Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Microbiologie Medicală Vol PDF Mircea Popa PDF
Microbiologie Medicală Vol PDF Mircea Popa PDF
1 (2010) curs
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o 46. Bacilii Gram-pozitivi nesporulai. Genul Corynebacterium (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Cristiana
Cerasella Dragomirescu) - 383
o 47. Ali bacili Gram-pozitivi nesporulai de importan medical (Gabriela Loredana Popa, Alina Borcan,
MI Popa) - 385
o 49. Genul Clostridium. Clostridium tetani (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 386
o 50. Clostridium botulinum (Gabriela Loredana Popa) - 392
o 51. Clostridiile gangrenei gazoase (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 396
o 52. Genul Mycobacterium. Mycobacterium tuberculosis (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Henriette
Stavri, D Stavri) - 410
o 53. Germeni spiralai. Genul Treponema. Treponema pallidum (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 422
o 54. Genul Borrelia (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 436
o 55. Genul Leptospira (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 442
Utiliznd aceste reguli precum i diferitele tehnici microbiologice, Koch a descoperit bacilul
tuberculos (bacilul Koch), bacilul holeric, etc., precum i modul de transmitere pentru
numeroase alte boli infecioase (Babessia, Trypanosoma, Plasmodium etc.). Descoperirile
menionate au reprezentat debutul bacteriologiei, micologiei, virusologiei, parazitologiei i
imunologiei ca tiine. n doar aproximativ 15 ani (dup 1880) au fost descoperite i izolate n
cultur pur microorganisme implicate n multe dintre bolile infecioase importante. Aceste
descoperiri au fcut posibil stabilirea ca entiti bine definite a medicinei preventive i
respectiv a terapiei specifice (etiologice).
Ilia Mecinikov a evideniat modul natural de aprare a organismului fa de agenii infecioi
prin anumite celule care au proprieti fagocitare i a scris n 1901 primul tratat de imunologie.
n coala german apar o serie de nume celebre, cum ar fi Behring, care a studiat toxinele
bacteriene, imunitatea umoral i seroterapia precum i Paul Ehrlich (1854-1915). Cercetrile lui
Ehrlich stau la baza chimioterapiei antimicrobiene. Prin utilizarea derivailor arsenicali n
tratamentul sifilisului ipotezele sale au fost confirmate. Mai mult dect att, n anul 1878 Ehrlich
realizeaz c exist diferene de afinitate tinctorial fa de coloranii pe baz de anilin.
Aceast descoperire l ajut s studieze efectul diferitelor substane chimice, dar st i la baza
apariiei coloraiilor n microbiologie.
Ehrlich arat c mycobacteriile au proprietatea de acido-rezisten iar doi ani mai trziu (1884),
cercettorul danez Christian Gram pune bazele coloraiei care i poart numele i care are o
remarcabil utilitate dup aproape 125 ani de la aceast descoperire.
Dei asistena medical ntr-o anumit form a existat nc de la debutul vieii umane pe
pmnt, nceputurile nursing-ului profesional au fost realizate de ctre Florence Nightingale
(1820-1910), care a nceput munca sa cu mai bine de 140 de ani n urm, n cursul rzboiului din
Crimeea (1854-1856). Descoperirile ulterioare, privind relaia dintre microorganisme i boal, au
necesitat dezvoltarea unor proceduri de nursing mai complexe i mai rafinate dect cele
utilizate de ngerii din Crimeea.
Descoperirea msurilor profilactice precum administrarea de vaccin variolic (1796), de toxoizi i
antitoxine (n difterie i tetanos), a serurilor imune (von Behring, Frnkel i Kitasato, 1890), a
vaccinurilor polio i rujeolos (Enders, Weller i Robins 1949; Salk 1954; Sabin i alii, 1954-1967),
precum i utilizarea de gama globuline pentru prevenirea pojarului, rabiei, tusei convulsive etc.,
au fcut necesar dezvoltarea de noi concepte i educaie n prepararea i administrarea
acestor substane.
Identificarea cilor de transmitere a infeciilor a condus la dezvoltarea de metode eficace de
prevenire a rspndirii bolilor. n 1895, sir Ronald Ross (1857-1932), medic militar n India, a
demonstrat transmiterea agentului etiologic al malariei prin intermediul narilor. Parazitul a
fost vizualizat n eritrocitele umane n 1881 de ctre Laveran, chirurg al armatei franceze n
Algeria. n 1900 a fost demonstrat transmiterea virusului febrei galbene de ctre o specie
particular de nari (Aedes aegypti), n Cuba.
Descoperirea unor teste de diagnostic n domeniul microbiologiei a necesitat o pregtire
microbiologic mai avansat a medicilor, asistentelor i a altor profesioniti ai sntii n
7
metode pentru colectarea produselor i raportarea specific de laborator, astfel nct terapia s
demareze ct mai precoce. Descoperirea de substane chimice specifice (de exemplu
sulfonamidele, Domagk 1935) i substane antibiotice (de exemplu penicilina, streptomicina,
tetraciclina i cloramfenicolul) a contribuit la mbuntirea modului de abordare medical a
problematicii bolilor infecioase. Primul medicament anti-tuberculos este descoperit n anul
1944 (streptomicina - Scharty, Bugie, Waksman).
Procedurile chirurgicale moderne ar fi imposibile fr dezinfecie i sterilizare. Industria laptelui,
a conservelor, a hranei ambalate i congelate sunt dependente de microbiologie. Sanitaia
sistemelor de ap i tratarea apelor poluate sunt posibile numai datorit cunotinelor
acumulate prin microbiologie n cursul ultimului secol. n multe moduri profesiunea medical i
fiecare latur a ei este dependent de cunoaterea, nelegerea i utilizarea informaiilor din
microbiologie.
La coala romn de microbiologie nfiinat de profesorii Victor Babe (1854-1926) i Ion
Cantacuzino (1863-1934) s-au pregtit multe generaii de microbiologi, viitori cercettori i
profesori, care au contribuit la dezvoltarea microbiologiei din ara noastr.
Victor Babe s-a nscut la Viena n anul 1854, a studiat la Facultatea de medicin din Budapesta,
apoi n Viena unde a fost numit preparator la catedra de Anatomie condus de profesorul
Lauder. Ulterior este recomandat pentru a deveni asistent la catedra de Anatomie patologic la
Facultatea de medicin din Budapesta. A fost n acelai timp anatomopatolog i microbiolog. A
fost att elevul lui Robert Koch, ct i al lui Louis Pasteur. A fost numit docent i profesor la
Facultatea de medicin din Budapesta la o vrst foarte tnr (27 ani). Cu patru ani mai trziu,
n anul 1885, public mpreun cu A.V. Cornil primul tratat de bacteriologie medical din lume
(n 1891 apare a treia ediie a tratatului). A doua ediie a acestui tratat se afl n Biblioteca
Institutului Naional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie i Imunologie Cantacuzino.
Victor Babe a demonstrat importana introducerii tehnicilor microbiologice n
anatomopatologie. Ar putea fi menionat i faptul c pe parcursul celor 10 ani de activitate la
Facultatea din Budapesta, a dat indicaiile necesare pentru construirea unui nou Institut de
anatomie patologic iar n cadrul acestuia a unei secii dedicate bacteriologiei. A evideniat
proprietile neutralizante ale serurilor imune, a descoperit corpusculii metacromatici ai
bacilului difteric (Babe-Ernst), o nou metod de preparare a serului antidifteric etc. n 1886 a
fost numit profesor de anatomie patologic i bacteriologie la Facultatea de Medicin din
Bucureti. Este fondatorul Institutului de Bacteriologie pe baza cruia s-a dezvoltat actualul
Institut Victor Babe. n 1889 a preparat vaccin antirabic, ara noastr fiind a treia ar din
lume care a reuit s prepare acest vaccin. A condus institutul creat pn aproape de sfritul
zilelor sale, care a fost la puin timp dup pensionarea sa.
Din pcate, n ciuda monumentalitii sale, nu a fost posibil s fie gsit un spaiu n care s-i
poat continua cercetrile i dup pensionare, lucru din pcate mult prea des ntlnit n istoria
medicinei noastre.
Cu privire la poziia acestui mare cercettor precum i la situaii care par a fi foarte
asemntoare peste ani, n ciuda trecerii timpului i a speranei c evoluia societii noastre
este ntr-o direcie pozitiv, vom prezenta n continuare un fragment din discursul profesorului
Victor Babe, inut la Universitatea din Cluj n anul 1919. Astzi lumea civilizat ateapt deci
8
lucruri mari din partea noastr; nu mbogirea oligarhiei politice n afaceri, certuri politice,
persecuiuni i denunuri infame pentru interese egoiste i nguste, ci pstrarea i sporirea celor
mai valoroase achiziiuni ale omenirii: sntatea, prosperitatea, fora, justiia, instruciunea i
tiina, spre a asigura pacea i progresul i prin ele fora i fericirea poporului romn, servind de
exemplu popoarelor din Orient.
Dar politica noastr de pn acum n-a fcut dect s ne duc n cea mai mare desorganizare,
desbinare i dezastru economic, permind prin egoism i nepsare ca rnimea s fie azi
degenerat, analfabet, lipsit i ndatorat peste msur; politicienii notri au reuit s oprime
toate valorile, nlocuindu-le prin clientela lor politic; au adus funcionarismul, birocratismul,
nepotismul la culme; politicienii notri n nepsarea lor pentru interesele rii au lsat armata la
nceputul rzboiului aproape nepregtit n clipele cele mai periculoase prin care a trecut ara i
din care nu ne-a scpat dect vitejia fr pereche a soldatului romn.
Trebue s ne ntrebm dac nu acest politicianism este cauza tuturor relelor i dac nu este o
datorie patriotic s ntrebuinm toate mijloacele necesare ca s-l nimicim i s-l nlocuim cu o
alt putere care s ne garanteze regenerarea i progresul.
n adevr trebue s fim profund ngrijai i s ne ntrebm nainte de toate cum vom putea s
eim din acest dezastru i cum vom putea face fa creanei mari pe care am contractat-o fa
de lumea civilizat.
Publicul care, pn deunzi, a observat la guvernanii notri aceleai viiuri politice, aceeai
nepsare pentru interesele reale ale rii, acelai nepotism, aceeai venalitate, acelai egoism
care ne-a condus la degenerare ca i nainte rzboiului, ateapt cu nerbdare o schimbare
radical a moravurilor politice care s ne pun n poziiunea de a ndeplini mreaa noastr
misiune.
Fa de aceste adevruri ar fi trebuit s ne ateptm ca Romnia nou s pun piciorul n prag i
s rup odat pentru totdeauna cu vechiul politicianism. ns ce vedem spre profunda noastr
descurajare; c aceeai principii dezastruoase, egoiste, aceeai fraze goale domin i politica de
astzi i c mergem orbi nainte spre un dezastru sigur. n loc ca ntinderea i bogia acestei ri
binecuvntate s ne asigure un loc de frunte i stare economic briliant, ne gsim astzi n
deplin faliment, expui ruinei i foametei i mai mult dect oricnd sub dependena i
exploatarea nemiloas a naiunilor mari.
Ion Cantacuzino a avut o personalitate cu totul deosebit, imposibil de cuprins ntr-o trecere
att de sumar prin istoricul microbiologiei. A studiat la Paris Filozofia i Literele, tiinele
naturale i Medicina. Pregtirea n microbiologie a desvrit-o pe parcursul a 9 ani, n
laboratorul lui Ilia Mecinikov, la Paris. A cunoscut mai multe limbi strine, inclusiv latina i
greaca. A studiat la Paris i a revenit n ar pentru satisfacerea stagiului militar (geniti, Jilava).
A continuat studiile n Frana (tiine naturale 1886, medicin 1887). Lucreaz n Institutul
Pasteur ncepnd cu 1892, devine doctor n medicin n 1894 i este numit profesor suplinitor
de Morfologie animal la Facultatea de tiine din Iai (1894). A fost numit profesor la
Facultatea de Medicin din Bucureti n anul 1901 i a grupat n jurul su un mare numr de
tineri medici, care au devenit la rndul lor ndrumtori i creatori de coal (Al. Sltineanu, C.
11
Datorit eforturilor depuse, incidena i prevalena anumitor boli infecioase a sczut. Trebuie
avut ns n vedere emergena i re-emergena diferitelor maladii.
Microbiologul, medicul clinician i asistenta medical trebuie s aplice cunotinele de
microbiologie n practica de zi cu zi. Dei anumite tehnici pot fi nvate din rutin, persoana cu
adevrat profesionist nelege faptele tiinifice precum i principiile aflate la baza acestor
tehnici. Profesionistul tie de asemenea n ce mod ar trebui adaptate aceste tehnici n cazul
anumitor tipuri de pacieni (ex. pentru cei supui chirurgiei cardiace, pacienilor care au suferit
arsuri pe suprafee ntinse), ce tehnici trebuie utilizate n slile de operaie, de ateptare i n
instituiile unde sunt ngrijii copii mici sau foarte mici, cum pot fi modificate acestea n condiii
de urgen (de exemplu n caz de rzboi sau alte calamiti produse de om sau calamiti
naturale) i cum trebuie fcut informarea pacienilor, populaiei, de exemplu referitor la
imunizri. Un membru antrenat al echipei medicale poate s diferenieze adevrul de
interpretarea greit i / sau dezinformarea din aa-zisa literatur medical scris pentru
publicul larg i poate recunoate erorile aprute n mass media, dac are noiunile necesare de
microbiologie.
Persoanele care lucreaz n domeniul sanitar dar i orice alt persoan realmente interesat,
constat sau pot constata c n aproape orice activitate cotidian exist o aplicabilitate a
cunotinelor microbiologice.
Povestiri Adevarate
1.1.1. Girolamo Fracastoro (1478-1553)
S-a nscut ntr-o veche familie de medici. A fost coleg la Facultatea de Medicin cu Nicolaus
Copernicus (astronom i medic). S-a ocupat att de medicin ct i de astronomie, matematic,
poezie, geografie, muzic etc.
Poate fi considerat un bun diagnostician; este primul medic care a fcut diferena ntre cium i
tifosul exantematic (au existat 2 izbucniri epidemice de tifos, analizate de aceast minte
luminat, n 1505 i n 1528). Se poate spune c a descris corect din punct de vedere
epidemiologic, n lumina datelor cunoscute la acea vreme, ciuma, variola, febra tifoid i tifosul
exantematic.
A scris mai multe lucrri n domeniul medical, care cuprind informaii incredibil de corecte,
dintre care unele au fost confirmate ulterior aproape n totalitate.
Prima dintre aceste lucrri a fost scris n versuri i se pare c a fost publicat la Veneia
[Syphilis sive morbus Gallicus (Sifilisul sau boala galic), 1530, trei volume; numele se datoreaz
faptului c se presupune c sifilisul ar fi fost rspndit n Italia de trupe franceze asediatoare]. n
primele dou volume, Fracastoro descrie cu bune amnunte sifilisul; a descris i luesul ca
entitate n cadrul acestei patologii, a discutat modalitile de debut i chiar diferenele ntre cele
trei stadii ale bolii. Apar menionate i informaii despre modaliti de diagnostic i tratament
(vapori de mercur, mixturi din sulf, mercur i extracte vegetale etc). n aceast scriere sunt
discutate chiar i metode de prevenie. n al treilea volum, Girolamo Fracastoro prezint date
12
privind cltoriile lui Columb n Indiile de Vest (se pare c boala era foarte rspndit printre
btinai) dar i o poveste din mitologie, povestea pstorului Syphil (numele sifilisului are, se
pare, o vechime foarte mare) care a fost pedepsit de zeul Apollo, tocmai prin aceast boal.
Lucrarea De contagione, contagionis morbis et eorum curratione (Despre contagiune, boli
contagioase i tratamentul lor), publicat tot la Veneia, la vrsta de 68 de ani, include toate
cunotinele i teoriile lui Fracastoro referitor la bolile contagioase ale acelor vremuri. n mod
uimitor, cu sute de ani nainte ca aceste aspecte s fie studiate i parial demonstrate tiinific
de ctre Louis Pasteur, ntr-o vreme cnd bolile erau considerate drept pedeapsa zeilor, teoria
miasmelor morbigene a lui Hipocrate este combtut iar Fracastoro emite ipoteza conform
creia bolile contagioase sunt transmise prin intermediul unor fiine invizibile [Seminaria
morborum (seminele bolilor)]. Dup mai mult de 130 de ani, Antony van Leeuwenhoeck
utilizeaz microscopul pentru a studia cteva dintre microorganisme. n plus, Girolamo
Fracastoro discut cile de intrare a seminelor bolii n organism: a. pe gur, b. prin respiraie,
c. prin rni, d. direct prin piele. Mai mult dect att, clasific contagiul drept fiind de trei
feluri: a. prin contact direct (ex. n tuberculoz, lepr, sifilis); b. prin contact indirect, prin
fomites (haine, aternuturi, farfurii) i c. la distan (seminele morbigene fiind purtate la
distan de ctre vnt, ploaie, apa rurilor etc., ca n cazul ciumei). Cu toate c a oferit incredibil
de multe explicaii, cu toate c teoriile sale au fost n bun parte confirmate ulterior, la acea
vreme nu au fost acceptate iar teoria miasmelor morbigene a fost pentru nc mult timp
considerat ca fiind valabil.
Cu toate acestea, se poate spune c Girolamo Fracastoro poate fi recunoscut n istoria
medicinei ca printele patologiei infecioase.
revenire sus
14
Toate aceste fapte au fost realizate cu mijloace improvizate, ntr-un modest laborator de
nvmnt, n care ncperea cea mai impuntoare - sala de lucrri practice pentru studeni nu putea primi deodat mai mult de 25-30 de persoane. Conducerea profesorului crea o
atmosfer de munca entuziast i dezinteresat, o motivaie admirabil printre colaboratori.
Personalul tehnic se ntrea, numrul asistenilor benevoli de asemenea. Prin activitatea
practic, laboratorul putea pune la ndemna studenilor mijloace de lucru care nu puteau fi
gsite ntr-un simplu laborator universitar. Institutul Cantacuzino, exista de fapt. Rzboiul din
1916-1918 a demonstrat imperios promovarea unei legi dedicate nfiinrii, aa cum am
menionat. De altfel, istoria nu se schimb; n ultimii 20 de ani aproape fiecare pas realizat n
dezvoltarea sistemului de sntate public din Romnia a beneficiat de cte o problem de
sntate care a demonstrat autoritilor (cel puin pentru o perioad de timp) c este necesar
o intervenie concret.
Mijloacele improvizate nu mai puteau fi suficiente pentru o ara ntregita, cu o populaie de
trei ori mai mare i care suferise pe timpul i din cauza ocupaiei strine. n reorganizarea
sanitar a rii, s-a impus, ca o msur de prim necesitate, organizarea unui Institut central de
seruri i vaccinuri, echipat n aa fel nct s corespund nevoilor considerabil crescute ale
Romniei Mari, institut de producie, de cercetare dar i de nvmnt.
Prin Legea din 1921, graie guvernului de atunci, s-a creat o instituie avnd urmtoarele
scopuri:
- s prepare toate serurile, vaccinurile, precum i alte produse similare, necesare n profilaxia i
tratamentul specific al maladiilor infecioase din ar;
- s fac toate lucrrile necesare pentru cercetarea tiinific a acestor maladii i s stabileasc
metodele tip pentru serologie i de microbiologie;
- s serveasc drept organ de control pentru toate analizele bacteriologice i s-i dea avizul n
ce privete introducerea n ar a serurilor i vaccinurilor preparate aiurea;
- s pregteasc medici specialiti n microbiologie;
- s tipreasc publicaii periodice n legtur cu activitatea tiinifica a acestui Institut, precum
i cu activitatea medical i biologic din ntreaga ar.
Institutul prepara i da spre ntrebuinare numai serurile i vaccinurile care fceau dovada
eficacitii lor. n acelai timp, n laboratoarele institutului se cerceta i se ncercau metodele
noi de diagnostic microbiologic i serologic, sau de tratament.
Una dintre remarcabilele realizri ale cercetrilor din institut a fost realizarea vaccinului BCG i
nceperea vaccinrii tuturor copiilor. La acea vreme vaccinul BCG se mai producea numai n
cadrul Institutului Pasteur din Paris.
Astzi n cadrul institutului exist laboratoare naionale de referin (multe dintre acestea fiind
certificate internaional, de ctre Organizaia Mondial a Sntii), inclusiv un laborator foarte
performant de biologie molecular. Producia nc mai continu, chiar dac preparatele pentru
uz uman includ n principal (doar) vaccinul gripal sezonier. Anul trecut, INCDMI Cantacuzino a
15
fost una dintre puinele instituii la nivel mondial care a reuit s produc n timp util vaccinul
gripal pandemic.
n cldirea principal se gsete sala de curs i lucrri practice n care se pred bacteriologie,
noiuni de imunologie i micologie, pentru studenii de anul doi ai facultii de medicin. La
parter exist sala de curs i seminarii pentru studenii din anul cinci, epidemiologie.
Institutul Cantacuzino rmne cel mai important centru de cercetare din Romnia. n ceea ce
privete capacitatea de producie, existena acestuia este indispensabil (oricrei ri). Avem
sperana c n ciuda anumitor evenimente din ultimii ani, nu vom vorbi niciodat despre Acest
Institut la timpul trecut, ci doar la prezent i viitor.
16
Forma
2. 2. 1. n funcie de form, bacteriile se pot grupa n mai multe categorii i pot avea:
a). form cocoidal, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat. Majoritarea
steptococilor i stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt lanceolai,
gonococii i meningococii pot fi reniformi.
Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultur n care se dezvolt, de vrsta culturii
bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum i de modul n care are loc diviziunea n cursul
procesului de cretere i multiplicare (planul de diviziune).
Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele genuri
de bacterii, de ex.:
- stafilococii sunt coci sferici dispui n grmezi (ciorchine);
- pneumococii sunt coci lanceolai dispui doi cte doi, eventual nconjurai de o capsul
comun (n diplo);
- streptococii sunt coci dispui n lanuri etc.;
17
b). form de bastona (bacili, rods), drepi cu capetele uor rotunjite (enterobacterii), drepi
cu capetele tiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuite
(Fusobacterium nucleatum), dispui uneori ntr-un mod caracteristic (de exemplu n palisade,
ca i scndurile dintr-un gard - bacilii pseudodifterici);
c). aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus);
d). actinomicete, care n culturi tinere formeaz filamente lungi, ramificate (asemntor
mucegaiurilor); aceste filamente se fragmenteaz i rezult aspecte bacilare (ex. Actinomyces
israelli);
e). forma spiralat (bacili curbi - V. cholerae, spirili i spirochete - T. pallidum).
Unele bacterii, chiar i atunci cnd rezult prin multiplicarea unei singure celule mam
prezint un pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.).
n culturi vechi sau sub influena unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu
antibiotice etc., pot aprea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care pot
crea confuzii de diagnostic pentru examinatorul fr experien sau care nu face o examinare
innd cont de context. Dac are loc repicarea acestora pe mediu de cultur proaspt iar
examinarea ulterioar se face la timpul potrivit (avnd n vedere durata optim de multiplicare)
vor rezulta forme tipice pentru specia respectiv.
Dimensiunile
2. 2. 2. Dimensiunile variaz n funcie de gen, specie, condiiile de mediu, vrsta i stadiul de
dezvoltare al culturii. n general bacteriile au dimensiuni de ordinul micrometrilor, de exemplu,
pentru coci 0,5-2 m, iar pentru bacili 0,3-2/0,5-10 m. Dintre bacteriile vizibile la microscopul
optic, Francisella tularensis (discutat astzi n legtur cu posibile atacuri teroriste) poate avea
dimensiuni mici, de circa 0,3-0,6 m / 0,2 m. Rickettsiile, chlamydiile i mycoplasmele nu sunt
vizibile la microscopul optic datorit dimensiunilor foarte mici. Flagelii pot atinge dimensiuni de
pn la 10m. Formele filamentoase rezultate dup tratamentul cu antibiotice pot depi
aceast dimensiune. Bacteriile din genul Proteus pot prezenta n mod natural forme
filamentoase, de dimensiuni mari.
Dac n 1993 a fost pus n eviden Epulopiscium fishelsoni (60-800 m / 200-500 m), cea mai
mare bacterie cunoscut astzi este Thiomargarita namibiensis, o proteobacterie Gram
negativ, potenial vizibil cu ochiul liber (dimensiuni ntre 100300 m i pn la 750 m).
(1999)
Datorit dimensiunilor mici, bacteriile pot fi vizualizate numai cu ajutorul microscopului, fie
clasic, cu lumina transmis direct, atunci cnd utiliznd un ocular cu o mrire de 10 i un
obiectiv (de imersie) cu o mrire de 90-100 X, se realizeaz o amplificare a dimensiunilor
bacteriene de circa 900-1.000 X, fie utiliznd alte tipuri de microscoape. Spre exemplu,
utilizarea preparatelor colorate prin metode n care marcajul se face cu subtane fluorescente
va crete puterea de rezoluie iar numrul de cmpuri investigate poate fi mai redus n
18
comparaie cu investigarea unui preparat colorat clasic (a se vedea capitolul referitor la genul
Mycobacterium).
Iluminarea n cmp obscur permite examinarea preparatelor proaspete i evidenierea
agentului etiologic al sifilisului (T. pallidum), agentul etiologic al leptospirozei (Leptospira spp.),
inclusiv mobilitatea acestora.
Informaii privind preparatele microscopice, executarea i colorarea frotiurilor, tehnica
examenului microscopic n diagnosticul microbiologic sunt prezentate n anexa nr. 1.
Att din punct de vedere structural ct i funcional, exist o serie de asemnri ntre celula
procariot i celula eucariot. Bacteriile prezint att elemente structurale interne ct i
structuri externe care pot i merit a fi studiate avnd implicaii n relaiile dintre celula
bacterian i organismul gazd. Exist dou tipuri de elemente structurale, unele dintre acestea
fiind ntlnite la toate speciile de bacterii (constante), altele fiind ntlnite numai n anumite
condiii i doar la anumite specii sau tulpini bacteriene (facultative).
21
Swedberg dar sunt constituii din dou subuniti de cte 30S i respectiv 50S. n subunitatea
mic intr o singur molecul de ARNr, 16S i 21 de tipuri de proteine ribozomale. n
subunitatea mare intr mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S). ntre cele dou
subuniti se formeaz canalul prin care trec moleculele de ARNm (mesager) n cursul sintezei
proteice. Se apreciaz c ntr-o bacterie cu dimensiuni medii, aflat n faza de cretere activ, se
sintetizeaz circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens.
Ribozomii au rol esenial n procesul de biosintez proteic. Au tendina de a se grupa n
polisomi (poliribozomi) cu eficien sporit n biosinteza proteic. n aceste condiii, la un
moment dat pe aceeai molecul de ARNm se afl n scopul traducerii mesajului genetic mai
muli ribozomi, care constituie un ansamblu care poart numele de polisom.
Biosinteza proteic
Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor.
Cu toate c secvena de aminoacizi din structurile proteice este dictat de secvena de baze
azotate din ADN, pentru c nu exist afinitate i posibilitate de cuplare ntre ADN i aminoacizi
este necesar ca o alt structur s permit poziionarea aminoacizilor n lanul viitoarei
proteine.
Iniial are loc transcrierea informaiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta aceast
informaie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este
segmentul de ADN care deine informaia genetic pentru sinteza unei proteine. Segmentul de
ADN care controleaz sinteza unui polipeptid poart numele de cistron.
ARNm care deine informaia genetic pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poart
numele de ARNm monocistronic.
La bacterii, de obicei, o molecul de ARNm trebuie s poarte informaia necesar pentru sinteza
mai multor catene diferite i n acest caz ARNm poart numele de ARNm policistronic. Aceast
situaia particular este datorat dimensiunii mici a acestor procariote precum i
metabolismului intens care are loc n cursul procesului de cretere i multiplicare. Spre exemplu,
la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenial 3 enzime diferite, iar mesajul
genetic pentru sinteza acestora se afl deinut de o singur molecul de ARNm policistronic.
De regul, numai o caten de ADN este folosit drept matri pentru ARNm. Transcrierea
mesajului genetic este selectiv (se desfoar ntre promotor i semnalul de terminare) i este
controlat de ARN polimeraza ADN-dependent.
Pentru traducerea mesajului genetic este necesar intervenia la nivel ribozomal a moleculelor
de ARNt (de transfer). Acestea au o dubl specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de
aminoacizi exist una sau mai multe molecule de ARNt; n acelai timp exist enzime specifice
fiecrui tip de aminoacid care controleaz legarea corect a aminoacizilor activai pe ARNt
corespunztor). La nivelul fiecrui ARNt exist trei nucleotide (anticodon) complementar
codonului care corespunde aminoacidului.
23
ARNt nu are niciodat la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU i n aceste condiii ne
putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG i UGA sunt codoni stop.
Succesiunea specific a nucleotidelor este transpus ntr-o secven specific de aminoacizi care
intr n constituia lanului polipeptidic din proteina n curs de formare.
2. 3. 1. 6. Incluziile
Incluziile sunt formaiuni care apar n citoplasm la sfritul perioadei de cretere activ.
Dimensiunea i forma incluziilor citoplasmatice pot varia n funcie de condiiile externe. Pot
conine polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai genului Corynebacterium,
la a cror descoperire a avut un rol important Profesorul Victor Babe), substane anorganice
simple, polimeri organici (rezervor energetic mai ales la germenii sporulai aerobi), lipide,
cristale, granulaii de sulf etc.
2. 3. 1. 7. Vacuolele
Vacuolele sunt formaiuni sferice care conin diferite substane n soluie apoas. Au o
membran lipoproteic numit tonoplast. Au fost descrise n mai ales la bacteriile acvatice i ar
putea avea un rol n plutirea acestora.
2. 3. 1. 8. Nucleul
Masa nuclear vine n contact direct cu citoplasma. Este localizat n partea central a celulei.
Conine ADN, nu are nucleoli. Are afinitate pentru coloranii bazici, dar pe preparatele colorate
uzual este mascat de bazofilia intens a citoplasmei bogat n ARN.
Unicul cromozom bacterian este alctuit dintr-o singur molecul de ADN dublu catenar, cu
aspectul unui fir lung (1.000-2.000 m), nchis ntr-un inel i replicat pe el nsui, superspiralat.
Mrimea cromozomului poate s difere n funcie de specia bacterian (i respectiv numrul de
perechi de baze); cea mai mic celul bacterian ar fi cea de Mycoplasma spp., la care
dimensiunea este de 4.700 kpb, n timp ce cromozomul de E. coli poate avea o dimensiune de
circa 3 ori mai mare. Avnd n vedere c dimensiunea bacteriilor este de circa 1-2 mm n cazul
cocilor i de cteva ori mai mare n cazul bacililor, pentru ca materialul genetic s poat fi
coninut n acest spaiu redus, acesta trebuie s fie compactat ntr-un mod remarcabil i astfel,
rezult nucleoidul bacterian care poate fi difereniat microscopic. Nucleoidul este format din
molecula de ADN asociat cu proteine i o cantitate variabil de ARN.
Relativ recent (1989) s-a descoperit c exist i bacterii care dein cromozomi lineari (ex.
Borrelia burgdorferi). Toate speciile din genul Borrelia dein i plasmide lineare.
Replicarea cromozomului bacterian se face printr-un mecanism semiconservativ. Aa cum am
menionat, cromozomul este unic, ns n celula care se dezvolt rapid exist posibilitatea ca
nainte ca prima replicare s se fi ncheiat s se iniieze nc o replicare i n acest caz celula
bacterian va putea fi meroploid (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai
multe ori) sau chiar poliploid (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori). Dac replicarea
cromozomial nu este succedat de diviunea celulei (aa cum se ntmpl n mod obinuit),
putem remarca n celula bacterian existena mai multor cromozomi. Cromozomii suplimentari
24
(n total 2 sau 4) nu aduc o informaie genetic diferit pentru c ei sunt copii ale cromozomului
iniial (identici cu acesta).
Nucleul deine informaia genetic necesar proceselor vitale de cretere i multiplicare.
Codonul
Din punct de vedere funcional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN
formeaz un codon. Codonii dein informaia genetic pentru a plasa ntr-o anumit secven
un anumit aminoacid, n lanul polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul ribozomilor.
Cistronul
Cistronul reprezint o subunitate funcional a genei, capabil s determine independent
sinteza unui lan polipeptidic.
Gena
Gena structural reprezint o poriune a genomului, respectiv o anumit secven de nucleotide
dispuse liniar. Genele structurale reprezint circa 90% din ansamblul informaiei genetice.
Poart nscris n structura sa informaia genetic necesar pentru sinteza unei proteine
specifice, structurale sau funcionale (enzime).
2. 3. 2. Structuri facultative
Structurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsul, cili (flagelii), fimbrii
(pili) i spori (forme de rezisten).
2. 3. 2. 1. Capsula: structur, rol, evideniere
Numeroase bacterii sintetizeaz polimeri organici (de obicei polizaharide) care formeaz n jurul
celulei o matrice fibroas, numit glicocalix.
La unele bacterii glicocalixul ader strns de celula bacterian i reprezint capsula. Exist
bacterii care dein o capsul bine definit, cu structur polizaharidic (S. pneumoniae, K.
pneumoniae, unele tulpini de E. coli etc) sau cu structur polipeptidic (Bacillus anthracis etc).
La alte bacterii, glicocalixul formeaz o reea lax de fibrile care se pierde parial n mediu i
poate fi separat de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibil, care nu este vizibil la
microscopul optic.
Roluri:
- factor de virulen, mpiedicnd fagocitarea bacteriei i favoriznd invazivitatea;
- rezisten fa de surfactani, anticorpi;
- permite aderarea unor bacterii (rol de adezin);
25
26
2. 4. Povestiri adevrate
27
28
n cazul n care ipoteza unei afectri datorit sporilor provenii de la bacterii anaerobe ar fi fost
emis de la nceput i dac nu s-ar fi instituit (la o parte dintre cazuri) antibioterapia empiric cu
antibiotice / chimioterapice cu spectru larg anterior recoltrii probelor, procentul de infecii cu
etiologie confirmat ar fi putut s fie mai mare.
S-au emis mai multe comunicate de pres pentru a pune n tem populaia i pentru a alerta
comunitatea medical i pe eventualii consumatori de droguri.
2. 4. 2. Capsula bacterian
Multe s-au scris despre Neisseria meningitidis, meningococul, rspunztor pentru izbucniri
epidemice de meningit, cu urmri ngrijortoare (decese, sechele). Infeciile meningococice
rmn nc o problem de sntate la nivel mondial iar nelegerea mecanismelor prin care
Neisseria meningitidis eludeaz mecanismele de aprare ale gazdei este foarte important.
Meningococul determin boala prin invazivitate i multiplicare, adernd la celulele umane i
invadndu-le ns dup aceast etap procesul rmne, n mare parte, un mister.
Unul din atributele de patogenitate ale meningococului este reprezentat de capsula
polizaharidic, cu un rol clar demonstrat n supravieuirea bacterian n fluidele extracelulare.
Studii recente au artat c aceeai structur contribuie i la supravieuirea intracelular.
Sistemul complement este unul dintre factorii de aprare foarte importani n protecia
subiecilor fa de infecia cu N. meningitidis; totui acest microorganism s-a adaptat i a
dezvoltat mecanisme proprii de protecie anti-complement.
Structurile bacteriene de genul capsulei polizaharidice precum i cele care imit structurile
proprii (self) ale gazdei sau leag molecule proprii organismului salveaz germenul de la liz
celular i fagocitoz. Se pare c Neisseria meningitidis i folosete eficient proprietile, att
extra- ct i intracelular.
Prin inocularea de tulpini capsulate i necapsulate marcate izotopic n culturi celulare de celule
fagocitare i nefagocitare umane s-a ncercat monitorizarea invazivitii i multiplicrii
intracelulare. Rezultatele au fost surprinztoare deoarece capsula, care diminueaz capacitatea
de aderare la membrana celular i de intrare a germenului n celul, este esenial pentru
supravieuirea intracelular a microorganismului. Un posibil mecanism prin care se produce
aceast supravieuire ar fi cel al rezistenei capsulare la peptidele cationice antimicrobiene
(CAMPs cationic antimicrobial peptides), componente ale sistemului imun nnscut.
Degradarea intracelular a bacteriilor internalizate poate fi legat de o multitudine de
mecanisme, printre care aciunea pH-ului, stresul oxidativ sau aciunea enzimelor litice i a
peptidelor antimicrobiene. Teoretic prezena capsulei ar putea interfera, direct sau indirect, cu
oricare din aceste mecanisme. n particular s-a evideniat deja medierea rezistenei pentru
Klebsiella pneumoniae la CAMPs de ctre capsula sa, polizaharidic.
n ceea ce privete capsula N. meningitidis, studii preliminare au artat deja c tulpinile
necapsulate sunt mai susceptibile aciunii defensinelor, protegrinelor i polimixinei B,
asemntoare CAMPs. Polimixina B, un peptid ciclic de origine microbian, a fost folosit ca
model al CAMPs datorit proprietilor ei de permeabilizare a membranei externe a germenilor
29
2. 5. Direcii de cercetare
1. Bader J, Albin A, Stahl U, Spore-forming bacteria and their utilisation as probiotics, Benef
Microbes 2012 Mar 1; 3(1):67-75
2. Beceiro A, Toms M, Bou G, [Antimicrobial resistance and virulence: a beneficial relationship
for the microbial world?], Enferm Infecc Microbiol Clin. 2012 Mar 1 (to be published)
3. Salman V, Amann R, Girnth AC, Polerecky L, Bailey JV, Hgslund S, Jessen G, Pantoja S, SchulzVogt HN, A single-cell sequencing approach to the classification of large, vacuolated sulfur
bacteria, Syst Appl Microbiol. 2011 Jun; 34(4):243-59
4. Segura M., Fisher Scientific Award Lecture - The capsular polysaccharides of Group B
Streptococcus and Streptococcus suis differently modulate bacterial interactions with dendritic
cells, Can J Microbiol. 2012 Mar; 58(3):249-60
2. 6. Evaluarea cunotinelor
1. Alegei afirmaia fals:
a. Bacilii au form rotund i se adun n grmezi
b. Haemophilus influenzae este un cocobacil
30
c. Dimensiunile bacteriene sunt de ordinul micrometrilor i din acest motiv bacteriile se pot
examina la microscopul optic
d. Aspectul in diplo este caracteristic pneumococilor
e. Exist bacterii cu dimensiuni foarte mici (ex.: Chlamydia spp. i Mycoplasma spp.) care nu pot
fi vizualizate la microscopul optic
2. Despre componentele structurale ale celulei bacteriene este adevrat urmtoarea afirmaie:
a. Peretele bacteriilor Gram-negative nu conine murein
b. Membrana celular este o structur facultativ
c. Nucleul bacterian este nvelit de membran nuclear i conine numeroi nucleoli
d. Capsula bacterian reprezint un factor de virulen i favorizeaz invazivitatea
e. Bacteriile cu flageli sunt imobile
3. Peretele bacterian:
a. Este o component constant a bacteriilor din toate genurile
b. Este degradat cu uurin sub aciunea lizozimului (muramidazei)
c. Are aceeai grosime att la bacteriile Gram-negative, ct i la cele Gram-pozitive
d. Nu este sediu de aciune pentru nici un tip de antibiotic
e. Conine antigene capsulare
4. Care dintre enunuri este corect n ceea ce privete structurile facultative bacteriene:
a. Sporii bacterieni au rol n replicarea ADN-ului
b. Mobilitatea bacteriilor este dat de fimbrii
c. Sporul este o form de rezisten bacterian
d. Capsula este ubicuitar la toate genurile bacteriene
e. O bacterie nu poate avea mai mult de un singur flagel
5. Sporii bacterieni:
a. Nu se distrug prin autoclavare
b. Sunt forme de rezisten ale bacteriilor i se pot transforma n forme vegetative
c. Nu se vizualizeaz microscopic
d. Pentru orice tip bacterian, sunt localizai n acelai loc i anume central
e. Sunt caracteristici tuturor speciilor bacteriene
31
pot stimula creterea i funcia bacteriei (de exemplu fierul n cazul bacilului difteric, care
condiioneaz i producerea de toxine),
cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi),
cerurile (acizi grai plus alcooli monovaleni superiori), care se gsesc n cantitate mare la
bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. n peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc). Dintre
acestea, ceara D pare a fi implicat n inducerea hipersensibilitii ntrziate (de tip IV).
fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema pallidum
(agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor Gramnegative, cu activitate toxic.
3. 1. Constituia chimic a bacteriilor (b)
3. 1. 6. Pigmenii
Pigmentogeneza este caracteristic bacteriilor cromogene i este dependent de condiiile de
cultivare.
Producerea de pigmeni poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. n cazul tulpinilor de
Pseudomonas aeruginosa sau n cazul unor specii din genul Staphylococcus). Trebuie s reinem
nc de la nceput faptul c n cazul stafilococilor, pigmentogeneza este doar un caracter
orientativ i nu vom clasifica drept patogen o tulpin de stafilococ n funcie de culoarea
coloniei. Stafilococii sunt condiionat patogeni. Testul orientativ privind patogenitatea este
testul coagulazei care ar trebui efectuat n mod obligatoriu pentru toate tulpinile izolate de la
pacieni.
Dup localizarea pigmentului, bacteriile pot fi:
33
Putem aminti i faptul c pigmenii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecie fa de
radiaiile UV (pigmeni carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborat de P.
aeruginosa fa de B. anthracis) i rol enzimatic.
3. 1. 7. Enzimele
n cazul bacteriilor se poate aprecia c metabolismul este foarte intens. Capacitatea de a
elabora anumite enzime este determinat genetic (exist peste 2000 de determinani genetici
diferii), precum i prin mecanisme de control care pot modifica bagajul enzimatic n funcie de
necesiti.
Dup locul de aciune, enzimele bacteriene se pot mpri n:
enzime intracelulare.
n raport cu reacia catalizat, enzimele pot fi: hidrolaze, transferaze, oxidoreductaze, liaze,
izomeraze etc.
Dup modul de apariie, enzimele pot fi:
inductibile (sunt sintetizate de ctre bacterie numai ca rspuns la anumii compui aprui
n mediu).
Studierea comportamentului enzimatic este foarte util n taxonomie. Fiecare unitate
taxonomic bacterian (gen, specie) are un spectru de activitate enzimatic propriu; studierea
acestuia poate avea o deosebit importan n identificarea bacteriilor.
3. 1. 8. Substane cu aciune antibiotic:
unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B.
licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizeaz gramicidina, iar B. polymyxa sintetizeaz
polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astzi, din alte genuri, vezi capitolul nr. 48).
3. 1. 9. Vitaminele bacteriene
Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi secretat de exemplu
de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care poate fi sintetizat de E. coli, riboflavina
sintetizat de B. subtilis, vitaminele B2 i B12 sintetizate de B. megaterium etc. sau vitaminele
din grupurile B i K, care pot fi sintetizate sub influena florei bacteriene intestinale umane.
3. 1. 10. Factorii de cretere
Factorii de cretere sunt metaboliii eseniali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza
substanelor care se gsesc n mediul extern. Factorii de cretere trebuie neaprat inclui n
mediul de cultur n cazul n care dorim s izolm microorganismul respectiv, numit
microorganism pretenios (ex. factorii X i V trebuie inclui n mediul de izolare pentru
Haemophilus influenzae).
34
bacterii autotrofe, capabile s-i sintetizeze toi compuii organici din materie anorganic
i
metabolismului este acela c enzimele par a fi chemate n joc numai cnd activitatea lor este
necesar. Activitatea unei enzime poate fi modificat variind fie cantitatea ei, fie cea a
substratului pe care acioneaz.
n unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuat prin cuplarea unor efectori specifici
(metabolii care moduleaz activitatea enzimatic).
De multe ori, activitatea unei enzime care catalizeaz o etap metabolic iniial este (poate fi)
inhibat de produsul final al cii respective. O astfel de inhibiie nu poate depinde de competiia
pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiia depinde de faptul c enzimele
reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzim are att un situs catalitic de legare cu substratul, ct
i unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori).
Legarea unui efector de situsul su duce la o modificare conformaional a enzimei, astfel nct
afinitatea situsului catalitic scade (inhibiie allosteric) sau crete (activare allosteric).
Cnd o bacterie peritriche se mic, flagelii se asociaz i se mic mpreun, rezultnd o
deplasare liniar. La diferite intervale de timp, bacteria i schimb direcia (flagelii se dau
peste cap). Acest comportament face posibil chemotaxia: o celul care se ndeprteaz de
sursa atractantului chimic i schimb sensul de micare mult mai frecvent n comparaie cu una
care se apropie de atractant i ca o nsumare, bacteria se va deplasa nspre atractant. Spre
exemplu, prezena unui zahar sau a unui aminoacid este sesizat de receptori specifici localizai
pe membrana celular (de multe ori acelai receptor particip i la transportul membranar al
acelei substane). Celula bacterian este prea mic pentru a fi capabil s detecteze existena
unui gradient chimic (n spaiu), dar s-a demonstrat experimental c detecteaz gradienii n
timp (de exemplu, concentraia unei substane scade n timp ce bacteria se ndeprteaz de
surs i crete n timp ce aceasta se apropie de surs).
Anumii compui acioneaz ca respingtori (R), iar alii ca atractani (A). Un mecanism care ar
explica rspunsul celulei fa de A/R ar implica metilarea i respectiv demetilarea unei proteine
specifice din membran, care depinde de GMPc. Atractanii produc o inhibiie tranzitorie a
demetilrii acestei proteine. Respingtorii stimuleaz demetilarea.
Mecanismul prin care o modificare n comportamentul celular se produce ca rspuns la o
modificare de mediu poart numele de transducie senzorial. Aceasta pare s fie responsabil
de:
chemotaxie;
36
prin membran cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reductor frecvent
utilizat este NADPH-ul.
Enzimele catenei respiratorii sunt:
- nicotinice (cu coenzima NAD i NADP);
- flavinice (cu gruparea proteic FMN sau FAD);
- ferice (grupul prostetic conine Fe sub form de derivai ai protohemului, spre exemplu
citocromi, citocromoxidaz, peroxidaz etc).
NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin
mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid).
Pentru sinteza ATP-ului se utilizeaz fosforilarea oxidativ (la nivel de catalizator) cuplat cu
partea terminal a lanului respirator.
Respiraia anaerob (anoxibiotic)
n respiraia anaerob acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substan
anorganic diferit de oxigen sau de orice substan organic (fermentaia); fosforilarea se face
la nivelul substratului.
Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezult prin fermentaia
zaharidelor i reprezint un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere
taxonomic i biochimic. Etapele fermentaiei sunt mai reduse, ctigul energetic fiind mai mic.
De exemplu n cazul genului Clostridium, prin fermentaie acetic se obine 1 mol ATP, iar prin
fermentaie butiric se obin 0,5 moli ATP. Fermentaia butiric a fost descoperit de Louis
Pasteur n anul 1861 (produs de Vibrion butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum). Rolul
biologic al fermentaiei este reprezentat de producerea energiei i nu de obinerea unor produi
finali.
Sinteza ATP-ului
Sinteza ATP-ului se realizeaz prin cuplarea reaciilor de oxidoreducere cu reaciile de
fosforilare.
n respiraia aerob se utilizeaz mai ales fosforilarea oxidativ (la nivel de catalizator) cuplat
cu partea terminal a lanului respirator.
n respiraia anaerob fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii i acceptorii fiind
metabolii anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaia).
Energetica respiraiei bacteriene
Prin fosforilarea oxidativ se pot obine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoz.
Prin fosforilarea substratului se pot obine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoz.
Energia este folosit apoi n procese metabolice de asimilaie.
Tipul respirator
n raport cu utilizarea proceselor pentru obinerea energiei i de relaia cu oxigenul din mediu,
bacteriile se pot grupa n 4 tipuri respiratorii principale (vezi i Tabelul nr. 1):
- strict aerob, atunci cnd bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvolt numai n
prezena unei presiuni crescute a O2, care este folosit ca acceptor final unic. Aceste bacterii
posed catalaz, peroxidaz, citocromi (de exemplu catalaza desface H2O2 toxic pentru celula
bacterian; vezi Figura nr. 1) i utilizeaz numai procese de respiraie. Unele specii aerobe
(exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta n medii lipsite de oxigen, dac n mediu
sunt prezeni nitratul sau nitritul;
37
- strict anaerob, atunci cnd bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium botulinum,
Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai n absena O2. Nu pot
supravieui n prezena O2, care nefiind redus are o aciune bactericid. Nu au catalaz,
peroxidaz (care acioneaz asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc
pentru obinerea energiei numai procese de fermentaie. Pentru cultivarea lor este necesar
utilizarea unui mediu cu potenial redox foarte sczut.
- aerob facultativ anaerob, atunci cnd bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc) se dezvolt
mai bine n mediile cu oxigen, prin procese de respiraie, dar pot prezenta ambele tipuri
respiratorii, n funcie de potenialul redox. Majoritatea au catalaz sau citocromoxidaz, dar nu
au peroxidaze flavoproteice. n acest tip se ncadreaz majoritatea bacteriilor studiate.
- anaerob microaerofil, atunci cnd bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolereaz mici
cantiti de O2.
3. 3. Ci metabolice
Metabolismul glucidic
Polizaharidele utilizabile de ctre bacterii nu pot ptrunde ca atare n celul. Ele sunt degradate
de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindeaz unitile monozaharidice
din extremitile lanurilor polizaharidice) i endohidrolaze (care hidrolizeaz unitile interne).
Polizaharidele existente n celul ca materiale de rezerv au o degradare diferit, prin
fosforoliz, rezultnd hexozo-monofosfai.
Principalele ci metabolice (de catabolism) sunt:
a). calea hexozo-difosfailor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care n final pentru 1 mol de
glucoz se obin 1 mol de acid piruvic i 2 moli ATP;
b). calea pentozo-monofosfailor;
c). calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas).
Metabolismul lipidic
Multe bacterii degradeaz trigliceridele prin lipaze exocelulare n glicerol i acizi grai liberi.
Activitatea lipazic poate fi cercetat pe medii care conin glicerol-tributirat. Pentru degradarea
lipidelor unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posed enzime specifice (lecitinaza
D, fosfolipaza C). Prin degradarea fosfolipidelor din membrana hematiilor, fosfolipaza C confer
bacteriilor proprietatea de hemoliz.
Acizii grai sunt degradai preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii grai reprezint
surse de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic genereaz 129 moli de ATP).
Bacteriile saprofite au proprieti lipolitice intense, participnd la biodegradarea grsimilor i
uleiurilor (mai ales n mediul marin).
Metabolismul proteic
n lumea bacterian mai rspndii sunt D-aminoacizii. Acetia pot forma diferite polipeptide cu
activitate antibiotic (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu capsula bacilului
anthraxului. Particip de asemenea i la formarea peretelui celular (de exemplu D-Ala).
Cile de degradare sunt reprezentate mai ales de:
a). transaminarea i dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au ci proprii de
catabolism, utile n identificare);
38
3. 4. Ci biosintetice particulare
3. 4. 1. Formarea structurilor precursorilor biosintetici glutamat, aspartat etc. se realizeaz
utiliznd inclusiv structuri chimice care n lumea vie sunt utilizate numai de ctre bacterii, de
exemplu acidul diaminopimelic sau acidul dipicolinic.
3. 4. 2. Sinteza peptidoglicanului
Sinteza peptidoglicanului se desfoar pe parcursul mai multor etape (vezi Figura nr. 3). ncepe
prin sinteza n citoplasm a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM). Aceast structur se
ataeaz de bactoprenol (un lipid din membrana celular), dup care urmeaz un lan de reacii
biochimice. Legarea ncruciat final se realizeaz printr-o reacie de transpeptidare n care
terminaiile amino libere ale pentaglicinei nlocuiesc reziduurile terminale ale D-Ala de la
peptidul nvecinat. Reacia este catalizat de transpeptidaze, un set de enzime numite i PBPs
(penicillin binding proteins) care au att activitate de transpeptidaze i carboxipeptidaze, dar
controleaz i gradul de legare a peptidoglicanului (aspect foarte important n diviziunea
celular). La nivelul lor se pot lega penicilinele i alte medicamente beta-lactamice (Figura nr. 4).
Aceast cale de biosintez are o importan particular n medicin, oferind i baza aciunii
selective a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracin, vancomicin, cicloserin etc).
Spre deosebire de celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu fluidele organismului. n
interiorul lor presiunea osmotic este foarte mare i viabilitatea lor depinde de integritatea
peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular. Orice compus care inhib o etap n
biosinteza peptidoglicanului la o bacterie n cretere va putea produce liza bacterian (efect
bactericid).
3. 4. 3. Sinteza LPZ
Sinteza este asemntoare cu cea a peptidoglicanului; n ambele situaii, o serie de subuniti se
asambleaz pe un lipid transportor la nivelul membranei i apoi sunt transferate n fabrica
polimerului n cretere pentru realizarea peretelui celular. Toate componentele LPZ sunt
sintetizate i ansamblate la nivelul membranei citoplasmatice.
3. 4. 4. Sinteza capsulei extracelulare
Capsula se sintetizeaz enzimatic din subuniti activate. n sinteza capsulei extracelulare (poate
avea structur polizaharidic sau peptidic) nu sunt implicate lipide transportoare de
provenien membranar. Prezena capsulei este adesea determinat de condiiile de mediu.
De exemplu, dextranii se pot sintetiza pornind de la sucroz i acest lucru se va realiza doar dac
exist sucroz n mediu.
3. 4. 5. Sinteza substanelor de rezerv
Cnd nutrienii sunt n exces, bacteria poate converti o parte din ei n granule de rezerv
(vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutin, care difer de la o bacterie la alta.
3. 5. Cultivarea bacteriilor
39
3. 5. 1. Definiii utile
Populaia reprezint o multitudine de indivizi ai unei specii care convieuiesc ntr-un anumit
biotop.
Clona este populaia care rezult dintr-o singur celul prin nmulire vegetativ (diviziune
binar).
Tulpina reprezint populaia microbian alctuit din descendenii unei singure izolri n cultur
pur.
Temperatura de dezvoltare
n funcie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:
- mezofile, cu temperatura optim de 30-37C;
- psichrofile, cu temperatura optim n jur de 20C (unele acceptnd temperaturi apropiate de
0C; Listeria spp. poate supravieui sau se poate chiar i multiplica la temperatura din frigider).
Ele sunt adaptate la acest mediu prin numrul mare de acizi grai nesaturai coninui de
membrana plasmatic. Gradul de nesaturare al unui acid gras se coreleaz cu timpul de
solidificare sau stadiul de tranziie termic (temperatura la care se topete sau se solidific
lipidul). Acizii grai nesaturai rmn n faz lichid la temperaturi joase, dar sunt denaturai la
temperaturi moderate. Fie c acizii grai din membran se afl n faz lichid sau solid, ei
afecteaz fluiditatea membranei, care afecteaz n mod direct capacitatea de a funciona.
- termofile, cu temperatura optim de 50-60C (unele putnd s se multiplice i la temperaturi
apropiate de 95C, ca de ex. Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt adaptate s reziste la
temperaturi de peste 60C printr-o varietate de modaliti. Acizii grai din membrana bacteriilor
termofile sunt acizi grai saturai, permind membranelor s rmn stabile i funcionale la
temperaturi ridicate.
- extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optim de 80C sau mai mare i o
temperatur de dezvoltare maxim de 115C. (2) Nu sunt patogene.
Bacteriile studiate de microbiologia medical sunt n marea lor majoritate mezofile.
3. 5. 2. Noiuni de cretere i multiplicare bacterian
Creterea oricrui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creterea volumului
celular raportat la creterea suprafeei este mai mare, n cursul creterii se ajunge la un punct
critic. Multiplicarea celular este o consecin a creterii. Se restabilete raportul optim dintre
volumul i suprafaa celulei.
Multiplicarea majoritii bacteriilor se face prin diviziune simpl (binar). Sporii nu reprezint
forme de multiplicare (aa cum se ntmpl n cazul fungilor sau paraziilor).
3. 5. 3. Cultivarea bacteriilor
Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecii, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient
s obinem mai nti respectivul microorganism n cultur pur, pentru ca ulterior s i putem
studia diferitele caractere n vederea identificrii.
Metodele de cultivare a bacteriilor urmresc mai multe obiective:
izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui produs plurimicrobian n culturi
monomicrobiene denumite culturi pure.
40
Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrei bacterii. Termenul nsmnare
definete operaia de introducere a unei cantitai de germeni ntr-un mediu de cultur
artificial, n timp ce pentru culturile celulare, ou embrionate i mai ales animale de experien
folosim termenul inoculare.
Cultivarea se realizeaz prin nsmnarea bacteriilor pe medii de cultur. Mediile solide sau
lichide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare creterii i multiplicrii
bacteriene se numesc medii de cultur.
Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea ntr-un mediu de cultur poart numele de
cultur bacterian.
Mediile de cultur
Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii i pe medii artificiale.
Exist anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi
cultivate dect pe gazde vii, aa cum se ntmpl n cazul virusurilor, respectiv: animale de
laborator, ou de gin embrionate sau culturi de celule.
Majoritatea bacteriilor, fungii i unele protozoare se pot cultiva i pe medii artificiale.
Mediile de cultur artificiale trebuie s fie nutritive (s conin factorii de cretere necesari), s
fie sterile, s aib un anumit pH (de obicei ntre 7,2-7,6), s aib o anumit presiune osmotic,
s aib umiditatea favorabil multiplicrii germenilor etc.
