Comisia de Apiterapie

PROTEINELE DIN LPTIORUL DE MATC CA UNEALT N ELABORAREA INGREDIENTELOR NECESARE SNTII

J. IMTH , Katarna BLIKOV , Elena KOVOV
1 2 1 1 2

Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Chemistry, SK-84538 Bratislava, REPUBLICA SLOVACA Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Dbravsk cesta 9, SK-84538 Bratislava, REPUBLICA SLOVACA E-mail: chemsim@savba.sk

Rezumat Calitatea produselor albinei melifere (Apis mellifera L.) a fost evaluat pe baza proprietilor statice care pot fi determinate prin analize chimice, fizice i instrumentale. Astzi este acceptat n general c definirea calitii produselor apicole ar trebui fcut n baza funciilor dinamice ale fiecrei componente. Lptiorul de matc a fost acceptat i folosit adesea ca o substan care sprijin sntatea. Se nmulesc documentele tiinifice n sprijinul conceptului c cele mai atractive componente bioactive ale produselor apicole sunt proteinele din lptiorul de matc. Descoperirea recent c proteinele din lptiorul de matc ar putea deine funcii fiziologice imunomodulatoare, supresoare ale reaciilor alergice, dar i proprietile lor antihipertensive i de stimulare a proliferrii au deschis o nou epoc n utilizarea lptiorului de matc i a mierii de albine. Studiul nostru sistematic molecular-biological despre proteinele individuale i despre peptidele lptiorului de matc a relevat c proprietile lor multifuncionale ar putea fi folosite ca markeri pentru standardizarea dozelor de utilizare a lptiorului de matc, care poate fi consumat n dieta zilnic i care dup ingerare regleaz sau afecteaz un anume proces fiziologic. Efectele medicale i farmacologice ale produselor apicole vor fi evaluate i cuantificate mai exact pe baza cantitii individuale ale proteinelor din lptiorul de matc folosit zilnic. Vor fi prezentate proprietile proteinelor individuale ale lptiorul de matc i funciile lor fiziologice n timpul dezvoltrii larvale i ca ingrediente ale unor alimente funcionale. Cuvinte cheie: lptior de matc al albinei melifere / protein / peptide / purificare / proprieti fiziologice

Introducere Colonia de albine melifere, un superorganism alctuit din celule individuale care sunt de fapt nsi albinele melifere, este reflectat i n mecanismele cu ajutorul crora culegtoarele culeg, proceseaz i conserv nectarul i polenul i asigur hrana puietului. Proteinele i peptidele sintetizate de ctre albinele melifere n glandele cefalice, joac un rol important n procese ca hrnirea i protejarea puietului mpotriva agenilor patogeni. Lptiorul de matc este un produs de secreie a glandelor cefalice ale albinelor doici i servete drept hran pentru larvele albinelor melifere. Prin comportamentul profilactic el este distribuit ntre indivizii coloniei (CRAILSHEIM, 1992). Lptiorul de matc este un sistem de substane multiple, coninnd proteine (12-15%), ap (60-70%), zaharuri totale (10-12%), lipide (3-7%), minerale, amino-acizi i vitamine (TAKENAKA, 1982; IMTH, 2001). Lptiorul de matc este considerat a fi o hran unic elaborat n natur n timpul evoluiei animalelor. Ingrijirea i hrnirea larvelor eclozionate sunt asigurate de albinele melifere tinere care, prin secreiile glandelor lor cefalice, aprovizioneaz larva viitoarei mtci cu lptior de matc, larva viitoarei albine lucrtoare cu lptior de lucrtoare i larva viitorului trntore cu lptior de trntore. Aceste tipuri de lptior nu difer unul de cellalt din punctul de vedere al compoziiei chimice a componentelor de baz, precum proteinele, carbohidraii i lipidele. Diferena esenial const n faptul c lptiorul de matc conine spre deosebire de lptiorul de lucrtoare o component(te) care determin ce va deveni un ou diploid egal din punct de vedere genetic: o matc sau, n absena acestei componente, o albin lucrtoare. Totui, aceast component nu a fost nc identificat. Cheia acestui mecanism de reglare se afl codificat n gene speciale ale albinei melifere, care sunt activate n stadiul iniial de dezvoltare larvar a viitoarei mtci i reprimate la larva viitoarei albine lucrtoare. Este vorba despre aa numita manifestare difereniat a genelor, adesea reglat pe baz hormonal, i care este implicat i n reglarea manifestrii altor gene responsabile pentru diferite semnale fenotipice care difereneaz matca de lucrtoare. Datorit aceastei diferenieri i a faptului c albinele melifere hrnesc matca cu lptior de matc pe parcursul ntregii ei viei, matca are o durat de via lung. Mtcile triesc 4 pn 5 ani, lucrtoarele doar 3-4 sptmni. Acest fenomen a stat la baza ideii c lptiorul de matc ar putea fi sursa longevitii oamenilor. Dei aceasta este doar o ipotez nefondat experimental, descoperirile tiinifice recente sugereaz c mai ales proteinele coninute n lptiorul de matc ar aciona ca factorul de revitalizare n nutriia oamenilor. Proteinele secretate de ctre albinele melifere n produsele lor au diferite funcii n crearea unor condiii optime de dezvoltare a coloniei de albine melifere. Glandele hipofaringiene, mandibulare i salivare reprezint sursa celor mai importante proteine ale albinelor melifere. In aceste glande sunt sintetizate sute de diferite proteine i peptide care joac un rol de nenlocuit n hrnirea puietului i n diferenierea acestuia, n procesarea polenului floral n ghemotoace de polen i apoi n pstur precum i n tehnologia unic de procesare a nectarului n miere. Aceste proteine, o secreie exogen a albinelor melifere, nlesnesc contactul direct cu sursa de hran (carbohidraii din nectar, proteinele din polen) i protecia (barier de protecie fa de agenii patogeni).

