FACULTATEA DE TIINA I TEHNOLOGIA ALIMENTELOR

DEPARTAMENTUL: INGINERIA PRODUSELOR ALIMENTARE

DISCIPLINA: SPCCPA

Determinarea prin metoda HPLC a

ochratoxinei A din boabe de cafea

INTRODUCERE
Ochratoxina A a

fost izolat pentru prima dat n 1965,

de un grup de cercettori sud africani.

Fig. 1 Structura chimic ochratoxina A

Studiile realizate la cereale, n Europa, arat c, dintre ciupercile

productoare de OTA, Penicillium verrucosum este predominant, spre
deosebire de Aspergilus ochraceus care este prezent ocazional.
Principala cale de absorbie este nivelul intestinal. Este apoi
distribuit la diferite organe, dar se pot ntlni cantiti mici de
ochratoxina A liber n snge. Ochratoxina A are o mare afinitate pentru
anumite proteine plasmatice de care este fixat (aproximativ 90%).

Este un contaminant frecvent al cerealelor, al cafelei, nucilor,

fructelor uscate, piperului.
Limitele maxime admise de OTA stabilite la nivelul Comisiei
Europene sunt urmtoarele:
Produsul

Nivelul
maxim
(g/kg

Ochratoxina A
Cafea crud prjit i cafea

sau ppb)

5.0

prjit i mcinat cu excepia

cafelei solubile

10.0

Cafea solubila (cafea instant)

Tabel 1. Ochratoxina A: limite maxime admise n Uniunea
European

!!!Prezena ochratoxinei A n alimente prezint un pericol

pentru sntatea uman i animal.

Boabele de cafea
Sunt formate din dou pari
aplatizate pe o parte i desprite de o
adncime longitudinal. Bobul de
cafea este de culoare verde n
interior,acoperit de o pelicul subire
argintie, peste care se afla un nveli
pergamentos de culoare galben spre
brun.
Exista ns fructe n interiorul
crora se gsete un singur bob de
cafea de forma rotund i care este
denumit de cultivatori Caracoli. Aceste
boabe de cafea provin din fructele
arbutilor mbtrnii,care cresc pe
ramurile lor exterioare.

Compoziie chimic
Cafea verde

Cafea prjit

[%]

[%]

Apa

11,3

2,7

Substane azotoase

12,6

13,9

Cofein

1,9

1,3

Grsimi

11,7

14,4

Zahr

6,3

2,8

Dextrin

0,4

1,3

Acid cafetanic

8,4

4,7

Celuloza

23,9

23,9

Substante minerale

3,8

3,9

Substante solubile

29,3

28,8

Componente

Tabel 2

Generaliti HPLC

HPLC este prescurtarea de la

High Performance Liquid
Chromatography (Cromatografie lichid
de nalt performan), metod de
analiz calitativ utilizat n biochimie
i chimie analitic pentru separarea,
identificarea i cuantificarea
compuilor. HPLC folosete o coloan
ncrcat cu diferite materiale (faza
staionar), o pomp ce mpinge
faza(ele) mobil(e) prin coloan i un
detector care arat timpurile de retenie
ale moleculelor. Timpul de retenie
depinde de interaciunea dintre faza
staionar, moleculele de analizat i
solvenii utilizai.

Fig.2

Materiale utilizate

Mod de lucru - Extracia ochratoxinei A i

purificarea extractului

Pentru determinarea specificitii metodei au fost analizate probe

coninnd ochratoxina A i o prob coninnd faza mobil utilizat ca solvent al
probelor injectate. La timpul de retenie al ochratoxinei A nu s-a obtinut nici un
semnal n cromatograma corespunzatoare fazei mobile, rezulta deci faptul ca nu
exista interferenti.

Fig.3 Cromatograma pentru soluia standard de ochratoxin A

Identificarea picului corespunztor ochratoxinei A se realizeaz n functie de timpul de

retenie. n condiiile menionate, timpul de retenie pentru ochratoxina A este de 9,5 min.

Validarea metodei de determinare a

ochratoxinei A prin cromatografie de lichide
de nalt performana (HPLC)

Fig.4

Metoda de analiz prin HPLC prezentat a fost validat, urmrindu-se

urmtorii parametri:
stabilitatea n timp a soluiei,
linearitatea,
limita de detecie i limita de cuantificare,
precizia sistemului,
precizia metodei,
exactitatea metodei.