Factorii de cretere reprezint substane eseniale pe care microorganismele nu sunt capabile
s le sintetizeze din nutrienii de care pot s dispun. Ei sunt necesari n cantitai mici.
ndeplinesc anumite roluri n biosintez. Factorii de cretere pot fi grupai n:
1. Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN i ARN);
2. Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor;
3. Vitamine: necesare n calitate de coenzime i grupri funcionale pentru enzime.
Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesit factori de cretere. Aceste bacterii pot sintetiza
purinele eseniale, pirimidinele, aminoacizii i vitaminele pornind de la o surs de carbon.
Alte bacterii necesit purine, pirimidine, vitamine i anumii aminoacizi pentru a crete. Aceti
compui trebuie adugai n prealabil n mediile de cultur.
Factorii de cretere nu sunt metabolizai direct ci sunt asimilai de ctre bacterii pentru a-i
ndeplini rolul n metabolism. Tulpinile mutante care necesit anumii factori de cretere ce nu
sunt necesari tulpinii din care au provenit sunt numite auxotrofe. Spre exemplu, o tulpina de E.
coli care necesit triptofan pentru dezvortare se va numi auxotrof-triptofan i va fi desemnat E.
coli trp- (2).
Clasificarea mediilor de cultur artificiale
Aceste medii se pot clasifica dup starea de agregare, dup natura ingredientelor, dup
complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), dup scopul urmrit (de transport,
de izolare, de identificare etc.), dup coninutul n ap, etc. Exist medii de cultur simple (agar,
ap peptonat, bulion simplu etc) i medii de cultur mai complexe (agar-snge, bulion
glucozat, agar Muller-Hinton etc). (vezi anexa nr. 2)
Medii speciale
Mediul electiv conine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltrii unei anumite bacterii
(de exemplu mediul Lffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric) (Figura nr. 5).
41
Prin coninutul su n substane antimicrobiene, mediul selectiv inhib dezvoltarea altor bacterii
dect cea a crei izolare se urmrete. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea
bacilului difteric sau medii n care includem antibiotice (fa de care bacteria care se dorete a fi
izolat este rezistent) (Figura nr. 6)
Mediul de mbogire favorizeaz nmulirea anumitor bacterii patogene, inhibnd dezvoltarea
florei de asociaie dintr-un produs patologic. Funcioneaz concomitent ca mediu selectiv i ca
mediu electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de mbogire
utilizate pentru izolarea Salmonella typhi).
Mediul diferenial conine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate fi sau nu
metabolizat, determinnd modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu, agarul cu
albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care difereniaz bacteriile lactoz-pozitive (cum este E.
coli) de bacteriile lactoz-negative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat
citrat lactoz), TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree). (Figurile nr. 7-10).
Colonia izolat
Pe medii solide, germenii nsmnai n suprafa produc colonii. Colonia este totalitatea
bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clon
bacterian.
Coloniile izolate se pot obine de exemplu prin tehnica nsmnrii prin dispersie (cu ansa
bacteriologic sau cu tamponul). Dup prelevarea cu ansa a unei poriuni din produsul
patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizeaz ansa; se verific
temperatura, prin atingerea mediului ntr-o zon nensmnat, ct mai periferic; cu ansa
steril se traseaz a doua latur a poligonului; se resterizeaz ansa i se repet procedeul
descris pn la realizarea a 4-5 laturi, fr a atinge prima latur. n acest mod, pe ultimele
laturi ale poligonului se vor putea observa dup trecerea timpului necesar multiplicrii
bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1)
Incubarea const n meninerea mediilor de cultur nsmnate, n condiiile necesare pentru
dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvolt i duc la apariia unei culturi n
circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optim de dezvoltare (asigurat n termostat)
pentru c timpul de generaie este de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp
de generaie de 12-27 ore i n acest caz cultura devine pozitiv n 2-8 sptmni. Pentru
bacteriile strict anaerobe este necesar incubarea n anaerobioz (ex. n medii la care s-au
adugat ingrediente cu activitate reductoare sau n anaerostat); dorim s subliniem c dac
transportul nu se face n condiii de anaerobioz, nu vom mai obine nici un rezultat indiferent
de mediile utilizate (Figura nr. 11).
Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi
Culturile bacteriene sunt discontinue cnd se realizeaz n volum limitat de mediu, care nu este
rennoit i continue atunci cnd mediul de cultur este continuu rennoit. O populaie
bacterian poate fi meninut indefinit n faza de multiplicare exponenial dac se adaug
continuu mediu de cultur proaspt, cu omogenizare prin curent de aer steril i evacuare a unei
cantiti corespunztoare de cultur (de exemplu n dispozitivul numit chemostat sau
turbidostat).
Chemostatul utilizeaz un mediu de cultur n care unul dintre nutrieni, aflat n concentraie
mai redus dect ceilali, funcioneaz ca factor limitant al creterii. Mediul de cultur proaspt
42
este admis n vasul de cultur n ritmul n care este consumat factorul limitant, iar cultura este
evacuat cu acelai ritm. Cultura este meninut astfel la o valoare constant i submaximal
ratei de cretere, reglat prin factorul limitant. Chemostatele sunt foarte utile pentru obinerea
de tulpini mutante pentru c dup ce rata de multiplicare a fost determinat ansa de selectare
a acestor tulpini este mai mare (Figura nr. 12).
n laboratorul de microbiologie clinic, de regul se utilizeaz culturile discontinue.
Timpul de generaie
Populaia care rezult prin diviziunea unei bacterii crete n progresie geometric cu raia 2.
Timpul necesar pentru dublarea populaiei se numete timp de dublare sau timp de generaie.
Timpul de generaie n faza exponenial i n condiii optime de cultivare este determinat
genetic. De exemplu, pentru E. coli este de circa 20 minute (ca i pentru majoritatea bacteriilor
studiate). Pentru Mycobacterium tuberculosis timpul de generaie poate avea o valoare ntre
12-27 ore.
Fazele dezvoltrii unei culturi bacteriene
Teoretic, dinamica unei populaii bacteriene ar trebui s evolueze exponenial. Dinamica real a
populaiei bacteriene n cultur discontinu are ns o evoluie caracterizat printr-o curb la
care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmic; faza staionar i faza de
declin (Figura nr. 13).
Faza de lag
Numrul bacteriilor nsmnate rmne staionar sau scade; germenii se adapteaz la
condiiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, i consum pn la dispariie
incluziile, cresc mult n dimensiuni, sintetizeaz enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se
divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag dureaz aproximativ 2 ore. Aceast faz
este aparent dependent de o varietate de factori incluznd dimensiunea inoculului, timpul
necesar pentru a-i reveni din ocul fizic datorat transportului, timpul necesar pentru sinteza
coenzimelor eseniale sau a factorilor de diviziune i timpul necesar pentru sinteza a noi enzime
ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent n mediu. (2)
Faza de multiplicare logaritmic (exponenial)
Celulele bacteriene prezint caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt ns ceva mai mari),
citoplasma este intens bazofil i omogen, lipsit de incluzii. Bacteriile sunt foarte sensibile la
antibiotice. Aceast faz este adecvat pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor n
vederea preparrii de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenial dureaz aproximativ 2-3 ore.
Faza staionar
Multiplicarea este realizat n progresie aritmetic, dar pentru c numrul bacteriilor care sunt
distruse este aproximativ egal cu numrul bacteriilor nou aprute rata de cretere devine nul.
Germenii au morfologia caracteristic speciei; n aceast faz realizm identificarea germenilor.
Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene ncepe formarea sporilor. Faza staionar
dureaz aproximativ 2-3 zile.
Faza de declin
Substratul nutritiv srcete, apar metabolii toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc
i enzime autolitice, rezervele de hran din incluzii (ex. acidul poli--hidroxi butiric sau
glicogenul) se consum, pentru un timp sursa de energie rmne doar ARN-ul celular. Unele
43
bacterii pot persista 2-3 luni. n acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare i se
exprim o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru
o durat limitat de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogenez devine foarte
intens.
Aspectul culturilor pe medii solide
Condiiile de cultivare i aspectul culturii sunt caractere cheie n identificarea bacteriilor.
Aspectul coloniilor variaz ntre diferitele bacterii, fr a permite diferenieri definitive de specie
(dar au utilitate n contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene i n contextul general al
diagnosticului de laborator, care la rndul su trebuie s aib loc ntr-un context n care punem
n balan i alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea ntre medicii de diferite specialiti
este esenial). Se examineaz:
dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm i mici, sub 1
mm),
consistena,
aderena la mediu,
prezena sau absena hemolizei (pe medii de tipul geloz-snge). (Figura nr. 14)
Colonia S (smooth) are suprafa bombat i neted, margini circulare i adesea aspect
strlucitor. Germenii pstreaz structura antigenic i nu aglutineaz spontan cu soluie salin
fiziologic. Germenii capsulai i pstreaz capsula. Virulena este conservat. Majoritatea
bacteriilor studiate formeaz colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli etc). (Figura nr. 15)
Colonia R (rough) este plat, suprafaa ei prezint rugoziti, marginile sunt crenelate. Structura
antigenic nu este caracteristic. Nu pstreaz capsula. Virulena nu este conservat (excepii
Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae). O bacterie care n
mod caracteristic duce la apariia unei colonii de tip S (ex. o enterobacterie), n cazul n care
testele de identificare prin reacii antigen-anticorp (ex. aglutinare pe lam, folosind anticorpi
cunoscui) nu se efectueaz la timpul potrivit ci mai trziu, prin nbtrnire va suferi anumite
modificri, coloniile vor deveni de tip R iar identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va
mai fi posibil. (Figura nr. 16)
Colonia M (mucoid) este mare, strlucitoare, mucoas. Este dat de exemplu de bacteriile care
prezint capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). (Figura nr. 17) Coloniile de
Streptococcus pneumoniae pot fi i de tip S i de tip M.
n cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obinuite nu vom putea obine
colonii izolate (a fost descris fenomenul de invazie). (Figura nr. 18) Cultura se ntinde pe toat
suprafaa plcii n strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate
fi inhibat prin incorporarea n mediu de acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc.
Aspectul culturilor pe medii lichide
Bacteriile i fungii facultativ anaerobi se dezvolt n toat masa de lichid, tulburndu-l. Bacteriile
strict aerobe se dezvolt preponderent la suprafaa mediului. Ca un aspect particular, n apa
peptonat Vibrio cholerae se poate dezvolta i formeaz un vl la suprafaa mediului. n acest
caz, pH-ul mediului este 9-9,5.
44
Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbur omogen mediul
(majoritatea bacteriilor). (Figura nr. 19)
Variantele R realizeaz o tulburare mai puin omogen. Pot lsa mediul limpede, formnd
flocoane care se depun sau un strat (vl) la suprafaa mediului (de exemplu bacilul difteric sau
bacilul tuberculos). (Figura nr. 20)
Alte informaii privind mediile de cultur, diferitele tehnici de cultivare, examinarea culturilor
bacteriene i diferitele tehnici de identificare fenotipice utile n diagnosticul microbiologic sunt
prezentate n anexa nr. 2.
3. 6. Povestiri adevrate
3.6.1. Penicilina, o mare descoperire ... nscut dintr-o mic neglijen
Era prin anul 1928 cnd Alexander Fleming, investignd caracteristicile stafilococilor, a
descoperit n mod accidental penicilina printr-o eroare de cultivare. Fleming era deja cunoscut
drept un cercettor de excepie prin activitatea deja desfurat, de ex. datorit descoperirii
lizozimului (1922); pe de alt parte, omul de tiin demonstra un grad de neglijen n
activitatea de laborator.
ntors din concediu n septembrie 1928, a gsit cteva dintre plcile cultivate anterior,
contaminate cu un fung din genul Penicillium i a decis s le arunce ntr-o soluie de dezinfectat.
Puin mai trziu, vrnd s arate unui coleg cteva dintre rezultatele activitii sale, a gsit cteva
plci care nu fuseser nc dezinfectate iar de aceast dat a observat o mic zon, la
contactul dintre cultura fungic i cultura bacterian, zon n care bacteriile nu s-au dezvoltat.
Pornind de la aceast observaie, Fleming a obinut un extract din cultura fungic, cu proprieti
bactericide. Pentru c fungul fcea parte din genul Penicillium a denumit acest extras penicilin.
A publicat rezultatele acestei descoperiri n anul 1929.
Au mai trecut aproape 16 ani, timp n care s-a reuit izolarea i stabilizarea acestui extract, i n
anul 1945 s-a nregistrat producerea antibioticului revoluionar numit penicilin.
Pentru descoperirea sa, Fleming mpreun cu biochimistul Ernst Chain i farmacologul Howard
Florey au fost laureai cu Premiul Nobel pentru Fiziologie i Medicin n anul 1945.
3.6.2. O fost rickettsie rescrie vechile clasificri
n 2009, o echip de cercettori i-a oferit Coxiellei burnetii mijloacele de a evada din mediul
intracelular. Pn la aceast dat, agentul etiologic al febrei Q era unul dintre exemplele
stereotipe de bacterie strict parazit, imposibil de cultivat pe medii artificiale.
Nu a fost una dintre acele descoperiri rapide, neateptate, ci a ncununat o munc minuioas
de studiere a necesitilor metabolice ale acestor bacterii. Cercetrile au evoluat progresiv: ntro prim etap, a fost obinut un mediu de cultur artificial, care reproducea condiiile de pH
acid din interiorul vacuolelor asemntoare lizozomilor, n care Coxiella spp. se multiplic n
celulele gazdei. Pe acest mediu, denumit ulterior Complex Coxiella Medium (CCM), Coxiella
burnetii i-a putut desfura activitatea metabolic timp de aproximativ 24 de ore.
ntr-o a doua etap, cercettorii au reuit s dovedeasc faptul c bacteria este microaerofil.
Au adaptat mediul n consecin i l-au numit ACCM (Acidified Citrate Cysteine Medium).
Cultivarea Coxiella burnetii pe medii de cultur artificiale ar putea permite studierea factorilor
de patogenitate, studierea structurii genetice i poate i realizarea unui model de abordare
pentru ali germeni strict intracelulari. (3-4)
45
3. 7. Direcii de cercetare
Vom prezenta mai jos cteva dintre direciile de cercetare actual. Cititorul le poate evalua
deschiznd urmtoarele link-uri:
- Economical Evolution: Microbes Reduce the Synthetic Cost of Extracellular Proteins,
http://mbio.asm.org/content/1/3/e00131-10
- The genome sequence of Rickettsia prowazekii and the origin of mitochondria,
http://www.nature.com/nature/journal/v396/n6707/full/396133a0.html
- Engineering of Lactobacillus jensenii To Secrete RANTES and a CCR5 Antagonist Analogue as
Live HIV-1 Blockers, http://www.asm.org/images/Communications/hiv-aac.pdf
3. 8. Evaluarea cunotinelor
La urmtoarele ntrebri alegei un singur rspuns corect:
1. Care dintre urmtoarele bacterii este cromopar?
A. Staphylococcus aureus
B. Staphylococcus epidermidis
C. Pseudomonas aeruginosa
D. Escherichia coli
E. Bacillus anthracis
2. Unul dintre urmtoarele este un microorganism strict aerob:
A. Clostridium tetani
B. Clostridium botulinum
C. Bordetella pertussis
D. Escherichia coli
E. Staphylococcus aureus
3. Penicilina se leag la nivelul:
A. hidrolazelor
B. oxidoreductazelor
C. izomerazelor
D. permeazelor
E. transpeptidazelor
4. Se cultiv numai pe gazde vii:
A. Staphylococcus aureus
B. Chlamydia trachomatis
C. Streptococcus pyogenes
D. Streptococcus pneumoniae
E. Haemophilus influenzae
5. Pe ce mediu se produce modificarea culorii sau aspectului culturii datorit prezenei unui
substrat?
46
A. Mediu electiv
B. Mediu selectiv
C. Mediu diferenial
D. Mediu Lffler
E. Mediu de mbogire
Bibliografie recent
1. Miyamoto-Shinohara Y, Sukenobe J, Imaizumi T, Nakahara T, 2008, Survival of freezedried bacteria, J. Gen. Appl. Microbiol., 54, 9-24
2. Todar Kenneth, 2008, The Growth of Bacterial Populations, Todars Online Textbook of
Bacteriology, disponibil pe internet la adresa: http://textbookofbacteriology.net
3. Omsland A, Cockrell DC, Fischer ER, Heinzen RA, 2008, Sustained axenic metabolic
activity by the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii, J. Bacteriol., 190, 3203-12
4. Omsland A, Cockrell DC, Howe D et al., 2009, Host cell-free growth of the Q fever
bacterium Coxiella burnetii, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 4430-4
47
48
Produsul de curare este un agent chimic care ndeprteaz murdria (materie organic i/sau
anorganic) de pe suprafee sau obiecte, dar nu prezint activitate antimicrobian (bactericid,
virucid, fungicid sau sporicid) i care nu reduce nivelul de contaminare microbian.
Splarea minilor este procedura prin care se elimin murdria i se reduce flora tranzitorie prin
aciune mecanic, utiliznd ap i spun (Figura nr. 1, Film nr. 1).
Factori care influeneaz eficacitatea metodelor de control:
- mrimea populaiei bacteriene;
- timpul de expunere la agentul decontaminant (creterea timpului de expunere crete rata
distrugerii);
- efectul concentraiei, a temperaturii i a pH-ului (o concentraie mai mare crete rata
distrugerii);
- stabilitatea agentului;
- structura microorganismului etc.
Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori i a sporilor) din
anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafee. Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici
sau cu ajutorul substanelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative asupra esuturilor
gazdei). mpiedic rspndirea bolilor infecioase.
Dezinfecia igienic a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune direct
asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fr a aciona asupra florei
rezidente.
Dezinfecia chirurgical a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune
direct asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia i cu aciune asupra
florei rezidente.
Produsul pentru dezinfecie de nivel sczut este un agent chimic care distruge bacteriile
vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate i virusurile mari necapsulate.
Produsul pentru dezinfecie de nivel intermediar este un agent chimic care distruge bacteriile
vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate i mycobacteriile.
Produsul pentru dezinfecie de nivel nalt este un agent chimic care, n condiii bine definite
de timp i temperatur, distruge microorganismele, are aciune sporicid i reprezint un
potenial sterilizant chimic (Figura nr. 2).
Sterilizantul chimic este un agent chimic (nu n form gazoas), utilizat pentru sterilizarea
dispozitivelor medicale critice, care nu se pot steriliza prin metode fizice. Un sterilizant chimic
distruge toate categoriile i formele viabile de microorganisme, nivelul de supravieuire al
acestora fiind mai mic sau egal cu 10-6 (probabilitatea prezenei unui singur microorganism viu
pe un dispozitiv medical sterilizat este egal sau mai mic cu 1/1.000.000).
Termenul de valabilitate reprezint perioada de timp n care un produs dezinfectant este
eficient, din punct de vedere al concentraiei substanei active i eficacitii antimicrobiene.
Timpul de contact (timp de aciune) reprezint perioada de timp n care produsul dezinfectant
este n contact direct cu suprafaa sau obiectul care trebuie dezinfectat. Perioada de timp n
care produsul antiseptic este n contact direct cu esuturile vii.
Sterilizarea reprezint distrugerea sau ndeprtarea tuturor microorganismelor patogene
sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafa sau dintr-un mediu (lichid sau
49
solid). Toate materialele utilizate n laboratorul de microbiologie trebuie s fie sterile nainte de
utilizare. Exist o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel nct i metodele
de sterilizare sunt destul de variate, dup cum urmeaz:
- Metode de sterilizare prin cldur (cldura uscat sau cldura umed);
- Metode de sterilizare prin filtrare;
- Metode de sterilizare utiliznd radiaiile, dar i
- Metode chimice de sterilizare.
Metodele de sterilizare care utilizeaz radiaiile (cu excepia radiaiilor ultraviolete) i metodele
chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilen) sunt utilizate rareori n laboratorul de
microbiologie.
Sterilizarea va fi ntotdeauna precedat de pregtirea materialului care urmeaz s fie sterilizat,
respectiv: splare, uscare, ambalare (n cazul materialelor curate, necontaminate) urmat de
autoclavare, splare, uscare, ambalare (n cazul materialelor contaminate refolosibile).
Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc. trebuie curate perfect,
de ex. prin splare cu ajutorul unor detergeni. Dac aceste materiale au fost contaminate cu
snge, nainte de splare se vor dezinfecta. Sticlria de laborator este colectat n recipiente
speciale i se sterilizeaz prin autoclavare; pipetele vor fi meninute n amestec dezinfectant
pn a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile i acele (dei este necesar utilizarea pe scar
larg a seringilor i acelor de unic ntrebuinare) contaminate se vor introduce n baie de
amoniac 1-2% timp de 15-30 minute, se vor peria n soluie de 1-2% detergent cationic i se vor
spla cu jet de ap pentru ndeprtarea substanelor chimice (Figura nr. 3).
Instrumentele de unic utilizare sunt, n general, destinate chirurgiei moderne. Pot fi izolate
(aparate de sutur mecanic toracic, abdominal, vascular etc) sau pot fi furnizate n seturi de
instrumente de unic utilizare. Sterilizarea acestor instrumente se face industrial prin iradiere cu
raze gamma sau etilenoxid. Utilizarea instrumentelor de unic utilizare (disposable) confer
un plus de siguran, n pofida unui pre relativ ridicat.
Exist o serie de metode pentru a controla eficiena sterilizrii, prin indicatorii fizici (ex.
termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus
stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verificarea eficacitii sterilizrii cu ajutorul
radiaiilor, pot fi utilizai spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus) (Figura nr. 4).
Prin aciunea cldurii procesele chimice i fizice sunt mult accelerate; distrugerea se produce
dup atingerea temperaturii de 50-60C prin ruperea legturilor intramoleculare, mai ales a
punilor de hidrogen care menin proteinele i alte macromolecule n stare nativ. Ca urmare
protoplasma se denatureaz. Celulele bogate n ap sunt mult mai sensibile la aciunea cldurii
dect microorganismele care conin puin ap sau sunt liofilizate. Apa din compoziia
microorganismelor absoarbe cldura proporional cu volumul su. Sterilizarea prin cldura are
loc n dou variante principale: prin cldur uscat i umed.
Sterilizarea prin cldur:
a). Sterilizarea prin cldur uscat are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor
bacteriene. Amintim cteva dintre variantele tehnice:
a1. Sterilizarea prin nclzire la incandescen (la rou) reprezint introducerea i meninerea n
flacra becului Bunsen pn la nroire, pe toat lungimea, a obiectului care urmeaz a fi
sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologic (cu bucl sau fir) sau pentru spatul (Figura
nr. 5, Film nr. 2).
Flambarea reprezint trecerea prin flacr (de cteva ori) a unui obiect, fr a se atinge
temperatura de incandescen. Flambarea se aplic pentru portans, gtul unui recipient de
sticl (tub, eprubet, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur i nu reprezint
sterilizare.
a2. Sterilizarea cu aer cald se realizeaz n etuv (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr. 6). Etuva
este o cutie metalic cu perei dubli. Cu ajutorul unor rezistene electrice i a unui termostat se
obine i menine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii n interiorul
aparatului este realizat cu ajutorul unui sistem de ventilaie (Schema nr. 1).
Pentru majoritatea materialelor care urmeaz a fi sterilizate, temperatura din etuv trebuie s
ating 180C, pentru o durat de 1 or sau 160C pentru o durat de 2 ore. Pot exista i alte
variante, de exemplu n funcie de dimensiunea obiectelor de sterilizat.
Sterilizarea cu aer cald este indicat pentru obiecte de sticl, obiecte de porelan, pulberi inerte
i termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de
menionat faptul c repetarea sterilizrii, n timp, conduce la declirea oelului) etc.
Nu se vor steriliza n etuv soluiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vat,
bumbac, fibr sintetic, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.
a3. Incinerarea reprezint arderea pn la obinerea de cenu (Figura nr. 7). Exist anumite
reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. n cazul spitalelor,
n Romnia au existat astfel de incineratoare n structura unitii sanitare respective. Odat cu
procesul de aderare la Uniunea European i respectiv necesitatea aplicrii unor reguli impuse
pentru toate rile membre, majoritatea incineratoarelor de spital au fost nchise. Modul n care
s-a realizat n perioada 2003-2004 negocierea privind stoparea activitii acestor incineratoare
nu a inut cont de situaia real din ara noastr. n lipsa unui incinerator propriu, unitatea
sanitar trebuie s ncheie un contract de prestri servicii cu o firm de profil. Din punctul de
vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerrii materiale de unic
folosin din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experien etc.
51
b). Sterilizarea prin cldur umed este cea mai eficient metod de sterilizare i are ca
mecanism coagularea proteinelor i degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite
substane n soluie, sticlrie (cu excepia pipetelor i lamelor), instrumentar chirurgical
(metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultur, aparate de filtrat etc.
b1. Autoclavarea este esenial att pentru laboratoarele de microbiologie ct i pentru unitile
sanitare n general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de ap realizeaz
134C la 2 atmosfere.
Autoclavul are ca pies principal un cazan cu perei metalici, care se nchide etan cu un capac
prevzut cu un sistem special de nchidere i n interiorul cruia, vaporii de ap sunt comprimai
la presiunea necesar n vederea sterilizrii (Schema nr. 2).
Exist mai multe tipuri de autoclave:
- autoclave cu perete simplu
verticale
orizontale
- autoclave cu manta de aburi
verticale
orizontale.
n continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical,
la care vaporii provin din apa aflat n cazanul de presiune i ajung n camera de sterilizare de
jos n sus (Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este nregistrat de un manometru.
Pentru punerea n funciune a autoclavului, n dotare exist 2 robinete: unul superior (robinetul
de aer i vapori, care permite legtura ntre cazan i mediul exterior) i unul inferior (robinetul
care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele exist o supap de siguran
care se deschide i permite evacuarea vaporilor atunci cnd, accidental, presiunea vaporilor
depete limita de siguran. n momentul de fa pentru evitarea riscului de a veni n contact
cu vapori de ap fierbini aflai sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu
permite deschiderea capacului pn cnd presiunea din interior nu o egalizeaz pe cea din
exterior. Cazanul de presiune este inclus ntr-un perete exterior solid care la partea inferioar
are un spaiu n care se afl sursa de cldur.
n partea inferioar a cazanului de presiune se afl un suport pe care se aeaz o plac de metal
perforat (Figura nr. 9). Pe suport se aeaz materialele care trebuie sterilizate iar faptul c
placa este perforat permite trecerea vaporilor de ap produi dup nclzirea apei. n vederea
sterilizrii se procedeaz astfel:
verificm nivelul apei din partea inferioar a cazanului, care trebuie s fie pn la o
distan de 2-3 centimetri de suport; dac nivelul a sczut, se completeaz (recomandabil se va
utiliza ap distilat);
nchidem etan capacul, folosind sistemul special de etaneizare cu care este dotat
autoclavul pe care l avem la dispoziie;
52
deschidem robinetul pentru evacuarea aerului i vaporilor (dac rmne aer n
cazanul cu presiune eficiena sterilizrii va scdea considerabil; vaporii de ap fiind mai uori,
vor nclzi n special partea superioar a cazanului n timp ce aerul, care va atinge temperaturi
inferioare, fiind mai greu, va rmne n partea inferioar a cazanului) ;
nchidem robinetul dup evacuarea aerului i apariia unui jet continuu de vapori;
53
4. 2. 1. 6. Presiunea osmotic
Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) n medii hipertone are efecte letale asupra unor
bacterii. n medii hipotone are loc acumularea de ap n celula bacterian; aceasta devine
turgescent i peretele bacterian cedeaz.
55
cationici (sruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul
dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)].
e). Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet de genian, albastru de
metilen, fucsin bazic etc), derivaii de acridin, de exemplu rivanolul.
Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70, diferii derivai halogenai,
hipermanganatul de potasiu 1, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substane
antiseptice. Dorim s menionm i s subliniem c att n cazul antisepticelor ct i n cazul
dezinfectantelor este important ca substana utilizat s aib concentraia corespunztoare, s
fie aplicat pentru o durat de timp corespunztoare, s se afle n termenul de garanie. Aceeai
substan chimic (de ex. cloramina) poate intra n categoria antisepticelor sau n categoria
dezinfectantelor, n funcie de concentraie (concentraia este mai mare n al doilea caz).
n continuare vom prezenta pe scurt cteva exemple de substane dezinfectante. Dorim s
menionm faptul c, pn n prezent, nu exist nici un dezinfectant ideal. Exist numeroase
substane i numeroi productori de antiseptice i dezinfectante.
Hipocloriii:
soluiile de hipoclorit se prepar periodic (se inactiveaz dup mai mult de 24 ore),
concentraia n clor activ este diferit n funcie de scopul urmrit (ex. 2.500 ppm clor activ
pentru dezinfectarea pipetelor contaminate);
au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, sporilor bacterieni, fungilor (100
ppm n o or), virusurilor (200 ppm n 10 minute);
efectul este diminuat considerabil n prezena substanelor organice (n special proteine),
maselor plastice, detergenilor.
Derivaii fenolici:
din cauza toxicitii, potenialului carcinogenetic i corozivitii, fenolii nu se folosesc ca atare,
ci sub forma derivailor fenolici;
soluiile fenolice se prepar periodic (dup cel mult 24 ore);
concentraia poate fi diferit n funcie de scopul urmrit (de obicei este de 2-5%);
au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, fungilor, unor virusuri (ex. HIV
este inactivat de soluia 0,5%);
efectul este diminuat pe suprafeele de cauciuc, lemn sau material plastic.
Glutaraldehida:
cel mai frecvent este utilizat concentraia de 2%, la un pH alcalin;
are efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ (n cazul mycobacteriilor este
necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor;
datorit faptului c nu corodeaz metalele (aa cum se ntmpl n cazul substanelor
prezentate mai sus) se poate folosi i la dezinfectarea suprafeelor metalice;
56
nu poate fi folosit pentru suprafee, datorit vaporilor iritani i timpului mare de expunere;
ideal pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai
mare de timp n containere meninute nchise.
Iodoforii:
sunt substane care complexeaz iodul pe care l elibereaz n soluii apoase;
au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor,
unor virusuri (ex. virusuri cu nveli lipidic);
sunt inactivai de substane organice (n special proteice), mase plastice, detergeni;
pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor, dezinfecia pipetelor contaminate.
Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O):
exercit activiti bactericide prin alkilarea acizilor nucleici i prin nlocuirea hidrogenului labil
printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH);
sporii de Bacillus subtilis nu sunt distrui;
acest tip de sterilizare se utilizeaz pentru materiale care nu rezist atunci cnd sunt supuse
aciunii temperaturii sau radiaiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic
etc.);
fiind o substan exploziv, etilenoxidul este utilizat n camere speciale n care se menine
o presiune negativ, iar pentru a preveni o explozie dioxidul de carbon poate fi combinat cu
aceast substan n ncperi de oel speciale; o alt variant de protecie ar fi combinarea cu
hidrocarburi fluorinate.
indiferent de varianta folosit trebuie respectate toate recomandrile productorului;
exist o serie de inconveniente n ceea ce privete acest tip de sterilizare (pot s apar efecte
carcinogenetice i afectarea sistemului nervos etc., dar e posibil afectarea ntregului organism);
sterilizarea este n principiu influenat de: concentraia etilenoxidului, temperatur,
umiditatea relativ i timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraiei va reduce la
jumtate timpul necesar pentru sterilizare).
4. 2. 3. Produsele biocide
Directiva 98/8/CE definete produsele biocide dup cum urmeaz: Substane active i
preparatele coninnd una sau mai multe substane active, condiionate ntr-o form n care
sunt furnizate utilizatorului, avnd scopul s distrug, s mpiedice, s fac inofensiv i s
previn aciunea, sau s exercite un alt efect de control asupra oricrui organism duntor, prin
mijloace chimice sau biologice (vezi directiva CE).
Din categoria produselor biocide sunt excluse produsele de curenie, detergenii sub form de
pulbere sau lichid i alte produse similare, ce nu sunt destinate a avea efect biocid.
57
58
Toate proteinele fagice pot conduce la apariia de anticorpi, descoperire utilizat n studierea
nrudirii dintre diferii bacteriofagi.
Relaii bacteriofag-bacterie
ntre bacteriofag i bacteria gazd se pot stabili dou tipuri de relaii:
- de tip litic sau productiv (Figura nr. 15);
- de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16).
Relaiile sunt strict specifice i sunt mediate de receptori.
Ciclul litic are mai multe etape i anume:
1. Adsorbia: Ataarea este specific. Exist receptori strict specifici la nivelul bacteriofagului, ce
recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este iniial reversibil (prin fibrele
cozii), apoi ireversibil (prin croetele plcii bazale). Adsorbia fagic modific permeabilitatea
membranei citoplasmatice bacteriene.
2. Penetrarea: Fagul elibereaz muramidaza care lizeaz mureina din peretele bacterian. Teaca
cozii se contract i antreneaz cilindrul axial prin peretele bacterian, ducnd apoi la injectarea
ADN-ului fagic n citoplasma bacterian;
3. Multiplicarea: Dup aproximativ 4-5 minute, funcia ADN-ului bacterian este blocat i
preluat de ADN-ul fagic ce coordoneaz sinteza componentelor proprii. Se sintetizeaz un
numr nsemnat de proteine virale.
4. Maturarea (ansamblarea) fagului
5. Liza bacteriei (ex. datorit sintezei unor enzime asemntoare lizozimului) i eliberarea
bacteriofagului matur, virulent.
Bacteriile lizosensibile permit adsorbia, penetrarea i multiplicarea fagilor viruleni pn la
realizarea lizei celulei bacteriene.
Evidenierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene
n mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunztor duce dup cteva zeci de
minute (uneori chiar i cteva zile) la limpezirea mediului;
pe mediu solid, nsmnat uniform, inocularea fagului litic duce la apariia unei zone de
liz, clar, bine circumscris (spotul de bacteriofagie), metod utilizat n lizotipie;
dac se amestec o suspensie de fagi cu o pictur de cultur (pur) bacterian, iar tulpina
respectiv are receptori potrivii bacteriofagilor i aceast suspensie se amestec cu geloz
nclzit putem transfera suspensia ntr-o plac Petri;
bacteriofagii infecteaz bacteriile; dup circa 30 minute bacteriile sunt lizate i elibereaz
fagii; acetia difuzeaz prin geloz i infecteaz bacteriile situate n apropiere i ciclul se reia;
o parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potrivii) nu sunt infectate i n timp se
multiplic iar cultura bacterian opacizeaz mediul; dup circa 18-24 de ore putem observa arii
cu celule lizate (transparente) pe un fond produs de cultura bacterian (bacterii nelizate), aceste
59
arii numindu-se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii viruleni sunt clare, n
comparaie cu plajele mai puin clare produse de bacteriofagii temperai (fagii viruleni sunt acei
bacteriofagi care nu pot evolua dect n ciclul litic)
Ciclul reductiv (de lizogenizare) are aceleai etape, iniial.
Dup adsorbie i penetrare, ADN-ul fagic:
transducia;
conversia genetic (cu producerea de exotoxine de ctre unele bacterii lizogenizate, cum
ar fi toxina difteric, toxina scarlatinoas, toxina botulinic de tip C etc);
recombinarea genetic (atunci cnd o bacterie parazitat de doi fagi diferii, dar nrudii,
elibereaz la sfritul ciclului litic pe lng tipurile parentale i tipuri de fagi care nsumeaz
unele din proprietile celor doi fagi parentali) etc.;
inducia fagic (sub influena unor ageni inductori, de ex. raze UV, sau spontan, profagul
i rectig virulena, devine fag virulent, i produce liza bacteriei respective).
Bacteriile lizorezistente nu permit infecia cu un fag fie datorit lipsei receptorilor specifici, fie
datorit unei stri de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii viruleni omologi
profagului gzduit.
Fagul defectiv reprezint profagul care persist indefinit n stare latent (nu se reactiveaz).
Aplicaii practice ale fenomenului de bacteriofagie:
fagii viruleni sunt un element de echilibru ecologic n mediul natural de via al bacteriilor
(n nia ecologic respectiv);
fagii temperai pot avea un rol deosebit n reasortarea materialului genetic al bacteriilor,
ntruct atunci cnd se detaeaz (inducie) de cromozomul bacterian pot antrena poriuni din
ADN-ul bacterian;
fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorit specificitii
relaiei fag-bacterie);
anumite mutante ale fagilor se folosesc n ingineria genetic drept vectori ai ADN
recombinant (ex. fagii Charon Lambda);
s-au evideniat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic i antigenic
par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilitii la un anumit tip fagic) este una dintre cele mai fine
60
61
canalizri construite corespunztor, care au permis refularea apei din zonele poluate n reeaua
de ap potabil etc.
Cu toate c la baza acestei epidemii au stat mai muli factori, cel mai important dintre acetia a
fost lipsa clorinrii (antiseptizrii) corespunztoare a apei potabile.
Datele reale cu privire la aceast epidemie sunt prezentate succint la punctul
44. 8. 2.
4. 3. 2. Epidemia de holer din Dhaka - bacteriofagii
Holera se transmite cel mai frecvent prin consumul de ap contaminat cu tulpini de Vibrio
cholerae, n special n zonele cu educaie sanitar precar. Datele epidemiologice i de mediu
obinute n urma unei izbucnirii epidemice (outbreak) de holer n Bangladesh, au sugerat
rolul bacteriofagului litic specific pentru V. cholerae, care ar putea limita gradul de severitate al
epidemiei prin efectul de distrugere a bacteriilor prezente n sursele de ap contaminat, sau
chiar i n cazul unor persoane infectate.
Au fost emise dou ipoteze privind rolul potenial al bacteriofagilor specifici: a. n cadrul relaiei
bacterie-bacteriofag, bacteriofagii lizeaz un numr mare de bacterii, ulterior densitatea
bacteriofagilor scade i la un moment dat bacteriile se pot multiplica exponenial i densitatea
bacterian atinge nivelul la care pot determina o izbucnire epidemic (severitatea izbucnirii
epidemice va fi cu att mai mare cu ct densitatea bacteriofagilor rmai n sursele de ap
contaminate este mai mic); b. dac izbucnirea epidemic este datorat multiplicrii bacteriene,
necorelat cu diminuarea densitii fagice, introducerea bacteriofagilor n sursele de ap ar
putea reduce amploarea izbucnirii epidemice i ar putea duce chiar i la declinul acesteia.
n ambele situaii amploarea efectului bacteriofagilor depinde de balana care se stabilete ntre
rata de multiplicare a vibrionilor i de rata de distrugere a fagilor.
n timpul izbucnirii epidemice din Dhaka, Bangladesh, au fost cuantificate: a. incidena
infeciilor, b. densitile tulpinilor de V. cholerae implicate (serotipul O1, rezistent la
streptomicin) i c. concentraiile bacteriofagilor litici specifici pentru aceast tulpin (JSF4), att
n scaunul pacienilor spitalizai ct i n rezervoarele de ap potabil.
Studiul a fost posibil pentru c implica o singur tulpin, a crei densitate a putut fi uor
monitorizat prin susceptibilitatea/rezistena la streptomicin.
Pe baza observaiilor n dinamic, studiul a sugerat c infeciile sunt cauzate de consumul de
ap dintr-un rezervor comun, n care bacteria i fagul se reproduc i interacioneaz
independent de populaia uman. Iniial, schimbrile temporare climaterice au creat condiiile
unei descreteri a concentraiei fagice, cu o multiplicare exponenial a vibrionilor n sursele de
ap. Populaia a nceput s se infecteze consumnd apa respectiv, s-a creat un cerc vicios de
multiplicare bacterian n rezervor prin recontaminarea rezervorului datorit igienei precare i
astfel epidemia s-a amplificat. Dup un timp producia de fagi a nceput s creasc, datorit
concentraiei mari de vibrioni din rezervor i n persoanele infectate. Amplificarea densitii
fagice a dus la un declin al densitii bacteriene i respectiv la scderea numrului de persoane
infectate, pn la dispariia cazurilor.
Studiul (a fost realizat i un model matematic foarte interesant) a sugerat i posibilitatea ca
fagul s se dezvolte iniial n gazdele infectate cu V. cholerae, i abia apoi s ajung n rezervor
(datorit lipsei de igien). Aceast amplificare (numeric i funcional) a bacteriofagilor ar
putea reprezenta o important component n prevenirea / controlul epidemiilor de holer.
62
63
morgani i67% la Pseudomonas aeruginosa. Aa cum a fost precizat de ctre diveri autori,
compoziia de baze azotate este un index taxonomic. (1)
La celulele procariote ADN-ul este inelar, mpachetat n nucleoidul din citoplasm. La bacteria
intestinal E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alctuiesc o macromolecul de 1,4
milimetri lungime, dar numai 2 nanometri lime. Aceasta conine 4.400 de gene deja
secveniate. n ciuda lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este extrem
de bine nfurat n nucleoid, n aproximativ jumtate din diametrul celular.
ADN-ul apare ca o macromolecul format din dou catene polinucleotidice antiparalele i
complementare rsucite n dublu helix. Cele dou catene sunt unite prin puni de hidrogen
formate ntre bazele azotate opuse (A=T i GC). Modelul structural al ADN-ului a fost propus de
ctre Watson i Crick n anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea mai
important proprietate a acizilor nucleici i condiioneaz toate proprietile ADN-ului, mai ales
cea de autoreplicare i cea de transfer al informaiei genetice.
Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experiene succesive, iniial prin cercetrile lui W.
Griffith (1928) privind fenomenul de transformare bacterian, ulterior prin experiene care au
confirmat rezultatele obinute de Griffith, dar abia n 1944 Avery, MacLeod i Mc Carthy
demonstreaz faptul c ADN-ul este substratul chimic al ereditii i reprezint materialul
genetic al oricrei celule (funcie ndeplinit aa cum tim astzi de ARN, la ribovirusuri).
La temperatura camerei ADN-ul este o structur stabil n condiii fiziologice normale, datorit
legturilor intercatenare (2 ntre A i T i 3 ntre C i G). Dac temperatura depete 65C,
stabilitatea punilor de hidrogen ncepe s cedeze, dublul helix ncepe s se desfac i rezult
dou catene complementare (proces numit denaturare termic). Denaturarea devine complet
la temperaturi care depesc valoarea de 90C.
Renaturarea (reannealing) reprezint refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar prin acest
proces se poate stabili relaia filogenetic ntre dou specii (n funcie de procentul de
renaturare). De exemplu dac se utilizeaz ADN denaturat provenit de la E. coli i ADN
denaturat provenit de la Salmonella spp., fiecare marcat cu acelai izotop (ex. C14), fraciunea
de ADN marcat i evaluat prin diferite tehnici va fi fraciunea din ADN care este
complementar pentru cele dou specii (aceste experiene au stat la baza brevetrii tehnicilor
de hibridare molecular). Renaturarea este un proces mai lent dect denaturarea.
Denaturarea i renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite fie n
tehnologia ADN-ului recombinant, fie n studierea relaiilor filogenetice ntre diferite specii. Cu
ct speciile sunt mai nrudite, cu att secvenele de baze azotate au un mai mare grad de
similitudine (lanurile lor monocatenare renatureaz mai rapid).
Genom. Genotip. Fenotip
Genomul reprezint suma genelor unui organism.
Totalitatea informaiei genetice a unui organism se numete genotip.
Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip n interaciune cu
mediul ambiant se numete fenotip.
Funciile ADN-ului ca material genetic sunt:
- conservarea informaiei genetice;
64
- replicarea;
- transcrierea i traducerea materialului genetic;
- protejarea materialului genetic propriu (self);
- reglarea i controlul activitii celulare.
Transmiterea mesajului genetic la bacteriile descendente
Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantitii de material genetic urmat de
diviziune.
Replicarea ADN const n sinteza unor noi molecule de ADN, identice cu molecula parental i
identice ntre ele, pe baz de complementaritate (replicare semiconservativ). Dup ruperea
legturilor de hidrogen i separarea celor 2 catene, fiecare caten servete drept matri pentru
sinteza unei noi catene. Replicarea ADN este una dintre cele mai importante reacii din lumea
vie. Watson i Crick au fost primii care au propus modelul semiconservativ de replicare a ADN.
n celula care se dezvolt rapid, exist posibilitatea ca nainte de terminarea primei replicri s
se iniieze nc o replicare. n acest caz celula bacterian va putea fi merodiploid (doar anumite
regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori dect n mod normal) sau chiar poliploid
(tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori dect n mod normal).
n general, dac replicarea cromozomial nu este succedat de diviunea celulei (aa cum se
ntmpl n mod obinuit), putem remarca n celula bacterian existena cromozomilor
supranumerari. Cromozomii suplimentari (n total 2 sau 4) nu aduc o informaie genetic
diferit, pentru c ei reprezint copii ale cromozomului iniial (deci sunt identici cu acesta).
Repliconul (Jacob, Brenner, Cuzin)
In vivo se pot replica numai moleculele de ADN constituite ntr-o unitate de replicare
independent numit replicon. Indiferent dac celula are mai muli cromozomi (celula eucariot
este diploid) sau un singur cromozom (celula procariot), tot genomul trebuie s fie replicat.
Repliconul bacterian este bicatenar i circular, caracterizat prin:
- o secven nucleotidic specific marcnd nceperea replicrii;
- gene care codific sinteza unor proteine specifice numite iniiatori;
- o secven nucleotidic semnal pentru terminarea replicrii.
Exemple de repliconi:
- cromozomul i plasmidele bacteriene;
- genomul bacteriofagilor.
Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de repliconi. O gen
structural din cromozom are toat informaia necesar sintezei iniiatorului replicrii (o
protein complex). Dup ce replicarea a nceput, nu mai poate fi oprit pn n momentul cnd
se ajunge la dedublarea cromozomului.
Cromozomul bacterian funcioneaz ca un replicon, fapt dovedit de experiena n care
fragmentele de ADN introduse ntr-o celul bacterian (de ex. prin conjugare) nu se pot replica
dac rmn libere n citoplasm, dar vor putea fi replicate odat cu ntregul cromozom n
cazul n care sunt integrate n cromozomul bacterian.
65
Replicarea corect este controlat de un mecanism foarte precis care identific apariia de
nucleotide libere, mperecheate eronat i n momentul apariiei unui astfel de eveniment
nucleotidul este tiat iar polimerizarea se oprete (corectitudinea citirii este realizat cu
ajutorul ADN-polimerazei I).
5. 2. Hibridizarea acizilor nucleici
Reacia de hibridizare a acizilor nucleici se poate realiza datorit complementaritii
nucleotidelor (structura primar). Prin aceast tehnic se poate demonstra nrudirea sau
eventual identitatea a dou microorganisme, pe baza gradului (procentului) de omologie a
secvenelor nucleotidice.
Din punct de vedere tehnic, cultivm o bacterie de referin (cunoscut) n aa fel nct s
putem marca ADN-ul cromozomial (ns uneori aceste experiene se fac prin marcarea ADN-ului
plasmidic). Spre exemplu, o variant poate fi reprezentat de cultivarea n mediu cu timidin
tritiat, astfel nct rezult marcarea radioactiv a ADN-ului cu tritiu. ADN-ul extras din fiecare
microorganism este tratat pentru a obine fragmente monocatenare. ADN-ul dublu catenar se
reface, dac fragmentele de ADN (int) ale bacteriei testate au secvene nucleotidice
complementare cu fragmentele ADN (sond molecular) de referin. Cu ct gradul de
complementaritate dintre sonda molecular i int este mai mare, cu att structura hibrid
format va fi mai stabil i mai greu de disociat. Actualmente sondele moleculare sunt
sintetizate chimic sau enzimatic.
Utilitatea hibridizrii acizilor nucleici
Aceast tehnic se utilizeaz n taxonomia microbian i st la baza funcionrii sondelor
nucleotidice, care depisteaz rapid i cu foarte mare sensibilitate microorganisme sau numai
unii determinani genetici ai acestora. Un alt aspect important este reprezentat de specificitatea
sondei utilizate. Se apreciaz, c pentru a elimina riscul unei hibridizri ntmpltoare, sonda
nucleotidic ar trebui s aib cel puin 20 nucleotide.
5. 3. Amplificarea genetic
conceptul amplificrii cantitii de acizi nucleici a fost introdus n 1983 de ctre Mullis, dar anul
1955, odat cu descoperirea ADN polimerazei I, a reprezentat un moment crucial. Folosind
ADN-polimeraza i dou secvene scurte de ADN (oligonucleotide, primeri), s-a pus la punct un
test repetitiv de sintetizare a ADN-ului care a fost numit Reacia de polimerizare n lan
(Polymerase Chain Reaction, PCR).
ADN-polimeraza este capabil s conduc la sinteza unui al doilea lan de ADN, ntotdeauna
orientat 5-3, folosind ca substrat patru nucleotide trifosfat, un lan de ADN ca matrice
(model) i un fragment scurt de ADN complementar utilizat drept primer (amors). Pentru un
lan polinucleotidic, vom utiliza de fapt doi primeri, care sunt complementari pentru dou
secvene specifice i diferite ale ADN-ului int.
Iniierea sintezei de ADN va putea avea loc numai dup ce ADN-ul dublu catenar este denaturat
(termic). Urmeaz o etap de rcire, permind astfel ataarea primerilor (care sunt furnizai n
exces) de fragmentele de ADN complementar. Sinteza de ADN mediat de ADN-polimeraz va
produce dou molecule dublu catenare. Dac procesul se repet, vor rezulta patru molecule de
66
ADN. ADN-ul se multiplic exponenial (dublndu-se de fiecare dat) ori de cte ori se repet
reacia. Teoretic, PCR poate amplifica un fragment scurt de ADN pornind de la o singur
molecul la 1.000 de copii, dac procesul se repet de 10 ori i la circa un milion de copii, dac
procesul se repet de 20 de ori. Acest proces poate avea loc automat ntr-un aparat numit
termociclor; aparatul repet ciclul constnd n denaturarea prin cldur (la 94-96C), ataarea
primerilor (la 40-60C) i sinteza ADN-ului (la 65-75C), folosind ADN-polimeraza termostabil
(Taq-polimeraza) izolat de la o bacterie, care triete n izvoarele termale din Yellowstone
National Park, Thermus aquaticus.
Aplicaiile tehnicii de amplificare genetic
PCR a nceput s fie aplicat n numeroase domenii ale cercetrii medicale fundamentale.
Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum i de metoda de extragere i de
recuperare a ADN-ului. Datorit sensibilitii extrem de mari a procesului, contaminarea
datorat manipulrii produselor de amplificare PCR obinute anterior n acelai laborator poate
reprezenta o problem deosebit de serioas. Contaminarea se poate realiza fie ntre probe, n
timpul desfurrii protocolului de lucru, fie datorit diferitelor manipulri. Prima variant este
mai uor de evitat, astfel nct sursa major de contaminare n laboratorul de biologie
molecular rmne eventuala contaminare a reactivilor. Verificarea acestei posibile erori este
obligatorie pentru orice reacie PCR, printr-o reacie de control (control negativ) la care nu se
adaug ADN. Aceast problem a contaminrii nu este superpozabil cu cea a rezultatelor falspozitive. O contaminare ntre probe este mult mai dificil de identificat. Principalele msuri de
precauie ar fi reprezentate de: utilizarea unor camere de lucru separate pentru manipularea
produselor care conin ADN i respectiv pentru prepararea celorlali reactivi, folosirea
micropipetelor (dou seturi de micropipete, pentru produse cu i fr ADN), utilizarea conurilor
cu filtru, lucrul ntr-o ni special amenajat i dotat cu hot cu flux laminar de aer.
Recent s-a demonstrat faptul c lumina ultraviolet are capacitatea de a inactiva ADN-ul dublu
catenar contaminant.
Alte modaliti de a elimina (diminua) riscurile contaminrii sunt reprezentate de: includerea
unei nucleotide modificate n PCR (nlocuirea deoxiuridinei-P cu deoxitimidin-3P) i respectiv
folosirea enzimelor de restricie pentru ndeprtarea ADN-ului contaminat din RT-PCR
(transcriere invers).
Utilizarea PCR n diagnosticul bolilor infecioase
PCR poate fi util n diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau parazitare.
n infecia cu HIV, PCR i-a dovedit utilitatea att n diagnostic (secvenele HIV-1 sunt detectabile
n 100% din cazuri atunci cnd virusul este cultivabil i n 64% din cazuri n situaia unor culturi
negative), ct i n stabilirea prognosticului. n cazul infeciilor cu citomegalovirus (CMV), PCR
poate detecta ADN viral n snge cu 7-10 zile mai devreme dect sunt identificate antigenemia
sau viremia. n mod asemntor, PCR este util n identificarea altor ageni etiologici (n
contextul general epidemiologic, clinic i paraclinic) precum virusurile hepatitei B i C, virusurilor
papilloma, herpes virusurilor sau a unor enterovirusuri.
Diagnosticul infeciilor bacteriene poate beneficia de asemenea de tehnicile moleculare prin
amplificare genic. Actualmente sunt puse la punct protocoalele de lucru utile identificrii
67
69
Plasmidele R (de rezisten la antibiotice) confer celulei purttoare rezistena la unul sau la mai
multe antibiotice. Plasmidele R au o structur genetic complex, fiind alctuite din:
- gene care asigur proprietatea de rezisten la antibiotice;
- gene care formeaz factorul de transfer al rezistenei (RTF).
Asigur capacitatea de replicare autonom i de transfer prin conjugare (cele dou tipuri de
elemente pot exista independent sau se pot asocia).
Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacterian sau prin transducia mediat
de bacteriofagi.
Plasmidele Col
Plasmidele Col codific proprietatea unor bacterii de a elabora substane antibiotice de tip
special, numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc).
Plasmidele Col sunt transferabile de la tulpinile Col+ la tulpini Col- prin transformare genetic,
transducie fagic sau prin conjugare.
Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (fa de specia omolog), iar
biosinteza lor nu are efect letal pentru specia productoare.
Factorul F (factorul de sex, factorul de fertilitate)
Factorul F controleaz capacitatea unor bacterii de a aciona ca donoare de material genetic n
procesul de conjugare. Factorul F codific structurile (de exemplu pilul F) i enzimele necesare
transferului de ADN.
n funcie de prezena plasmidelor F, de raportul lor cu cromozomul bacterian i de modul n
care faciliteaz transferul de material genetic, bacteriile se pot grupa n patru categorii distincte:
bacterii F-; bacterii F+; bacterii Hfr; bacterii F.
Bacteriile FBacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule femele care se comport
ca receptoare de material genetic.
Bacteriile F+
Bacteriile F+ dein factorul F autonom n citoplasm. Sunt echivalente unor celule masculine,
donoare de material genetic, capabile s transmit factorul F.
Bacteriile Hfr (High frequency of recombination)
Bacteriile Hfr (cu mare frecven de recombinare) dein factorul F integrat n cromozomul
bacterian. Se comport ca donoare de material genetic, au o mare frecven de conjugare i
recombinare. De obicei prezena factorului F integrat determin transferul unui numr variabil
de gene cromozomale i mai rar, chiar transferul factorului F.
Bacteriile F
Bacteriile F dein o structur plasmidic de tip special (factor de fertilitate recombinant) care a
fost anterior integrat n structura unui cromozom i s-a desprins din acesta, ncorpornd n
structura sa unele gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de mascul i se comport ca
donoare de material genetic (factorul F).
70
71
Mutaiile extinse reprezint alterri care depesc limitele unui codon, putnd afecta secvene
mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaie poligenic).
Mutaiile regresive (retromutaii) afecteaz celule mutante, determinnd revenirea acestora la
tipul iniial, restabilind secvena nucleotidic originar.
Mutaiile supresoare permit exprimarea funciei anterioare a genei, dei o modificare a
secvenei bazelor nucleotidice persist.
Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o bacterie
receptor sunt:
- transformarea;
- transferul mediat de bacteriofagi (transducia);
- conjugarea.
Transformarea
Transformarea este un transfer genetic realizat atunci cnd bacteria accept ADN liber provenit
de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie s fie competent n a
accepta ADN-ul de la bacteria donor.
Prima transformare a fost descris n 1928 de ctre Griffith, n experimente referitoare la
virulena pneumococilor fa de oarecele alb.
Transformarea poate avea loc doar atunci cnd bacteriile intr n faza staionar a ciclului
celular. Ptruns n celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate nlocui (prin
recombinare genetic) o secven nucleotidic omolog, bacteria receptoare dobndind un
caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice).
Unele bacterii sunt competente n mod natural. n cazul bacteriilor care nu sunt natural
competente, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesar tratarea chimic
a acestora, de ex. cu ioni de calciu.
Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin:
- transducie;
- conversie lizogenic.
Transducia reprezint transferul unui fragment genetic (cromozomial sau extracromozomial) de
la o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un fag temperat). Fagul se
numete transductor. Bacteria receptoare se numete transductant.
Transducia specializat (restrictiv) este caracteristic fagilor transductori care au proprietatea
de a transfera numai un numr restrns de gene bacteriene situate n imediata apropiere a
situsului de legare a profagului n cromozomul bacterian.
Transducia generalizat (nerestrictiv) presupune c teoretic, oricare din genele cromozomului
bacterian, indiferent de poziia lor n genom, pot fi ncorporate n mod accidental n particula
viral matur pentru a forma un fag transductor, care le poate transmite unor bacterii
73
5. 6. Povestire adevrat
Folosirea cunotinelor din domeniul geneticii, n munca de detectiv
mbinarea examinrii foarte detaliate a secvenelor genomice microbiene cu o cunoatere
aprofundat a evoluiei bacteriilor poate fi util att n obinerea unor diagnostice de mare
precizie, ct i n aplicarea unor teste de diagnostic relevante n medicina legal.
