Probleme generale ale analizei

medicamentelor
FR X - capitolul Monografii- Metode generale de analiz :
Prelevarea probelor pentru analiz .
Controlul organoleptic
Determin ri fizice i fizico-chimice
Determin ri cantitative
Determin ri farmacognostice
Determin ri farmacotehnice
Determin ri biologice i biochimice
Controlul preparatelor radiofarmaceutice

Analiza
medicamentului
defineste
in
sens
larg
examinarea partilor constituiente ale unui intreg
reprezentat de medicament, presupunand specific
determinarea calitativa si/sau cantitativa a compozitiei
si/sau structurii substantelor sau amestecurilor utilizand
strategii, metode si instrumente caracteristice.
11

MEDICAMENT/
SUBSTANTA
MEDICAMENTOASA

PROBA FINALA
DE ANALIZAT

1. Prelevarea probei

2. Pregatirea probei
pentru analiza

3. Determinari experimentale
(preliminare, calitative, cantitative)
- direct, fara pregatire
- dupa o prelucrare specifica

PROBA REPREZENTATIVA

DATE
EXPERIMENTALE
4. Evaluarea critica
a rezultatelor

REZULTATUL ANALIZEI
BULETIN DE ANALIZA

22

PRELEVAREA PROBELOR PENTRU ANALIZA

Probele prelevate pentru determinarile calitative i
cantitative trebuie s reprezinte, sub toate aspectele,
caracteristicile produsului din lotul sau seria respectiva
(FR-X)
FR-X:
lot - o cantitate de materie prim, presupus a fi unitar,
din care se obin una sau mai multe serii de produse
serie - totalitatea unitilor de produs obinute n condiii
identice, ntr-un singur ciclu de operaii

recipient - conine unitile de produs care constituie o

serie, ex. flacoane, fiole, folii, tuburi, cutii, pungi etc.

ambalaj - conine recipientele grupate adecvat

33

PRELEVAREA PROBELOR
DEPOZIT
Lot

FARMACII
Serie

Subst. farm.

Prep. ind.

Elaborate

Laborator
Cantitate 4p
Cantitate 3p
Cantitate 3p
Cantitate 2p
Masa de analiza Cantitate 3p
2p proba
2p proba
2p proba
1p proba
Cantitate 1p
2p proba
2p contraproba 1p contraproba
1p contraproba 1p contraproba
1p contraproba

44

CONTROLUL ORGANOLEPTIC
Aspect
Miros

CONTROL ORGANOLEPTIC

Gust

Culoare

55

DETERMINARI FIZICE, FIZICO-CHIMICE I

CHIMICE
DETERMINAREA SOLUBILITII

prevederile de la alineatul "Solubilitate" au un caracter orientativ

privind solubilitatea substanelor n diferii solveni
prevederile nscrise n cadrul altor alineate, cum ar fi
"solubilitatea n alcool", au un caracter obligatoriu, fiind
considerate teste de puritate
Solubilitatea poate fi exprimat prin specificarea volumului de
solvent (n mililitri) necesar pentru a dizolva 1 g substan solid
sau 1 ml substan lichid, la temperatura de 20 20C.
Verificarea solubilitii substanelor farmaceutice nu este
necesar s se efectueze n toi solvenii prevzui n monografie,
ci este necesar s se controleze solubilitatea n cel puin doi
solveni diferii.
Dac se constat prezena unor impuriti insolubile, se verific
solubilitatea i n ceilali solveni prevzui.
66

Diferitele solubiliti pot fi exprimate i cu ajutorul unor

expresii - n acest caz prevederile de solubilitate se refer la
temperatura de 20 5oC.
Expresii folosite

foarte uor solubil

uor solubil
solubil
puin solubil
foarte puin solubil
greu solubil
foarte greu solubil
practic insolubil

Volumul de solvent (ml) necesar pentru a

dizolva 1 g substan solid sau 1 ml
substan lichid
cel mult 1 ml
de la 1 ml pn la 10 ml
de la 10 ml pn la 30 ml
de la 30 ml pn la 100 ml
de la 100 ml pn la 500 ml
de la 500 ml pn la 1000 ml
de la 1000 ml pn la 10.000 ml
mai mult de 10.000 ml

77

DETERMINAREA INDICILOR

Indice de aciditate = numrul de miligrame de hidroxid de

potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor grai liberi
coninui n 1 g prob de analizat (uleiuri volatile, uleiuri grase,
balsamuri, ceruri etc.).
Se calculeaz conform formulei:

5.61 V
I
A
m
n care:
- IA = indice de aciditate
- V = volumul de KOH 0.1 mol/l n ap folosit la titrare (ml)
- m = masa probei luate n lucru (grame)
- 5.61 = num rul de miligrame de KOH corespunz tor la 1 ml KOH 0.1
mol/l.

88

Indice de saponificare = num rul de miligrame de hidroxid de

potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor liberi i a acizilor
rezultai din saponificarea a 1 g prob de analizat.
Se calculeaz conform formulei:

(V1 V2 ) 28.05
IS
m
n care:
- IS = indice de saponificare
- V1 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate n lucru (grame)
- 28.05 = num rul de miligrame de KOH corespunz tor la 1 ml KOH
0.5 mol/l n alcool.

