MICROBIOLOGIE GENERAL NOTE DE CURS 1.

CONCEPTUL DE BACTERIE
Primele bacterii au fost evideniate i descrise de ctre A. Leeuwenhoek n 1675. Recunoaterea lor ca grup distinct a fost fcut n perioada 1850-1875 de ctre Cohn, pe baza proprietilor grupului omogen al eubacteriilor. Stanier i Lwoff (1973) consider c F. Cohn este adevratul fondator al bacteriologiei ca ramur a biologiei. Descoperirea diferitelor grupuri de bacterii (actinomicete, spirochete, mixobacterii etc.) a scos n eviden multe caractere care nu sunt unitare, de exemplu: au fost derscrise bacterii imobile sau mobile prin unul sau mai muli flageli, prin alunecare, trre sau prin contracia unui folament axial; s-a evideniat c multiplicarea se poate face prin diviziune, nmugurire sau formare de celule specializate (spori), sau prin segmentare i fragmentare (la actinomicete); unele bacterii (actinomicetele) prezint, datorit structurii lor miceliene, analogii frapante cu grupul fungilor n care au fost ncadrate mult vreme; mixobacteriile prezint un ciclu de dezvoltare complex, care include un stadiu de cretere vegetativ i unul de fructificaii policelulare, adesea cu dimensiuni macroscopice ca protistele amoeboide.

Conceptul de bacterie a fost definit n perioada 1960-1964, oferind posibilitatea de a grupa pe criterii obiectiv-tiinifice, discriminatorii, microorganismele reunite pn atunci numai pe baz de acord pur convenional. Stanier (1962, 1964, 1967) a demonstrat primul c diversificarea prin evoluie a lumii bacteriene are la baz un caracter comun celula procariot. Conceptul de bacterie, n forma sa actual poate fi definit n funcie de aceast organizare procariot i prin antitez cu tipul de organizare eucariot.

Celua procariot, mai puin complex, este unitatea de structur a bacteriilor sensu lato i a algelor albastre-verzi. Celula eucariot, mai complex, este unitatea de structur a tuturor celulelor animale, a plantelor vasculare, a briofitelor, a fungilor i a tuturor celorlalte grupuri de alge. Divergena fundamental care separ bacteriile i algele albastre-verzi de toate celelalte organisme, corespunznd diferenei dintre tipul procariot i eucariot, reprezint cea mai mare discontinuitate evolutiv prezent azi n lumea vie. Nu se cunosc intermediari ntre procariote i eucariote, adic nu se cunosc organisme cu o structur celular de tranziie. Dodge (1965, 1971), pornind de la observaia c dinoflagelatele au unele caracteristici ale procariotelor i altele aparinnd eucariotelor propune includerea lor ntr-un grup intermediar Mesokariota. Cercetrile de microscopie electronic i cele de biologie molecular au dezvluit i accentuat discontinuitatea dintre procariote i eucariote i au dus la acumularea unui numr important de caractere discriminatorii, care permit s se stabileasc ceea ce este realmente tipic i ceea ce este numai aparent i superficial similar, pentru ncadrarea pe baze tiinifice a diferitelor entiti ntr-un grup sau altul.

Poziia microorganismelor n lumea vie

Diferenele fundamentale dintre bacterii i celula vegetal (ca prototip de celul eucariot) demonstreaz absena oricrei puni de legtur ntre lumea bacterian i cea a plantelor, de aceea ncadrarea bacteriilor n rndul plantelor este arbitrar i nelogic (Stanier i Van Niel, 1962, 1977). Meninerea acestei ncadrri a bacteriilor n grupa plantelor de-a lungul anilor a reprezentat rezultatul refuzului ndrtnic de a privi lucrurile n fa, singurul argument care poate fi invocat fiind acela al aprecierii pretiinifice, dup care n lumea vie ar exista doar dou categorii de organisme mutual exclusive plantele i animalele. Pe msur ce lumea microscopic a fost cunoscut mai aprofundat a devenit evident c unele microorganisme nu pot fi clasificate fr rezerve n nici unul din cele dou regnuri tradiionale i c exist grupuri ntregi cu caractere intermediare revendicate n egal msur i de botaniti i de zoologi (de ex., Euglena, Chlamydomonas, Volvox etc.). Incnvenientele majore ale sistemului tradiional de clasificare au fost sesizate iniial de Hogg (1860) care a propus gruparea microorganismelor ntr-un regn nou, regnul Primigenum, denumit ulterior Protoctista. Haeckel (1866) propune crearea unui regn menit s grupeze toate formele inferioare de via, regnul Protista, definit i delimitat n mai multe variante, pentru ca n formele sale finale (1894-1904) s includ numai microorganismele unicelulare sau unicelular-coloniale. Stanier (1970) mparte regnul Protista n dou subgrupuri: protiste inferioare, corespunznd microorganismelor procariote (bacterii i alge albastre-verzi); protiste superioare, corespunznd microorganismelor eucariote, care includ algele, fungii i protozoarele. n aceast accepiune, cadrul conceptului de Protista este exins la toate organismele unicelulare, cenocitice sau multicelulare care nu formeaz esuturi. Sistemul celor patru regnuri propus de Copeland (1938) i modificat de Hutchinson (1967) i Weisz (1971) are ca trstur esenial diviziunea lumii microorganismelor n patru regnuri: 1. Regnul Monera (Mychota), care include bacteriile propriu-zise i algele albastre-verzi; 2. Regnul Protoctista (Protista), incluznd organismele eucariote inferioare cu organizaie unicelular, unicelular-colonial, sinciial sau multicelular, fr diferenieire celular avansat (de ex., algele cu excepia celor dou procariote, fungii, mixomicetele i protozoarele). 3. Regnul Plantae (Metaphyta, Weisz) - corespunznd plantelor terestre i acvatice organisme eucariote superioare, multicelulare, cu perete celular i difereniere celular variabil de la limitat la intermediar. 4. Regnul Animalia (Metazoa, Weisz) - incluznd organisme multicelulare eucariote, coninnd celule fr perete celular i fr plastide, avnd i prezentnd o difereniere avansat, tisular i de organe. Dei are o serie de avantaje mari fa de sistemele anterioare i reprezint o contribuie major la interpretearea lumii vii, sistemul celor patru regnuri, n diferitele sale variante, prezint o serie de imperfeciuni, care, dei sunt proprii lumii vii ca obiect de clasificare, apar cu eviden maxim, legate tot de lumea organismelor simple. ntre aceste imperfeciuni sunt menionate urmtoarele: Regnul Protoctista (Protista), foarte diferit n raport cu grupul Monera (Meychota), este lipsit de unitate i de claritate, din cauza faptului c limitele de organizare ale organismelor sunt foarte largi, iar diferenierea lui de organismele superioare nu este clar trasat. Aceast situaie se datoreaz

faptului c nu exist nici o cale bun pentru a separa organismele eucariote inferioare de cele superioare, ci numai diferite alternative de opiune, cu dificulti i incnveniente diferite. Lund drept criteriu nivelul de difereniere tisular, apartenena algelor i a fungilor superiori la regnul Protista este o consecin imediat, care atrage dup sine o a doua, eterogenitatea lui. Linia de demarcaie ntre Protista, pe de o parte, i plantele i animalele superioare, pe de alta, este trasat, n primul rnd de gradul de difereniere tisular situaie care creeaz o delimitare destul de neclar. n fapt, regnul Protoctista reprezint mai curnd o confederaie de organisme excluse din celelalte trei regnuri (Monera, Plantae, Animalia), care cuprinde o foarte larg gam de organisme cu diferite niveluri intermediare de organizare, superioare n raport cu procariotele, dar inferioare plantelor vasculare i animalelor superioare. Sistemul celor cinci regnuri, propus de Whittacher (1969), ncearc s ocoleasc deficienele sistemelor precedente, utiliznd urmtoarele criterii de grupare: 1. Stabilirea a trei niveluri de organizare: a) procariot; b) eucariot unicelulur; c) eucariot multicelular; 2. Existena a trei modaliti principale de nutriie, determinante a trei direcii majore de evoluie, care la nivelul multicelular (multinuclear) se exprim prin divergenele evolutive ale celor tri regnuri superioare: a. nutriia fotosintetic (secundar absorbtiv) caracteristic plantelor; b. nutriia ingestiv tipic pentru animale; c. nutriia absorbtiv caracteristic fungilor. Consecinele adoptrii acestor criterii sunt n esen pe lng unele restructurri ale grupelor mai mici urmtoarele: 1. apariia regnului Fungi ca al treilea regn de organisme superioare, alturi de plante i animale; 2. trecerea algelor verzi n regnul Plantae, alturi de plantele verzi superioare; 3. plasarea liniei de demarcalie dintre organismele superioare i protiste la trecerea de la unicelular la multicelular multinuclear. n acord cu aceste principii, sistemul celor cinci regnuri elaborat de Whittaker are urmtoarea structur: 1. Regnul Monera include organisme unicelulare de tip procariot, corespunznd bacteriilor, organisme cu existen unicelular-solitar sau unicelular-colonial, cu excepia actinomicetelor care au organizare de tip micelial. Modul de nutriie este predominant absorbtiv, iar metabolismul de tip foto- sau chimiosintetic. Reproducerea se face prin diviziune asexuat, mai rar prin nmugurire. Rar, prezint fenomene de protosexualitate. Imobile sau mobile (prin flageli simpli, de tip special, sau prin alunecare-trre). 2. Regnul Protista include organisme primar unicelulare sau unicelular-coloniale de tip eucariot. n unele cazuri sunt prezente stadii de via cu structur simpl sau multinuclear. Modul de nutriie este diferit de la un grup la altul (absorbie, ingestie, fotosintez sau combinaii ale acestor tipuri). Reproducerea este, de asemenea, de tip diferit, incluznd diviziunea asexuat (la nivel haploid) i procese sexuale adevrate, cu cariogamie i meioz. Sunt imobile sau mobile prin flagel de tip superior sau prin alte mijloace. 3. Regnul Plantae include organisme multicelulare cu celule eucariote, care au peretele celular celulozic, frecvente vacuole n citoplasm i pigmeni fotosintetici n plastide. Modul principal de nutriie este cel fotosinteic; unele linii au devenit absorbtiive. Esenial imobile, triesc ancorate pe un substrat. Prezint difereniere structural care duce la apariia unor organe de fotosintez, ancorare i de sprijin (suport), iar la formele superioare la formarea unor esuturi specializate fotosintetice, vasculare i de acoperire. Reproducerea este 3

n primul rnd sexuat, cu cicluri de generaii alternative, haploide i diploide, primele fiind progresiv reduse spre membrii superiori regnului. 4. Regnul Fungi. Exceptnd subregnul Gymnomycota, include organisme multinucleare, cu nuclei de tip eucariot, dispersai ntr-un sinciiu micelial, acoperit de un perete celular, adesea septet, caracterizate prin lipsa plastidelor i a pigmenilor fotosintetici. Nutriia este de tip absorbtiv. Diferenierea somatic este absent sau limitat; n schimb, diferenierea esutului reproductiv i complicare ciclului de via sunt foarte marcate la formele superioare. n primul rnd imobile (dar cu flux citoplasmatic n miceliu), triesc nclavate n mediu sau n sursa de hran. Prezint cicluri reproductive tipice, incluznd procese sexuale i asexuale. Micelii, cel mai des haploide la formele inferioare i dicariotice la multe forme superioare. 5. Regnul Animalia include organisme multicelulare de tip eucariot, fr perete celular, fr plastide i fr pigmeni fotosintetizani. Nutriia este n primul rnd de tip ingestiv, cu digestie ntr-o cavitate intern; unele forme sunt absorbtive; la unele grupuri lipsete cavitatea digestiv intern. La formele superioare nivelul de organizare i de difereniere tisular depete de departe celelalte regnuri, ducnd la apariia a diferite sisteme senzoriale neuromotorii. Motilitatea organismelor sau a prilor lor (la formele sesile) se bazeaz pe existena unor fibrile contractile. Reproducerea predominant sexuat; stadiile haploide, diferite de cele ale gameilor, aproape lipsesc la organismele situate deasupra filumurilor inferioare. Sistemul lui Whittaker, dei foarte recent creat, este agreat de un mare numr de specialiti, care consider c el reprezint cel mai bine relaiile dintre organisme, att n ceea ce privete nivelurile de organizare ale lumii vii, ct i modul de nutriie care afecteaz tipul de organizare. El are avantaje evidente n sensul unei mai pregnante coerene a regnurilor, ca uniti de clasificare decurgnd din precizarea mai net a caracterelor lor definitorii, dar i o serie de limitri care sunt evideniate chiar de Whittaker, dar care nu sunt legate de lumea bacteriilor.

2. ANATOMIA BACTERIILOR 2.1. Morfologie

Forma bacteriilor este controlat genetic. Dei variaz destul de mult, n funcie de condiiile de mediu, polimorfismul acestor microorganisme este relativ limitat i caracterizat, de cele mai multe ori, prin predominana formei tipice pentru specia dat. Deoarece forma bacteriilor este greu de apreciat direct din mediile naturale, cunotinele de morfologie bacterian se refer, de obicei, la celulele cultivate, n condiii artificiale de laborator, n care caz forma celulei poate fi influenat de vrsta culturii, de compoziia mediului, de temperatur etc. Datorit acestui fapt, forma bacteriilor care reprezint un criteriu taxonomic important se apreciaz n mod convenional pe celule provenite din culturi tinere, n faza de cretere activ, pe medii de cultur corespunztoare i n condiii optime de temperatur, tensiunea O2, pH etc. n culturi vechi, n care cele mai multe bacterii sunt pe cale s degenereze sau s moar, apar celule cu forme aberante (cu aspecte de Y, ramificate, filamentoase etc.), care se observ i n cazul cultivrii n condiii improprii de mediu (temperatur nepotrivit, concentraii mari de sruri anorganice, doze subletale de substane antibacteriene); acestea rezult din interferena unor aciuni nocive cu procesul de diviziune normal sau din altererarea mecanismelor de permeabilitate selectiv, urmat de imbibiia cu ap i autoliza structurilor celulare prin aciunea enzimelor proprii. Dup forma celulei, bacteriile pot fi grupate n cinci mari categorii: 1. sferice; 2. cilindrice; 3. spiralate sau elicoidale; 4. filamentoase; 5. ptrate. La cela mai multe specii, celulele-fiice se separ i rmn independente datorit agitrii mecanice, curenilor de convecie din mediu, micrii browniene, forelor rezultate din presiunea de turgor a celulelor care cresc, ct i a aciunii flagelilor, n cazul bacteriilor mobile. La unele specii aparinnd grupului de bacterii sferice i uneori chiar al celor cilindrice, celulele-fiice nu se despart la sfritul diviziunii, ci formeaz grupri caracteristice cu valoare texonomic. Rareori ns toate celulele speciei respective sunt grupate tipic. Caracteristic este modul de grupare dominant. Modul de grupare a celulelor dup diviziune este n funcie de raportul geometric dintre diferite planuri succesive de diviziune i de tendina celulelor-fiice de a rmne unite. n unele cazuri, gruparea nu reprezint un caracter morfologic propriu, ci este o consecin a stadiului de cretere sau a condiiilor de cultur. Spre exemplu, Corynebacterium diphteriae are tendina s se grupeze n palisad, iar Mycobacterium tuberculosis n grupuri de trei bacili, care dau impresia de structur ramificat. Aceste moduri de grupare reprezint ns excepii de la regul, deoarece cea mai mare parte dintre bacteriile respective apar izolate unele de altele.

1. Bacteriile sferice (cocii) au form sferic, ovoidal, elipsoidal, reniform, uneori neregulat, sau parial poliedric, diametrele celulei fiind aproximativ egale. Deoarece aceast form este adesea modificat de diferii factori de mediu este discutabil dac n stare vie celula este realmente sferic. n funcie de poziia celulelor-fiice dup diviziune, cocii prezint urmtoarele ase subtipuri morfologice: a) cocul simplu sau izolat, la care celulele rezultate din diviziune rmn independente; b) diplococul, la care diviziunea se face dup planuri succesive paralele, celulele rezultate rmnnd grupate cte dou (Streptococcus pneumoniae); c) streptococul la care diviziunea se face dup planuri succesive paralele, dar celulele rezultate formeaz lanuri de lungimi variabile, ca un irag de mrgele (Streptococcus pyrogenes); d) tetracocul sau tetrada, la care planurile succesive de diviziune sunt perpendiculare unele fa de altele, iar celulele rezultate sunt dispuse n grmezi de patru elemente (Micrococcus tetragenes); e) sarcina, la care planurile de diviziune sunt orientate n trei direcii diferite, perpendiculare unul pe alrul (al doilea pe primul, i al treilea pe primele dou), de unde rezult o grupare n cuburi sau pachete (Sarcina flava, S. aurantiaca); f) stafilococul la care planurile succesive de diviziune sunt dispuse n cteva direcii, iar organismele rezultate se aranjeaz n grupri neregulate n form de ciorchine (Staphylococcus aureus). Lampropedia are forma unor celule rotunde sau aproape cubice, grupate n iruri regulate, formnd tablete rectangulare de 16, 32 sau 64 de celule agregate, datorit unei matrice extracelulare. Celulele care formeaz tablete, avnd n interior incluziuni refringente strlucitoare, sunt acoperite de un nveli structurat complex, distinct de peretele celular, care nu nconjur celulele individuale, ci numai ansamblul gruprii lor. Izolat din rumen, ape mloase, stagnante, Lampropedia formeaz pelicule pe suprafaa mediilor lichide. 2. Bacteriile cilindrice cunoscute mai ales sub denumirea comun de bacili, au form de bastonae. Raportul dintre cele dou axe variaz mult, unele bacterii putnd lua form aproape sferic-oval (cocobacili); acestea din urm fiind greu difereniate de coci, dar n culturi pure exist mereu cteva celule suficient de lungi, pentru a identifica natura lor cilindric. Bacilii sunt drepi sau uor ncurbai la mijloc sau la una din extremiti. Capetele pot fi tiate drept (Bacillus antracis) sau rotunjite ca la majoritatea celorlali. Marginile laterale ale celulei sunt de obicei paralele, dar pot fi i apropiate la extremiti, n firm de suveic (Fusiformis fusiformis), sau ndeprtate i rotunjite la una sau ambele extremiti, n form de mciuc sau de picot (Corynebacterium). Bacilii pot fi grupai: cte doi (diplobacili); n lanuri cu lungimi variabile (streptobacili); n palisad ca scndurile unui gard, celulele rmnnd apropiate i paralele n sensul axului lung, aezarea fiind rezultatul unei micri de basculare a celuleifiice, avnd ca punct de sprijin peretele transvers recent separat; sub form de rozet sau de stea (Agrobacterium stellulatum, Ag. radiobacter, Phyllobacterium stappi).