Comisia de Apiterapie

Proteinele exogene ale albinei melifere Clasificarea proteinelor secretate de albina melifer n lptiorul de matc i n produsele derivate din acesta O cantitate important din lptiorul de matc este alctuit din proteine, care formeaz aproximativ 50% din masa uscat a lptiorului de matc (IMTH, 2001). Proteinele importante formeaz 90% din cantitatea total a proteinelor cu mas molecular de 49-87 kDa atribuit unei proteine i unei familii de gen (HANES i IMTH, 1992; SCHMITZOV et al., 1998; MALECOV et al., 2003). Proteinele minore coninute de lptiorul de matc sunt alctuite din proteine i peptide cu diferite funcii, inclusiv proprieti antimicrobiene i antifungice (FUJIWARA et al., 1990; BLIKOV et al., 2001; BLIKOV et al., 2002; BACHANOV et al., 2002). Pe baza funciilor, proteinele i peptidele exogene ale albinelor melifere pot fi clasificate dup cum urmeaz: Enzimele tehnologice ele sunt implicate n transformarea nectarului n miere: -glucozidaza, glucozoxidaza, catalaza i amilaza. Proteinele nutritive sunt secretate n hrana larvelor ca principala surs proteic a larvelor de albine melifere. Proteinele i peptidele protective sunt secretate de albinele melifere n produsele lor i apr puietul n timpul dezvoltarii mpotriva agenilor patogeni. Proteinele i peptidele fiziologic active ndeplinesc diferite funcii n cadrul coloniei de albine i influeneaz procesele din culturile de esuturi ale celulelor de animale n condiii in vitro. Proprietile structurale ale lptiorului de matc In general lptiorul de matc este definit ca o emulsie. Investigarea lptiorului de matc proaspt cu microscopul electronic de scanare (SEM) a relevat trsturile sale structurale unice (IMUTH, 2001). Examinarea cu SEM a artat c n unele zone stratul de lptior de matc conine particule sferice globulare relativ mari (fig. 1). Dimensiunea acestora oscila de la 20 la 80 m. Aceste globule erau conectate ntre ele printr-un sistem de canale-filamente. Diametrul filamentelor este de aproximativ 2 m, iar lungimea variabil. O mrire i mai mare a unui globul a artat filamente care iradeau de la suprafaa ca o scoic a globulei. A fost emis idea c structura fin a lptiorului de matc este generat de glandele hipofaringiene ale albinei melifere.