Spre exemplu, dorim s amintim situaia creat n 2001 n urma atentatelor teroriste din SUA,
cnd o serie de instituii, dar i persoane particulare, au primit plicuri avnd un praf alb sau
maroniu, care n unele cazuri (au existat i alarme false) s-a dovedit a conine spori de Bacillus
anthracis. Cteva elemente concrete cu privire la situaia din acea perioad vor fi prezentate n
capitolul dedicat genului Bacillus.
Dup cartografierea genomului de B. anthracis s-au evideniat ca fiind posibile circa 3.500 de
mutaii nucleotidice unice. n funcie de acestea se tie actualmente, c tulpinile cunoscute pot
fi mprite n 8 grupe, fiecare grup fiind la rndul su divizat n mai multe subgrupe. Toate
aceste grupe studiate sunt foarte stabile privind o posibil variaie genetic (nu exist crosslink-uri ntre grupe), ceea ce face ca Bacillus anthracis s reprezinte un candidat ideal pentru
studii de biologie molecular folosite n scopul punerii la punct a unor teste, care s identifice cu
mare finee o anumit tulpin, inclusiv originea acesteia.
74
Prin metode ale biologiei moleculare s-a demonstrat de exemplu c tulpina de B. anthracis
folosit n atacurile teroriste fcea parte din grupul Ames. Aceast ncadrare a putut s fie
stabilit prin evidenierea a 6 mutaii specifice grupului Ames (4 la nivel cromozomial, una la
nivelul plasmidului pX01 i una la nivelul plasmidului pX02).
Aadar, iat cum, pentru o bacterie stabil din punctul de vedere al unei posibile variaii
genetice, se poate realiza o adevrat munc de detectiv i prin metode specifice de laborator
se poate stabili originea i apartenena sa, pornind de la caracteristicile genetice.
75
insecticide,
77
79
pozitivi, coci gram negativi i gram pozitivi, micoplasme, chlamydii. Dintre posibilelel reacii
adverse am putea aminti: fotosensibilitate, cefalee, vertij, convulsii.
Sulfamidele (sulfonamidele) sunt analogi structurali ai acidului paraaminobenzoic (PABA) i
inhib dihidro-pteroat-sintetaza. Se formeaz analogi nefuncionali ai acidului folic,
metabolismul celulei bacteriene fiind astfel inhibat. Rezistena apare prin alterarea
dihidropteroat-sintetazei scznd capacitatea de legare a sulfonamidelor i este mediat
plasmidic. Rezistena la un membru al familiei trebuie nregistrat ca rezisten i fa de
celelalte substane cu structur similar.
Trimetoprimul, omolog al acidului dihidrofolic, inhib reductaza acestui acid.
Sulfamidele i trimetoprimul pot fi utilizate separat pentru a inhiba creterea bacterian. Dac
sunt ns utilizate mpreun, vor produce o blocare dubl n secvena sintezei de ADN, rezultnd
o cretere marcat a activitii lor (sinergism). O astfel de substan, frecvent folosit n practica
medical, este cotrimoxazolul (ex. biseptol), coninnd sulfametoxazol i trimetoprim.
Pirimetamina, la fel ca i trimetoprimul, inhib dihidro-folat-reductaza.
Unele antibiotice, cum ar fi actinomicinele, sunt inhibitori eficieni ai sintezei de ADN; dar
realizeaz aceast inhibiie att la nivelul celulei bacteriene ct i la nivelul celulei animale,
nefiind suficient de selective pentru a putea fi utilizate n terapia antibacterian.
6. 3. 4. Clasificarea antibioticelor i chimioterapicelor dup spectrul de aciune
Prin spectrul de aciune antimicrobian se nelege lista grupurilor (speciilor) de bacterii asupra
crora un anume antibiotic sau chimioterapic este activ. n practic, trebuie cunoscut nu numai
spectrul antimicrobian iniial al fiecrui preparat antimicrobian, ci i modificrile ulterioare,
survenite n urma apariiei germenilor rezisteni.
Spectrul antimicrobian iniial este stabilit pentru fiecare antibiotic n parte, o dat cu
introducerea sa n terapeutic.
Antibiotice cu spectru ngust
Aceste antibiotice pot fi submprite n dou subgrupuri:
- antibiotice cu spectru de tip penicilinic, active pe bacili Gram-pozitivi, coci Gram-pozitivi i
coci Gram-negativi. Din acest grup fac parte majoritatea penicilinelor, macrolidele,
lincosamidele etc;
- antibiotice cu spectru de tip streptomicin, active pe bacili Gram-negativi, coci Gramnegativi, coci Gram-pozitivi. n acest grup sunt incluse aminoglicozidele, polimixinele etc.
Antibiotice cu spectru larg
Antibioticele din acest grup sunt active pe bacili Gram-pozitivi i negativi, coci Gram-pozitivi i
negativi. Sunt active i pe spirochete, leptospire, rickettsii, chlamydii, mycoplasme. n acest grup
au fost incluse cloramfenicolul i tetraciclinele.
La acest grup clasic de antibiotice cu spectru larg se pot aduga alte antibiotice, cum ar fi:
penicilinele cu spectru lrgit (ampicilina, amoxiciclina etc), ureidopenicilinele, tienamicinele,
cefalosporinele din generaiile II-IV, unele fluorochinolone, unele sulfamide etc.
6. 3. 5. Clasificarea antibioticelor i chimioterapicelor antibacteriene dup structura chimic
1. Antibioticele betalactaminice
a). Penicilinele
- penicilinele naturale (de exemplu penicilina G);
80
81
6. 4. Lantibioticele
Denumirea de lantibiotice a fost introdus relativ recent, fiind vorba de un grup special de
substane antimicrobiene cu o serie de proprieti datorit crora au fost clasificate ntre
antibiotice i bacteriocine. Lantibioticele sunt sintetizate de bacterii Gram-pozitive (ex. din
genurile Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Streptomyces) i prezint un spectru de
activitate specific fa de anumite bacterii Gram-pozitive. Din punct de vedere al structurii
chimice lantibioticele sunt polipeptide policiclice.
Masa molecular a acestor substane se situeaz ntre 1.825 daltoni (mersacidina) i 3.488
daltoni (Pep5). Pe baza structurii lor diferite, s-au descris dou tipuri de lantibiotice: A i B.
Tipul A: sunt lantibiotice produse de stafilococi, lactococi i bacili Gram-pozitivi, de ex. nisina,
subtilina, epidermina, gallidermina i Pep5.
Lantibioticele i au originea n proteine precursoare inactive (pre-lantibiotice) sintetizate la
nivel ribozomal, convertite enzimatic n polipeptide active din punct de vedere biologic. n
privina mecanismului de aciune se tie de ex. c nisina i Pep5 au activitate bactericid
depolariznd membrana citoplasmatic a celulei bacteriene, formnd pori i inducnd autoliza
acesteia. Datorit faptului c exist o specificitate a lantibioticelor fa de anumite bacterii se
consider c exist i alte mecanisme implicate.
82
Genele responsabile de sinteza lantibioticelor pot fi localizate cromozomial sau plasmidic. De ex.
n cazul nisinei, genele sunt localizate pe cromozonul celulei bacteriene (15) de Lactococcus
lactis, iar informaia genetic pentru biosinteza epiderminei este localizat pe plasmidul pTu 32.
Utilizarea lantibioticelor n industria alimentar i n practica medical
Dintre lantibioticele cunoscute, nisina are cea mai larg aplicabilitate practic. Nisina inhib
tulpinile din genurile Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria la o
concentraie 30 ml / ml, activitatea inhibitorie fiind maxim la pH < 5,5. Nisina inhib
sporularea bacteriilor din genurile Clostridium i Bacillus; nu are efect asupra bacteriilor Gramnegative sau asupra fungilor. Nisina este folosit pe scar larg n industria alimentar drept
conservant natural pentru vegetale, fructe, brnzeturi proaspete i procesate, carne, pete,
cacao, buturi alcoolice (vinuri). Nu prezint dezavantajele nitrailor i nitriilor (produc
nitrozamin cu aciune carcinogen). n practica medical este utilizat n unguente cosmetice.
Este folosit i ca agent terapeutic n medicina veterinar (n tratamentul local al infeciilor
bacteriene).
Epidermina, produs de Staphylococcus epidermidis, are aciune antimicrobian fa de
germeni care pot aciona patogen la nivel tegumentar: Propioniibacterium acnes, Streptococcus
spp., Staphylococcus spp. Astfel, epidermina i gallidermina (sintetizat de Staphylococcus
gallinarum) constituie alternative terapeutice pentru derivatele de vitamina A i eritromicin, de
ex. n cazurile de acnee juvenil, eczem, foliculite etc.
Dintre lantibioticele de tip B putem exemplifica lanthiopeptina, care are aciune antiviral fa
de virusul Herpes simplex.
83
mutaii ntr-un singur pas (single large step mutations) o singur mutaie duce la
creterea CMI pentru un anumit antibiotic. Pot duce la euarea tratamentului atunci cnd
acesta este instituit cu un singur antibiotic.
mutaii n mai muli pai (multistep mutations) mutaii secveniale care duc la creterea
gradat a CMI.
84
85
86
controlul strict al folosirii acestor medicamente dup o prescriere corect (ex. nu pentru
un guturai sau alt infecie insensibil la antibiotice anti-bacteriene)
s colecteze date
s trimit rezultatele obinute n cadrul fiecrui proiect ctre toate rile membre. (9)
CDC a dezvoltat la rndul su un plan de aciune cu privire la rezistena la antibiotice care
cuprinde patru mari puncte:
Supraveghere,
Prevenire i Control,
Cercetare i
Producie. (10)
87
reducerea tensiunii arteriale maxime cu peste 40% fa de nivelul obinuit. Prezena sau
suspiciunea sepsisului, ocului septic sau a sindromului de disfuncie multiorganic, chiar i
atunci cnd nu sunt clar demonstrate, constituie un argument hotrtor pentru administrarea
de antibiotice sau chimioterapice datorit gravitii deosebite a acestor entiti clinice. Totui,
chiar i n aceast situaie nu exist nici un argument logic de a institui antibioticoterapia nainte
de a recolta produse pentru a fi examinate n cadrul diagnosticului bacteriologic direct.
2. Care este terenul pe care s-a instalat infecia?
Evaluarea terenului, a situaiei gazdei care urmeaz a fi tratat, are un rol important n stabilirea
oportunitii antibioticoterapiei. Infeciile uoare, aprute la persoane tinere anterior
sntoase, de obicei nu necesit tratament cu antibiotice sau chimioterapice. Aceleai infecii
aprute la pacienii cu imunodepresie fac antibioticoterapia strict necesar (i este indicat s
utilizm medicamente bactericide). Existena unor factori favorizani mrete prezumia de
infecie i necesit instituirea terapiei cu antibiotice, chiar n contextul unor semne fizice
(exemplu febr) aparent minore. Aceti factori sunt de obicei reprezentai de imunodepresia la
nivelul ntregului organism (la pacieni cu diabet, ciroz, cancer, SIDA, politraumatisme, operaii
extinse etc.) sau de imunodepresie local (datorit prezenei unor catetere, sonde, unturi,
proteze implantate etc.). La bolnavii imunodeprimai se va opta de obicei pentru antibiotice
bactericide; n aceast situaie este de obicei acceptat asocierea de antibiotice.
Etapa n care se alege medicamentul antimicrobian care urmeaz a fi administrat
Din gama larg de antibiotice disponibile la ora actual (peste 250 de molecule diferite),
selectarea celui mai indicat se face dup mai multe criterii.
Relativ frecvent, alegerea se bazeaz pe criteriul prezumiei etiologice, cu condiia nceperii
diagnosticului microbiologic direct anterior nceperii terapiei (nu exist nici o justificare,
indiferent de eventuala gravitate a maladiei, pentru a administra nti antibiotice i apoi a-i
aduce aminte c era preferabil s recoltezi produsul patologic, s l trimii ctre laborator n
vederea izolrii, identificrii i stabilirii sensibilitii/rezistenei la antibiotice i chimioterapice a
germenului implicat n respectiva patologie). Ulterior, alegerea poate fi corectat pe baza
precizrii definitive a etiologiei (cu condiia ca diagnosticul microbiologic direct s fi fost
lansat), dar i pe baza aprecierii eficienei clinice i a efectelor adverse ale terapiei iniiale.
n vederea alegerii medicamentului antimicrobian pe care urmeaz s l administrm pacientului
cu o boal infecioas este strict necesar s: a). stabilim diagnosticul etiologic, s ncercm i s
reuim diferenierea infeciilor bacteriene (tratabile cu antibiotice i chimioterapice antibacteriene) de infeciile virale; elementele care ne permit orientarea spre etiologia bacterian
ar fi: un tablou clinic mai sever (exist i infecii virale foarte grave, nsoite de modificri
substaniale ale strii generale a pacienilor), febra mai nalt, frisoanele, inflamaia mai
accentuat, prezena supuraiilor, leucocitoza (numeric i procentual n analiza formulei
leucocitare). Trebuie s realizm de asemenea o examinare clinic n detaliu a pacientului (din
cretet i pn la tlpi), examenul microbiologic (inclusiv examinarea microscopic
citobacteriologic); b). testm sensibilitatea la antibiotice a bacteriei izolate i implicate n
infecia supus antibioticoterapiei (de ex. antibiograma); c). realizm sau primim informaii
privind diagnosticul anatomo-clinic al bolii; d). cunoatem proprietile farmacologice ale
antibioticelor propuse a fi folosite; e). avem n vedere i criteriul economic (raportul costeficien); f). analizm necesitatea unei eventuale asocieri de antibiotice.
89
Trebuie de asemenea s avem n vedere i s decidem care este calea i modul de administrare
pentru antibioticul ales n funcie de gravitatea, localizarea infeciei, caracterul acut sau subacut
al bolii, tipul antibioticului ales, tolerana pentru acest antibiotic a pacientului tratat. Spre
exemplu, putem folosi penicilina V (de administrare oral) n infecii de gravitate medie sau
chiar i n unele infecii grave, n funcie de localizare, ca alternativ pentru penicilina G sau alte
preparate beta-lactamice, dac bacteria izolat i pstreaz sensibilitatea fa de penicilin,
dac gazda nu prezint hipersensibilitate de tip I fa de penicilin i dac vom reine care este
procentul de absorbie al acestui medicament i n acest sens vom administra doze duble
comparativ cu dozele utilizate pentru administrarea parenteral i pe stomacul gol.
n cazul n care analiza noastr a permis rspunsul la toate ntrebrile listate mai sus se vor
stabili dozele necesare, intervalele ntre administrri, durata tratamentului, precum i
momentul opririi acestuia. Controlul terapiei antimicrobiene se va realiza pe tot parcursul
administrrii incluznd metode clinice (de ex. ameliorarea semnelor i simptomelor) i metode
de laborator (examene paraclinice, dozarea antibioticelor n ser etc.).
doar bnuiala unei infecii. Este incorect s decidem antibioticoterapia la ntmplare sau
pe ncercate (cu o eventual eroare suplimentar reprezentat de schimbarea succesiv a
antibioticului n raionamentul c poate de data aceasta va merge fr s ncercm s ne
fundamentm decizia pe criterii raionale (cel puin pe criterii de probabilitate). Raionamente
simpliste de tipul febr = infecie = antibiotice i chimioterapice (deseori ntlnite n practic, din
pcate) nu pot conduce dect la eec, la modificarea evoluiei bolii i la mpiedicarea stabilirii
ulterioare a diagnosticului (mascare clinic i bacteriologic) i tratamentului corect. Cu privire
la criteriile de probabilitate este adevrat c n Romnia nu exist ghiduri i recomandri privind
utilizarea corect a antibioticelor, bazate pe studii actuale, realizate pe eantioane
reprezentative statistic pentru Romnia i n aceste condiii referina este reprezentat de
studiile fcute n SUA sau n Europa de Vest i de manualul domnului profesor Mircea Angelescu
(1998).
n al doilea rnd este incorect s utilizm antibiotice fr a solicita, fr a obine i fr a
interpreta corect datele de laborator. Indiferent de specialitate (medical, chirurgical) i
indiferent de supra-specialitate este necesar cunoaterea i utilizarea corect a unor noiuni
elementare de bacteriologie. Este absolut incorect s ncepem antibioticoterapia nainte de
recoltarea produsului patologic. n funcie de contextul clinic i de gravitatea patologiei n cazul
creia presupunem drept etiologie o infecie bacterian este recomandabil s solicitm i
efectuarea unor examene paraclinice de baz (leucogram, VSH, radiografie, sumar de urin
etc). Nu trebuie s uitm c atunci cnd suspicionm o infecie bacterian, indiferent de
specialitate (aceste analize pot fi efectuate chiar i personal; ca alternativ trebuie s stabilim o
foarte bun colaborare ntre clinic i laborator) avem la ndemn posibilitatea i necesitatea
efecturii de preparate ntre lam i lamel (native) i frotiuri (colorate Gram, cu albastru de
metilen, Giemsa etc.) din produsul obinut prin recoltare de la pacientul cu o presupus infecie
bacterian. Realizarea i examinarea frotiurilor poate dura chiar i numai 5 minute, permind n
scurt timp obinerea unui rezultat orientativ, uneori foarte important. Nu ar trebui s indicm
tratamentul cu antibiotice fr a ine seama de sensibilitatea la antibiotice a germenului. n
cazul unor infecii grave se poate ncepe antibioticoterapia, dup criterii de probabilitate. ns,
n cazul n care produsul patologic a fost recoltat anterior, a fost transmis ctre laborator, a fost
prelucrat iar agentul etiologic a fost identificat i s-a stabilit care este sensibilitatea la antibiotice
i chimioterapice iar evoluia clinic i paraclinic nu este favorabil, demonstrnd c
antibioticul ales nu a fost cel mai potrivit, pentru c avem rezultate de laborator vom putea
schimba tratamentul, de aceast dat pe criterii tiinifice evitnd schimbri repetate i la
ntmplare sau chiar inducerea unui prognostic rezervat pacientului supus tratamentului din
clinica n care ne desfurm activitatea). Trebuie s nu greim i s lum n considerare drept
ageni etiologici diferii germeni saprofii sau condiionat patogeni, cultivai din focare sau
caviti septice deschise, sau izolai din produse contaminate n cursul recoltrii.
O alt eroare ar fi ignorarea posibilitii ca germenul izolat s fie doar unul dintre cei 2 sau mai
muli germeni implicai.
nc din anul doi de studiu se obin primele date cu privire la toate aspectele descrise mai sus
precum i cu privire la testarea sensibilitii la antibiotice (de ex. antibiograma), metod care nu
trebuie interpretat mecanic, nu trebuie nici subestimat i nici supraevaluat (mai ales atunci
cnd este efectuat difuzimetric i / sau nu este standardizat).
91
Aa cum am mai subliniat n cadrul acestui capitol, nu trebuie niciodat s absolutizm datele
clinice, datele paraclinice, datele de laborator, luate fiecare n parte i scoase din contextul
general. Nu exist o prioritate pentru clinic sau o prioritate pentru laborator; datele trebuie
interpretate, integrate i utilizate n contextul clinic, paraclinic i de laborator general. Aceasta
reprezint, dup opinia noastr, un aspect esenial al medicinii pe care dorim s o practicm la
cel mai nalt nivel, n favoarea pacienilor pe care trebuie s i tratm.
n al treilea rnd este incorect s prescriem fr justificare antibiotice i chimioterapice, spre ex.
n stri febrile neinfecioase (maladii cu mecanism prin hipersensibilitate, maladii ale esutului
colagen, neoplazii etc), n boli infecioase cu ageni patogeni care nu sunt sensibili la antibiotice
(ex. este absurd s utilizm penicilin sau orice alt antibiotic antibacterian n tratamentul
gripei). Este de subliniat c este incorect s indicm antibioterapia (i s ateptm ca indicaia
noastr s aib efect curativ) n cazul unor supuraii colectate neglijnd i / sau temporiznd
incizia i drenajul (antibioticul nu difuzeaz n focarul purulent; n plus, va fi inactivat la acest
nivel).
n al patrulea rnd, atunci cnd este necesar antibioterapia, este incorect s alegem eronat un
antibiotic sau o asociere de antibiotice (n cazul n care aceast asociere este strict necesar),
prin necunoaterea sau nerespectarea spectrului antimicrobian, prin nefolosirea antibioticului
de elecie (ex. folosirea augmentinului sau cloramfenicolului sau tetraciclinei n angina
streptococic la pacientul care nu prezint hipersensibilizare la penicilin), prin utilizarea de
antibiotice nedifuzibile n focar (infecia urinar nu se poate trata cu cloramfenicol deoarece
cloramfenicolul se elimin prin bil sau prin urin sub form de metabolit inactiv). n plus nu
trebuie s uitm faptul c lucrm cu bolnavi i nu cu boli i n acest sens pentru un anume
pacient pot exista anumite contraindicaii specifice (ex. hipersensibilizare fa de antibioticul pe
care dorim s l utilizm, cu posibilitatea apariiei unui oc anafilactic).
Este incorect s indicm asocierea antibioticelor antagoniste din punct de vedere al
mecanismului (ex. penicilin G + tetraciclin) sau s indicm asocierea de antibiotice cu acelai
spectru (eroare poate fi dramatic n cazul asocierii a dou aminoglicozide sau a dou
antibiotice cu spectru larg). Primul exemplu a fost ales pentru a atrage atenia privind eroarea
de a asocia antibiotice care pot da reacii adverse serioase (ex. afectarea pn la determinarea
apariiei surditii prin afectarea nervului acustico-vestibular), reacie de notorietate n cazul
aminoglicozidelor (streptomicin, kanamicin, gentamicin, amikacin etc.).
n al cincilea rnd, este incorect s indicm din start antibiotice i chimioterapice ntr-un aazis scop profilactic. Spre ex. n cazul n care pacientul prezint un panariiu la degetul inelar
singura atitudine corect este de realiza incizia, drenajul, antiseptizarea i pansarea local,
vindecarea urmnd a se produce; nu este necesar ci este chiar contraindicat s recomandm
administrarea de antibiotice i chimioterapice. nc din primii ani de studenie se poate reine
faptul c, n principiu, utilizarea antibioticelor n scop profilactic trebuie privit cu rezerve
serioase. Pe de alt parte, trebuie cunoscute situaiile n care antibioticoprofilaxia este util i
recomandabil (de ex. nainte i dup efectuarea unei extrageri dentare, manevr sngernd,
la un pacient care are stenoz mitral).
92
6. 8. Povestiri adevrate
6. 8. 1. Gentamicina administrat n aerosoli
Datorit conjuncturii actuale internaionale, s-a concluzionat c probabilitatea unui atac terorist
cu arme biologice este din ce n ce mai mare. Avnd n vedere c prevenirea poate fi o mai bun
form de aprare, specialitii occidentali au hotrt s pun la punct un program naional de
protecie anti-bioterorism. n Statele Unite, acest program poart numele de BioShield.
Iniial au fost identificate structurile microbiene sau tulpinile care ar putea fi utilizate n cazul
unui atac biologic, cele mai importante fiind: toxina botulinic, Bacillus anthracis, virusurile
febrei hemoragice, Yersinia pestis, Francisella tularensis i virusul variolic.
n afar de identificarea problemelor poteniale a fost necesar gsirea soluiilor de prevenire /
control / combatere.
n cadrul acestui capitol vom discuta numai subiectul legat de un antibiotic cunoscut, dar
condiionat ntr-o form special, prezentnd astfel o serie de avantaje. Gentamicina i
respectiv mecanismul de aciune al acesteia sunt elucidate. Condiionarea n aa fel nct
administrarea s poate fi fcut pe care inhalatorie prezint o serie de avantaje, spre exemplu:
93
a. eliberare mai rapid; b. biodisponibilitate mai bun; c. remanen mai bun; d. posibilitate de
dozare mai bun; e. capacitatea de a ajunge mai uor i mai direct la nivelul organelor afectate.
Att n cazul tularemiei ct i n cazul pestei, formele pulmonare sunt cele mai grave, cu cea mai
mare mortalitate i cu cea mai mare contagiozitate, cu alte cuvinte tratamentul acestor forme
de boal reprezint o prioritate.
Avnd n vedere toate aceste meniuni, gentamicina administrat pe cale inhalatorie trebuie
avut n vedere att pentru tratament ct i pentru profilaxia post-expunere n cazul unui atac
bioterorist.
Aceste studii sunt foarte recente iar informaiile au devenit disponibile n ultima parte a anului
2007.
6. 8. 2. A da sau a nu da aceasta este intrebarea!
Cnd administrm antibiotic? Mai ales c, spre exemplu, administrarea unui antibiotic adecvat
la pacienii cu sepsis diminu mortalitatea ntr-un procent semnificativ cu ct se face mai
precoce (de ordinul orelor). Aadar, administrarea de urgen a unui antibiotic depinde de
capacitatea de a recunoate bolnavul critic. Legarea ulterioar de etiologia infecioas a
strii critice nu face dect s confirme decizia. Dac va fi incriminat, ulterior, o alt etiologie a
strii critice (IMA, pancreatita acut, HDS cu oc etc) oprirea antibioticului nu afecteaz n sens
negativ evoluia, aa cum ar fi fost afectat de ntrzierea administrrii acestuia. La vrstnici,
infecia urinar poate fi frecvent o cauz de sepsis. La un pacient vrstnic, febril, cu
hipotensiune, cu imagine EKG nespecific pentru un IMA (posibil in primele ore), ateptm chiar
i 4 ore fr s administrm antibiotic, pn la elucidarea modificrilor EKG, dar dac sursa
hipotensiunii era un sepsis cu punct de plecare renal, sau altul, atunci mortalitatea poate crete
de la simplu la dublu (17%-30%).
La pacientul care nu e critic, se pot monitoriza semnele clinice i se poate atepta cu
administrarea antibioticului pn la determinarea posibilei etiologii infecioase.
Dar pe de alt parte nu trebuie s uitm c nimeni nu ne oprete, indiferent de decizia care va fi
luat, s recoltm snge pentru hemoculturi, urin pentru uroculturi sau alte produse, care pot
fi trimise ctre laborator nainte de nceperea tratamentului antibiotic.
6. 8. 3. S-a ntmplat nu demult n Romnia ...
V aducem la cunotin cazul pacientei n vrst de 21 de ani, care s-a prezentat la medic
pentru o plag tiat la nivelul falangei distale a policelui minii stngi. Pacienta se tiase n
marginea unei conserve pe care o desfcuse de curnd. Plaga era n aparen profund i
secionase coronar pulpa degetului ptrunznd i n patul unghial. Sngerarea abundent i
ndelungat a plgii, dar i durerea pulsatil la nivelul policelui, aprut dup aproximativ o or,
au fost motivele prezentrii la medic. Pacienta a menionat faptul c acas a aplicat ap
oxigenat pe plag (a procedat corect, fiindc apa oxigenat, prin efectul de spumare,
antreneaz cheagurile de snge i resturile anorganice de la nivelul leziunii, dar realizeaz i o
uoar hemostaz, oxigennd totodat plaga i prevenind astfel dezvoltarea germenilor
anaerobi). De asemenea, a aplicat local un antibiotic sub form de pulbere (ceea ce nu este la
fel de corect).
La spital, din cauza durerii intense care a cuprins ntre timp ntreaga mn pn la articulaia
pumnului, medicul a evitat aplicarea unui prinit alcoolizat, realiznd hemostaza plgii i
efectund n continuare toaletarea marginilor i interiorului acesteia, aplicnd i ap oxigenat.
94
Leziunea s-a dovedit a fi minor i n mod cert nu necesita suturare. Totui, medicul curant
cunotea faptul c pacienta este student la facultatea de medicin i studiind n diferite spitale,
lua aproape zilnic contact cu bolnavii, cu echipamentul medical, dar i cu celelalte cadre
medicale. n mediul spitalicesc, att pacienii ct i membrii personalului sanitar se pot infecta
dac exist soluii de continuitate i dac nu se respect msurile de prevenire i control. n
acest context, medicul i-a propus pacientei iniierea unei antibioterapii cu oxacilin
(menionnd c stafilococul alb i auriu rspund bine), timp de cinci zile, pentru a preveni
apariia unei infecii piogene a degetului. Un motiv de ngrijorare l constituia durerea
chinuitoare, pulsatil la nivelul minii (apare de obicei ca un fenomen nsoitor pentru un
panariiu subcutanat pulpar, ns abia dup 24 - 48 de ore; n cazul de fa durerea s-a instalat la
o or de la lezarea zonei).
Dei iniial reticent la ideea de a lua antibiotice n scop profilactic, pacienta a acceptat,
convins de ctre medic c riscul apariiei unei infecii era mare.
A doua zi, sftuindu-se cu un medic din universitate, pacienta a cntrit mai bine acest risc,
ajungnd la concluzia c antibioterapia pe care o urma nu era nici pe departe necesar. Medicul
de la spital a tratat leziunea ca pe o plag chirurgical pentru care antibioterapia ar fi putut s
fie instituit n scop profilactic (nainte de realizarea contaminrii plgii) sau metafilactic (n
contextul unei inoculri bacteriene prezumtive). O alt eroare, de aceast dat a pacientei, a
fost aplicarea local de pulbere antimicrobian imediat dup lezarea zonei. Evident c riscul
apariiei unei infecii exista, la fel ca i n povestea drobului de sare. Pacienta a decis s
urmeze antibioterapia timp de trei zile n loc de cele cinci recomandate; evoluia a fost
favorabil, iar plaga s-a cicatrizat fr complicaii. Suntem convini c acest lucru a fost posibil
nu datorit antibioticelor administrate, ci datorit faptului c leziunea a fost minor, precum i
datorit capacitii de rspuns a organismului. Pacienta a decis ca pe viitor, n situaii similare, s
analizeze mai atent beneficiile i riscurile administrrii de antibiotice, acest caz constituind un
elocvent contra-exemplu.
n concluzie, chiar dac fenomenul apariiei rezistenei la antibiotice este bine cunoscut i
neles, iat c n Romnia anului 2007 nc se mai prescriu antibiotice pentru orice zgaib!
6. 8. 4. Antibiotice folosite ca biostimulante
Nu doar fiinele umane sunt supuse uzului iraional al antibioticelor, ci i animalele de ferm.
Situaiile de necesitate, n care acestea chiar sunt bolnave, reprezint numai o mic parte din
totalul situaiilor n care le sunt administrate antibiotice. n majoritatea cazurilor,
medicamentele antimicrobiene sunt introduse n doze mici n hrana sau apa lor pentru efectul
biostimulant.
nc din anii 40, antibioticele au nceput s fie folosite n fermele din toat lumea pentru
capacitatea de a determina o cretere mai rapid n greutate a animalelor. O alt consecin
este c acestea devin adevrate rezervoare de germeni rezisteni, care pot fi apoi transferai
omului. Producia de carne crete spre beneficiul ctorva productori, dar crete concomitent i
ponderea bacteriilor rezistente la antibiotice, n dauna sntii unei lumi ntregi.
n UE, de la 1 ianuarie 2006 a intrat n vigoare o directiv a Comisiei Europene, care interzice
folosirea antibioticelor n scop biostimulant. Lista antibioticelor utilizate n alt scop dect cel
terapeutic s-a micorat treptat, de la an la an, pentru ca n 2006 responsabilii europeni, pe
deplin convini de concluziile cercettorilor n domeniul microbiologiei, s le interzic complet.
95
Fenomenul rezistenei microbiene la antibiotice are o istorie aproape la fel de lung ca i cea a
antibioticelor. n discursul rostit cu ocazia primirii Premiului Nobel, Alexander Fleming avertiza
n legtur cu uurina cu care pot fi produse microorganisme rezistente la invenia sa penicilina. Nu este nevoie de altceva dect ca acestea s fie expuse la doze mai mici dect doza
bactericid. Aceasta se ntmpla n 1945. Foarte curnd temerile sale s-au adeverit, ncepnd s
apar primele tulpini rezistente.
n 2009 s-a dovedit clar transmiterea de la animal la om a unui germen redutabil - stafilococul
auriu rezistent la meticilin (MRSA).
Aadar, n condiiile eforturilor pentru prevenirea apariiei i rspndirii germenilor rezisteni,
sistarea abuzului de antibiotice n ferme ar trebui s se gseasc n lista de prioriti. (11)
6. 8. 5. Antibiotice fr reet?
Tot n 2009 civa cercettori s-au adunat i au avut ca scop verificarea numrului de site-uri
care ofer antibiotice fr reet. Cu ajutorul motoarelor de cutare Google i Yahoo au gsit
138 de astfel de site-uri. Dintre acestea, 36,2% vindeau antibiotice fr reet iar 63,8% ofereau
o reet online. Penicilinele erau disponibile pe 94,2% din aceste site-uri, macrolidele pe 96,4%,
fluoroquinolonele pe 61,6% iar cefalosporinele pe 56,5%. 98,6% exportau spre SUA.
Rezultatele descrise n acest studiu sugereaz c exist o surs mare de antibiotice n SUA care
nu este afectat de iniiativele legate de schimbarea prescrierii antibioticelor i care poate
contribui la extinderea rezistenei la antibiotice i chimioterapice.
Comunitatea medical mpreun cu instituiile de sntate public i companiile farmaceutice
trebuie s-i extind eforturile pentru a controla rezistena la antibiotice. n timpul anamnezei
medicul poate oferi informaii legate de antibiotice, rezistena la antibiotice i posibilele
interaciuni ntre antibiotice. Pacienii au nevoie s fie educai n acest sens! (12)
6. 8. 6. i care s fie soluia?
n SUA i UK se estimeaz c un foarte mare procent din infeciile nosocomiale cu S. aureus este
produs de tulpini meticilino-rezistente (MRSA) i o bun parte sunt MDR. O mai mic parte din
aceste tulpini (i totui numrul este n cretere) prezint nivele joase de rezisten la
vancomicin. S-au descoperit noi antibiotice care pot fi utilizate n tratamentul MRSA i chiar i a
tulpinilor rezistente la vancomicina (ex. daptomicina) dar nu o s treac mult timp pn se va
dezvolta rezistena i la ele. Este o soluie inventarea continu de noi antibiotice?
Unele tulpini de E. coli (una din cauzele comune de ITU) sunt rezistente la antibiotice din ase
clase diferite incluznd cele mai nou recomandate, fluoroquinolonele. Mai mult dect att, n
sudul Asiei i n China, 60-70% E. coli sunt rezistente la fluoroquinolone. (13)
Aa c rmne ntrebarea - ce este de fcut?
Sau mai bine zis, ce va face cititorul dup ce va citi aceste rnduri?
Care este atitudinea pe care o va adopta medicul curant, studentul viitor medic sau omul care
dorete pur i simplu s se informeze?
Am avea o propunere: n cazul n care nu va reui s nvee sau s aplice noiunile nvate
secundum arte, mcar s nu participe la implementarea n practic a celor mai frecvente
erori n utilizarea antibioticelor i chimioterapicelor.
96
6. 9. Direcii de cercetare
Vom prezenta mai jos cteva dintre direciile de cercetare actual pe care cititorul le poate
evalua deschiznd urmtoarele link-uri:
-Predicting resistance mutations using protein design algorithms
http://www.pnas.org/content/107/31/13707.full
-Rapid molecular detection of Tuberculosis and Rifampin resistance
http://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMoa0907847
- Antibiotics Are Not Automatic AnymoreThe French National Campaign To Cut Antibiotic
Overuse
http://www.plosmedicine.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pmed.1000080
- Significant Reduction of Antibiotic Use in the Community after a Nationwide Campaign in
France, 20022007
http://www.plosmedicine.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pmed.1000084
- Prevalence and Antimicrobial Resistance Pattern of Bacterial Meningitis in Egypt
http://www.medscape.com/viewarticle/715718
- Global Health Advocates Call for Renewed Focus on Drug Resistance
http://www.medscape.com/viewarticle/727041
- CDC Issues Plan to Combat Extensively Drug-Resistant Tuberculosis
http://www.medscape.com/viewarticle/588332
- New Drugs and New Regimens for the Treatment of Tuberculosis: Review of the Drug
Development Pipeline and Implications for National Programmes
http://www.medscape.com/viewarticle/720268
- ID Society Calls for 10 New Antimicrobials by 2020
http://www.medscape.com/viewarticle/718786
-Despre antibiotice, rezistenta si testarea sensibilitatii
http://wwwn.cdc.gov/dls/master/ams/intro/open.swf
-Institutul National de Alergie si Boli Infectioase
http://www.niaid.nih.gov/topics/antimicrobialresistance/Pages/default.aspx
-European Antibiotic Awareness Day
http://ecdc.europa.eu/en/eaad/Pages/Home.aspx
- Alliance for the prudent use of antibiotics (a se citi si actiunile intreprinse in Romania si
planurile lor de viitor)
http://www.tufts.edu/med/apua/index.shtml
-Antibiotics for the prevention of malaria,
http://www.mpg.de/english/illustrationsDocumentation/documentation/pressReleases/2010/p
ressRelease20100721/index.html
A. nucleul betalactam
B. nucleul carbapenem
C. betalactaminele
D. betalactamazele
E. inhibitorii de betalactamaze
2. Au/Are efect bactericid:
A. cefalosporinele
B. tetraciclinele
C. sulfonamidele
D. cloramfenicolul
E. eritromicina
3. Inhib sinteza peretelui celular:
A. macrolidele
B. tetraciclinele
C. cloramfenicolul
D. sulfonamidele
E. penicilinele
4. n cazul rezistenei extracromozomiale, transmiterea materialului genetic NU se poate realiza
prin:
A. transducie
B. transformare
C. mutaie spontan
D. conjugare
E. transpoziie
5. NU se obinuiete administrarea de antibiotice bactericide la pacienii cu:
A. cancer
B. SIDA
C. politraumatisme
D. proteze valvulare
E. grip
Bibliografie
Liu B, Pop M, 2009, ARDB Antibiotic Resistance Genes Database, Nucleic Acid Res., 37,
D443-D447
Demain AL, Sanchez S, 2009, Microbial drug discovery: 80 years of progress, J. Antibiotics, 62,
5-16 (e 16)
Davies J, Davies D, 2010, Origins and Evolution of Antibiotic Resistance, Microbiol. and
Molecul. Biol. Rev., 74, 417-433
98
99
Tehnicile calitative
o antibiograma difuzimetric comun (cu discuri)
o antibiograma difuzimetric comparativ
o antibiograma difuzimetric standardizat
o antibiogramele difuzimetrice rapide
Tehnicile cantitative
o metoda diluiilor n mediu lichid
o metoda diluiilor n agar
o metoda microdiluiilor n agar
o metoda punctelor de ruptur
100
o testul E
o metode i sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.
7. 1. 1. 1. Antibiograma difuzimetric comun
Din punct de vedere tehnic nsmnm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar MuellerHinton) turnat n plci Petri. nsmnarea se poate realiza de exemplu prin inundarea plcii
urmat de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (exist i alte
variante tehnice). Dup circa 20 minute (timp n care placa Petri se las cu capacul ntredeschis
n vecintatea becului de gaz, aprins) se aplic microcomprimatele n care sunt ncorporate
antibiotice n concentraie standardizat. Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu
ajutorul unei pense, n condiii aseptice, sau cu ajutorul unui aplicator automat (la minim 30
mm distan ntre ele i minim 15 mm de marginea plcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite
pentru o plac Petri cu diametrul de 9 cm).
Microcomprimatele trebuie s vin n contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul
unei pense le presm uor (dup caz). Dup nc 15-20 minute, incubm plcile peste noapte n
termostat, la 28 sau 35-37C, n funcie de temperatura optim de multiplicare a
microorganismului testat.
Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzeaz n mediu, realiznd zone de inhibiie n care
coloniile microbiene nu se dezvolt (Figura nr. 3).
Cu ct zona de inhibiie este mai larg, cu att germenul va fi considerat mai sensibil. Dac n
interiorul zonei de inhibiie (chiar dac diametrul nregistrat este foarte mare) se dezvolt
colonii, mutani rezisteni, germenul va fi considerat rezistent (Figura nr. 4).
Aceast metod, cu toate c este folosit pe scar larg n laboratoare, permite de fapt numai
eliminarea antibioticelor complet inactive i eventual selecionarea antibioticelor foarte active,
pentru c tehnica nu este standardizat.
7. 1. 1. 2. Antibiograma difuzimetric comparativ (Stokes, Bal)
Se efectueaz pentru microorganismul de testat n paralel cu un microorganism de referin, din
aceeai specie (sau o specie asemntoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram-pozitivi putem
alege pentru comparaie o tulpin de Staphylococcus spp. Tulpina de referin are o
sensibilitate cunoscut la diferitele antibiotice pe care le utilizm.
Prin aceast metod se nltur o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre ex.
calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru microorganismul
de referin i pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprim cu termenii: sensibil,
intermediar, rezistent, n funcie de diametrul zonelor de inhibiie a multiplicrii celor doi
germeni, fa de acelai antibiotic (jumtile de cerc se examineaz comparativ). n cazul n
care cunoatem CMI (concentraia minim inhibitorie) a microorganismului de referin, putem
face aprecieri cu privire la CMI pentru microorganismul testat.
Din punct de vedere tehnic, pe o plac de forma unui ptrat (mprit n 3 zone egale
marcnd pe partea extern a plcii liniile de demarcaie) se inoculeaz n treimea medie
microorganismul de referin iar n treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru care
dorim s realizm testarea. Inoculul trebuie s fie astfel realizat nct s conduc la apariia
dup incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care s nu fie confluente. Plasm
microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaie dintre culturi. Incubm peste noapte
la 35-37C urmnd ca n ziua urmtoare s citim i s interpretm rezultatele. (Figura nr. 5)
101
inoculul, care se obine de preferat din 5 colonii izolate (cultur pur) i trebuie s aib o
turbiditate corespunztoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 108 uniti
formatoare de colonii/ml) n majoritatea cazurilor;
timpul de incubare (n majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37C, nu mai mult de 2-3 plci
suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;
102
(Figura nr. 6). Pentru controlul de calitate utilizm i un ir de tuburi pe care le inoculm cu o
tulpin de referin corespunztoare. n ziua urmtoare citim i interpretm rezultatele.
Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egal cu cantitatea de mediu, concentraia final de
antibiotic se va njumti (de ex. n tubul n care diluia iniial a fost de 16 mg/ml, diluia final
va fi 8 mg/ml etc.). n tubul martor meninut la +4C ar trebui s nu fie prezent creterea, n
tubul martor meninut la 35-37C creterea trebuie s fie prezent (Figura nr. 7).
n tuburile inoculate cu tulpina de referin trebuie s avem rezultatul corespunztor datelor pe
care le cunoatem privitor la respectiva tulpin.
n tuburile cu microorganismul testat, ultima diluie care a inhibat dezvoltarea
microorganismului corespunde CMI. Se consider (n general, pentru c CMI difer n funcie de
specia microbian) c microorganismele n cazul crora CMI este 3 mg/ml vor fi eficient
inhibate de ctre antibioticul respectiv i in vivo.
CMI nu are aceeai valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la amoxicilin n
cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus aureus, 0,03 mg/ml pentru
Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentru Haemophilus influenzae, 2 mg/ml pentru E. coli,
16 mg ml (i practic aceasta semnific rezisten in vivo) pentru Bacteroides fragilis iar n cazul
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa sau Chlamydia trachomatis tulpinile sunt
rezistente.
7. 1. 1. 5. Determinarea CMB (concentraia minim bactericid)
Pornind de la rezultatul obinut prin metoda diluiilor n mediu lichid, se vor utiliza ca surs de
inocul tuburile n care dezvoltarea microbian a fost inhibat (Figura nr. 8).
Este necesar o plac Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi mprit n sectoare, numrul de
sectoare fiind corespunztor numrului de tuburi fr cretere microbian. nsmnm n
condiii aseptice din fiecare tub fr cretere microbian, fiecare n sectorul de plac
corespunztor (Figura nr. 9). Incubm pentru 16-18 ore la 35-37C. CMB va corespunde ultimei
concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele nsmnate (sectoare de plac fr
apariia culturii) (Figura nr. 10). Se consider c antibioticul va fi eficient in vivo dac n serul
pacientului se pot atinge concentraii de antibiotic care s depeasc de 4-8 ori CMB.
Determinarea CMI i CMB este extrem de important pentru aprecierea eficacitii
antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infeciilor
severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc), precum i la imunodeprimai,
efectuarea acestei metode este indispensabil.
7. 1. 1. 6. Metoda punctelor de ruptur (breakpoints)
Metoda este folosit n laboratoarele moderne de microbiologie i este utilizat pentru a defini
sensibilitatea i rezistena la antibiotice. Depinznd de metoda de testare rezultatele sunt
exprimate sub forma unei concentraii (mg/l sau g/ml) sau sub forma unui diametru (mm). (1)
Metoda este practicat de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales dac volumul
de munc este mare sau foarte mare. Prin aceast metod se pot testa mai multe
microorganisme, n acelai timp. Antibioticele sunt incorporate n mediul de cultur, la o
anumit concentraie limit, n funcie de cunotinele i datele acumulate n ceea ce privete
activitatea in vivo a respectivelor medicamente. Plcile sunt inoculate simultan cu mai multe
tulpini bacteriene, n spot, folosind un inoculator construit special, sunt incubate n condiii
corespunztoare pentru 16-18 ore. n cazul n care tulpina sau tulpinile din diferitele specii
103
tulpini martor;
inocul bacterian;
soluie salin steril (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea inoculului
bacterian;
104
benzi E test (a. cu ageni antimicrobieni cu nucleu lactam, b. cu ali ageni
antimicrobieni); se pstreaz n congelator la -20C pn n momentul utilizrii (Figurile nr. 1314. Modul de prezentare a benzilor E-test); au o durat de utilizare de 1-2 ani (pentru prima
grup) i respectiv de 2-3 ani
tampoane sterile;
foarfece;
surs de lumin;
nainte de a deschide folia care include benzile, inspectm pentru a observa dac exist
perforri; dac folia respectiv nu este intact, atunci benzile din interiorul ei nu se mai pot
folosi; dac nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai nti tiem cu o foarfec de-a
lungul liniei ntrerupte apoi ntre compartimentele ce conin benzile
scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete i le punem n plci Petri sterile; apoi le
putem aplica pe mediul de cultur care conine inoculul microbian de testat
cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferm mai multe colonii dintr-o cultur bacterian
de 18-24 de ore ntr-un tub cu soluie salin steril sau bulion; omogenizm (exist i varianta s
transferm mai multe colonii n bulion, s incubm timp de 2-8 ore pn cnd obinem
densitatea dorit)
ajustm (vizual) densitatea folosind soluie salin steril 0,85% sau bulion, la un standard
de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta la standardul
dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizual a turbiditii inoculului nu garanteaz
numrul corect al unitilor formatoare de colonii).
C. Inocularea plcilor:
introducem tamponul steril n tubul care conine suspensia bacterian de testat, rotim de
cteva ori, apoi eliminm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereii interiori ai
tubului;
105
depunem inoculul pe suprafaa plcii cu mediul de cultur avnd grij s acoperim
complet suprafaa mediului (ex. inoculm pe 3 direcii diferite, rotind placa cu cte o treime);
lsm placa timp de circa 10 minute, ca s se usuce, nainte de a aplica benzile E test.
D. Aplicarea benzilor E test:
lum cu grij o band fr s atingem sau zgriem partea pe care este depus agentul
antimicrobian; dac folosim pensa steril, apucm cu grij de captul benzii notat cu E (benzile
trebuie s fie complet separate una de cealalt nainte de a le aplica pe suprafaa mediului de
cultur inoculat cu tulpina de testat); dac se folosete aplicatorul E test, banda adeziv
trebuie s fie n poziia corect (la fiecare capt al aplicatorului);
dac lucrm cu plci cu diametrul de 90 mm, aplicm una sau dou benzi; dac lucrm cu
plci cu diametrul de 150 mm, putem aplica ase benzi E test (benzile se pun la distane egale,
radial, pornind din centrul plcii; marginea captului benzii notat cu E trebuie s ating
marginea plcii);
banda trebuie s fie n contact cu suprafaa agarului; eliminm eventualele bule de aer de
sub band cu ajutorul unei pense ncepnd de la marginea bulei i mutnd-o n sus pe gradient
pn la captul notat cu E (prezena bulelor mici nu va afecta rezultatul testrii);
banda aplicat pe suprafaa agarului nu se mut n alt poziie (lund contact cu mediul de
cultur, agentul antimicrobian de pe partea posterioar se elibereaz imediat); dac banda a
fost aplicat cu partea posterioar n sus atunci se apuc cu grij, se ntoarce i se pune corect
pe suprafaa mediului; dac banda a atins suprafaa mesei de lucru sau un alt obiect, se poate
folosi n continuare att timp ct nu a luat contact cu o substan lichid.
E. Incubarea:
putem citi rezultatul n cazul n care creterea bacterian este confluent sau aproape
confluent (Figura nr. 15 - Interpretare rezultate E-test pentru E. coli);
inem placa lng o surs de lumin (atunci cnd mediul este Mueller-Hinton); citim
valoarea CMI n punctul n care creterea bacterian intersecteaz banda E test; dac am
utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% snge de oaie, sau geloz-chocolate MuellerHinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o surs de lumin reflectant i
o lup;
(zona de inhibiie se afl sub banda E test), valoarea CMI se raporteaz ca fiind mai mic dect
concentraia cea mai sczut a agentului antimicrobian de pe banda E test;
n cazul unei valori CMI situat ntre dou marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe
care l notm va fi valoarea cea mai mare;
raportm rezultatul obinut pentru tulpina studiat dup ce verificm rezultatul obinut
pentru tulpina de referin (control de calitate);
Exist i sisteme automate (ex. ATB i rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex. ATB
Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice, utiliznd
criteriile de interpretare NCCLS (Figura nr. 21).
7. 1. 1. 9. Tehnici de biologie molecular utilizate n testarea sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice
Au fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a optimiza
obinerea unor rezultate corecte i n timp ct mai scurt, cu privire la sensibilitatea/rezistena
microorganismelor la antibiotice i chimioterapice. Metodele care au la baz tehnicile de
107
biologie molecular pot fi foarte utile (chiar dac costurile sunt mai ridicate). De ex. se cunoate
c agentul etiologic al tuberculozei se multiplic lent pe medii de cultur i n aceste condiii
rezultatele vor fi obinute n circa 2 sptmni prin metodele clasice. Se pot utiliza diferite
tehnici i n final hibridizarea molecular pentru a studia diferite mutaii care pot s dea
informaii cu privire la sensibilitatea/rezistena tulpinilor studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB
(LIPA= Line Probe Assay), se realizeaz cu ajutorul unei truse comerciale puse la punct n USA.
Metoda permite concomitent identificarea M. tuberculosis precum i testarea sensibilitii la
rifampicin, dup o amplificare genetic a unui material (ADN) provenit fie din culturi
mycobacteriene, fie chiar din produse clinice (Figura nr. 22).
Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN-ului rezultat dintr-o amplificare prin PCR
(Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor linii
(benzi) paralele, pe fii de nitroceluloz. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt biotinilate (cuplate
cu biotin). Dup hibridizare se adaug streptavidin conjugat cu fosfataz alcalin, acest
conjugat atandu-se de produii de hibridizare rezultai anterior. Incubarea n prezena unui
reactiv cromogen conduce, n cazul existenei hibridizrii, la apariia unor benzi colorate,
vizibile. n cazul testrii rezistenei la rifampicin, se urmrete apariia unei/unor mutaii la
nivelul genei care codific pentru subunitatea a ARN polimerazei (gena rpoB). (5-6)
Identificarea apartenenei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificat cu ajutorul
unei oligonucleotide specifice, situat n poziia a 3-a, dup linia care marcheaz fiecare fietest i respectiv linia care permite verificarea calitii conjugatului (conjugate control).
Produsul unei tulpini sensibile la rifampicin deine fragmente amplificate, care hibridizeaz cu
sondele specifice S1, S2, S3, S4 i respectiv S5. Absena uneia sau a mai multor benzi
demonstreaz c tulpina este rezistent la rifampicin (Figura nr. 23).
Pentru tulpinile rezistente la rifampicin, trusa comercial INNO-LIPA permite suplimentar
aprecierea locusului mutaiei. De exemplu, o tulpin poate prezenta o mutaie n regiunea R5
(serin-leucin) n timp ce alt tulpin prezint o mutaie n regiunea R4a (histidin), aceste
mutaii aprute la nivelul genei rpoB fiind dintre cele mai frecvente i pot fi identificate prin
aceast metod.
determinarea NEI (nivel de eficien inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte umori (Figurile nr.
24-26 - Citirea NEI din hemocultur sub terapie cu ertapenem; Film nr. 3);
determinarea NEB (nivel de eficien bactericid) pentru ser, LCR sau alte umori; puterea
bactericid a serului celor tratai (NEB) msoar capacitatea diluiilor din serul unui bolnav
tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul coninnd germenul infectant; se determin diluia
cea mai nalt de ser care mai manifest capacitate bactericid (Figurile nr. 27-29);
108
utilizarea acestor metode a fost indicat n cazul endocarditelor bacteriene,
osteomielitelor, fibrozei chistice sau sepsisului la pacieni cu variate grade de imunodepresie;
produsele se recolteaz de obicei la o or dup administrarea unei doze i cu cteva minute
nainte de administrarea urmtoarei doze de antibiotic; (Film nr. 4 Citirea NEI, Efectuarea NEB)
determinarea nivelului de antibiotic realizat n snge, LCR sau n alte umori (prin metode
microbiologice, enzimatice, HPLC etc).
7. 2. Povestiri adevrate
7.2.1. Rezistena la antibiotice a tulpinilor de S. aureus n Romnia, comparativ cu EU
n statele Uniunii Europene, serviciile de sntate public i-au ndreptat atenia n ultimii ani
ctre stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA), incidena acestei specii microbiene fiind
ntr-o permanent cretere att n infeciile nosocomiale, ct i n cele comunitare. Alturi de
ali ageni patogeni care stau la baza declanrii de infecii nosocomiale (Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Aspergillus spp. etc.), MRSA este
agentul etiologic izolat n aproximativ 5% din totalul acestor infecii.
n vederea monitorizrii n timp i spaiu a susceptibilitii, dar i a rezistenei la antibiotice a
diferitelor specii bacteriene cu potenial patogen crescut, s-a pus la punct EARSS (European
Antimicrobial Resistance Surveillance System) un program de supraveghere a sensibilitii la
antibioticele folosite n practica medical curent a tulpinilor izolate de Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus aureus, E. coli, Enterococcus faecalis / faecium, K. pneumoniae i
P. aeruginosa). Supravegherea tulpinilor de S. aureus i implicit a MRSA este realizat ncepnd
cu anul 1999.
n anul 2006, 31 de state din Europa au raportat ctre EARSS efectuarea testrii sensibilitii la
antibiotice pentru un numr de 29.552 de tulpini de S. aureus izolate. Dintre acestea, 7.037
(23,81%) au fost identificate ca fiind MRSA. Dintre cele 31 de state, 15 au raportat o inciden a
infeciilor cu MRSA mai mare de 25%. n ri precum Croaia, Grecia, Islanda, Malta, Turcia,
MRSA s-a izolat cu precdere n unitile de terapie intensiv (peste 60% din totalul tulpinilor de
MRSA).
Din raportul pe 2006 al EARSS reiese faptul c n statele din Europa Central, rata infeciilor
nosocomiale i comunitare cu MRSA se situeaz ntre 7-22%, comparativ cu partea de nord a
continentului, unde rata este sub 4%. Marea Britanie a raportat ntre 1.500 i 4.000 de tulpini
de MRSA pe an, Frana ntre 1.700 i 3.900 de tulpini pe an, Suedia ntre 1.300 i 2.000 de
tulpini pe an, Germania ntre 800 i 1.300 de tulpini pe an, Slovenia ntre 150 i 365 de tulpini pe
an, iar Bulgaria a raportat ntre 100 i 170 de tulpini pe an.
n comparaie cu aceste stateRomnia a raportat n perioada 2002-2006 un numr foarte sczut
de tulpini, variind ntre 78 i 92 de tulpini pe an (circa jumtate din numrul de tulpini raportate
de Slovenia i de circa 16 ori mai puine dect Suedia); n acest context, datele raportate la
ECDC nu au valori statistic semnificative.
n anul 2005 s-a efectuat n ara noastr, la Institutul de Boli Infecioase Matei Bal, un studiu
al crui obiectiv principal a fost stabilirea spectrului de sensibilitate la antibiotice pentru un
numr de 589 de tulpini de S. aureus izolate. Peste jumtate din tulpini au fost izolate de la nivel
faringian, dar s-au izolat tulpini i din leziuni cutanate, prin hemocultur etc. Testarea
sensibilitii la antibiotice a fost efectuat prin E-test, evideniindu-se 92 (15,61%) tulpini de
109
MRSA. Acest nivel redus al meticilino-rezistenei poate fi corelat, printre altele, cu numrul
mare de tulpini izolate din exsudat faringian, la care nivelul de meticilino-rezisten este mai mic
de 10%. Studiul a relevat faptul c macrolidele, ciclinele i cotrimoxazolul constituie n prezent
alternative terapeutice compromise, rmnnd active (pentru tulpinile identificate n institut) n
antibioterapie clindamicina, rifampicina i aminoglicozidele. Procentul de tulpini de S. aureus
penicilino-rezistente raportat a fost de 26% (i nu de 100% cum ar putea prea c este sugerat
atunci cnd, n relaie cu o tulpin de S. aureus, penicilina este uitat complet).
Tulpinile de MRSA constituie o problem de sntate public pe tot cuprinsul Europei. Totui,
faptul c n unele ri (cum ar fi Cipru sau Turcia) incidena infeciilor cu MRSA este n scdere,
reprezint o speran n ncercarea de a controla rata infeciilor nosocomiale i respectiv a celor
comunitare n care sunt implicate tulpinile de MRSA.
