capacitate de a colora. Exista
2 tipuri:
– Ionizate – formeaza legaturi electrochimice cu
substratul (schimb de electroni: cedare –
acceptare)
– Neionizate – formeaza legaturi de hidrogen cu
substratul
 Colorarea – etape

• Deparafinarea - dizolvarea parafinei cu

hidrocarburi aromatice (3 bai succesive)
• Hidratarea – eliminarea solventilor parafinei (3
bai succesive de alcool cu concentratii progresiv
scazute – 96/90/70, timp de 2-5 min./alcool)
• Colorarea cu solutie apoasa sau alcoolica
• Spalarea cu apa distilata pentru indepartarea
excesului de colorant
• Clarificarea – indepartarea alcoolului cu xilol
 Colorarea

• Coloratie progresiva = actiunea

colorantului este sistata prin spalare cand
s-a evidentiat structura cautata
• Coloratie regresiva = actiunea
colorantului este prelungita pina la
supracolorare, apoi se intervine cu un
decolorant (diferentiator), a carui actiune
este oprita prin spalare
Colorarea – autostainer liniar – 10 programe
simultane, capacitate ~250 lame/ zi
 Montarea

• Scop si mecanism:
– Protejarea de deteriorari
– Conservare si asigurarea unui mediu omogen
• Medii de montare:
– Naturale
• Anhidre: balsam de Canada, colofoniu
• Apoase: glicerina, sirop Apathy
– Sintetice: entelan, pertex
Montarea – automat de montat lame,
capacitate ~ 400 lame / zi
Examinarea preparatului histopatologic
Preparatul microscopic
permanent

Tehnici de colorare uzuale

(histopatologice) si speciale
(histochimice)
 Col. Hemalaun Eozina (HE)
HEMATOXILINA

• este colorantul extras din arborele Haematoxylum campechianum

(logwood , lemn colorat).
• Prin oxidare se transformă în hemateină, un compus cu o colorație
albastru-violet intens.
• Aceasta este utilizată împreună cu un mordant (de regula saruri
de Fe(III) sau Al(III) pentru colorarea nucleilor celulelor.
• Componentele celulare care se coloreaza cu hematoxilină poartă
denumirea de compus bazofilic.
 Col. Hemalaun Eozina (HE)
Hematoxilina
(sol.
alcoolica)

Maturare prin oxidare

Hemateina

Sulfat dublu de aluminiu

si potasiu

Meyer (coloratie progresiva)

Hemalaun

Harris (coloratie regresiva)

 Eosina (tetrabrom fluoresceina)

• este un colorant cu o fluorescență roșie, format prin adiția bromului la fluoresceină;

• Este un colorant utilizat pentru evidențierea citoplasmei, a fibrelor de colagen;
• Actualmente există 2 structuri care se referă la eosină:
1. eosin Y (eosin Y ws, eosin galbena, Acid Red 87, C.I. 45380,
bromoeosină, acid bromofluoresceic , D&C Red No. 22, având o ușoară nuanță
de galben.
2-lea component este eosin B(Acid Red 91, C.I. 45400, Safrosine, Eosin
ecarlat sau Roșu imperial) ;
• Eosina este utilizat ca mediu de contrast în colorația cu hematoxilină, eosina colorând
citoplasma în roz-orange iar hematoxilina nucleii în albastru sau violet. Eosina
colorează de asemenea eritrocitele în roșu intens.
 Eosina (tetrabrom fluoresceina)

Eozina Y Eozina B
Coloratie Hemalaun/Hematoxilina- Eozina

• Indicatie:
– Coloratie uzuala
standard pentru tesuturi
• Coloranti:
– Hemalaun Meyer - bazic
– Eozina Gelbich - acida
• Rezultate:
– Nucleu – albastru
– Citoplasma – roz / rosie
 Col. van Gieson
• Indicatie:
– Coloratie uzuala
tricroma pentru
tesuturi
• Coloranti:
– Hematoxilina ferica
Weigert
– Fuxina acida
– Acid picric
• Rezultate:
– Nucleu – negru
– Citoplasma – galbena
– Colagen – rosu
 Col. Tricroma
Masson
• Indicatie:
– Coloratie speciala tricroma
pentru tesuturi
• Coloranti:
– Hematoxilina ferica
– Solutie coloranta A – acid
fosfomolibdenic
– Solutie coloranta B –
albastru de anilina
• Rezultate:
– Nucleu – negru
– Citoplasma – rosie
– Colagen – albastru
 Alte coloratii pentru tesuturi
• Coloratia Giemsa
– Coloranti: sol. May
Grumwald, sol. Giemsa,
acid acetic
– Rezultate: nuclei – rosu
violet, citoplasme
policrome (de la albstru
pal la albastru inchis),
cartilaj albastru, mucina
violet
• Utila pentru detalii
morfologice in tesuturi
limfoide: splina, ganglion
limfatic, maduva osoasa
• In frotiuri cervico-vaginale
este utila pentru detectarea
Trichomonas Vaginalis
• Col. Mallory
– Coloranti: fuxina acida, albastru
Mallory
• Col. AZAN
– Coloranti: azocarmin, albastru
Heidenhein (anilina, orange G)
– Rezultate: nucleu – rosu,
citoplasma - albastru rosiatica,
colagen – albastru, tesut
muscular striat – orange
– Utila pentru studiul glandelor
endocrine
• Col. Lie
– Coloranti: oxid galben de
mercur, fuxina acida
– Rezultate: fibrele miocardice
ischemice se coloreaza in rosu
Fibre miocardice ischemice perivascular
(“wavy fibers”), col. Lie, 20x
 Coloratii pentru fibrele conjunctive
• Pentru colagen:
– Col. Van Gieson, col.
Masson
• Pentru fibrele de
reticulina:
– Impregnare argentica
Gomori
• Pentru fibre elastice:
– Rezorcin fucsina
bazica Weigert –
albastre
– Orceina – cafeniu
roscate
Sectiune prin tesut hepatic colorat prin metoda Shikata –
cu orceina pentru a demonstra hepatocitele „ground glass”
care contin antigen VHB (antigen Australia)