Fig. 1 Vizualizare SEM a particulelor globulare tipice ale lptiorului de matc natural. O celul de matc cu o larv de 2 zile (Apis mellifera carnica L.) a fost tiat dintr-un fagure de la stupina particular a autorului. Larva a fost nlturat i lptiorul de matc o din celul a fost congelat la -20 C pentru a investiga n mare caracteristicele structurale ai lptiorului de matc cu SEM. Pentru a preveni distrugerea structurii originale a lptiorului de matc au fost omise procedurile de fixare. Probele de lptior de matc au fost prelevate din probele congelate. Ele au fost expuse la temperatura camerei timp de 72 de ore i au putut forma un strat subire pe discurile din aluminiu cu un diametru de 1,2 cm. Probele au fost apoi colorate negativ cu Cu ntr-o camer cu 3 vid la 10 Pascal i examinate cu SEM (Jeol, model JSM-580, Japonia).

Prepararea proteinelor din lptiorul de matc in form natural Pentru a putea izola proteinele ntr-un stadiu pe ct mai natural, am elaborat o metod de fracionare a lptiorului de matc prin ultracentrifugare (IMTH, 2001). Au fost obinute astfel trei straturi distincte din punct de vedere fizic. Fraciunea supranatant a fost un fluid verde glbui, numit plasm i care reprezenta 61% (w/v) din lptiorul de matc nativ. O fraciune vscoas glbui maronie, numit lptior i care reprezenta stratul intermediar, avea o consisten gelatinoas. Aceast fraciune forma 32% din cantitatea de lptior de matc (w/v). Sedimentul alb de la fund (7% w/v din lptiorul de matc) prea s fie o

Comisia de Apiterapie

substan aproape stabil. Cantiti semnificative de acizi grai erau concentrate n fraciuni cu un coninut mai sczut de ap. La ultracentrifugare s-a obinut un gel semi-solid galben auriu, asemntor chihlimbarului. Analizele biochimice au artat c era o proteina important a lptiorului de matc (numit anterior MRJP1) de tip albumin i de aceea a fost numit apalbumina-. Este aadar normal s sugerm c din interaciunea ntre apalbumina- i acizii grai a rezultat fraciunea proteic insolubil n ap al lptiorului de matc. Este interesant c alte proteine ale lptiorului de matc, localizate predominant n fraciunea supranatant, cum ar fi apalbumina- (numit anterior MRJP2) i apalbumin- (numit anterior MRJP3) nu pot forma un gel, dei sunt foarte asemntoare cu apalbumina- (SCHMITZOV et al., 1998). Proprieile fizice i chimice ale apalbuminei- Apalbumina- a format o structur subunitar (IMTH, 2001). Subunitatea de baz este de aproximativ 420 kDa i s-a format din monomerul de baz 55 kDa. Observaiile la microscop au artat c apalbumina- formeaz n soluii apoase structuri similare celor care se ntlnesc i n lptiorul de matc. n funcie de concentraia apalbuminei-, au fost generate diferite structuri cu o repetabilitate regulat (fig. 2). Este vorba despre o structur autoasamblatoare a proteinei, rezultat al oligomerizrii subunitilor acestea. Este interesant c alte proteine din lptiorul de matc nu au abilitatea oligomerizrii, dei au un grad ridicat de asemnri secveniale cu apalbumina-.

Fig. 2 Autoasamblarea structurilor filamentoase regulate al apalbuminei-. Vizualizarea cu microscopul cu lumin a fost efectuat la 20 de minute dup aplicarea unei picturi (3 l) de apalbumina- (80 mg per 1 ml ap) pe sticla de acoperire.