99

Indice de ester = numrul de miligrame de hidroxid de

potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor grai rezultai din
saponificarea a 1 g prob de analizat.
Se calculeaz conform formulei:

n care:
- IE = indice de ester
- IS = indice de saponificare
- IA = indice de aciditate.

10
10

Indice de hidroxil = num rul de miligrame de hidroxid de

potasiu echivalent cu acidul acetic consumat prin acetilarea a 1
g prob de analizat.
Se calculeaz conform formulei:

(V1 V2 ) 28.05
IH
IA
m
n care:
- IH = indice de hidroxil
- V1 = volumul de KOH 0.5 mol/l n alcool folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de KOH 0.5 mol/l n alcool folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate n lucru (grame)
- IA = indice de aciditate
-28.05 = num rul de miligrame de KOH corespunz tor la 1 ml KOH 0.5
mol/l n alcool.

11
11
11

Indice de iod = num rul de grame de iod fixat de 100 g prob

de analizat.
Se calculeaz conform formulei:

(V1 V2 ) 0.01269
II
.100
m
n care:
- II = indice de iod
- V1 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate n lucru (grame)
- 0.01269 = num rul de grame de iod corespunz tor la 1 ml Na2S2O3
0.1 mol/l.

12
12

Indice de peroxid = numrul de mililitri de tiosulfat de sodiu

0.01 mol/l oxidat de iodul eliberat din acidul iodhidric prin
aciunea peroxizilor din 1 g prob de analizat.
Se calculeaz conform formulei:

10 (V2 V1 )
Ip
m
n care:
- IP = indice de peroxid
- V1 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea martorului
(ml)
- V2 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate n lucru (grame).

13
13

DETERMINAREA PUNCTULUI DE TOPIRE

Punct de topire = temperatura la care o substan se topete

complet.
Dac substana se topete cu descompunere, se consider punct de
topire sau punct de descompunere, temperatura la care substana
i schimb aspectul (se brunific sau apar bule de gaze).

p.t. substane solide pulverizabile

se efectueaz n dispozitive speciale
sau ntr-un balon Kjeldahl cu
capacitatea de 150 - 250 ml, n care
se introduce un termometru potrivit.
la termometru se ataeaz , cu
ajutorul unui inel de cauciuc sau prin
aderen , un tub capilar din sticl ,
nchis la un cap t.
ca lichid de nc lzire se folosete:
apa distilat p.t. < 700C
parafina lichid , acidul sulfuric sau
uleiul de silicon - p.t > 700C

14
14

Determinare:
proba de analizat pulverizat i uscat se introduce n tubul capilar i se taseaz
pentru a forma un strat compact de 3 - 4 mm n lime
tubul capilar se ataeaz la termometru
inc lzirea se efectueaz astfel nct temperatura s se ridice cu 3 - 40C/minut.
se citete temperatura la care substana se topete complet.
n cazul substanelor care se descompun prin nc lzire prelungit , balonul se
nc lzete, n prealabil, pn la o temperatur cu aproximativ 100C sub punctul
de topire presupus, dup care se ataeaz capilarul cu substana i se continu
nc lzirea astfel nct temperatura s se ridice cu 1 - 20C/minut.
Dac punctul de topire al probei de analizat nu este cunoscut, se efectueaz , n
prealabil, o determinare orientativ .

15
15

n unele cazuri, specificate n monografii, punctul de topire se determin

cu un microscop special prev zut cu un dispozitiv de nc lzire.

Termomicroscopie ( microscop Boetius )

1
2
3
4
5
6
7

surs de lumin
mas de prob nclzit
termometru
obiectiv
surs de lumin
ocular
mner pentru poziionarea probei

5
4
2

3
16
16

DETERMINAREA CONCENTRAIEI N ALCOOL

se bazeaz pe distilarea alcoolului

se determina densitatea sau indicele de refracie a distilatului
hidroalcoolic.
Determinare:
se folosete un aparat de distilare cu alonj care trebuie s p trund n
ap
se distil nu mai mult de 30 minute
se determin densitatea relativ cu ajutorul picnometrului i se citeste
concentraia n alcool a distilatului (% m/V) din tabele alcoolmetrice.
se calculeaz dupa formula:

n care:
- c = concentraia n alcool a distilatului
corespunz toare densitii relative (% m/V)
- m = masa probei luate n lucru (g).

17
17

prin volatilizare
- Distilare

cromatografice

METODE DE SEPARARE
prin extracie:
- lichid-lichid
- solid-lichid
- in faza solida
- cu fluide supercritice
18
18

METODE DE SEPARARE PRIN VOLATILIZARE

- DISTILAREA

Distilarea este una din cele mai vechi metode de separare si

purificare a lichidelor.
Separarea se bazeaz pe diferenele dintre presiunile de vapori
ale lichidelor care compun un amestec.
Pe scurt, distilarea presupune nclzirea lichidelor, separnd
vaporii si recondensndu-i pentru a obine un nou lichid care
va fi concentrat n compui mai volatili.