3. Bacteriile spiralate sau elicoidale cuprind trei subtipuri morfologice: a) vibrionul, n form de virgul (Vibrio cholerae); b) spirilul, n form de spiral cu mai multe ture de spiral rigide (Spirillum volutans); c) spirocheta, n form de spiral cu mai multe ture flexibile, care se pot strnge sau relaxa (Borrelia, Treponema i Leptospira). 4. Bacteriile filamentoase au ca prototip actinomicetele, microorganisme cu asemnri morfologice asemntoare cu fungii, avnd particularitatea de a forma hife ramificate (de unde aspectul de miceliu). n unele cazuri aspectul filamentos este determinat de aezarea celulelor individuale n lanuri de celule reunite printr-o teac delicat cu perete neted, care n condiii favorabile pot acumula hidroxid de fier sau mangan. 5. Bacteriile ptrate evideniate n apa hipersalin din unele bli din Peninsula Sinai (Walsby, 1980) au forma unor ptrate cu latura de 1,5-11 m i o grosime inegal (0,1 m sau chiar mai mic n regiunea central i 0,2-0,5 m la periferie, Parkes, 1981). Uneori formeaz placarde de 8-16 ptrate la care se vd net planurile de diviziune. Celulele conin vacuole cu gaze, care dispar la presiune, situate frecvent de-a lungul marginilor ptratelor. n unele cazuri sunt dispersate la ntmplare n celul. Multiplicarea se face prin diviziune. n unele cazuri, fiecare bacterie ptrat crete pn ia forma unui dreptunghi, care se divide n dou ptrate egale. Alteori, diviziunea se face n dou planuri ce alterneaz n unghi drept iar celulele rezultate din diviziune formeaz placarde. Bacteriile ptrate au fost ncadrate n genul Quadra aparinnd probabil grupului Archaebacteria (Parkens i Walsbz,1981).

n afara acestor cinci tipuri morfologice de baz exist bacterii cu forme particulare, rezultate din gruparea lor ntr-un trichom, prezena unor prelungiri celulare (prostec), a unor aprndice acelulare etc. Bacteriile care formeaz trichoame. Trichomul este o grupare de celule sub forma unui filament multicelular, uniseriat, rezultat din diviziune, n care celulele adiacente au o suprafa relativ mare de contact strns i sunt meninute ntr-un nveli parietal comun (Starr,1973) (Leucothrix, Beggiatoa, Caryophanon latum, Sphaerotilus natans). Bacteriile prostecate. Unele bacterii prezint o complicaie morfologic prosteca (gr. = adaos, apendice, coad) sub forma unui apendice semirigid, situat n continuarea unei celule procariote i avnd totdeauna un diametru mai mic dect cel al celulei mature. Funciile prostecii: - implicat n reproducerea bacteriilor care nmuguresc; - mrete suprafaa celulei i implicit a membranei plasmatice, permind sporirea activitilor asociate (respiraia i absorbia de sunbstane nutritive); - are rol de fixare (Caulobacter), dei frecvent a fost gsit i la celule plutitoare.

Bacteriile cu apendice acelulare. Bacteriile prezint un aspect filamentos datorit unor apendice acelulare, formate din substane secretate sau excretate de ele, nedelimitate de perete celular. Gallionella ferruginea, prezent n ape feruginoase, are forma unui bob de fasole de 0,5x1,2 m i este situat la extremitatea unui apendice filamentos acelular, format dintr-un produs secretat de ea nsi prin porii situai pe partea sa concav.

Celulele bacteriene miniaturale (minicelulele). Minicelulele sunt corpusculi mici, aproximativ sferci, care nu cresc i sunt formai printr o septare neobinuit, n apropierea uneia dintre extremitile unei bacterii cilindrice. Au cel mai adesea un diametru mai mic dect al unei celule bacilare parentale. Sunt lipsite de material nuclear sau deficiente n ADN. De aceea sun incapabile de cretere i diviziune. Au fost descrise ca un proces de diviziune inegal (asimetric) la Escherichia coli, Salmonella, Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae, Erwinia amylovora .a.

2.2. Proprieti fizice

Dimensiuni Bacteriile au dimensiuni foarte mici, n medie 0,5-1 m x 3-6 m. Cele mai mici aparin genului Mycoplasma i au diametrul 125-250 nm. Cele mai mari pot ajunge la 1020m lungime, iar n cazul formelor filamentoase, n mod excepional, chiar la 500 m (Saprospira grandis). Sub raportul dimensiunilor cele mai mici bacterii se suprapun virusurilor mari (Poxvirus), vizibile la microscopul fotonic, iar cele mai mari depesc mrimea celor mai mici protiste eucariote. Deoarece celulele difer mult ca form, stanier (1970) recomand volumul ca unic baz satisfctoare de apreciere a mrimii bacteriilor. Volumul celulei bacteriene poate fi apreciat cu ajutorul formulelor de calcul aplicate corpurilor geometrice regulate. Suprafaa celulei bacteriene se poate calcula ncadrnd bacteriile ntr-o form geometric regulat, pe baza dimensiunilor celulei. Exemple: 1,104x10-9 cm2 (Mycoplasma), 35,340x10-9 cm2 (Escherichia coli), 12 576 x10-9 cm2 (Saprospira grandis). Densitatea sau greutatea specific a celulei bacteriene vii (n stare umed) variaz ntre 1,07 i 1,32. Valoarea acestui indice este n funcie de proporia relativ a substanerlor celulare cu densitate diferit de cea a apei (D=1). Lipidele au densitatea sub 1,0, glucidele 1,41,6, proteinele1,5, acizii nucleici 2,0, srurile minerale 2,0-2,5. Deoarece compoziia chimic a bacteriilor este variabil chiar la aceeai specie, n funcie de condiiile de mediu sau de vrsta celulei, densitatea lor este caracteristic numai n raport cu anumite condiii de cretere. Celulele tinere, care sunt turgescente, au o densitate mai mic dect cele btrne, iar la bacteriile cultivate pe medii lichide valoarea ei este mai mic dect la cele cultivate pe medii solidificate. Datorit densitii lor mici, bacteriile rezist la sedimentare spontan n medii gazoase i lichide, din care ns pot fi separate prin centrifugre. Greutatea unei bacterii poate fi calculat mprind greutatea unei anumite mase de celule la numrul unitilor componente. Celulele de Escherichia coli, care sunt de 500 de ori mai mici dect o celul vegetal sau animal de dimensiuni medii ( 10 m), au o greutate de 1012 dal, respectiv de 6 x 106 dal ori mai mare dect greutatea unei molecule de ap (g.m.=18 dal.) Raportul dintre suprafaa celulei i greutate are o valoare foarte ridicat la bacterii. n cazul unui coc cu diametrul de 1 m acest raport este de ~ 55 000, la E. coli ~ 81 000, la Chlamydia ~ 193 000, iar la Mycoplasma ~ 290 000. Acelai raport la om (24000 cm2/70 000 g) 8

este de 0,342, respectiv de 84 146 ori mai mic dect la Bacillus megaterium, de 239 233 ori mai mic dect la Escherichia coli, i de 850 611 ori mai mic dect la Mycoplasma Datorit raportului foarte mare dintre suprafaa i volumul bacteriilor, comparativ cu alte organisme, asemntor aceluia al particulelor de substane n state de dispersie coloidal, o cantitate mic de bacterii, de exemplu 1 g de Escherichia coli, care conine 1,8 x 1012 celule nsumeaz o suprafa total de contact cu mediul de circa 56 000 cm2; pentru comparaie menionm c 1 g celule de drojdie conine 8,3 x 109 celule, care au o suprafa de 9 100 cm2. Mrimea considerabil a acestei suprafee reactive de la interfaa celular mediu este deosebit de important, deoarece, practic toate substanele care intr i ies din celul trec prin aceast zon. Teoretic, pe baza unor considerente de ordin biologic i biochimic, limita inferioar de mrime a unei celule bacteriene este determinat de posibilitatea ei de a conine toi constituenii necesari pentru cretere i diviziune, respectiv un numr minim de enzime diferite (probabil cteva sute), aflate fiecare ntr-un numr variabil de molecule, acizi nucleici, glucide, lipide etc. Cea mai mic bacterie vizibil la microscopul fotonic are dimensiuni foarte apropiate de aceast limit molecular necesar pentru meninerea funciilor celulare. Celulele cu dimensiuni mai mici nu ar fi fizic suficient de cuprinztoare pentru a conine ntreg echipamentul enzimatic i moleculele necesare pentru via. n cazul microorganismelor eucariote, limita cea mai mic de mrime este determinat de limitri structurale: cele mai mici protiste eucariote sunt algele din genul Micromonas (M. pulsatilla 1-1,5 m) cu un singur cloroplast i o singur mitocondrie, care alturi de nucleu ocup ceaq mai mare parte din celul. Orice reducere de dimensiuni dincolo de aceast limit nu se poate face dect prin eliminarea unui organit celular, fr de care ns funciile metabolice ar nceta de ndat. Ca regul general, celulele eucariote sunt ns mai mari dect cele procariote i conin structuri absente la procariote. Celulele procariote nu pot depi anumite limite de mrime i, n general, nu pot ajunge la dimensiunile foarte mari ale celulelor eucariote. Limita superioar de mrime a unui organism unicelular este posibil corelat cu raportul suprafa/volum, avnd n vedere c toi nutrienii trebuie s ptrund n celul, iar produii de catabolism s fie eliminai. Pe msur ce dimensiunile unei celule cresc, volumul ei crete mult mai rapid dect suprafaa (volumul crete la cub n raport cu raza celulei, n timp ce suprafaa crete cu raza la ptrat). Cnd raza celulei crete de trei ori, volumul crete de 27 de ori (33), iar suprafaa de numai 9 ori (32). n prezena acestui dezechilibru, celula nu poate ngloba nutrieni i elimina substane reziduale n acord cu necesitile crescute ale volumului celular mrit (Nester i colab., 1973). Celulele eucariote mari au rezolvat aceast problem fie prin modificarea adecvat a formei (aducnd astfel prileinterne ale celulei aproape de suprafa), fie, mai ales, prin prezena curenilor citoplasmatici care asigur circulaia nutrienilor i a produilor de uzur dintr-o zon n alta. Ca o regul general, valabil la toate nivelele de complexitate biologic, rata metabolismului este invers proporional cu mrimea organismului, iar rata de cretere (determinat n special de rata global a metabolismului) crete pe msur ce dimensiunile celulare scad n corelaie cu raportul suprafa/volum. Dimensiunile mici ale bacteriilor apar ca o condiie esenial pentru creterea i multiplicarea lor rapid, n comparaie cu celulele eucariote, ceea ce le confer un mare avantaj biologic n natur, asigurnd supravieuirea lor n competiie cu alte organisme. Celulele mai mari au nevoie de mult timp pentru ca nutrienii s ptrund n celul i s fie metabolizai pentru a asigura creterea acesteia. Un alt factor care pare s determine o limit superioar de mrime a celulelor bacteriene este dificultatea de meninere a unei reglri satisfctoare i de coordonare a 9

activitii metabolice ntr-o celul mare cu organizare de tip procariot. Unele bacterii foarte mari, Spirillum volutans, Thiospirillum jenense etc., nu pot fi cultivate dect extrem de greu, n contrast cu bacteriile mici din acelai grup fiziologic (Stanier, 1970). Explicaia const n faptul c la aceste bacterii condiiile fizico-chimice necesare dezvoltrii sunt foarte restrnse, iar capacitatea de reglare a funciilor metabolice eseniale pentru a le conferi flexibilitatea adaptativ la modificri minore ale mediului foarte limitat.

10

3. ULTRASTRUCTURA CELULEI BACTERIENE

Lund ca reper peretele celular, constituenii celulei bacteriene pot fi grupai n dou mari categorii: intraparietali, care formeaz protoplastul (membrana plasmatic, mezosomii, citoplasma, nucleoidul, ribosomii, magnetosomii); extraparietali (capsula, stratul mucos, glicocalixul, spinii, flagelii, fimbriile i pilii).

3.1. Peretele celular

Celula bacterian este delimitat de un perete celular bine definit structural i cu consisten rigid. Situat n afara membranei citoplasmatice, el este acoperit, la unele specii, de o capsul sau de un strat mucos pericelular, iar la bacteriile mobile este strbtut de flageli. Datorit indiceluli de refracie mic, peretele celular este invizibil ori foarte greu vizibil la celulele vii examinate la microscopul fotonic. Evidenierea lui este ns posibil prin colorare selectiv sau prin examinare la microscopul electronic. La bacteriile tinere, care au citoplasm abundent, compact i omogen, peretele celular ader intim la coninutul celular subiacent. La celulele btrne sau n curs de liz, plasmoliz etc., peretele celular devine evident, fiind deprtat de citoplasm. Punerea n eviden a peretelui celular se poate face fie prin izolarea lui ca structur intact complet, fie prin modificarea raporturilor lui spaiale cu citoplasma. Aceast modificare se poatwe obine pe cale dezintegrrii celulare prin ultrasonare sau agitare cu perle de sticl, cu ajutorul dehnicii de microdisecie sau prin provocarea unui oc osmotic (inducie de plasmoliz sau plasmoptiz) ori a autolizei celulare. Examinat la microscopul electronic, peretele celular izolat are aspectul unui sac gol, care conserv forma bacteriei din care provine, i constituie asemntoare ochiurilor unei plase, cu tram regulat, care apare ca fiind formt din fascicule de fibre paralele care se ncrucieaz. Grosimea peretelui celular variaz ntre 15 i 35 nm, excepional putnd s ajung la 80 nm, ca la Lactobacillus acidophilus. Este mai subire la celulele tinere care cresc mai rapid. n funcie de prezena i particularitile de structur ale peretelui celular au fost propuse trei diviziuni n cadrul regnului Procaryotae (Gibbson i Murray, 1978): 1. Firmacutes (l. firmus = tare; cutis = piele, nveli), corespunznd bacteriilor Grampozitive cu perete celular gros, lipsit ns de membrana extern; 2. Gracilicutes (l. gracilis = subire), corespunznd bacteriilor Gram-negative cu perete celular n mod obinuit subire, avnd n structura sa membran extern; 3. Mollicutes (l. mollis = moale, delicat), corespunznd genului Mycoplasma, care cuprinde bacterii Gram-negative fr perete celular uniform. n funcie de structur i de compoziia chimic, pereii celulari ai bacteriilor aparin la trei categorii, care coincid cu modul de colorare: Gram-pozitiv, Gram-negativ sau acidorezistent. Pereii celulari din cele trei categorii au drept constituient comun peptidogicanul, dar se deosebesc n ceea ce privete raportul, prezena, natura, cantitatea i aranjamentul structural al proteinelor, polizaharidelor i lipidelor.

11

Peretele celular al bacteriilor Gram-pozitive apare la microscopul electronic ca un strat unic, relativ omogen, dei frecvent pot fi deosebite mai multe structuri contigue, foarte rar bine definite. Componentul major este peptidoglicanul (80-90% din greutatea uscat), care apare foarte net dup colorare cu sruri ale metalelor grele i poate fi degradat dup tratare cu lizozim. n afar de peptidoglican, peretele celular al bacteriilor Gram-pozitive mai conine proteine i polizaharide care includ acizii teichoici, teichuronici, neteichoici i polizaharide neutre. Peptidoglicanul (sin. murein), glicopeptid, mucopeptid, glicozaminopeptid, mucocomplex este un component parietal caracteristic i comun tuturor bacteriilor, cu excepia genului Mycolasma, a formelor L i a bacteriilor halofile extreme. Este unu heteropolimer compus dintr-o poriune glican i o component peptidic. Poriunea glicanic -foarte uniform- are structura unor lanuri lineare formate din resturile alternente a dou N-acetilhexozamine diferite, legate ntre ele prin legturi -1,4. Componenta peptidic conine ca unitate de construcie un tetrapeptid. Unitile tetrapeptidice aparinnd lanurilor de glican adiacente sunt legate prin intermediul unor puni specializate, interpeptidice. Astfel alctuit sacul peptidoglicanic este n esen o molecul unic, gigant i rigid, avnd o structur de reea tridimensional care formeaz n jurul protoplastului bacterian o reea ca o plas rigid cu ochiuri mici. Peptidoglicanul poate fi atacat de lizozim i de penicilin. Acizii teichoici sunt molecule polimere lungi i flexibile (formate din 1,5-poli ribitolfosfat i 1,3-poli glicerofosfat) localizate exclusiv n peretele celular, membrana plasmatic i straturile capsulare ale bacteriilor. Sunt prezeni numai la bacteriile Gram-pozitive i aparin la trei categorii: acizii teichoici parietali (la suprafae celulei), legai covalent de stratul peptidoglicanic al peretelui celular; acizi teichuronici legai de peretele celular; acizii teichoici membranari (sau lipoteichoici) legai covalent de fraciunea glicolipidic a membranei plasmatice, formnd o reea ntre membrana plasmatic i peretele celular. Acizii teichoici confer bacteriilor Gram-pozitive o serie de proprieti importante: au rol esenial n meninerea unei concentraii de ioni metalici, n particular Mg2+ la suprafae extern a membranei plasmatice, important pentru activarea unor sisteme enzimatice membranare dependente de cationi; au rol arhitactural; joac un rol important ca determinani de patogenitate (inhib fagocitoza i protejeaz bacteriile contra efectului bactericid al fagocitozei); leag i controleaz activitatea autolizinelor cu rol n creterea i diviziunea peretelui celular; acizii lipoteichoici acioneaz ca receptori de fag i de colicine, crend avantaje adaptative bacteriilor Gram-pozitive. Peretele celular al bacteriilor Gram-negative este mai subire dect al bacteriilor Gram-pozitive, este distinct stratificat, are o structur mai complex datorit prezenei membranei externe, care apare cu o structur similar membranei plasmatice (triplustrat). Este alctuit din urmtoarele structuri:
12

1. Complexul peptidoglican-lipoprotein care este situat n zona median a peretelui, are o grosime de 1,5-3,0 nm i este electronodens; stratul peptidoglicanic reprezint 2,410% din greutatea peretelui celular. La bacteriile Gram-negative sacul mureinic poate fi conceput ca o reea bidimensional sau ca un monostrat molecular, cu structur relativ constant. 2. Membrana extern a peretelui celular (numit astfel pentru c este situat la exterior fa de stratul peptidoglicanic i de membrana plasmatic) are o grosime de 6-20 nm. Membrana extern este alctuit din fosfolipide (35%), care formeaz un strat intern continuu, proteine (15%) i lipopolizaharide (50%), care sunt asociate cu stratul extern.