Probele n faz mobil

pot fi stocate la temperatura
camerei cel puin 10 zile, fr a
aprea degradarea acestui
compus.
Tabelul 3. Stabilitatea soluiei

Tabelul 4. Ariile picurilor ochratoxinei A obinute n studiul linearitii metodei

Fig.5 Dreapta de calibrare a ochratoxinei A

Deoarece cantitatea de ochratoxin A din probe este mic,

ecuaia curbei de calibrare a fost calculat pentru concentraii
cuprinse ntre 9,765625 i 39,0625 ng/ml.

Dup calculul statistic s-a obinut ecuaia curbei de calibrare:

Arie pic = 1,0750780952381 x concentraia + 7,325
Valoarea coeficientului de corelaie (r) este 0,9983 iar eroarea
standard a curbei de regresie (SE) este 1,3229431474665. Folosind
aceste valori s-au calculat limita de detecie (LD) i limita de
cuantificare (LQ) cu formulele (1) i (2):

Tabelul 5.
Ariile picurilor
corespunztoare
ochratoxinei A
pentru cele cinci
determinri

Prima etap n determinarea preciziei o reprezint studiul

preciziei sistemului. Astfel, o soluie de concentraie de 20 ng/ml a fost
analizat de cinci ori.(tabel 5)
Pentru aceste valori, deviaia relativ standard (RSD %) a fost calculat
ca fiind 8,6912%.
Pentru concentraii n prob de ordinul ng, valoarea este bun, deci
sistemul este precis.
Precizia i exactitatea metodei au fost determinate prin calcularea
valorii medii a 3 determinri la trei concentraii diferite n jurul valorii
de interes 39.0625 ng/ml, 19.53125 ng/ml i respectiv, 9.765625
ng/ml (concentraia urmrit 50%).

Utiliznd ecuaia curbei de calibrare i ariile picurilor au fost calculate

concentraiile pentru fiecare prob. A fost determinat regsirea ca procent din
valoarea concentraiei teoretice, regsirea medie i precizia metodei exprimat prin
deviaia standard relativ din regsirea calculat.
Pentru aceste dou grupuri de date (I i II), valorile obinute sunt prezentate n
tabelul nr. 6.
Dup prelucarea statistic a ambelor seturi de determinri a rezultat o valoare
de 16,9629 % a deviaiei standard relative ceea ce demonstreaz precizia metodei;
regsirea medie fiind de 99,2% (pe intervalul 61,6 126,1%), ceea ce demonstreaz
exactitatea metodei

Tabelul 6. Ariile
picurilor ochratoxinei A
pentru grupul de date I i II

APLICAIE LA DETERMINAREA
OCHRATOXINEI A DIN PROBE DE CAFEA
BOABE PRJT
Probele au fost procurate din uniti ce comercializeaz produse vrac. Sau analizat 40 de probe de cafea boabe prjit, de diferite sorturi (Columbia 10
probe, Jacobs 10 probe, Indonezia 8 probe, Brazilia 4 probe, Robusta 2
probe, India 1 prob, cafea decofeinizat 5 probe). Metoda de analiz
validat a ochratoxinei A prin HPLC a fost aplicat la determinarea ochratoxinei
A din probe de cafea boabe
n urma analizei prin HPLC, cromatogramele obinute au fost prelucrate,
stabilindu-se aria picurilor corespunztoare ochratoxinei A i, folosind ecua ia
dreptei de regresie, s-a calculate coninutul n ochratoxin A pentru probele de
cafea..
Denu mire
Ochratoxin A

Nr.
Nr. crt.

Tabel 7

(g/kg prob

prob

pro b

cafea boabe)

1.

Cafea Indo nezia

0,77

2.

Cafea Indo nezia

0,87

3.

Cafea Indo nezia

1,06

4.

Cafea Indo nezia

0,55

5.

10

Cafea Col umbia

9,47

Figura nr.6 Dou dintre cromatogramele obinute la analiza probelor de cafea

boabe
prin metoda HPLC

n urma analizei HPLC s-au obinut urmtoarele rezultate:

Din cele 40 de probe analizate: n 5 probe (12,5% din numrul total de probe),
ochratoxina A a fost prezent sub limita maxim admis de legislaia n vigoare (5
g/kg cafea boabe prjit), ntr-o singur prob concentraia ochratoxinei A a fost
peste limita maxim admis A, iar n 34 de probe (85% din numrul total probe)
ochratoxina A nu a fost identificat prin metoda aplicat.

V MULTUMESC PENTRU
ATENIA ACORDAT!