PARAMETRII DE LUCRU I EFICIEN:

echilibrul de distributie vapori-lichid
volatilitatea relativa
talerul teoretic
19
19

Curbe de distilare

20
20

METODE DE SEPARARE PRIN EXTRACTIE

EXTRACIA LICHID LICHID

Extracie = transferul unei substane dizolvate dintr-un solvent

n alt solvent nemiscibil cu primul.
Distribuia substanei respective ntre cele dou faze depinde de
solubilitatea acesteia n cei doi solveni.
Componenii supui distribuiei interfazice manifest preferine
pentru unul sau altul dintre solveni, participnd selectiv la
procesul de transfer.
Dac la echilibru concentraiile componenilor sunt sensibil
diferite ntre cei doi solveni, procesul poate fi utilizat n scopul
separrii lor.
21
21

Etape in extracia lichid lichid:

1.

formarea speciei extractibile i punerea sa n contact cu

sistemul de solveni adecvai
2. sedimentarea
3. decantarea
4. determinarea cantitativ a componenilor izolai
5. recuperarea solvenilor

Etapa cea mai important este cea de selecionare a sistemului de

solveni i stabilirea formei sub care este extras substana. Aceasta
se poate realiza prin cunoaterea parametrilor procesului de extracie
care sunt:
constanta de repartiie
coeficientul de extracie
factorul de recuperare.
22
22

PROCEDEE DE EXTRACIE LICHID-LICHID

Dup sensul de curgere al lichidului i dup principiul

de funcionare al instalaiei:

1. Extracia simpl
2. Extracia continu
3. Distribuia n contracurent.

23
23

EXTRACIA SOLID-LICHID
Principii generale
se aplic atunci cand este o faz solid sau semi-solid (material vegetal, pulberi
de forme farmaceutice solide etc.)
implic operaiile de extracie de tip percolare, filtrare i splare.

o
o

Are 2 etape, realizate n acelai aparat sau n aparate separate:

contactul solventului cu materialul solid supus extraciei
constituientului solubil (solut) n solvent
separarea sau splarea soluiei de reziduul solid

transferul

Procesul complet include recuperarea solutului separat i a solventului, prin

evaporare sau distilare.

APARATURA

o
o

depinde de prima etap

termeni ce indic tipul de aparat utilizat:
solid bed sau fixed bed - se refer la orice operaie n care prin materialul
solid fix trece solventul utilizat pentru extracie
dispersed contact - se refer la operaiile n care particulele solide, suspendate
n fluid sunt n micare relativ unele fa de altele i fa de solvent, n timpul
contactului solid-solvent.

24
24

EXTRACTIA IN FAZA SOLIDA

(SOLID-PHASE-EXTRACTION, SPE)
este un proces de separare prin care compui dizolvai sau suspendai
ntr-un amestec lichid sunt separai de alti compusi din amestec n funcie
de proprietile lor fizice i chimice

poate fi folosit pentru a izola analiii de interes dintr-o mare varietate de

matrici, inclusiv urin, snge, ap, buturi, sol, i esuturi de origine
animal

utilizeaz afinitatea substanelor dizolvate sau suspendate ntr-un lichid

(faza mobil), pentru un solid prin care proba este trecut (faza staionar)
pentru a separa dintr-un amestec componentele dorite i nedorite

rezultatul
analiii de interes dorii sau impuritile nedorite din proba sunt reinute
pe faza staionar
partea care trece prin faza staionar este colectat sau casat (daca
conine analiii dorii sau impuritile nedorite)
in cazul n care poriunea reinut n faza staionar include analiii dorii,
acetia pot fi apoi separai din faza staionar prin colectare printr-un
proces suplimentar, n care faza staionar se spal cu un eluent
corespunztor.

25

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALT PERFORMAN

HIGH PERFORMANCE/PRESSURE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Cromatografia de lichide de nalt performan/nalt presiune

(High Performance/Pressure Liquid Chromatography - HPLC) sau
de nalt vitez (High Speed Liquid Chromatography HSLC) este
o tehnic:
modern i rapid care elimin unele dezavantaje ale
cromatografiei planare
utilizat pentru separarea i determinarea soluilor organici i
anorganici din orice probe, n special substane i produse
farmaceutice, biologice, alimentare, industriale, de mediu etc.