Fig.1. Reprezentarea schematic a nveliuilor celulare, evideniind structura membranei externe a peretelui celular i raporturile cu spaiul periplasmic i membrana citoplasmaric. (G. Zarnea, 1983, dup DiRienzo i Inouye, 1980)

Semnificaia biologic a peretelui celular

Peretele celular reprezint sistemul de susinere mecanic, un fel de corset neelastic, al ntregii arhitecturi celulare. Datorit rigiditii sale determin celulelor o form caracteristic. Asigur protecia fa de ocul osmotic. Presiunea osmotic intern este de ~5-6 atm. (la Escherichia coli de ~20-30 atm.). Fr suportul rigid al peretelui celular membrana plasmatic nu ar putea rezista acestei presiuni interne i nu ar putea asigura protejarea protoplastului. Particip la procesul de cretere i diviziune celular, urmnd membrana citoplasmatic n formarea septurilor transversale, care, dup replicarea cromozomului bacterian separ celula-mam n dou celule-fiice. Unii constitueni parietali imprim suprafeei celulare o anumit specificitate, jucnd rolul de receptori pentru unii bacteriofagi, determinnd fenomenul de recunoatere a celulelor apte de conjugare sau, n cazul bacteriilor patogene, acionnd ca factori antigenici capabili s induc n organismul animal infectat elaborarea de anticorpi specifici care pot servi ca receptori celulari de suprafa.

13

 Conine enzime autolitice capabile s atace structura glicopeptidului, active n momentul sporulrii, al eliberrii sporului prin liza sporangelui, al germinrii, ca i n biosinteza peretelui celular i n reglarea acestui proces. La bacteriile Gram-negative, prezena membranei externe i a constituenilor ei confer bacteriilor respective proprieti deosebite n raport cu mediul nconjurtor: acioneaz ca barier impermeabil pentru molocule hidrofobe, mpiedicnd intrarea n celul a diferitelor substane potenial nocive i pierderea unor metabolii necesari; funcioneaz ca o sit molocular asigurnd trecerea unor oligopeptide, oligozaharide i a unor substane hidrofile; transportul pasiv este mediat de molecule proteice transmembranare, numite porine care formeaz adevrate canale moleculare prin membrana extern; membrana extrn reine n spaiul periplasmic enzimele degradative sintetizate n celul, dup ce au traversat membrana plasmatic, precum i o varietate de molecule nutritive; prin aceast funcie activitile enzimatice eseniale pentru celul, dar potenial duntoare pentru constituenii citoplasmatici, au loc n afara membranei plasmatice, iar degradarea moleculelor nutritive mari la monomeri simpli este efectuat n apropierea proteinelor de legare i a permeazelor specifice care permit transportul selectiv n celul a unor molecule mai mari de 700 daltoni; este sediul unor sisteme de transport specifice: pentru vitamina B12, maltoz, maltodextrine, ioni ferici i nucleozide); este implicat n adsorbia unor fagi.

3.2. Protoplatii i sferoplatii

Protoplastul reprezint ansamblul structurilor celulare rmase dintr-o bacterie Grampozitiv dup ndeprtarea integral a peretelui celular sub aciunea lizozimului. mbrcat n membrana citoplasmatic, protoplastul se menine n medii izotonice sau hipertonice ca formaiune aproximativ sferic, pstrnd, n general, proprietile i activitile vitale ale celulei din care provine (capacitatea respiratorie normal, sinteza de proteine i de acizi nucleici, viabilitatea n culturi i, n anumite condiii, chiar capacitatea de diviziune i aptitudinea de a asigura multiplicarea fagului al crui acid nucleic se gsea deja n celul n momentul pierderii peretelui celular). Protoplastul nu este capabil s refac prin sintez peretele celular dac acesta a fost complet ndeprtat. Funcia de barier osmotic asigutat de membrana citplasmatic, este mult mai labil n lipsa proteciei conferite de peretele celular rigid i, ca urmare, n medii hipotonice protoplastul lizeaz. La bacteriile Gram-negative, peretele celular nu poate fi degradat complet, astfel c tratarea cu lizozim i slbete doar structura prin degradarea selectiv a mucocomplexului. n medii hipotonice celula astfel tratat se lizeaz, iar n mediile hipertonice se transform n sferoplast, corp sferic echivalent unui protoplast, nconjurat de constituenii peretelui celular care au rezistat la aciunea lizozimului. Protoplatii aparinnd unor specii diferite de bacterii (B. megaterium i B. subtilis) fuzioneaz n prezena unor substane ce acioneaz ca ageni de fuzionare , producnd formarea de bacterii bi- sau multinucleate care n cursul reversiei la forma bacilar (prin refacerea peretelui celular) sau unterior, ntr-o perioad scurt de timp, duc la apariia unor bacterii cu genotip haploid, modificat prin recombinare genetic cu caractere provenind de la cele dou celule originare (Schaeffer, 1976, Fodor i Alfldi, 1976).

14

3.3. Spaiul periplasmic

Spaiul periplasmic sau zona periplasmic este un compartiment ntlnit numai la bacteriile gram-negative, delimitat spre interior de membrana citoplasmatic, iar spre exterior de un strat care acioneaz ca o sit molecular, corespunznd membranei externe a peretelui celular (Mitchell, 1961). Spaiul periplasmic i complexul peptidoglican-lipoprotein ocup aceeai zon a peretelui celular, n care primul adpostete constituenii periplasmici, iar cellalt susine i ntrete nveliurile celulei. Spaiul periplasmic conine numeroase enzime implicate n nutriie, proteine specifice, neenzimatice proteine de legare, care leag specific anumite substane (zaharuri, aminoacizi, ioni anorganici) transportndu-le pn la nivelul proteinelor de transport legate de membran.

Semnificaia biologic
Membrana extern a peretelui celular las s treac n regiunea periplasmatic numeroase substraturi hidrofile (echivalente cu tetra- i pentamere de aminoacizi, dimeri i trimeri de carbohidrai). Funcia principal a enzimelor periplasmice (fosfataze, sulfataze, amidaze etc.) este de a pregti chimic substanele care difuzeaz prin membrana extern pentru trecerea lor prin membrana plasmatic n citoplasm. Prin acest mecanism, bacteriile Gram-negative prin intermediul enzimelor degradative acioneaz asupra unei largi varieti de substraturi ntlnite n natur, convertind substanele care difuzeaz n spaiul periplasmic n molecule transportabile n celul, unde sunt accesibile imediat proteinelor de legare i permeazelor. Acest aspect confer bacteriilor Gram-negative un deosebit avantaj biologic. De aceea bacteriile adaptate la viaa n mri, ruri, lacuri etc. sunt n majoritatea lor Gramnegative. Spre deosebire de bacteriile Gram-negative, cele Gram-pozitive elibereaz cea mai mare parte a enzimelor lor extracelular, n mediu. Acest mecanism este avantajos pentru bacteriile care triesc n condiii de mare concentraie de substrat i de mare densitate populaional, deoarece produii de digestie ai enzimelor extracelulare, neasociate cu peretele celular, sunt accesibili tuturor celulelor aflate n vecintatea locului lor de producere.

3.4. Membrana plasmatic

Membrana plasmatic (membran citoplasmatic, membran celular) este formaiunea structural care acoper de jur mprejur citoplasma bacterian, separnd-o de suprafaa intern a peretelui celular, de care este de obicei strns lipit, datorit diferenei de presiune osmotic ntre coninutul celular i mediul extern. Membrana plasmatic poate fi pus n eviden la microscopul fotonic, fie dup o colorare selectiv cu albastru Victoria, fie prin examinarea bacteriilor vii la microscop, n cmp ntunecat, n care caz apare ca o linie net, luminoas, strlucitoare. Membrana plasmatic examinat la microscopul electronic pe seciuni ultrafine n condiii tehnice standard - apare ca o formaiune triplu stratificat, cu o grosime de 7,5-10 nm, alctuit din dou straturi ntunecate care separ un strat mai clar. Robertson a denumit aceast structur unitate de membran (unit-membrane), pornind de la ideea c ea reprezint unitatea structural din care sunt alctuite structurile membranare complexe. Aspectul de triplu strat a dus la elaborarea modelului de structur greit, n acord cu care stratul bimolecular de fosfolipide ar fi mrginit de fiecare parte de un strat proteic (Robertson, 1969), variant a modelului propus iniial de Danielli-Dawson (1935).

15

 Modelul de structur acceptat n unanimitate modelul mozaicului fluid (SingerNicolson, 1972) propune o aezare caracteristic a componentelor specifice ale membranei reprezentate de lipide, proteine i glucide n acord cu proprietile lor, satisfcnd exigenele termodinamice i furniznd o explicaie satisfctoare a proprietilor generale ale biomembranelor. Dup acest model fosfolipidele formeaz un film fluid, discontinuu, n care plutesc proteinele globulare, n timp ce glucidele interacioneaz fie cu unele fie cu altele.

Fig.2. Evidenierea structurii internea membranei plasmatice, prin tehnica de nghearefracturare de-a lungul planului central al stratului dublu lipidic (G. Zarnea, 1983, dup Staehlin i Hull, 1979) Lipidele sunt reprezentate de fosfolipide molecule amfipatice cu structur complex, avnd o extremitate polar, hidrofil (hidrosolubil n stare izolat), alctuit dintr-o grupare fosfat (PO-4) i ali constitueni, legai printr-o molecul de glicerol care formeaz un fel de punte de cozile moleculei, reprezentate de doi acizi grai, ce constitue regiunea nepolar, hidrofob (insolubil n ap) a moleculei. n contact cu apa gruprile polare poart de regul sarcini electrice. Deoarece cele dou extremiti ale moleculelor lipidice au solubiliti incompatibile, n suspensie apoas ele se organizeaz spontan pentru a forma un dublu strat de molecule, discontinuu i fluid-vscos, n care moleculele sunt aranjate coal-la-coad n aa fel nct capetele ionice polare (hidrofile) sunt expuse spere soluia apoas de ambele pti ale membranei, iar lanurile nepolare (hidrofobe) ale acizilor grai sunt orientate n direcia opus contactului cu apa. n felul acesta, cele dou monostraturi de molecule formeaz mpreun dou straturi hidrofile periferice separate de poriunea central hidrofob. Aceast modalitate de aranjare reprezint configuraia de minim energie posibil pentru o suspensie de lipide n ap i este, n acelai timp, foarte adecvat pentru funcia de barier ntre dou soluii apoase (cun sunt interiorul celulei i mediul extern). Structura de dublu strat fosfolipidic explic proprietile de permeabilitate ale membranei, deoarece acest strat este impermeabil fa de particulele ncrcate i fa de ioni i uor penetrabil de moleculele liposolubile. Fiecare dublu strat este un lichid bidimensional n care moleculele lipidice difuzeaz lateral, schimbndu-i poziia pn la un milion de ori pe secund. n schimb deplasarea unei molecule de pe un monostrat pe altul (trenziia flip-flop) se face foarte rar (cel mai des o dat pe lun pentru o molecul dat). Raritatea deplasrilor flip-flop ale lipidelor i proteinelor permite meninerea compoziiei membranei i a structurii ei caracteriestice. Dublul strat fosfolipidic trebuie s fie suficient de fluid pentru a permite micarea liber a proteinelor membranare implicate n procesele de transport activ. 16

Fosfolipidele formeaz matricea structural a membranei i sunt rspunztoare de integritatea structural a acesteia. Prin structura caracteristic a dublului strat, ele confer membranei impermeabilitatea la cele mai multe molecule hidrosolubile, care sunt insolubile n regiunea uleioas a prii de mijloc a membranei. Proteinele, n raport cu poziia lor n structura membranei, sunt de dou tipuri: proteinele integrate (intrinsece); proteinele de suprafa (periferice sau extrinsece). Proteinele integrate, n general insolubile n ap, nu pot fi ndeprtate fr ruperea dublului strat lipidic. Au o orientare fix: fiecare protein de acelai tip este ndreptat n aceeai direcie. Cele mai multe strbat toat grosimea membranei celulare (proteinele transmembranare) dar unele pot fi expuse fie numai pe suprafaa intern (citoplasmatic), fie spre suprafaa extern. Regiunile lor dirijate spre interior i/sau spre exterior au caracter hidrofil, ceea ce mpiedic tranziia lor tip flip-flop. Proteinele de suprafa, neinserate n dublul strat lipidic, sunt n general hidrosolubile i situate fie pe suprafaa intern, fie pe cea extern, de regul legate de proteinele integrate. Din punct de vedere funcional, proteinele de membran pot fi: enzime care fac biosinteza nveliurilor celulare (membrana plasmatic, polimeri parietali, extraparietali), proteine de transport care asigur transportul moleculelor solubile din mediu n celul i invers; citocromi i alte proteine aparinnd sistemului transportor de electroni; proteine cu activitate adenozinfosfatazic (ATP-aza); proteine implicate n turnover-ul lipidelor i al proteinelor membranare (fosfolipaze, proteaze, peptidaze).

Fig. 3. Membrana plasmatic reprezentarea schematic a unui model tridimensional (G. Zarnea, 1983, dup Lodish i Rothman, 1979) Glucidele reprezint componentul cel mai slab reprezentat n structura membranei i se regsesc sub forma unor polizaharide legate de proteine (glicoproteine) sau interacionnd cu anumite lipide (glicolipide).

17

Semnificaia biologic
Membrana plasmatic reprezint singura suprastructur citoplasmatic permanent a celulei bacteriene, avnd rolul de a delimita spaiul intracelular. Ea formeaz un compartiment nchis, dar nu reprezint o grani fizic inert a celulei, ci o structur funcional capabil s asigure o deosebire net ntre interiorul i exteriorul acesteia. Aceast proprietate este consecina faptului c membrana plasmatic prezint o asimetrie funcional, cu importan esenial pentru viaa celulei, n sensul c suprafaa intern funcioneaz diferit de cea extern. Astfel un ion sau o molecul pompat la interior printr-un punct al membranei ar putea fi eliminat n altul cu o cheltuial inutil de energie. Aceast asimetrie funcional are la baz o asimetrie de structur molecular, manifestat pe mai multe ci: cele dou monostraturi lipidice includ proporii variate ale diferitelor tipuri de molecule lipidice; carbohidraii sunt prezeni numai pe suprafaa extern a membranei, n timp ce proteinele periferice sunt situate aproape ntotdeauna pe faa intern; fiecare tip de protein integrat are o orientare definit, care este aceeai pentru fiecare molecul de acelai tip. Membrana plasmatic este asociat cu toate funciile (transport, fosforilare), care la organismele superioare sunt legate de structuri difereniate. Membrana plasmatic poate s-i mreasc suprafaa, furniznd mai mult spaiu pentru diferite activiti celulare (respiraie, fotosintez) prin invaginare, formnd sisteme de membrane, care uneori se ramific n citolpasm, sau se pot detaa, formnd entiti virtual independente. Funcioneaz ca o barier osmotic, dotat cu impermeabilitate cvasitotal fa de multe tipuri de mlecule, permind trecerea nestnjenit a altora. Ea asigur n acest fel schimburile necesare i selective ntre mediul extern i cel intracelular, meninnd constant compoziia chimic i ionic a celulelor, care, la rndul lor, influeneaz critic numrul enorm de reacii interdependente ce au loc n citoplasm. Proprietile de permeabilitate ale membranei plasmatice pot fi sintetizate astfel: substanele uor solubile n solvenii lipidelor, ca i unii anioni (ex. Cl-) traverseaz uor biomembranele; unii ioni ca Na+, K+, glucidele i proteinele, nu o pot traversa uor, celula recurgnd la mecanisme speciale de transport. Membrana plasmatic bacterian i structurile derivate din ea formeaz baza structural a sinergonului fotosintezei i a celui respirator, reprezentnd prin aceasta un echivalent funcional al cloroplastelor, respectiv al mitocondriilor din celulele eucariote. Este implicat n mobilitatea bacterian, datorit faptului c una din structurile corpului bazal al flagelului este strns legat de structura sa. Unele proteine legate de membran sau aflate n contact lax cu ea (fiind localizate n spaiul periplasmic) joac rolul de chemoreceptori. Particip la formarea i eliminarea unor proteine, ca enzimele i exotoxinele, care pot fi sintetizate n membrana plasmatic, sau pe suprafae ei extern. n primul caz, trecerea lor extracelular s-ar realiza fie printr-un mecanism de tipul pinocitozei inverse, fie datorit unei poriuni glucidice legate, care ar facilita eliberarea. n al doilea caz, moleculele sintetizate ar difuza liber n mediu.

3.5. Mezosomii
Mezosomii (Fitz James, 1967) au fost descrii iniial sub denumiri diferite: membrane intracitoplasmatice (Hopwoord, 1960), corpi periferici (Chapman, 1953), condrioizi (Van Iterson, 1961) sau plasmalemasomi (Edwards, 1963).

18

 Greenawalt (1975) consider mesozomii structuri membranoase intracitoplasmatice, caracterizate prin trei particulariti definitorii: deriv ultrastructural din membrana celular ca o invaginare n form de sac sau pung, care conine corpi membranoi; pot fi extrudai din sacul mezosomal n spaiul dintre membrana plasmatic i peretele celular prin agitare, ndeprtarea peretelui celular sau dup plasmoliz; sunt asociai fizic i/sau topografic cu replicarea i segregarea cromosomului, cu formarea septului de diviziune i cu sporularea. Structurile membranare care nu ntrunesc aceste condiii trebuie numite membrane intracelulare (intracitoplasmatice) sau structuri similare mezosomilor (mezosome-like). La microscopul electronic apar sub forma unor structuri cu form, mrime, localizare i complexitate foarte diferite, n general putnd varia nu numai n funcie de starea fiziologic a celulei, ci i de calitatea i natura tehnicilor de prfixare i fixare, precum i de unghiul de secionare.