7.2.2. Este nceputul sfritului erei antibioticelor?
Conform unor studii recente s-a descoperit o nou gen numit New Delhi metallo beta
lactamaz sau NDM 1. Aceast gen se gsete la nivelul plasmidelor i astfel poate fi copiat cu
uurin i transmis altor tipuri de bacterii. Pentru prima dat bacteria care purta gena NDM a
fost izolat de la un pacient suedez de origine indian care a avut infecie urinar n timp ce
vizita New Delhi. Studiile arat c ntre 1 i 4% dintre bacteriile Gram negative din sudul Asiei
poart gena NDM.
NDM a fost identificat cu precdere la E.coli i Klebsiella pneumoniae, tulpinile devenind nalt
rezistente la toate antibioticele cu excepia tigecycline i colistin. Dar exist cazuri n care nici
aceste antibiotice nu sunt eficiente. n prezent nu exist alte antibiotice pentru a distruge
bacteriile purttoare ale acestei gene. Pot aprea infecii obinuite precum infeciile tractului
urinar cauzate de microorganisme rezistente la antibiotice. O ncercare pentru tratarea acestor
infecii ar putea fi administrarea unor cocktail-uri de antibiotice n sparana c acestea vor
avea un efect sau se pot folosi doze foarte mari dar exist pericolul de intoxicaie sau a altor
reacii adverse.
Din cauza turismului medical n general mai ales pentru proceduri precum chirurgia estetic
aceast nou superbacterie se poate rspndi n ntreaga lume. n urma unui studiu s-a constat
c NDM1 a fost identificat mai ales n Bangladesh, India i Pakistan i a ajuns n Marea Britanie
prin intermediul unor pacieni care s-au ntors din aceste ri dup tratament.
Rezistena la antibiotice trebuie considerat o problem global, mondial. (7)
Bibliografie
1. Turnidge J, Paterson DL, 2007, Setting and Revising Antibacterial Susceptibility Breakpoints,
Clin. Microbiol. Rev., 20(3), 391-408.
2. Goue Denis Gohore Bi, Jun Li, Fahima Nekka, 2009, Antimicrobial breakpoint estimation
accounting for variability in pharmacokinetics, Theor. Biol. Med. Model., 6, 10.
3. Kuper KM, Boles DM, Mohr JF, Wanger A, 2009, Antimicrobial Susceptibility Testing: A Primer
for Clinicians, Pharmacotherapy, 29(11), 1326-1343.
4. Mandell, Bennett, Dolin, 2005, Principles and Practice of Infectious Diseases, 6th ed.
110
5. Cavusoglu C, Turhan A, Akinci P, Soyler I, 2006, Evaluation of the Genotype MTBDR Assay for
Rapid Detection of Rifampin and Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates, J.
Clin. Microbiol., 44(7), 2338-2342.
6. Morgan M, Kalantri S, Flores L, Pai M, 2005, A commercial line probe assay for the rapid
detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and
meta-analysis, BMC Infect. Dis., 5, 62.
7. Kumarasamy K, Toleman MA, Walsh TRR, Bagaria J, Butt F, Balakrishnan R, 2010, Emergence
of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological,
and epidemiological study, The Lancet Infect. Dis., 10, 597-602.
111
112
114
Dintre toate structurile moleculare studiate, ARNr este cea mai puin variabil. S-a demonstrat
c anumite poriuni ale secvenei ADNr a diferitor organisme nrudite ntre ele sunt remarcabil
de similare. Astfel, se poate deduce urmtoarea idee: secvenierea genelor unor organisme
apropiate filogenetic poate fi aliniat foarte precis, astfel obinndu-se o evaluare mult mai
exact a diferenelor existente. Cum? Prin compararea zonelor hipervariabile ale ARNr, extrem
de specifice unei anumite specii. Din acest motiv, genele care codific pentru ARNr (ADNr) au
fost utilizate pentru a determina taxonomia, filogenia i pentru a specifica ratele de difereniere
dintre speciile bacteriene. De asemenea, analiza dup realizarea secvenierii ARNr 16S ofer
numeroase informaii asupra evoluiei bacteriene i asupra relaiilor dintre specii. Iniiatorul
acestor metode a fost Carl Woese, cel care a propus ulterior clasificarea microorganismelor n
sistemul celor trei domenii Archaea, Bacteria i Eucarya.
Spre exemplu, ntr-un studiu s-a analizat prin secvenierea ARNr 16 S (aparine subunitii mici
30 S ribozomale) acid nucleic bacterian provenit de la 50 tulpini. Astfel, s-au descoperit 1.250
secvene diferite, dintre care 85% nu au putut fi identificate. Majoritatea nu aparin grupurilor
taxonomice cunoscute i clasificate pn n momentul de fa, n timp ce mai mult de jumtate
nu au mai fost descoperite n nici un alt situs sau n afara organismului.
Pn n prezent au fost identificai aproximativ 420 membri ai florei normale, fcnd parte din
117 genuri diferite. Se presupune c exist peste 1.000 de specii bacteriene n sistemul nostru
intestinal.
Un exemplu de algoritm de diagnostic/identificare ar fi urmtorul:
1. Prelevarea de produs (materii fecale)
2. Depozitarea preparatului n una din urmtoarele variante:
-procesare imediat
sau
- ngheare la -80 C
sau
-depozitare ntr-un aparat de depozitare i prelucrare special (PSP Spin Stool DNA Plus Kit), la
temperatura camerei
3. Purificarea acidului nucleic
-exist i kituri comerciale
-liza celular cu ajutorul unui kit
4. Amplificarea ADN prin tehnica PCR utiliznd primeri ale cror inte sunt regiunile variabile ale
genei ARNr 16S
5. Analiza i interpretarea rezultatelor
8. 2. 3. Modificri ale florei intestinale normale
Compoziia florei microbiene normale este influenat de numeroi factori, precum stilul de
via, dieta, starea de sntate versus starea de boal, vrsta. Astfel, dac este urmrit evoluia
n timp a prezenei speciilor de Bifidobacterium i Enterobacteriaceae n sistemul intestinal, se
vor observa diferene semnificative:
Bifidobacterium spp. se afl n cantitate maxim la copil, n cantitate medie la adult i respectiv
n cantitate minim la persoanele n vrst, n timp ce Enterobacteriaceaele se afl n cantitate
maxim tot la copil, n cantitate minim la adult i n cantitate medie la persoanele n vrst.
(Schema nr. 1; Factori ce determin modificarea compoziiei florei normale)
115
De-a lungul tractului gastro-intestinal se realizeaz o selecie prin cooperarea dintre gazd i
diferitele bacterii. O serie de factori locali determin o distribuie neuniform a florei, dintre
acetia putem aminti:
-factori fizici:
temperatura;
gradientul de oxigen (majoritatea speciilor bacteriene sunt anaerobe);
-factori chimici:
pH-ul (ntre mese, nu exist microorganisme la nivel gastric);
procentul de H2O;
acizii biliari;
secreia pancreatic;
nivelele diferiilor nutrieni;
secreia local de imunoglobuline;
diferitele substane produse tocmai de ctre bacterie;
-factori mecanici:
peristaltismul intestinal (bacteriile se pot ataa de mucoas atunci cnd peristaltismul este
sczut; iat i unul dintre motivele pentru care medicamentele anti-peristaltice nu sunt benefice
n infeciile digestive); (Tabelul nr. 2)
fenomenul de competiie ntre diferitele specii bacteriene etc.
116
117
118
8. 3. 2. Flora microbian normal inhib dezvoltarea bacteriilor patogene prin efectul de barier
sau fenomenul de competiie
ntr-un organism gazd sntos, flora normal realizeaz un strat protector de-a lungul
sistemului intestinal. Bacteriile comensale ocup situsurile de ataare ale mucoasei i consum
factorii nutriionali produi de enterocite. La rndul lor, celulele intestinale secret produi antibacterieni, chemokine, citokine i IgA. (Figura nr. 6)
n anumite condiii, spre exemplu atunci cnd:
- exist o cantitate mai mare de tulpini din specii bacteriene patogene;
- este urmat un tratament ndelungat cu antibiotice (mai ales dac au spectru larg);
- exist factori care deprim mecanismele de aprare ale gazdei (ex. o stare de imunosupresie, o
modificare a tranzitului prin peristaltism sczut etc.);
- se exercit aciunea unor factori externi (ex. radiaii, arsuri, substane chimice etc.) flora
microbian este afectat, iar bacteriile patogene pot invada mucoasa intestinal.
8. 3. 3. Flora normal intestinal determin greutatea fiecrui individ
ntr-un studiu realizat n anul 2006 pe oareci germ-free, hrnii cu alimente bogate n
polizaharide, s-a observat c animalele colonizate doar cu Methanobrevibacter smithii i cu
Bacteroides thetaiotaomicron au prezentat o depunere semnificativ mai mare de grsime n
comparaie cu animalele din alte grupuri de control. S-a demonstrat c:
- Bacteroides thetaiotaomicron intervine n dezvoltarea vascularizaiei intestinale; induce
formarea reelelor capilare i stimuleaz absorbia i procesarea carbohidrailor; n timp ce
- Methanobrevibacter smithii deine funcia unui reglator caloric n intestinul distal i prin
sinergie cu B. thetaiotaomicron stimuleaz digestia zaharurilor i crete absorbia caloriilor.
Mai recent, s-au descoperit numeroase mecanisme prin care flora microbian normal intervine
n reglarea greutii corporale i a depunerilor adipoase. (Figura nr. 7)
Primul dintre acestea ar fi influenarea metabolizrii nutrienilor i a reglrii energetice. S-a
demonstrat faptul c bacteriile metabolizeaz polizaharide nondigerabile transformndu-le n
produi digerabili, astfel crescnd extracia energetic.
O alt ipotez stabilete o legtur ntre flora normal intestinal i homeostazia metabolic. O
dieta bogat n lipide moduleaz populaiile bacteriene dominante la nivel intestinal: cresc
bacteriile Gram negative i scad bifidobacteriile, eubacteriile i Bacteroides spp.
Aceast modificare determin creterea nivelului plasmatic al lipopolizaharidelor (LPZ) care
induce un rspuns inflamator cronic de mic intensitate la nivelul ficatului, al esutului adipos i
al hipotalamusului. Apare o cretere n greutate i o acumulare excesiv a lipidelor la nivel
hepatic. n timp, crete riscul apariiei rezistenei la insulin i al dezvoltrii diabetului zaharat de
tip 2. (Figura nr. 8)
Un al treilea mecanism este acela prin care flora normal induce reglarea unor gene ale gazdei.
Acestea sunt implicate n modularea depozitelor i a consumului energetic.
Aceste descoperiri ar putea s aib o mare importan att n tratamentul obezitii ct i n
tratamentul celor subnutrii. Ar putea explica de ce oameni care consum aceeai cantitate de
hran, prezint modaliti diferite de depunere a grsimilor.
Totui ar rmne un semn de ntrebare: diferenele observate n flora normal a pacienilor
obezi este cauza sau consecina obezitii?
8. 3. 4. Fermentarea i absorbia polizaharidelor n colonul proximal
119
8. 4. Relaii microorganism-gazd
Cu o parte din microorganismele ntlnite organismul stabilete relaii de simbioz, convieuirea
fiind folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la care particip unii
coliformi intestinali).
Foarte multe din microorganismele care alctuiesc microflora normal se afl n relaii de
comensualism cu organismul, germenii depinznd nutriional de gazd, creia nu i creeaz
prejudicii. Aceast convieuire exprim ns un echilibru instabil, care poate fi uor tulburat.
Diferii factori (ai gazdei, din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor) pot modifica
aceste relaii, astfel nct unele microorganisme din flora normal pot manifesta aspecte
patogene - este vorba de microorganismele condiionat patogene.
Relaia de parazitism tipic apare ns doar atunci cnd microorganismele se dezvolt n
detrimentul gazdei, cu manifestri clinice mai mult sau mai puin evidente.
Astfel, n cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta dect n
organismul gazdei (de exemplu Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia
pneumoniae etc). Alte bacterii sunt facultativ parazite, putnd tri i libere n natur, dar o dat
121
ptrunse n organism stabilesc cu acesta relaii de parazitism (de exemplu Clostridium tetani,
Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).
8. 5. Povestire adevrat
Rolul i importana florei microbiene normale a organismului, sunt mai mult dect bine stabilite.
Rolul infecionistului este, ca pe durata tratamentelor cu antibiotice pentru diverse afeciuni, s
afecteze ct mai puin aceast flor. O prim idee este utilizarea de antibiotice cu spectru ct
mai intit (ngust), cu efect asupra patogenului respectiv. Pe de alt parte piatra de
ncercare a medicilor, credem, o reprezint evitarea tratamentelor antibiotice inutile. Ci
dintre medici nu recomand scheme dup scheme de medicamente anti-stafilococice doar
pentru c la exsudatul faringian se izoleaz un stafilococ, fie el chiar i auriu? Mai toi.
ncercm sterilizarea de acel stafilococ, doar dac pacientul urmeaz s primeasc un
transplant (ex. medular sau hepatic) sau dac va primi un tratament intens imunosupresor,
altfel nici nu trebuie cutat! Iar pe de alt parte, rmne o ntrebare pe care o punem tuturor
generaiilor de studeni cu care lucrm: n cte dintre cazurile de infecii stafilococice ntlnite i
raportate n foile de observaie pe care le vor vedea este menionat i testul coagulazei? ns,
revenind la subiectul acestui capitol, nu trebuie s uitm niciodat c utilizarea medicamentelor
antibiotice i chimioterapice, n special a celor cu spectru larg, afecteaz uneori decisiv flora
microbian normal a crei utilitate este n momentul de fa binecunoscut.
8. 6. tiai c ...
....Gregor Reid, director al Centrului Canadian petru Cercetarea i Dezvoltarea Probioticelor a
afirmat: Lactobacilul este doar o bacterie. S spui c un produs conine lactobacil este ca i
cum ai spune c l aduci pe George Cloney la o petrecere. Poate fi actorul sau poate fi doar un
tip de 85 de ani din Atlanta pe care ntmpltor l cheam George Cloney. n cazul probioticelor
exist diferene importante ntre tulpini?
....atunci cnd dorii s achizionai produse ce conin probiotice ar trebui s le cutai pe acelea
pe a cror etichet este specificat tulpina coninut i care ofer cititorilor acces liber la
studiile tiinifice de suport? O surs bun pentru informarea asupra efectelor variatelor tulpini
probiotice este www.PubMed.gov.
....putei s v facei singuri iaurt cu probiotice? Avei nevoie de 1l lapte steril-orice tip, chiar i
de soia, un iaurt-sursa de probiotice i de un recipient n care dorii s facei iaurtul. Cuptorul se
ncalzete timp de 15 minute la 180 grade, se las s se mai rceasca timp de 10 minute. Se
aeaz n cuptor recipientul i compoziia pentru iaurt. Se nchide ua de la cuptor i se las 12
ore, peste noapte. Dac diminea observai c nu a ajuns la consistena dorit mai lsai-l n
cuptor timp de 12-24 ore.
8. 8. Evaluarea cunotinelor
122
123
124
9. 2. 1. Multiplicarea i invazivitatea
Germenii patogeni se multiplic la poarta de intrare i invadeaz organismul prin formarea de
abcese i prin propagarea din aproape n aproape n pat de ulei, dar pot trece i direct n
circulaia general. n acest caz produc infecii la distan. Pentru a avea loc aceast succesiune
a evenimentelor, germenii trebuie s poat rezista reaciilor de aprare nespecific a gazdei (de
exemplu fagocitozei) i s poat adera de celulele mucoaselor (prin adezine) sau de anexele
dermului. Exist o aderen nespecific, de fapt un proces chimic i fizic, reversibil, cu
implicarea atraciei hidrofobe, electrostatice dar i a micrii browniene i a existenei
biofilmului de polimeri. Aderena specific poate fi la rndul su reversibil dar, dac implic
suficient de muli factori (structurali, diferite fore de legtur), poate deveni ireversibil.
Biofilmul include populaii bacteriene aparinnd uneia sau mai multor specii, nconjurate de
polimeri extracelulari (EPS - extracellular polymeric substances). Microorganismele ader ntre
ele, dar i la suprafee, formndu-se o structur asemntoare unui sistem circulator ce permite
accesul nutrienilor i eliminarea substanelor reziduale, precum i comunicarea
interbacterian. Dezvoltarea biofilmului cuprinde 5 etape (Figura nr. 1):
ataarea reversibil,
ataarea ireversibil,
maturarea 1,
maturarea 2 i
dispersia.
Industrial, biofilmele sunt responsabile de ancrasarea rezervoarelor de stocare i de nfundarea
conductelor de ap. Din punct de vedere medical, se pot observa n cazul endocarditei (pe
valve), otitei medii, plcii dentare i pot reprezenta o problem pentru pacienii cu fibroz
chistic. Biofilmele se dezvolt i pe implanturi sintetice cum ar fi: catetere intravasculare, valve,
pacemakere, instrumente ortopedice, lentile de contact etc.
O caracteristic foarte important a biofilmelor este reprezentat de rezistena crescut la
antibiotice, de pn la 500 de ori mai mare. Responsabile de aceasta sunt att EPS, care
acioneaz ca o barier sau care pot chiar inactiva antibioticele, ct i faptul c n cadrul
biofilmului bacteriile cresc mult mai greu, astfel nct o activitate metabolic sczut va conduce
la o asimilarea mai lent a antibioticelor.
125
126
LPZ cuprinde 3 regiuni: lipidul A (regiunea I), o poriune centrala rugoas polizaharidic
(regiunea II) i polizaharidul O / antigenul O (regiunea III).
- antigenele de tip K (cu structur polizaharidic sau polipeptidic - pentru Bacillus anthracis)
etc.
n ceea ce privete procesul aderenei, se cunoate faptul c orice obiect aflat n imersie atrage
particulele suspendate, inclusiv microorganismele, la suprafaa lui. Teoria coloidal DLVO (dup
numele autorilor) menioneaz c la nivelul suprafeei de imersie exist 2 poziii de stabilitate
termodinamic, prin intervenia gravitaiei, chemotaxiei, forelor de tip van der Waals, forelor
electrostatice i tensiunii superficiale (Schema nr. 1).
Contrabalansarea forelor de atracie i repulsie conduce la mpingerea dezordonat a
particulelor spre un minim secundar, poziie ce se situeaz la suprafaa de imersie. Acest
minim secundar corespunde fenomenului de adsorbie sau reinere (docking), proces
reversibil.
Ulterior sunt implicate i alte fore de legtur (covalente, de hidrogen, ionice, hidrofobe) care
vor duce la atingerea minimumului primar, cnd particulele devin legate ireversibil de
substrat. Aderena se produce atunci cnd particulele prsesc minimumul secundar i intr
n minimumul primar. Pentru unele bacterii (ex. V. cholerae, unele tulpini de E. coli, B.
pertussis, Helicobacter pylori) ataarea este destinaia final, n timp ce pentru altele (ex.
Salmonella, Shigella, Yersinia) reprezint doar o etap, urmnd penetrarea tisular i / sau
diseminarea n organism.
9. 2. 1. 2. Factori solubili care permit multiplicarea i invazivitatea germenilor (agresine) (Tabelul
nr. 1)
- coagulaza liber i/sau legat a S. aureus care transform fibrinogenul n fibrin i pe de o
parte poate masca bacteria nconjurat de structuri asemntoare cu ale gazdei, pe de alt
parte poate preveni fagocitarea sau chiar mpiedica ajungerea antibioticelor i chimioterapicelor
la sediul infeciei;
- leucocidina secretat dup ce stafilococul a fost fagocitat i care transform leucocitul n piocit
(se inser n membrana leucocitului i produce pori sau degradeaz enzimatic fosfolipidele de la
nivelul membranei);
- producerea unor substane care cresc concentraia intracelular de AMPc pn la concentraii
ce inhib fuzionarea fagozom-lizozom (de exemplu la Mycobacterium tuberculosis);
- producerea de catalaz (de exemplu: Staphylococcus aureus, Mycobacterium fortuitum),
glutation peroxidaz, superoxid dismutaz, citocrom oxidaz (Vibrio spp., Pseudomonas
aeruginosa, Neisseria spp.) care inhib sau inactiveaz radicalii activi de oxigen;
- producerea unor factori care confer rezisten la enzimele lizozomale, dup fuzionarea
fagozom-lizozom (Salmonella enteritidis, Mycobacterium leprae etc);
- producerea de enzime litice:
1. colagenaza (este produs de Clostridium histolyticum i Clostridium perfringens i distruge
colagenul prezent n muchi facilitnd rspndirea procesului infecios), hialuronidaza
(scindeaz acidul hialuronic, o component a esutului conjunctiv), fibrinolizina (determin liza
cheagului prin convertirea plasminogenului n plasmin) etc (streptococ, stafilococ, unele
clostridii);
127
9. 2. 2. Multiplicare i toxinogenez
Germenii se multiplic la poarta de intrare i elaboreaz exotoxine care produc alterri celulare
i distrucii tisulare la distan, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote i prin functio
laesa (toxikon era otrava n care erau nmuiate sgeile lupttorilor greci). Din punct de
vedere didactic trebuie menionate urmtoarele noiuni:
9. 2. 2. 1. Exotoxinele
128
Exotoxinele sunt elaborate n general de microbi Gram-pozitivi lizogenizai (de exemplu bacilul
difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic
(Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar i de bacili Gram-negativi, prin mecanism
cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau
sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli). (Tabelul nr. 2)
Au structur proteic, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar legrii de
receptorii celulei gazd i internalizrii ulterioare a poriuni enzimatice A (active). Exotoxina nu
i exercit efectele toxice dect dup ce poriunea A este eliberat din structura iniial. Sunt
secretate n timpul vieii germenilor. Sunt difuzibile la distan. Toxicitatea lor este foarte mare,
doza letal fiind de circa 0,1 g/kg corp (pn la 1 ng/kg corp n cazul toxinei botulinice).
Au afinitate diferit n funcie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard, SNC,
rinichi n cazul bacilului difteric). Manifestrile clinice apar dup o perioad de laten (cnd
toxina este deja fixat pe celulele int).
Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecii i reprezint urgene medicale, toxina
putnd fi neutralizat numai dac este liber n circulaie.
Au putere antigenic mare, fa de ele aprnd anticorpi antitoxin.
Un alt exemplu important privind exotoxinele se refer la Tcd A i Tcd B, produse de Clostridium
difficile i care acioneaz asupra celulelor intestinului gros, fiind responsabile de o boal
diareic uoar, pn la colit fulminant. Ele produc la acest nivel leziuni microscopice, dar i
leziuni mari, asemntoare unor plgi; endoscopic, se vor identifica noduli.
Prin degradarea proteinelor Rho, Rac i Cdc 42, responsabile de reglarea proceselor structurale
dependente de polimerizarea actinei, se poate observa la microscopul electronic alterarea
microfilamentelor de actin, rezultnd marginalizarea nucleului, schimbri n morfologia
citoscheletului, dar i alte modificri (alterarea suprafeei celulare i rearanjarea microvililor).
(Figura nr. 5)
Astfel, modificrile produse de toxinele Tcd A i Tcd B sunt: inflamaia, creterea permeabilitii
esutului epitelial intestinal, stimularea producerii de chemokine i citokine, acumularea de
neutrofile, producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului, activarea mastocitelor, producerea
substanei P, distrugerea direct a mucoasei intestinale, ruperea jonciunilor strnse (Zonula
occludens), degradarea actinei F. Substana P este responsabil de: activarea neuronilor din
submucoas, eliberarea TNF-, activarea macrofagelor din lamina propria; este implicat n
diareea inflamatorie.
9. 2. 2. 2. Antitoxinele
Avnd structur proteic, exotoxinele sunt imunogene i determin apariia de anticorpi
specifici (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxic prin cuplare
specific cu toxina. (Tabelul nr. 3) Se pot obine astfel seruri imune utile n seroterapia specific.
De regul aceste seruri sunt preparate pe cal i sunt utile n neutralizarea exotoxinelor (ex. n
tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului).
Administrarea antitoxinelor trebuie fcut cu precauie datorit faptului c anticorpii preparai
pe cal reprezint n acelai timp i antigene pentru gazda uman, dar n acelai timp ct mai
curnd posibil.
Tratamentul acestor entiti clinice este complex i nu reprezint subiectul acestui manual.
Administrarea antitoxinelor trebuie fcut dup o testare a unei eventuale hipersensibiliti i n
cazul c aceasta exist se recurge la desensibilizare i abia ulterior la seroterapie (administrarea
129
IgA secretorii (sunt secretate IgA i IgG cu rol n aglutinarea, dar i blocarea competitiv a
receptorilor celulelor. Cantitatea de IgA la nivelul fluidelor mucoaselor este mai mare dect IgG
datorit rezistenei acesteia la proteoliz prin cuplarea cu un polipeptid. IgA se poate lega de
bacteriile patogene intracelulare mpiedicnd ptrunderea acestora n celule.),
lactoferin (protein cu rol n legarea fierului. Fierul este un element important pentru
supravieuirea bacteriilor. Cu toate acestea, bacteriile care colonizeaz pielea i mucoasele au
mecanisme de achiziionare a fierului chiar n prezena acestor proteine),
alfa 1 antitripsin, lizozim (joac unul din rolurile cele mai importante, avnd efect
antimicrobian asupra bacteriilor gram pozitive prin hidroliza aminoacizilor din componena
peptidoglicanilor) etc.;
- pH-ul acid al unor secreii locale: pH-ul acid i flora bacterian au rol n inhibarea invaziei
bacteriilor patogene. Zonele inflamate au susceptibilitate crescut la colonizare.
- Prezena microflorei normale, ce constituie nia ecologic pe care germenii nou venii tind s o
ocupe. Flora comensal este un ecosistem cu rol n aprarea mpotriva invaziei
microorganismelor patogene. Mecanismele competitive sunt: competiia pentru aceleai
substane nutritive, competiia pentru aceiasi receptori. Secret i bacteriocine, fiind toxice
pentru alte bacterii, dar de obicei din aceeai specie, acizi grai volatili sau ali metabolii toxici.
9.3.2. barierele de organ
- Bariera hematoencefalic: este o barier fiziologic ntre sistemul sangvin i sistemul nervos
central (SNC). Aceasta servete la meninerea unei homeostazii constante n SNC. Aceast
barier are rolul de filtru, mpiedicnd ptrunderea n creier a unor substane toxice, germeni
patogeni, care se pot afla n snge. n acelai timp bariera permite ptrunderea din snge a
substanelor nutritive necesare SNC.
- Tractul respirator: particulele inhalate pot supravieui filtrrii n tractul respirator superior i
traheobronic. Fluxul turbulent determin depunerea particulelor de dimensiuni mari la nivelul
mucusului tractului respirator, iar sistemul mucociliar le ndeparteaz din plmani. Efortul de
131
tuse ajut la eliminare. Secreiile bronice conin substane precum: lizozim, -defensine,
lectine. Cnd particulele inhalate ajung la nivelul alveolelor ndeprtarea este realizat de
macrofage i histiocite. Toate aceste mecanisme de aprare pot fi nvinse de microorganisme
prin cantitatea acestora sau prin expunere ndelungat. Poluarea aerului, prezena
traheostomei, agenii alergici, defectele genetice etc. pot diminua mecanismele de aprare
ale tractului respirator.
- Tubul digestiv: Bariera acestuia este reprezentat de aciditatea gastric i rolul antibacterian al
diferitelor enzime (pancreatice, intestinale, biliare). Peristaltismul i descuamarea celulelor
epiteliale au i ele rol n aprarea antimicrobian. Salmonella spp. i M. tuberculosis produc
infecii la persoanele cu aclorhidrie, iar peristaltismul ncetinit favorizeaz infecia cu Shigella
spp. Pierderea jonciunilor strnse dintre enterocite poate favoriza translocarea bacteriilor n
circulaie.
- Tractul genitourinar: urina este n mod normal steril. Factorii care mpiedic colonizarea
bacterien sunt pH-ul, ureea, hipertonicitatea, glicoproteina Tamm-Horsfall (produs de rinichi
i excretat n cantitate mare n urin). Glicoproteina Tamm-Horsfall acioneaz ca un burete,
bacteriile leagndu-se de aceasta i astfel mpiedicnd colonizarea esuturilor. Tractul urinar
inferior este splat de fluxul urinar de 4-8 ori pe zi, eliminnd organismele patogene. Retenia
urinar este una dintre principalele cauze ale infeciilor urinare.
9.3.3. ganglionii limfatici de pe traiectul vaselor limfatice; Link Capitolul 10
9.3.4. sistemul fagocitar: Fagocitoza este mecanismul de nglobare i distrugere a
microorganismelor de ctre celulele dendritice, PMN, macrofage etc. Macrofagele se gsesc n
toate esuturile corpului, iar celulele PMN i monocitele circul prin snge i sistemul limfatic.
Chemokinele au rol n iniierea migrrii celulelor fagocitare spre esuturi, avnd rol n inflamaie.
Cnd o bacterie este internalizat ntr-un fagozom, este distrus de radicalii de oxigen, i de
diverse peptide. Microorganismele sunt digerate, iar peptidele se cupleaz cu moleculele
complexului major de histocompatibilitate, fiind ulterior prezentate limfocitelor T, determinnd
multiplicarea acestora i activarea rspunsului imun celular i umoral.
Fagocitoza este mai eficient n spaiile intratisulare nguste (alveolele pulmonare), dect la
nivelul suprafeelor ntinse (sinovial) sau n snge. Opsonizarea favorizeaz fagocitoza.
9.3.5. sistemul complement; Link Capitolul 15 (Sistemul complement)
9.3.6. citokinele: Link Capitolul 13 (Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi)
- interferonii (alfa, beta, gamma);
- interleukinele;
- colony-stimulating factor (CSF);
- citolizinele-factorul de necroz al tumorilor (TNF) alfa i beta;
- poliperforinele;
- factorii de cretere, de exemplu transforming growth factor (TGF) alfa i beta;
- factorii supresori i inhibitori ai multiplicrii.
9.3.7. sistemul imun (umoral i celular);
132
9. 4. Povestiri adevrate
9. 4. 1. LPZ i CID
Coagulare intravascular diseminat n cadrul unei enterocolite ulceronecrotice la un prematur
cu nutriie parenteral total (Punct de plecare: LPZ-ul germenilor Gram-negativi)
n primvara anului 2007, ntr-o maternitate din Bucureti s-a nscut pe cale natural un
prematur cu vrsta de gestaie de 30 sptmni i greutate de 1.600 g, cu scorul Apgar 7 (la 5
minute de la natere). Mama copilului a prezentat n cursul sarcinii infecii urinare recidivante
cu Escherichia coli. Cu circa 12-14 ore nainte de natere a avut loc ruperea prematur a
membranelor (travaliul cu membrane rupte peste 12 ore implic riscul producerii de infecii).
Prematurul a prezentat de la natere o detres respiratorie, pentru care a necesitat ventilaie cu
presiune pozitiv continu i nutriie parenteral total (avnd, n plus, intoleran digestiv).
Nutriia parenteral continu a presupus cateterizarea venoas central a copilului. ntruct
aceast cateterizare, asociat cu ventilaia asistat cresc riscul infecios al nou-nscutului, s-a
instituit antibioterapia empiric de protecie cu ampicilin i gentamicin.
Evoluia copilului a fost iniial favorabil timp de o sptmn, pentru ca ulterior acesta s
dezvolte o patologie digestiv manifestat prin abdomen meteorizat (mrit de volum), vrsturi
bilioase i scaune sanguinolente, asociate cu febr (39C).
S-a pus diagnosticul clinic i radiologic de enterocolit ulceronecrotic (necroz intestinal de
etiologie incert) i sepsis neonatal.
133
134
Examenul CT abdomino-pelvin evideniaz un abces la nivelul iliopsoasului de 6,6 pe 8,5 cm, iar
pe IRM-ul de coloan lombar se observ osteomielit la nivelul corpului vertebral L5 i a
procesului stng transvers.
Abcesul a fost drenat, iar n culturi a crescut Staphylococcus aureus meticilino-rezistent.
Culturile n anaerobioz au fost negative. Hemoculturile nu s-au pozitivat.
A efectuat 6 sptmani tratament parenteral cu vancomicin, urmat 2 sptmni de tratament
cu linezolid per os datorit dorinei pacientului de a merge la munc. A primit apoi Biseptol nc
8 sptmni.
Dup terminarea tratamentului VSH-ul a sczut la 14 mm/h, cu o Protein C Reactiv 0,7 mg/dl.
La 6 luni nu s-au nregistrat recderi.
n afar de identificare bacteriei i antibiogram s-a efectuat i latex aglutinare pentru
evidenierea PB2 (protein binding 2). Cu ajutorul tehnicii PCR a fost detectat fraciunea genic
responsabil de sinteza leucocidinei Panton-Valentine. (5)
Discuii: Infeciile reprezint complicaiile cele mai frecvente la pacienii transplantai. Infeciile
cu Stafilococ auriu meticilino-rezistent sunt predominant infecii intraspitaliceti i au devenit o
problem de sntate public. (6)
Un alt factor de risc important pentru infecia cu Stafilococ este i diabetul zaharat.
Leucocidina PantonValentine este un factor solubil, care permit multiplicarea i invazivitatea
stafilococului. Determin liza polimorfonuclearelor i monocitelor. Este considerat un factor de
virulen, care determin creterea severitii bolii att n afeciunile cutanate, ct i n
osteomielit sau pneumonii necrotizante.
9. 5. Direcii de cercetare
1) Un nou mecanism ce afecteaz virulena i sensibilitatea la antibiotice a Salmonella spp.
http://www.sciencedaily.com/releases/2010/07/100729172433.htm
2) Toxinele: prieteni sau dumani?
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2640701/pdf/10221874.pdf
3) Penetrarea barierei snge-creier de ctre Staphylococcus aureus (rolul acidului lipoteichoic)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2893325/
4) Reglarea expresiei hemolizinelor i a virulenei Stafilococului auriu de ctre diverse kinaze i
fosfataze
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2884019/
5) Noi Metalo--Lactamaze
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20577157
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2786356/
6) Patogenitate bacterian
http://textbookofbacteriology.net/pathogenesis.html
9. 6. Evaluarea cunotinelor
135
Bibliografie
1.
Gerald L. Mandell, John E. Bennett, Raphael Dolin, 2009, Principles and Practice of
Infectious Diseases, 7th edition, 37-47, 2423-2435.
2.
Topley, Wilson, 2006, Microbiology and Microbial Infections 10th edition
3.
Gerald L. Mandell, John E. Bennett, Raphael Dolin, 2005, Principles and Practice of
Infectious Diseases, 6th ed., 20-23
4.
Dehority W., E. Wang, P. S. Vernon, C. Lee, F. Perdreau-Remington, and J. Bradley,
2006, Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus necrotizing fasciitis in
a neonate, Pediatr. Infect. Dis. J., 25, 1080-1081
136
5.
Salliot C., V. Zeller, X. Puechal, V. Manceron, S. Sire, N. Varache, J. Etienne, N.
Desplaces, J. M. Ziza, 2006, Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus aureus
infections: report of 4 French cases, Scand. J. Infect. Dis., 38, 192-195
6.
Linares L., C. Cervera, F. Cofn, M. J. Ricart, N. Esforzado, V. Torregrosa, F.
Oppenheimer, J. M. Campistol, F. Marco, and A. Moreno, 2007, Epidemiology and outcomes of
multiple antibiotic-resistant bacterial infection in renal transplantation, Transplant. Proc., 39,
2222-2224
137
Noiuni de imunologie
Imunologia este o tiin care a aprut relativ recent, iniial ca un domeniu al Microbiologiei,
studiind mecanismele de aprare a organismelor (uman i animal) fa de agresiunea din cursul
procesului infecios.
n Imperiul Roman immunitas nsemna scutirea de anumite obligaii.
n primul secol dup Iisus Christos, descriind rezistena la veninul unor erpi veninoi, Lucanus a
considerat c immunitas nseamn scutit de a te mbolnvi.
Observaiile medicului englez Edward Jenner privind faptul c o parte dintre persoanele care
mulgeau vacile nu s-au mbolnvit n cursul epidemiei de variol, dar i faptul c pustulele care
apreau pe ugerul vacilor, ca i pe tegumentul minii persoanelor care mulgeau se asemnau,
au dus la concluzia c ntre aceste fenomene exist o legtur. n 1796, Jenner a realizat una
dintre primele experiene pe om (a inoculat secreie din pustulele de la vaci la un copil; ulterior
a inoculat secreie de la pacieni cu variol, iar copilul se pare c nu s-a mbolnvit de variol).
Cu toate acestea, reaciile n mass-media vremii nu au ntrziat s apar. (Figura nr. 1) vacile
din poza de la RM
Imunologia a fost fundamentat de studiile realizate de ctre marii cercettori Pasteur i
Metchnikoff. Louis Pasteur a vaccinat gini mpotriva holerei aviare, a vaccinat oi mpotriva
antraxului i a reuit prevenirea infeciei cu virusul rabic. Pasteur a decis s denumeasc
procedeul de inoculare cu germeni atenuai, urmat de protecia fa de boal, vaccinare
(probabil pentru c Jenner a obinut primele sale rezultate recoltnd i inoculnd produsul
obinut de la vaci). Ilia Metchinikoff a descoperit fagocitoza. Emil von Behring i S. Kitasato au
studiat fenomenul prin care se obin antitoxinele i ulterior au realizat experimentele care au
stat la baza seroterapiei. Despre hipersensibilitate a nceput s se discute n 1902, iar termenul
de histocompatibilitate este cunoscut din 1946. Aceste studii i multe altele, care ar merita
dedicarea unui volum ntreg, mult amplificate n deceniile care au urmat sunt mai departe n
continu micare, cu numeroase descoperiri chiar i n prezent.
Relaia ntre organismul gazd i sistemul imun (organe, celule, anticorpi, citokine etc) ar putea
fi asemnat cu relaia stabilit ntre o ar i armata rii respective, cu sisteme de control,
sisteme de comand, reacii la nevoie (uneori n regim de urgen) n care exist implicare
important i din partea altor sisteme (nervos, endocrin). Mai mult dect n exemplul privind
situaia la nivelul unei ri, soldaii din sistemul imun (de ex. LT citotoxice, celulele NK) pot
avea att o activitate efectoare ct i de control i retro-control (i depesc limitele de
simpli soldai).
S-ar putea ridica o ntrebare i anume: de ce avem nevoie de un sistem imunitar?
S nu uitm faptul c n fiecare zi organismul nostru se ntlnete cu nenumrabile
microorganisme: bacterii, virusuri, parazii etc. Unele microorganisme nu ne afecteaz n nici un
mod, altele au efecte benefice fa de organismul nostru, n timp ce o mare parte dintre
microorganisme pot duce la apariia unor mbolnviri. n acest context, sistemul imun a fost
nevoit s gseasc modaliti prin care s lupte mpotriva microorganismelor patogene i
condiionat patogene.
Mai mult dect att, chiar i substane strine (non-self) neinfecioase dar i structuri proprii
modificate pot duce la un rspuns imun. S-a demonstrat i faptul c mecanisme care n mod
normal protejeaz organismul de eventualele infecii pot fi implicate n determinarea unor
leziuni tisulare sau de organ.
138
Avnd n vedere toate aceste aspecte (dorim s subliniem faptul c realitatea este cu mult mai
complex), o definiie a imunitii ar putea fi urmtoarea: imunitatea reprezint o reacie fa
de orice structur non-self (fie microorganism sau o substan strin de tipul unei
macromolecule proteice, glicoproteice etc) sau fa de o celul sau structur proprie care a
suferit modificri.
Informaiile privind sistemul imun sunt prezentate n cadrul mai multor catedre i discipline.
Avnd drept int o ct mai bun nelegere a capitolelor pe care ne-am gndit s le introducem
n Manualul de Microbiologie dorim s facem o scurt trecere n revist a organelor,
celulelor, moleculelor i mecanismelor implicate n imunitate.
Menionm faptul c nu vei gsi aici toate definiiile i explicaiile; pentru aceasta cititorul va
trebui s parcurg fiecare capitol n parte. Etapele pe care le descriem au doar scop didactic; n
realitate fenomenele se petrec simultan i sunt mult mai complexe dect pot fi explicate ntr-un
simplu manual sau chiar i dect ar putea fi acestea explicate de oamenii de stiin, n acest
moment. Ceea ce noi cunoatem este, de fapt, o pictur ntr-un ocean.
Astfel, ne propunem s lum ca exemplu un microorganism oarecare - un antigen. n cazul n
care acesta reuete s depeasc barierele naturale ale organismului (piele, mucoase etc) i
s ptrund n gazd, urmtoarea linie de aprare este reprezentat de imunitatea nnscut.
Fagocitele reprezentate spre exemplu de macrofage i granulocite recunosc microbii de orice fel
(recunoaterea nu este specific) i ncep procesul de fagocitoz. Apare i rspunsul inflamator.
Ulterior intr n aciune imunitatea adaptativ care se manifest cu ajutorul limfocitelor.
Aceasta din urm este specific deoarece dezvolt n timp (cateva zile) celule i molecule
specifice pentru a lupta strict mpotriva acestui antigen.
O alt deosebire major ntre cele dou tipuri de imunitate este reprezentat de capacitatea
limfocitelor de a se transforma n limfocite cu memorie dup ntlnirea cu un anumit antigen.
Astfel, spre deosebire de macrofage i granulocite, la o a doua ntlnire cu acelai antigen,
limfocitele l vor recunoate iar procesul de aprare se va declana mult mai rapid.
Explicnd puin mai n n profunzime (menionm c explicaii mai detaliate vor fi furnizate n
capitolul 11 i n alte capitole care urmeaz) avem n vedere faptul c antigenul ptruns n
organism este captat de ctre celulele prezentatoare de antigen (APC) (macrofage, celule
dendritice, limfocite B etc).
Antigenul nu poate fi recunoscut ca atare de ctre sistemul imun deoarece doar o anumit
parte a lui numit epitop prezint proprietatea de imunogenicitate la valoare maxim i poate
declana un rspuns imun. Antigenul este endocitat de ctre APC, prelucrat n lizozomi iar
epitopii rezultai vor fi prezentai limfocitelor n complex cu moleculele sistemului major de
histocompatibilitate (MHC). MHC include molecule prezente pe celulele organismului uman
(vezi capitolul 12). Limfocitele vor declana un rspuns imun.
Exist dou tipuri principale de limfocite i anume limfocitele T i limfocitele B, dup cum exist
dou tipuri de rspuns imun, umoral i celular. Limfocitele T secret citokine care pot activa
oricare din cele dou tipuri de rspuns imun iar limfocitele B (dup proliferare i blastizare)
secret imunoglobuline (anticorpi) implicate n rspunsul imun umoral.
Antigenele pot fi clasificate n mai multe grupe: exogene/endogene, timodependente/
timoindependente etc.
Rspunsul imun umoral este declanat de antigene exogene timodependente i independente
prezentate pe MHC II, iar rspunsul imun celular este declanat de antigene endogene
timodependente prezentate pe MHC I.
139
n cazul n care ne ntrebm: cine produce aceste celule i unde se desfoar rspunsul imun?
O parte a explicaiei ar include existena organor limfoide primare precum mduva osoas
hematogen (sediul producerii limfocitelor T i B i maturrii limfocitelor B) i timusul (sediul
maturrii limfocitelor T) i organe limfoide secundare precum pulpa alb a splinei unde se
desfoar rspunsul imun umoral i este iniiat cel celular care se desfoar apoi la locul
infeciei i ganglionii limfatici (vezi i capitolul 10).
Sistemul imun se poate confrunta cu o mare problem, i anume, aceea de a menine balana
ntre un rspuns imun eficace i limitarea apariiei de leziuni tisulare (n cadrul unui RI exagerat).
Cnd aceast balan se rupe apar bolile autoimune i strile de hipersensibilitate.
Povestire adevrat: Povestea vaccinului
Edward Jenner s-a nscut pe data de 17 mai 1749 n Berkeley, Gloucestershire. nca de mic el a
fost interesat de tiine i natur. Pe atunci circula zvonul cum c lptresele sunt protejate de
variol, zvon pe care l-a auzit i el.
La 21 ani a plecat n Londra i a devenit studentul lui John Hunter, cel mai renumit chirurg din
Anglia i un respectat i cunoscut biolog i anatomist. ntre cei doi s-a nchegat o prietenie
adevrat. Jenner a studiat geologia i a fcut mai multe experimente cu snge uman. A ctigat
experien n biologie i bineneles, n chirurgie.
De-a lungul anilor, Jenner a tot auzit zvonul c lptresele erau protejate de variola. Punnd
lucrurile n balan, Jenner a concluzionat c forma de variol fcut de vaci ar putea avea o
oarecare legtur cu un posibil mecanism de protecie. n mai 1796 a gsit o tnr lptreas,
Sarah Nelms, care avea leziuni nou aprute datorit variolei vacilor pe mini i brae. Pe data
de 14 mai 1796 a inoculat material din leziunile ei la biatul unui servitor n vrst de 8 ani,
James Phipps. Ulterior, biatul a prezentat febr i discomfort n zona axilar. La 9 zile a
prezentat simptomele unei rceli i i-a pierdut apetitul dar ziua urmtoare era iar bine. n iulie
1796 Jenner l-a inoculat iar pe biat, de data aceasta cu material dintr-o leziune nou aprut de
variol uman. Baiatul nu a dezvoltat boala aa c Jenner a concluzionat c acesta era protejat
complet.
n 1797, Jenner a trimis un scurt comunicat spre Societatea Regal descriind experimentul i
observaiile sale. Totui, lucrarea a fost respins. n 1798, dup ce a mai experimentat pe civa
oameni, Jenner a publicat o mic carte numit O incursiune n cauzele i efectele vaccinului
antivariolic, o boal descoperit n unele din rile vestice ale Angliei, mai ales n Gloucestershire
i cunoscut sub numele de variola vacilor.
Cuvntul latin pentru vac este vacca iar pentru variola vacilor este vaccinia. Jenner a decis
s denumeasc aceast nou procedur vaccinare. n 1798 publicaia avea trei pri. n prima
parte Jenner prezint viziunea sa legat de variola vacilor ca o boal a cailor transmis la vaci.
Teoria a fost infirmat n timpul vieii lui Jenner. Apoi a prezentat ipoteza c infecia cu variola
vacilor protejeaz de infecia cu variol uman. n cea de-a doua parte sunt continuate
observaiile critice relevante pentru testarea ipotezei sale. A treia parte a fost o discuie lung,
n parte polemic, legat de descoperirile i problemele variate legate de variol. Reaciile la
aceast publicaie au fost din cele mai diverse.
Jenner a plecat la Londra n cutare de voluntari pentru vaccinare. Dup trei luni nu gsise nici
mcar unul singur. El a pornit un studiu la nivel naional n cutarea persoanelor care prezint
rezisten la variol n rndul celor care fcuser variola vacii. Rezultatul acestui studiu i-a
confirmat teoria. n ciuda erorilor i controverselor nenumrate folosirea vaccinrii s-a rspndit
rapid n ntreaga Anglie i pn n 1800 a atins majoritatea rilor Europene (Jenner a vaccinat n
140
1801 populaia din Cluj i Trgu Mure, apoi aceast procedur s-a extins n ntreaga ar n
urmtorii 31 de ani (1).
Dei a fost apreciat la nivel mondial i i s-au acordat multe onoruri, Jenner nu a avut intenia s
se mbogeasc. n 1802, Parlamentul Britanic i-a oferit suma de 10,000 pentru descoperirea
sa, iar cinci ani ulterior i-a oferit nca 20,000. Pe de alta parte, el a fost i subiectul ridiculei i
atacurilor, nu doar al onorurilor. n ciuda acestor lucruri el i-a continuat activitile n slujba
vaccinrii.
Lucrarea lui Jenner reprezint prima ncercare tiinific de control a bolilor infecioase prin
folosirea deliberat a vaccinrii. Totui, nu el este cel care a descoperit vaccinarea, dar a fost
primul care a oferit un status tiinific acestei proceduri. Benjamin Jesty este cel care a vaccinat
primul mpotriva variolei.
La sfritul secolului XIX s-a descoperit c vaccinarea nu confer imunitate pentru toat viaa i
de aceea este nevoie de revaccinare. Mortalitatea datorat variolei era n scdere, dar
epidemiile artau c boala nc nu era inut sub control. n 1950 s-au implemantat mai multe
msuri de control i variola a fost eradicat n mai multe zone ale Europei i America de Nord.
Procesul de eradicare la nivel mondial al variolei a fost discutat atunci cnd Adunarea Mondial
a Sntii a primit un raport, n 1958, legat de consecinele catastrofale ale variolei n 63 de
ri. n 1967 s-a nceput o campanie global condus de Organizaia Mondial a Sntii care a
dus la eradicarea variolei n 1977. n data de 8 mai 1980 Adunarea Mondial a Sntii a
anunat c lumea nu mai are variol i a recomandat ca toate rile s nceteze vaccinarea. (2)
Nu am dorit s povestim totul legat de vaccinare n cadrul acestui capitol, ci doar s v
introducem puin n povestea acestei tehnici pentru a arta evoluia lucrurilor i efectul benefic
pe care l-a avut aceast descoperire n ntreaga lume. Aa cum se tie, vaccinarea rmne
momentan singura metoda cu cel mai bun raport cost-eficien. Pe aceast cale dorim s
sensibilizm studenii la medicin i cititorii acestei cri n ceea ce privete vaccinarea i s
infirmm teoriile greite care au circulat i continu s circule n ultimul timp.
Bibliografie
1. Mihancea N., 1979, History of smallpox vaccination in Romania and source of the IC strains of
vaccinia virus, Rev Ig Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol Pneumoftiziol Bacteriol Virusol
Parazitol Epidemiol., 24(4), 247-52
2. Riedel S, 2005, Edward Jenner and the history of smallpox and vaccination, Proc. (Bayl Univ
Med Cent), 18(1), 21-25.
141
142
Un limfocit T sau B matur care a prsit timusul, respectiv mduva osoas hematogen, nu mai
revine niciodat la acest nivel, cele dou organe fiind n afara cilor de recirculare a limfocitelor
antigen-specifice din organele limfoide secundare.
10. 2. 1. Timusul
Timusul se formeaz n perioada de dezvoltare a celui de-al treilea arc branchial.
nc din stadiul de dezvoltare fetal, timusul este prezent n cavitatea toracic, fiind dispus
retrosternal, ca un organ bine difereniat, deja funcional. Agenezia acestei regiuni duce la
apariia unui deficit congenital rar, sindromul Di George (aplazia congenital timic sau boala
pipernicirii), caracterizat prin tulburri ale imunitii celulare i implicit prin susceptibilitate
crescut la infecii (respiratorii, digestive i cutanate, produse n special de fungi i virusuri i
mai rar de ctre bacterii), tetanie neonatal (datorat absenei paratiroidelor) i malformaii
congenitale diverse (arc aortic dublu, tetralogie Fallot, micrognatism, atrezie de esofag etc).
Timusul este un organ situat n mediastinul anterior i superior, retrosternal, format din doi lobi
unii printr-un istm median. Fiecare lob este format din lobuli compartimentai de septuri
derivate din capsula organului. Lobulul timic este alctuit din 2 zone: cortical (la exterior) i
medular (la interior). Iniial se dezvolt zona cortical.
Greutatea sa variaz cu vrsta (este bine dezvoltat la ft, greutatea crete pn la pubertate dezvoltarea maxim se realizeaz la vrsta de 10-12 ani, apoi sufer o involuie lent, fr s
dispar total).
n zona cortical, trama de-a lungul creia se plaseaz protimocitele (sosite n timus de la MOH)
cuprinde celule epiteliale, celule dendritice intratimice i macrofage. Limfocitele mici, denumite
i timocite corticale, sunt numeroase, grupate n grmezi, n jurul celulelor epiteliale. Ele se divid
activ, dar nu se structureaz n noduli limfatici.
n zona medular, celulele epiteliale sunt izolate sau grupate formnd corpusculii lui Hassal
(formaiuni de celule epiteliale care degenereaz, fiind mereu nlocuite cu alte celule similare),
caracteristici timusului. Se consider c au rol fagocitar. Cresc att numeric ct i ca dimensiuni,
probabil datorit contactului cu microorganismele din flora normal, dar i contaminrii cu alte
microorganisme. Medulara mai conine i celule dendritice, macrofage i timocite. Timocitele
medulare sunt mult mai dispersate dect cele din zona cortical. La acest nivel are loc selecia
negativ a timocitelor.
Timusul are capacitatea de a elimina prin selecie pozitiv celulele care, odat eliberate n
circulaie, nu ar fi putut produce efectul scontat, deoarece nu ar fi recunoscut structurile nonself i prin selecie negativ celulele care ar fi dat reacii autoimune.
Populaia limfocitar aflat n proces de multiplicare n timus, este foarte sensibil la aciunea
corticosteroizilor, 95% din limfocite fiind distruse. Restul de 5% din limfocitele cortico-rezistente
sunt cele care, la finalul maturaiei, trec n circulaie. Se pare c iniial are loc distrugerea a 80%
dintre limfocite, 20% ajung la nivel medular i dintre acestea supravieuiesc cele 1-5% limfocite
cortico-rezistente. Timocitele ajunse n zona medular sunt mai rezistente la aciunea
cortizolului dect cele din zona cortical. (Figura nr. 1)
Rolul timusului se manifest local i la distan:
molecule CD2, CD3, CD4, CD8 i TCR. Urmeaz o dubl selecie, pozitiv i negativ. n selecia
pozitiv, timocitele care recunosc antigenele strine fixate pe moleculele MHC pot prolifera
(timocitele CD4+ recunosc moleculele MHC clasa II, timocitele CD8+ recunosc moleculele MHC
clasa I), n timp ce acele limfocite care nu i-au dezvoltat receptori pentru antigene sunt
distruse. n selecia negativ, timocitele care recunosc structurile self sunt distruse, eliminnduse astfel timocitele puternic autoreactive, care ar conduce la apariia unor fenomene autoimune
imediat dup natere. n timus are loc multiplicarea, diferenierea i selecia limfocitelor T. Tot
la nivel timic are loc producerea celulelor de control, cu rol n prevenirea bolilor autoimune
(experienele realizate prin nlocuirea limfocitelor proprii cu limfocite de la persoane sntoase
a dus, pentru un timp, la dispariia semnelor de boal, dovedind astfel existena acestor celule
timice). (Figura nr. 2)
144
Dezvoltarea organelor limfoide secundare, numite i periferice sau efectoare, este tardiv fa
de cea a organelor limfoide primare, atingnd dezvoltarea deplin numai dup stimularea
antigenic. Amintim ca exemple de organe limfoide secundare: ganglionii limfatici, splina i
organele limfoide ataate sistemului digestiv (apendice, amigdale, plci Peyer) etc. La nivelul
acestor organe se cantoneaz limfocitele T provenite din timus i limfocitele B provenite din
mduva osoas hematogen, migrate pe calea torentului circulator. n organele limfoide
secundare, aceste celule se vor activa n urma contactului cu antigenele.
n anumite zone ale organelor limfoide secundare, precum cele din ganglionii limfatici sau din
splin, se gsesc grupuri de celule, constituite n special din limfocite B, denumite foliculi sau
noduli limfatici. naintea stimulrii antigenice, aceti foliculi primari sunt n repaus, cu limfocite
mici apropiate unele de altele, determinnd un aspect dens, caracteristic. Aceste limfocite
mature sunt denumite naive, deoarece nu au avut contact cu antigenul. Dup circa 3-6 zile de
la stimularea antigenic, foliculii primari se transform n foliculi secundari, cu un centru
germinativ clar, nconjurat de o zon mai ntunecat. n jurul foliculului exist o zon marginal
puin vizibil, constituit din limfocite B cu memorie. Foliculul secundar persist cteva
sptmni dup care redevine folicul primar.
Organele limfoide secundare cuprind urmtoarele grupe:
10. 3. 1. Ganglionii limfatici
Ganglionii limfatici (nodulii limfatici) reprezint structuri imune, organizate, situate la
interseciile traseelor limfatice. Au urmtoarele roluri:
joac rolul unui filtru care n mod nespecific ndeprteaz/elimin complexele antigenanticorp circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex. cu Plasmodium spp.,
Babesia microti);
eliminarea hematiilor degradate, mbtrnite;
146
Sistemul imunitar asociat tubului digestiv (GALT - gut associated lymphoid tissue) cuprinde
plcile Peyer i formaiunile limfoide ale apendicelui (secret IgA), limfocitele intra-epiteliale i
limfocitele sub-epiteliale. Plcile Peyer reprezint aglomerri de celule limfoide (la nivelul
jejunului, duodenului i ileonului). Dup infecii bacteriene se mresc i se pot uni n adevrate
cordoane limfoide. Nu au vase limfatice proprii;
Sistemul imunitar asociat arborelui bronic (BALT - bronchus associated lymphoid tissue);
147
Inflamarea apendicelui (apendicit) este o afeciune frecvent ntlnit n seciile de chirurgie, iar
apendicectomia a devenit o procedur de rutin, avnd puine riscuri (n general datorate
efectelor anesteziei). Studii recente afirm c apendicectomia (desfurat n cazul unei
apendicite acute i nu atunci cnd nu exist de fapt aceast afeciune) are efecte benefice n
scderea incidenei dezvoltrii colitei ulcerative. S-a constatat c la pacienii suferinzi de
apendicit la vrste tinere care au fost supui operaiei, a sczut riscul de apariie a colitei
ulcerative cu pn la dou treimi. Se pare c efectul este dat de o stimulare a limfocitelor T
supresoare ce survine n urma procedurii chirurgicale. ns apendicectomia nu reprezint o
soluie n cazul celor la care boala s-a instalat deja.