Clasificare
n funcie de mecanismele care stau la baza separrii
componentelor,cromatografia de lichide se clasific astfel:
cromatografie prin adsorbie
cromatografie prin repartiie
cromatografie cu faze inverse
cromatografie prin schimb ionic
cromatografie prin excluziune molecular.
26

APARATURA
Schema unui cromatograf HPLC

-1-2
-

sau mai multe rezervoare cu solventi

o pomp de nalt presiune
sistem de degazare
injector pentru introducerea probei
(precoloane) coloane cromatografice
detectoare
sistem de prelucrare a datelor

27

APLICAIILE HPLC
ANALIZA CALITATIVA

Separarea si identificarea substanelor medicamentoase

Identificarea unui component prezent intr-un amestec se poate face dupa cromatografiere prin:

Metode cromatografice:
- Dupa marimile de retentie
- Metoda adaosului standard
- Metoda retentiei relative

Metode spectrale

elimoclavina

Alcaloizi din ergot

lisergol

CH2OH
H

HN

CH2OH
N CH
3
H

N CH
3
H
HN

28

Atenolol

Condiii:

Coloana: -Burke, 2 4.6 mm x 25 cm

Faza mobil: CH2Cl2-EtOH-MeOH(85:10:5),15 mM

H2N

NH4OAc

O
OH

Viteza de curgere: 1 ml/min;

Detecie: 254 nm
Timp de curgere = 16 min
K = 4.41
=1.13

Bupivacaina
CH3

H H
N
O
CH3

N
CH3

Condiii:
Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm i.d.

Faza
mobil:hexan-n-propanol-trietilamina
(80:20:0.1)
Viteza de curgere: 1 ml/min
Detecie: 254 nm
Timp de curgere: 7-8 min
K = 1.89
= 1.25

29

Efedrina

Condiii:

Coloana: Chiral AGP

100 x 4.0 mm

Precoloan: Chiral AGP, 10 x 3.0 mm

Faza mobil: ac. octanoic 0.001 M n

tampon fosfat pH 7.0

Detecie: 225 nm

CH3
H C NH CH3
H C OH

Ketoconazol
N
N
O
O
H3C

O
H

Cl

Cl

Condiii:
Coloana: (S,S)Whelk-O 1
10/100(FEC) 25 x 4.6 mm
Faza mobil: Diclormetan-hexan-IPA
+ 0.011 M acetat de amoniu
(46:46:8)
Viteza de curgere: 1.5 m>/min
Detecie: 254 nm
Timp de reinere: 16 min
K = 6.60
= 1.19

30

Analiza produilor modificai chimic (prin derivatizare)

este adesea necesar pentru a atinge o cromatografie

satisfctoare.
se aplic pentru componentele de toate polaritile i greutile
moleculare i este un avantaj al HPLC fa de gaz-cromatografie.
Este utilizat pentru a crete sensibilitatea deteciei cand
detectrile utilizate nu sunt satisfctoare pentru componentele
nederivate.
Absorbia n UV i fluorescena pot fi obinute cu ajutorul unor
reactivi.
UV: N-succinimid-p-nitrofenilacetat (SNPA), fenilhidrazin i 3,5dinitrobenzen (DNBC).
derivaii fluoresceni pot fi formai cu ageni de tipul: cloruri de
dansil (DNS-Cl), 4-bromometil-7-metoxicumarina (BMC) i cu unele
amine fluorescente.

31

Detectarea imunologic

Tehnica implic colectarea de solvent n fraciuni mici (1 ml) i prelevri

de medicament n fraciuni.

Necesit mult timp, dar au reversibilitate i selectivitate mai mare decat

detectrile convenionale.

n multe cazuri, lichidele biologice pot fi injectate direct n coloan.

HPLC cu detectare imunologic este utilizat pentru analiza

metaboliilor care sunt dificil de izolat din lichidele biologice prin extracie
(glucuronidele). Astfel de compui polari nu pot fi observai n concentraii
mici prin detectri convenionale, ele fiind mascate de componentele
endogene.

Poate fi utilizat pentru determinarea: canabinoidelor, opioidelor,

lisergidelor, glicozidelor cardiotonice din lichidele biologice.

32

ANALIZA CANTITATIVA

Se bazeaza pe corelatia care exista intre aria (inaltimea)

picului si concentratia componentului respectiv.
Metodele de determinare constau in masurarea:
Aria picului:
- metode manuale
- metode electronice
Concentratia probei:
- metoda normarii ariilor
- calibrare cu standard extern
- metoda standardului intern
- metoda adausului standard

33

Determinarea cantitativ a substanelor farmaceutice

Determinarea cantitativ a vitaminei B-12 din ser

Condiii:

HPLC/ICP-MS

ICP = Inductively coupled plasma emission spectrometer

HPLC/ICP-MS cu sistem de lucru LC-10A, ELAN6100,

Waitresss LC

Coloana:COSMOSIL, 5C18-AR

Faza mobil: ap-ac.acetic-isopropanol (90:1:9)

Viteza de curgere: 10 ml/min

Determinarea amitriptilinei i perfenazinei

Condiii:

HPLC/Agilent 1000

Coloana: cianopropil

Faza mobil: acetonitril-metanol-fosfat monopotasic

Viteza de curgere 2.0 mL/min

Detecie: UV 215 nm

34

Determinarea omapatrilatului din plasm (inhibitor de

endopeptidaz)
S
O
HS

N
H

COOH

Condiii
HPLC: Waters 510 HPLC pump,
Waters automated gradient
Coloana analitic BDS Hypercil C8 (3
m, 50 mm2 mm ID) precedat de
Hypercil C8.
Faza mobil: 62.5 % ap i 37.5 %
acetonitril, cu acetat de amoniu 1
mmol/L la pH 5.5.
Viteza de curgere: 0.2 mL/min,
Volumul injectat 25 L.