Fig. 4. Structura schematic a mezosomului bacterian, evideniind modul de ptrundere a citoplasmei n structura acestuia, ntr-un spaiu care nu este conectat nici cu cisternele tubululor, nici cu mediul extern. Tubulii din sacul mezosomal apar pe seciunea transversal circulari. Situsul de legare al genomului este localizat pe faa citoplasmatic a sacului mezosomal (G. Zarnea, 1983, dup Reusch i Burger, 1973).
Au fost descrise trei tipuri morfologice de mezosomi, dup unii autori interconvertibile: lamelari (formai prin plierea membranei invaginate ntr-un aranjament n spiral ncolcit ca un ghem); veziculari sau saciformi (vezicule aproape sferice); tubulari (de forma unor tubuoare lungi). Dup localizare mezosomii pot fi: septali; periferici; nucleari.

19

 Mezosomii au caracteristicile structurale ale membranei plasmatice din care deriv (structura triplustratificat i grosimea de 7,5 8,0 nm). Sunt mai numeroi i mai bine dezvoltai la bacteriile Gram-pozitive, n timp ce la bacteriile Gram-negative sunt relativ mai greu de observat, fiind n general rudimentari, slab dezvoltai ca mrime i mai puini ca numr. Prin expunere n medii hipertonice, mezosomii sunt extrudai n spaiul dintre membran i peretele celular sub forma unor filamente, ca un irag de mrgele, care poate ajunge la dimensiunea de 20 nm.

Fig. 5. Reprezentarea schematic a stadiilor de formare a mezosomilor. A, B. Dezvoltarea unui mezosom sacular turtit, dintr-un mezosom sferic (vezicular). x i y reprezint punctele terminale ale sacului i situsurile poteniale de cretere ale membranelor intracelulare. C. Pentru simplificare diagrama ilustreaz numai dezvoltarea n punctul x printr-o secven de sgei i vezicule, dei procesul are loc i n punctul y. D. Mezosom cu structur complex multilamelar, format prin creterea i plierea sacului turtit prin extinderea lui x la x` i a lui y la y`. (G. Zarnea, 1983).

Originea, creterea i diferenierea mezosomilor

Formarea mezosomilor este un proces complex, care ncepe cu invaginarea membranei plasmatice i sfrete cu legarea de genomul bacterian; are loc n special n zona n care creterea membranei se face mai repede dect a peretelui celular, ceea ce are drepr consecin invaginarea acestuia sub forma unor pungi pline cu membrane (Rogers, 1970). Invaginarea iniial duce la formarea unui sac sferic, conectat cu membrana printr-un peduncul de lungime variabil, deschis spere mediul extern i/sau spaiul periplasmic. Mezosomul simplu, sferic, sufer n continuare modificri rezultate din diferite grade de turtire nsoite de invaginri secundare, care duc la formarea de lamele, vezicule i tubuli. n cazul n care complexitatea mezosomului crete, dezvoltarea se face pe seama membranei nou

20

sintetizate care se adaug membranei invaginate. Concomitent cu creterea n complexitate apare posibilitatea unui grad mai mare de compartimentare a constituenilor citoplasmatici, chiar n mezosomi, care apar la microscopul electronic sub forma unor canale rezultate din invaginrile secundare. Nu se cunoate natura stimulilor implicai n invaginare i nici a celor care determin modificri de form, localizare i complexitate.

Semnificaia biologic
Mezosomul nu este o structur static ci este un organit influenat permanent de dinamica proceselor celulare. Morfologia mezosomului este influenat de condiiile de prelucrare premergtoare examinrii la microscopul electronic (prefixare, calitatea i natura fixrii chimice etc.), care afecteaz tipul, forma i poate chiar localizarea n celul. Unii autori consider mezosomii ca fiind structuri vestigiale sau redundante, versatile (instabile) i multifuncionale, neeseniale pentru viabilitatea bacteriilor, avnd o deosebit plasticitate structural, ca un rspuns la nevoi specifice, variate. Formarea mezosomilor este modalitatea prin care celula bacterian are posibilitatea de a-i mri, prin invaginare i pliere, suprafaa membranei plasmatice, ca rspuns la condiiile de mediu, de aceea, se consider c nu ar avea funcii diferite sau suplimentare fa de cele ale membranei plasmatice. Rolul mezosomilor n replicarea genomului bacterian a fost demonstrat pe baze morfologice, genetice i biochimice. Fiind legat de membrana plasmatic, ct i de materialul nuclear are un rol important n controlul replicrii cromosomului i al plastidelor bacteriene, prin transmiterea semnalului biochimic care ia natere la suprafaa celulei. La B. subtilis, n faza iniial, fiecare nucleosom este legat de un mezosom, pentru ca pe msur ce celula crete i se apropie de diviziune mezosomul s se divid, iar formaiunile rezultate s migreze spre extremitile celulei, antrennd cromosomii bacterieni progeni. Fora care realizeaz aceast deplasare este reprezentat de sinteza i ncorporarea de constitueni noi de membran celular. Mezosomii particip la reacii de fosforilare, oxidoreducere i transport de electroni, care au loc ns cu o pndere mai mic dect n membrana plasmatic. Conin fosfataze acide, esteraze etc. i ar putea funciona ca organite subcelulare degradative, asimilabile funcional cu lizosomii din celulele eucariote (Revsch, 1972). Au rol n unele procese secretorii ca, de exemplu, n producerea i eliberarea unor exoenzime ca penicilinaza. Mezosomii ar fi implicai n sinteza nveliurilor celulare, n mod particular a membranei plasmatice, a peretelui celular i a septului transversal care separ celulele dup diviziune. Tichy i Landman (1969) consider c ar reprezenta o regiune specializat prin care, n cursul transformrii genetice, ADN transformat ar ptrunde n celul.

3.6. Citoplasma
Citoplasma bacterian este, n general, considerat ca un sistem coloidal complex format din proteine, glucide, lipide, ap i substane minerale, sistem n care apa i compuii dizolvai n ea acioneaz ca faza extern a unui sol (Lamanna, 1949). Deoarece n citoplasm coexist strile de emulsie i de soluie, aceasta poate fi considerat ca un complex de stri fizice ntr-o continu transformare. Se caracterizeaz prin meninerea permanent a strii de gel ceea ce are ca rezultat o imobilitate a coninutului (lipsa curenilor citoplasmatici) i reprezint o condiie indispensabil a meninerii nemicibilitii nucleului cu citoplasma, avnd n vedere absema unor membrane intracelulare.

21

 Citoplasma bacterian nu are o organizare definit, similar celulei eucariote, care conine organite difereniate i delimitate de membrane. La celulele tinere i n condiii normale de dezvoltare, citoplasma ader la peretele celular i se prezint ca o mas dens, omogen i intens colorabil. La celulele btrne citoplasma i pierde treptat afinitatea tinctorial, se retract centripet ndeprtndu-se de perete i capt o structur granular cu vacuole din ce n ce mai evidente la microscopul electronic. La bacteriile examinate pe seciuni mai puin fine (~ 50 nm), zona citoplasmatic apare ca fiind plin de agregate de ribosomi, aspect rezultat din suprapunerea acestor structuri cu de 10 nm. Pe seciuni extrem de subiri citoplasma apare ca mas amorf i lipsit de particule structurale, cu ribozomi rari. n interiorul citoplasmei se gsesc materialul nuclear, incluziunile, vacuolele i ceilali constitueni ai protoplastului. O caracteristic a citoplasmei bacteriene este prezena unei mari cantitpi de ARN, ceea ce explic bazofilia ei intens, mai evident la celulele tinere. Celulele moarte se coloreaz mai puin intens, ca i celulele btrne, la care sinteza ARN a ncetat, iar cel existent a fost folosit ca surs de N i P.

3.7. Nucleul
Spre deosebire de celulele eucariote care au un nucleu cu structur bine definit, mrginit de o membran i coninnd un numr definit de cromozomi capabili de diviziune mitotic, nucleul bacterian reprezint o form primitiv de organizare, lipsit de membran (de tip procariot), inclavat direct n citoplasm, n mod obinuit n partea central a celulei i care nu sufer modificri de tip mitotic n cursul ciclului de diviziune. Datorit caracterelor sale particulare, aceast structur a fost desemnat cu numeroi termeni ca: nucleoid, nucleosom, material nuclear, nucleoplasm, echivalent nuclear sau "nucleu" prin analogie funcional cu structura echivalent a celulelor eucariote. Deoarece citoplasma bacterien este puternic bazofil ca urmare a prezenei ARNului, nu este posibil diferenierea la microscopul fotonic cu colorani bazici a materialului nuclear constituit din ADN, la fel de bazofil. Evidenierea corpului cromatic bacterian la microscopul fotonic nu se poate face prin colorare selectiv dect dup ndeprtarea ARN-ului citoplasmatic prin hidroliz acid (tehnica Robino i Feulgenw) sau enzimatic (tehnica Boivin, cu ribonucleaz). Cu aceste tehnici materialul nuclear apare sub diferite forme (granule sferice sau ovalare, halter, bastonae izolate sau dispuse n V, filament axial etc.), reprezentnd 5-16% din volumul celulei. Materialul nuclear este localizat n mod obinuit n partea central a celulei. El se prezint ca o zon mai clar, cu o densitate medie mai mic dect aceea a citoplasmei nconjurtoare, astfel c la bacterii contrastul dintre structurile intracelulare este inversat n raport cu acela caracteristic celorlalte celule, la cere nucleul este mai dens dect citoplasma. Acest aspect este determinat de densitatea neobinuit de mare a citoplasmei bacteriene. Pe seciuni ultrafine se observ c regiunea nuclear este plin cu fibrile fine cu ntre 2,0 i 5,0 nm, uneori aranjate n iruri ondulate, paralele, care dispar dup digestia cu dezoxiribonucleaz, ceea ce arat c sunt formate din ADN i corespund cromosomului bacterian. Cromosomul bacterian denumit i lineom, nucleosom sau genofor, s-a dovedit a fi alctuit dintr-o singur molecul de ADN, de form circular (extremitile sunt reunite), cu o lungime de 1 400 m i un de 2,5 nm, corespunznd diametrului moleculei de ADN dublu catenar.

22

Organizarea fizic a nucleului

Molecula de ADN depete de aproximativ 1 000 de ori lungimea linear a celulei. Ea este mpachetat pentru a forma un corp cromatic de 1 500 de ori mai mic dect propria sa dimensiune n stare desfurat. Teoretic mpachetarea unei molecule att de lungi ntr-un volum mic implic plierea moleculei de cel puin 1000 de ori i meninerea ei n stare compact. Au fost propuse mai multe modele pentru a explica mecanismul acestui proces care dac s-ar face la ntmplare ar duce la ncuracrea moleculei de ADN astfel nct o parte din infermaia genetic ar deveni inaccesibil pentru transcriere. Stonington i Pettijohn (1971) au izolat nucleul din E. coli sub forma unei structuri compacte cu g.m. 2,5 x 1090,5 x 109 dal (1 600 1 700 S). Aceast structur este alctuit din ADN corespunznd genomului pliat, complexat cu ARN i proteine i este foarte sensibil la Rnaz. Complexul ADN-ARN-protein conine 80% ADN; ARN-ul reprezint 10% din greutate i este format din ARNr i ARNm, n stare nscnd, iar proteina care formeaz tot 10% (mai puin de 1% din proteina celular total), este ARN-polimeraz (subunitile , i ). Dup tratare cu ribonucleaz, din acest complex se elibereaz o molecul de ADN dublu helicat depliat, ceea ce demonstreaz c ARN are rolul de a stabiliza i menine forma condensat (compact) a nucleului.

Fig. 6. Modelul lui Worcel i Burgi (1072) pentru plierea cromosomului la E. coli. Cromosomul formeaz ~ 50 bucle superhelicale n jurul unei structuri celulare format din ARN. Trastarea cu DN-az, care produce incizii monocatenare, elibereaz bucle individuale i reduce progresiv valoarea constantei de sedimentare (S) del la 1500 S laa 155 S. Tratarea cu ribonucleaz depliaz complet cromosomul, dndu-i form care sedimenteaz mai lent (G. Zarnea, 1983).

Fig. 7. Modelul lui Pettijohn (1974) de mpachetare a cromosomului bacterian. A. Cromosom circular nepliat cu 350 m. B. Cromosom pliat cu 7 bucle. n realitate, ar exista 40-80 domenii de pliere, corespunznd unui de 30 m. C. Cromosom pliat n care buclele au suferit transformare superhelicat. Dac pasul suprahelici este de 11 nm, nucleului este de 2 m. Modelul bidimensional devine tridimensional prin plierea zonelor superhelicale deasupra i dedesubtul planului hrtii. DNaza produce incizii monocatenare i desface superhelicea n bucla respectiv, fr a afecta structura superhelical a altor domenii (D). E. Secionarea a dou molecule de ARN ale unor domenii adiacente unete cele dou domenii fr pierderea structurii lor superhelicale (G. Zarnea, 1983). 23

 Pettijohn i Hecht (1974) au elaborat un model n acord cu care ADN din cromosomul de E. coli ar fi condensat ntr-o structur compact printr-un proces de pliere i formare de superhelice, n care structura condensat a ADN este meninut de molecule de ARN, ce leag i stabilizeaz buclele de pliere. Pentru a menine starea condensat a ADN este necesar o sintez continu de ARN, fapt care explic asocierea ARN-polimerazei. Rouviere-Yaniv (1975) a izolat de la E. coli o protein specific, proteina HU, asociat cu ADN i implicat n plierea lui n celul. n mod nomal, bacteriile aflate n faza de repaus n culturi staionare i vechi au un singur cromosom, astfel c sunt unicelulare. n faza de cretere activ, n culturi tinere pe medii optime, ele apar ca multinucleate, avnd 2-4 cromosomi, care sunt genetic identici, deoarece provin din replicarea dintr-un singur cromosom parental. De aceea, indiferent de aspectul morfologic al materialului nuclear, din punct de vedere genetic, bacteriile sunt organisme haploide, astfel nct chiar atunci cnd celula primete un aport de material nuclear exogen prin procese de transfer genetic diploidia nu este dect parial i tranzitorie. Apariia bacteriilor multinucleate este n mod obinuit rezulatul unei lipse de sincronizare ntre ritmul de cretere i ritmul de diviziune celular.

Semnificaia biologic
Cromosomul bacterian poart n structura sa toat informaia genetic esenial, necesar pentru existena unei celule, respectiv setul de determinani genetici reprezentnd acel minimum necesar pentru ca o bacterie s poat ocupa poziia s-a ecologic normal: gene necesare pentru metabolismul energetic, pentru biosintez, cretere i diviziune i, n acelai timp, pentru reglarea activitilor celulare. El determin i arhitectura celulei bacteriene, ereditatea i capacitatea de evoluie a acesteia.

3.6. Ribosomii
Sunt particule nucleoproteice intracitoplasmatice de form aproximativ sferic. Au diametrul de aproximativ 20 nm. Pot fi caracterizai dup constanta de sedimentare la ultracentrifug (uniti Svedberg S) i prin apacitatea d a participa la sinteza proteinelor in vitro. La procariote se gsesc n citoplasm 15 000-10 000 particule ribozomale, cu constanta de sedimentare 70 S cu tendina de a se disocia rapid n dou subuniti inegale cu constantele de sedimentare de 30 S i 50 S. 2+ + Mrimea i stabilitatea lor este n funcie de concentraia ionilor Mg i K . Subunitatea mic 30 S (g.m. 900 000 dal) este alctuit din 21 molecule de proteine diferite, notate de la S1 la S21 i o molecul de ARNr, notat 16 S. Subunitatea ribosomal mic are trei regiuni: capul (1/3 din subunitatea mic), baza (formeaz restul de 2/3) i platforma, care este separat de cap printr-o scobitur numit fisur sau despictur. Subunitatea mare 50 S (g.m. 1 000 000 dal) este alctuit din 34 de proteine diferite, notate de la L1 la L34 i ou molecule de ARNr, una de 23 S i cealalt de 5 S. Moleculele 16 S i 23 S aleARNr nu sunt transcrise separat, ci deriv din degradarea catabolizat de o nucleaz a unui precursor mare de 30 S (pre-ARNr). Modelul de structur al subunitii mari include o protuberan central, flancat de cte o prelungire de fiecare parte, cea mai extins fiind denumit peduncul,iar cealalt creast, ntre ele avnd o vale.

24

 Cnd cele dou subuniti sunt asociate, pedunculul subunitii mari are baza aproape de constricia de pe o subunitate mic, iar capul nei subuniti mici i protubrana subunitii mari sunt aproximativ aliniate.

Fig. 8. Reprezentarea schematic a subunitilor ribosomale30 S i 70 S (G. Zarnea, 1983).

Proteinele i moleculele de ARN ocup poziii bine definite la suprafaa ribosomilor, conferind subunitii 50 S o form asemntoare unui fotoliu i subunitii 30 S forma unei haltere asimetrice rezemat orizontal pe braele i sptarul fotoliului. ntre cele dou subuniti rmne un canal lung i ngust, prin care trece ARNm, purttor al informaiei genetice necesare pentru sinteza proteinelor.

Semnificaia biologic
Ribosomii sunt componeni eseniali ai sistemului de traducere a informaiei genetice, reprezentnd adevrate fabrici de proteine.

Fig. 9. Rolul poliribosomilor n biosinteza proteinelor (G. Zarnea, 1983). La nivelul lor se desfoar ciclul ribosomal care determin iniierea, creterea i terminarea lanului polipeptidic, n care interacioneaz cu ARNm, pentru a lega specific moleculele de aminacizi, asigurnd formarea moleculei de protein. Aceast activitate are loc

25

numai cnd cele dou subuniti sunt asociate i combinate cu ARNm, ca i cu ali componeni neribosomali ca ARNt i unele proteine. n cursul procesului de biosintez a proteinelor ribosomii individuali au tendina de a se grupa n iruri lineare de 4-50 de elemente formnd polisomi (poliribosomi sau ergosomi). Mrimea acestora este determinat de lungimea moleculelor de ARNm. Poliribosomii se deplaseaz de-a lungul moleculei de ARNm, permimd ca lanil polipeptidic s creasc progresiv n lungime, pe msur ce ribosomii se deplaseaz spre extremitatea terminal a secvenei de baze traduse, fapt care confer o eficien mult mai mare procesului de biosintez a proteinelor.