Colita ulcerativ este o boal inflamatorie a intestinului caracterizat prin apariia ulceraiilor n
peretele colonului, diaree cu snge i crampe abdominale. Cauzele instalrii bolii sunt multiple,
de natur genetic, cauz autoimun, alimentaie necorespunztoare. Un parcurs de 10 ani
netratat poate degenera n cancer de colon sau cancer rectal.
Chiar dac apendicectomiile au devenit floare la ureche pentru muli medici chirurgi iar
pacienii nu se tem de o operaie uoar, este de reinut faptul c diagnosticul trebuie
instaurat corect de ctre medic care adesea uit c durerea la nivelul zonei inghinale drepte nu
este semnul patognomonic pentru apendicit i nu se mai obosete s mai fac alte teste,
realiznd uneori o operaie inutil i netratnd pn la urm suferina pacientului.
Care este organul care pe lng funcia limfoid, are i funcie hematoformatoare n
ansamblu?
splina;
ganglionul limfatic;
timusul;
mduva osoas hematogen.
3. http://ebooks.unibuc.ro/biologie/mihaiescu/index.htm
4. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai, 2007, Cellular and Molecular Immunology
5. http://www.nejm.org
6. http://www.medscape.com
7. Lee Goldman, Dennis Ausiello, 2008, Cecil Medicine, 3rd edition
8. Jawetz, Melnick, Adelberg, 2007, Medical Microbiology, 24th edition
9. Junqueira, Carneiro, 2005, Basic Histology Text & Atlas
10. T. W. Sadler, 2006, Medical Embryology
150
funciilor i
sinteza de citokine dar i de receptori pentru acestea de ctre limfocitele naive dar mature
diferenierea limfocitelor efectoare n limfocite cu memorie.
Aadar, avem de-a face cu trei tipuri de limfocite:
naive mature dar care nu au avut contact cu antigenul; acestea urmeaz s fie distruse
n cazul n care ntr-o perioad de 1-3 luni nu au contact antigenic
efectoare
cu memorie - care vor reaciona mai rapid la a doua stimulare cu acelai antigen.
153
Tipuri de limfocite T
Limfocitele T ajuttoare (T helper, CD4+) (LTh/Th)
Limfocitul Th este un veritabil coordonator, orientnd rspunsul imun (RI) ctre RI celular sau
ctre RI umoral. Exist cinci subtipuri de LTh (Th0, Th1, Th2, Th3 i Th17):
limfocitele Th0 sunt limfocite tinere (sub influena unor stimuli moleculari, ex. IL-4, IL12, se vor transforma n limfocite Th1 sau n limfocite Th2);
limfocitele Th1 sintetizeaz limfotoxin, IL-2, IFN-, TNF- i TNF-
o au rol foarte important n aprarea anti-viral, i anti-neoplazic (dar i n aprarea antifungic i anti-bacterian),
o sunt implicate mai ales n RIC,
o stimuleaz switch-ul izotipic spre IgG2 i IgG3,
o amplific rolul citotoxic al macrofagelor i stimuleaz proliferarea LTc;
limfocitele Th2 sintetizeaz IL2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13;
o au rol mai ales n RIU,
o sunt implicate n reaciile de hipersensibilitate,
o stimuleaz proliferarea LB i secreia de anticorpi;
o sunt stimulate de semnale venite de la bazofile i eozinofile (papaina duce la sinteza de IL-4
de ctre bazofile care duce la stimularea rspunsului Th2) (1).
limfocitele Th3 (limfocitele T reglatorii) deprim funcia altor limfocite (CD4+, CD8+,
LB, NK); secret Il-10 (inhib Th1 i Th2, deci RIU i RIC) i TGF- (inhib rspunsul imun); sunt
CD4+ i CD25+;
relativ recent au fost identificate limfocitele Th17; acestea se gsesc la interfaa dintre
mediul extern i mediul intern (ex. la nivelul tegumentului, de-a lungul tractului gastrointestinal); sintetizeaz IL-6, IL-17 i TNF-;
o au rol de protecie la nivelul acestor suprafee,
o studii recente au aratat c sunt implicate n inducerea i exacerbarea autoimunitii i
inflamaiei (datorit IL-17),
o activeaz RIC (importante n RI prin recrutarea neutrofilelor i macrofagelor la locul infeciei),
o sunt n relaie cu LT reglatorii care previn fenomenele inflamatorii i mediaz tolerana imun
(2),
o secreia lor este stimulat de IL-23,
o LTh-17 cu memorie reacioneaza fa de antigenele Candida albicans (3).
Limfocitele T citotoxice (Tc, CD8+)
Se refer n principal la LT CD8+, cu toate c aceast proprietate a fost observat i la unele LT
CD4+, cu urmtoarele diferene:
LTc CD8+ pot liza oricare dintre celulele organismului care exprim molecule HLA I (HLA human leukocyte antigen system)
LTc CD4+ i limiteaz funcia la celulele care exprim molecule HLA II.
Au mai multe roluri, de ex. realizeaz supravegherea imunologic prevenind multiplicarea
anarhic a celulelor. Dac de ex. apar antigene tumorale, LTc au capacitatea de a le recunoate,
de a se multiplica/activa i de a le distruge. n aceast supraveghere, LTc sunt ajutate de
celulele NK.
Distrugerea antigenelor este indus prin dou mecanisme:
inducerea apoptozei prin intermediul unui receptor al morii celulare, ceea ce duce la
fragmentarea ADN-ului celulei int;
154
atacul asupra celulei int prin perforine (proteine ce rup membrana plasmatic sau
lizozomal) i granzine (serin proteaze care lizeaz substraturi sau activeaz diverse proteaze)
sintetizate i eliberate de ctre LTc.
LTc au un rol important n aprarea mpotriva celulelor infectate viral. Activitatea lor este
intensificat de IFN-g.
Importana activitii litice a LTc a fost demonstrat att experimental (pe modele animale) ct
i la pacieni care prezentau defecte ale citotoxicitii. Exist sindroame genetice transmise
autozomal recesiv n cadrul crora este afectat citotoxicitatea sau prezentnd mutaii la nivelul
genei ce codific informaia pentru sinteza de perforine. Aceste sindroame au fost asociate cu
imposibilitatea controlrii infeciilor virale, mai ales cu CMV, EBV i HSV (4).
Limfocitele T inductoare ale hipersensibilitii ntrziate
Sunt celule care secret IL-2 i n acelai timp IFN-g, activatoare pentru alte limfocite T,
macrofage i celulele NK.
Limfocitele T supresoare (Ts, CD8+)
Limfocitul T supresor este o celul CD8+, ca i LT citotoxic.
Limfocitele Ts au rol n reglarea rspunsului imun, meninndu-l n limite normale.
n lipsa Ts, orice stimul antigenic ar putea fi urmat de o proliferare anarhic a unei clone de
limfocite (acele limfocite dotate cu receptorul specific pentru respectiva structur antigenic).
n mod normal, ntre populaiile de limfocite Th i Ts exist un echilibru, care se cuantific prin
raportul Th/Ts, raport care trebuie s fie supraunitar. Exemplul cel mai cunoscut n care
valoarea raportului devine subunitar este infecia HIV / SIDA.
O parte dintre limfocitele T nu au funcie efectoare i se transform n LT cu memorie.
Limfocitele T ( T cells)
Limfocitele T sunt sechestrate la nivelul barierelor epiteliale sau la nivelul focarului inflamator
i manifest citotoxicitate fa de diverse inte.
Sunt activate direct de antigen (non-peptide de dimensiuni mici) fr a fi necesar prezentarea
n conjuncie cu MHC.
Reacioneaza fa de extractele mycobacteriene. Sunt stimulate de gruprile fosfat din diveri
compui precum NTP (nucleotid trifosfat din ADN i ARN). Teste efectuate pe animale de
laborator care au fost infectate cu Listeria spp., Leischmania spp., Mycobacterium spp.,
Plasmodium i Salmonella spp. au artat un nivel de protecie mediu realizat de aceste
limfocite.
Se acumuleaz la nivelul focarului inflamator n boli cu implicare imun precum artrita
reumatoid sau sarcoidoza (cauza nu este cunoscut).
Sunt implicate att n imunitatea nnscut ct i n cea adaptativ, prin
155
exprim receptori pentru complement CR1 (CD35) i CR2 (CD21). Ultimul recunoate
fragmentul C3d, component degradat al fragmentului C3 al complementului. Acesta contribuie
la activarea limfocitului B.
exprim receptori pentru anumite lectine (ex. PWM) utilizate in vitro pentru transformarea
limfoblastic a limfocitelor B, dar i receptori pentru endotoxine bacteriene (LPZ).
Transformarea unui LB naiv ntr-un LB activ i apoi n plasmocit necesit intervenia succesiv a
citokinelor (ca ntr-o cascad).
Activarea are loc datorit recunoaterii antigenice dar i datorit secreiei de IL-1 de ctre celula
prezentatoare de antigen (APC) i respectiv secreiei de IL-4 de ctre Th2. Limfocitul B activ
exprim receptori pentru alte interleukine, n special IL-5 i IL-6 i lanul a al IL-2. LB se va divide
i va da natere la numeroase celule identice n foliculul limfoid secundar.
Limfocitul B se difereniaz progresiv ntr-un limfoblast sau imunoblast care secret IgM. Sub
aciunea diferitelor citokine are loc comutarea izotipic (isotypic switch) de la IgM la IgG, IgA sau
IgE; n urma acestei comutri plasmocitul va secreta IgG, IgA sau IgE. De exemplu, sub aciunea
IL-4 are loc comutarea izotipic a IgM n IgG sau IgE iar sub aciunea IL-5 n IgA.
Exist i limfocite B active care nu se transform n plasmocite ci persist sub form de limfocite
B cu memorie, cu o durat de via lung (asigurnd spre exemplu protecia fa de o nou
mbolnvire, de ex. dup scarlatin/infecie cu streptococul piogen de grup A, lizogenizat).
Limfocitul B are urmtoarele funcii: 1. Prezentarea antigenelor ctre LT; 2. Sinteza
imunoglobulinelor (anticorpilor). n cazul antigenelor timo-dependente, are loc trecerea de la
rspunsul primar cu secreie predominent de IgM, la un rspuns secundar cu predominena
IgG sau mai rar a IgA sau IgE. n cazul antigenelor timo-independente, se menine sinteza
anticorpilor din clasa IgM.
Limfoblastul (lymphoid progenitor) d natere la trei linii celulare (LT, LB i NK). Exist o gen
(Pax5) care este esenial pentru maturarea LB (5).
156
celulele dendritice,
monocitele / macrofagele i
limfocitele B;
- celulele ocazionale (ndeplinesc funcia doar n anumite condiii de activare celular)
neutrofilele,
celulele endoteliale i
celulele epiteliale.
Celulele prezentatoare de antigen (APC) au urmtoarele funcii (Figura nr. 3):
prezint antigenele native LT urmnd selecia clonei de limfocite specifice acelui antigen,
au pe membran mai multe tipuri de receptori pentru mai multe tipuri de particule.
Sunt clasificate, n funcie de distribuia n organism i de particularitile fenotipice, n trei mari
clase i ase tipuri:
157
celule Langerhans CDL, care la nivel cutanat formeaz un strat continuu ntre derm i
epiderm (dar le gsim i la nivelul tubului digestiv i organelor genitale),
n esutul cutanat se transform n CDL (capteaz antigenele opsonizate), apoi iau calea
vaselor limfatice transformndu-se n CDV, ajung la nivelul organelor limfoide secundare unde
se transform n CDID care prezint pe membrana epitopi n conjuncie cu MHC II.
n interstiiu se transform n CDI, apoi fie iau calea vaselor limfatice (i urmeaz drumul
de mai sus), fie trec n circulaie, se transform din nou n CDS i ajung n splin unde fie
o ajung periarteriolar (zona cu LT) i se transform n CDF care reprezint filtre pentru
antigenele solubile,
o ajung n jurul zonei periarteriolare (zona cu LB) i se transform n CDID.
Subliniem c este vorba despre aceeai celul dendritic, n circulaie prin organism; n funcie
de locul n care ajunge are alte caracteristici structurale i funcionale.
Celulele dendritice tipice (CDL, CDI, CDID) au form neregulat, cu prelungiri numeroase, lungi i
efilate (de unde vine i denumirea lor). n citoplasma celulelor dendritice se gsesc numeroase
mitocondrii. CDF nu au att de multe prelungiri i se dispun n grmezi. CDS au aspect rotund
ovalar iar CDL sunt celule vluroase.
Au rol important n maturizarea precursorilor LT.
Induc tolerana LT, eliminnd LT autoreactive (cele care la nivel timic au interacionat cu MHC i
ar putea s reacioneze la fel de puternic i cu celulele somatice normale din organismul uman
i s genereze autoimunitatea). Astfel, CD elimina LT care au scpat seleciei negative (vezi Cap.
10, paragraf 10.2.1.).
Se pare c aceste celule intervin n declanarea RI naintea macrofagelor.
Monocitele / macrofagele pot fagocita exo-antigenele ntr-o vacuol numit endozom primar.
Fuziunea endozomilor secundari cu lizozomii permite degradarea antigenelor n peptide
imunogenice. Moleculele MHC II, produse la nivelul reticulului endoplasmic, pot ncrca
aceste peptide. Fago-lizozomii fuzioneaz cu membrana plasmatic i astfel, peptidul de pe
MHC II se exprim la suprafaa extern a macrofagelor.
Macrofagele reprezint APC majoritare n organism, ns nu toate pot ndeplini funcia de APC,
respectiv:
celelalte vor funciona ca APC n cinci etape
1. captarea Ag (proces imunologic nespecific, mediat de receptori);
2. endocitarea Ag captate (realizat doar de ctre macrofagele activate metabolic);
3. prelucrarea Ag native captate (are loc la nivel lizozomal iar la finalul ei, rmne un epitop,
format dintr-o hapten cu specificitate maxim i o protein carrier);
4. conservarea epitopilor n anumite sectoare subcelulare (n acest fel este asigurat
autontreinerea RI n timp);
5. prezentarea epitopilor pe membrana APC, cuplai n permanen cu molecule MHC.
Sistemul MM exprim molecule MHC II, mai ales dup activarea prin interferonul gamma (IFNg). Dup contactul cu limfocitul T, macrofagele secret IL-1 i IL-6 i TNF-a; TNF-a activeaz RI i
procesul inflamator local.
Limfocitele B pot funciona ca APC profesionale numai n condiii de activare metabolic. Au
capacitatea de a recunoate epitopii conformaionali ai antigenelor i de a-i prezenta
limfocitelor T (de peste 30 de ani a fost dovedit faptul c RI la antigenele timo-dependente
necesit cooperarea LB-LT). Prezint pe suprafaa lor receptori de tip CR i FcR i pot sintetiza
molecule MHC II.
LB recunosc i prezint numai Ag solubile. Exist studii care afirm faptul c LB au o mai mare
eficien n procesul de prezentare al antigenelor n comparaie cu macrofagele.
LB naive dar mature (nc nu au avut contact cu antigenul, dar au fost maturate n mduva
osoas hematogen) sunt stimulate de antigen. Ag este captat prin intermediul BCR (receptor
pentru antigen de pe LB). LB capteaz antigenul, l proceseaz, prezint apoi epitopii n complex
cu molecule MHC II spre LTh CD4+. Acesta din urm trimite semnale ctre alte LB prin citokine i
molecule de suprafa iar LB ncep s prolifereze, se transform n limfoblaste B, apoi n
plasmocite care vor secreta anticorpi.
citotoxicitate, citostatism,
prin citotoxicitate mediat celular, dependent de anticorpi (ADCC) (n acest caz, anticorpii
se fixeaz cu captul Fab pe epitopii celulei int i cu fragmentul Fc de macrofag).
Macrofagul produce substane litice cu care perforeaz membrana celulei int (asemntor cu
aciunea ADCC a celulelor NK).
Macrofagele secret un numr foarte mare de substane:
factori de coagulare,
faptul c monocitele infectate streptococic se transform n celule dendritice secretoare de IL12 i nu n macrofage. Celule sanguine mononucleare periferice de la subieci sntoi au fost
infectate cu ase tulpini de streptococi orali. S-a observat c monocitele stimulate de aceste
antigene exprim fenotipul i funcia celulelor dendritice (8).
Mai multe studii au artat c M. leprae activeaz puine macrofage i celule dendritice. S-a
demonstrat c la nivelul monocitelor naive M. leprae induce niveluri crescute de citokine ce
inhib monocitele. M. leprae este implicat att ntr-o stimulare ct i ntr-o inhibare a
monocitelor (9).
complexele Ag-Ac,
161
162
4.
Bibliografie
1. Bird L, 2008, Allergy and Asthma: Calling all TH2 cells, Nature Rev. Immunol., 8, 162
2. Bettelli E, Korn T, Oukka M, Kuchroo VK, 2008, Induction and effector functions of TH17
cells, Nature, 453, 1051-1057
3. Dong C, 2008, TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and
genetic programming, Nature Rev. Immunol., 8, 337-348
4. Trapani JA, Smyth MJ, 2002, Functional significance of the perforin/granzyme cell death
pathway, Nature Rev. Immunol., 2, 735747
5. Bell E, 2007, Turning B cells into T cells, Nature Rev. Immunol., 7, 838-839
6. Welin A, Winberg ME, Abdalla H et al., 2008, Incorporation of Mycobacterium
tuberculosisLipoarabinomannan into Macrophage Membrane Rafts Is a Prerequisite for the
Phagosomal Maturation Block, Infection Immunity, 76, 2882-2887
7. Carbonetti NH, Artamonova GV, Rooijen N, Ayala V, 2007, Pertussis Toxin Targets Airway
Macrophages To Promote Bordetella pertussis Infection of the Respiratory Tract, Infection
Immunity, 75, 1713-1720
8. Hahn CL, Schenkein HA, Tew JG, 2005, Endocarditis-Associated Oral Streptococci Promote
Rapid Differentiation of Monocytes into Mature Dendritic Cells, Infection Immunity, 73, 50155021
9. Sinsimer D, Fallows D, Peixoto B et al., 2010, Mycobacterium leprae Actively Modulates
the Cytokine Response in Nave Human Monocytes, Infection Immunity, 78, 293-300
10. Sawant KV, McMurray DN, 2007, Guinea Pig Neutrophils Infected with Mycobacterium
tuberculosis Produce Cytokines Which Activate Alveolar Macrophages in Noncontact Cultures,
Infection Immunity, 75, 1870-1877
11. Padigel U, Lee J, Nolan T et al.,2006, Eosinophils Can Function as Antigen-Presenting Cells To
Induce Primary and Secondary Immune Responses to Strongyloides stercoralis, Infection
Immunity, 74, 3232-3238
12. MacGlashan D, 2008, New roles for basophils, Immunol. Cell Biol., 86, 637-638
13. Sokol CL, Barton GM, Farr AG, Medzhitov R., 2008, A mechanism for the initiation of
allergen-induced T helper type 2 responses, Nat. Immunol., 9, 310-318
Sistemul HLA. n 1958 se pune n eviden, n serul unui pacient cu aplazie medular i
politransfuzat, un alloanticorp care aglutineaz leucocitele altor subieci. Aceasta st la originea
descoperirii sistemului allotipic HLA (human leucocyte locus A), evideniat la nivelul leucocitelor,
apoi la majoritatea celulelor. Exist o mprire a sistemului HLA pe mai multe gene HLA-A, HLAB, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP i HLA-DQ. Studiul supravieuirii grefelor cutanate, ntre donor i
receptor HLA identic sau diferit a dovedit c sistemul HLA corespunde genetic i funcional cu
MHC uman.
lanul greu a (44 kDa) este o protein transmembranar cu polimorfism alelic, codat de o
gen a sistemului HLA; cuprinde 3 domenii extracelulare, o poriune transmembranar i o
parte intracitoplasmatic scurt;
lanul greu a (33-34 kDa) cuprinde dou domenii externe a1 i a2, o poriune
transmembranar i o terminaie carboxilic scurt intracitoplasmatic;
lanul uor (28 kDa) are o structur asemntoare, cu dou domenii externe 1 i 2.
Moleculele clasei a II-a au o distribuie mult mai restrns n comparaie cu moleculele clasei I.
Ele sunt exprimate pe celulele prezentatoare de antigen (APC):
celule dendritice (celule Langerhans din piele, celule interdigitate ganglionare i din timus,
celule dendritice din epiteliul cilor respiratorii),
monocite / macrofage i
limfocite B.
Limfocitele T nu exprim astfel de molecule dect dup activare.
166
12. 3. Roluri
Limfocitele T protejeaz organismul uman de 2 mari categorii de ageni patogeni: virusurile,
care preiau comanda celulei pe care o infecteaz (devenind astfel antigene endogene) i
bacteriile care se replic autonom, majoritatea extracelular.
Cele 2 clase ale MHC sunt eseniale n recunoaterea i rspunsul imun fa de peptide derivate
din agresori. n lupta dintr-o infecie viral, virusul este eliminat de ctre LT CD8+ care
recunoate peptide virale endogene ataate de MHC-I. n schimb, o bacterie e eliminat prin
fagocitare de ctre macrofage sau neutrofile.
LT CD4+ recunoate peptidele bacteriene legate de MHC-II i direcioneaz rspunsul imun
ctre activarea macrofagelor i producia de anticorpi care opsonizeaz bacteria.
Moleculele de histocompatibilitate au aadar un rol fundamental n prezentarea peptidului
antigenic ctre:
HLA
peptidul antigenic
TCR.
Rolul moleculelor HLA clasa I
Au rol n principal n reacia imun care implic intervenia LTc. Moleculele HLA I prezint un
peptid endogen sintetizat de o celul contaminat de o bacterie/un virus/un parazit cu
dezvoltare intracelular sau un peptid endogen rezultat din degradarea unor celule self
tumorale sau mbtrnite ctre receptorul de antigen (TCR) al limfocitului T CD8+. Se va obine
astfel un rspuns imun celular prin activarea i multiplicarea LTc avnd ca rezultat liza celulelor
int ce au prezentat antigenul prin HLA-I. (Figura nr. 4)
Rolul moleculelor HLA clasa a II-a
167
Ele intervin n principal n rspunsul imun n care sunt implicate APC i LTh. Moleculele HLA II
prezint limfocitului Th CD4+ peptide de origine exogen, provenite din proteinele endocitate i
degradate de APC. (Figura nr. 5)
Etape:
a) Legarea antigenului exogen de molecula HLA clasa II:
1. Endocitoza - particulele antigenice (bacterii, proteine strine) sunt internalizate nespecific de
monocite / macrofage sau specific de limfocitele B prin IgM. Ele urmeaz calea endocitozei;
2. Generarea peptidelor antigenice - prin fuzionarea endozomilor cu lizozomii, proteinele sunt
degradate n peptide prin activarea proteazelor lizozomale la un pH acid;
3. Asocierea cu HLA II - moleculele HLA clasa II-a sintetizate n reticulul endoplasmic sunt
asociate, sub forma unui complex, cu o protein accesorie, lanul invariabil II. Aceasta mpiedic
legarea peptidelor endogene de HLA-II prin blocarea situsului de legare n timpul sintezei sale i
permite legarea peptidelor exogene prin distrugerea lanului dup terminarea sintezei;
4. Trecerea prin membrana celular - ansamblul HLA-II-peptid exogen este exprimat la suprafaa
APC. (Figura nr. 6)
b) Interaciunea ntre APC i limfocitul T helper:
Peptidele antigenice sunt recunoscute de ctre LTh prin TCR numai dac sunt prezentate de
ctre APC pe MHC-II.
Pe de alta parte, limfocitul helper CD4+, prin TCR-ul su nu poate interaciona cu o APC dect
dac recunoate antigenele cuplate cu moleculele MHC ale individului (restricie allogenic).
Molecula accesorie CD4 a limfocitului helper interacioneaz cu domeniul 2constant al HLA-II
declannd astfel primul semnal ctre limfocit pentru activarea sa. n urma unor reacii n
cascad LT va intra n mitoz, va secreta o serie de citokine i va colabora cu LB spre producia
de anticorpi avnd ca scop eliminarea antigenelor exogene. Specificitatea reaciei este datorat
asocierii trimoleculare TCR, HLA, peptid antigenic.
O parte din moleculele codificate de regiunea HLA-II sunt implicate n procesarea i ncrcarea
peptidelor pe HLA-I. Astfel, PSMB8 i PSMB9 sunt subuniti ale proteozomului iar TAP1 i TAP2
transport peptidele endogene din citoplasm n RE. BTNL2 este implicat n susceptibilitatea la
sarcoidoz
Moleculele HLA-III sunt mprite n dou categorii n funcie de rol:
a.) cu rol n imunitate i inflamaie: componentele complementului C2 i C4, TNF, HSP (proteina
de oc termic);
b.) cu rol enzimatic: CYP21
168
n diferite studii, s-a analizat importana compatibilitii HLA n transplantul de inim, rinichi,
celule stem hematopoietice.
Polimorfismul sistemului HLA este foarte mare i de aceea probabilitatea ca organele donoare
s fie potrivite primitorului este foarte mic. n transplanturi a existat practica de a se aloca
organe fr a se lua n considerare compatibilitatea HLA donor-receptor. De aceea, n trecut, nu
a fost posibil analizarea corespunztoare a ratei de succes a transplantului cu organe
compatibile HLA. ntr-un studiu realizat pe 8.331 de pacieni, internai n 104 centre din 24 state
din USA, doar 128 subieci au primit cte o gref cardiac compatibil HLA (A, B sau DR) sau
doar cu o singur incompatibilitate. S-a observat supravieuirea esutului pe o durat de 3 ani,
iar rezultatele au fost dependente de sistemul HLA. Astfel, au avut succes: la compatibilitate
maxim 834% transplanturi fa de 76 2% transplanturi la 2 nepotriviri. Aadar,
supravieuirea grefei n transplantul de cord este semnificativ influenat de compatibilitatea
HLA.
Exist dou tipuri de incompatibilitate: a antigenelor (detectabil serologic) i a alelelor
(detectabil prin metode de analizare a ADN-ului). ntr-un studiu s-a testat ipoteza conform
creia incompatibilitatea alelelor este mai puin imunogen dect incompatibilitatea
antigenelor i, astfel, este mai puin asociat cu rejecia de transplant cu celule stem
hematopoietice. Peste 450 de pacieni cu leucemie mieloid cronic au primit transplant de
mduv de la donori diferii. Prin secvenierea ADN, s-au analizat alelele clasei I HLA (A, B, C) i
s-au observat ratele de respingere a grefei la transplanturile fr nici o incompatibilitate, la cele
cu o singur incompatibilitate a alelelor sau a antigenelor sau la transplanturile cu 2 sau mai
multe nepotriviri. Rezultatele au confirmat ipoteza i, astfel, riscul rejeciei de transplant a fost
semnificativ mai mare la cei cu o incompatibilitate antigenic HLA, fa de cei cu o
incompatibilitate alelic. Riscul a fost de asemenea crescut la cei cu mai multe nepotriviri HLA i
la primitorii homozigoi HLA n locusul de incompatibilitate. n concluzie, transplanturile de la
donori cu o singur incompatibilitate a alelelor HLA au un risc sczut de rejecie i pot fi
realizate cu succes. n schimb, incompatibilitatea de antigene HLA, detectabil serologic, crete
riscul de respingere a esutului.
12.4.2. Asocierea subtipurilor HLA cu susceptibilitatea la boli
Studii epidemiologice au demonstrat c peste 40 de boli se ntlnesc mai frecvent la indivizi
purttori ai anumitor alele HLA I sau II dect la populaia general. Importana acestor efecte
este extrem de mare, dei nu vor fi probabil niciodat demonstrate ca absolute. De exemplu,
ntre 90% i 95% din pacienii caucazieni cu spondilit ankilozant posed HLA-B27 (1), iar 30%50% din pacienii caucazieni cu diabet zaharat tip I sunt HLA-DQ2/DQ8 heterozigoi. Interesant
este faptul c HLA-DQ6 pare a fi responsabil de protecia mpotriva diabetului zaharat de tip I.
Majoritatea bolilor care au legtur cu anumite gene HLA au un caracter autoimun. Baza
molecular a acestei legturi este necunoscut din cauza lipsei identificrii autoantigenului
primar care reprezint trigger-ul. (2) Cu toate c mecanismele prin care genotipurile HLA
controleaz susceptibilitatea la aceste boli sunt nc incomplet definite, se crede c participarea
moleculelor MHC n stabilirea toleranei imunologice i n recunoaterea antigenelor st la baza
acestor fenomene.
Alelele HLA ce ofer protecie pot media eliminarea n timus a LT potenial patogene
responsabile de autoimunitate, n timp ce alelele HLA susceptibile pot eua n eliminarea LT
patogene.
169
Pe de alt parte, genotipurile HLA pot guverna receptivitatea la anumite vaccinuri. Spre
exemplu, subiecii care au alela HLA-DR3 sunt, ntr-o proporie crescut substanial, nereceptivi
la vaccinarea cu antigenul de suprafa al hepatitei B. Totodata, indivizii cu HLA-DRB1*03 sau
HLA-DQA1*0201 au o inciden crescut de seronegativitate la vaccinarea mpotriva pojarului.
(3)
Un studiu realizat de curnd pe ceteni americani caucazieni certific faptul c homozigoii
HLA-DR13-DQ6 prezint risc crescut de asociere a distoniei cervicale. (4)
O alt boal cu caracter autoimun i conexiuni certe cu sistemul HLA este scleroza multipl. (56)
12.4.3. Prezentarea de antigene independent de MHC
Recent s-a fundamentat ideea conform creia exist o clas nou de LT care recunosc antigene
prezentate de molecule ce nu sunt MHC-I sau MHC-II. Una dintre aceste clase de LT folosete un
receptor pentru antigen ce recunoate antigene lipidice prezentate pe molecule CD1. CD1 sunt
asemntoare structural cu MHC-I, ns lanurile CD1 formeaz un situs ce poate acomoda
componente glicolipidice ale patogenilor microbieni. Astfel, complexele CD1-glicolipide servesc
drept int pentru recunoaterea de ctre LT ce au un tip special de receptor: TCR. Aceast
prezentare a glicolipidelor microbiene pe molecule CD1 pare s fie responsabil de
recunoaterea independent de MHC a mycobacteriilor. (3)
E. imunogenicitatea.
2. Moleculele MHC-II se afl pe:
A. majoritatea celulelor din organism
B. numai pe celulele nucleate
C. numai pe macrofage
D. toate APC
E. limfocite
3. Colaborare intercelular exist ntre:
A. HLA-II i LTc
B. HLA-I i LTc
C. APC i HLA-I
D. HLA-I i LTh
E. HLA-I i HLA-II
4. Moleculele HLA-II prezint ctre limfocite n situsul lor:
A. imunoglobuline
B. sfingolipide
C. peptide exogene
D. TCR
E. peptide endogene
Bibliografie
1. Reveille JD., 2009, Recent studies on the genetic basis of ankylosing spondylitis, Current
Rheumatology Reports., 11(5), 340-8
2. Caillat-ZuchmanS., 2009, Molecular mechanisms of HLA association with autoimmune
disease, Tissue Antigens, 73 (1), 1-8
3. David D Chaplin, 2010, Overview of the immune response, Journal of Allergy and Clinical
Immunology, 125 (2 Suppl 2), S3-23
4. Deitiker PR, Oshima M., Jankovic J., Duane DD., Aoki KR., Atassi MZ., 2010, Association of HLA
Clas II alleles and haplotypes with cervical dystonia: HLA DR13-DQ6 (DQB1*0604) homozygotes
are at greatley increased risk of cervical dystonia in Caucasian Americans, Autoimmunity, Epub
ahead of print
5. Romero-Pinel L., Pujal JM, Martinez-Yelamos S., Gubieras L, Matas E., Bau L., Torrabadella M.,
Azqueta C., Arbizu T., 2010, HLA-DRB1: genetic susceptibility and disability progression in a
Spanish multiple sclerosis population, European Journal of Neurology, Epub ahead of print
6. Link J., Lorentzen AR., Kockum I., Duvefelt K., Lie BA., Celius EG., Harbo HF., Hillert J., Brynedal
B., 2010, Two HLA class I genes independently associated with multiple sclerosis, Journal of
Neuroimmunology, Epub ahead of print
prezena factorilor stimulatori, citokine, secretate de una din cele dou celule aflate n
contact sau, uneori, de o celul aflat la distan (indirect).
Rezultatul va fi activarea sau inhibarea funciei celulare, ca urmare a transportului informaiei
prin mesagerii secunzi spre organitele intracitoplasmatice, membrana celular sau genele
nucleare.
13. 1. Moleculele de adeziune
Contactul ntre dou celule nu se face spontan. Rolul moleculelor de adeziune este complex i
nu se limiteaz la procesele imunologice.
Legturile intercelulare asigurate de liganzi sunt reacii chimice clasice specifice, saturabile i
reversibile.
Clasificarea moleculelor de adeziune se poate face n dou moduri, structural i funcional.
L-selectinele sunt exprimate constitutiv pe suprafaa leucocitelor, n timp ce expresia Eselectinelor pe endoteliu este indus de ctre TNF-a, IL-1 i lipopolizaharidele bacteriene iar a Pselectinelor de ctre C5b, histamin i trombin.
L-selectinele joac un rol important pentru LT imature i APC (celule dendritice) care sunt
astfel direcionate ctre situsuri cu rol imunologic important, precum nodulii limfatici sau GALT.
P-caderine (placentare),
molecula CD4
Aceast molecul este exprimat pe suprafaa a 2/3 din LT mature circulante, definind subsetul
de LT CD4+. Molecula CD4 este prezent i pe suprafaa celulelor dendritice cutanate i pe
173
molecula CD8
Aceast molecul este exprimat pe suprafaa a 1/3 din LT mature circulante. Definete
subsetul de LT cu activitate citotoxic i unele celule NK (n proporie mai mic) (Figura nr. 2).
Molecula CD8 este homodimeric (CD8a/CD8a) sau heterodimeric (CD8a/CD8b). Rolul su
primordial este s asigure interaciunea cu o parte monomorf a moleculei HLA I, pentru
recunoaterea domeniului a3 al acestei molecule. Molecula CD8, ca i molecula CD4, este
asociat cu tirozinkinaza.
NB. Pentru mai multe informaii despre apoptoz, vezi capitolul Toleran Imunologic.
13. 1. 2. 2. Moleculele de adeziune necesare costimulrii ntre celulele prezentatoare de antigen
i limfocitele T
n permanen, ntre APC i LT se stabilesc cupluri de adeziune intercelular. Este nevoie de
prezena APC dar i de o colaborare bidirecional (crosstalk) ntre APC i LT (trebuie s
existe o dubl activare a celor dou tipuri de celule, n sens anterograd i retrograd), ntruct n
lipsa acestora, limfocitul T nu este capabil s capteze i cu att mai mult, s prelucreze Ag native
T-dependente (Figura nr. 3). Cuplurile de adeziune stabilesc un efect de fermoar ntre
membrana APC i LT, legtura avnd loc nainte ca TCR s vin n contact cu epitopul (cuplul se
formeaz chiar dac APC prezint un epitop pentru care LT nu are receptori specifici).
Se descriu trei cupluri:
Cuplul B7-CD28
Molecula CD28, care recunoate receptorul B7, este prezent pe toate LT, cu excepia LT
supresoare i permite costimularea ntre APC i LT.
174
2). n cazul n care APC este puin activat, va exprima pe membrana sa puine molecule B7.
Acest fapt va oferi un avantaj de legare moleculelor cu afinitate mai mare, aa nct majoritatea
moleculelor legate vor fi de tip CTLA-4 (CD80), iar semnalul transmis va fi inhibitor (Figura nr. 5).
Raportul semnalului activator/inhibitor transmis de aceste cupluri moleculare este modulat de
factorii de mediu i decide comportamentul ulterior al LT (vezi capitolul Toleran
Imunologic pentru mai multe detalii).
Cuplul CD40 i CD40L
Molecula CD40L (L pentru ligand) nu se exprim dect pe LT activate CD4+ sau CD8+ i nu
pe cele n repaus. Este de asemenea prezent pe bazofile i mastocite. Sindromul hiper-IgM, Xlinkat se caracterizeaz prin absena moleculei CD40L funcionale.
Molecula LFA2 (CD2) permite formarea rozetelor E (E pentru eritrocite) ntre LT umane i
eritrocitele de oaie. Fenomenul se datoreaz prezenei LFA3 pe eritrocitele de oaie.
Molecula LFA3 (CD58) are o distribuie larg, care cuprinde celulele endoteliale vasculare,
fibroblatii, limfocitele i macrofagele.
Cuplul LFA1 i ICAM 1, 2 i 3
Molecula LFA1 corespunde integrinei aL/2 (CD11a/CD18). Prezena sa este relativ difuz la
nivelul diferitelor leucocite (neutrofile, monocite, LT, LB i LT de memorie).
ICAM1 (CD54), ICAM2 i ICAM3 sunt puternic exprimate la nivelul LT citotoxice i permit
activarea lor. ICAM1 se gsete pe neutrofile n repaus, celule endoteliale, monocito/macrofage
i LB activate.
Aceste dou cupluri de adeziune permit recunoaterea i interaciunea ntre LT CD4+ i APC sau
ntre LT CD8+ i celula int, proces completat de specificitatea TCR. Conexiunea constituit
ntre LT CD4+ i APC a fost numit sinaps imunologic, subliniind transferul informaional
implicat n recunoaterea epitopului exprimat pe moleculele MHC II de ctre TCR (Figura nr. 6).
175
Citokinele sunt substane proteice, solubile, cu greutate molecular mic, 8-70 kDa. cel mai
frecvent sunt sintetizate de ctre celule dup activare prealabil, acionnd ca mediatori asupra
altor celule sau asupra lor nsi, n cantiti foarte mici, de ordinul pico sau nanogramelor. n
momentul de fa au fost identificate peste 100 de molecule diferite de citokine. O parte dintre
citokine au n special efecte chemotactice i din acest motiv au fost numite chemokine.
Termenii de limfokine (substane sintetizate de limfocite) sau de monokine (provenind din
monocite) nu se mai folosesc deoarece citokinele sunt sintetizate de o gam mult mai larg de
celule. Termenul de interleukine, care indic o aciune ntre dou leucocite, a persistat i
continu s persiste n denumirea prescurtat, de la IL-1 la IL-35.
Termenul de citokine pare s fie cel mai adecvat. n unele cazuri, denumirea provine de la una
din activitile care au permis descoperirea citokinei: TNF (tumor necrosis factor), IFN
(interferon), GM-CSF (granulocyte/monocyte-colony stimulating factor), G-CSF (granulocyteCSF), M-CSF (monocyte-CSF), TGF (transforming growth factor). n afara sistemului imun i
hematopoietic au fost descoperii i ali factori de cretere: NGF (nerve growth factor), FGF
(fibroblast growth factor), EGF (epithelial growth factor) etc.
Citokinele acioneaz datorit prezenei receptorilor specifici, desemnai prin denumirea lor
englez: IL-1R, IL-2R, TNF-R etc. Ei sunt prezeni uneori pe aceeai celul care a sintetizat
citokina (efect autocrin) sau pe alte celule (efect exocrin). O clasificare atotcuprinztoare a
citokinelor este foarte dificil, din punct de vedere funcional, pentru motivele prezentate (i
care reprezint un punct din cutia Pandorei la care se face uneori referire, atunci cnd sunt
luate n discuie aceste structuri). Din punct de vedere didactic (i funcional), vom ncerca s
prezentm n continuare o grupare a celor mai cunoscute dintre citokine.
TNF- i TNF-
TNF- este produs de monocite / macrofage dar i de diverse alte celule (limfocite T, limfocite B,
celule NK, fibroblaste, mastocite, bazofile, celule gliale etc), ca reacie la contactul cu diferite
bacterii sau lipopolizaharidele din peretele germenilor Gram-negativi. Sursa cea mai important
pentru TNF- rmne ns sistemul monocito-macrofagic. TNF- favorizeaz expresia
moleculelor de adeziune la nivelul endoteliului vascular i al monocitelor; atrage ctre sediul
procesului infecios alte monocite i leucocitele PMN. Are o activitate anti-viral, anti-parazitar
i anti-tumoral. Stimuleaz lipoliza, glicoliza muscular i reabsorbia osoas prin care poate
antrena apariia caexiei (TNF a fost numit iniial caexin). Induce formarea altor mediatori ai
inflamaiei (leucotriene, PAF). Formarea sa este la rndul su indus de IFN, IL-1, factori de
cretere sintetizai de monocit, endotoxinele bacteriilor Gram-negative, diferite virusuri,
bacterii, unele componente ale sistemului complement, leucotriene i prostaglandine.
Eliberarea TNF- este inhibat de glucocorticoizi, 2-macroglobuline, 2-antitripsin etc. TNF-
176
este sintetizat de LT activate i celule NK i are aciuni identice cu TNF-, acionnd pe acelai
tip de receptori. n momentul de fa este clasificat ntre limfotoxine (LT-).
IL-1 i IL-6
Sunt dou citokine cu rol asemntor. Sunt produse de numeroase celule: monocite,
macrofage, LT, LB, celule endoteliale vasculare, keratinocite (din piele), astrocite i celule gliale
(din creier) etc.
IL-1 se gsete sub dou forme: IL-1a fixat la membran i IL-1 secretat. Experimental a fost
demonstrat c stimularea cu orice structur microbian a celulelor care n mod potenial
sintetizeaz IL-1 va duce la sinteza acestor molecule (IL-1a i IL-1). Ele sunt codificate de gene
diferite dar recunosc aceeai receptori: primul receptor IL-1R1 induce transducia informaiei la
nivel celular, n timp ce IL-1R2 nu induce un semnal celular. IL-1 are funcie imunologic,
activnd la nivel superior LTh, care se vor divide mitotic i se vor diferenia n diverse clase. IL1, eliberat n spaiul extracelular i n snge, exercit o puternic aciune proinflamatorie.
Celulele care sintetizeaz IL-1 produc cteva ore mai trziu un antagonist al receptorului de IL-1,
numit IL-1Ra, care face ca aciunea IL-1 s fie tranzitorie. IL-1 induce creterea expresiei
moleculelor de adeziune; activeaz limfocitele T i B; crete sinteza proteinelor de faz acut la
nivel hepatic; crete catabolismul celulelor musculare i al osteoclastelor (rezorbie osoas);
activeaz sistemul nervos central cu febr, anorexie i insomnie. Fiind i prima interleukin
numit ca atare, IL-1 a fost considerat iniial drept o molecul piretogen. Inocularea de IL-1 la
subieci umani conduce la apariia febrei i frisonului. Concentraia de IL-1 din plasm poate s
creasc i n condiii fiziologice (ex. n stres nepatologic, exces de vitamin A, n timpul
menstruaiei).
IL-6 are o aciune att asupra sistemului imun ct i asupra unor celule care nu aparin acestuia,
asemntoare cu aceea a Il-1, cu o singur diferen: ea acioneaz mai ales pe maturaia
terminal a LB n plasmocite i pe diferenierea LT citotoxice. Ca i IL-1, produce proteoliz
endogen, induce sinteza proteinelor inflamatorii la nivel hepatic (fibrinogen, haptoglobin, 1antitripsin, protein C reactiv etc) i activeaz sistemul nervos central conducnd la apariia
febrei, anorexiei, somnolenei etc. IL-6 induce sinteza de imunoglobuline; are i rol n maturarea
celulelor pe linia megakariocitar. Sinteza IL-6 este stimulat de IL-1.
Limfotoxinele
Limfotoxina (LTx) a fost identificat n urma efectului citotoxic exercitat de limfocitele activate,
ulterior a fost sintetizat i caracterizat, dar s-a dovedit c nu exist un singur factor de acest
tip, ci o serie de substane care ar putea fi grupate ntr-o superfamilie. Iniial LT-, o
limfotoxin solubil, a fost definit drept factor de necroz tumoral (TNF-). Dintre numeroii
membri ai superfamiliei limfotoxinelor menionm LT- i LT-, sintetizate n special de LT i LB
activate, dar i de ctre celulele NK sau celule LAK (lymphokine activated killer cells). Au rol n
etapele de iniiere a inflamaiei i se pare c au un rol n realizarea unei protecii fa de
agresiunea microbian.
IFN-g
Dintre efectele pro-inflamatorii ale IFN- amintim activarea macrofagelor (acest interferon este
probabil cea mai important substan care produce trecerea macrofagelor de la o stare n
ateptare la starea activ, bactericid) i astfel intervine n fazele iniiale ale inflamaiei dar i n
177
IL-10
Acioneaz att asupra celulelor hematopoietice ct i asupra altor celule. Dac iniial s-a
considerat c are efecte pro-inflamatorii, n momentul de fa se cunoate faptul c, prin
efectele inhibitorii asupra monocitelor, neutrofilelor, celulelor dendritice, este de fapt o
interleukin cu efect anti-inflamator. A fost numit i factor de inhibare al macrofagelor.
IL-11
Sinteza IL-11 poate avea loc la nivelul fibroblastelor, condrocitelor, sinoviocitelor,
keratinocitelor, celulelor endoteliale, celulelor epiteliale etc. Administrarea de IL-11 stimuleaz
sinteza unor reactani de faz acut, la fel ca i IL-6. Totui, efectul esenial al IL-11 se adreseaz
creterii trombocitare. Are i efecte anti-inflamatorii la nivelul adipocitelor i osteoclastelor.
Relativ recent, a fost avizat utilizarea IL-11 n tratamentul asociat chimioterapiei din cancer,
pentru a preveni apariia unei trombocitopenii severe la pacienii care primesc medicaie
citotoxic, anti-tumoral.
IL-12
Cunoscut drept o substan care induce sinteza de IFN-, IL-12 are i alte efecte de stimulare a
rspunsului inflamator al gazdei, n urma unui proces infecios. Sursa cea mai important de IL12 este reprezentat de celulele dendritice.
IL-16
Iniial a fost considerat o chemokin pentru LT Helper (CD4 +), dar poate exercita astfel de
activiti i fa de alte celule implicate n procesul infecios i n inflamaie. Sursa principal de
IL-16 este reprezentat de LT CD8+.
IL-17 (A, B, C, F)
Au efecte proinflamatorii i de stimulare a hematopoiezei.
IL-18
A fost considerat drept o molecul care induce sinteza de IFN-. Ulterior s-a dovedit c singur,
nu duce la o stimulare eficient, dar n asociere cu IL-12, efectul de stimulare al sintezei de IFN-
demonstreaz sinergism. IL-18 este sintetizat n special de macrofagele activate i de ctre
celulele dendritice, dar exist i alte celule productoare de IL-18 (monocite, keratinocite, celule
epiteliale intestinale etc). Are efecte pro-inflamatorii, efecte n procesul infecios declanat de o
serie de bacterii (ex. Listeria spp.), parazii (ex. Cryptococcus neoformans) sau virusuri (ex.
virusul gripal), efecte anti-tumorale i intervine n patogenia unor boli n care exist inflamaie
cronic sau n boli autoimune.
IL-22
Este o citokin nrudit cu IL-10, dar cu puternice proprieti pro-inflamatorii. ntr-un studiu pe
celule pulmonare, s-a demonstrat un rspuns semnificativ IL-22 mARN la 6 ore de la debutul
infeciei cu Klebsiella pneumoniae. Rspunsul indus n celule cultivate n prezena aceastei
178
citokine, este de exprimare a moleculelor defensive n celulele epiteliale traheale. Unul din
efectele induse de aceast citokin este exprimarea moleculei lipocalin-2, cu rol n sechestrarea
fierului. ntr-un model de infecie colonic s-a demonstrat c lipsa IL-22 duce la instabiltatea
barierei epiteliale i diseminare bacterian.
IL-23
Are efecte asemntoare cu IL-12, exercitate n combinaie cu IL-12. Este sintetizat mai ales de
celulele dendritice.
IL-2, cu efect autocrin i paracrin, a fost prima interleukin utilizat n terapia cancerului
(administrarea pe cale intravenoas a fost asociat, din nefericire, cu efecte toxice severe;
datorit acestor efecte, dar i descoperirii unor efecte similare prin administrarea altor
molecule n alte situaii clinice, n momentul de fa a intrat ntre noiunile medicale clasice i
definirea sindromului de toxicitate al citokinelor). Mai recent, se ncearc administrarea IL-2 la
pacienii cu infecie HIV / SIDA, n sperana c efectele proliferative asupra LT CD4+ vor
mbunti istoria natural a bolii. O analiz recent a datelor din dou mari studii clinice a
artat un efect neutru al terapiei. (1)
Prin potenarea activitii citotoxice a LT i a celulelor LAK, IL-12 ar putea avea utilitate
clinic n inhibarea procesului infecios determinat de virusuri dar i n diferite forme de
neoplazii.
IL-18 are sau induce efecte mpotriva virusului Epstein-Barr, virusului gripal, virusului
herpes simplex etc dar are i efecte anti-tumorale.
179
IL-2 este produs n special de LT CD4+ de tip Th0 i Th1 (cu rol n RIP de tip celular)
activate i ntr-o mai mic msur de celulele NK i de celulele dendritice. i LT Th2 (cu rol n RIP
de tip umoral) pot sintetiza IL-2. IL-2 acioneaz asupra diferitelor celule cu rol n imunitate
[asupra limfocitelor T acioneaz printr-un mecanism autocrin, antrennd proliferarea i
activarea spre subsetul Th1 dar i Th2; transform celulele Nk n celule LAK (lymphokine
activated killer cells); antreneaz proliferarea limfocitelor B]. Acioneaz sinergic cu IL-12 i IFN stimulnd activitatea citotoxic a celulelor NK. IL-2 a fost prima dintre interleukine care a fost
caracterizat pn la nivel structural. Este o interleukin cu 133 aminoacizi, o greutate
molecular de 15,5 kDa; gena care codific sinteza de IL-2 se gsete pe cromozomul 4.
IFN-g este produs de limfocitele Th1; sursa esenial pentru aceast interleukin este
reprezentat de celulele NK. Rolul principal al IFN-g este activarea macrofagelor, cu producerea
speciilor reactive ale oxigenului i NO, cu efect bactericid asupra microorganismelor
intracelulare. Prin aciunea sa anti-Th2, reduce rspunsul imun umoral. IFN- controleaz funcii
imune implicate n aprarea antibacterian, antiviral i antiparazitar.
IL-4 acioneaz n etapa iniial a rspunsului imun umoral, permind trecerea LB din
stadiul G0 la stadiul G1. Stimuleaz producerea i maturarea intramedular a LB. Aciunea sa
este ntrit de IL-1. De asemenea, stimuleaz producerea de IgG, specific RIU secundar i
blocheaz producerea de IgM, specific RIU primar. Mecanismul are loc la nivel de genom i se
numete izotipic switch (comutare izotipic) (Figura nr. 8). Citokina este totodat un factor de
cretere pentru bazofile i mastocite. Are de asemenea rol n hematopoiez. Acioneaz sinergic
cu IL-3 n cursul diferenierii mastocitelor i limfocitelor. Dac exist o sintez crescut peste
normal a IL-4 de ctre LT Th2, se nregistreaz o cretere semnificativ a sintezei de IgE iar din
punct de vedere clinic apariia manifestrilor hipersensibiliti de tip umoral (tip I).
IL-5 stimuleaz RIU la nivelul mucoaselor. Intr n aciune mai trziu, alturi de IL-2,
permind multiplicarea LB. IL-5 are rol de factor de cretere pentru leucocitele
polimorfonucleare eozinofile dar are efecte stimulatoare i asupra bazofilelor. La fel ca i IL-4 i
IL-5, are rol hematopoietic. Stimuleaz sinteza de Ig A de ctre limfocitele B. Datorit efectelor
menionate, un tratament novator al afeciunilor datorate hipersensibilitii de tip I ar putea s
se adreseze tocmai IL-5 (medicamente anti- alergice care s aib drept int molecula IL-5).
Printre numeroasele sale activiti, IL-6 este o citokin proinflamatorie, cu aciune tardiv
n procesul de maturaie a imunoblastelor n plasmocite.
180
IL-10 induce diferenierea iniial a liniei de celule B. IL-10 inhib citokinele proinflamatorii
i sinteza de IFN-g, comportndu-se ca o citokin reglatorie negativ pe subsetul Th1. Are de
asemenea i rol stimulator, n cazul maturrii mastocitelor, n cazul aprrii antivirale i
antitumorale, precum i rol chemoatractant pentru limfocitele T (CD8+).
IL-13 este produs de LT Th2 activate (dar exist i clone de LT Th1, Th0 sau LT CD8+ care
pot sintetiza aceast molecul). IL-13 inhib sinteza citokinelor proinflamatorii i, ca i IL-4,
stimuleaz sinteza IgE.
13. 2. 5. Chemokine
Aceste molecule de adeziune cuprind aproximativ 50 de membri divizai n mai multe familii
(CC, CXC, XC, CX3C). Denumirea familiilor i moleculelor aferente a fost standardizat n raport
cu structura chimic, pe baza numrului i poziionrii gruprilor de cistein. Numele
receptorilor chemokinelor (citokine cu rol n chemotaxie) se stabilete pornind de la grupul de
litere prezentat, la care se adaug litera R i un numr, n timp ce liganzii conin litera L i un
numr. Ele prezint o activitate chemotactic fa de limfocite, monocite, eozinofile etc.
Neutrofilele, de exemplu, exprim receptori CXCR1 i CXCR2, n timp ce eozinofilele, bazofilele i
monocitele exprim receptori CCR1, CCR2, CCR3 i CCR5. Aceste structuri exist n permanen
pe suprafaa celulelor normale circulante i pot fi detectate prin metode de laborator.
Majoritatea liganzilor sunt molecule solubile, ce se secret n torentul circulator, n timp ce unii
liganzi (CX3CL1, CXCL16) conin o poriune transmembranar, permind ancorarea celulelor de
endoteliul vascular n condiii de flux fiziologic. Prin intermediul acestor receptori, celulele
menionate vor reaciona la stimulul primit de la celulele endoteliale sau de la alte celule
agresate de toxine bacteriene; un alt stimul este reprezentat de citokinele pro-inflamatorii (ex.
IL-1, TNF, IFN etc). Trebuie menionat c studiile arat tot mai des rolul chemokinele n procese
patologice, precum ateroscleroz, scleroza multipl etc.
13. 2. 6. Hematopoietine
Hematopoieza este controlat de ctre un sistem fiziologic autoreglabil, prin care se menine un
compartiment de celule stem i un compartiment de difereniere pentru toate liniile sanguine.
Sistemul necesit un echilibru ntre sinteza osoas i meninerea unui spaiu hematopoietic
medular graie echilibrului ntre osteoblaste i osteoclaste. n procesul de proliferare i
difereniere a celulelor stem intervin numeroase citokine:
SCF (stem cell factor) provine n principal din celulele stromale ale mduvei osoase. SCF
este produs att n form solubil ct i ntr-o form legat de membrana citoplasmatic.
1.
a.
b.
c.
d.
2.
a.
b.
c.
d.
3.
4.
5.
a.
b.
c.
d.
e.
Bibliografie
1. The INSIGHTESPRIT Study Group and SILCAAT Scientific Committee, Interleukin-2 Therapy in
Patients with HIV Infection. N Engl J Med., 2009, 361(16), 1548-1559
185
186
- pFc: cuprinde fragmentele peptidice rezultate dup aciunea pepsinei, cu ntregul domeniu
CH3 situat dup aminoacidul 333 al lanului greu;
- Fd: corespunde primei pri a lanului greu dup aciunea papainei, cu formarea fragmentului
Fab, i dup reacia de reducere-alchilare, pentru a extrage lanul uor;
- Fv: corespunde prilor variabile ale lanului greu i lanului uor (VH+VL).
Pentru Ig, noiunea de domeniu se regsete la lanurile grele n 4 exemplare (IgG, IgA, IgD) sau
5 exemplare (IgM, IgE) i la lanurile uoare n 2 exemplare. Terminologia utilizat este
urmtoarea:
Lanurile grele:
- VH - pentru fragmentul greu variabil (variable heavy), comun tuturor claselor i subclaselor cu
aceeai specificitate.
- CH 1, CH 2, CH 3 i CH 4, - pentru fragmentul greu constant (constant heavy), care conine
diferenele pentru fiecare clas i subclas; de exemplu pentru IgG1 exist fragmentele Cg11 ,
Cg12 i Cg13 i pentru IgM, fragmentele Cm1, Cm2, Cm3,Cm4.
Lanurile uoare:
- VL pentru fragmentul uor variabil (variable light), diferit pentru lanurile kappa i lambda: Vk
i Vl.
- CL pentru fragmentul uor constant (constant light), cu un singur lan Ck i patru Cl
funcionale.
Domeniile variabile VL i VH formeaz locul unde anticorpul se cupleaz cu determinantul
antigenic (epitop). Faa interioar a situsului anticorpului (situs combinativ) vine n contact
direct cu epitopul i se numete paratop. Faa exterioar a situsului combinativ se numete
idiotip.
lanuri Iga i 2 lanuri Ig. Ansamblul formeaz BCR (B cell receptor), comparabil cu TCR-ul
limfocitului T.
IgM seric (IgMs) cuprinde un lan greu cu un domeniu variabil VH, 4 domenii constante Cm1 Cm4 i un procent ridicat de hidrai de carbon (12 %). Molecula nsi este un pentamer cu un
prim inel al punii disulfurice la sfritul lui Cm3, un al doilea la terminarea lui Cm4 i un lan J
(joining chain). Masa molecular este foarte mare (circa 970.000 D), cu un coeficient de
sedimentare de 19 S. Concentraia seric este de 1,2 g / l. Reprezint circa 5-10% din totalul
imunoglobulinelor din ser. Are 10 situsuri combinative dintre care numai 5 sunt funcionale. IgM
are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-placentar.