Alte determinri cantitative

Determinarea activitii antioxidante a capsaicinei;
Determinarea cantitativ a aminoacizilor din lichidul
cefalorahidian;
Determinarea cantitativ a cumarinei din extracte alcoolice.
35

GAZ CROMATOGRAFIA
GAS-CHROMATOGRAPHY (GC)
Definitie

Atunci cnd se folosete un gaz ca faz mobil ntr-un sistem

cromatografic, tehnica este denumit gaz-cromatografie (GC,
cromatografie de gaze, cromatografie in faza gazoasa). Aceast tehnic
se efectueaz ntotdeauna ntr-o coloan cromatografic deoarece faza
mobil trebuie s curg n mod continuu.

Clasificare

cromatografia gaz-lichid (GLC):

- faza staionar este un lichid
- fenomenul de separare are loc prin repartiie cromatografic
cromatografia gaz-solid (GSC)
- faza staionar este o suprafa solid
- fenomenul de separare are loc prin adsorbie.
36

APARATURA
Filters/Traps

Data system
H

RESET

Regulators

Syringe/Sampler
Inlets
Detectors

Gas Carrier

Hydrogen

Air

Column

37

APLICAIILE GAZ-CROMATOGRAFIEI
1. Identificarea
impuritatilor

compuilor

medicamentoi

si

cercetarea

se folosesc mrimile de reinere VR i tR

identitatea timpului de reinere al unui component cu acela al aceluiai
component pur ofer un indiciu c cei doi componeni sunt identici
timpii de reinere sunt proporionali cu punctele de fierbere ale
componenilor care ies din coloan n ordinea acestora
folosind diferite faze staionare selective componenii se pot separa chiar
dac au aceleai puncte de fierbere
timpul de retenie depinde de diferii factori (lungimea coloanei, diametru,
temperatura). Din aceast cauz, n scopuri calitative se utilizeaz aanumiii timpi de retenie relativi, trr, definii prin relaia:

unde:

tA = timpul de retenie al componentei A;

tet = timpul de retenie al etalonului.

38

Se practic adugarea n amestecul de analizat a unei componente

pure. Dac are loc creterea pe cromatogram a maximului ce
corespunde componentului adugat, aceasta se consider drept
dovad a identitii componentei - etalon.
Operaia se efectueaz pentru aceeai prob de analizat pe mai
multe coloane cu diferii adsorbani.

2. Studii de stabilitate pentru materii prime si produse finite cu

posibilitatea identificarii produsilor de degradare.
3. Studii farmacocinetice studii
(determinarea concentratiei plasmatice).

de

biodisponibilitate

39

4. Determinarea cantitativ a compuilor medicamentoi

Principala problem a analizei cantitative n gaz-cromatografie este
msurarea ariei picurilor.
Aria picurilor este proporional cu cantitatea de substan ce se
gsete n zona eluat.
Aria maximului picului poate fi calculat prin mai multe metode:
- msurarea nlimii maximului simetric, considerndu-l de forma
unui triunghi, cnd aria este proporional cu nlimea: metod
destul de precis, dar exactitatea ei depinde de msura n care forma
maximului rmne neschimbat dac cantitatea de substan
variaz.

- planimetrarea ariei de sub pic - aparatele moderne evalueaza ariile

cu ajutorul dispozitivelor de integrare i a computerelor.
Prin metodele enumerate se msoar aria sau cantitatea de
substan proporional cu aria de sub pic. Aceste cantiti trebuie
transformate n valori sau procente ale componenilor analizai.

- Gaz-cromatografele moderne efectueaz automat determinrile

cantitative prin ataarea la aparat a unui calculator adecvat.
40

Definitie:

CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC

ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY (IEC)

Este o tehnica cromatografica in care faza staionar este constituita din

compui n a cror structur se afl grupri acide sau bazice ionizabile
capabile s rein cationi sau anioni, in anumite conditii experimentale.

Aceti compui poart numele de rini schimbtoare de ioni.

Ionii schimbatorului pot fi inlocuiti de ali ioni fie din faza mobil, fie din
prob, de unde denumirea de cromatografie prin schimb ionic.

Clasificare:
cromatografie de schimb cationic:
schimbtorul reine ionii ncrcai pozitiv, nlocuind ionul H+ al acestuia
Ex: (-SO H, -PO H )
3
3 2

cromatografie

de schimb anionic:
schimbtorul reine ionii ncrcai negativ, inlocuind ionul X- al acestuia
Ex: (-RN+H3X-)

41

42

APARATURA

43

APLICAIILE CROMATOGRAFIEI IONICE

Cromatografia ionica se dezvolt n zilele noastre cu
aplicaii n:
analiza medicamentelor
chimia anorganic
chimia organic

44

CROMATOGRAFIA CU FLUIDE SUPERCRITICE

SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY (SFC)
Cromatografia cu fluide supercritice (SFC) deriv din metodele
convenionale ale cromatografiei de lichide, n special din HPLC i din
gaz-cromatografie (GC), fiind o metod de separare puternic i
universal, att la scar analitic, ct i la scar preparativ.
Relaia celor trei tipuri de cromatografie este redat ma jos:

45

46

Caracterisiticile fluidelor supercritice

Densitate (Kg/m3)

Vscozitate (cP)

0.01

Difuziune
(mm2/s)
1-10

1000

0.5-1.0

0.001

100-800

0.05-0.1

0.01-0.1

Gaz
Lichid
Fluid
supercritic

Lichid

Gaz

Fluid
supercritic
X

Difuzibilitate mare

Vscozitate sczut

Compresibilitate mare

Densitate mare

47

APARATURA

48

APLICAIILE CROMATOGRAFIEI CU FLUIDE SUPERCRITICE

1. Determinarea unor sulfonamide

Condiii:
o
Aparatura: Sistem Gilson SF3 pSFC
o
Coloana: 250 x 4,6 mm cu faz staionar cianopropil (mrimea particulelor 5
mm)
o
Temperatura: 50o C
o
Sistem injecie: Model 7125, 10 ml
o
Faza mobil: CO2 modificat cu metanol (10% primele 5 minute, cretere liniar la
15% timp de 10 minute)
o
Viteza de curgere: 2 ml, 21 minute
o
Presiunea: 180 bari
o
Detecie: UV 230 nm

TIC

49

2. Analiza unor substane anticancerigene i anti-HIV

3. Separri chiralice
Albendazol sulfoxid (ABZSO) - antihelmintic
- Chiralpak AD, eluie cu 2-propanol
- Chiralcel OD, eluie cu metanol

50

5. Alte aplicatii
o
o
o
o

Separri de vitamine liposolubile

Separri de acizi grai
Separarea benzodiazepinelor din ser
Purificri de substane farmaceutice

Cromatografia cu fluide supercritice a fost conceputa mai ales

pentru separarea:
o
substantelor termolabile
o
compusilor nevolatili
o
unor macromolecule

51

CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE
Definiie: Cromatografia de excludere steric este o metod prin
care moleculele se separ pe baza mrimii lor sau n termeni
tehnici, pe baza volumului hidrodinamic. n mod curent, se aplic
moleculelor mari sau complecilor macromoleculari, cum ar fi
proteinele i polimerii industriali.

Clasificare:

cromatografie
de
filtrare
prin
gel
(Gel
Filtration
Chromatography, GFC) - faza mobil este o soluie apoas.

cromatografie de permeaie prin gel (Gel Permeation

Chromatography, GPC) - faza mobil este de natur organic.
cromatografia de excludere de mrime

52

Calibrare/
Echilibrare

Introducerea probei

Eluia

53

APARATURA

54

APLICAIILE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUDERE

1. SEPARAREA MOLECULELOR

Separarea moleculelor cu mrime diferit

gelurile care exclud substanele cu mase moleculare mai mari de 5.000
u.a.m. realizeaz o veritabil desalefiere, deoarece ionii minerali care
difuzeaz liber pot fi eliminai n acest mod
separarea iodului nefixat n cursul purificrii unui trasor, dup marcarea
unei proteine cu 131I.
Analiza unui amestec de macromolecule
purificarea fraciunilor plasmatice pentru prepararea de medicamente sau
reactivi de diagnostic
analiza stabilitii materialelor plastice (ambalaje)
Separarea celulelor
limfocitele izolate de monocite
Fracionarea moleculelor mici
analiza peptidelor
analiza coloranilor

55

2. DETERMINAREA MASEI MOLECULARE

etalonarea direct a coloanei cromatografice cu etaloane de mas

molar cunoscut

etalonarea indirect, plecnd de la determinarea volumului

hidrodinamic
determinarea masei molare a imunoglobulinelor IgG din forme
farmceutice, presupunnd c 90 % sunt sub form de monomeri
i 10 % sub form de dimeri.
3. DETERMINAREA DISTRIBUIEI MASELOR MOLECULARE
se bazeaza pe relatia liniara dintre volumul de elutie si logaritmul
masei moleculare.
4. DETERMINAREA PURITII UNOR SUBSTANE
FARMACEUTICE
Ex: determinarea unor proteine cu mase moleculare mari (ca
impuritati) in insulina.

56

Diagrama spectrului electromagnetic al luminii

57

SPECTROMETRIA UV - VIS

Regiunea spectral:
UV - ndeprtat: 100 - 200 nm
UV - apropiat: 200 - 400 nm
VIS: 400 - 800 nm.
Absorbtia luminii in UV-VIS se datoreaza prezentei cromoforilor.

Cromofori (grupe cromofore)

sunt grupe de atomi, care prezente ntr-o substan pot da natere
la spectre electronice (de absorbie).

Grup auxocrom
este o grup de atomi saturat care, ataat unui cromofor,
modific lungimea de und (max) la care are loc absorbia i
intensitatea maxim de absorbie.