Care este funcia structurilor autoformatoare ale apalbuminei- n colonia de albine melifere? Numeroase proteine sunt mult mai stabile n structuri supra-moleculare dect n forme monomerice. Dac este luat n considerare coninutul ridicat n proteine al lptiorului de matc, atunci din punct de vedere teoretic nu poate fi presupus c toate proteinele hrnitoare din lptiorul de matc sunt metabolizate imediat. Concentraia ridicat de aminoacizi ar induce o presiune osmotic disproporionat de mare n tractul digestiv al larvei. Am mai constatat c apalbumina- apare de asemenea n miere i n ghemotocul de polen. Albina melifer poate folosi proprietile structurale ale apalbuminei- n procesarea polenului floral n ghemotocul de polen. S-ar prea c albina melifer nfoar polenul n apalbumin ca pe un senvici. Apalbumina- este n lptiorul de matc un factor formatator de textur, de asemenea i n produsele cosmetice care conin lptior de matc. Se pare c n cadrul dezvoltrii larvare apalbumina- ndeplinete mai multe funcii dect rolul ei nutriional. Proprietile fiziologice ale proteinelor din lptiorul de matc Pot fi fcute cteva generalizri referitoare la propritetile fiziologice ale proteinelor majore din lptiorul de matc. Evidenele comportamentale att de sugestive nu ne indic n mod direct dac proteinele majore din lptiorul de matc au aceleai funcii n stadiul timpuriu i n cel trziu al dezvoltrii larvare. Studierea scindrii proteinei din lptiorul de matc n intestinul mediu al larvei (TSAO and SHUEL, 1968) a artat c unele proteine din lptiorul de matc au putut trece prin epiteliul intestinului fr s fi suferit vreo schimbare. Coninutul ridicat de aminoacizi eseniali le-a predestinat rolul lor nutriional n cadrul coloniei de albine. Fraciunea proteic a lptiorului de matc produs de albinele melifere conine numeroase componente valoroase i substane biologic active. n afar de proteinele majore ale lptiorului de matc sunt prezente n el mai multe proteine minore n cantiti reduse, inclusiv peptide antibiotice (FUJIWARA et