Apare n RI primar.
IgA
IgA seric. Sub forma IgA1 (80%) i IgA2 (20%), ea se gsete ca monomer (GM 160.000, 7 S) sau
ca dimer sau trimer, ultimele dou forme cu lanul J de jonciune. IgA2 are o structur original.
Lanurile uoare unite ntre ele printr-o punte disulfuric nu sunt legate printr-o legtur
covalent cu lanurile grele. Concentraia sanguin a IgA este de 2,4 g / l. Nu are receptori
pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-placentar. Nu particip la
aglutinarea, precipitarea sau liza antigenelor corpusculare. Are activitate bactericid mai mare
dect IgG i dect IgM.
IgA exocrin sau secretorie cuprinde dou subclase IgA1 i IgA2. Masa molecular este de
400.000, cu coeficient de sedimentare de 11 S. Molecula cuprinde dou uniti de IgA reunite
printr-un lan J. Acest ansamblu este nconjurat de unitatea secretorie sintetizat de celulele
epiteliale ale tubului digestiv.
Au rol important n aprarea la nivelul mucoaselor (digestiv, respiratorie etc) i n reglarea
compoziiei florei microbiene de la suprafaa acestora. Este important ca nou-nscutul s
primeasc de la mam colostrul i apoi s fie alimentat pe cale natural pentru a primi IgA
(sinteza proprie ncepe dup circa 1 lun de la natere).
IgD
Are un nivel seric sczut iar rolul su nc nu este pe deplin cunoscut. IgD se afl, mai ales, la
suprafaa limfocitului B n asociere cu IgMm unde ar putea juca rolul de receptor activ de
difereniere celular i memorie. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate
traversa bariera hemato-placentar. Concentraia de IgD crete n ser de la natere i pn la
vrsta de 15 ani. Crete n serul femeilor nsrcinate.
IgE
Dei concentraia lor seric este infim (0,0001 g/l), fixarea pe bazofile i mastocite le confer
un rol important n inflamaie i hipersensibilitatea de tip imediat. posed, ca i IgM, un al
patrulea domeniu constant, care i confer o mas molecular de 190.000 D i un coeficient de
sedimentare 8S, superior IgG. IgE se fixeaz pe receptor prin intermediul domeniilorCe2 i
Ce3,ntr-o poziie aproape orizontal.
Lanurile uoare
Acestea sunt n proporie de 2/3 lanuri kappa i 1/3 lanuri lambda, excepie fcnd IgD la care
lanurile lambda sunt majoritare.
188
Termenul de clon a fost mprumutat din bacteriologie, unde toate microorganismele care
deriv dintr-o bacterie sunt identice ntre ele i cu prima bacterie. n imunologie, aceasta
desemneaz toate celulele derivate dintr-un limfocit (cu o specificitate imunologic).
Un rspuns imun obinuit corespunde unui rspuns policlonal cu imunoglobuline:
cu diferite afiniti.
Ansamblul sintezei determin o hipergamaglobulinemie difuz datorat heterogenitii Ig
prezente, corespunztoare numrului de clone limfocitare diferite, i se traduce prin molecule
cu ncrctur electric diferit.
14. 4. 2. Ig monoclonale au urmtoarele caracteristici:
afinitate unic.
Acest aspect poate rezulta din proliferarea benign (imunoglobulin monoclonal benign) sau
malign (mielom multiplu, boal Waldenstrom) a unui LB matur. Toate Ig secretate de clon au
o structur chimic identic, cu mobilitate electroforetic unic, astfel nct electroforetic
proteinele prezint un vrf cu baz ngust, iar imunoelectroforetic se caracterizeaz prin
apariia celei de-a doua curburi a arcului normal, avnd urmtoarele 3 caracteristici: linie
groas, curb foarte marcat, poziie mai apropiat de imunoserul revelator.
14. 6. Funcii
190
191
eozinofilele i plachetele au receptori de slab afinitate Fc e RII. Plachetele au i receptori
Fc g care le confer o activitate antiparazitar;
puncia pleural (att pentru a elimina aceast cauz de presiune mecanic asupra arborelui
cardiovascular ct i pentru punerea diagnosticului etiologic i stabilirea sensibilitii la
antibiotice a agentului sau agenilor etiologici). S-a recoltat i snge pentru hemoculturi, nainte
de administrarea altor medicamente antibiotice sau chimioterapice. Lichidul pleural era sub
presiune; s-au extras cu uurin peste 375 mililitri de lichid opac, tulbure. Produsele au fost
trimise imediat ctre laboratorul de bacteriologie. Frotiul colorat Gram a pus n eviden rare
PMN (2-5 / cmp) i rari coci Gram-pozitivi, aezai unul cte unul sau n diplo. Coloraia ZiehlNielsen nu a pus n eviden bacili acid-alcoolo rezisteni. Att culturile din lichidul pleural ct i
cele hemoculturi au rmas sterile. Prin reacii antigen-anticorp s-a ncercat punerea n eviden
a prezenei antigenelor capsulare n lichidul pleural (pneumococ, H. influenzae, meningococ),
dar reaciile au fost negative.
Dozarea imunoglobulinelor serice a artat valori mari pentru Ig G (1.400 mg/dL), o valoare de
160 mg/dL pentru IgM, n timp ce IgA a fost nedozabil (0 mg/dl). Fraciunea C3 a
complementului a fost dozabil, n cantitate mai mare dect valorile normale.
n condiiile obinerii acestor date clinice, paraclinice i de laborator, s-au administrat antibiotice
n asociere [iniial o combinaie ntre un glicopeptid i o cefalosporin de generaia a III-a
(pentru 2 sptmni), apoi o combinaie ntre vancomicin i amikacin (pentru nc 2
sptmni)], n afar de drenajul lichidului pleural (sub control clinic i paraclinic), administrare
de oxigen, administrare de lichide, electrolii i substane nutritive intravenos. Avndu-se n
vedere rezultatul dozrii imunoglobulinelor, s-au administrat i imunoglobuline intravenos. Lent,
evoluia din punct de vedere clinic a fost favorabil. Pe partea dreapt, radiologic s-a constatat
organizarea unui proces pahipleuritic. Copilul a fost spitalizat pentru o lun, iar nainte de
externare valorile bio-umorale au fost urmtoarele: VSH =12 mm/or, numr de leucocite=
6.500/ mm3 (fr neutrofilie), hemoglobin = 10.2/dL, hematocrit = 34%, IgA = 0 mg/dL.
Discuii
Cu excepia vrstei, au existat o serie de asemnri ntre cele dou cazuri. Ambii copii au avut n
antecedente episoade de IACRS i IACRI, mai multe / an, n fiecare an, fr diagnostic etiologic,
pentru care au primit tratament la domiciliu, de regul incluznd antibiotice sau chimioterapice.
Episodul infecios discutat, datorit evoluiei grave, a condus la recomandarea de internare i n
fiecare dintre cele dou cazuri internarea a fost realizat, succesiv, la dou nivele spitaliceti. n
ambele cazuri, la spitalul de nivel inferior, copii au primit tratament antibiotic nainte de
recoltarea produselor pentru punerea unui diagnostic etiologic. n aceste condiii nu a fost
posibil nici stabilirea sensibilitii microorganismelor implicate i tratamentul anti-infecios a
fost condus empiric, ceea ce ar fi putut reprezenta un important factor de risc, inclusiv
pierderea pacientului.
n primul caz nu s-a putut emite nici o ipotez privind etiologia (alta dect bacterian) iar n al
doilea caz, elementele observate la studierea frotiului din lichidul pleural au permis
suspicionarea unei pneumonii de etiologie pneumococic.
Tratamentele conduse n ambulatoriu, auto-tratamentele stabilite de prini (n baza amintirii
unor recomandri medicale anterioare), lipsa unei culturi medicale care s ridice suspiciunea
privind o cauz de baz care s explice un numr de infecii respiratorii, repetate, mai
numeroase dect n mod obinuit, ne fac s realizm motivele pentru care deficitul imun a fost
descoperit relativ tardiv (cu toate c n ambele cazuri a existat un deficit absolut n sinteza de
IgA, foarte probabil un deficit primar).
194
Pe de o parte, din aceste prezentri sesizm, foarte concret, importana bunei funcionri a
sistemului imun i una dintre situaiile care pot aprea n cazul existenei unor deficiene, iar pe
de alt parte este de subliniat c tratamentul bolilor infecioase ar trebui realizat numai dup
diagnosticul etiologic, cu testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice, singura variant
corect, care poate veni n sprijinul pacienilor pe care trebuie s i ngrijim.
Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ce nu au origine imun i prezint cel puin dou
situsuri identice de legare specific a unor structuri glucidice;
MBL este o protein din clasa colectinelor, avnd domenii lectinice prin care se ataaz
glucidelor i un domeniu colagen-like. MBL se gsete n cantitate mic n serul indivizilor
sntoi, ns n cazul infeciilor acute, concentraia acesteia crete semnificativ. S-a constatat
c persoanele care au deficit de MBL dezvolt n copilrie mult mai multe infecii dect copiii
normali, lucru ce atest importana aprrii organismului prin activarea complementului pe
calea lectinic la vrste la care sistemul imun nu s-a constituit n totalitate din punct de vedere
funcional.
Interaciunea acestora formeaz un complex asemntor celui format n primele subetape ale
cii clasice (C1qrs) i activeaz calea clasic fr a necesita prezena complexelor antigenanticorp.
Pe lng MBL, alte trei proteine pot, prin legarea lor de anumite structuri antigenice, s
declaneze activarea complementului pe calea lectinic. Aceste proteine sunt ficolina-1, ficolina2 i ficolina-3. Pot lega zaharuri sau compui acetilai prezeni pe suprafaa microorganismelor.
Dintre MBL i ficoline, cea mai abundent n plasm i cea care intervine cel mai adesea n
declanarea cii lectinice, este ficolina-3, numit i antigenul Hakata sau -2 macroglicoproteina
termolabil. (1)
Calea altern poate fi activat de bacterii, fungi, virusuri, parazii, venin de viper, produi de
coagulare, celule tumorale etc.
196
Calea clasic i calea altern (alternativ) converg ctre C3, apoi urmeaz o cale efectoare
comun, implicnd ultimele componente ale sistemului complement (Figura nr. 3). n fiecare
dintre etape, intervin proteine activatoare, inhibitoare sau reglatoare precum i receptorii
pentru complement. Aceste elemente se gsesc fie n plasm fie la nivelul peretelui celulelor
autologe sau omologe.
n mod curent, sistemul complement este desemnat prin litera C. Pentru fiecare component
studiat i bine delimitat n cadrul cascadei de activare se adaug o cifr, de la C1 la C9, care
este eventual urmat de o liter (care reprezint o anumit subdiviziune; spre exemplu, pentru
C1 exist C1q, C1r i respectiv C1s).
Ca urmare a activrii sistemului C', unele componente (C4, C2, C3, C5), sunt fragmentate, aceste
fragmente fiind desemnate printr-o liter ataat componentei iniiale (exemplu C3a i C3b). n
general componenta b este de dimensiuni mai mari (excepie C2a, fragment nglobat ntr-un
complex proteolitic i care are dimensiuni mai mari dect C2b) i se fixeaz la nivelul structurii
int, n timp ce componenta a este mai mic, este solubil i posed o activitate anafilactoid
sau chimiotactic.
Anafilatoxinele sunt polipeptide mici, eliberate n cursul cascadei de activare a complementului,
care prezint receptori pe mastocite, monocite, macrofage, neutrofile, trombocite i au efect
proinflamator. Cea mai puternic dintre anafilatoxine este C5a. Aciunile anafilatoxinelor sunt
de tipul:
197
198
Aceast cale poate fi activat de ctre diferite microorganisme, de componente ale acestora, de
numeroase substane neimune, spre exemplu:
endotoxine bacteriene,
alte substane (insulin, hemoglobin, zymosan, fibre de azbest, gluten, prafuri, unele
substane de contrast utilizate n radiologie, venin de viper sau veninul altor erpi etc.).
Calea altern poate fi activat de complexele imune care cuprind IgG sau IgA.
Printre componentele cii alterne se numr:
C3. n plasm, prin proteoliza spontan a C3, sunt formate n permanen mici cantiti de C3b.
Moleculele de C3b se fixeaz de suprafeele acceptoare, n particular de peretele
microorganismelor sau de celulele infectate i alterate. Cteva bacterii, a cror structur este
bogat n acid sialic, pot evita aciunea sistemului complement. La rndul su, C3b acioneaz
asupra factorului B.
Factorul B. Element al cii de amplificare, factorul B este clivat n Ba i Bb. Complexul C3bBb,
format n prezena ionilor de Mg2+, constituie C3-convertaza alternativ, care cliveaz noile
molecule de C3 n C3b. Acest clivaj accelerat de C3, d natere C5-convertazei (C3bBb)n.
Factorul D, factor prezent sub form activ n ser nainte de activarea C, cliveaz factorul B,
ceea ce faciliteaz formarea complexului C3bBb.
Ansamblul factorilor activatori ai cii clasice i alternative realizeaz o bucl de amplificare, care
permite transformarea numeroaselor molecule de C3 n C3b astfel nct C3b s acopere
(opsonizeze) peretele bacterian. (Figura nr. 2)
199
C9. Aceast protein are dou proprieti: 1. de a se insera la nivel membranar, graie unei fee
hidrofobe; 2. de a polimeriza, formnd astfel peretele unei soluii de continuitate de circa 10
nm n diametru la nivelul membranelor celulelor int (limfocitul T utilizeaz o substan numit
perforin, cu efect asemntor cu cel produs de C9). Formarea sau fixarea complexului C5b9 n
cantiti sublitice la suprafaa celulelor antreneaz sinteza i eliberarea mediatorilor inflamaiei
(leucotriene, IL-1 etc). (Figura nr. 3)
Exist o serie de mecanisme de reglare a activitii sistemului complement, acestea fiind
mediate de proteine reglatoare care intervin la un moment dat n cursul cascadei de activare,
avnd capacitatea de a o limita sau chiar opri. (Tabelul nr. 2)
n general, aceste proteine inhib formarea C3 convertazei sau promoveaz disocierea ei (cnd
aceasta deja s-a format). Decay Accelerating Factor (DAF) Factorul de accelerare a disocierii
C3 convertazei este o protein care poate dezactiva C3 convertaza cii clasice, dar are i rolul
de a inhiba formarea ei, nepermind elementelor C2a i C4b s interacioneze. mpreun cu
CR1 (complement receptor 1), DAF competiioneaz cu factorul B la legarea de
C3b, prevenind astfel constituirea C3 convertazei cii alterne. Acest complex DAF-CR1 poate s
disloce Bb din compusul C3bBb, disociind C3 convertaza cii alterne.
Factorul H are aciune similar.
Tot din categoria proteinelor reglatoare face parte i Factorul I, o proteaz din plasm care
cliveaz C3b n mai multe situsuri, inactivndu-l. Iniial rezult C3bi, apoi C3c i C3dg (fragment
ce rmne ataat membranei celulare).
Properdina (factorul P), n contrast cu toi compuii enumerai anterior, intervine n reglarea
sistemului complement prin stabilizarea C3 convertazei cii alterne. Deficienele de properdin
au fost asociate cu creterea susceptibilitii fa de infeciile provocate de Neisseria spp.
atac ale membranei (componentele C5-C9) lizeaz diferite microorganisme: bacterii, virusuri sau
parazii. Aceasta reprezint o activitate citolitic direct a complementului cu sau fr prezena
anticorpilor.
Prin mecanisme asemntoare, agenii infecioi pot fi acoperii de C3b sau C3bi care sunt
recunoscui de diferii receptori, prezeni la nivelul diferitelor celule fagocitare eseniale:
neutrofile i macrofage. Dup aderare, acestea vor fagocita microorganismele. Diferite
microorganisme au dezvoltat mecanisme de rezisten la aciunea complementului: ex.
prezena unei capsule care mpiedic activarea cii alternative (S. pneumoniae, Haemophilus
influenzae), sintetizarea unor substane care fixeaz C3b sau antreneaz o rezisten la inseria
complexului de atac al membranei.
15. 5. 3. n metabolismul complexelor imune. Curarea (clearance-ul) complexelor imune este
facilitat n mare msur de ctre sistemul complement. Simpla fixare a complementului inhib
formarea complexelor imune de talie mare (calea clasic) i le solubilizeaz. Totui complexele
circulante acoperite de C3b pot adera la hematii, iar apoi pot fi transportate pn la nivelul
celulelor Kuppfer hepatice, pentru a fi fagocitate. C1q are proprietatea de a precipita
complexele imune in vitro. Aceast proprietate st la baza diverselor metode de detectare a
complexelor imune circulante.
15. 5. 4. n reglarea rspunsului imun.Pe limfocitele B se gsesc receptori pentru C3d sau C3dg
(CR2).
15. 5. 5. n inducerea secreiei de citokine de ctre monocite i macrofage prin intermediul
receptorilor C3. (5)
Sistemul C' poate aciona n sistem heterolog (C' recoltat de la animale, de ex. nurc, cobai se
poate folosi n reacii de diagnostic n microbiologia medical, sistemul indicator provenind de la
un alt animal de ex. oaie, bou) i din aceast cauz a fost i este nc folosit n foarte multe
situaii. Trebuie ns reinut faptul c sistemul C' se degradeaz rapid la temperaturi mai mari de
56C i din aceast cauz reactivii care conin C' trebuie meninui la rece (0C) inclusiv pe
timpul transportului.
202
Dei sinteza elementelor care formeaz sistemul complement ncepe relativ repede, n perioada
fetal (ntre sptmnile 6 - 14 de via intrauterin), concentraia acestora la natere nu
depete jumtate din cea de la adult.
Dintre efectele necesare ale sistemului complement, opsonizarea reprezint o etap esenial n
cadrul unei fagocitoze eficiente. Componenta C3 a sistemului complement reprezint punctul
de convergen ntre calea clasic i calea alternativ (altern). C3 favorizeaz fagocitoza prin
structuri care se ataeaz suprafeei bacteriene i sunt recunoscute de anumii receptori. Pe
suprafaa neutrofilelor sunt expui receptorii CR1 (CD35) - care se leag de componenta C3b.
Neutrofilele prezint i receptori CR3. Comparativ cu configuraia receptorilor la adult,
neutrofilele nou-nscuilor sunt deficitare n exprimarea CR3.
Un studiu recent a demonstrat c blocarea (la adult) receptorilor CR3 mpiedic buna
desfurare a proceselor de opsonizare i fagocitoz. Acelai studiu a emis ipoteza c
depozitarea unor anumii compui de clivare ai C3 pe suprafaa streptococului de grup B ar fi un
factor important n aprarea gazdei mpotriva agravrii infeciei.
Alte experimente au artat c la oriceii cu deficit de C3 eliberarea de TNF- indus de
streptococ este semnificativ redus. n concluzie, calea altern a complementului i factorul C3
ar putea reprezenta cheia eliberrii de TNF-. Abilitatea streptococului de grup B de a activa
sistemul complement a fost demonstrat n vitro.
Dei se tie c nou-nscuii prezint concentraii relativ mici ale complementului, n mod
aparent calea altern este suficient de activ nct s amplifice eliberarea de TNF- n cazul
infeciilor streptococice. Acest fapt a fost demonstrat de diferite studii care au certificat
creterea marcat a eliberrii TNF- de ctre monocitele nou-nscuilor.
Avnd n vedere c eliberarea de TNF- ca rspuns la infeciile grave cu streptococ de grup B
pare s aib o strns legtur cu fiziopatologia acestor infecii, se consider c terapia
adjuvant imunomodulatoare administrat cu scopul de a reduce activitatea pro-inflamatorie a
streptococului ar putea fi eficient. O astfel de terapie ar include i modularea cii alterne a
complementului.
15. 6. 2. Consecine ale deficitului de properdin
Sistemul complement este un complex de molecule care face parte din ansamblul imunitii
nespecifice. De-a lungul timpului, s-au descoperit o serie de afeciuni corelate cu deficiene ale
acestor compui dintre care i boli autoimune, dar i reacii de hipersensibilitate.
Un subiect ndelung studiat l reprezint deficitul de properdin i predispoziia persoanelor
care posed aceast caren fa de infeciile cu specii din genul Neisseria.
Properdina este o glicoprotein reglatoare a cii alterne de activare a complementului, singura
care regleaz pozitiv cascada enzimatic prin stabilizarea C3 i C5 convertazei cii alterne.
Concentraia seric fiziologic de properdin este de 5-15 g/ml, fiind un amestec de
monomeri, dimeri, trimeri i tetrameri n raport de 1:2:1.
n 1982, ntr-o familie suedez, a fost descris primul caz de caren de properdin n asociere cu
o infecie meningococic cu debut fulminant. Ulterior, studiindu-se aceast problem, s-a ajuns
la concluzia c exist 3 tipuri diferite de deficit de properdin (observate clinic la indivizi diferii).
Primul tip se caracterizeaz prin absena proteinei n plasm. Cel de-al doilea se manifest
printr-un titru foarte sczut al properdinei, iar cel de-al treile tip presupune o concentraie
seric normal, dar o variant nefuncional a proteinei.
203
Detectarea unei astfel de condiii la un pacient este foarte dificil de fcut. Pe lng testele de
laborator care sunt foarte laborioase, este necesar un istoric infecios al pacientului i al familiei
acestuia. Din pricina diagnosticului greu de stabilit, deficitul de properdin este rar ntlnit, ns
prezent n faz ocult (nediagnosticat) n special n cadrul rasei caucaziene, nefiind reportate
cazuri la nici o alt populaie. Formele de deficit de properdin sunt maladii genetice
transmisibile, X-linkate. Se cunoate deja, n toate trei tipurile bolii, care sunt mutaiile ce survin
i unde sunt acestea localizate.
Predispoziia fa de infeciile cu Neisseria meningitidis apare ca manifestare clinic n toate
tipurile deficitului de properdin. Serotipurile cel mai des implicate n astfel de infecii sunt W135 i Y, mai puin serotipul B, fa de care s-a constatat c organismul uman i-a dezvoltat
metode mai eficiente de aprare prin mecanisme de fagocitoz. Indivizii cu deficit de
properdin au un risc mai crescut de 250 de ori de a dezvolta o infecie meningococi dect
restul populaiei sntoase. Dac la o persoan normal, ansele cele mai mari de a face infecie
cu meningococ sunt la vrsta de 6 ani, la un individ cu deficit de properdin, vrful riscului
dezvoltrii infeciei este n jurul vrstei de 14 ani. Mortalitatea n astfel de cazuri este de pn la
75%. Infeciile recurente sunt extrem de rare n condiiile date, fapt ce atest c probabil
aprarea umoral devine mai eficient la aceste persoane.
Pacienii cu deficit de properdin au un rspuns umoral adecvat la vaccinul tetravalent
antimeningococic (care conine antigene din serotipurile A, C, Y, W135), organismul genernd
anticorpi anticapsulari ce devin eficieni n combaterea instalrii infeciei. Partea bun este c
nu la toi pacienii la care este detectat deficitul de properdin se dezvolt infecii
meningococice. Acest lucru a sugerat c exist i ali factori adiionali care favorizeaz
predispoziia ctre aceste infecii. S-a constatat astfel c la o parte dintre indivizii cu deficit de
properdin, lipsea alotipul G2m(n) (alotipul reprezentnd o secven aminoacidic de pe lanul g
al moleculei de IgG2 specific fiecrui individ). Se speculeaz c aceast combinaie: deficit de
properdin lipsa alotipului G2m(n) este un temei relevant care explic de ce indivizii afectai
prezint un risc net superior de a se imbolnvii de infecii meningococice.
204
205
Bibliografie recent
Munthe-Fog L, Hummelshoj T, Honore C et al., 2009, Immunodeficiency associated with FCN3
mutation and ficolin-3 deficiency, N Engl J Med, 360, 2637-2644
Rochowiak A, Niemir ZI, Merkur Lekarski P, 2010, The structure and role of CR1 complement
receptor in physiology, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20369732
Rochowiak A, Niemir ZI, Merkur Lekarski P, 2010, The structure and role of CR1 complement
receptor in pathology, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20369733
Schwartz RA, Thomas I, 2010, Complement receptor deficiency,
http://emedicine.medscape.com/article/1051238-overview
Erdei A, Molnar E, Csomor E et al., 2004, Indirect effects of C3 on the adaptive responses, IN:
The Complement system. Novel Roles in Health and Disease
Antigenul se definete drept o substan recunoscut specific de ctre sistemul imun. Ali autori
consider c antigenul este o substan capabil s induc un rspuns imun (imunogenicitate) i
s fie recunoscut de ctre sistemul imun (specificitate). Rspunsul imun (RI) tinde s
neutralizeze i s elimine antigenul din cauza cruia s-a declanat.
Antigenele (Ag) care pot declana RI sunt definite drept substane imunogene.
Haptenele reprezint Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declana
activarea limfocitelor (fr de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene numai dac se
combin cu macromolecule carrier. Aadar, haptena este un antigen incomplet, are
specificitate dar nu are imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic rezultat prin
degradarea moleculei de penicilin este o hapten. Pot aprea reacii de hipersensibilitate dup
cel puin al doilea contact cu aceast structur i numai n condiiile n care gazda ntr n
categoria persoanelor atopice, avnd structura genetic de codificare pentru o protein
carrier, care cupleaz acidul penicilinoic stimulnd astfel RI.
Tolerogenele sunt Ag care declaneaz activarea limfocitelor, ns RI este inhibat activ, imediat.
Orice bacterie trebuie vzut ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt imunogene
(unele pot fihaptene altele tolerogene). Mecanismele de aprare mpotriva microorganismelor
sunt diferite dar pot fi deduse n funcie de structura i caracterele de patogenitate ale
respectivei bacterii. Acesta este un alt exemplu care demonstreaz faptul c ntre capitole
diferite exist legturi importante, iar noiunile citite i nelese la timpul lor pot fi foarte utile,
ulterior.
Exist 4 tipuri principale de perete bacterian (tip gram pozitiv, gram negativ, tip micobacterian i
spirochetal) iar patogenitatea poate varia ntre 2 extreme (toxicitate fr invazivitate i
invazivitate fr toxicitate). (Figura nr. 1)
Recunoaterea antigenului depinde de structurile complementare ale sistemului imun,
preexistente introducerii sale. Moleculele CMH clasa I sau II pot prezenta o multitudine de
peptide antigenice diferite i nu sunt specifice unui antigen n mod particular.
Moleculele simple precum apa, srurile minerale i ureea sau comune majoritii speciilor (ca
acizii grai, creatinina, mono- i dizaharidele, fibrina) nu sunt antigene. Pe de alt parte,
moleculele mici de tipul metalelor grele (crom, nichel), responsabile de apariia
hipersensibilitii, sau medicamentele, pot deveni antigene dup ce se asociaz cu diferite
macromolecule.
mai mari i ndeprtarea filogenetic este mai important. Termenul izotip indic un caracter
comun tuturor indivizilor unei specii, i, n acelai timp, corespunde unui xenoantigen pentru
celelalte specii.
Alloantigenele sunt prezente la unii indivizi din aceeai specie. Alloanticorpii sunt obinui prin
imunizarea intra-specie sau inter-specii, dup absorbia anticorpilor anti-izotip.
Autoantigenele sunt substane recunoscute prin rspunsul imun i prezente la animalul imunizat
sau la om n contextul unei afeciuni autoimune. n mod normal, un individ nu declaneaz un
rspuns imun mpotriva structurilor proprii. Un rspuns autoimun se poate obine prin
imunizarea animalului cu substane proprii mpreun cu adjuvani sau prin injectarea unor
substane self uor alterate.
Idiotipul se refer la un caracter propriu prilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau
anticorpilor aprui dup imunizarea fa de un antigen dat.
IgM, uor adsorbabili de substanele A sau B salivare. Aceti anticorpi, considerai alloanticorpi
n cazul transfuziilor sanguine, sunt de fapt heteroanticorpi.
Antigene restrnse: Unele antigene sunt limitate la o singur specie i la un singur tip celular (un
exemplu fiind antigenele sanguine Rh). Anticorpii aprui n urma rspunsului imun nu apar
dect dup contactul cu hematiile unui subiect de grup diferit, dup o transfuzie sau dup
pasajul hematiilor fetale n sngele femeii gravide.
209
- Ag incomplete care nu pot declana RI dar pot reaciona (in vitro) cu Ac; sunt de ex. epitopi
izolai, nelegai de grupri purttoare (pot fi haptene).
repetitive, fie sub forma mai multor motive proteice diferite, recunoscute de ctre sistemul
imun.
Numrul determinanilor antigenici care pot fi recunoscui de ctre sistemul imun constituie
repertoriul imun. Pe baza cunotinelor asupra structurii prii variabile a imunoglobulinelor,
genomul uman codific pentru aproximativ 107-108 tipuri posibile de anticorpi diferii. n plus,
mutaiile frecvente n linia B aduc posibiliti suplimentare, lrgind repertoriul imun. Acelai Ac
poate recunoate mai muli determinani antigenici diferii, cu afiniti variabile.
Pe de alt parte, o molecul de antigen are mai muli epitopi (10-20), valena antigenului fiind
dat tocmai de numrul acestora (de ex. dac exist 16 epitopi, valena este 16 i ar putea fixa 8
molecule de anticorpi din clasa IgG, fiecare cu cte 2 situsuri combinative). Fiecare epitop este
recunoscut i declaneaz un RI i sinteza de anticorpi care l recunosc doar pe el.
16. 2. 2. Imunogenicitatea
Imunogenicitatea este capacitatea unui Ag de a induce un rspuns imun umoral sau celular.
O hapten este o molecul mic (natural sau artificial), incapabil s induc singur un
rspuns imun dar care poate fi recunoscut de componentele sistemului imun. Termenul a fost
introdus de Landsteiner n 1930. Haptena are specificitate dar nu are imunogenicitate.
Termenul de hapten nu este sinonim cu cel de determinant antigenic: haptena poate fi mai
mic, egal sau mai mare ca epitopul.
Purttorul(carrier-ul) este partea Ag cu structur proteic, n general, care prin cuplare cu
haptena face ca aceasta s devin imunogen.
16. 2. 3. Alergenicitatea
Unele antigene sunt capabile s induc producia de anticorpi IgE i prin aceasta s provoace o
reacie de hipersensibilitate mediat umoral (tip I). Principalele alergene cunoscute sunt
polenul, veninul de viper, praful de acarieni i unele fragmente sau produse de origine animal.
211
212
lng dependena activrii LTc de prezentarea MHC I-Ag, mai exist i o dependen de
activitatea litic a fagozomilor.
TCR (fie ei situai pe LT CD4+ sau CD8+) sunt de 2 tipuri: cu lanuri i cu lanuri . Aceste 2
tipuri difer prea puin ca structur i mai mult ca distribuie. Consecutiv, cele 2 specii de
receptori vor avea funcii diferite. TCR se gsesc la nivelul sngelui periferic i a timocitelor,
iar TCR la nivelul pielii, mucoaselor, aparatului digestiv i reproductor. De aceea s-a ridicat
ipoteza conform creia LT n care predomin TCR s nu aib neaparat nevoie de prezentare
MHC-Ag pentru activare (Unele LT recunosc fosfoliganzi derivai din M. tuberculosis care le
determin activarea).
Superantigenele activeaz direct LT, fr a mai fi nevoie de prezentarea lor de ctre un APC pe
un MHC. Stafilococcii i streptococcii posed 21 de superantigene, probabil cu rol adaptativ. Sar putea ca motivul s fie o ct mai rapid depleie de LT a gazdei i inhibarea producerii de
anticorpi. Certa e ns toxicitatea determinat de eliberarea masiv de citokine. TSST-1 (toxic
shock syndrom toxin-1) aparinnd stafilococcilor este un exemplu de superantigen. i proteina
M a Streptococcus pyogenes formez un complex cu fibrinogenul, complex care se leag de
integrinele de pe neutrofile, determinnd eliberarea n cantiti mari a mediatorilor inflamatori.
Dac un antigen convenional activeaz 0,01-0,1% LT, superantigenele activeaz 5-30% din
populaia LT.
16.4.6. TSS ... HSP ... utilitatea antigenelor ...
Datele din USA referitoare la TSS (toxic shock syndrome) publicate ntr-un articol n 2010 relev
o incidena a infeciilor GAS (group A streptococci) de 1,5-5,2o/oooo/an, din care 8-14% au
dezvoltat TSS, cu o mortalitate de 30-70%. O epidemie de varicel crete riscul de TSS la
62,74o/oooo. La 50% din pacienii cu TSS au avut afectri severe de esuturi moi, precum
fasciita necrozant, miozit, celulit. (1)
HSP (Heat shock proteins) sunt proteine comune att organismelor umane, ct si bacteriilor i
au fost denumite astfel datorit faptului c s-a remarcat creterea expresiei acestora n condiii
de temperaturi ridicate sau fa de ali factori de stres (ex. un proces infecios). HSP au rol n
asamblarea, formarea structurii cuaternare a proteinelor i n transportul altor molecule. n
timpul unei invazii bacteriene, sistemul imun se ndreapt i mpotriva HSP, att a celor
autohtone, ct i a celor bacteriene. HSP activeaz sistemul imun prin intermediul CD91, CD40,
CD14 i anumii TLR. Datorit asemnrii structurale ntre cele 2 tipuri de HSP se presupune c
aceste proteine ar avea un rol important n generarea bolilor autoimune.
Tot timpul ne aflm sub influena antigenelor bacteriene. Unele asigur sau nlesnesc procese
fiziologice, aa cum se ntmpl la nivelul intestinului gros, altele, prin competiie ne protejeaz
de germeni viruleni, aa cum se ntmpl de ex. la nivelul foselor nazale. Dar exist i teoria
igieniei, neconfirmat i nu neaprat adevarat sau aplicabil tuturor microorganismelor,
conform creia i infecia uoar i tranzitorie (nu boala) cu bacterii patogene este de folos.
Alergiile (strile de hipersensibilitate), bolile inflamatorii ale intestinului subire i bolile
autoimune ar fi generate de un dezechilibru imun generat de igien, vaccinuri i antibiotice.
Ideea este nu de a elimina aceste 3 modaliti clasice de aprare mpotriva infeciilor, ci de a
afla cum, cnd i ct trebuie folosit fiecare arm i de a cunoate ct mai bine adversarul
mpotriva cruia o folosim.
16.4.7. oc toxico septic sau alergie? Streptococ sau Stafilococ?
217
Pacienta n vrst de 25 ani, se prezint la camera de gard dup 2 zile de rash cutanat i o
durere surd difuz n cadranul stng inferior al toracelui.
n urm cu o sptmn a fost diagnosticat cu faringita streptococic i a primit amoxicilin. Sa prezentat dup 3 zile la serviciul de dermatologie datorit rash-ului, unde i s-a pus diagnosticul
de alergie la amoxicilin. Prin urmare, a fost ntrerupt tratamentul cu amoxicilin i s-a
recomandat prednison.
Este corect atitudinea dermatologului?
Argumentai.
La efectuarea anamnezei pacienta acuz grea, vrsturi, febr, fatigabilitate, dezorientare i
durerea surd menionat mai sus. Neag s fi avut sngerri (melen, hemoptizie, hemoroizi).
Examen i analize: TA=65/35 mmHg, AV=110-120bpm, FR=20/min, T:39,7C, SO2=93%.
La examenul fizic: pacienta este palid, cu starea general alterat. Orofaringele clar, fr
exsudate sau eritem, crepitaii difuze la auscultaia pulmonar, fr sufluri supraadugate sau
zgomote patologice cardiace, abdomen suplu, mobil cu respiraia. n tabel sunt listate
determinrile biochimice i hematologice anormale (comparativ, valorile normale). (Tabelul nr.
1)
Se efectueaza o radiografie (Rx) cardio-pulmonar, care este n concordan cu explorrile
paraclinice i cu examenul clinic, punndu-se diagnosticul de etap, ARDS (adult respiratory
distress syndrome). (Figura nr. 3)
La ntoarcerea de la radiologie, pacienta devine iar hipotensiv, tahicardic, tahipneic; febra se
menine n ciuda adminitrrii de acetaminofen. Se decide intubarea pacientei datorit
insuficienei respiratorii ce se agraveaz, se recolteaz probe de snge, urin, exsudat faringian
i se face o puncie lombar. Se solicit titrul ASLO i TSST-1. Se iniiaz tratament cu
clindamicin, vancomicin i meropenem iar pacienta este transferat n serviciul de ATI.
Comentarii explicative
n 1993 s-a ajuns la un consens privind TSS produs de streptococi, care presupune stabilirea
diagnosticului pozitiv dac sunt ndeplinite concomitent urmtoarele condiii:
1) Izolarea streptococcilor de grup A (GAS) dintr-o zon n mod normal steril (snge, fluid
cerebro-spinal, pleural, peritoneal)
2) Hipotensiune
3) 2 sau mai multe dintre urmtoarele:
Insuficien renal (creatinina>2mg/dL sau valori de 2 ori mai mari dect n mod normal la
pacienii cu boal renal)
Coagulopatie
Rash maculo-eritematos
mialgie sever. Pacienii cu infecie streptococ pot prezenta necroz de esut moale (celulit,
fasciit, abces, miozit), simptomatologie influenza-like, varicel n antecedente n cazul celor
nevaccinai.
n cazul TSS stafilococic, se pare c toxina TSST-1 este responsabil de 75% din cazuri. Pentru
TSS steptococic, proteina M este responsabil de 75% cazuri iar SPEs A, B, C sunt responsabile
de circa 13% (SPEs = Streptococcus pyogenes exotoxins). Specificitatea determinrii Ac anti
TSST-1 este de 90%, n timp ce pentru determinarea titrului proteinei M nu exist teste fiabile.
Se poate folosi n schimb titrarea ASLO n dinamic.
n ciuda ambiguitii privind etiologia, tratamentul rmne acelai:
17. Rspunsul imun umoral i celular (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)
220
n momentul n care un Ag ptrunde pentru prima dat n organism, sistemul imun nu posed
dect un numr redus de limfocite T sau B specifice recunoaterii poriunilor peptidice
(epitopilor) acestui Ag. Astfel, dintr-un repertoriu preexistent de limfocite, Ag le va selecta
numai pe cele care sunt capabile s recunoasc i s se combine cu Ag. n acelai timp (cu mici
excepii) nu exist nici o celul sau molecul capabil s elimine Ag sau microorganismul care l
poart, motiv pentru care este necesar apariia limfocitelor T citotoxice, secretoare de citokine
(imunitate celular) sau a plasmocitelor anticorp-secretante (imunitate umoral).
activarea limfocitelor,
222
Creterea logaritmic: (sintez activ de Ac, de ctre plasmocite) dureaz circa 3 zile; n
timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacii Ag-Ac; urmeaz o faz de stagnare
(cteva zile), timp n care titrul anticorpilor serici se menine relativ constant;
examinarea claselor de anticorpi produi arat c primii anticorpi care apar sunt de tip IgM
(cei din clasa IgG apar cteva zile mai trziu iar nivelul lor crete pe msur ce nivelul IgM
scade);
poate aprea chiar i dup administrarea unor doze destul de mici de antigen;
latena este redus la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de cretere
logaritmic;
persistena acestora este mai lung (Ac produi se menin timp mai ndelungat, luni de
zile).
Diferena dintre RIP i RIS este datorat n primul rnd existenei limfocitelor cu memorie. Dup
eliminarea Ag, n organism continu s circule celule cu memorie, reacia imun la al doilea
contact cu acelai Ag avnd caracteristicile de mai sus. Memoria imun se stabilete din timpul
RIP i este specific.
Determinarea claselor IgM i IgG are o dubl importan practic:
223
Dup contactul cu antigenul i activarea complet, LTh se vor numi LThp (primitive), care
ulterior vor ncepe proliferarea i sinteza de IL2. Prin stimulri autocrine repetate LThp se vor
diferenia n LTh0 i apoi n LTh1 sau LTh2 n funcie de mediul citokinic din jur i de citokinele
produse (vezi i 11.3.1.).
Limfocitele Th2 sunt reprezentative pentru RIU (Figura nr. 1). LTh2 secret IL-2, IL-4, IL-5 i IL-6,
care activeaz LB i stimuleaza mecanismul de switch izotipic n genomul LB. Acest switch se
realizeaz prin rearanjarea ADN-ului, pentru sinteza Ac diferii structural, dar cu aceeai
specificitate pentru antigen.
Limfocitele B pot fi activate i direct, n cazul antigenelor timoindependente de origine
polizaharidic, cu epitopi repetitivi. Aceasta se realizeaz prin formarea unor puni ntre
receptorii de suprafa i determin redistribuia Ig pe suprafaa membranei celulare. n lipsa
interleukinelor produse de LT, activarea LB este limitat la sinteza de IgM, fr comutarea
spre IgG.
Prima etap const n activarea limfocitelor B din stadiul G0 al ciclului celular spre stadiul G1
(celula sintetizeaz ARN i crete n volum); stimulul este reprezentat de contactul cu antigenul.
IL-4, secretat de limfocitele Th, poate transforma limfocitele B din stadiul G0 i G1 i crete
expresia moleculelor MHC. n acest stadiu LB activat exprim molecule noi: CD23, CD34 i CD40.
Al doilea timp corespunde proliferrii policlonale a celulelor B activate, care trec din stadiul G1
n fazele S i M. Aceast faz necesit prezena IL-2 i IL-5.
Ultima faz const n diferenierea n celule productoare de anticorpi - plasmocite; secreia de
IL-6 ajut procesului de maturizare iar diferitele interleukine permit orientarea izotipic spre
sinteza unei clase particulare de imunoglobuline.
Aadar, exist o intens colaborare ntre LB, LTh i APC att prin contact direct cu ajutorul unor
molecule de adeziune, ct mai ales prin intermediul citokinelor, adevrai mesageri (hormoni)
ai imunitii.
17. 2. 4. Teoria seleciei clonale
Teoria seleciei clonale a fost propus n jurul anului 1950 de ctre McFarlane Burnet. Aceast
teorie afirm c la nivelul sistemului imun exist un numr imens de capi de clone de
limfocite, fiecare dintre aceti capi de serie corespunznd unei structuri antigenice (unui
anume epitop); n cadrul aceleai teorii, Burnet a fcut estimarea c n lume ar exista circa 100
de milioane de tipuri de epitopi diferii. Clona, aa cum se cunoate, este o populaie de celule
identice din punct de vedere genetic, descendente ale unei singure celule mam.
Toate celulele unei anumite clone au la suprafa, molecule identice cu structur
imunoglobulinic; aceste imunoglobuline au rol de receptori pentru structurile antigenice
(pentru fiecare antigen diferit exist un receptor diferit).
Structurile antigenice selecteaz din acest numr imens de limfocite cap de serie pe acelea
care au receptori complementari (configuraie spaial etc) i astfel determin proliferarea i
diferenierea lor n celule productoare de anticorpi. Celulele unei clone au aceeai specificitate
pentru structura antigenic datorit creia au proliferat.
Clonele de limfocite care ar putea s produc anticorpi fa de structurile proprii (self) sunt
reprimate n timpul vieii intra-uterine i numai celelalte clone pot ajunge la maturitate. n lipsa
acestei represii apar boli autoimune grave, potenial fatale.
224
IL-2 - produs numai de LT (n principal CD4+ i numai ntr-o mic msur de ctre
CD8+), are o aciune autocrin asupra LT dar i asupra monocitelor, macrofagelor, LT CD8+ i a
celulelor NK;
225
IFN-g - produs n principal de LT (CD8+ i mai puin din CD4+) dar i de celulele NK,
activeaz macrofagul, crete sinteza de molecule MHC II, recruteaz celule NK i le activeaz
funcia citotoxic sub efectul TNF-a i mpiedic infectarea celulelor cu virusuri (aciune
antiviral).
227
228
Vaccinarea este definit drept o metod profilactic, care urmrete creterea rezistenei
specifice a unei gazde, printr-o imunizare activ, cu stimularea rspunsului umoral sau celular,
dup caz. De fapt, vaccinrile incluse n programele naionale de vaccinare (conform
recomandrilor Organizaiei Mondiale a Sntii, OMS) reprezint metodele profilactice cu cel
mai bun raport ntre cost i eficien, n comparaie cu orice alt metod cunoscut.
Strategiile de vaccinare au n vedere mai multe aspecte, inclusiv statusul imun al gazdei
respective (imunocompetent sau imunodeprimat).
Unele vaccinuri se pot administra i n timpul unei izbucniri epidemice (outbreak) sau a unei
epidemii, pentru prevenirea apariiei de cazuri noi i scurtarea duratei epidemiei.
Exist i posibilitatea administrrii unor vaccinuri n scop curativ, gazda fiind deja infectat n
momentul inoculrii (ex. vaccin HBV la persoanele cu hepatit cronic, cu HBV).
Vaccinuri corpusculare (bacteriene, virale), incluznd, dup caz, corpi vii atenuai sau
distrui (inactivai) prin aciunea unor factori fizici (ex. cldur) sau chimici (ex. mertiolat de
sodiu). Vaccinul BCG conine bacterii vii atenuate, stimuleaz RIC i se administreaz pentru a
preveni tuberculoza. Vaccinurile poliomielitic (Salk) sau hepatitic A includ virusuri omorte.
Vaccinurile poliomielitic (Sabin), rujeolos, rubeolos conin virusuri vii, atenuate i stimuleaz RIU
i rspunsul imun la poarta de intrare.
Vaccinuri asociate, care conin amestecuri de antigene (DTP, DT, dT, rujeolos-rubeolos
etc).
Date privind schema de vaccinare aflat n uz n ara noastr la acest moment, precum i
cteva informaii privind substanele imuno-modulatoare (ex. Cantastim) sunt prezentate n
anexa nr. 4.
229
Situaia a fost de asemenea periculoas n Ucraina, unde mai mult de 1.300 de cazuri au fost
raportate n primele zece luni ale anului 1992. Ameninarea extinderii n alte state, foste
membre URSS, a fost real. Eforturile uriae de a vaccina att copiii ct i adulii au fcut, pn
la urm, posibil controlul epidemiei. Totui, n perioada 1990-1998, peste 150.000 de cazuri de
difterie au fost raportate, din toate statele foste membre ale URSS, nregistrndu-se i un foarte
mare numr de decese.
Dar care a fost motivul i de ce a aprut o epidemie de difterie dup 1990 ?
Incidena difteriei n Rusia era foarte mare n prima jumtate a secolului 20; peste 750.000 de
cazuri au fost raportate doar n Rusia n anii 50 (imunizarea mpotriva difteriei a nceput n
anumite zone ale Uniunii Sovietice n 1920, ns abia n 1958 a fost statuat imunizarea
universal a copiilor, n toat Uniunea Sovietic). Este adevrat c n 1977, au nceput s fie din
nou raportate cazuri de difterie, n URSS, atingnd o valoare maxim n 1984 (1.609 cazuri). Din
1978, pentru prima dat, majoritatea cazurilor au aprut la aduli.
Mass-media a avut un rol extrem de negativ prin atitudinea advers fa de imunizare. Multe
dintre bolile prevenite de vaccin aveau o inciden sczut i n acest context a aprut o
micare anti-imunizare n pres, n contextul unei perioade (1985-1990) de profund
nencredere n guvern. Dup 1990, prinii nu mai erau de acord s permit imunizarea copiilor
cu vaccinuri produse n Rusia fiind fcui s cread c acestea le fac ru i i mbolnvesc. Chiar i
membri ai comunitii medicale au avut ieiri n pres n care au exprimat prerea c aceste
vaccinuri duneaz.
n plus, o parte din prini considerau c amnarea (nerespectarea schemelor de vaccinare,
neprezentarea la medic atunci cnd erau invitai s o fac) sau evitarea vaccinrii copiilor sunt o
nou-descoperit libertate, n cadrul democraiei instaurate odat cu dizolvarea URSS.
Epidemia aprut n anii 90 a ngrijorat comunitatea medicala internaional n legtur cu
vaccinul produs n Rusia. Contrar opiniilor anecdotice, studiile realizate au demonstrat c
vaccinul era eficient [este totui posibil ca vaccinul s fi fost transportat n condiii improprii i
astfel s fi avut, n mod real, o eficacitate mai mic (presupunere care nu a fost demonstrat)].
Este adevrat c i schemele de vaccinare din URSS au suferit n anii '80 unele modificri,
diferind de schemele recomandate de OMS (ex. coninut mai mic de antigen, creterea
intervalului ntre vaccinri, renunarea la administrarea DT la intrarea n coal) iar preocuparea
pentru sntatea public a sczut, din diverse motive. Rata vaccinrii la copii a sczut n anii 80,
la mai puin de 70% (mult sub recomandrile OMS).
Reacia fa de aceast epidemie s-a concentrat iniial asupra vaccinrii a ct mai multor copii
dar i a adulilor din grupele de risc. Vaccinarea tuturor adulilor a fost aprobat abia n 1993. Sau fcut vaccinri la locul de munc dar i vizite la domiciliu pentru vaccinarea omerilor. Pentru
a crete rata imunizrii la copii s-a diminuat lista contraindicaiilor i a nceput s se foloseasc
schema complet de vaccinare. n octombrie 1994, s-a reintrodus vaccinarea copiilor la intrarea
n clasa I. n 1995 - 1996, epidemia a nceput s fie controlat. Dar care au fost pierderile umane
i materiale, reale, probabil c nu vom cunoate, vreodat.
n timp ce apariia epidemiei a fost unul dintre cele mai spectaculoase exemple ale interveniei
negative a mass-media n problemele de sntate public, controlul epidemiei de difterie a fost
unul dintre cele mai spectaculoase succese ale interveniei de sntate public n secolul 20.
Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate
s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri.
1. The open window of susceptibility to infection after acute exercise in healthy young male
elite athletes; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kakanis%20MW%22
2. New strategies of mammary cancer vaccination: based on the administration of tumor cells
genetically modified to express major histocompatibility complex (MHC) class II gene products;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21050309
3. Receptor tyrosine kinase signaling favors a protumorigenic state in breast cancer cells by
inhibiting the adaptive immune response; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20924104
4. Replacement of dietary fish oil by vegetable oils affects humoral immunity and expression of
pro-inflammatory cytokines genes in gilthead sea bream Sparus aurata;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20817101
5. Model systems to the rescue: The relationship between aging and innate immunity;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21057627
6. Innate Immune Response to Mycobacterium tuberculosis Beijing and Other Genotypes;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21049036
7. Skin Commensals Amplify the Innate Immune Response to Pathogens by Activation of Distinct
Signaling Pathways; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21048787
8. An Effective HIV Vaccine: A Combination of Humoral and Cellular Immunity?
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20636279
Bibliografie
1.
Firdaus SD, 2009, Enhancing versus supressive Effects of Stress on Immune
Function: Implications for Immunoprotection and Immunopathology,
Neuroimmunomodulation, 16(5), 300-317
2.
Schedlowski M, Jacobs R, Stratmann G et al., 1993, Changes of natural killer
cells during acute psychological stress, J. Clin. Immunol., 13(2), 119-126
3.
Everson CA, Toth L, 2009, Systemic bacterial invasion induced by sleep
deprivation, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol., 278(4), R905-R916
4.
Cooper MA, Colonna M, Yokoyama WM, 2009, Hidden talents of natural
killers: NK cells in innate and adaptive immunity, EMBO Rep., 10(10), 1103-30
232
un contact sensibilizant,
o perioad de laten i
233
vasodilataie arterio-capilar prin contracia fibrelor musculare netede din peretele
venulelor postcapilare,
medicamentos. Din antecedentele din copilrie, avea notat n carnetul de sntate o reacie
alergic (dermatit atopic i urticarie) dup ingerarea de unt de arahide.
Dup spusele colegilor care au nsoit-o la spital, nainte de a-i aprea simptomele, a mncat o
ciocolat de la un tonomat din cmin. Pe ambalaj nu apreau notate alunele ca ingredient.
Totui ...
Iat cteva elemente privind alergiile la diferite alimente
Reaciile de hipersensibilitate aprute dup ingestia anumitor alimente afecteaz aproximativ 68% dintre copiii mai mici de 4 ani i aproape 2% din populaia SUA cu vrsta mai mare de 10 ani.
Alergia la produsele alimentare reprezint una dintre cele mai importante cauze pentru
reaciile anafilactice tratate n departamentele de urgen din SUA i din multe state
occidentale. n fiecare an sunt raportate circa 30.000 reacii anafilactice, 2.000 de spitalizri i
200 de decese din cauza reaciilor de sensibilitate la diferite produse alimentare. Reaciile n
urma consumului de arahide i alune de pdure conduc la un procent important de reacii
anafilactice fatale sau foarte grave. n SUA, de unde putem obine date statistice privind aceast
situaie, 3 milioane de oameni sufer astfel de alergii. Dei exist numeroase programe de
informare (tot n SUA) cu privire la alergiile alimentare, majoritatea pacienilor nu tiu cum s
acioneze i cum s se salveze n cazul unei reacii anafilactice.
Cum s-ar putea pune diagnosticul?
La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, n absena unor semne recente de
astm, trebuie s ridice ntotdeauna suspiciunea anafilaxiei. Anafilaxia indus de produse
alimentare poate fi confundat de ex. cu un atac astmatic sever. Cu alte cuvinte, anamneza i
examenul clinic pot contribui la orientarea diagnosticului.
Tratamentul alergiei la alune
n primul rnd i cel mai important este ca reacia de hipersensibilitate (HS) de tip I s fie
prevenit i msurile includ educarea pacienilor i a familiilor acestora cu privire la modul n
care s evite ingestia accidental de alune, cum s recunoasc primele semne i simptome ale
unei reacii alergice i cum s reacioneze n primele stadii ale unei reacii anafilactice.
Spre deosebire de imunoterapia tradiional (pentru reaciile de HS la nepturi de insecte etc)
n cazul HS la alune sunt investigate metode de tratament neconvenionale precum injectarea
lunar de anticorpi anti-IgE (care, prin scderea nivelelor de IgE, pot preveni activarea
rspunsului la alergenul proteic din alune) sau obinerea prin inginerie genetic a unor proteine
de alune recombinante (prin substituirea unor aminoacizi critici se poate preveni activarea
reaciilor mediate de IgE).
Tratamentul reaciei anafilactice
Pacienii care au HS de tip I la alune trebuie s primeasc urgent adrenalin (injectat
intramuscular), antagoniti ai receptorilor histaminici H1 i H2 (administrai oral, intramuscular
sau intravenos), oxigen, albuterol (pe cale inhalatorie) i corticosteroizi (injectabil). Datorit
faptului c pot aprea reacii bifazice (definite ca o agravare simptomelor, ce necesit o nou
terapie dup tratarea iniial a reaciei anafilactice) i deoarece circa 90% din rspunsurile
236
bifazice apar n primele 4 ore de la reacia anafilactic iniial, pacienii trebuie inui sub
observaie cel puin 4 ore nainte de a fi externai din camera de urgen.
Se recomand continuarea tratamentului timp de 3 zile (prednison i antihistaminice), cu toate
c nu a fost demonstrat c aceast recomandare ar reduce riscul simptomelor recurente.
18. 3. 2. Dar cum s-ar putea modula secreia IgG4/IgE?
Pentru a bloca interaciunea Th2 - IL-4 se pot folosi Ac anti IL-4 sau receptori solubili pentru IL-4.
Utilizarea receptorilor solubili IL-4 s-a ncercat terapeutic, cu rezultate bune in vitro
(administrare inhalatorie), dar nu i in vivo (probabil datorit contracarrii aciunii acestora prin
intervenia altor citokine implicate n sinteza de IgE).
Sinteza de IgG4 i sinteza de IgE se afl sub controlul acelorai citokine i se realizeaz de
aceeai populaie celular. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulin sunt situate foarte
apropiat una de cealalt, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine
independent de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare c un rol l-ar putea juca Il-10.
Copii care triesc n cas cu o pisic e posibil s nu dezvolte hipersensibilitate la alergenii
aceasteia, prin modificarea raspunsului Th2
237
Testele cutanate, prick-test, reprezint metoda cel mai des utilizat n diagnosticul HS de tip
I.
Se introduc cte 0,1l din fiecare preparat antigenic de testat intradermic (de obicei se
testeaz 25 de astfel de preparate), un martor pozitiv (histamina), i unul negativ (soluie salin
fiziologic). Modificrile cutanate apar n 5-15 min i dureaz 30 minute sau mai mult. Vor fi 2
tipuri de rspuns:
papul, cu aspect eritematos i dimensiuni mai mari i care are ca mecanism reflexul de axon.
Alt tehnic ar include dozarea IgE, ns testul este mai puin sensibil dect testele cutanate.
Un test cutanat pozitiv nu inseamn neaprat c persoana prezint HS de tip I, ci c exist o
mare probabilitate s fie aa. Numai un test cutanat pozitiv de mari dimensiuni (>10mm
diametru) este urmat i de un rspuns tardiv, caracterizat prin eritem i induratie. Rspunsul
tardiv apare la 2-3 ore dup injectarea intradermica a antigenului, ine pn la 24 ore i este
sugestiv pentru inflamaie cronic la nivelul foselor nazale, plmnului, pielii, datorndu-se:
Testele patch reprezint aplicarea cutanat a 10g alergen i realizarea unei biopsii din
zona respectiv dup 24 sau 48 ore. Exist 3 moduri de aplicare a antigenului n cazul patchtest: injecii intradermice locale, plasture sau godeu. Ultima metod are avantajul c se pot lua
probe repetate fr traumatizarea suplimentar a pielii la fiecare prelevare.