26

4. METABOLISMUL MICROORGANISMELOR
Metabolismul microorganismelor reprezint totalitatea reaciilor biochimice implicate n activitatea lor biologic, prin intermediul crora energia i elementele biogene sunt preluate din mediu i utilizate pentru biosintez, degradare i cretere, ca i pentru activiti fiziologice secundare (mobilitate, luminescen etc.). Ca urmare a acestor reacii substanele din mediu sunt transformate n constitueni celulari, energie i produi de metabolism. Diferitele reacii ale metabolismului ndeplinesc patru funcii eseniale pentru viaa celulei: eliberarea de energie i stocarea ei sub form de ATP i ali compui macroergici. producerea subunitilor folosite pentru construcia constituenilor celulari, pornind de la substanele nutritive. activarea subunitilor de construcie monomere, pe seama energiei de legtur din compuii macroergici i formarea constituenilor celulari macromoleculari, prin asamblarea monomerilor. formarea i degradarea biomoleculelor necesare anumitor funcii specializate ale celulei. Aceste funcii sunt realizate printr-o reea complex i variat de ci metabolice, care funcioneaz perfect coordonat datorit interveniei unor reacii speciale (pace marker reactions, Krebs i Kornberg, 1957). Cile metabolice sunt secvene de reacii chimice, catalizate enzimatic, care permit organismelor vii s obin din nutrieni, att compuii necesari pentru sinteza constituenilor celulari, ct i energia necesar pentru aceste sinteze, ca i pentru alte procese care necesit consum de energie. Au fost descrise patru tipuri de ci metabolice: cile catabolice; cile anabolice; cile amfibolice; cile anaplerotice.

4.1. Cile catabolice

Procesele biochimice implicate n degradarea diferiilor compui nutritivi din mediu i eliberarea de energie n celul sunt reunite sub denumirea de catabolism, iar reaciile enzimatice implicate n degradare sunt numite reacii catabolice. Ca regul general procesele de catabolism evolueaz n trei faze succesive (Kornberg, 1965): Faza I corespunde degradrii macromoleculelor la unitile mici constitutive. Ex.: proteinele sunt degradate la aminoacizi, glucidele la hexoze, lipidele la glicerol i acizi grai. Se elibereaz ~1% din energia total a macromoleculelor, care se pierde sub form de cldur. Faza II corespunde etapei n care diferitele micromolecule rezultate n faza precedent sunt degradate incomplet, elibernd ~1/3 din energia total cu producerea n afar de CO2 i H2O a unui numr relativ mic de produi diferii, numii intermediari metabolici ai cilor metabolice centrale.

27

Ex.: hexozele pot fi metabolizate pe ci diferite (calea glicolizei, calea Entner-Doudoroff sau cale hexozomonofosfatului), dar produii obinui final nu sunt foarte diferii, reprezentnd, cu excepia CO2, intermediari ai cilor metabolice centrale sau precursori ai lor. Aminoacizii pot fi utilizai pe ci diferite, dar catabolismul lor duce la formarea de acetil-CoA sau intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici (ciclul Krebs). Caracteristica esenial a acestei faze decurge din faptul c dei exist o mare varietate de ci catabolice, acestea conduc transformarea surselor primare de carbon la un numr redus (~12) de intermediari ai cilor metabolice centrale. Faza a III-a are o evoluie diferit n funcie de natura microorganismului studiat. n cazul microorganismelor aerobe, care pot metaboliza substraturile nutritive integral (pn la CO2 i H2O), calea major de desfurare a acestei faze i eliberare de energie este cea a ciclului acizilor tricarboxilici (ciclul Krebs), cuplat cu fosforilarea oxidativ. Microorganismele care nu pot efectua conversia complet a surselor de C la CO2 i H2O realizeaz aceast faz prin reacii de fermentaie (alcoolic, lactic, butiric, propionic, acetonobutilic etc.), n care produii cilor catabolice servesc direct sau indirect - ca donori, respectiv acceptori de H, n secvene de reacii de oxidoreducere cuplate. n aceste cazuri, cantitatea de energie util pentru celul este mult mai sczut, n raport cu cea eliberat n cursul respiraiei aerobe, prin mecanismul fosforilrii oxidative (Kornberg, 1965).

4.2. Cile anabolice

Procesele de asimilare, corespunznd anabolismului, se realizeaz prin secvene de reacii enzimatice, care asigur folosirea intermediarilor cilor centrale ale metabolismului pentru sinteza blocurilor de construcie, componente ale macromoleculelor. Cile anabolice au ca punct de plecare, de multe ori, intermediari ai cilor centrale, foarte diferii de cei care rezult din catabolismul compusului respectiv. Cile catabolice i anabolice pentru dou substraturi chimice date nu sunt complet reversibile i sunt numai parial comune. Spre exemplu, degradarea glicogenului la acid lactic este catalizat de 12 enzime, dintre care numai 9 catalizeaz reacii reversibile; pentru celelalte trei ci, din considerente energetice, se folosesc ci ocolite, care implic enzime diferite i intermediari diferii. Ca i procesele de catabolism, reaciile de biosintez, corespunznd reaciilor anabolice, se realizeaz tot n trei faze succesive, prin utilizarea micromoleculelor precursoare produse n faza a III-a a catabolismului i conversia lor la molecule mai mari blocuri de construcie (faza a II-a), care n final sunt asamblate n macromolecule de proteine, glucide i lipide. Spre deosebire de cile catabolice, ale cror nceputuri sunt multiple, dar definite ca punct de plecare (pornind de la mai multe proteine, glucide i lipide diferite), pentru ca s evolueze convergent spre anumite ci finale comune, cile anabolismului au ca punct de plecare un numr foarte limitat de molecule precursoare simple, de la care evolueaz divergent i ramificat pentru a realiza gama larg de molecule ce caracterizeaz celulele vii.

4.3. Cile amfibolice

Denumirea generic de ci amfibolice (gr. amfi = dou) pentru a desemna cile metabolice centrale, care ndeplinesc, n acelai timp, funcia de eliberare de energie i de furnizare a unor precursori pentru biosinteze, a fost propus de Davis, n 1961.

28

 Cile catabolice i cele anabolice funcioneaz simultan n celule, sub forma unor secvene de reacii catalizate de enzime i nsoite, la fiecare treapt, de o modificare caracteristic, energetic. n felul acesta, de exemplu, ntre catabolismul unui substrat organic i procesele de biosintez se stabilesc, la modul general, dou legturi biochimice distincte: 1. n anumite trepte specifice ale cilor catabolice se elibereaz o parte din energia chimic a metaboliilor pentru a fi conservat sub form de ATP, n timp ce n anumite trepte ale anabolismului, energia din ATP este utilizat pentru biosinteze. 2. Produii cilor de catabolism funcioneaz nu numai ca intermediari n eliberarea treptat de energie, ci sunt punctul de plecare al unor reacii de biosintez n care reprezint precursori ai componenilor celulari. n felul acesta, calea de catabolism al unui substrat organic funcioneaz, cel puin parial, ca o cale de iniiere a unor reacii de biosintez. Ciclul Krebs, spere exemplu, reprezint nu numai o cale de oxidare total a acetil CoA, ci, n acelai timp, i o surs important de intermediari (-cetoglutarat, oxalilacetat, succinat) pentru cile de biosintez. Datorit acestui fapt, el nu funcioneaz, niciodat, n ciclu nchis, deoarece anumii intermediari trec direct n cile de biosintez.

4.4. Cile anapleurotice

Deoarece intermediarii cilor centrale amfibolice sunt n permanen ndeprtai, pe de o parte, n cursul fazei a III-a a catabolismului, cu eliberare de energie, i, pe de alt parte, prin utilizarea lor n diferite biosinteze, funcionarea multor cicluri este condiionat de asigurarea unei reaprovizionri permanente cu intermediarii utilizai, ncetul cu ncetul, pe parcursul desfurrii lor. Aceast funcie este asigurat de o serie de ci metabolice auxiliare cile anapleurotice diferite de cele ale catabolismului, reprezentate de una sau mai multe etape catalizate enzimatic, care asigur completarea acestui deficit prin introducerea unor metabolii n anumite cicluri metabolice eseniale. Funcionarea i interaciunile celor patru tipuri de ci metabolice au loc n mod perfect coordonat, datorit mecanismelor complexe care asigur reglarea activitii lor, i adaptat la nevoile microorganismelor, determinate, n mare msur, de compoziia mediului n care triesc. Evoluia cilor metabolice sub forma unor reacii secveniale multiple confer metabolismului o mai mare flexibilitate i diversitate, asigurnd, n acelai timp, eliberarea treptat a energiei i efectuarea interconexiunilor cu alte reacii ale metabolismului i n special cu cele de biosintez.

4.5. Particularitile generale ale metabolismului microorganismelor

Natura i diversitatea nutrienilor folosii. Considerate n ansamblu, microorganismele sunt organismele cele mai tipic omnivore dintre toate cele cunoscute, deoarece i pot realiza metabolismul folosind foarte numeroase i diferite surse de substane nutritive, de la N molecular, CO2, So pn la substanele organice complexe. Teoretic, aproape orice substan din mediu, organic sau anorganic, din care se poate obine energie, este accesibil metabolismului bacterian. n lumea bacteriilor exist ns i mari diferene individuale sub raportul potenialului biochimic n sensul c, unele specii, ca de exemplu cele din genul Pseudomonas pot utiliza ca surs de C i energie 70-200 de substane chimice diferite, n timp ce altele sunt foarte specializate, utiliznd un numr foarte limitat de nutrieni. Astfel, bacteriile metilotrofe utilizeaz numai metanul i metanolul, bacteriile celulozolitice, numai celuloza, Nitrosomonas numai NH3 i O2, iar Bacillus fastidiosus numai acidul uric i compuii purinici nrudii.

29

Bacteriile sulfatreductoare (Desulfovibrio desulfuricans) nu utilizeaz ca surs de C dect un numr limitat de compui organici (lactat, piruvat i acizi dicarboxilici cu C4) i spre deosebire de majoritatea bacteriilor, nu metabolizeaz nici un glucid i nici un aminoacid, cu excepia cisteinei. Diferitele grupuri sistematice de bacterii se caracterizeaz deci prin anumite particulariti metabolice, n aa fel nct, n afara unor substane folosite de toate microorganismele (ap, CO2, sruri minerale etc.), unele specii sau grupuri fiziologice de specii au nevoie i de anumite substane nutritive specifice, indispensabile pentru realizarea metabolismului celular. Plasticitatea metabolismului microorganismelor este o alt particularitate, decurgnd din capacitatea acestora de a se adapta la tipul i cantitatea de nutrieni diferii, prezeni n mediu. E. coli, de exemplu, utilizeaz nu numai glucoza i NH3 ca surs de C i N, ci i o gam larg de nutrieni, incluznd diferite alte glucide, glicerol, etanol, acetat etc., respectiv purine, pirimidine, aminoacizi, datorit echipamentului enzimatic complex, care asigur conversia tuturor acestor substane n compui care pot intra n cile metabolice centrale. Diversitatea mecanismelor enzimatice i a produilor. Microorganismele pot utiliza acelai substrat nutritiv pe mai multe ci distincte sau parial intricate, fiecare dintre ele putnd s duc, n funcie de natura microorganismului, la formarea de produi diferii. Diferitele ci metabolice pot coexista n acelai microorganism i se pot substitui una celeilalte, n funcie de condiiile fiziologice i/sau de mediu. Intensitatea metabolismului bacterian. Una din caracteristicile distinctive ale activitilor metabolice microbiene este intensitatea lor excepional comparativ cu aceea a activitilor omologe ale organismelor superioare. Astfel, activitatea respiratorie a unui gram (raportat la greutatea uscat) de bacterii aerobe este de cteva sute de ori mai intens dect aceea a omului, iar potenialul metabolic al microorganismelor din 25 cm superficiali ai solului, pe o suprafa de un hectar, este echivalent cu cel la ctorva zeci de mii de oameni. Un gram de bacterii lactice hidrolizeaz circa 178-14 890 g lactoz pe or. Pentru a atinge un asemenea nivel de activitate metabolic organismul uman ar avea nevoie de mai multe mii de tone de alimente pe or. O celul de E. coli, care se divide la un interval de o or, sintetizeaz pe secund 4 000 de molecule de lipide, aproximativ 1 000 tipuri de proteine (fiecare avnd 300 de aminoacizi) i 4 molecule de ARN (Nester, 1973).

30

5. NUTRIIA MICROORGANISMELOR
Microorganismele, ca toate organismele vii, au nevoie pentru cretere i multiplicare, ca i pentru toate celelalte manifestri ale activitii lor biologice, de prezena n mediul nconjurtor a unor substane nutritive, care s conin, pe de o parte, elementele chimice necesare pentru sinteza constituenilor celulari, pentru activitatea enzimelor i sistemelor de transport, iar, pe de alt parte, s le furnizeze substanele necesare pentru producerea de energie biologic util. Din cauza caracterului foarte heterogen al mediilor naturale i dificultilor de a pune la punct tehnici de identificare i dozare a diferitelor substane prezente n jurul celulelor bacteriene se cunosc foarte puine date referitoare la procesele lor de nutriie n natur. Mediile de cultur utilizate n practic conin, ntr-o form adecvat tipului de nutriie al fiecrui microorganism, nutrienii eseniali pentru sinteza de material celular i pentru producerea de energie in vitro, care condiioneaz procesul de cretere i multiplicare. Ele includ n mod obligatoriu, pe lng o serie de ioni anorganici, diferii compui ai C, H, O, N, P, S etc.

5.1. Bioelementele
Microorganismele au nevoie pentru cretere de aceleai bioelemente ntlnite n structura oricrui sistem biologic. Bioelementele majore (macroelementele) i anume C, O, H, S, P, K, Mg, Ca i Fe, sunt necesare n concentraii relativ mari (> 10-4 M). Dintre acestea C, O, H, N, S i P formeaz ~95% din greutatea celular uscat a bacteriilor i reprezint, ca atare, constituenii majori ai biomasei celulare a microorganismelor. Macroelementele ndeplinesc funcii cu semnificaie esenial n metabolism i, n general, n viaa microorganismelor. Astfel, sulful este necesar pentru sinteza unor aminoacizi (cistein i metionin) i a unui numr de coenzime; fosforul intr n structura acizilor nucleici, a fosfolipidelor, a acizilor teichoici, precum i n structura unor nucleotide ca ATP, GTP, NAD+ i FAD. K, Mg, Ca, i Fe sunt ioni metalici necesari pentru activitatea enzimelor sau intr, ca elemente, n compoziia complexelor metalice. Spre exemplu, fosfolipidele peretelui celular bacterian sunt chelate cu ioni de magneziu. Calciul intr n structura unor coenzime; ionii feros i feric fac parte din structura unor purttori redox, cum sunt citocromii i proteinele FeS. Bioelementele minore (microelementele sau micronutrienii, trace elements) Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W, i Ni sunt necesare n cantiti foarte mici, unele (Zn i Mn) ca elemente eseniale pentru toate microorganismele, n timp ce altele (Se, Mo, Co, Cu, i W) numai pentru unele activiti metabolice speciale: zincul este necesar pentru c ADN-polimerazele i ARN-polimerazele sunt metaloproteide cu zinc; molibdenul intr n constituia nitrogenazei, enzim esenial pentru procesul de fixare biologic a azotului; cobaltul particip la efectuarea reaciilor metabolice dependente de vitamina B12; cuprul intr n structura unor enzime care transfer electroni de la nivelul unui substrat la oxigen. Nevoia de ioni minerali variaz cantitativ i calitativ de la un microorganism la altul, n primul rnd, datorit diferenelor de constituie enzimatic i de eficacitatea mecanismelor de concentrare activ a lor din mediu.

31

5.2. Sursa de carbon

n funcie de natura sursei de carbon folosit pentru cretere i multiplicare, microorganismele formeaz dou mari grupuri: microorganismele autotrofe, care folosesc CO2 ca unic sau ca principal surs de C celular; microorganismele heterotrofe sau organotrofe, la care substanele organice servesc, n acelai timp, ca surs de C pentru biosinteze i producere de energie. Marea varietate a tipurilor nutriionale ntlnite la microorganisme nu poate fi ns exprimat numai n funcie de sursei de C. Se iau n considerare criterii suplimentare ca: natura sursei de energie; natura substanelor folosite ca donatori de hidrogen (sau de electroni). n cazul microorganismelor care folosesc diferite substane organice, rolul de surs de energie este asigurat prin faptul c oxidarea sau dezasimilarea lor se face cu eliberare de energie util pentru celul i eliberarea unei mari varieti de produi de metabolism, de exemplu CO2 (produsul major al metabolismului respirator) sau ca un amestec de CO2 i compui organici (n cazul metabolismului fermentativ). n acelai timp, compuii organici utilizai ca nutrieni sunt folosii ca punct de plecare pentru sinteza celor cteva mii de substane organice constitutive, care sunt ncorporate prin reacii consumatoare de energie n structura celulelor. Exist mari diferene n ceea ce privete natura i numrul compuilor care pot fi folosii ca surs de C. Nutriia heterotrof poate fi: simpl, ca la E. coli, care poate fi cultivat pe medii de cultur ce conin numai glucoz i sruri minerale; complex, ca la Lactobacillus sp., care are nevoie de o serie de compui organici, inclusiv vitamine. Heterotrofia implic incapacitatea de sintez a unor metabolii eseniali i necesitatea de a-i gsi ca substane preformate n mediu, spre deosebire de autotrofe, care sunt capabile s sintetizeze constitueni organici, pornind de la compui anorganici simpli. Unele microorganisme heterotrofe au nevoi foarte specifice i nu se pot dezvolta dect n prezena unui singur compus organic: Bacillus fastidiosus utilizeaz numai acidul uric; microorganismele celulozolitice utilizeaz numai celuloza; bacteriile metilotrofe folosesc numai metanul, metanolul i dimetileterii. Alte microorganisme, ca, de exemplu, bacteriile din genul Pseudomonas, folosesc o gam foarte larg, de peste 100 de compui organici cu C, pe care nu sunt capabile s i sintetizeze (carbohidrai, polialcooli, acizi grai, acizi aminai, hidrocarburi, acizi aromatici etc.). Este probabil c toate microorganismele heterotrofe au nevoie i de CO2 n cantiti foarte mici pentru diferite reacii biosintetice. Dovada o constituie faptul c ndeprtarea complet a CO2 mpiedic sau inhib creterea microorganismelor respective n medii organice. Cel mai adesea, nevoile de CO2 sunt acoperite de nsui metabolismul normal al substanelor organice, care produce cantiti importante de CO2. Exist i excepii, reprezentate de unele bacterii i fungi microscopici a cror dezvoltare heterotrof este condiionat de prezena unei atmosfere bogate n CO2 (5-10%).