Lipofuscina

Incluzii virale
Sectiune printr-o artera de tip muscular -
coloratie Verhoeff pentru fibrele elastice.

Contracolorare cu van Gieson .

• Rezultat:
• Fibrele elastice - negru;
• Fibrele de colagen rosu;
• Citoplasma miocitelor -
galbena
 Impregnarea argentica Gomori

• Coloranti:
– Permanganat de potasiu
(KMnO4)
– Metabisulfit de sodiu si
potasiu
– Solutie argento-
amoniacala
• Rezultate:
– Fibre de reticulina – negru
– Fibre de colagen – rosu
purpuriu
– Nucleu – negru
– Citoplasma galbena
Coloratie Weigert

Fibre elastice la nivelul mediei aortice, 10x

Hematoxilina fosfotungstica (PTAH)
Structura periodica a miofibrilelor, 10x Microtrombi fibrinosi in capilarele
glomerulare, 10x
 Coloratii pentru structuri subcelulare

• Metoda Cajal Da Fano:

– Evidentiaza complexul Golgi – negru
– Citoplasma – aurie
– Nucleu – necolorat
• Metoda hematoxilina ferica Regaud:
– Evidentiaza mitocondria – negru
• Metoda Brachet:
– Coloranti: verde metil pironina
– Rezultate: DNA – verde, RNA - rosu
 Tumora Brenner cu degenerescenta
Histochimia glucidelor chistica si secretie PAS (+), 10x

• Col. PAS:
– Coloranti: acid periodic
HIO4, reactiv Schiff
– Rezultate: glucidele se
coloreaza in rosu viu
– Variante: PAS cu Fungi PAS (+), hife, 20x
diastaza, PAS – AB pH
2,5
• Carmin amoniacal
BEST:
– Glicogen - rosu
Bazofilia, metacromazia si ortocromazia

• Bazofilia = proprietatea unor substante glucidice de a se

colora cu coloranti bazici
• Metacromazia = proprietatea unor substante de a se colora
diferit de colorantul utilizat (prin existenta unor grupari
anionice ce absorb lumina diferit de restul agregatelor)
– Albastru de toluidina – evidentiaza mastocitele, a caror
granulatii citoplasmice sunt rosii
• Ortocromazia = proprietatea unor substante de a se colora
la fel cu colorantul utilizat
– Rosu de Congo – evidentiaza amiloidul in rosu (in
lumina vizibila) sau produce o birefringenta verde (in
lumina polarizata)
– Albastru alcian la pH = 2.5– coloreaza MPZ acide
nesulfatate in albastru
Bazofilia, albastru de metil, 100x, imersie
 Metacromazia si Amiloidoza renala, glomerul cu
amiloid, Rosu Congo, 40x
ortocromazia Lumina polarizata, 40x

Mastocit cu granulatii metacromatice,

albastru de toluidina, 60x
Histochimia lipidelor

• Coloranti:
– Sudan (III, IV, B, BB)
– Scharlach
– Oil Red
• Rezultate:
– Lipide colorate in rosu
portocaliu
• Observatie:
– Sunt coloratii la gheata,
folosindu-se o solutie
saturata alcoolica a
colorantului
Agregate lipidice intr-o placa de
aterom aortica, 20x
 Histochimia proteinelor

• Reactii nespecifice:
– Identificarea unor aminoacizi
• Reactia Millon – pentru tirozina
• Reactia Sakagushi – pentru arginina
• Reactii specifice:
– Identificarea unor heteroproteine
• Metoda Feulgen – pentru DNA complexat cu
histone
• Bazofilia
 Coloratii speciale pentru diferite
structuri patologice
• Col. Perls (albastru de Berlin)
– Coloranti: ferocianura de potasiu si HCl
– Rezultate: evidentiaza fierul in albastru
• Col Masson – Fontana
– Coloranti: azotat amoniacal de argint
– Rezultate: evidentiaza melanina in negru
• Col. Grimelius (argentafina)
– Evidentiaza granule neuroendocrine
• Coloratia cu rhodamina – pentru cupru
• Coloratia Hymans van den Bergh – pentru bilirubina
• Col. Rosu de Congo – pentru amiloid
Col. Perls (reactia vitala)
Coloratii citologice si bacteriologice