58

Tipuri de tranziii:
-

tranziii
tranziii
tranziii
tranziii
tranziii

- * (alcani)
- * (alchene, compui carbonilici, alchine, azo compui)
n - * (oxigen, azot, sulf, compui halogenai)
n - * (compui carbonilici)
d d* (metale)

59

Spectrometru UV-VIS cu monofascicul

Spectrometru UV-VIS cu fascicul dublu

60

Substante determinabile spectrometric

61

SPECTROSCOPIA N INFRAROU
INFRARED SPECTROSCOPY (IR)
Grupeaza metode de identificare si dozare nedestructive bazate
pe absorbtia sau reflexia de catre probe a radiatiilor
electromagnetice cuprinse intre 0,75 - 1000 m:

Regiunea fundamentala 2,5 - 25 m = regiunea IR analitic

62

63

64

APARATURA

Elementele constitutive ale unui spectrofotometru n IR:

- sursa de radiaii
- monocromatorul
- cuva pentru proba
- detectorul
- amplificatorul
- dispozitivul de nregistrare.

65

APLICAIILE SPECTROSCOPIEI N IR

nu exist compui care s prezinte spectre IR identice.

domeniul frecvenelor < 1500 cm-1 (regiunea amprentelor digitale) sunt

mult utilizate pentru stabilirea identitii substanelor analizate.

1. IDENTIFICAREA SUBSTANELOR MEDICAMENTOASE

se compar spectrul substanei de analizat cu spectrul obinut n aceleai
condiii cu substane etalon

se compar spectrul substanei de analizat cu spectrul etalon (din

cataloage sau monografii) la care s-au precizat valorile benzilor de absorbie
caracteristice i care trebuie s fie prezente i n spectrul substanei de
analizat.

Spectrul etalon = se obine utiliznd drept substane aa - numitele

substane de referin pentru IR (s.r.i.r.) nscrise n capitolul Standarde al
farmacopeelor.

66

Exemple:
acetazolamid, acid iopanoic, acid nalidixic
p-aminobenzoat de etil, ampicilina sodic, trihidrat de
ampicilin, benzilpenicilina potasic, palmitat de
cloramfenicol, clordiazepoxid, acetat de clortestosteron,
cloxacilina sodic
clorhidrat de cocain, acetat de cortizon, acetat de
dezoxicortizon, dexametazona, dextran 40 i 70,
diazepam, ergocalciferol

lactobionat
de
eritromicin,
furosemid,
hidroclorotiazid, hidrocortizon, hidroxiprogesteron

67

2.
DECELAREA
MEDICAMENTOASE

IMPURITILOR

SUBSTANELOR

Impuritile substanelor medicamentoase provenite din procesul

de obinere, ct i cele rezultate prin degradarea substanei pstrate
n condiii necorespunztoare produc modificri vizibile atunci cnd
se efectueaz o analiz atent a spectrului nregistrat.

Se observ:
modificri ale benzilor de absorbie care trebuie s caracterizeze
substana pur
apariia altor benzi caracteristice unor legturi sau funcii noi.

68

3.
DETERMINAREA
MEDICAMENTOASE

CANTITATIV

SUBSTANELOR

determinarea cantitativ a substanelor medicamentoase ca atare

determinarea cantitativ a substanelor medicamentoase din
produsele farmaceutice.

Probleme:
realizarea unor condiii standardizate
respectarea legii Lambert-Beer.

Exemplu: Alilestrenolul
- se foloseste solvent CCl4.
- maximele de absorbie caracteristice = 1310 cm-1, 1650 cm-1.
- legea Lambert-Beer se verific folosind soluii de concentraii = 0,5-2
g% (m/v).
- se poate determina n aceste condiii i din diverse produse
farmaceutice.

69

Componentele unui spectrometru FT-IR

70

Avantajele FT-IR
Vitez:

deoarece toate frecvenele sunt msurate

determinrilor FT-IR sunt de ordinul secundelor

simultan,

majoritatea

Sensibilitate:
sensibilitatea metodei este mult mbuntit deoarece detectorii utilizai
sunt mai sensibili, zgomotul de fond este mult sczut, iar scanarea rapid
permite coadiia mai multor scanri, reducnd zgomotul msurat
ntmpltor la nivelul dorit (semnal mediu)

Simplitatea aparaturii:
oglinda mobil a interferometrului este singura parte a aparatului care se
mic continuu, astfel nct este foarte puin posibil o defectare mecanic

Calibrarea intern:
aceste aparate utilizeaz ca standard de calibrare intern a lungimii de
und, lasere cu He, Ne. Aparatura are auto-calibrare i nu necesit o
calibrare de ctre utilizator.

71

APLICAIILE FT-IR
metod utilizat pentru identificarea oricrei probe.
sensibilitatea va face posibil identificarea unei cantiti foarte
mici de impuriti, ceea ce demonstreaz c analiza FT-IR este o
metod valoroas n controlul de calitate sau n aplicaiile asigurrii
calitii.
sensibilitatea i precizia detectorilor FT-IR, la care se adaug gama
larg de software de algoritm au crescut utilizarea practic a
metodei n analiza cantitativ.

Evaluare i identificare:
de compui organici, anorganici
n formularea medicamentelor
n determinarea omogenitii materialelor
n medicina legal.