32

5.3. Sursa de azot

Azotul este necesar n cantiti mari deoarece reprezint ~10% din greutatea uscat a celulei bacteriene, n care este ncorporat n general, sub form redus, ca grupri NH2. Azotul este prezent n mod natural ca N2 sau n diferite combinaii ca NH3, nitrat, nitrit sau compui organici. Sursa preferat de N pare s fie NH3, care este utilizat practic de toate microorganismele. n cazul microorganismelor fixatoare de N2, acesta este redus iniial la NH3, nainte de a fi ncorporat n compui organici. mod similar, microorganismele care folosesc nitraii sau cele care utilizeaz N organic i convertesc iniial la NH3, form accesibil pentru biosinteze.

5.4. Factorii de cretere

n anul 1901, Wildiers a observat c levurile nu se pot dezvolta pe medii de cultur sintetice, formate exclusiv din substane minerale ca surse de N i C, dect dac li se adaug culturi vechi sau omorte de levuri sau extracte de levuri, cultivate pe medii complexe sau pe diverse produse de origine biologic. Mediul sintetic nu satisface deci nevoile metabolice ale levurii. Adugarea de levuri omorte l mbogesc cu un factor care stimuleaz creterea. Substanele nedefinite prezente n aceste preparate au fost numite factorul bios. S-a demonstrat c factorul bios este un amestec de vitamine, i aminoacizi ca: mezoinozitol, acid pantotenic, piridoxin, acid nicotinic, biotin, aneurin, -alanin, L-leucin etc. Cercetrile au demonstrat c unele microorganisme au nevoie nu numai de surse de energie, de C i de N, ci i de anumite substane organice oligodinamice, eseniale pentru metabolismul lor, numite factori de cretere. Factorii de cretere ai unui microorganism sunt acele substane pe care microorganismul dat este incapabil s la sintetizeze n cursul metabolismului su i n absena crora multiplicarea lui este imposibil (Lwoff, 1943). La unele microorganisme factorii de cretere sunt de origine endogen, fiind elaborai prin biosintez n cursul metabolismului celular, astfel c prezena lor ca substane preformate n mediu nu este necesar. n schimb, microorganismele care nu au capacitatea de a sintetiza unul sau mai muli dintre aceti metabolii eseniali nu pot tri dect dac mediul lor este suplimentat cu factorul sau factorii de cretere pentru a cror sintez facultile lor metabolice sunt deficitare. n funcie de natura lor chimic, factorii de cretere pot fi grupai n trei categorii: aminoacizi necesari pentru sinteza proteinelor; purine i pirimidine utilizate pentru sinteza ARN, ADN i a unor coenzime; vitamine care funcioneaz ca grupri prostetice ale unor enzime, ale unor proteine-purttor sau cu funcie de coenzime. n raport cu celelalte categorii de nutrieni, care folosesc pentru formarea constituenilor celulari, factorii de cretere sunt necesari n cantiti mici, deoarece cei mai muli ndeplinesc funcii specifice n biosinteze.

5.5. Oxigenul
Oxigenul este furnizat microorganismelor, n primul rnd, de diferii nutrieni i de apa din constituia mediilor de cultur. Din cauza solubilitii sale sczute, oxigenul aflat n soluie este utilizat foarte repede de bacteriile aerobe, chiar n cazul unor populaii puin numeroase. De aceea, frecvent, densitatea atins de o cultur este adesea limitat de rata de difuzie a O2 prin interfaa aer-ap, chiar cnd culturile sunt bine aerate.

33

 n culturile aerate prin simpla rotaie a flacoanelor creterea unor bacterii aerobe este adesea limitat la ~1-2 mg greutate uscat/ml. Creterea mai abundent necesit tehnici speciale, care mresc aria interfeei lichidaer, ca, de exemplu, barbotarea rapid cu aer printr-un filtru poros, sau prin recircularea culturii. Pentru necesiti de ordin practic, pe baza efectului pe care oxigenul l exercit asupra creterii i metabolismului, microorganismele pot fi grupate n patru categorii: 1. Microorganismele strict sau obligatoriu aerobe (de exemplu, Bacillus anthracis, B. subtilis, Mycobacterium tuberculosis), care au nevoie absolut de prezena oxigenului molecular i sunt incapabile s triasc n anaerobioz. 2. Microorganismele strict sau obligatoriu anaerobe (de exemplu, Clostridium tetani, C. botulinum, Welchia perfringens etc.), care nu se pot dezvolta n prezena oxigenului molecular i, ca urmare, pot fi cultivate numai n medii srcite n O2, deoarece chiar la presiuni joase, de ordinul a 10-5 atm, pot avea efect inhibitor. n practic, se folosesc nglobri n medii ale unor substane care favorizeaz creterea bacteriilor anaerobe, de exemplu tioglicolatul de sodiu 0,1%, care reduce O2 din mediu. Alte procedee: adugarea unui strat de ulei de parafin; utilizarea de agar semisolid (0,20,3%), pentru a diminua difuzia O2; cultivarea n recipiente (anaerostate) din care oxigenul a fost ndeprtat sau nlocuit cu un amestec controlat de alte gaze. 3. Microorganismele microaerofile (de exemplu, Spirochaetales, Thiobacteriales etc.) cresc cel mai bine la presiuni de oxigen mai mici (~0,2 atm) dect n aerul atmosferic. Aceast particularitate reflect prezena unor enzime care sunt inactivate n condiii de oxidare puternic i pot fi meninute n stare funcional numai la presiuni joase de O2. 4. Microorganismele anaerobe, facultativ aerobe (E. coli, Staphylococcus, Streptococcus etc.) au capacitatea de a se dezvolta deopotriv n prezena sau n absena O2. unele dintre ele (de exemplu bacteriile lactice) desfoar n esen un metabolism de tip fermentativ, chiar n prezena aerului, fr a fi sensibile la O2. Altele, cum sunt levurile, E. coli i Enterobacteriaceae-le, n general, sunt capabile s-i orienteze metabolismul spre respiraie sau spre fermentaie, n funcie de condiiile de mediu, respectiv de disponibilitile de O2. n esen nevoia de O2 reflect mecanismul molecular prin care microorganismele i satisfac nevoile energetice.

34

6. AUTOTROFIA
n concepia clasic, autotrofia reprezint tipul de metabolism caracteristic organismelor capabile s creasc n absena oricrui compus organic. Microorganismele autotrofe utilizeaz CO2 ca surs unic sau major de carbon celular i N sub form de NH3, nitrat sau chiar N molecular, diferite sruri minerale i apa, de la care i construiesc numeroasele substane organice caracteristice organismelor vii. Microorganismele autotrofe folosesc aceeai surs de C, adic CO2. Ele se deosebesc, n raport cu natura sursei de energie care asigur creterea, putnd fi difereniate n: o fotoautotrofe, care pot obine toat energia necesar pentru cretere de la lumin, oxidnd compui anorganici compui ai sulfului sau So; o chimioautotrofe, care i obin energia necesar din oxidarea unor compui anorganici redui ca NH3, nitrii, compui ai S, Fe sau H2. Sub raportul capacitii lor de biosintez, autotrofele pot fi considerate ca microorganisme complete, deoarece posed sistemele enzimatice cele mai complexe, care asigur producerea tuturor componenilor celulari de la CO2, pe seama oxidrii unor substane anorganice. Au fost descrise urmtoarele categorii de microorganisme autotrofe: Microorganisme autotrofe obligate, care fixeaz CO2 ca principal surs de C, pe calea Benson-Calvin (calea ribulozodifosfatului), utiliznd o substan anorganic redus ca surs de energie, sau, dac sunt fototrofe, ca donator de electroni. Ele sunt de dou tipuri: 1. microorganisme chemolitotrofe obligate, obin toat energia necesar pentru cretere i pentru asimilarea C prin oxidarea specific (n absena luminii) a unor compui anorganici ai S, ai ionilor NH4+, nitrit i fier feros sau a H molecular; 2. microorganisme fotolitotrofe obligate, utilizeaz energia luminoas, asociat cu oxidarea compuilor redui ai S sau H2. Microorganisme autotrofe facultative, care au o mult mai mare adaptabilitate metabolic, incluznd specii (Acidithiobacillus novelus, Hydrogenomonas etc.) ale cror particulariti fiziologice merg de la capacitatea de a se dezvolta autotrof, pn la cea de cretere heterotrof. Chemolitotrofele facultative pot crete fie autotrof (n medii cu sruri minerale, utiliznd substane anorganice ca surs de C i energie), fie heterotrof, folosind substane organice.

Orientri noi asupra conceptului de autotrofie

Iniial definiia autotrofelor a fost legat numai de metabolismul carbonului, caracteriznd organismele care folosesc energia obinut prin oxidarea unor donatori anorganici de electroni pentru a fixa CO2, ca prim i indispensabil surs de C. Schlgel (1975) a considerat cel dinti definiia autotrofiei legat de utilizarea CO2 ca surs major obligatorie de C, ca depit. Dup Schlgel, definitoriu pentru autotrofe este faptul c un organism este capabil s sintetizeze substanele celulare de la CO2, ca surs principal de C, deoarece faptul c unele autotrofe sunt facultativ heterotrofe i pot crete ocazional i pe substane organice este de importan minor. Cum cele mai multe microorganisme autotrofe nu se ncadreaz n conceptul riguros clasic stabilit, s-a ncercat s se redefineasc conceptul de autotrofie. Aceste ncercri au ca suport, printre altele, urmtoarele argumente (Whittenbury i Kelly, 1977): 1. microorganismele autotrofe nu prezint nici un mecanism comun de oxidare a compuilor anorganici, ceea ce demonstreaz caracterul neuniform al grupului; diferitele substraturi sunt oxidate de enzime diferite, pe ci diferite; 2. cele mai multe bacterii autotrofe nu sunt inhibate de anumite substane organice, sau nu sunt singurele organisme inhibate;

35

3. numeroase microorganisme, considerate convenional ca heterotrofe, oxideaz anumite substane anorganice, ceea ce demonstreaz c oxidarea compuilor anorganici redui nu este o proprietate limitat la autotrofe i nici un caractercheie obligatoriu pentru autotrofie; 4. exist bacterii care nu cresc n absena luminii sau a unor surse anorganice de energie; nici una nu este ns autotrof obligat. Aceste date demonstreaz c principalele categorii de autotrofe descrise n literatura de specialitate nu acoper toate categoriile nutriionale care pot fi considerate ca autotrofe. Rezult c este preferabil s se menin o separare net ntre metabolismul energetic i cel al carbonului, deoarece este evident c producerea de energie de la un substrat anorganic nu trebuie cuplat obligatoriu cu autotrofia. n felul acesta, exist posibilitatea clasificrii fiziologice precise: o n funcie de sursa de energie (litotrof sau organotrof); o n funcie de tipul de nutriie cu C (autotrof sau heterotrof). n timp ce termenul clasic de autotrof poate implica sau nu utilizarea unui donator anorganic de electroni, termenul chemolitoautotrof este precis i nseamn organism care fixeaz CO2, utiliznd energia eliberat prin reacii chimice din oxidarea unor donatori anorganici de electroni. n acest context conceptul de autotrofie include: 1. organismele considerate ca autotrofe i n concepia clasic, organisme care asimileaz CO2 pe calea circuitului Calvin; 2. organismele care folosesc ali compui de tip C1 i calea ribulozomonofosfatului, calea serinei sau alte ci specifice.

Cauzele autotrofiei obligate

Nu exist o explicaie valabil pentru toate cazurile de autotrofie. Mai muli factori, acionnd separat sau n combinaie, pot explica autotrofia unui organism sau a unui grup de organisme: 1. Permeabilitatea limitat fa de nutrienii organici. S-a demonstrat c bacteria Acidithiobacillus thiooxidans, adaptat s triasc ntr-un mediu toxic, mpiedic ptrunderea compuilor organici nocivi n celul prin proprietatea de permeabilitate selectiv. n schimb A. denitrificans este permeabil pentru anumite substane organice (glicerol), dei nu le folosesc n metabolism; 2. Incapacitatea de a obine energie suficient de la substratul heterotrof; 3. Prezena unei leziuni metabolice: adic incapacitatea de a crete pe nutrieni organici datorit lipsei uneia sau mai multor enzime necesare pentru sinteza anumitor metabolii eseniali; 4. Influena patologic a unor nutrieni organici exogeni: la A. neapolitanus creterea este inhibat de mici cantiti de fenilalanin, metionin i cistein; 5. Autoinhibarea i antrenarea autotrofelor: la creterea heterotrof a fost observat c anumii nutrieni pot fi metabolizai dar nu permit creterea; de exemplu aspartatul produce compui toxici cnd este prezent n culturile de A. thiooxidans, care cresc n medii cu S i CO2; 6. Dependena de un anumit produs esenial specific. ntr-un mediu mineral aerob, suplimentat cu un substrat organic, deci n condiii de heterotrofie, Nitrosomonas oxideaz preferenial NH3 la nitrit, epuiznd sursa de N necesar pentru scopuri biosintetice. Au mai fost luai n discuie i ali factori, cum ar fi: capacitatea limitat de a sintetiza compuii necesari pentru cretere din alte surse diferite de CO2; blocarea biochimic a creterii n prezena unui exces de nutrieni organici; inhibarea creterii de ctre anumii produi ai metabolismului compuilor organici; dependena de un anumit intermediar anorganic al procesului respirator n chemotrofie sau fototrofie, pentru anumite reacii specifice n celul. 36

6.1. Microorganismele chemolitoautotrofe

Bacteriile chemolitoautotrofe au dou particulariti de metabolism definitorii: 1. capacitatea de a obine energie (ATP) i putere reductoare din oxidarea unor compui anorganici (H2, CO, NH3, NO2-, Fe2+, So, S2O32- etc.); 2. capacitatea de a utiliza CO2 ca surs unic sau principal de C, pe care l reduc la aldehid 3-fosfogliceric (fixarea reductiv a CO2) pentru a participa la metabolismul celular (ciclul Calvin-Barsham). Unele sunt chemolitotrofe obligate (bacteriile care oxideaz NH3 i NH2 ), altele sunt facultative (hidrogenbacteriile) deoarece pot crete i chemoorganotrof utiliznd carbonai sau acizi organici. Capacitatea de a oxida compui anorganici redui nu este limitat doar la chemolitotrofe. Unele heterotrofe posed enzimele necesare pentru oxidarea H2, dar nu se pot dezvolta pe medii complet anorganice, datorit incapacitii de a utiliza CO2 ca unic surs de C, din lipsa enzimelor ciclului Calvin. De asemenea, unele bacterii heterotrofe pot oxida cu mai mic eficien compuii redui ai N (NH3, NH2-), ceea ce demonstreaz c utilizarea acestora nu este o particularitate exclusiv a chemolitotrofelor. n raport cu heterotrofele, microorganismele chemolitotrofe prezint o serie de dezavantaje legate de metabolismul energetic: o dei realizeaz reacii de oxidare care asigur o conversie energetic global cu o eficien considerabil, ele cresc slab i produc mai puin ATP, datorit randamentului energetic molar relativ sczut al substanelor pe care le folosesc; o fixarea reductiv a CO2, principala surs de C celular, necesit putere reductoare pentru a aduce C din CO2 la nivelul de oxidare caracteristic glucidelor; Practic, chemolitotrofele (cu excepia celor care oxideaz hidrogenul) consum 80% din bugetul lor energetic total pentru conversia CO2 n constitueni celulari.

6.2. Mixotrofia
Mixotrofia este capacitatea microorganismelor chemolitotrofe facultative de a combina utilizarea surselor de energie i/sau de C autotrofe, cu folosirea substraturilor organice. Termenul de mixotrofie a fost introdus de Pfeffer (1897) pentru a descrie tipul de metabolism n care compuii organici sunt fie necesari, fie stimulatori pentru creterea anumitor plante, iar Pringsheim (1967) l-a utilizat pentru a caracteriza bacteriile (de exemplu, Beggiatoa) a cror cretere autotrof este mult stimulat de prezena unor compui organici specifici. n accepiunea actual, mixotrofia implic producerea concomitent de energie, prin mecanisme alternative, chemolitotrofe i chemoorganotrofe sau utilizarea concomitent de mecanisme autotrofe i heterotrofe. Dei nutrienii mixotrofi nu au efect beneficial cnd sunt n exces, pot oferi un avantaj deosebit n condiii de limitare nutriional. ntruct n natur condiiile mixotrofe se ntlnesc foarte frecvent, microorganismele mixotrofe au un avantaj selectiv evident fa de heterotrofe i autotrofe, a cror cretere este limitat de cantitile insuficiente de substane organice, respectiv anorganice. Datorit acestui fapt, este probabil c mixotrofia reprezint modul de existen principal al microorganismelor chemolitotrofe facultative n natur. Exemplu: La Acidithiobacillus intermedius rata de cretere este mai mare n condiii de mixotrofie (mediu cu tiosulfat i glucoz), dect n condiii autotrofe sau heterotrofe. La A.novellus ns nutriia mixotrof (mediu cu tiosulfat i glucoz) nu prezint nici un avantaj, ba chiar este stnjenitoare, dimiunund rata de utilizare a glucozei, ct i rata de cretere.

37

6.3. Sintrofia
Studiindu-se bacteria Haemophilus influenzae s-a pus n eviden un fenomen general: microorganismele capabile s-i sintetizeze constituenii celulari de la compui simpli din mediu excret adesea mici cantiti de vitamine, aminoacizi sau ali factori de cretere, n afara celulei lor, unde pot fi folosii de alte organisme auxotrofe pentru substanele respective. Acest fenomen permite dezvoltarea pe medii de cultur solide, n jurul coloniilor excretoare de substane organice, a unor colonii satelite formate din microorganisme mai pretenioase (auxotrofe), care gsesc astfel substanele eseniale pentru cretere. Exemple: H. influenzae pe geloz-snge formeaz colonii mici, punctiforme i translucide. n vecintatea coloniilor de Staphylococcus, care contamineaz n mod accidental mediul de cultur, coloniile de H. influenzae devin mai mari, mai voluminoase, deoarece stafilococul este capabil s fac sinteza de NAD+ pe care n excret n mediu, permind bacteriei H. influenzae s se dezvolte mult mai abundent dect este posibil n prezena cantitilor mici de NAD+ coninut n snge. Bacteriile metanogene nu pot utiliza glucoza ca surs de C i energie, dar pot crete uor pe seama produilor finali formai prin degradarea glucozei de ctre bacteriile anaerobe, capabile s fermenteze acest compus.