Un test patch pozitiv nseamn prezena eczemei cu spongioliza epidermului (formarea de
vezicule pline cu lichid ntre cheratinocite) la nivel macroscopic i prezena unui infiltrat celular
dermic la nivel microscopic (eozinofile, bogate n MBP-major basic protein, bazofile, limfocite).
S-a reuit clonarea de LT specifice mpotriva acarienilor din pielea persoanelor cu eczem
(produs n mod natural, nu prin aplicarea unui patch), lucru care nu este posibil i din pielea
persoanelor alergice dar care nu dezvolt eczem, ceea ce sugereaz nu doar rolul de helper, ci
238
239
240
Alte sisteme sangvine implicate n reaciile posttransfuzionale, n afar de sistemele ABO i Rh,
sunt MN, Duffy i Kell. Formarea de IgG vor induce o reacie hemolitic mai puin accentuat.
Eritrocitele transfuzate vor fi preluate de fagocitele de la nivelul ficatului i splinei, i nu vor da o
hemoliz intravascular sistemic. ns poate aprea i n acest caz necroza acut tubular
datorit eliberrii masive a componentelor eritocitare.
Pot aprea reacii postransfuzionale ndreptate i mpotriva altor componente celulare
sangvine, ns consecinele nu sunt la fel de pregnante ca n cazul eritrocitelor.
Reaciile de respingere de gref se manifest la nivelul esuturilor vascularizate direct (un
exemplu de esut care nu sufer reacii de respingere este corneea). Cele mai severe
manifestri se datoreaz tot sistemului ABO, cu activarea complementului, liza eritrocitelor,
recrutare de neutrofile i trombocite. ns frecvente sunt i manifestrile datorate
incompatibilitii MHC.
Alte exemple:
- anemia hemolitic dup ataarea de proteinele de suprafa a hematiilor a unor medicamente
(penicilin, fenacetin, chinidin etc) i iniierea producerii i cuplrii unor anticorpi de tip IgG.
HS de tip II la medicamente se poate produce n 3 modaliti diferite:
n rile dezvoltate, populaia cumulat este mai mic de 20% din populaia globului; pentru
restul populaiei (peste 80%), RAA i cardita reumatismal continu s reprezinte o problem
important. Se estimeaz c la nivel mondial exist 15,6 milioane de persoane cu RAA, n fiecare
an apar peste 450.000 de cazuri noi, iar circa 230.000 decese sunt provocate fie de RAA fie de
diferitele complicaii ale RAA. Este posibil ca numrul real de cazuri s fie mai mare.
O consecin negativ a scderii interesului fa de RAA n rile dezvoltate este reducerea
cercetrii n acest domeniu i singurele progrese din ultima jumtate de secol au fost realizate n
domeniul tratamentului medical i chirurgical al RAA.
Principala modalitate de control al RAA rmne tratamentul corect al faringitelor cu streptococ
-hemolitic de grup A i administrarea de injecii cu penicilin retard (varianta depozit cu
intervalul cel mai lung ntre 2 administrri poate fi administrat la 3-4 sptmni), de-a lungul
unei perioade lungi de timp, la persoanele cu o istorie de RAA pentru a preveni episoadele
recurente (profilaxie secundar). Ambele strategii au fost publicate nc din anii 50, n SUA. n
prezent se ncearc i obinerea unui vaccin, pentru profilaxie primar (se estimeaz c n 10-20
ani va putea fi obinut un vaccin sigur i eficient).
n lipsa unor cercetri realizate n rile dezvoltate, se ncearc obinerea unor date n statele n
care RAA are o frecven crescut. Spre exemplu, studii realizate n Mozambic, Cambodgia,
Frana i Australia, au demonstrat utilitatea ecocardiografiei n detectarea pacienilor cu boal
cardiac reumatic (copii cu vrst colar), detectndu-se astfel cu 90% mai multe cazuri dect
prin metoda clasic, de diagnostic clinic. S-a descoperit c 2-3% dintre copii cu vrst colar din
Cambodgia i Mozambic sufereau de boal cardiac reumatic, majoritatea nefiind diagnosticai
n cursul acestui studiu. Aceste date confirm faptul c RAA i cardita reumatismal au o
suficient de mare importan pentru a atrage atenia publicului internaional i a comunitilor
de cercetare.
243
afluxul de trombocite, cu generarea fenomenelor de tromboz.
Fenomenul Arthus a fost observat la iepure, cobai, oarece etc, dar i la om. Experimentul a fost
efectuat pe iepure prin injectarea de antigen netoxic (ex. albumin) de la alt specie, asociat cu
un adjuvant imun. Dup unele rapeluri, necesare uneori pentru obinerea de anticorpi circulani
IgG precipitani, reacia Arthus poate fi obinut prin injectarea subcutanat a antigenului.
Manifestrile apar dup 2 ore, atingnd maximum la 6 ore i dispar dup 24-48 ore. Constau n
edem, eritem indurat, peteii i uneori purpur necrotic sau chiar necroz. Leziunile de la locul
injectrii antigenului duc la fixarea de igG i C3b cu sediul perivascular sau n peretele vascular.
Boala serului
a) Boala serului acut. naintea erei antibioticelor, multe boli infecioase erau tratate prin
injectarea de ser de cal hiperimunizat. n 1911, von Pirquet descrie complicaiile acestei terapii
sub termenul de boal seric (febr, artralgii, vasculit cutanat), survenit la unii bolnavi dup
8-12 zile de la prima injecie.
Injectarea unic, pe cale intravenoas, a unei substane netoxice, ca serumalbumina bovin
(BSA), n cantitate mare, la animalul neimunizat (iepure), este urmat de apariia bolii serice
acute (experimental) cu 3 faze: 1. faza anterioar imunizrii (dureaz 5-8 zile. BSA marcat
radioactiv, scade, iniial brutal prin difuziune n spaiile extravasculare, apoi dup 24 de ore,
lent, corespunztor propriului catabolism); 2. faza complexelor imune (corespunde prezenei
concomitente de BSA i a anticorpilor anti-BSA); este boala seric cu glomerulonefrit. n jurul
zilei a 5-a, concentraia sangvin de BSA scade rapid. Anticorpii anti-BSA liberi nu sunt decelabili
dect dup dispariia BSA liber. Detectarea complexelor imune corespunde acestei perioade,
ca i scderea complementului seric. Manifestrile patologice nu sunt datorate anticorpilor antiBSA liberi i nici complexelor imune circulante. Ca i n reacia Arthus, leziunile sunt datorate
aciunii complementului, care este urmat de un aflux de neutrofile. La animalul fr
complement apare o simpl albuminurie fr glomerulonefrit); 3. faza de restitutio ad
integrum (nu mai exist antigen liber sau conjugat decelabil; anticorpii anti-BSA sunt crescui;
manifestrile clinice, n special glomerulonefrita, regreseaz rapid).
b) Boala seric cronic. Este dificil de reprodus la animal. Totui administrarea repetat a
antigenului (din 2 n 2 zile), permite producerea unei glomerulonefrite cronice
extramembranare proliferante.
Patologia uman
Principalele afeciuni umane sunt:
bolile comparabile cu reacia Arthus (n care antigenul induce o reacie local prin
difuziunea anticorpilor IgG precipitani); un exemplu este boala plmnului de fermier [dup
contactul n timpul zilei cu fnul mucegit (Actinomyces thermophylus), apare la nceputul nopii
(dup 6 ore) o stare de asfixie care dispare n urmtoarele ore];
Prin anamnez s-a aflat c n urm cu circa o lun, pacienta a fcut o infecie orofaringian,
pentru care a primit tetraciclin.
Examenul clinic la internare a relevat o stare general bun, absena temperaturii, greutate = 63
kg, nlime = 147 cm, TA = 140/80 mmHg, 80 bti cardiace / minut, 20 respiraii / minut,
jugulare turgescente, raluri ronflante la nivelul bazelor pulmonare, ficat palpabil la 5cm sub
rebordul costal.
Au fost nregistrate urmtoarele valori pentru analizele de laborator efectuate: hematocrit
40,2%, hemoglobin 13,5 g/dl, numr leucocite = 15.600/mm3. Examenul de urin a artat o
densitate de 1025, pH = 5, proteinurie = 4+, fr glicozurie, hematurie = 3+, hemoglobinurie =
3+, leucocite, hematii i cilindri numeroi n sedimentul urinar iar urocultura a fost negativ.
Dup 12 ore de la internare, proteinuria a crescut. Iar celelalte analize de laborator au avut
urmtoarele rezultate: proteine totale = 6,4 g%, albumin = 3,6 g%, globuline = 2,8 g%, glicemie
= 156 mg%, Na = 136 mEq/l, K = 4 mEq/l, Ca = 10 mg%, P = 8,2 mg%, acid uric = 10,6 mg%, uree
= 174 mg%, creatinin = 1,84 mg%, proteina C reactiv = 100 mg%, C3 = 8,3 mg% (Normal = 0,5 1,5 mg%), C4 = 42,9 mg% (Normal = 400-500 g/ml), ASLO = 833 UI/ml. Factorul anti-nuclear a
fost absent.
Examenul ecografic renal a fost n limite normale.
Funcia renal s-a deteriorat progresiv, i n aceste condiii, la 20 de zile de la internare, ureea a
ajuns la valoarea de 223 mg%, creatinina la valoarea de 8,3 mg%, clearance-ul creatininei la 5,34
ml/min, iar proteinuria la 3,9 g/24 h.
S-a efectuat o biopsie renal care a evideniat o glomerulonefrit proliferativ difuz
endocapilar exsudativ, cu necroz tubular acut (25% proliferri celulare). La
imunofluorescen s-au observat depozite granulare difuze de C3 n capilare i mezangiul
arteriolelor. Prin ME s-au observat depozite voluminoase mezangiale i subepiteliale.
n acest context s-a pus diagnosticul de glomerulonefrit acut post-infecioas.
Pacienta a primit un tratament n urma cruia funcia renal s-a ameliorat progresiv, iar la 6 zile
ureea a ajuns la valoarea de 122 mg%, creatinina = 2,85 mg% i clearance-ul creatininei = 14
ml/min, moment n care a fost externat (la cerere).
Dup aproximativ dou sptmni, pacienta a revenit, iar la acel moment valoarea diurezei era
sczut, prezenta proteinurie = 9,2 g/24 h, uree = 180 mg%, creatinin = 3,17 mg, clearance-ul
creatininei = 9 ml/min; din punct de vedere clinic pacienta era dispneic i prezenta
fatigabilitate intens.
A doua biopsie a demonstrat nrutirea tabloului anterior, cu 80% proliferri celulare i 42%
scleroz glomerular i necroz fibrinoid pe arterele mici, cu depozite de C1q, C3, IgG i fibrin.
Pacienta a evoluat foarte rapid ctre IRA. Dup 3 sptmni s-a nceput dializa. Dup 9
sptmni, a prezentat erizipel la membrul inferior drept i oc septic, urmat de deces.
d). Boala seric se caracterizeaz prin febr, artralgii, vasculit cutanat survenit imediat dup
injectarea de ser de cal hiperimunizat
ntrebarea 2
Care dintre urmtoarele nu este faz a bolii serice acute?
a). faza leziunilor vasculare
b). faza anterioar imunizrii
c). faza de restitutio ad integrum
d). faza complexelor imune
ntrebarea 3
Urmtoarea afirmaie leziunile sunt datorate aciunii complementului, care este urmat de un
aflux de neutrofile este valabil:
a). pentru reacia Arthus
b). pentru boala serului
c). att pentru reacia Arthus ct i pentru boala serului
d). pentru nici una dintre ele.
ntrebarea 4
Printre principalele afeciuni umane datorate HS de tip III nu se numr:
a). boala plmnului de fermier
b). lupusul eritematos diseminat
c). cardita reumatismal
d). glomerulonefritele i periarteritele poststreptococice.
ntrebarea 5
Depunerea complexelor imune este dependent de:
a). permeabilitatea presional
b). regimul presional crescut
c). prezena turbulenelor
d). nici una dintre meniunile de mai sus
e). primele 3 afirmaii sunt corecte.
72 ore, asigurnd o bun iluminare a zonei examinate (de preferat lumina natural). Se
identific existena unei eventuale arii intens eritemato-violacee, circumscriind urma nepturii
dermice. Apoi se apreciaz tactil (prin repetate micri ntr-un sens i altul deasupra zonei de
reacie) cu pulpa inelarului, limitele unei zone de induraie (perceput ca fiind reliefat) i care
corespunde histopatologic infiltraiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentnd
rspunsul imun fa de antigenul injectat. Se msoar i se nregistreaz diametrul maxim al
zonei de infiltraie (a se vedea i anexa nr. 3). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermic de
tuberculin se rezolv n mod normal n 5-7 zile; persistena acestora face ca leziunea s se
transforme dintr-una tuberculinic ntr-una granulomatoas.
- Hipersensibilitatea granulomatoas
Este o form mai grav de hipersensibilitate (ntrziat) de tip IV care survine atunci cnd
antigenul persist i nu poate fi eliminat. Se caracterizeaz printr-o acumulare i o proliferare de
macrofage, care stau la originea granulomului care apare la 21-28 zile dup sensibilizare i
poate s persiste mai multe sptmni. Hipersensibilitatea granulomatoas poate succeda
diferite hipersensibiliti ntrziate precedente, n general dup o perioad de 3 - 4 sptmni.
Elementul distinctiv al hipersensibilitii granulomatoase este formarea de celule epiteloide,
celulele derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii reticulului
endoplasmatic, cu rolul lor de a ntreine inflamaia prin secreia continu de TNF. Persoanele
cu deficit de IFN nu dezvolt granuloame, ns nici nu se apr eficient mpotriva tuberculozei,
leprei, leishmaniozei, schistosomiazei etc. Prin fuziunea celulelor epiteloide rezult celule
gigante. Mai sunt denumite i celule Langhans. Atenie, sunt diferite de celulele
Langerhans! Aceste celule gigante au mai muli nuclei, ns periferici, reticulul endoplasmic este
puin dezvoltat, iar mitocondriile i lizozomii sunt n degradare. Se pare ca aceste celule
Langhans ar reprezenta etapa final din diferenierea macrofagelor.
Reaciile de hipersensibilitate de tip IV observate n patologia uman pot fi observate n trei
grupe principale de afeciuni:
1. Eczema de contact care poate aprea datorit bijuteriilor care conin nichel, produselor din
piele de animal, produselor cu sruri de crom, cremelor solare, compuilor chimici de cauciuc,
produselor farmaceutice (penicilin, streptomicin, neomicin) etc;
2. Maladii infecioase n care agenii patogeni se dezvolt intracelular (tuberculoz, lepr,
leishmanioz, listerioz, micoze profunde etc);
n cazul M. tuberculosis, leziunea granulomatoas conine pe lng macrofage, celule epiteloide,
celule gigante i LT dispuse centrifug, i o zon de necroz central, un fel de puroi numit
cazeum. n jurul ntregului ansamblu se afl o zon de fibroz i o cantitate crescut de colagen.
n cazul M. leprae, reacia granulomatoas se numete reacia Mitsuda.
Apariia de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoz unei alte
persoane cu sarcoidoz, constituie pozitivarea testului Kweim.
3. Alte maladii (sarcoidoz ciroz biliar primitiv, hepatitele cronice virale B i C, SIDA, infecia
HIV, poliartrita reumatoid, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).
Cazul prezentat este cel al unui pacient de sex masculin, n vrst de 53 de ani, internat pentru
slbiciune muscular la nivelul membrelor inferioare, cu deficit proprioceptiv. Investigaiile de
laborator au fost n limite normale, iar testul HIV a fost negativ. Examenul tomografic (CT)
cranian a revelat o leziune masiv n lobul parietofrontal drept, cu zone omogene perilezionale
relativ sugestive pentru un proces malign (cancer) cu localizare cerebral; examenul RMN a
confirmat existena i dimensiunile leziunii.
Datorit simptomatologiei i valorilor crescute ale reactanilor de faz acut, s-a nceput terapia
cu corticosteroizi, pacientul prezentnd o remisie a simptomelor. S-a efectuat biopsie din zona
afectat, histologic descoperindu-se leziuni foliculare cu celule epitelioide dar fr necroz. S-au
realizat frotiuri colorate Gram, Ziehl-Neelsen i PAS; nu au fost evideniate microorganisme iar
decizia a fost de a nu se trimite produsele recoltate spre laboratorul de bacteriologie.
Pentru a se elucida motivul apariiei acestei leziuni, au fost realizate i o serie de investigaii
extracerebrale (CT toraco-abdominal, lavaj bronhoalveolar i bronhoscopie) fr a se obine
date suplimentare pentru un diagnostic pozitiv.
n aceste condiii, medicul curant a pus diagnosticul de sarcoidoz localizat la nivelul SNC iar
pacientul a fost externat, continund la domiciliu tratamentul cu corticosteroizi, conform
scrisorii medicale eliberat n spital.
Dup 2 luni brbatul a fost reinternat cu deficiene motorii i febr (38,2C). S-a indicat din nou
examen CT; rezultatul nu a permis explicarea simptomatologiei. Recoltndu-se produse din mai
multe zone, examenul bacteriologic, complet, a permis punerea diagnosticului de tuberculoz
diseminat.
S-a continuat tratamentul cortizonic, dar s-a nceput tratamentul anti-tuberculos cu o asociere
de 4 medicamente (izoniazid, rifampicin, pirazinamid i etambutol).
Dup 4 luni simptomele au reaprut i s-a luat decizia interveniei chirurgicale, pentru excizia
formaiunii. Analiza anatomo-patologic a pus n eviden structura tipic pentru granulomul
tuberculos (ceea ce prin biopsia oarb efectuat cu cteva luni nainte, nu s-a reuit).
Tratamentul a continuat, dar a fost adugat amikacina, penta-terapia anti-TB realizndu-se
pentru o durat de 6 luni. Pacientul nu a prezentat reacii adverse. Dup un an, au fost scoase
din asocierea medicamentoas 3 medicamente iar pacientul a primit pentru nc 6 luni (durata
total a tratamentului anti-TB a fost de 18 luni) numai izoniazid i rifampicin.
Discuii
Tuberculoza cerebral are o rat de mortalitate care variaz ntre 5 i 60%. Tratamentul de
elecie este cel medicamentos, cu o durat de circa 18 luni, pn la dispariia leziunilor sau pn
la calcificarea acestora. O cretere paradoxal n dimensiuni a leziunii, sub tratament, poate
duce la recomandarea interveniei chirurgicale de excizie a tuberculomului, aa cum s-a
ntmplat i n aceast situaie.
251
ntrebarea 2
Alegeti dintre urmtoarele afirmaii adevrate pe cea care nu se potrivete n context (ca sens
de desfurare a reaciilor imune):
a). Ultravioletele inhib direct celulele Langerhans, care au un rol important n sensibilizare
b). Persoanele cu deficit de IFN nu dezvolt granuloame
c). Absena reaciei epidermice la contactul tegumentului cu DCNB se datoreaz unui deficit
imun celular
d). Keratinocitele exprim la suprafaa lor molecule HLA DR la 48-96 de ore dup apariia
infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica rspunsul imun al gazdei
ntrebarea 3
Alegei varianta care se potrivete pentru spaiile libere din urmtoarea afirmaie:
Intradermoreacia la .................... presupune apariia unei eventuale arii intens...................,
circumscriind urma nepturii dermice, ...................... si reliefate, care corespunde
histopatologic infiltraiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentnd rspunsul
imun fa de antigenul injectat
a). tuberculin; eritemato-violacee, indurate
b). bacil Koch; eritemato-violacee; indurate
c). tuberculin; cianotice; retractile
d). bacil Koch; cianotice; indurate
ntrebarea 4 (avei de stabilit asocierea corect)
1). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermic de tuberculin se rezolv n mod normal
n...........
2). Citirea rezultatului se face dup...........
3). Hipersensibilitatea de tip IV reprezint o reacie ntrziat, care apare la...............
a). 5-7 zile
b). 48-72 ore
c). 72 ore
Care este asocierea corect?
a). 1-a; 2-b; 3-c
b). 1-c; 2-b; 3-a
c). 1-a; 2-c; 3-b
d). 1-b; 2-a; 3-c
ntrebarea 5
Care dintre urmtoarele tipuri de HS de tip IV nu are echivalent la om?
a). Hipersensibilitatea tuberculinic
b).Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote;
c). Hipersensibilitatea de contact
d). Hipersensibilitatea granulomatoas
Boala Graves, o afeciune a glandei tiroide (gu exoftalmic, tegument cu aspect de coaj de
portocal, hipertiroidism) a fost considerat o boal autoimun, n care organismul produce
autoanticorpi anti-receptor pentru hormonul tireotrop (TSH) i autoanticorpi anti-tiroxin i
anti-tireoglobulin (mecanismul nu a fost elucidat complet).
Celulele foliculare tiroidiene (prezint pe suprafa receptori pentru TSH), sunt stimulate att
fiziologic de ctre hormonul hipozar, ct i patologic, de ctre autoanticorpii (de tip IgG) care
imit structura i funciile TSH. Aceast dubl stimulare conduce la o hipersecreie de
hormoni tiroidieni (T3 i T4), putnd provoca tireotoxicoz. Simptomele din hipertiroidism pot fi,
parial, explicate de ctre aceste mecanisme. De exemplu, exoftalmia poate fi explicat prin
faptul c att glanda tiroid i muchii externi ai globului ocular prezint un Ag comun care este
recunoscut de ctre auto-Ac; rezult un proces inflamator retroocular i protruzia globilor
oculari. Aspectul de coaj de portocal al pielii se datoreaz infiltrrii de Ac subcutanat,
determinnd un proces inflamator la acest nivel.
Miastenia gravis este o boal neuromuscular caracterizat clinic prin hipotonie muscular
intermitent (accentuat n efort, ameliorat n repaus) i oboseal muscular. Mecanismul de
producere este autoimun, prin blocarea receptorilor de tip N (nicotinic) ai acetilcolinei de ctre
auto-Ac circulani, care ajung la nivelul jonciunii musculare post-sinaptice
253
254
Fiecare determinant antigenic poate avea o structur liniar lucru posibil pentru orice tip de
molecul: protein, carbohidrat, lipid, acid nucleic iar n cazul proteinelor, n plus fa de
secvena liniar, un epitop poate fi determinat de conformaia proteinei structura teriar.
Astfel se definesc dou tipuri de epitopi: liniari i conformaionali.
Pe o protein se pot gsi ambele tipuri de epitopi, crescnd astfel ansele ca aceasta s
interacioneze cu paratopul specific.
Pe de alt parte, secvenele de aminoacizi cunoscute de anticorpi pot fi ascunse n cadrul
proteinei, reacia Ag-Ac neputnd avea loc.
Aranjamentul spaial al epitopilor pe o protein poate influena modul de legare a Ac. Astfel c
atunci cnd determinanii antigenici se situeaz la o distan net unul fa de cellalt, anticorpii
se pot lega fr s se suprapun. Cnd epitopii sunt foarte apropiai, ntre anticorpii specifici
apar restricii de natur steric, ajungnd s se suprapun.
Legarea unui anticorp de epitop poate conduce, n cazuri mai rare, la modificarea
conformaional a unui alt epitop, cu consecine pozitive sau negative asupra reaciei Ag-Ac.
Acest efect se numete efect alosteric, iar mecanismul este asemntor celui asociat enzimelor
alosterice la care centrul activ se poate modifica dup ce enzima a interacionat cu un cofactor
activator sau inhibitor.
Interaciunea dintre epitop i paratop este definit de 2 parametri (afinitatea i aviditatea
anticorpilor). (Figura nr. 2)
Afinitatea msoar fora de legare dintre epitop i paratop. Afinitatea este rezultanta
forelor de atracie i de respingere care mediaz interaciunea celor doi reactani. O
interaciune cu afinitate nalt presupune structuri complementare perfecte, n timp ce
complementaritatea imperfect a gruprilor reactante determin o afinitate sczut, deoarece
forele de atracie sunt active numai pe distane foarte mici i sunt diminuate de forele de
respingere. Afinitatea anticorpilor se poate msura prin dializ la echilibru. Afinitatea reprezint
caracteristica unei singure perechi Ag-Ac i este definit printr-o constant, (Kd), care relev ct
este de uor s despari un complex Ag-Ac n componentele sale. Cnd Kd este sczut, afinitatea
este crescut. n serul uman, anticorpii au diferite afniti fa de antigene, lucru determinat n
principal de secvenele din CDR.
Aviditatea este un parametru al interaciunii Ag-Ac care rezult din multivalena Ag. Cele
mai multe Ag posed mai mult dect un epitop. De exemplu, bacteriile, polizaharidele etc, au pe
suprafa un numr mare de epitopi repetitivi (antigene multivalente). Ag proteice au epitopi
multipli, dar diferii. Antigenele multivalente leag un numr echivalent de molecule de
anticorpi. Energia total de legare a epitopilor multipli ai unui Ag, cu paratopii specifici este mult
superioar n comparaie cu energia separat a fiecrei interaciuni dintre epitop i paratop.
Aviditatea caracterizeaz energia medie de legare a unui Ag multivalent cu Ac specifici i
msoar fora rezultant a afinitii dintre epitopii multipli ai unui Ag i paratopii
complementari. Complexele Ag-Ac formate de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea
lor fiind dificil, deoarece este necesar ruperea tuturor legturilor existente. O molecul
pentameric de IgM care are afinitate sczut fa de un antigen multivalent, poate s se lege
ferm de Ag, reacia avnd aviditate crescut datorit nsumrii interaciunilor de joas afinitate
dintre fiecare epitop i paratop.
Spre exemplu, lund n considerare ceea ce se ntmpl n cursul RIP i RIS:
Anticorpii din clasa IgM, care apar n RIP au afinitate mare i aviditate mic pentru Ag (se
cupleaz uor cu epitopul, dar legtura dureaz puin);
Anticorpii din clasa IgG, care apar n RIS au afinitate mic, dar aviditate mare pentru Ag (i
legturile sunt mult mai stabile).
n anumite cazuri pot avea loc reacii ncruciate; un Ag reacioneaz cu un Ac care a fost
sintetizat fa de un alt Ag (aceste reacii pot aprea de ex. datorit faptului c anumite Ag
posed anumite grupri determinante comune). Spre exemplu, serul imun anti-polizaharid
capsular de Streptococcus pneumoniae aglutineaz eritrocitele umane de grup A (cu
specificitate antigenic conferit de N-acetil-galactozamin), iar serul imun anti-Escherichia coli
aglutineaz eritrocitele umane de grup B (cu specificitate antigenic conferit de galactoz).
Persoanele alergice la diferite mncruri sau substane, pot dezvolta foarte uor alte stri de
hipersensibilitate la structuri asemntoare.. De exemplu un individ alergic la alune, poate s
dezvolte alergie i fa de soia, mazre sau alte semine.
n cazul unora dintre tipurilor de reacii care vor fi discutate n capitolele urmtoare,
interaciunea primar nu devine vizibil (complexele Ag-Ac sunt de dimensiuni mici, solubile i
se pot desprinde uor). In vivo aceste interaciuni sunt spre exemplu necesare i suficiente n
vederea neutralizrii unor exotoxine circulante (difteric, botulinic etc), pentru inhibarea
activitii unor bacterii sau virusuri, sau n declanarea unor reacii de hipersensibilitate (ex. n
reacia de HS de tip I).
Interaciunile teriare definesc manifestrile in vivo ale reaciilor Ag-Ac i depind n special
de anumite variabile care sunt caracteristice gazdei. Interaciunile teriare pot conduce la un
rezultat pozitiv (protecia gazdei) sau negativ (degradare tisular).
reacii de precipitare
o pot avea loc n gel (imunodifuzia radial simpl Mancini, dubla difuzie Ouchterlony etc) sau
o pot avea loc n mediu lichid (reacia Ramon, Ascoli etc.)
reacii de aglutinare
256
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
infecie streptococic, uor de tratat cu penicilin. Aceast abordare ar fi ideal pentru a reduce
administrarea abuziv de antibiotice cu spectru larg, fiind nevoie doar de un test de laborator
simplu i sensibil.
258
1. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai, 2007, Cellular and Molecular Immunology, 3rd
edition, 6, 143-161
2. Jawetz, Melnick, Adelberg, 2007, Medical Microbiology, 24th edition, II-8, 128-137
3. Kayser, Bienz, Eckert, Zinkernagel, 2005, Medical Microbiology, 121-132
4. Lee Goldman, Dennis Ausiello, 2008, Cecil Medicine, 3rd edition, Section VII, 249-270
5. Strohl, Rouse, Fisher, 2001, Lippincott's Illustrated Reviews: Microbiology, 79-101, 437-455
6. Ilker Ukay, Tristan Ferry, Richard Stern, Juan Ambrosioni, Axel Gamulin, Diego Andrey,
Marina Djordjevic, Louis Bernard, Pierre Hoffmeyer, Daniel Lew; Use of serum antistreptolysin O
titers in the microbial diagnosis of orthopedic infections; International Journal of Infectious
Diseases, Volume 13, Issue 4 , Pages 421-424, July 2009
7. http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/ab-ag-rx.htm - Immunoglobulins-Antigen-Antibody
Reactions, Dr Gene Mayer
259
Difuzia dubl
o metoda Elek,
o difuzia dubl radial (Ouchterlony)
C. Reacii de precipitare n care difuzia n gel este combinat cu migrarea n cmp electric
Imunoelectroforeza
Contraimunoelectroforeza
Electroimunodifuzia.
20. 2. 1. Reacii de precipitare n mediu lichid
Au la baz unirea Ag cu Ac n mediul lichid, formndu-se complexe Ag-Ac, care vor precipita
atunci cnd Ag i Ac se gsesc n anumite proporii.
20. 2. 1. 1. Reacii de precipitare n amestec
260
Reacia de precipitare ntre Ag i Ac se poate cuantifica i este foarte util pentru a demonstra
prezena i respectiv absena precipitatului n funcie de concentraiile relative de Ag i Ac. Spre
exemplu, pentru titrarea toxinei difterice (metoda Ramon) se pun n contact, n amestec n
tuburi, cantiti egale din componenta care trebuie titrat (toxina difteric, Ag) cu cantiti
variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Cantitatea maxim de precipitat se gsete n tubul
unde exist raportul de echivalen. Pentru sistemul toxin difteric - anticorpi anti-toxin
difteric (ca i n cazul sistemului toxin tetanic - anticorpi anti-toxin tetanic), raportul de
echivalen se suprapune peste proporia optim, astfel nct se poate observa relativ uor
tubul n care apare cantitatea cea mai important de precipitat. Cunoscnd titrul anticorpilor, se
afl imediat titrul toxinei (1 Lf = 1 limes floculans = cantitatea de toxin care se combin cu o
unitate de antitoxin = 1 UA = 1 unitate antitoxic). Dac spre exemplu precipitarea maxim
apare n tubul n care titrul anticorpilor este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf.
n mod asemntor, prin metoda Dean i Web se poate determina titrul anticorpilor anti-toxici,
cunoscnd titrul toxinei.
20. 2. 1. 2. Reacii de precipitare n inel
Reacia de precipitare n inel, const n punerea n contact a Ag i Ac astfel nct s nu se
amestece; reacia care apare la interfaa dintre Ag i Ac se concretizeaz printr-un inel de
precipitare albicios. Se utilizeaz pentru identificarea originii petelor de snge (reacia Uhlenhut,
n medicina legal) i pentru identificarea provenienei unor preparate pe baz de carne (n
industria alimentar).
Demonstrativ, n cursul lucrrilor practice, reacia de precipitare n inel (reacia Ascoli) se poate
utiliza pentru identificarea prezenei antigenului crbunos (Ag obinut de la Bacillus anthracis).
Istoric, soluia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. splin) recoltate de la un
animal care a decedat i pentru care se suspecta c decesul a fost produs de o infecie
generalizat cu Bacillus anthracis. Fragmentul de organ se mojareaz n soluie de clorur de
sodiu steril, adugndu-se ulterior cteva picturi de acid acetic, apoi se meninea la
temperatura de fierbere timp de 5-10 minute. Dup decantarea i alcalinizarea cu NaOH, urma
filtrarea i rezulta soluia antigenic. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru
reacie i 2 tuburi martor. n primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticrbunos i 0,5 ml
soluie salin fiziologic iar n al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal i 0,5 ml
soluie de antigen. n ceea ce privete tubul de reacie trebuie s pipetm nti 0,5 ml din serul
anticrbunos, urmnd ca soluia de antigen (n cantitate de 0,5 ml) s fie pipetat foarte lent,
eventual prin scurgere pictur cu pictur pe peretele interior al tubului, n aa fel nct cele
2 soluii s nu se amestece. n cazul reaciei pozitive (prezena Ag crbunos n soluia
antigenic), dup circa 5 minute, la interfaa dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare.
20. 2. 1. 3. Reacia de precipitare n tub capilar a fost utilizat pentru evidenierea prezenei
proteinei C reactive (CRP).
20. 2. 1. 4. Dozajul nefelometric: n prezena unei cantiti constante de Ag sau Ac, se formeaz
complexe Ag-Ac care modific intensitatea i dispersia luminii direct proporional cu
concentraia de Ag sau Ac (principiul de msurare este proporionalitatea dintre cantitatea de
complex antigen-anticorp format i lumina mprtiat). Cu ajutorul unui nefelometru, care
utilizeaz fascicule luminoase monocromatice intense i a unei msurri a precipitatului n
mediu lichid prin difracie de raze luminoase, este posibil dozarea uoar, reproductibil a
antigenului sau a anticorpilor, folosind o curb de etalonare. Nefelometria se utilizeaz curent i
determin cantitativ proteine specifice din ser i urin (IgG, IgA, IgM, CRP, haptoglobin,
orosomucoid, fibrinogen, C3, C4, prealbumin, alfa1-antitripsin etc).
20. 2. 2. Reacii de precipitare n mediu gelifiat
Utilizarea gelozei, n care pot s migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumit concentraie de
agar n soluie de tampon veronal, n aa fel nct porii gelului s permit migrarea), va duce la
vizualizarea reaciei Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare.
20. 2. 2. 1. Imunodifuzia radial simpl (IDRS Mancini)
261
Imunodifuzia radial simpl (Mancini) se bazeaz pe difuzia spontan i radial a Ag din proba
de cercetat, ntr-un gel care conine o cantitate constant de anticorpi, determinnd apariia
unui cerc de precipitare al crui diametru este direct proporional cu concentraia de antigen
din prob. Pentru a obine un cerc de precipitare de mrime convenabil, concentraia Ac
nglobai n gel trebuie s fie aleas n funcie de titrul acestora i de concentraia Ag care
urmeaz a fi testat. Metoda permite determinareacantitativ a imunoglobulinelor (IgG, IgM,
IgA), fraciunii C3 a complementului, alfa1-antitripsinei, siderofilinei etc.
Sunt necesare plcue (de ex. cu diametrul de 5 cm) n care se toarn un gel care include Ac fa
de structura a crei concentraie dorim s o determinm. Exist un cod al culorilor i spre
exemplu, plcuele care vor fi utilizate pentru determinarea concentraiei de IgG au culoare
roie, pentru IgA culoarea este albastr, pentru siderofilin culoarea este portocalie etc. n gel
sunt perforate mici godeuri (3 mm diametru). Sunt necesare seruri de cercetat i un ser de
referin n care se cunoate concentraia diferitelor componente (spre ex. cte 100 UI / ml
pentru fiecare dintre cele 3 imunoglobuline). nainte de pipetarea serurilor n godeuri se
realizeaz diluarea acestora, diluia fiind pentru IgG, IgA i siderofilin i respectiv pentru
IgM, complement C3 i alfa1-antitripsin. Diluia serului de referin se face n funcie de
proteina care urmeaz a fi determinat. Cantitatea de ser introdus n fiecare godeu este de 5
ml (un godeu pentru serul de referin i restul pentru serurile de cercetat).
Dup 10 minute de meninere a plcuei pe masa de lucru aceasta se incubeaz la 37C, cu
stratul de gel poziionat n sus, timp de 48 ore pentru IgA i IgM i respectiv 24 de ore pentru
celelalte componente. Citirea se realizeaz cu ajutorul unei rigle gradate, din plastic, o rigl
special pentru aceast analiz (demonstrat n cursul lucrrilor practice). Se va msura iniial
diametrul cercului de precipitare din jurul godeului n care se afl serul de referin iar rezultatul
obinut trebuie s corespund ateptrilor (de ex. 6 mm pentru IgG care a fost diluat i astfel
are concentraia de 25 UI / ml). n cazul c rezultatul este cel ateptat, se poate face direct
citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurile de cercetat; n caz contrar este
necesar o corecie (dac spre exemplu diametrul este 6,5 mm n loc de 6 mm, din valoarea
obinut pentru serurile de cercetat se scad 0,5 mm). Dup citirea diametrelor, se compar
rezultatele cu cele puse la dispoziie n tabele iar cifra obinut se nmulete cu diluia probei
(spre ex. dac obinem o valoare de 50 UI / ml pentru IgG, vom nmuli cu 4 pentru a obine
rezultatul real).
20. 2. 2. 2. Imunodifuzia dubl radial (Ouchterlony)
Imunodifuzia dubl se bazeaz pe difuzia Ag i Ac (unul spre cellalt) ntr-un gel. Deoarece
mrimea moleculelor de Ag i Ac este mai mic dect diametrul porilor gelului, iar distana
parcurs de reactant ntr-un anumit timp este direct proporional cu gradientul concentraiei
sale i invers proporional cu greutatea sa molecular, migrarea reactanilor unul spre cellalt
determin formarea unor linii de precipitare la locul de ntlnire Ag-Ac. n gelul transparent vor
aprea linii opace, numrul lor corespunznd numrului sistemelor Ag-Ac studiate.
Metoda certific prezena sau absena proteinei cercetate. Se pot evidenia alfa-fetoproteina,
proteina C reactiv, beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa i lambda, produi
de degradare ai fibrinogenului (PDF) etc. n micologie, prin imunodifuzie se poate identifica
prezena exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis,
Coccidioides immitis etc) sau prezena Ac fa de Ag fungice, spre exemplu n diagnosticul
serologic al unei aspergiloze invazive. Aceast metod este nc frecvent utilizat pentru
determinarea specificitii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi n patologia uman.
Sunt necesare lame de microscop pe care se toarn un gel de agar 1%, lama putnd fi folosit
pe parcursul unei zile (dac acest lucru nu se poate ndeplini, lama trebuie pstrat n camer
umed, la temperatura frigiderului, pentru maxim o sptmn). n gelul de pe lam se
perforeaz 3 grupe de godeuri, cte 7 godeuri n fiecare grup (1 godeu central i 6 godeuri
periferice, fiecare cu diametrul de 3 mm). Dac spre exemplu dorim s determinm prezena
proteinei C reactiv (CRP) n seruri de cercetat, avem nevoie de un ser cu Ac anti-CRP, seruri de
cercetat i un ser de referin care conine CRP. Numerotnd godeurile periferice, pipetm Ac
262
cellalt este amplificat de cmpul electric. Reacia (apariia unei linii de precipitare ntre
godeuri, n cazul n care n godeul catodic se gsete Ag presupus) poate fi citit dup numai 3090 minute n loc de 24 de ore aa cum se ntmpl n dubla difuzie Ouchterlony. Metoda a fost
utilizat din punct de vedere istoric pentru identificarea prezenei Ag HBs. Se poate utiliza
pentru identificarea antigenelor capsulare n lichidul cefalorahidian la pacieni cu meningit
acut (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae).
20. 2. 3. 4. Electroimunodifuzia
Electroimunodifuzia are la baz electroforeza probelor care conin proteina-antigen, ntr-un
strat de gel, care conine o cantitate constant de anticorpi monospecifici (anti-protein
antigen), rezultnd zone de precipitare n form de rachet sau conuri, a cror arie este direct
proporional cu concentraia antigenului. Metoda are o sensibilitate mai mare dect IDRS.
acestora, dispozitivul este centrifugat. n cazul unei reacii pozitive complexul Ag-Ac se va putea
vizualiza la nivelul coloanei, n timp ce n cazul unei reacii negative, hematiile se depun n
poriunea inferioar a coloanei.
20. 4. 5. Aglutinarea mediat de Ac anti-imunoglobuline
Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule ncrcate cu Ac i vor duce la apariia unor
aglutinate (prin apariia complexului imun). Se utilizeaz spre exemplu n decelarea factorului
reumatoid (tehnica Waaler-Rose).
toate direciile, pentru a favoriza contactul dintre cei 2 reactani i unirea complexelor Ag-Ac
mici, solubile, pentru a forma reele de complexe Ag-Ac. n cazul reaciei pozitive
(coresponden ntre Ac cunoscui i Ag pe care dorim s l identificm) pictura se limpezete
i apar grunji de aglutinare. Este indicat s citim reacia pe fond negru. De cele mai multe ori
citirea se face cu ochiul liber ns n cazul unor aglutinate de dimensiuni foarte mici poate fi
necesar s folosim o lup, un microscop sau un aglutinoscop. Pentru identificarea diferitelor
microorganisme exist scheme care orienteaz etapele de urmat (tabelele i schemele
respective se livreaz de ctre productori mpreun cu serurile cu Ac specifici). Lamele pe care
se fac reaciile de aglutinare, dup terminarea reaciilor se introduc n amestecul dezinfectant.
n cadrul lucrrilor practice vor fi discutate aglutinrile pentru identificarea E. coli, Salmonella
spp. pn la nivel de specie (conform clasificrii Kauffmann-White) i respectiv a grupurilor de
Shigella spp. Tot prin aglutinare direct se mai pot identifica tulpini de Vibrio cholerae,
Haemophilus influenzae tip b, tulpini de Brucella spp., tulpini de E. coli entero-patogen, iar n
cazul leptospirelor i unor rickettsii apariia aglutinrii trebuie verificat cu ajutorul
microscopului.
Reacii de aglutinare indirect se pot utiliza pentru detectarea n p.p. a streptococilor de grup A
sau B, pneumococilor, meningococilor, E. coli tip capsular K1, H. influenzae tip capsular b,
pentru detectarea unor enterotoxine (stafilococice, clostridiene etc), pentru detectarea unor
fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) sau a unor virusuri. Tot prin
tehnica de aglutinare indirect se pot identifica exotoxine n filtratul de cultur, streptococii de
grup A-D, E. coli O:157, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes etc.
20. 5. 1. 2. Aglutinarea n tuburi
Tehnica de aglutinare n tuburi se poate folosi pentru confirmarea unui rezultat pozitiv la
aglutinarea pe lam sau atunci cnd rezultatul unei aglutinri pe lam nu este suficient de clar.
Vom avea la dispoziie cultura pur de identificat care se va prepara difereniat n funcie de
tipul de Ag pe care dorim s-l identificm. Spre exemplu, dac ncercm s identificm Ag de tip
O iar bacteria ar putea s prezinte i Ag H sau Ag K (care ar putea inhiba aglutinarea cu Ag O)
cultura se va menine 1-2 ore la 100C pentru inactivarea Ag de nveli, dup care se va trece la
realizarea aglutinrii n tuburi (o procedur asemntoare poate fi necesar i n cazul tehnicii
de aglutinare pe lam). Vom utiliza un ir de eprubete n care vom introduce Ac cunoscui, care
se vor dilua succesiv, binar, cu soluie salin fiziologic. n tuburile respective vom aduga o
cantitate echivalent de suspensie Ag (spre ex., la 0,5 ml Ac vom aduga 0,5 ml suspensie Ag).
Incubarea se va face difereniat, n funcie de tipul de Ag pe care dorim s-l identificm (ex. 20
ore la 52C pentru identificarea Ag O).
Reacia este pozitiv n cazul apariiei aglutinatelor (grunjoase - n cazul prezenei Ag O,
floconoase - n cazul prezenei Ag H etc). Reacia de aglutinare n tuburi permite i verificarea
titrului la care are loc formarea complexelor Ag-Ac.
cercetat. Cu colul unei alte lame amestecm i omogenizm cei 2 reactani. Prin micri de
nclinare a lamei n toate direciile facilitm formarea complexelor Ag-Ac, n cazul n care n serul
de pacient sunt prezeni Ac anti-Brucella spp. Reacia este pozitiv n cazul n care se remarc
prezena aglutinatelor. Chiar i n perioada n care aceast se utiliza n diagnostic, o reacie
pozitiv pe lam trebuia s fie confirmat prin aglutinare n tuburi.
Tehnica de aglutinare indirect poate fi utilizat n diagnosticul serologic al infeciilor produse
de Helicobacter pylori, Treponema pallidum (hemaglutinare pasiv) etc.
20. 5. 2. 2. Aglutinarea n tuburi
Tehnica de aglutinare n tuburi se poate folosi n diagnosticul serologic al brucelozei (reacia
Wright), diagnosticul serologic al infeciilor produse de Cryptococcus neoformans, diagnosticul
serologic al febrei tifoide etc. Denumirea de reacie Widal pentru diagnosticul serologic al febrei
tifoide a intrat n istoria medicinii.
Lund n discuie diagnosticul serologic al febrelor enterice, inclusiv febra tifoid, sunt necesare
urmtoarele: seruri recoltate (n dinamic) de la pacienii la care se suspicioneaz acest
diagnostic, tampon fosfat salin, baie de ap cu temperatur reglabil, Ag cunoscute (Ag O i Ag
H). Se va lucra cu 2 rnduri de eprubete, un rnd pentru detectarea prezenei i titrului Ac antiO, al doilea pentru detectarea prezenei i titrului Ac anti-H (pentru persoanele n convalescen
sau n cazul suspicionrii strii de purttor vom ncerca s identificm n serul de cercetat Ac i
titrul Ac anti-Vi, de ex. prin hemaglutinare pasiv).
Serul de cercetat, pentru fiecare rnd de tuburi, va fi diluat cu tampon fosfat salin, n diluii
binare. Dac amestecul de ser de cercetat i diluant va fi n cantitate de 0,5 ml, vom aduga o
cantitate similar de Ag, cte 0,5 ml Ag O n primul rnd de tuburi i respectiv cte 0,5 ml Ag H
n al doilea rnd de tuburi. Vom proceda n aa fel nct s obinem n primul tub o diluie de
1/20, n al doilea tub 1/40 etc. Un tub va conine doar un amestec de tampon fosfat salin i
soluie Ag (tub martor). Dup ce omogenizm coninutul tuburilor, vom incuba tuburile cu Ag O
timp de 20 ore la 52C iar tuburile cu Ag H vor fi incubate timp de 2 ore la 52C urmat de 10
minute la temperatura camerei.
Citirea se va realiza dup incubare, comparnd rezultatul din fiecare tub cu martorul pentru Ag.
Pentru evidenierea reaciei vom agita uor tuburile. Aglutinarea H difer de aglutinarea O.
Aglutinatul O este mai dens, mai grunjos, n timp ce aglutinatul H este mai floconos i uor de
disociat prin agitare. Ultimul tub care mai prezint aglutinare vizibil permite stabilirea titrului
reaciei. n capitolul 38 vom relua acest tip de diagnostic i vom discuta modalitile de
interpretare.
267
Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pallidum, Leptospira spp.,
Borrelia spp., Brucella spp., diferite virusuri etc.
n scopul creterii sensibilitii i specificitii se aleg proprietile Ag cunoscut, o anumit
temperatur de incubare (de ex. 4C n loc de 37C n RFC Kolmer) etc. Ac fixatori de C' apar
precoce n cursul bolii astfel nct identificarea prezenei lor poate semnifica o infecie acut sau
recent.
270
diagnosticul serologic
o reacia ASLO (vezi i capitolul 28);
intrat IDR Dick, care permite testarea susceptibilitii fa de scarlatin (toxina este elaborat de
ctre streptococul de grup A lizogenizat) i respectiv IDR Schick, care permite testarea
susceptibilitii fa de difterie (toxina este elaborat de ctre bacilul difteric lizogenizat).
o Ambele IDR se realizeaz similar din punct de vedere tehnic;
o Spre ex. n cazul IDR Schick se injecteaz n treimea medie a antebraului, strict intradermic o
cantitate de 0,1 ml toxin difteric diluat corespunztor. n cazul n care n sngele persoanei
testate se gsete o cantitate de Ac anti-toxin mai mare de 0,03 UAI / ml, toxina inoculat va fi
neutralizat i nu va aprea nici o modificare la locul inoculrii (lipsa eritemului semnific faptul
c persoana testat nu este susceptibil s fac difterie, n cazul n care se infecteaz cu un bacil
difteric toxigen). n cazul n care persoana respectiv nu prezint Ac anti-toxin difteric, Ag
inoculat va conduce la apariia unui eritem la locul de inoculare.
22. 2. 3. Terapia sau profilaxia specific (imunoterapie pasiv)
Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obinute de la persoane imunizate
(natural sau artificial) fa de o anumit maladie infecioas, de ex. n imunoterapia infeciei cu
Clostridium tetani (tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.000 UAI.
Administrarea de seruri imune heterologe, obinute prin hiperimunizarea cailor, n
tratamentul tetanosului, difteriei, botulismului etc.
Terapia bolilor n care mecanismul patogenic implic exotoxine trebuie instituit ct mai rapid,
deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci cnd se gsesc n circulaie. Pe de alt
parte, administrarea de ser heterolog trebuie realizat numai n caz de necesitate (datorit strii
de hipersensibilitate care ar putea fi indus i care ar duce la reacii adverse).
reacii de precipitare
reacii de aglutinare
reacii de seroneutralizare.
Dac n cazul primelor 2 tipuri de reacii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul liber, cu
ajutorul unei lupe etc) n cazul RFC i RSN este necesar utilizarea unor sisteme indicator. n
continuare vom discuta despre reaciile Ag-Ac n care pentru interpretare este necesar
marcarea reactanilor, ceea ce se poate face:
- izotopic (radio immunoassay, RIA);
- enzimatic (enzyme-linked immunoassay, ELISA);
- fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA);
- chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc.
n prezent aceste metode sunt extrem de folosite avnd avantajul unei mari sensibiliti, sunt
automatizate i adaptabile la testri utile n toate disciplinele bio-medicale.
273
24. Inflamaia i procesul infecios (MI Popa, Andreea Bara, Milena Tocu)
24. 1. Inflamaia
24. 1. 1. Inflamaia este un proces fiziopatologic complex ce include: fenomene alterative,
fenomene de tip reactiv, vasculo-exudative i proliferative (este vorba despre o reacie tisular
nespecific, cu caracter de aprare local) i fenomene reparatorii. Inflamaia are drept
principal scop limitarea aciunii i eventual neutralizarea agentului agresor (indiferent de
natura acestuia). Cu alte cuvinte, discutm despre fenomenul inflamator i n cadrul unor
agresiuni microbiene (bacteriene, fungice, parazitare, virale, prionice), dar inflamaia
reprezint un concept mult mai complex (apare n mult mai multe circumstane, dect n cele
infecioase). (Figura nr. 1)
Inflamaia poate interesa esuturi, organe, sisteme sau chiar ntregul organism i are drept
semne / simptome clasice, urmtoarele: tumor (umflare, edem), rubor (eritem, nroire local),
calor(temperatur crescut n zona n care evolueaz fenomenul inflamator), dolor(durere),
nsoite sau nu de functio laesa (tulburri funcionale mai ample sau mai puin ample,
mergnd pn la impoten funcional, de ex. imposibilitatea deplasrii membrului inferior
datorit unei inflamaii la articulaia genunchiului, n cadrul unei infecii diseminate cu Neisseria
gonorrhoeae).
24. 1. 2. Exist o mare diversitate de ageni determinani ai unui proces inflamator, printre
acetia putnd fi enumerai:
- diferiii ageni fizici (radiaii, frig, cldur, curent electric, traumatisme etc.);
- microorganismele (prioni, virusuri, bacterii, fungi, parazii);
- agenii chimici exogeni, unii nc necunoscui pn n acest moment, dar exemplificarea
ncearc s dea n primul rnd sensul diversitii i s explice faptul c fenomenul inflamator
poate fi determinat de foarte multe substane dintre care vor fi enumerate doar cteva,
exogene (ex. ulei de croton, terebentin, caolin, dextran etc) i / sau endogene (uree, acizi biliari
etc.), care produc leziuni la nivelul sediului eliminrii lor din organism pe alte ci dect cele
fiziologice (de exemplu n situaia apariiei unui reflux bilio-gastric).
Indiferent de agentul determinant, n urma aciunii acestuia va putea aprea o afectare a
vaselor mici, a esutului colagen (noiune foarte important pe care o vom rentlni n cadrul
discutrii diferitelor maladii, cu sau fr o determinare precizat), a proteinelor interstiiale etc.,
rezultnd astfel eliberarea i de cele mai multe ori activarea unor mediatori i a unor enzime.
Acestea din urm pot fi considerate mecanismelele de declanare sau trigger pentru procesul
inflamator.
n rezumat, inflamaia reprezint reactivitatea diferitelor structuri ale organismului, structuri
care aparin diferitelor reele informaionale (de exemplu reeaua imun ce include organe ale
sistemului imun, celule ale sistemului imun, substane sintetizate i eliberate n cursul reaciilor
imune, inter-relaii mediate celular sau umoral etc) ce declaneaz diferite tipuri de rspunsuri
care urmresc, cel puin n stadiile iniiale, s realizeze o reechilibrare i aducere la normal, la
situaia anterioar intrrii n contact cu agentul agresor. Dintre variantele de posibile reacii
putem s amintim:
Rezultatul acestei reactiviti este reprezentat de ex. de apariia exsudatului inflamator (care
poate fi examinat prin metode de laborator).
274
Aa cum am menionat mai sus, toate aceste fenomene sunt declanate pentru neutralizarea
activitii agentului determinant (al inflamaiei). Fenomenele vasculo-exsudative, la fel ca i
exsudatul inflamator, ncearc s limiteze efectele produse de agentul pro-inflamator i s
mpiedice extinderea procesului inflamator spre zonele nvecinate sau la nivelul ntregului
organism. n cazul n care aceste activiti au succes, alte fenomene vor conduce la asanarea
focarului inflamator. Aceste fenomene, n ansamblu, pot determina:
- vindecarea anatomic n totalitate (restitutio ad integrum),
- vindecarea nsoit de cicatrizare sau
- cronicizarea inflamaiei.
Aa cum am aminitit, procesul inflamator este un proces fiziopatologic. Cel mai frecvent exist
tendina ctre vindecarea esuturilor lezate. Inflamaia devine un fenomen patologic n cazul n
care sistemele de control sunt dezorganizate sau atunci cnd procesul inflamator se
cronicizeaz.
Modificrile fiziopatologice apar independent de cauza inflamaiei sau, cu alte cuvinte,
indiferent de agentul determinant. Chiar dac acesta este reprezentat de un traumatism prin
compresiune, o neptur sau o tietur (de ex. cu un instrument chirurgical), o arsur
(indiferent de procentul de tegument afectat), de bacterii, virusuri, parazii, sau este vorba de o
necroz (mortificare) tisular care apare n cursul dezvoltrii unui neoplasm (cancer) sau n
urma apariiei metastazelor tumorii primare, n cursul procesului inflamator va rezulta sinteza i
eliberarea reactanilor de faz acut (RFA).
Diferitele particulariti structurale ale organismului gazd sau ale unui anumit esut ar putea
explica (parial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de ctre
acelai agent etiologic. Spre exemplu, Salmonella enteritidis serotipul typhimurium produce
inflamaii proliferative la nivelul sistemului limfatic i respectiv inflamaii exsudative n
parenchimul pulmonar. Mycobacterium tuberculosis, agentul etiologic al tuberculozei, produce
inflamaii alterative (la nivel pulmonar), inflamaii exsudative (la nivel pleural) sau inflamaii
proliferative (la nivel dermic).
24. 1. 3. Din punct de vedere didactic, etapele inflamaiei sunt urmtoarele:
1.Etapa de declanare, n care agentul determinant produce modificri la nivelul esutului
interstiial i n celulele parenchimatoase. Rezultatul detectabil prin metode de laborator este
eliberarea unor factori chemotactici, a unor proteaze i kinaze.
Factorii eliberai conduc la apariia rspunsului inflamator acut, respectiv:
- vasodilataie capilar (eritem, nroire),
- exsudare de proteine plasmatice (edem, umflare) i
- acumulare de leucocite PMN.
Principalele proteine care apar n aceast etap sunt componentele sistemului complement, dar
i diferite citokine. Elementele celulare importante n realizarea procesului inflamator sunt
reprezentate de sistemul monocit-macrofag (sistemul mononuclear fagocitar), colagenul
vascular i celulele endoteliale. Este de menionat i subliniat rolul important al ficatului.
Acumularea de celule inflamatorii la locul unde se afl agentul determinant este esenial n
declanarea inflamaiei. Dorim s menionm c examinarea prin metode de laborator a
prezenei acestor celule (de ex. ntr-o inflamaie de natur infecioas aprut la nivel faringian,
realizm un frotiu colorat i n primul rnd cutm s identific prezena leucocitelor PMN, astfel
avnd o informaie care susine ipoteza unei infecii bacteriene) poate fi foarte util. PMN i
macrofagele sunt atrase de moleculele chemotactice i migreaz direcionat de aceste molecule
prin procesul de diapedez, iar la locul inflamaiei fagociteaz, endociteaz, secret enzime
lizozomale i genereaz anioni superoxid. Pe de alt parte, leucocitele PMN i macrofagele
prezint receptori specifici de suprafa pentru componenta C5a a sistemului complement,
pentru CCF (crystal-induced chemotactic factor) i LTB4 (leucotriena B4), precum i pentru
peptidele din factorii chemotactici. Aceste peptide servesc cuplrii PMN-factor chemotactic i
astfel fagocitele se ndreapt spre locul unde acesta a fost produs. Ajungnd la nivelul respectiv,
275
PMN sau macrofagele i pierd configuraia rotund, devin oarecum triunghiulare, cu baza spre
factorul chemotactic. Pentru ca modificarea de form s fie posibil, are loc o rearanjare a
elementelor din citoschelet, microtubulii genereaz o polarizare fa-spate, filamentele de
actin se acumuleaz n faa i n spatele celulei. Se asigur astfel forele necesare deplasrii
(motilitatea celular depinde de polimerizarea monomerilor de actin n filamente de actin).