72

SPECTROSCOPIA N IR APROPIAT
NEAR INFRARED SPECTROSCOPY (NIRS)
este o tehnic rapid i nedistructiv, capabil de a furniza date despre
constituenii oricrei matrie
acoper lungimi de und cuprinse de la mijlocul infraroului pn la
domeniul vizibil.
13000-4000 cm-1 sau 800-2500 nm

73

APARATURA
Spectrofotometru NIR:

surs de lumin

monocromator

suport care s in proba sau o suprafaa pe care se pune proba

detector prin intermediul cruia se fac msurtori de reflexie sau

transmitan.

74

Moduri de masurare NIR

75

AVANTAJE NIR

nu este necesara prepararea probei reducere timp de analiza

metoda nedistructiva
cantitati mici de reactivi
metoda excelenta pentru analiza probelor solide

metoda neinvaziva

76

SPECTROSCOPIA DE MASA - MASS

SPECTROSCOPY (MS)
Definitie:
Spectroscopia de mas este o metod instrumental de analiz care se
bazeaz pe fragmentarea moleculelor substanelor organice sub aciunea unor
radiaii cu energii mari de pn la 100 eV, iar din analiza
- numrului
- sarcinii
- masei fragmentelor rezultate - se obin informaii asupra
structurii
identitii substanelor cercetate.
Datorit acumulrii de energie are loc fragmentarea moleculelor cu
ruperea unor legturi interatomice, proces prin care rezult :
- mai ales ioni pozitivi (rar negativi)
- radicali
- ioni radicali
- molecule neutre.
Aceste fragmente constituie piese importante de reconstituire a structurii
moleculare.

77

b)

Reprezentarea spectrelor de mas:

a)
spectrul de bare al metanolului;
spectrul de mas continuu al unei substane organice
oarecare

78

Sistem de presiune inalta

Injector

Sursa
de ioni

Analizor
de masa

Detector

Sistem
date

Diagrama unui spectrometru de mas

79

Surse de ionizare

1.
2.
3.
4.

5.
6.

Ionizarea prin impact electronic (Electron ionisation

- EI)
Ionizarea chimic (Chemical ionisation CI)
Bombardarea cu atomi rapizi (Fast Atom/Ion
Bombardment FAB)
Ionizarea prin desorbie laser asistat de o matrice
(Matrix assisted laser desorption ionization MALDI)
Ionizarea la Presiune Atmosferic (Atmospheric
Pressure Chemical Ionization - APCI)
Ionizarea prin electrospray (Electrospray Ionization
- ESI)
80

APLICAIILE SPECTROSCOPIEI DE MAS

Interpretarea spectrelor

+
+

+
+

81

Identificarea unui compus cu ajutorul spectrotecii MS

Exist spectroteci care corespund unor colecii (biblioteci) de spectre de
mas ale substanelor cunoscute, n care sunt incluse (codate) principalele picuri ale
acestora.
Utilizarea acestor spectroteci, n care se caut picurile care intereseaz,
implic urmtoarele etape:
reducerea datelor, prin care spectrul substanei care ne intereseaz este redus la
cel mult 16 picuri, acordnd preferin picurilor mai grele, mai semnificative dect
picurilor uoare; fiecare spectru este redus n bibliotec la 8 picuri
-

precercetarea, care const n selecionarea spectrelor reduse din spectrotec, la

acelea care au picuri cu aceleai poziii ca i picurile din spectrul redus al substanei
cercetate, chiar dac intensitatea lor este diferit
-

cercetarea principal, care const n reluarea seleciei precedente printr-un

algoritm mai subtil care include printre criteriile de alegere:
intensitatea
masa
raritatea picului, afectnd un indice de identitate de la 0 la 1000 fiecrui spectru,
prin aceasta realizndu-se o clasare prin similaritatea descresctoare.
Exist numeroi algoritmi de cercetare, iar prin modificarea criteriilor de
alegere se poate reduce cercetarea prin verificarea i alegerea ntre diverse
clasamente.
Cea mai important spectrotec de mas este aceea a NIST (National
Institut of Standards and Technology), care includea peste 250000 de spectre la
nivelul anului 1996, iar n prezent numrul spectrelor este desigur mai mare.
-

82

Stabilirea formulei moleculare

Spectrele de mas pot fi utilizate cu anse mari de certitudine
pentru stabilirea formulei moleculare a unei substane, deoarece poziia
fiecrui pic care provine din fragmentarea unui ion precedent (exceptnd
cazul unor reamenajri) ofer informaii care se pot utiliza pentru stabilirea
ionului n cauz. Exemplu:
- prezena unui pic cu (M-1)+ - ionul s-a format prin pierderea unui atom de
hidrogen
- prezena unui pic cu masa (M-15) + - ionul provine din ionul M+ prin
pierderea foarte probabil a unei grupe de metil (CH3 cu masa M=15)
daca ionul M+ conduce la un ion cu masa (M-18)+ - ionul a pierdut o
molecul de ap.
-

Trebuie s se in seama c, de regul, procesul de fragmentare sau

cel de reamenajare a ionilor care se formeaz din ionul molecular trebuie s
conduc la radicali sau ioni mai stabili dect ionul din care provin.

83

84