Comisia de Apiterapie

al., 1990; BILIKOVA et al., 2001; BILIKOVA et al., 2002). De un interes deosebit sunt proteinele i peptidele bioactive prezente n secvena aminoacid a proteinelor din hran. Aceste peptide, inactive n cadrul secvenei proteinei parentale, pot fi eliberate de ctre proteoliza enzimatic, de exemplu n timpul digestiei gastrointestinale sau n cel al procesrii hranei. Odat eliberate n corp, peptidele bioactive pot aciona ca nite componente reglatoare cu o activitate asemntoare celei a hormonilor. Structurile secvenelor biologic active nu au fost nc obinute i este necesar n continuare cercetarea digestiei enzimatice in vitro i/sau a digestiei gastrointestinale in vivo a proteinelor specifice. Componentele bioactive ale lptiorului de matc nu au fost complet evaluate, dar oricum studii recente in vitro demonstreaz c unele proteine majore ale lptiorului de matc influeneaz procese fiziologice foarte importante. Peptidele bioactive din lptiorul de matc i din proteinele majore ale acestuia ar trebui luate n calcul ca poteniali modulatori ai diferitelor procese reglatoare din organism. Relaia dintre activitate i structur i mecanismul prin care proteinele majore din lptiorul de matc i exercit efectele lor imunomodulatoare nu au fost nc stabilite. Totui rezultatele obinute cu proteinele 350 kDa i 55 kDa din lptiorul de matc sugereaz c proteinele majore ale lptiorului de matc ar putea afecta procese celulare importante. Proteinele 350 kDa cu o secven aminoacid cu terminal N, cum ar fi apalbumina- (SCHMITZOV et al., 1998) stimuleaz proliferarea monocitelor umane (linia de celule U 937) i hibridomele umanuman (linia de celule HB4C5) (KIMURA et al., 1995). Autorii citai au descoperit c structurile lanurilor de zahr cu legtur N a proteinei 350 kDa au de fapt structura tipic al manozei (Man9-GlcNAc2), ntlnit frecvent la animale, plante i insecte. Proteina 55 kDa al lptiorului de matc cu terminal N al secvenei aminoacide i care este identic cu a doua protein important ca abunden din lptiorul de matc, i anume apalbumina- (SCHMITZOV et al., 1998; BLIKOVA et al., 1999), menine viabilitatea ridicat a culturii primare de celule de obolan, dar nu stimuleaz proliferarea monocitelor umane (KIMURA et al., 1996). Estimarea structurilor chimice ale proteinelor majore bioactive din lptiorul de matc este primul pas spre descoperirea mecanismului molecular al activitilor lor fiziologice n sinergie cu alte componente bioactive ale lptiorului de matc. Din punctul de vedere al activittii fiziologice, poziia dominant este deinut de proteinele albuminoidelor cele mai abundente n lptiorul de matc: apalbumina- acid (IMUTH, 2001) i apalbumina- bazic (BILIKOVA et al., 1999), care apar i n creierul albinei melifere (KIMURA et al., 1995; KUCHARSKI and MALESZKA, 2002). Aceste descoperiri ca i similaritile dintre sistemul imun al insectelor i al mamiferelor (DUSHAY et al., 1966; IMLER and HOFFMANN, 2001; BAUD and KARIN, 2001) au artat c proteinele din lptiorul de matc ar putea fi factorul care este implicat n reglarea proceselor fiziologice importante. Datele referitoare la proprietile fiziologice ale proteinelor din lptiorul de matc, precum stimularea proliferrii monocitelor umane (KIMURA et al., 1995), sau proprietile imunomodulatoare ale lptiorului de matc (VER et al., 1996), suprimarea reaciilor alergice (OKA et al., 2001), sau activitatea antihipertensiv a peptidelor bioactive din lptiorul de matc (MATSUI et al., 2002) lrgesc potenialul aplicrii acestuia n farmaceutic i indic funcia lor natural n evoluia albinei melifere, unde pot juca un rol de inducere a mecanismului de aprare n timpul dezvoltrii larvare. Dac aceast presupunere este corect, atunci proteinele din lptiorul de matc ar putea induce producerea de bioreglatori de tipul citokinei, care au o funcie important n cadrul sistemului imunitar, al proceselor inflamatorii, i ar putea s participe i la controlul proliferrii, diferenierii i apoptozei celulelor. Aceast presupunere a fost coroborat de experimentele noastre preliminarii, n cadrul crora am detectat inducerea de citokine n macrofagele murine de ctre proteinele din lptiorul de matc. Observaiile noastre indic faptul c proteinele din lptiorul de matc sunt responsabile de stimularea in vitro a producerii de TNF- n monocitele umane de o soluie apoas de miere 1% (TONKS et al., 2001). Acestea indic de asemenea c aciunea proteinelor din albinele melifere poate stimula un sistem specific (reeaua de citokine) care activeaz genele responsabile de producerea de substane defensive, naintea apariiei infeciei bacteriene. Albina melifer, la fel ca i alte insecte, rspunde la infeciile bacteriene prin inducerea mrit de gene codate pentru peptide antimicrobiene, care sunt secretate ulterior n hemolimf. Un asemenea rspuns imun este foarte rapid (apare n cteva ore), dar adesea nespecific (CASTEELS, 1997; ZASLOFF, 2002). Anumite peptide antimicrobiene ale albinelor melifere (apidecina, abecina i himenoptecina) sunt induse n mod specific i eliberate n hemolimf abia dup infecia bacterian, n timp ce defensina-royalizina (FUJIWARA et al., 1990) i apisimina (BLIKOV et al., 2002), descoperite n lptiorul de matc, sunt probabil sintetizate pe tot parcursul vieii albinei melifere. Proteinele i peptidele din lptiorul de matc pot participa la mecanismul defensiv al albinei melifere mpotriva agenilor patogeni printr-o inactivare direct a microorganismelor aprute n produsele apicole, ca i prin inducerea de citokine cu participare la reglarea transcrierii proteinelor i peptidelor defensive. Datele obinute pe baza proprietilor biochimice i biologice ale proteinelor din lptiorul de matc vor servi ca baz pentru genomele funcionale ale sistemului de aprare al albinei melifere contra bolilor i la o mai bun nelegere a proprietilor fiziologice ale produselor apicole ca componente al hranei funcionale. Este nc dificil aprecierea eficacitii clinice ale lptiorului de matc, dar exist sperana ca cercetrile s descopere condiiile de activitate ale lptiorului de matc, mecanismul de acionare sau dozele potrivite i perioada lor de aplicare. Acest studiu experimental la nivel molecular despre proteinele secretate de albinele