6.4. Microorganismele oligotrofe

Termenul de microorganism oligotrof (sau oligocarbofil) caracterizeaz acele microorganisme a cror supravieuire i dezvoltare ca populaii vegetative sunt favorizate de prezena unor concentraii sczute de substane organice n mediu. ncadrarea n aceast categorie se poate face pe baza capacitii microorganismelor respective de a crete n mod evident pe medii de cultur care coni numai 5-10 mg C/l. Microorganismele oligotrofe se deosebesc de microorganismele copitrofe, a cror cretere este dependent de o aprovizionare abundent cu nutrieni, n medie de o sut de ori mai mare dect n habitatele oligotrofe. Din cauza dificultilor de studiu, bacteriile oligotrofe sunt grupate provizoriu n patru grupuri, pe baza relaiilor lor cu substanele organice din mediu: 1. primul grup cuprinde organisme care se pot dezvolta la prima cultivare n apa sterilizat a bazinului din care provin, dar care nu se dezvolt n recultivrile ulterioare, nici pe medii srace i nici pe medii standard bogate. Grupul este format din bacterii cunoscute numai pe baza morfologiei lor, studiat la microscopul electronic; 2. grupul al doilea este reprezentat de o mare varietate de microorganisme, care nu cresc deloc sau cresc foarte ncet dac sunt trecute din apa de testat pe medii bogate, dar care ncep s creasc bine pe medii bogate n nutrieni, dup recultivarea pe ap steril sau pe agar srac n nutrieni; 3. grupul al treilea include bacterii cu caractere morfologice i fiziologice particulare, care cresc numai pe medii speciale, uneori fiind nevoie de tehnici particulare de izolare; 4. grupul al patrulea este format din bacterii insuficient studiate i care nu au fost nc cultivate pe medii artificiale. Multe dintre ele sunt prostecate, ceea ce le ofer un avantaj adaptativ, nu numai pentru fixare, ci i pentru transportul nutrienilor n celul.

Semnificaia biologic.
Microorganismele oligotrofe acioneaz n natur ca ultimi utilizatori ai substanelor organice care rmn n urma activitii mineralizatorilor copiotrofi. Inhibarea creterii bacteriilor oligotrofe n medii bogate n nutrieni pare s fie datorat efectului toxic al produilor de metabolism i, n special, peroxidului de hidrogen, care se acumuleaz n mediu i determin liza celulelor.

38

7. DIFUZIA I TRANSPORTUL SUBSTANELOR PRIN MEMBRANELE CELULARE

Creterea i multiplicarea microorganismelor sunt condiionate de ptrunderea nutrienilor eseniali prin nveliurile celulare i de eliminare a unor substane rezultate din catabolism, mpiedicnd ns pierderea din celul a substanelor necesare. Toate microorganismele au structuri-barier i adevrate pori moleculare care asigur integritatea lor i limiteaz intrarea i ieirea anumitor compui chimici. Datorit acestor structuri, celula bacterian, spre exemplu, nu este niciodat ntr-o stare de echilibru n raport cu mediul nconjurtor n ceea ce privete concentraia diferitelor substane de cele dou pri ale membranelor celulare. Unele substane trec liber de cele dou pri ale membranei, dar cele mai multe nu pot fi transportate numai sub impulsul gradientului de concentraie, n aa fel nct transportul lor este condiionat de intervenia unor mecanisme speciale. n funcie de mecanismele fizicochimice care stau la baza lor, modalitile generale de transport prin membranele biologice ale electroliilor i neelectroliilor sunt: difuzia pasiv, difuzia facilitat, translocaia de grup, transportul activ i endocitoza (Zarnea, 1984).

Difuzia pasiv
Se realizeaz ca urmare a unui gradient de concentraie, posibil cnd n exteriorul celulei concentraia este superioar celei din interiorul acesteia. Difuzia pasiv este procesul de trecere liber a substanelor solubile prin membrana plasmatic, fr a interaciona cu moleculele din structura acesteia i fr consum de energie. Moleculele cu grad ridicat de solubilitate n lipidetraverseaz mai uor regiunea hidrofob a membranei. Deorece concentraia celor mai muli metabolii este mai mare n interiorul dect n afara celulei, difuzia pasiv este restrns, pe lng ap, la un mic grup de substane (unele gaze ca O2 i CO2, acizii grai i substanele liosolubile, anumii ioni). Difuzia pasiv se produce lent i nespecific i nceteaz cnd compusul respectiv ajunge n aceeai concentraie att n interiorul, ct i n afara celulei.

Difuzia facilitat
Se realizeaz ca urmare a prezenei n biomembrane a unor proteine receptoare denumite permeaze, localizate la nivelul plasmalemei sau n spaiul periplasmic. Aceast difuzie este stereospecific i se realizeaz fa de un gradient de concentraie, iar celula nu consum energie pentru acest transfer.

Transportul activ
Are urmtoarele particulariti: transportul n celul este asigurat chiar n absena gradientului de concentraie i se realizeaz cu consum de energie. Acest transport a fost demonstrat n cazul drojdiilor care pot acumula intracelular o cantitate de glucide i de aminoacizi mai mare dect cea existent n mediul de cultur. Se admite c o molecultransportor, care consum o cantitate de energie pentru a se activa i a produce o legtur instabil cu molecula nutrientului printr-o reacie catalizat enzimatic, transfer nutrientul i l elibereaz n interior. Transportorul se activeaz ca urmare a energiei eliberate prin transformarea ATP.

Translocaia de grup
Este un transport activ ntlnit la drojdii i mucegaiuri, n care intervine un sistem enzimatic complex de transferaze i transfosfataze, ce permit ptrunderea glucidelor prin

39

membrane sub forma esterilor fosforici. Astfel, fosfoenol-piruvatul se poate combina cu molecula de glucid din exteriorul celulei i se transform n piruvat i esterul fosforic al glucidului transportabil n interior.
n cazul microorganismelor acvatice (protozoare), exist sistemul de endocitoz sau pinocitoz prin care nutrientul din exterior este nglobat n interior, aprnd stadiul de pictur suspendat i eliberarea n interiorul celulei. Numeroase microorganisme, mai ales bacteriile, pot folosi pentru transportul intracelular aa-numitul gradient protonic" rezultat n urma transportului de protoni i ioni, care acioneaz permanent n celula vie ca o pomp electrochimic.

Difuzie pasiv

Difuzie facilitat

Transport activ

N-molecul nutrient E1,2,3 - enzime T*- transportor activat Endocitoz

40

8. METABOLISMUL GLUCIDELOR LA MICROORGANISME

Numeroase microorganisme utilizeaz glucidele ca surs de energie i de C celular pe calea unor secvene metabolice de catabolism i biosintez, care uneori variaz de la o specie la alta, astfel nct nu pot fi prezentate ntr-o schem unitar. Cea mai mare parte a rezervei de C din natur se gsete sub form de poliglucide, care n prealabil sufer un proces de degradare sub aciunea exoenzimelor microbiene la molecule mici, transportabile prin membranele celulare. Astfel, celuloza, care formeaz cea mai abundent rezerv de material organic din natur, rennoibil anual prin fotosintez, este degradat de bacterii, succesiv, la molecule oligoglucidice lungi, sub aciunea unei endoglucanaze extracelulare, la oligoglucide scurte, de ctre endoglucanazele periplasmice, i la celobioz i glucoz, de ctre -glucozidazele periplasmice (Ramasamy i Verachtert, 1980). Sistemele enzimatice celulozolitice ale diferitelor microorganisme sunt diferite, fiind formate din enzime extracelulare i intracelulare sau legate de suprafa. n general, degradarea celulozei are loc cel mai eficient prin contact direct ntre microorganisme i substrat, deoarece prin acest mecanism se realizeaz o concentraie enzimatic local maxim i o aranjare spaial favorabil (Hofstern, 1975; Tor-Magnus Enari, 1983). n mod similar, amidonul poliglucid vegetal format prin asocierea a dou specii macromoleculare distincte, amilopectina (component major formnd ~ 80 %) i amiloza este degradat sub aciunea -amilazei (la Aspergillus niger, A. oryzae, B. subtilis, B. stearothermophilus etc.) i de glucoamilaze, enzime exclusiv microbiene (prezente la Aspergillus, Rhizopus, levuri i bacterii), la moleculele monomere componente de D-glucoz.

Utilizarea glucozei n metabolismul microorganismelor

Forma principal n care glucidele sunt utilizate n metabolismul microorganismelor este reprezentat de glucoz. Procesul a fost studiat n detaliu la E. coli, care n condiii aerobe utilizeaz ~ 50 % din substrat, oxidndu-l la CO2 (C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + H2O; G0' = - 686 kcal) printr-o serie de reacii din care rezult suficient ATP pentru a asigura conversia restului de substrat (~ 50 %) n material celular. Au fost descrise patru ci principale: Calea Embden-Meyerhof-Parnas; Calea hexozomonofosfatului; Calea Entner-Doudoroff; Calea fosfocetolazei. Primele dou sunt funcionale deopotriv n celulele animalelor superioare, ca i la bacterii i fungi, n timp ce ultimele dou sunt folosite n exclusivitate de bacterii. Dei transformrile chimice efectuate n reaciile acestor ci la diferite microorganisme sunt aceleai, sistemele enzimatice efectoare active la un microorganism dat sunt, adesea, ntructva diferite de cele care acioneaz la alte microorganisme. n toate aceste ci, piruvatul ocup poziia unui intermediar-cheie, deoarece este situat la punctul de intersecie metabolic de la care pornesc diferitele ci terminale.

41

9. METABOLISMUL ENERGETIC AL MICROORGANISMELOR

Bioenergetica microbian (metabolis mul oxidativ energetic)
Procurarea energiei este o proprietate vital a celulei microbiene, care se realizeaz prin eliberarea energiei chimice a diferitelor alimente i formarea compuilor macroergici prin procesul de fosforilare. n metabolismul energetic, prin procese de oxidare i oxidoreducere pe cale enzimatic, substratul nutritiv trece n substrat oxidat, cu eliberarea de energie potenial (Q1). Substratul oxidat rezultat, avnd energia potenial diminuat (Q2), sufer n continuare transformri pn la produii finali:
E1 E Substrat nutritiv Substrat oxidat 2 CO 2 H 2 O

Q1 ADP Pi ATP

Q2 ADP Pi ATP

Substratul oxidat poate servi drept precursor sau, dac nu este util celulei, se poate elimina n mediu sub form de catabolit. Cantitatea de energie obinut prin catabolism poate fi obinut direct n biosintez, iar energia excedent este stocat n compui macroergici prin procesul de fosforilare, denumit astfel deoarece componenta macroergic, care stocheaz energia rezultat, conine grupri fosfat. Se consider compus macroergic un compus capabil s elibereze o cantitate de energie mai mare sau egal cu 30 kj/mol. Principalii compui macroergici sunt: ATP-ul, acetil fosfatul (Acetat~P), ADP-ul, fosfoenolpiruvatul, compui care pot disponibiliza cantiti variabile de energie, prin ruperea legturii macroergice. Fosforilarea poate fi de trei tipuri: fotosintetic, ntlnit la bacteriile din diviziunea Photobacteria care folosesc energia radiant; oxidativ, cnd formarea compuilor macroeregi cu fosfor are loc prin nmagazinarea energiei eliberate prin reacii de oxidare, n procesele de respiraie aerob sau anaerob; de substrat, n urma formrii de compui macroergici prin reacii de oxidoreducere, prin care glucidele sunt transformate, prin procese de fermentaie anaerob, n compui intermediari, acceptorul de H sau electroni fiind un compus organic. La fosforilarea oxidativ eliberarea energiei poteniale din diverse substraturi de natur organic se realizeaz prin procese de oxidare, care se pot desfura astfel: reacii de oxidare prin pierdere de electroni, caz n care are loc un transfer de electroni de la substane cu potenial de oxidoreducere negativ (maxim 0,41 pentru hidrogen), la substane cu potenial de oxidoreducere pozitiv (maxim +0,82 pentru oxigen); reacii de oxidare prin transfer de hidrogen (electroni i protoni): acest tip de oxidare este folosit de unele microorganisme anaerobe i aerobe i transferul este realizat de enzime active la diferite valori ale potenialului de oxidoreducere. Enzimele implicate n reaciile de oxidoreducere sunt dehidrogenazele aerobe (aldehid-dehidrogenaza) i anaerobe (alcooldehidrogenazele), care au drept coenzime NAD-ul sau NADP-ul i care preiau atomii de hidrogen trecnd din forma oxidat (NAD+) n forma redus (NADH + H+);

42

reacii de oxidare prin ctig de O2, cnd, n prezena enzimelor care acioneaz la un potenial de oxidoreducere pozitiv, are loc transferul de H la O2 provenit din aer i se formeaz apa; aceast reacie de oxidare este caracteristic microbiotei aerobe.

Respiraia aerob este un metabolism oxidativ dependent de oxigenul din aer, iar produsele finale sunt CO2 i apa, ntreaga energie a substratului oxidat eliberndu-se prin produsele finale ale respiraiei. Respiraia aerob este din punct de vedere energetic foarte avantajoas pentru celula microbian; de aceea, atunci cnd se urmrete obinerea de celule n cantiti mari (drojdie comprimat) sau de substane intracelulare, cultivarea se face n condiii de aerare. Microorganismele aerobe dispun de o caten respiratorie diversificat, n componena creia intr dehidrogenaze, citocromi, citocrom-oxidaze, oxidaze. Numeroase bacterii pot oxida hidrogenul (Pseudomonas), amoniacul pn la NO2 (Nitrosomonas), sulful i H2S pn la sulfit (Acidithiobacillus thiooxidans), sau Fe2+ la Fe3+ (Acidithiobacillus ferrooxidans), reacii cu rol important n ciclul natural al elementelor. Respiraia anaerob este un metabolism oxidativ n care substratul este transformat pn la CO2, iar electronii sunt cedai prin oxidare unor compui anorganici. Acest tip de respiraie este ntlnit la bacteriile strict anaerobe. Astfel, bacteriile denitrificatoare pot transforma NO3 la azot molecular, bacteriile metanogene pot transforma dioxidul de carbon n metan, bacteriile acetogene ale genului Clostridium pot transforma dioxidul de carbon n acid acetic. Aceste bacterii obin o cantitate mic de energie i pot crete n absena oxigenului molecular, la un potenial de oxidoreducere de 0,2...-0,3 V. innd cont c mediile care vin n contact cu O2 au un potenial redox de +0,2...+0,4 la un pH= 7, pentru a asigura dezvoltarea anaerobilor, n mediu se adaug substane cu caracter reductor ca: tioglicolat de sodiu, cistein-SH, sulfur de sodiu. Substanele reductoare menin un potenial oxidoreductor sczut, care permite dezvoltarea anaerobilor n plci, chiar cnd mediul vine n contact cu aerul. Pentru cultivarea anaerobilor se pot folosi i vase speciale numite anaerostate, n care O2 este legat chimic, sau cultura se menine n atmosfer de gaze inerte (CO2, N2). Metabolismul oxidativ anaerob poate fi ntlnit i la microorganisme facultativ anaerobe. Aceste microorganisme au capacitatea de a crete aerob, utiliznd oxigenul din aer (respitaie aerob), sau anaerob, utiliznd compui organici ca acceptori finali ai electronilor produi prin catabolism. n condiii aerobe microorganismele facultativ anaerobe i adapteaz echipamentul enzimatic pentru procese de oxidare pn la produi finali, utiliznd preferenial oxigenul, cnd este disponibil, datorit cantitii mai mari de energie rezultat prin respiraie aerob (36 moli ATP/mol glucoz asimilat, fa de 2-3 moli ATP/mol glucoz fermentat).

Celula microbian prelucreaz nutrienii obinnd energie i diferii compui, iar produii de catabolism sunt eliminai. n cursul acestor prelucrri metabolice, n funcie de faza de cretere a celulei, rezult produi de metabolism, care pot fi mprii astfel: produi primari, care se formeaz n faza de cretere exponenial a celulelor (trofofaza) i sunt produi eseniali pentru celul; produi secundari, care sunt formai n faza de declin a crterii celulelor (idiofaz) i nu sunt eseniali celulei (toxine, alcaloizi).

43

Fermentaii
Fermentaii anaerobe i produse de fermentaie Alcoolic (alcool etilic i CO2) Lactic (acid lactic, diacetil) Propionic (acid propionic, acid acetic, CO2) Butiric (acid butiric, CO2, H2) Microorganisme selecionate Saccharomyces sp. Lactobacillus sp. Lactococcus sp. Propionibacterium Fermentaii oxidative i produse de fermentaie Acetic (acid acetic, H2O) Gluconic (acid gluconic) Citric (acid citric) Oxalic, fum aric Microorganisme selecionate Acetobacter sp. Gluconobacter Aspergillus niger Aspergillus niger

Clostridium sp.

Aspergillus sp.

Fermentaii anaerobe
Fermentaia alcoolic Fermentaia alcoolic este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate prin reacii de oxidoreducere, sub aciunea echipamentului enzimatic al drojdiei, n produi principali (alcool etilic i CO2) i produi secundari (alcooli superiori, acizi, aldehide ,a.). Agenii tipici ai fermentaiei sunt drojdiile genului Saccharomyces care, prin fermentarea glucidelor, pot s produc mai mult de 8o alcool etilic. Fermentaia alcoolic este un proces ntlnit i la alte microorganisme: Bacillus macerans, Clostridium acetonoetilicus, Zygomonas mobilis, dar acestea produc prin fermentare cantiti mai reduse de alcool etilic comparativ cu drojdiile i nu sunt considerate ageni tipici. Fermentaia lactic Fermentaia lactic este un proces anaerob prin care glucide le fermentescibile sunt metabolizate sub aciunea echipamentului enzimatic al microorganismelor n acid lactic ca produs principal i produse secundare, cum ar fi: diacetil, aceton, acid acetic, alcool etilic i CO2. Bacteriile lactice homofermentative: Streptococcus lactis, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus bulgaricus, L.leichmanii, L. casei, L. acidophilus, L. jensenii fermenteaz glucoza la acid lactic, cu producere numai de urme ale altor produi. Bacteriile lactice heterofermentative: Leuconostoc mesenteroides, L. lacti, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis produc fermentaie mixt n care numai 1/2 din glucoz este convertit la acid lactic, restul fiind utilizat cu formare de alcool, formiat, acetat i CO2.

Procese metabolice aerobe (fermentaii oxidative)

Spre deosebire de fermentaiile propriu-zise anaerobe, fermentaiile acetic, gluconic, citric .a. sunt procese oxidative simple, care se desfoar n condiii aerobe i se difereniaz de metabolismul oxidativ (respiraie) prin aceea c oxidarea este limitat, rezultnd n condiii industriale acizi organici cu mare valoare economic.