• Col. Babes – Papanicolaou

• Col. May Grumwald Giemsa
• Col. Gram
• Col. Ziehl – Neelsen
Coloratia Babes - Papanicolaou
• Indicatie:
FCV celulelor scuamoase
– Citologie cervico-vaginala intermediare
• Coloranti: Spori de Candida Albicans ;
– Hematoxilina Harris
– Eozina alcoolica (EA 50)
– Orange G (OG 6)
• Rezultate:
– Nuclei – albastri
– Citoplasme – cianofila
(verde albastruie – celule
intermediare) sau
eozinofila (roz rosie –
celule superficiale)
Frotiu de sange periferic, col. MGG, 40x
Coloratia Gram

• Coloranti:
– cristal violet si
Stafilococi, Gram (+), 100x, imersie
– rosu safranina
• Rezultate:
– Bacterii Gram (+) –
albastre
– Bacterii Gram (-) -
rosii

Klebsiella Pneumoniae, Gram (-), 100x,

imersie
 Coloratia Ziehl – Neelsen

• Indicatie: bacili acid

alcoolo-rezistenti
• Coloranti:
– Fuxina carbol bazica
– Albastru de metilen
• Rezultate:
– Bacili rosii pe fond
albastru
• Observatie: reactia se
face la cald
 Laboratorul de diagnostic
molecular
• Laboratorul de • Laboratorul de
proteomica genomica

• Impliatiile genomice umane

• Imunohistochimie sau virale in procesele
• Imunocitochimie patologice
• Genomica functionala
• Genomica structurala
 Imunohistochimia (IHC)
• Reprezinta combinatia dintre 2 stiinte :
imunologia si histochimia, avind ca scop
evidentierea proprietatilor antigenice ale
unor substante intr-un tesut, utilizind
anticorpi monoclonali sau seruri polireactive.
• Vizualizarea substantelor antigenice se poate
face atit la nivel tisular, cit si la nivel celular
si subcelular, pe preparate la gheata sau
parafina.
 Tehnica IHC - principiul metodei

• Se lucreaza cu anticorpi monoclonali, de care sunt legate

una sau mai multe molecule enzimatice, ce catalizeaza
transformarea unui substrat incolor intr-un produs de
reactie colorat. Enzima este cuplata covalent cu portiunea
Fc a anticorpului; pe ea se plaseaza substratul cromogenic.
• Enzimele utilizate sunt : - peroxidaza
- fosfataza alcalina
• Substratele folosite sunt :
- DAB - 3,3'-Diaminobenzidine (brun) sau AEC - (3-Amino-
9-ethylcarbazole) (rosu) pentru peroxidaza
- “fast red” si “fast blue” pentru fosfataza alcalina
 Metoda ABC
(dupa Hsu et al., 1981, modificata de
G. Bussolatti & P. Gugliotta, 1983)
• In prima etapa, Ac primar
se cupleaza cu Ag dorit;
• in a doua etapa de Ac
primar se leaga un Ac
secundar, marcat cu biotina
• In a treia etapa, se
introduce un reactiv cu mai
multe molecule de avidina
marcata cu peroxidaza
• La locusul antigenic se
leaga un complex cu multe
molecule de peroxidaza,
intensitatea reactiei
cromogene va fi accentuata
si sensibilitatea metodei
mare
Metoda dextranului (DAKO EnVisionTM Systems, 1996)

• Permite cuplarea unui

mare numar de molecule
enzimatice pe un schelet
polimeric de dextran
hidrosolubil; cu acest
complex se pot cupla Ac
secundari
• Se obtine astfel un reactiv
care poate fi utilizat in
cadrul unei tehnici in 2
timpi, care aduce o mare
cantitate de enzime la
locul reactiei si va creste
foarte mult sensi-bilitatea
detectarii Ag dorit
Modele de expresie a reactiilor IHC

Membranar,
c-erbB2,
CDI, 20x

Citoplasmic
granular,
anti-MT,
carcinom
CSR, 10x

Citoplasmic
difuz, Vim,
sarcom,
40x

Nuclear
omogen,
PCNA, 40x
Principalele aplicatii ale tehnicilor IHC
in practica de rutina
1) Clasificarea histogenetica a tumorilor slab
diferentiate sau anaplazice
2) Diagnosticul limfoame/leucemii
3) Diagnosticul fenotipului tumoral( tumorilor
nonleucocitare)
4) Detectia antigenelor virale si microbiene
5) Evidentierea markerilor de prognostic in cancer
6) Stabilirea susceptibilitatii de raspuns la
tratament a unor tumori
• Deteminarea factorilor de prognostic in
cancer :
- Microinvazia si pseudoinfiltratia
- Micrometastazele oculte
- Factori de proliferare
- Proto-oncogene si anti-oncogene
- Factori de crestere
• BIOPSIA LICHIDA

• 1. Celule tumorale circulante

• 2. AND/ARN tumoral circulat
• 3. Particule subcelulare circulante -
exozomi