Comisia de Apiterapie

melifere n produsele lor este o ncercare de a defini bioactivitatea proteinelor i peptidelor din lptiorul de matc ca nutriente importante.
BIBLIOGRAFIE Bachanov K., Klaudiny J., Kopernick J., imth J. (2002) Identification of honeybee peptide active against Paenibacillus larvae larvae through bacterial growth-inhibition assay on polyacrylamide gel. Apidologie 33, 259-269 Baud V., Karin M. (2001) Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives. Trends in Cell Biology 11, 372-377 Blikov K., Klaudiny J., imth J. (1999) Characterization of the basic major royal jelly protein MRJP2 of honeybee (Apis mellifera L.) and its preparation by heterologous expression in E.coli. Biolgia, Bratislava 54, 733-739 Blikov K., Wu G., imth J. (2001) Isolation of peptide fraction from honeybee royal jelly as antifaulbrood factor. Apidologie 32, 275283 Blikov K., Hanes J., Nordhoff E., Saenger W., Klaudiny J., imth J. (2002) Apisimin, a new serine valin-rich peptide from honeybee (Apis mellifera L.) royal jelly: purification and molecular characterization. FEBS Letters 528, 125-129 Casteels P. (1997) Immune response in Hymneoptra, in: Molecular mechanisms of immune responses in insects. Breay, P. T., 24. Hultmark, D. (ed), Chapman and Hall, London, 92-110 Crailsheim K. (1992) The flow of jelly within a honeybee colony. J. Comp. Physiol. B. 162, 681-689 Dushay M. S., Asling B., Hultmark D. (1966) Origin of immunity: Relish, a compund Rel-like gene in the antibacterial defense. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1034-1047 Fujiwara S., Imai J., Fujiwara J., Yaeshima T., Kawashima T., Kobayashi K. (1990) A potent antibacterial protein in royal jelly. J. Biol. Chem. 265, 11333-113337 Hanes J., imth J. (1992) Identification and partial characterization of the major royal jelly protein of the honey bee (Apis mellifera L.). J. Apic. Res. 31, 22 - 26 Imler J. L., Hoffmann J. A. (2001) Toll receptors in innate immunity. Trends in Cell Biology 11, 304-310 Kimura Y., Washino N., Yonekura M. (1995) N-linked sugar chains of 350 kDa royal jelly glycoprotein. Biosci. Biotech. Biochem. 59, 507-509 Kimura Y., Kajiyama S., Kanaeda J., Izukawa T., Yonekura M. (1996) N-linked sugar chain of 55 kDa royal jelly glycoprotein. Biosci. Biotech. Biochem. 12, 2099-2102 Kucharski R., Maleszka R. (2002) Evaluation of differential gene expression during behavioral development in the honeybee using microarrays and northern blots. Genome Biology 3, research 0007.1-0007.9. Malecov B., Ramser J., OBrien J. K., Janitz M., Jdov J., Lehrach H., imth J. (2003) Honeybee (Apis mellifera L.) mrjp gene family: computational analysis of putative promoters and genomic structure of mrjp1, the gene coding for the most abundant protein of larval food. Gene 303, 165-175 Matsui T., Ykiyoshi A., Doi S., Sugimoto H., Yamada H., Matsumoto K. (2002) Gastrointestinal enzyme production of bioactive peptides from royal jelly protein and their antihypertensive activity. Journal of Nutritional Biochemistry 13, 80-86 Oka H., Emori Y., Kobayashi N., Hayashi Y., Nomoto K. (2001) Supression of allergic reactions by royal jelly in association with the restoration of macrophage function and improvement of Th1/Th2 cells responses. International Immunopharmacology 1, 521-532 Schmitzov J., Klaudiny J., Albert ., Schrder W., Schreckengost W., Hanes J., imth J. (1998) A family of major royal jelly proteins of the honeybee Apis mellifera L. Cell Mol. Life. Sci. 54, 1020-1030 imth J. (2001) Some properties of the main protein honeybee (Apis mellifera L.) royal jelly. Apidologie 32, 69-80 ver L., Oroli N., Tadi Z., Njari I. B., Vaploti I., Bai I. (1996) A royal jelly as a new potential immunomodulator in rats and mice. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 19, 31-38 Takenaka T. (1982) Chemical composition of royal jelly. Honeybee Sci. 3, 69-74 Tonks A., Cooper R. A., Price P. C., Molan P. C., Jones K. P. (2001) Stimulation of TNF-release in monocytes by honey. Cytokine 14, 240-242 Tsao W., Shuel R. W. (1968) Breakdown of royal jelly protein in the midgut of the larval honeybee. J. Apic. Res. 7 119-128 Zasloff M. (2002) Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395