Fermentaia acetic Fermentaia acetic este un proces aerob prin care substratul (alcoolul etilic) este oxidat n prezena oxigenului din aer, sub aciunea echipamentului enzimatic al bacteriilor actice, n acid acetic ca produs principal al fermentaiei.

44

 Caracterele morfologice i fiziologice ale bacteriilor acetice. Bacteriile acetice sunt bacterii strict aerobe, sub form de bastonae, gram-negative, grupate n perechi sau lanuri, cu dimensiuni variabile (0,5-0,8)x(80,9-4,2) m. Pot fi imobile sau mobile, cu cili polari sau peritrichi. n mediu acid, n timp, pot aprea forme de involuie, ramificate, care i pierd capacitatea de reproducere. n medii lichide (staionar) se dezvolt sub forma unui voat fragil care, cu creterea n dimensiuni, ascensioneaz pe pereii vasului (Acetobacter ascendens, A. aceti). Alte specii, A.xylinum, A. xilinoides formeaz, n vin oeit sau n oet, un strat gelatinos de natur -glucanic (coloidal i fibros). o Bacteriile acetice sunt mezofile (temperatura optim 30 C) i produc fermentaia o acetic ntr-un domeniu larg de temperaturi, 0...35 C. Au o termorezisten sczut n mediu lichid cu pH acid, inactivitatea lor avnd loc la 60 oC ntr-un minut, n timp ce bacteriile reinute pe suporturi solide (doage de lemn) sunt inactivate la temperaturi mai ridicate (100 oC).

Fermentaia gluconic Fermentaia gluconic este un proces oxidativ simplu prin care glucoza, n prezena oxigenului din aer i a sistemului enzimatic al microorganismelor selecionate, este transformat n acid gluconic ca produs principal. Agenii tipici ai fermentaiei gluconice sunt bacteriile din genurile Gluconobacter (Acetomonas) i Moraxella i mucegaiurile din genurile Aspergillus (A. niger, A. phoenicis, A.Wentii) i Penicillium (P. chrysogenum, P. luteum).

Fermentaia citric Fermentaia citric este un proces oxidativ complex prin care substratul glucidic (zaharoza) este metabolizat la compui intermediari de oxidare, cu acumulare n mediu a acidului citric ca produs principal. Ageni tipici ai fermentaiei citrice sunt tulpinile selecionate ale speciei Aspergillus niger care produc activ citrat sintetaz. Acidul citric se poate obine cu un bun randament (52 g/dm3) i prin cultivarea tulpinilor de drojdii din specia Candida oleophilla pe medii cu parafine.

Transformri microbiene ale compuilor organici macromoleculari

Se apreciaz c prin fotosintez, energia radiaiilor solare care cad anual pe pmnt (echivalen cu 3x1024 J) este convertit n energia chimic a combinaiilor organice, cu acumularea a 2x1011 tone C/an. Din aceast biomas vegetal, cea mai mare parte o constituie celuloza, substanele pectice, amidonul i n cantiti mai reduse, lipidele, acizii nucleici .a. n condiii naturale dup moartea vieuitoarelor vegetale i animale, n diferitele habitaturi (sol, ap) se produc degradri microbiene specifice, cu formare de: produi intermediari (condiii de anaerobioz); produi finali, ca CO2 i H2O (condiii de aerobioz). n afar de substraturile direct fermentescibile (glucoz, zaharoz, lactoz, acizi organici) microorganismele pot aciona i asupra altor compui organici, fie n condiii dirijate, cnd se obin produse cu valoare economic, fie n condiii naturale, cnd au loc procese complexe cu rol vital n circuitul natural al elementelor (C, N, O, S, P) i meninerea vieii pe Pmnt.

45

Descompunerea amidonului i a glicogenului Descompunerea acestor polioze au loc datorit unor microorganisme ce produc enzime extracelulare, care produc hidroliza acestor compui macromoleculari la molecule simple (glucoz, maltoz) transportabile prin membran i folosite n nutriie. Dintre enzimele microbiene care hidrolizeaz amidonul fac parte: -amilaza, amilaza i glucoamilaza, enzime extracelulare elaborate de bacterii, mucegaiuri i drojdii. Bacteriile genului Bacillus (B.subtilis, B.subtilis var. amyloliquefaciens, B.licheniformis, B.macerans, B.sthearothermophillus sunt productoare de -amilaz, enzim zaharogen care, prin hidroliza legturilor 1-4 glucozidice, elibereaz molecule de maltoz. Mucegaiurile Aspergillus, Mucor, Rhizopus produc mai ales -amilaz i glucoamilaz. Aspergillus niger i A. oryzae produc -amilaze. Mucegaiurile A.awamori, A.usami, A.niger i Rhizopus delemar produc glucoamilaz. Se cunosc peste 100 de specii de drojdii care produc -amilaz i glucoamilaz, dintre care mai importante sunt cele din genurile Saccharomycopsis (S.bispora, S.fibuligera), Schwanniomyces, Trichosporon i Candida. Hidroliza enzimatic a amidonului cu enzime vegetale (din mal) sau cu enzime microbiene, cu formare de glucide fermentescibile, este folosit n biotehnologia spirtului, a berii, a panificaiei sau pentru obinerea siropurilor dulci, a dextrinelor, a maltozei, a glucozei cristalizate .a.

Descompunerea celulozei i hemicelulozei Celuloza este un poliglucid rspndit n materiile prime de origine vegetal (aproximativ 1/3) i n structura pereilor celulari ai fungilor. Celuloza ajuns n sol i n ape este transformat n timp, sub aciunea microorganismelor care produc enzime celulozolitice: micromicete-ageni ai putrezirii, bacterii aerobe i anaerobe. Produii intermedieari de hidroliz sunt metabolizai n mod difereniat, n funcie de natura microorganismelor i de prezena/absena oxigenului din aer. Degradarea aerob a celulozei se caracterizeaz prin formarea din celobioz sau glucoz, n prima etap, a hidroxiacizilordin care, prin oxidare, se elibereaz CO2 i H2O. Dintre bacteriile aerobe care asimileaz celuloza fac parte bacterii cu forme spiralate aparinnd genurilor: Cytofaga, Cellvibrio, Cellulomonas. Importan industrial o au bacteriile din genul Cellulomonas, care pot fi cultivate aerob pe deeuri vegetale, pe hrtie .a., iar biomasa rezultat prin nmulire este valoroas prin coninutul ridicat n proteine (46,2%). Dintre micromicete au activitate celulozolitic superioar specii ale genurilor: Botryotinia, Fusarium, Mucor, Rhizopus, Trichoderma i Tricothecium. Tulpini selecionate de micromicete ale genurilor Trichoderma i Aspergillus sunt bune productoare de celulaze i sunt folosite industrial ca surse de enzime. Degradarea anaerob a celulozei are loc permanent n sedimente i n mlul apelor, la fermentarea compostului, n rumenul ierbivorelor, n profunzimea solului, n soluri inundate, lacuri termale. n transformarea celulozei se pot distinge trei etape, n funcie de natura produselor de fermentaie. Dup hidroliza celulozei la compui simpli, sub aciunea unei microbiote heterogene alctuite din bacterii anaerobe i facultativ anaerobe din familiile Enterobacteriaceae, Bacillaceae (genul Clostridium), se acumuleaz alcooli, acizi, CO2 i H2. Produsele rezultate n acest stadiu sunt folosite de bacteriile acetogene productoare de acid acetic pe cale anaerob, n a doua etap.

46

 n etapa a treia, denumit metanogen, sunt active bacteriile metanogene strict anaerobe din genul Methanobacterium cu speciile M.ruminantium, M.formicicum, M.mobilis, M.farkeri .a. Bacteriile anaerobe pot folosi acidul acetic ca surs energetic i produc metan. Se apreciaz c 73% din metan dezult din acidul acetic format n faza acetogen:
Methanosar CH3-COOH cina CH4 + CO2 bar ker i

Methanobacteriile pot forma metan prin reacia: 4CO + 2H2O Methanosarcina CH4 + 3CO2 thermoautotrophicum
n afara acestor procese naturale, care explic formarea zcmintelor de metan, n ultimele decenii a luat amploare metanogeneza dirijat n scopul obinerii de biogaz, prin prelucrarea microbiologic a dejeciilor animale, cnd se realizeaz concomitent protecia mediului i valorificarea energetic a metanului i a hidrogenului.

47

9. DINAMICA MULTIPLICRII BACTERIILOR N CULTURI

n general microorganismele sunt cultivate pentru mai multe scopuri: - izolarea i identificarea lor; - meninerea n stare viabil, n colecii, fr pierderea funciilor importante; - studiul structurii i funciei lor; - studierea rolului n natur; - obinerea de produi rezultai din biomasa celular, biosintez, fermentaii, bioconversii etc. n prezent se cunosc puine date n legtur cu dinamica multiplicrii populaiilor bacteriene n natur. Procesul este ns destul de bine cunoscut raportat la multiplicarea n condiii experimentale, de laborator, sau industriale. Exist dou tipuri principale de culturi bacteriene: culturi discontinue (n mediu de cultur nerennoit), care se pot realiza n dou variante o asincrone; o sincrone. culturi continue, n medii de cultur rennoite continuu.

Culturi discontinue asincrone

Aceste culturi corespund cultivrii n sisteme nchise, n care un anumit volum de mediu corespunztor este nsmnat cu bacteriile respective (batch-culture, eng. batch = arj, lot). n aceste condiii, creterea este limitat la un volum fix de mediu, care nu este rennoit i care de multe ori este modificat de acumularea produilor de metabolism, putnd deveni la un moment dat necorespunztor pentru cretere. Acest mod de cultivare este folosit frecvent n laborator, dei are o serie de dezavantaje de care trebuie inut seama: numrul bacteriilor variaz continuu, ritmul de cretere este impus de compoziia chimic a mediului care variaz de la un moment la altul, vrsta bacteriilor individuale este variabil, numrul de generaii posibile este limitat. Prin inocularea de celule, aparinnd unei culturi pure, ntr-un mediu nutritiv steril se poate stabili dinamica de cretere prin studiul vitezei de acumulare a biomasei sau prin creterea numrului de celule raportat la unitatea de volum a mediului. n timp ce la mucegaiurile inferioare, la care prin cretere are loc prin diviziunea nucleilor i nu a celulei coenocitice, creterea se apreciaz prin determinarea masic a biomasei formate, la alte microorganisme, la care concomitent cu diviziunea nuclear are loc i diviziunea celular (nmugurirea la drojdii, sciziune la bacterii, formare de perei despritori la mucegaiurile superioare), creterea se apreciaz fie prin acumularea de biomas fie prin determinarea numrului de celule. Pentru a aprecia dinamica multiplicrii, la intervale regulate se recolteaz probe mici de cultur, care sunt analizate, iar valorile logaritmice ale numrului de celule sunt nscrise pe curbe ale cror modificri arat tranziia de la o faz de cretere la alta. n general, se folosesc logaritmi n baza 2, deoarece fiecare unitate pe ordonat reprezint o dublare a populaiei bacteriene respective. n aceste condiii procesul evolueaz n ase faze succesive, n funcie de rata de cretere (notat cu r sau ): faza de lag, faza de accelerare, faza de cretere exponenial, faza de ncetinire i faza de declin. o Faza de lag (eng. to lag = a ntrzia), numit i de laten, sau de cretere zero, (=0) n care nu se constat o cretere a numrului de celule, numrul celulelor din inocul rmne neschimbat, sau chiar scade temporar. n aceast faz are loc o adaptare a celulelor la condiiile de mediu, biosinteza de ADN/ARN i o activizare a sistemelor enzimatice i elaborarea de enzime induse. n cazul drojdiilor, aceast faz poate dura 1-2 ore, durat ce

48

depinde de compoziia mediului i de capacitatea de reglare a metabolismului propriu. Durata fazei de lag poate fi redus la limite imperceptibile n cazurile n care se folosete un inoculum mare de cultur n faz logaritmic, iar transplantarea se face ntr-un mediu de cultur bogat, identic cu cel n care au fost cultivate bacteriile din inoculum. o Faza de iniiere a creterii, sau faza de accelerare a ritmului de cretere ( ), cnd are loc o cretere n dimensiuni a celulelor prin mrirea mai rapid a volumului n raport cu suprafaa celular, ceea ce favorizeaz declanarea procesului de diviziune; o Faza de cretere logaritmic sau de multiplicare exponenial, care reprezint faza n care creterea masei de celule poate fi determinat cantitativ prin dublarea numrului de celule n unitatea de timp (pentru drojdii i bacterii), sau ca dublare a biomasei / t pentru microorganismele filamentoase (streptomicete i fungi). Prin exprimarea acestor valori pe o scar semilogaritmic rezult o dreapt. Dac unghiul pantei acestei drepte este mic aceasta se datoreaz condiiilor de cretere, care nu sunt din cele mai favorabile. Dei celulele produc o modificare a mediului de cultur prin asimilare de compui nutritivi i eliberarea compuilor de catabolism, n faza logaritmic, rata de cretere rmne constant. Rata de cretere este independent de concentraia n nutrieni atta timp ct acetia se afl n exces. Rata de cretere n biomas X(g x dm-3) este corelat cu rata specific de cretere , n timp ce rata de cretere a numrului de celule este corelat cu rata specific de cretere i densitatea celulelor N. Rata specific de cretere , este dependent de trei parametri: - concentraia substratului limitativ S; - rata maxim de cretere m; - constanta specific dependent de substrat Ks, conform ecuaiei stabilit de Jaques Monod: = m S
Ks + S

Constanta Ks este concentraia substratului la care se obine din rata specific maxim de cretere ( = 0,5 m ) i este echivalent cu constanta Michaelis n cinetica enzimatic. Dac exist un exces al tuturor nutrienilor, atunci = m i cultura se afl deci n faza logaritmic la rata maxim de cretere. Dac unul dintre nutrienii preferai, de exemplu glucoza, s-a epuizat, n prezena altor surse de carbon se observ aa-numitul fenomen de diauxie cnd se poate, dup o nou faz lag, s aib loc metabolizarea noului substrat i creterea exponenial a celulelor. La sfritul fazei logaritmice se acumuleaz o cantitate maxim de biomas, substratul este rapid epuizat i cultura trece n faza staionar de cretere. Rata specific de cretere maxim m, are o importan considerabil n procesele industriale n care se urmrete obinerea de celule i este dependent de natura microorganismului i de condiiile de cultivare. De exemplu, pentru mucegaiuri, aceasta poate s varieze ntre 0,090 i 0,61 h-1. La cultivarea lui Aspergillus niger pe un mediu cu glucoz la 30oC s-au obinut o rat maxim de cretere m = 0,2 i un timp de dublare al biomasei de 3,46 h. Bacteriile aflate n faza logaritmic au o citoplasm omogen, nu conin substane de rezerv i au o mare afinitate pentru coloranii bazici, datorit coninutului lor mare de ARN. Mrimea lor este constant, depind ns dimensiunile caracteristice speciei. o Faza de ncetinire a creterii corespunde perioadei n care, ca urmare a epuizrii treptate a nutrienilor, reducerea concentraiei n oxigen i acumularea de compui de catabolism ce pot avea efect inhibitor asupra celulelor, creterea ia toate valorile intermediare ntre creterea cu o rat maxim i 0. o Faza staionar de cretere, cnd se stabilete un echilibru ntre numrul de celule care se formeaz prin reproducere i cel al celulelor care se autolizeaz. Cantitatea de biomas

49

poate rmne constant, dei se schimb compoziia celulelor. Datorit lizei unor celule se elibereaz noi substraturi care vor servi drept nutrieni pentru celulele viabile. Aceast faz poate fi prelungit atunci cnd urmrim pstrarea culturii pure, prin modificarea unor factori care scad viteza de metabolism celular; o Faza de declin sau curba de distrugere i inactivare metabolic a celulelor, are loc ca urmare a urmtorilor factori: o lipsa surselor de nutriie i energie; o denaturarea componentelor celulare n prezena substanelor acumulate (alcooli, acizi, .a.); o procentului de celule autolizate. Consecina acestor aciuni conduce, n final, la sterilizarea mediului i, deci, la moartea tuturor celulelor, respectiv la pierderea culturii.

Culturi discontinue sincrone

n cazul culturilor bacteriene obinuite diviziunile celulelor individuale urmeaz ritmuri proprii, n aa fel nct rezult o populaie eterogen, format din indivizi aflai, practic, n toate fazele ciclului lor de cretere i multiplicare. Chiar n cazuri speciale, n care pornim de la o singur celul, se constat c la descendenii acesteia, dup o perioad de diviziune sincron apar diferene decurgnd din timpul diferit dnecesar celulelor progene sa se divid. Culturile cu cretere sincron sunt selecionate din culturi asincrone i conin organisme foarte asemntoare deoarece aparin aceleiai categorii de vrst i/sau de dimensiune i ca urmare se divid aproape simultan. Procesul de diviziune sincron dureaz numai cteva generaii (2-3) deoarece diferenele individuale determin procese de defazare n ritmul de cretere, chiar ntre descendenii unei singure celule. Tehnicile de obinere ale culturilor sincrone pot fi grupate n dou categorii: A. Tehnici bazate pe selecie dup dimensiuni de vrst: filtrarea prin teanc de hrtii de filtru suprapuse; separarea prin centrifugare n gradieni de densitate nemetabolizabili de microorganismul studiat; separarea prin filtrare pe filtre de membran. B. Tehnici bazate pe modificri ale mediului, pot fi utilizate n numerase variante: expunerea microorganismelor auxotrofe la o perioad de nfometare, n medii fr n factor de cretere esenial, nainte de a fi trecute ntr-un mediu complet; expunerea la doze subletale de radiaii; expunerea la aciunea unui antibiotic care inhib sinteza proteinelor; expunerea microorganismelor fotosintetizante alternativ la ntuneric i lumin; expunerea alternativ, unic sau repetat, la temperaturi optimale i suprasau suboptimale pentru cretere.

Culturi continue
Anumite procese experimentale de laborator sau de producie industrial necesit prezena unor bacterii n faz exponenial de cretere, ceea ce nu se poate realiza timp ndelungat n condiiile obinuite de cultivare, ntr-in spaiu nchis, respectiv ntr-un volum fix de mediu nerennoit, n care faza exponenial are un numr limitat de generaii, iar unele condiii de mediu devin limitante. Obinera culturilor continue se realizeaz cu ajutorulunui dispozitiv numit chemostat baza pe principiul diluiei ontinue n volum constant.

50