(Figura nr. 2)
Fagocitarea agentului determinant al procesului inflamator (de ex. o structur bacterian)
este favorizat de opsonizare. Materialul fagocitat este inactivat la nivelul fagolizozomilor
(atunci cnd acest lucru este posibil) i / sau transformat n superantigen cu rol n declanarea
unor cascade de reacii imune. Pn n acest moment, sistemul complement a reprezentat
elementul esenial, fie c a fost activat pe cale direct sau pe cale altern. Fragmentele
rezultate n cascada complementului particip la stimularea secreiei macrofagice (mediatori ai
rspunsului inflamator acut).
Activitatea leucocitelor PMN este facilitat i de prezena unei ntregi game de proteine active
de tipul moleculelor de adeziune celular (selectine, integrine, ICAM-1 (intercellular adhesion
molecule), ELAM-1 (endothelial cell leucocyte adhesion molecule), GMP-140, adezine, LECAM-1
(leucocyte endothelial cell adhesion molecule), ISCOM (immunostimulating complex), PAF, MAC
(membrane atack complex), MACIF (MAC inhibitory factor), precum i o serie de proteine
sintetizate i eliberate de ficat drept reactani de faz acut (RFA). Dintre RFA am putea
meniona: proteina C reactiv (PCR este secretat n mod predominant de ficat i esuturile
adipoase ca rspuns la stresul inflamator i este reglat, n mare parte, de interleukina-6.
Valoarea semnificativ pentru prezena inflamaiei este de 1mg/dl sau mai mult. Fiind de
ncredere i uor de dozat, este foarte utilizat n practica medical ca metod de screening i
monitorizare a inflamaiei, ns nu trebuie s uitm ca PCR poate fi crescut i n sarcin sau n
arsuri etc). (1)
Ali RFA sunt:a2-macroglobulina, a1-antitripsina, a1-antichimotripsina, fibrinogenul,
haptoglobina, hemopexina, ceruloplasmina, componenta C3 i amiloidul P seric. Am subliniat cu
caractere speciale RFA care se testeaz mai frecvent n practic, n ara noastr.
Aceste proteine de faz acut mediaz procesul inflamator, n cursul cruia se i consum.
Majoritatea sunt glicoproteine sintetizate de ficat (mici cantiti sunt sintetizate i de ctre
macrofage). Rolul RFA nu este pe deplin elucidat. Se cunoate, totui, c o serie de RFA sunt
implicai att n procesele de necrobioz ct i n cele de remaniere tisular.
Informaii cu privire la existena unui proces inflamator putem obine i verificnd valoarea
VSH.
n continuare, evoluia procesului inflamator este determinat de tipul agentului agresor,
agresivitatea acestuia i momentul declanrii conflictului imun. Acesta din urm corespunde
de regul apariiei semnelor clinice (de ex. febr).
n completare la rspunsul celular, citokinele sintetizate de ctre diferitele celule stimulate
specific, antigene, mitogeni, endotoxine etc. vor influena / stimula i activitatea celulelor
productoare de citokine, rezultnd sinteza i eliberarea de noi tipuri de citokine. Se constituie
anse de tip feed-back endocrine i autocrine, care sporesc sinteza de citokine de ctre o
singur celul, n timp ce o singur citokin poate aciona asupra mai multor celule. (Figura nr.
6)
Spre exemplu, IFN-g(sintetizat i eliberat de limfocitul T) are cel puin trei aciuni importante i
anume: deviaz sinteza la nivelul mduvei osoase hematopoietice spre linia monocitomacrofagic, activeaz exprimarea Ag HLA de clasa a II-a la nivelul membranei macrofagelor i
crete puterea de fagocitoz a sistemului MM n vederea fagocitrii att a actualelor antigene,
ct i a viitoarelor complexe imune ce se vor constitui n cursul procesului inflamator.
Aproape simultan, celulele endoteliale reacioneaz elibernd diferii produi de secreie,
precum endotelinele (ET) i EDRF (endothelium-derived relaxing factor). Jocul dintre cele dou
276
proteine vasoactive condiioneaz pentru un timp aportul local de oxigen i nivelul acidozei.
Iniial se elibereaz local factorii vasodilatatori (EDRF) i NO, care au drept scop creterea
fluxului sanguin local, cu creterea atraciei de celule ale rspunsului imun la locul impactului cu
agentul determinant al procesului inflamator. EDRF este rapid inactivat de hemoglobin i de
substane antioxidante (care apar n urma stimulrii activitii PMN dar i datorit prezenei
eritrocitelor).
Pe msur ce debitul sanguin local crete (determinat de sistemul kinin / bradikin), crete i
sinteza de EDRF (EDRF are ns o via de numai 6-10 secunde). Vasodilataia local se
dezvolt pn n momentul n care celulele endoteliale, fiind comprimate de edemul
perilezional, ncep s sintetizeze i s elibereze local endoteline (ET), n special ET1. Aceast
endotelin (care are de asemenea o via foarte scurt) induce vasoconstricie brutal i
foarte intens, tocmai pentru scderea debitului sanguin i limitarea amplitudinii rspunsului
inflamator local (endotelina este considerat cel mai puternic vasoconstrictor din organism).
Rezultatul etapei de declanare este reprezentat de rspunsul inflamator acut, manifestat prin
vasodilataie capilar (eritem, nroire), exsudarea proteinelor plasmatice (edem) i acumulare
de leucocite PMN.
2.Etapa efectoare, care la rndul ei se submparte n trei subetape:
A) Subetapa molecular, n care se activeaz:
- cascada complementului;
- sistemul de coagulare-fibrinoliz;
- diferitele ci de metabolizare ale acidului arahidonic (care provine din peretele bacterian n
urma scindrii date de fosfolipaz), respectiv: a) calea ciclooxigenazei prin care rezult
prostaciclin (PGI) care determin vasodilataie, inhib agregarea trombocitelor i aderarea
PMN, prostaglandin (ex. PGE2) i tromboxan (TxA2) care determin agregare plachetar, are
efect vasoconstrictor i de cretere a permeabilitii capilare); b) calea lipooxigenazei, care duce
la apariia leucotrienelor, de exemplu LTD4, LTG4(care determin bronhoconstricie,
vasoconstricie sistemic, vasodilataie la nivelul microcirculaiei) i c)calea epooxigenazei;
(Figura nr. 7, Cile ciclooxigenazei si liopooxigenazei)
- sistemul kinin-bradikinin;
- familia citokinelor;
- superfamilia interferonilor;
- sistemul extracelular gunoier al actinei. Actina este o protein care se gsete n cantiti
mari i este responsabil pentru motilitatea celular, schimbarea formei i mrimii celulelor
(care depinde de proprietatea monomerilor de a polimeriza). Dup apoptoz, actina eliberat
are tendina de a polimeriza, ducnd la apariia de filamente de actin n vase, cu un rezultat
catastrofal (de exemplu n ocul septic, necroza hepatic etc). Exist ns i un mecanism
homeostatic ce are la baz dou proteine plasmatice, gelsolina i proteina Gc (care sunt
depite ns din punct de vedere funcional n distrugerile masive).
B) Subetapa vascular, n care au loc modificri ale calibrului vaselor mici, ale vitezei de
circulaie a sngelui, ale permeabilitii vaselor mici din aria tisular lezat. Iniial se produce
vasoconstricie, n decurs de secunde / minute (are loc un aflux masiv de celule sanguine
proinflamatorii - neutrofile, monocite, eozinofile - sub aciunea unor mediatori solubili eliberai
din zona tisular afectat, care produc dou categorii de efecte:
a) vasculare (dilataie arteriolocapilar cu creterea numrului de capilare active, hiperemie,
stimularea expresiei pe celulele endoteliale din zon a unor receptori de adeziune intercelular
astfel nct celulele sangiune recrutate vor adera la endoteliul vascular prin cuplaj receptorial i
n final o faz de staz vascular pasiv, cu hipoxie i creterea permeabilitii vaselor mici) i
b) chemotactice (celulele proinflamatorii sunt atrase ctre esutul lezionat i activate
metabolic)..
C) Subetapa exsudativ, n care se formeaz exsudatul inflamator (plasma exsudat, bogat n
proteine i LDH) la care se adaug elementele figurate extravazate, elementele celulare
mobilizate local i produi rezultai din diferite modificri locale. Prin constituenii si celulari i
277
Febra
278
prelungit.
Febra continueste o febr ridicat n care diferena dintre temperatura matinal i cea
vesperal timp de mai multe zile nu depete 1 grad C. Ea este ntlnit n pneumonia franc
lobar, febra tifoid (n perioada de stare a bolii), tifosul exantematic, osteomielit etc.
Febra remitenteste febra ce se caracterizeaz prin aceea c diferena dintre temperatura
matinal i cea vesperal depete 1 grad C. Ea apare n septicemii, supuraii pulmonare,
tuberculoza pulmonara grav, n perioada a doua a febrei tifoide.
Febra intermitentse caracterizeaz printr-o alternan n timp de 24 de ore a temperaturii
normale cu febr mult ridicat. Cnd oscilaiile devin foarte mari (ex. 3-5 grade C pe parcursul a
24 de ore) febra foarte ridicat oscilnd cu temperatura normal sau chiar subnormal vorbim
de febr hectic. Ea apare n supuraiile pulmonare, infecii urinare i unele septicemii etc.
Febra recurentevolueaz cu febr ridicat i continu timp de 5-8 zile alternnd cu perioade
afebrile. Ea apare n limfogranulomatoza malign, tuberculoza pulmonar, infecii urinare sau
biliare, leptospiroze etc.
Febra recidivanteste o variant de febr recurent caracterizat prin faptul c ascensiunile
termice survin la intervale foarte variate i mbrac caracter de puseuri (o ntlnim n colangite,
pielite, carcinom i unele forme de tuberculoz etc.).
Febra ondulanteste caracterizat prin ascensiuni termice ce se repet periodic. Ridicarea
temperaturii este progresiv, iar defervescena este lent pn la afebrilitate sau subfebrilitate
urmat de cicluri repetate.
Febra de tip inverseste febra n care temperatura matinal este mai ridicat dect cea vesperal.
Apare n tuberculoza pulmonar grav, supuraii profunde i inflamaii cavitare etc.
Febra neregulatse refer la febra care nu poate fi ncadrat n nici unul din tipurile descrise i
care nu poate fi descris aa cum s-a menionat mai sus. (3)
Febra de origine necunoscuteste luat n consideraie atunci cnd, dup 1 sptmn de
ncercri n a pune diagnosticul i a stabili etiologia febrei (clinic, paraclinic, alte metode de
laborator), nu am reuit s identific o cauz pentru creterea temperaturii.
VSH-ul
VSH reprezint rata la care sedimenteaz hematiile dintr-o prob de snge cu anticoagulant,
ntr-o or. n mod normal hematiile dintr-o prob de snge sedimenteaz lent datorit
ncrcturii de suprafa negative a acestora, care face ca celulele adiacente s se resping cnd
distana intercelular scade sub un nivel minim. n anumite afeciuni care determin creterea
proteinelor de faz acut (alfa-globuline, fibrinogen) sau creterea valorii imunoglobulinelor,
proteinele plasmatice se ataeaz pe suprafaa hematiilor i reduc potenialul de suprafa
determinnd agregarea hematiilor i creterea sedimentrii acestora.
Care sunt recomandrile efecturii acestui test?
VSH poate fi folosit ca test screening n suspiciunea unor reacii inflamatorii, infecii, boli
autoimune, discrazii plasmocitare, dar i pentru monitorizarea evoluiei i tratamentului n
anumite boli (ex. arterit temporal, polimialgie reumatic, artrita reumatoid, reumatism
articular acut, lupus eritematos sistemic, boal Hodgkin, tuberculoz, endocardit bacterian).
De reinut: VSH nu este un test diagnostic pentru o anumit boal i nu trebuie utilizat pentru
screening-ul pacienilor asimptomatici.
Sngele se recolteaz a jeun (pe nemncate) sau postprandial (dup mas) pe anticoagulant
(vacutainer cu dop negru cu citrat de sodiu 3,8 % tamponat). Dup prinderea venei se desface
garoul pentru a nu liza hematiile. S nu uitm c o mas lipidic poate determina alterri
280
281
/ sau indirect).
Manifestri clinice
a) Infecia local, n care agenii patogeni rmn cantonai la poarta de intrare i n vecintatea
acesteia, unde se multiplic (de exemplu n furunculul stafilococic, infecia amigdalian produs
de streptococul piogen).
b) Infecia de focar este o form particular a infeciei locale. Evolueaz cronic, cu manifestri
locale minime (acestea putnd chiar lipsi), adesea ns cu tulburri la distan (subfebrilitate,
mialgii, artralgii etc.) a cror apariie nc nu a fost complet explicat.
c) Infecia regional cuprinde un teritoriu mai extins, de obicei aferent porii de intrare, prin
afectarea vaselor limfatice i a ganglionilor limfatici regionali (de exemplu, infecia tuberculoas,
cu producerea de manifestri anatomo-clinice i paraclinice relativ caracteristice).
d) Boala infecioas cu manifestri clinice la nivelul ntregului organism (sistemice), n care
germenii patogeni disemineaz pe cale circulatorie (bacteriemie) n diferite esuturi i organe, la
distan de poarta de intrare sau de focarul infecios primar. Se descriu dou forme:
- boala infecioas ciclic, cu evoluie regulat, n mai multe etape care se succed ntr-un timp
limitat, de exemplu febra tifoid produs de S. typhi.
- septicemia (conform nomenclaturii mai vechi) are evoluie clinic neregulat, de obicei foarte
grav, fiind definit prin existena unei pori de intrare, a unui focar septic (detectat sau
suspectat), bacteriemiei i a unor metastaze septice care pot deveni focare secundare; din
focarele secundare au loc descrcri secundate de germeni n circulaie.
Drept bacteriemie definim prezena pasager de germeni viabili n snge. Bacteriemia nu duce,
de regul, la apariia de metastaze septice i nici la apariia unui tablou clinic manifest.
Bacteriemii pot apare de ex. dup extracii dentare sau intervenii chirurgicale pe focare septice,
ca i n multe dintre bolile infecioase (exemplu n pneumonia cu pneumococ, meningita cu
meningococ etc; se explic astfel utilitatea recoltrii de snge pentru hemocultur, cu toate c
produsul patologic principal este reprezentat de sput n primul caz i lichid cefalorahidian n
al doilea caz).
n momentul de fa, s-a decis utilizarea noiunii de sepsis, entitate care reunete existena unui
proces infecios i respectiv existena rspunsului inflamator sistemic. Starea de sepsis include
prin definiie dou sau mai multe din urmtoarele elemente:
O problem care poate aprea este legat de tulpinile de gonococ rezistente la antibiotice i
chimioterapice, ceea ce nu a fost constatat n aceast situaie.
24. 3. 2. Antibioterapia n unele afeciuni fr etiologie microbian - o eroare discutabil?
n anumite circumstane, abilitatea de a institui antibioterapia n scop profilactic poate fi
considerat salutar. Un astfel de exemplu l constituie administrarea de antibiotice locale n
afeciunile oculare acute de natur neprecizat (infecioas sau inflamatorie) care necesit
intervenire de urgen, acest tratament salvnd, de multe ori, vederea pacientului. Totui, de
cele mai multe ori, antibioticele locale (topice) sunt folosite n scop preventiv sau profilactic n
terapia ocular primar, fr ca acest lucru s fie necesar.
Este demonstrat statistic faptul c aproape toate keratoconjunctivitele la aduli sunt de origine
inflamatorie i nu infecioas. Prin urmare, tratamentul local cu corticosteroizi reprezint
alegerea adecvat. n comunitatea medical exist tendina de a limita prescrierea antibioticelor
topice, n sperana ncetinirii apariiei fenomenului de rezisten la medicamentele
antimicrobiene. n prezent, cea mai frecvent indicaie pentru prescrierea unui antibiotic ntr-o
afeciune ocular acut este reprezentat de ctre secreia mucopurulent la acest nivel, cu
recomandarea recoltrii secreiei respective i realizarea diagnosticului microbiologic direct,
nainte de administrarea oricrui alt medicament.
Trebuie menionat faptul c marea majoritate a presupuselor ulceraii corneene nu sunt altceva
dect infiltrate leucocitare sterile, care n nici un caz nu justific administrarea de medicamente
antimicrobiene. Este uimitor ns faptul c tratamentul cel mai frecvent al acestora se face cu
antibiotice locale!
24. 3. 3. Urmri ale unei inflamaii n legtur cu sepsisul bacterian
Este luat n discuie situaia unei paciente cu endocardit infecioas n antecedente, la care, n
urma unei intervenii stomatologice (moment n care a primit profilaxie cu antibiotice) a aprut
o osteit la nivel mandibular. Aceast descriere are relevan pentru mai multe aspecte care pot
fi luate n discuie, pornind de la sepsisul cu germeni Gram-negativi i continund cu utilizarea
corect a antibioticelor i chimioterapicelor, inclusiv situaia n care gestul chirurgical reprezint
alegerea optim. De asemenea, este exemplificat o urmare a fenomenului inflamator.
O pacient n vrst de 59 de ani s-a aflat n supravegherea unei clinici cu specific de boli
infecioase datorit unei afeciuni valvulare pe care s-a grefat n urm cu civa ani un proces
infecios. ntr-o perioad de civa ani, pacienta a necesitat mai multe controale sau intervenii
stomatologice i n cteva dintre aceste cazuri a primit antibiotice, datorit faptului c
interveniile au fost sngernde. Cu toate acestea, n urma uneia dintre aceste intervenii
(timp n care a primit o cefalosporin cu spectru lrgit), la cteva zile de la intervenie pacienta a
nceput s prezinte febr (38,8C), transpiraii, oboseal i dureri la nivelul toracelui. Numai
dup nc o sptmn a decis s se adreseze spitalului (necjit datorit prea multelor
spitalizri din ultimii ani), iar la camera de gard i s-a propus internarea, ceea ce pacienta a
acceptat.
Atitudinea a fost corect i susinut de datele anamnestice, pentru c n urm cu circa 3 ani
pacienta mai fusese internat n spitalul de profil, iar diagnosticul la acea dat a fost cel de
sepsis cu Enterobacterspp., ca urmare a unei extracii dentare (i de acea dat pacienta a primit
antibiotice, dar tulpina izolat s-a dovedit a fi rezistent la toate medicamentele beta-lactamice
care au fost testate prin antibiogram difuzimetric standardizat, inclusiv la medicamentele
administrate profilactic).
La internare, tensiunea arterial era n limite normale, dar auscultator medicul de gard a
detectat suflu sistolic att n focarul mitral ct i n focarul tricuspidian, iar dup cteva ore de la
internare, la contravizit, au putut s fie auscultate frecturi pericardice. Datele de laborator
obinute n regim de urgen au relevat leucocitoz (15.850/l) cu neutrofilie (10.900 PMN/l),
valori crescute ale reactanilor de faz acut (protein C reactiv 6mg/l, VSH 112 mm/or,
fibrinogen 526 mg/dl) i anemie (nr. hematii 3,1106/l). A fost recoltat snge pentru trei
286
287
S lum un caz ... alegem... boala Alzheimer. Bine, bine....dar Alzheimer-ul acesta nu e o boal
neurologic? Da, foarte bine. ns, ca i n situaia multor altor boli, astzi i se recunoate i o
component inflamatorie.
Iat cteva argumente pentru a susine componenta de inflamaie cronic a bolii degenerative
Alzheimer:
Unii se bazeaz pe dovezi terapeutice, respectiv pe faptul c AINS amelioreaz evoluia (n
special AINS de tipul ibuprofen, indometacin, sulindac)
Alii se bazeaz pe markeri biologici, artnd c PCR este crescut, cu valori n cele 3 quartile
superioare ale valorilor, cu 25 ani naintea diagnosticului bolii.
288
Sunt luate n discuie i teste genetice, spre exemplu mutaia genei M694 pentru gena Pyrin,
care reprezint un factor de risc pentru boala Alzheimer pentru populaia reprezentativ >65
ani din Italia. i se pare c este factor de risc i pentru alte boli, cum ar fi infarctul miocardic.
Iat i cteva exemple concrete ale farmacogeneticii/farmacogenomicii n cadrul bolii
Alzheimer, luate ca exemplu (nu poate fi o abordare exhaustiv).
Asocierea dintre genotipul ApoE i boala Alzheimer reprezint una din ntrebrile tiintifice
ridicate de dezvoltarea farmacogenomicii. Dar genotipul nu este numai profil de risc, ci i
indiciu terapeutic. Tacrina (inhibitor de acetilcolinesteraza) se pare c ncetinete progresia bolii
pentru cei care nu sunt homozigoi pentru ApoE4. Pe de alt parte, exist i studii cu rezultate
negative privind valoarea predictiv a genotipului ApoE. Un al doilea exemplu relevant este cel
al promotorului sintezei 5-LO. n urm cu civa ani s-a observat c inhibitorii cii lipooxigenazei
aveau efect numai pentru unii pacieni, variabilitate n strns legatur cu polimorfismul 5-LO.
S-a tras concluzia c putem stabili un tratament diferenial, n funcie de genotipul pacientului,
concluzie extrapolat de la astm la boala Alzheimer.
Un alt exemplu se refer la polimorfismul TLR4, receptor ce se pare c este implicat in
fiziopatologia bolii Alzheimer i care ar putea fi folosit pentru nelegerea rolului profilaxiei cu
antibiotice n acest caz. (9)
24. 6. Bibliografie
1.C-reactive protein: risk factor, biomarker and/or therapeutic target?
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20386760
2.http://www.sfatulmedicului.ro/analize/viteza-de-sedimentare-a-hematiilor-sau-a290
291
Doze nalte
Persisten
De scurt durat
Prelungit
Modul de
ptrundere
Prezena
adjuvanilor
Cantitate
293
Tolerana rezult din recunoaterea antigenelor de ctre subseturi limfocitare specifice. Aceste
limfocite, prezente i la indivizii sntoi, recunosc antigene proprii de pe APC, dar reacioneaz
ntr-o manier care induce tolerana i nu un rspuns imun.
Tolerana poate fi indus n limfocite imature n organe limfoide centrale (toleran central),
sau n limfocite mature n organe periferice (toleran periferic).
Tolerana central reprezint un proces intricat cu maturarea limfocitar. n cadrul acestuia,
limfocitele imature din organele limfoide centrale devin incapabile sa rspund la auto-antigene
prezentate. Aceasta se refer la:
- antigene exprimate ubicuitar
- antigene circulante
prin expunerea acestora pe celule specializate n timus (antigenele poart numele de timodependente) sau captate direct de LB n mduva hematogen (antigene timo-independente).
Tolerana central nu este un mecanism perfect i necesit consolidare prin mecanismele
toleranei periferice (unele antigene sunt exprimate numai n esuturile periferice).
Caracteristicele limfocitelor sine-tolerante sunt rezumate n Tabelul 2:
Caracteristic
Limfocite T
Limfocite B
Locul principal al
Timus (cortex); Periferie
inducerii de toleran
Faza de maturare
Limfocite T CD4+CD8+ (dublu pozitiv)
sensibil la toleran
Stimuli ce induc
tolerana
294
295
Figura 2. Rspunsul n urma interaciunii celulelor sistemului imun aflate n diferite stadii de
activare. n lipsa unor semnale de activare date de inflamaie, macrofagele i limfocitele imature
imunologic vor conduce la toleran.Celulele APC mature sunt caracterizate de prezena pe
membrana lor a ligandului costimulator numit B7. Celulele LT mature prezint pe membran
receptorul CD28, iar din interaiunea lor, se transmit semnale stimulatoare, rezultnd n
activarea i proliferarea LT. n absena uneia dintre cele dou molecule, se induce anergia. LT
imature prezint, n loc de CD28, o molecul inhibitoare, numit CTLA4. Funcia moleculei
CTLA4 este de fosfataz, cu rolul fiziologic de a contra-regla rspunsul imun.
Anergia reprezint o stare caracterizat de incapacitatea limfocitelor de a nu rspunde la
stimuli. Aceasta este indus n urma interaciunii cu un auto-antigen i inducerea toleranei. Sau descris o serie de factori epigenetici i morfologici (markeri de suprafa) caracteristici
limfocitelor anergice, dar ne vom opri asupra caracterelor funcionale:
- scderea expresiei de molecule TCR, creterea turn over-ului acestor molecule
- recrutarea tirozin fosfatazelor cu rolul de a diminua semnalizarea TCR
- semnale inhibitorii de la molecule de tip CTLA4 care competiioneaz cu CD28 pentru legarea
296
297
298
299
dendritice placentare s transforme LT CD4+ n fenotip CD25+ foxP3+, capabile de secreia IL-10
[3].
Figura 6. Inhibiia semnalelor B7 i TCR prin exprimarea n numr mare a CTLA4 la cteva zile de
la activarea limfocitar.
Antibody feedback
Anticorpii IgG inhib activarea limfocitelor B prin formarea de complexe antigen-anticorp (CAA)
cu antigene polivalente. CAA se cupleaz, prin poriunea Fc a anticorpilor cu receptorul specific
de pe limfocite B, FcRIIB (sau CD32). Aceti receptori conin secvene care, odat fosforilate,
recruteaz fasfataze (SHIP). Prin legarea simultan
301
Una din consecinele inflamaiei este fibroza tisular. n lipsa unei controlri judicioase a
semnalelor ce ntrein inflamaia i rspunsul imun, organismul ar suferi leziuni induse de aceste
mecanisme de aprare. Ca urmare a citokinelor secretate n focarul inflamator, fibroblastele
devin active metabolic, ducnd la producia i secreia de colagen. n cazul inflamaiei
moderate, ca cea ntlnit ntr-o stimulare normale a sistemului imun de ctre un agent
patogen comun, fibroza este minim iar citoarhitechtura i fiziologia tisular rmne fr
consecine un astfel de grad de fibroz este fiziologic; n cazul inflamaiei severe sau cronice,
fibroza este important i duce la disfuncii organice profunde. Unul din mecanismele care
rmn nc mult investigate sunt translaia epitelio-mezenchimal prin care, tot sub influena
produilor inflamatorii, celulele epiteliale trec n fibroblati sau miofibroblati care sunt
responsabile de fibroz [4]. Este lesne de neles c aceste modificri sunt cu att mai
importante n organele parenchimatoase ca plmnul, rinichiul i ficatul n care epiteliile naltspecializate au rol foarte important. Pierderea masei epiteliale induce disfuncii severe ale
funciei acestor organe.
25. 7. Povestire adevrat
Dei nu reprezint o metod terapeutic utilizat n tratamentul bolilor infecioase, trebuie
recunoscut importana terapiei .Reelele imunoreglatoare dezvoltate n decursul ontogenezei
organismului sunt rezultatul unei istorii complexe, marcat de repetate interaciuni cu factori
microbiali, rezultnd n comensalism de scurt/lung durat, sau infecie acut/cronic/latent.
Aceast istorie a fost numit biografia sistemului imun, jucnd un rol n sntate i boal.
microclimatul tumoral are efect de supresie asupra sistemului imun. Totodat, tumorile care
declaneaz un rspuns limfocitic pronunat au un fenotip mai blnd i un prognostic mai bun.
Interaciunile celulelor neoplazice cu sistemul imun sunt extensive. Trebuie readus n discuie
efectul carcinogen pe care l poate avea inflamaia cronic dar i anergia pe care o prezint
pacienii cu neoplasm activ.
Cile reglatoare care inhib rspunsul imunologic n cancer sunt caracterizate din ce n ce mai
bine, iar studiul lor a dus la descoperirea unor noi inte terapeutice. Ipilimumab este un anticorp
IgG1 monoclonal uman, care, datorit inhibrii CTLA-4, are rol n activarea imunitii antitumorale.
Studii de faza 2 au fost deja efectuate, folosind Ipilimumab att n monoterapie ct i mpreun
cu ali ageni (inclusiv alte vaccinuri anticanceroase). Un studiu multicentric, randomizat
publicat de curnd, a implicat trei brae de tratament Ipilimumab+Gp100 / Gp100
monoterapie / Ipilimumab monoterapie. Gp100 este o protein menlanosomal, ce i-a dovedit
eficacitatea prin mbuntirea rspunsul n pacienii tratai cu doze mari de interleukin-2. S-a
demonstrat astfel, pentru prima oar ntr-un studiu randomizat, c Ipilimumab, singur sau n
combinaie cu Gp100, a mbuntit supravieuirea pacienilor cu melanom malign metastatic,
comparnd cu cei ce au primit monoterapie cu Gp100.
Este pentru prima oar cnd o terapie mbuntete supravieuirea pacienilor cu melanom
metastazat. Datorit efectelor de derepresare a sistemului imun, aceast terapie poate prea
relativ nespecific. Efectele adverse serioase (inclusiv necroza hepatic fulminant), dei pot fi
tratate cu doze mari de corticosteroizi, pun probleme. Succesul nregistrat de Ipilimumab
dezvolt un cadru conceptual pentru continuarea studiilor folosind imunomodulatoare (de orice
form) n boala neoplazic. Vaccinarea cu celule neoplazice ntregi, sau antigene specifice, cu
DC-uri ncrcate cu antigene specifice sau autotransfuzia cu limfocite T anti-melanom activate i
expansionate in vitro, toate au potenial de a fi folosite n arsenalul mpotriva melanomului
malign.
302
Totui, dorim s subliniem faptul c prima ncercare (reuit) pentru reforma sistemului de
supraveghere a bolilor infecioase a fost nregistrat n perioada 1990-1991. Echipa format
atunci, echip care a nceput adevrata supraveghere pentru sntatea public, a fost din pcate
distrus n anul 1992, artnd nc o dat influena negativ a politicului n sntate.
Din anul 1999 Romnia face parte (ca membru fondator) din Reeaua de supraveghere a bolilor
transmisibile n Balcani. n anul 2000, a fost organizat una dintre cele mai importante ntlniri
cu scopul armonizrii supravegherii bolilor infecioase n Europa (Consensus Meeting on
Surveillance of Infectious Diseases, Grottaferrata, Italia, 7 aprile 2000). Prezentarea pe care unul
dintre coordonatorii prezentului volum a fcut-o cu acest prilej, discuiile care au urmat n
ateliere de lucru, ntlnirile cu factori de decizie ai Organizaiei Mondiale a Sntii, iniiativa
organizrii unei reele de supraveghere a bolilor infecioase/transmisibile n rile din Europa
Central i de Est (ntlnire plenar pe care am organizat-o n decembrie 2000, la Bucureti,
prima i singura de acest nivel n perioada 1990-2007, neegalat pn n prezent) au dus la
construirea unui proiect de reform n domeniul supravegherii bolilor transmisibile cu sprijin
european (Phare) pe care l-am gndit n perioada mai-octombrie 2000, l-am scris n perioada
octombrie-noiembrie 2000 (ajutat pentru finalizare de colegii de la Direcia de Integrare
European i Programe de Sntate din Ministerul Sntii) i care a fost aprobat la data
istoric de 14 noiembrie 2000.
Finanarea a fost de circa 5 milioane EUR (circa 4 milioane EUR fonduri nerambursabile, Phare).
Implementarea fondurilor pe care le-am ctigat n anul 2000 a avut loc n perioada 2003-2004,
dup opinia noastr mai trziu dect a fost cazul i cu o performan mai sczut n comparaie
cu cea care ar fi fost atins de echipa condus (n perioada 1999-2000) de unul dintre
coordonatorii prezentului manual, n acelai timp autorul proiectului.
304
Chiar dac reprezint msuri pentru prevenirea unor maladii virale (i nu bacteriene sau
fungice), vom mai aminti, dintre msurile luate n ultimii ani, mbuntirea programului de
vaccinare mpotriva infeciilor cu virusul hepatitei B, n anul 1999. Vaccinarea nou-nscuilor
avea deja o vechime de 4 ani, dar n 1999, prin politica dus n domeniul sntii publice, a
fost inclus i vaccinarea copiilor din clasa a III-a, vaccinarea tuturor elevilor din anul I de la
colile sanitare postliceale i respectiv a studenilor din anul I din facultile de medicin i
stomatologie. Ulterior, cohortele de copii vaccinai apropiindu-se, a nceput vaccinarea
tinerilor aflai n clasa a XII-a i astfel, nu numai viitorii medici sau asisteni medicali au
beneficiat i beneficiaz de aceast metod profilactic. Politica de vaccinare a permis ca n
numai civa ani, un mare numr de generaii de copii i tineri s fie vaccinate fa de o infecie
care devenise endemic la nivelul anilor 90.
Dac pn n anii 2000 au existat foarte bune relaii de colaborare cu OMS i CDC, Atlanta, acum
principala colaborare are loc cu ECDC, Stockholm. Bazele relaiilor cu ECDC au fost puse n
perioada 2005-2007, att n misiuni comune [investigarea izbucnirilor epidemice de grip aviar,
evaluarea epidemiei de rujeol (datorat acumulrii de persoane susceptibile n perioada 20012004), evaluarea sistemului de supraveghere al bolilor infecioase n general i al infeciilor cu
transmitere sexual n particular etc.], ct i prin participarea experilor romni la ntruniri
internaionale pe teme microbiologice sau epidemiologice.
Odat cu integrarea Romniei n UE a devenit posibil i pregtirea specialitilor romni, prin
includerea Romniei n sistemul de pregtire n scopul supravegherii bolilor infecioase la nivel
european, participarea (ncepnd cu anul 2007) ca membru cu depline drepturi n reelele
europene privind supravegherea bolilor infecioase, n reelele care discut viitorul
microbiologiei sau epidemiologiei la nivel european etc. ncepnd cu anul 2007, cetenii
romni pot participa i particip la modulul complet de pregtire n domeniul epidemiologiei, la
nivel european (European Programme for Intervention Epidemiology Training, EPIET).
Fiecare dintre aspectele menionate are o strns legtur att cu microbiologia, ct i cu
sntatea public i merit a fi cunoscute att de ctre medicii ct i de viitorii medici care
activeaz n sistemul sanitar romnesc sau la nivel european.
27. Diagnosticul n bolile infecioase partea a 2-a (MI Popa, Anca StreinuCercel, Oana Streinu-Cercel, Gabriela Loredana Popa)
Aa cum am menionat anterior, n privina terminologiei, n vorbirea curent se discut despre
boli transmisibile (traducere a termenului anglo-saxon communicable diseases), ns mai
corect este s le denumim boli infecioase.
magnitudinea febrei,
frecvena i durata episoadelor febrile,
recurena acestor episoade (cu/fr periodicitate),
relaia dintre puls i temperatur i patternul de remisie a episoadelor febrile (4) etc.
Administrarea de antibiotice i/sau antipiretice poate altera aspectul curbei termice (5), dar cu
toate acestea, n cazurile tipice, este important de decelat prezena unor pattern-uri febrile aazise clasice. De exemplu, febra teriar se suprapune peste ciclul de reproducere asexuat al
Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale pe cnd febra cuaternar este nalt sugestiv pentru
P. malariae(6). Totodat, febra continu poate fi ntlnit n patologiile de etiologie rickettsian
iar un pattern bifazic poate semnala febra Dengue (5).
4. Folosirea corect a datelor care pot fi oferite de ctre laborator constituie un alt aspect foarte
important. Este necesar ca fiecare medic clinician s tie ce analize s solicite, ce produse se
recolteaz de la bolnav, cnd i cum s le recolteze, cum s le expedieze / pregteasc pentru
expediere ctre laborator. Sunt de menionat i reinut urmtoarele reguli:
- produsele se recolteaz nainte de administrarea tratamentului antimicrobian;
- se trimite laboratorului o cantitate suficient de produs pentru examinat;
- produsul trimis trebuie s fie reprezentativ pentru boala respectiv (de exemplu, sput i nu
saliv n infeciile respiratorii inferioare);
- produsul trebuie recoltat n perioada n care probabilitatea decelrii agentului etiopatogen
este maxim (de exemplu, recoltarea pentru hemoculturi se face, pe ct posibil, n timpul unui
episod febril);
- produsul examinat nu trebuie contaminat cu ali germeni n cursul recoltrii sau al
transportului (recoltare i transport n condiii aseptice) (7);
- expedierea ctre laborator se face n condiiile de conservare cerute pentru fiecare produs n
parte (trebuie s existe recomandri specifice, n detaliu, la ndemna medicilor);
- se solicit examinarea imediat a produselor transmise ctre laborator;
- se urmrete, n timp, apariia rezultatelor i se ine legtura cu colegii din laborator.
ns, pentru ca datele de laborator s fie corecte este strict necesar respectarea unei anumite
conduite n laborator, utilizarea judicioas a diferitelor aparate i echipamente de laborator i
implementarea controlului de calitate (intern i extern) (a se vedea anexa nr. 5).
5. Trebuie s existe o colaborare strns i continu ntre clinician i specialistul de laborator.
Este necesar o informare (care s includ aspecte rezultate n urma anamnezei i elemente
clinice) a medicului de laborator fcut de ctre clinician (direct sau cel puin prin telefon)
pentru orientarea cercetrilor n laborator i pentru alegerea celor mai bune metode de
identificare a agentului etiologic. n acelai timp, laboratorul informeaz clinicianul pe parcurs n
legtur cu datele preliminare obinute.
n cadrul examenelor de laborator, un loc prioritar este ocupat de diagnosticul microbiologic
(bacteriologic i / sau imunologic), care va fi prezentat n continuare. Pe scurt vor mai fi notate
cteva alte date referitoare (examene paraclinice, utile n diagnosticul bolilor infecioase).
Diagnosticul citologic: const n punerea n eviden a unor aspecte celulare caracteristice,
utiliznd un material prelevat de la bolnav (ex. din leziuni tegumentare sau amprente de la
nivelul mucoaselor). Spre exemplu, citodiagnosticul revrsatelor pleurale i al lichidului
307
cefalorahidian poate aduce date preioase pentru elucidarea etiologiei unei pleurezii i respectiv
a unei meningite.
Diagnosticul histologic: prin biopsii (recoltate prin tehnic chirurgical) sau prin puncii-biopsii
ale diferitelor organe (ficat, rinichi, plmn, ganglioni limfatici, fragmente vasculare, mucoas
digestiv sau respiratorie) se pun n eviden modificri structurale caracteristice, determinate
de aciunea agentului patogen.
Metodele de laborator nespecifice: n diagnosticul bolilor infecioase sunt utile informaiile
obinute prin analiza valorii hemogramei, leucogramei (cu modificri destul de caracteristice n
anumite situaii), vitezei de sedimentare a hematiilor, testelor de disproteinemie, testelor
enzimatice, proteinei C reactive (beta-globulin care nu se gsete n serul normal, aprnd
numai n afeciuni inflamatorii, neoplasme i n procese necrotice), altor teste de inflamaie
(reactani de faz acut) etc.
Alte metode paraclinice: examenul radiologic poate furniza date de valoare pentru bolile
infecioase cu participare pulmonar (pneumonii virale, febr Q, pneumonie pneumococic
etc). Se mai pot folosi rectosigmoidoscopia, electroencefalografia, electrocardiografia, diferite
determinri biochimice, examene oftalmologice, scintigrafia, ecografia, tomografia
computerizat, rezonana magnetic nuclear.
biopsie etc). n cazul suspicionrii unei infecii mycobacteriene este necesar realizarea unui al
treilea frotiu, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examineaz la microscopul optic,
iniial cu obiectivul 40 pentru o analiz mai general, pentru stabilirea cmpului microscopic
sau a zonei de interes, apoi cu obiectivul de imersie. Se noteaz prezena diferitelor celule
(eventual modificate fa de normal, burate de microorganisme), prezena celulelor
inflamatorii (dovada reactivitii organismului, ex. leucocite, surprinznd eventual fenomenul de
fagocitoz), precum i eventuala prezen a microorganismelor (bacterii, levuri,
pseudofilamente, micelii), care va fi interpretat cu precauie, n contextul dat. Chiar dac
examenul microscopic este de cele mai multe ori un examen orientativ, trebuie realizat de
fiecare dat, cu rigurozitate, n anumite situaii putnd fi foarte important i foarte util.
Atunci cnd produsul recoltat este reprezentat de snge, urin sau materii fecale, de regul nu
se realizeaz frotiuri fixate i colorate. Spre exemplu, n cazul materiilor fecale, se va face o
coprocitogram, un preparat proaspt (nativ) ntre lam i lamel, cutndu-se n special
prezena leucocitelor (dar i a unor structuri care pot da anumite informaii cu privire la
funcionalitatea tractului digestiv). n cazul suspicionrii unei infecii urinare, se va realiza un
sediment urinar (dup centrifugarea urinei), care se va examina ntre lam i lamel n vederea
aprecierii numrului de leucocite pe cmp microscopic, n cazul n care acestea exist, n
vederea aprecierii prezenei unor cilindri leucocitari precum i a altor celule normale sau
patologice, a prezenei unor elemente fungice etc., date care pot fi deosebit de utile n vederea
unui diagnostic corect i util pentru pacient.
n cazul suspicionrii unei infecii micotice sunt utile att preparatele proaspete (ex. preparatul
montat n soluie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraii negative (tu de India,
nigrozin), precum i frotiurile colorate May-Grnwald-Giemsa sau Gram.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se va face n funcie de situaie (mediile
i condiiile de incubare se vor alege n funcie de presupusul microorganism pe care trebuie s-l
izolm; spre ex. n cazul n care infecia este produs de microorganisme strict anaerobe, n lipsa
condiiilor anaerobe de cultivare este imposibil izolarea agentului etiologic). Pentru fungi
trebuie utilizate mediile potrivite i o temperatur mai mic dect cea utilizat n cazul
bacteriilor. Cultivarea se va realiza n aa fel nct s se poat obine colonii izolate (tehnica
nsmnrii n poligon) i respectiv o cultur pur, care se va identifica.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
a) Caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolat, frotiu care se va fixa i colora
Gram sau Ziehl-Neelsen, dup caz, i se va examina microscopic. Prin examinarea frotiurilor se
vor evidenia numai microorganisme cu form i tinctorialitate similar (n cazul germenilor cu
polimorfism important, ex. Proteus spp., pe frotiu vom observa aspecte morfologice diferite (8),
de la aspecte cocobacilare pn la forme filamentoase). n cazul levurilor, aspectul este
cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai mari.
b) Caractere de cultur: se vor examina coloniile izolate aprute pe mediile de cultur solide i
care pot fi de tip S pentru majoritatea germenilor studiai inclusiv pentru levuri, de tip R n cazul
Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis i Bacillus anthracis, de tip M n cazul
bacteriilor capsulate, de exemplu Klebsiella pneumoniae i respectiv un aspect pufos n cazul
mucegaiurilor(detalii privind aspectele coloniilor microbiene sunt prezentate n capitolele
dedicate fiecrui gen n parte).
c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie microbian la alta i pot fi
foarte utile spre exemplu n cazul diferenierii enterobacteriilor (introducerea n practic a
mediilor multi-test permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU,
sistemele API etc). n cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma.
d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazndu-ne pe structura i
antigenicitatea microorganismelor i pe specificitatea reaciilor antigen-anticorp. Vom utiliza
309
anticorpi cunoscui pentru a identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin
reacii de aglutinare direct, pe lam, se pot identifica antigenele i respectiv speciile i tulpinile
din genul Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacii de aglutinare indirect se pot utiliza pentru
detectarea n p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru detectarea unor enterotoxine,
pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) etc.
e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora
anumite substane cu rol n patogenitate (ex. coagulaza produs de Staphylococcus aureus) sau
infecia experimental a unui animal de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un pacient
cu pneumonie dup inocularea sputei la oarecele alb; n cazul n care n sput exist
pneumococi, animalul va muri n 24-48 de ore, iar din sngele lui se va izola o cultur pur de
Streptococcus pneumoniae).
f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie);
g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode
moderne) (vezi anexa nr. 7).
5. Antibiograma i respectiv antifungigrama (testarea sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice antibacteriene i antifungice, n vederea stabilirii tratamentului) se realizeaz de
obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave, antibiograma difuzimetric trebuie
s fie completat de determinarea concentraiei minime inhibitorii (CMI) i respectiv bactericide
(CMB). n infecii grave, cu potenial fatal, poate fi necesar determinarea nivelului de eficien
pentru antibioticul utilizat, respectiv stabilirea nivelul de eficien inhibitorie (NEI) i nivelului de
eficien bactericid (NEB) (vezi i capitolul 7).
Recomandarea a fost de realizare a unui nou examen bacteriologic. Apelnd la unul dintre cei
mai experimentai colegi, unul dintre puinii i adevraii profesori din catedra de microbiologie,
n final a fost dovedit o dubl infecie, ITU i la nivel genital, cu Klebsiella pneumoniae.
Tratamentul infeciei la nivelul ambelor sedii a dus la vindecarea infeciei, dispariia semnelor i
simptomelor i primirea mulumirilor de rigoare, prin email.
27. 4. 2. Cu privire la lipsa diagnosticului microbiologic i urmrile acestei lipse
Un alt coleg mai tnr, de aceast dat n primii ani de studiu, a relatat dup momentul n care
312
aduli, transfer care nu a fost realizat cu foarte mult uurin, dar se pare c acest ultim
transfer a fost salutar. Actualul nostru coleg poart i astzi un deosebit respect celor care s-au
ocupat de el n clinica de ortopedie a spitalului, att efului de clinic dar i unui coleg, care la
acea vreme era mai tnr i pe care avem plcerea s l cunoatem i noi. Datorit suspiciunii de
cancer osos, au urmat alte analize, o tomografie computerizat i o scintigrafie osoas (din
fericire infirmnd respectiva suspiciune); tratamentul anti-infecios a fost continuat iniial cu
oxacilin 2g/zi n asociere cu gentamicin 2mg/kg/corp (de 2 ori pe zi) timp de 2 sptmni,
urmat de tratament cu oxacilin 2g/zi.
Tnrul nostru coleg i mai amintete c, nainte de transferul la al cincilea spital tratamentul a
fost administrat intra-venos cnd am plecat de la ... deja artam ca un drogat; aveam pe mini
foarte multe vene sparte, cheaguri pe branule ... iar n momentul n care a auzit pentru prima
dat c a existat suspiciunea de cancer osos a slbit circa 4 kg n 2 zile.
n final, pacientul a fost externat, vindecat, dup o lung perioad de suferin.
Din discuia cu tnrul nostru coleg i din amintirile acestuia, nu am remarcat vreo ncercare de
diagnostic microbiologic, vreo recoltare de produs patologic care s fie transmis spre analiz
(nainte de administrarea antibioticelor sau chimioterapicelor), vreo recoltare de snge pentru
hemoculturi.
Nu putem meniona toate impresiile pe care copilul, pacientul, tnrul coleg le-a acumulat pe
parcursul acestei experiene de via. Totui, amintim o dorin exprimat de acesta de fiecare
dat cnd trebuie s merg la spital, m rog s dau de un OM.
27. 4. 3. Despre unele teoreme din timpul facultii sau rezideniatului
Foarte mult timp, la cursuri n timpul studeniei sau n timpul rezideniatului am fost nvai c
IDR cu PPD (vezi i anexa nr. 3) nu are nici o valoare, n Romnia, pentru c toi copiii sunt
vaccinai la natere, pentru c tuberculoza este endemic etc.; n aceste condiii toi cetenii
romni au IDR pozitiv i o nou testare nu va aduce nicio informaie util. Am suspicionat de
mult timp c aceast teorem nu are acoperire real.
n ultimii patru ani, prin colaborare cu o serie de studeni entuziati (sigur, studiile trebuie
continuate i este necesar realizarea unor observaii pe un lot semnificativ statistic), am
nceput infirmarea acestor supoziii, transmise, din pcate, multor generaii de studeni,
rezideni etc. Din cei peste 60 de studeni care au dorit s participe la studiu, n 40,9% dintre
cazuri valoarea citirii la 48 i 72 de ore a fost 0 (zero) milimetri n timp ce n 19,7% valoarea
induraiei a fost de peste 10 i pn la 22 milimetri. ntr-un caz, consultul cu medicul de
specialitate pneumo-ftiziolog a dus la recomandarea administrrii de hidrazid a acidului
izonicotinic, pentru prevenirea unei tuberculoze manifeste, ceea ce probabil a fost salutar
pentru respectivul, mai tnr, coleg.
la demersul terapeutic
B. antibiograma nu mai este de actualitate n demersul diagnostic i terapeutic n bolile
infecioase, cazurile de rezisten la antibiotice i chimoterapice fiind din ce n ce mai rare
C.recoltarea produselor patologice trebuie efectuat nainte de administrarea tratamentului
antimicrobian
D. saliva poate nlocui cu succes sputa ca i produs patologic recoltat n infeciile respiratorii
inferioare
E.n cadrul examenelor de laborator, diagnosticul microbiologic are doar semnificaie istoric
3. n interpretarea curbei termice, este important s evalum urmtoarele aspecte:
A.periodicitatea episoadelor febrile
B.relaia dintre puls i temperatur
C.administrarea de antibiotice i/sau antipiretice
D.pattern-ul de remisie a episoadelor febrile
E.frecvena i durata episoadelor febrile
4. n recoltarea produselor patologice trebuie inut cont de urmtoarele elemente:
A.recoltarea pentru hemoculturi se face n timpul unui episod febril
B.se solicit examinarea produselor transmise ctre laborator n termen de 7-10 zile de la
recoltare
C. este important alegerea momentului ideal pentru recoltare
D.diagnosticul microbiologic ocup un loc prioritar n cadrul examenelor de laborator
E. n cursul recoltrii, evitarea contaminrii cu ali germeni are doar caracter de recomandare,
nefiind criteriu indispensabil
5. Urmtoarele afirmaii legate de examinarea microscopic a produsului patologic sunt
adevrate, CU EXCEPIA:
A. se vor realiza minim dou frotiuri din produsul patologic, care se vor colora cu albastru de
metilen (AM) / Giemsa i respectiv Gram
B. n cazul suspicionrii unei infecii urinare, sedimentul urinar se va examina ntre lam i
lamel
C. prezena celulelor inflamatorii este un element frecvent decelat i ca atare poate fi trecut cu
vederea
D. n cazul suspicionrii unei infecii mycobacteriene este necesar realizarea unui frotiu colorat
Ziehl-Neelsen
E.atunci cnd produsul recoltat este reprezentat de snge, urin sau materii fecale, de regul nu
se realizeaz frotiuri fixate i colorate
27. 6. Bibliografie
1. Wong CS, Ang LW, James L, Goh KT, 2010, Epidemiological characteristics of cholera in
Singapore, 1992-2007. Ann Acad Med Singapore, 39(7):507-6
2. Thirion L, Nikkels AF, Pirard GE, Etoricoxib-Induced Erythema-Multiforme-Like
Eruption, 2008, Dermatology 216:227-228 (doi: 10.1159/000112930)
3. Gandhi TN, DePestel DD, Collins CD, Nagel J, Washer LL, 2010, Managing antimicrobial
resistance in intensive care units. Crit Care Med., 38(8 Suppl):S315-23
4. Burke A. Cunha MD, The clinical significance of fever patterns, 1996, Infectious Disease
Clinics of North America - Volume 10, Issue 1
315
este esenial. Este de preferat ca medicul s tie care sunt manevrele necesare pentru a
procesa produsul patologic "la patul bolnavului". Realizarea i examinarea corect a frotiurilor
va permite nu numai ca n maxim 20 minute s se pun diagnosticul de meningit
meningococic (prezena leucocitelor i a cocilor Gram-negativi intra i extra-leucocitari) dar i
s se instituie tratamentul (de ex. cu penicilin).
n cazul n care pacientul prezint febr, tuse i expectoraie nu este recomandat
administrarea unor antibiotice doar pe baza existenei acestor semne. Administrarea unui
antibiotic cu spectru larg (ex. tetraciclin) ar putea crea probleme suplimentare. Dac dorim s
procedm corect, dup anamnez trebuie s urmeze examenul clinic complet, revenind cu
minuiozitate asupra examinrii semnelor i simptomelor n relaie cu aparatul respirator. Dintre
examenele paraclinice se realizeaz de obicei radiografia cardio-toraco-pulmonar. Alte
examene de laborator (aa cum am menionat n capitolul precedent) sunt necesare i trebuie
efectuate. Din punct de vedere microbiologic, recoltarea corect i transportul sputei reprezint
elementul esenial. n laborator sputa va fi prelucrat, vom realiza cel puin trei frotiuri pe care
le fixm i colorm cu AM / Giemsa, Gram i Ziehl-Neelsen. Din momentul recoltrii produsului
patologic i pn la obinerea primelor informaii prin examinarea frotiurilor, pot trece nu mai
mult de 20-30 minute. n cazul n care nu parcurgem aceste etape i de ex. administrm direct
tetraciclin, evoluia pacientului ar putea fi nefavorabil, chiar i ctre deces, iar frotiurile
realizate i examinate post-mortem (pe produse recoltate anatomo-patologic) ar putea
demonstra prezena de hife i levuri, semnificnd o infecie fungic. Continund cu etapa de
identificare am putea stabili, de ex., c a fost vorba de o pneumonie provocat de Candida
albicans. Decesul a fost precipitat de utilizarea iraional a tetraciclinei, medicament care
distrugnd flora de asociaie a permis multiplicarea n voie a fungului respectiv. Dac am fi
examinat sputa recoltat de la bolnav am fi putut detecta prezena elementelor fungice i am fi
ales medicaia corespunztoare.
Bacteriile studiate pot fi grupate dup mai multe criterii, dar o variant util este cea n care
avem n vedere structura peretelui bacterian i respectiv afinitatea acestuia fa de diferii
colorani.
Un prim grup important este cel care include cocii cu importan medical, Gram-pozitivi
(stafilococi, streptococi, pneumococi etc) i respectiv Gram-negativi (meningococi, gonococi
etc).
ntre bacteriile Gram-negative care au dimensiuni pe baza crora nu pot fi ncadrate drept coci
sau bacili se afl parvobacteriile, cocobacilii Gram-negativi (H. influenzae, B. pertussis, Brucella
spp. etc).
Bacilii Gram-pozitivi care vor fi inclui n prezentrile din acest manual se pot grupa n bacili
nesporulai (Corynebacterium diphteriae, Listeria spp.) i respectiv bacili Gram-pozitivi sporulai
(Bacillus anthracis, Clostridium spp.). Totui, nu trebuie s uitm c exist i ali bacili Grampozitivi.
Bacilii Gram-negativi studiai fie aparin familiei foarte numeroase a enterobacteriilor (E. coli,
Salmonella spp., Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Yersinia spp. etc), fie sunt
inclui n genuri separate precum V. cholerae din genul Vibrio sau Ps. aeruginosa din genul
Pseudomonas.
Microorganismele din genul Mycobacterium se pot colora (cu destul de mare dificultate; uneori
nu se coloreaz i apar sub aspectul unor zone necolorate, fantome bacteriene) prin metoda
Gram, dar n mod caracteristic se coloreaz prin metoda Ziehl-Neelsen. O adaptare a tehnicii
Ziehl-Neelsen este medoda de colorare Kinyoun. Specia principal studiat este M. tuberculosis.
Exist i alte specii de mycobacterii dar i bacterii aparinnd altor specii i genuri, care se pot
colora prin aceste tehnici.
O serie de bacterii spiralate (Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp.) nu se coloreaz
prin metoda Gram datorit structurii particulare a peretelui. Pot fi studiate microscopic fie n
317
preparate proaspete (utiliznd tehnici microscopice speciale) fie utiliznd coloraii particulare
(ex. impregnarea argentic).
Pn n urm cu o perioad de timp microorganismele aparinnd genurilor Rickettsia,
Chlamydia i Mycoplasma erau incluse n categoria virusurilor. Totui, proprietile lor
fundamentale fac s le studiem astzi ntre bacterii.
n obiectul de studiu sunt ncadrai i fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici aparte.
Noiunile legate de micologie sunt reluate n cadrul dermatologiei iar diagnosticul micologic este
prezentat mai pe larg n diferite tratate de specialitate.
Pentru fiecare microorganism studiat am abordat aspecte legate de ncadrarea ntr-un anumit
gen, caracterele generale mai importante (habitat, caractere morfo-tinctoriale, caractere de
cultur, caractere biochimice, rezistena fa de factori fizici i chimici, structura antigenic i
rspunsul imun realizat n organismul gazd, precum i caracterele de patogenitate).
Legat de caracterele distinctive ale microorganismului studiat am prezentat, n general foarte
succint, date cu privire la patogenia principalei afeciuni clinice produse (cu enumerarea mai
multor entiti clinice, de la caz la caz).
Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganismele avute n vedere este axat pe
datele microbiologice (diagnostic bacteriologic i respectiv diagnostic imunologic) urmnd
schema care a fost deja prezentat. Utilizarea n mod repetat a unei scheme clare permite o mai
bun fixare a cunotinelor precum i atingerea obiectivului stabilit: reinerea unor principii de
ctre mai tinerii colegi, indiferent de specialitatea care va fi aleas ulterior, sau de ctre medici.
Microbiologia este, dup opinia noastr, o tiin cu foarte mare aplicabilitate practic.
Elementele de baz ale microbiologiei sunt necesare i utile pentru toi partenerii implicai n
sistemul sanitar. Cunoaterea acestor elemente de baz ar putea preveni o serie de anomalii i
erori care uneori pot avea consecine dezastruoase (aa cum s-a ntmplat de ex. ntr-o
maternitate n care o serie de nou-nscui au decedat datorit unor infecii nosocomiale
contractate dup natere, n anul 2004).
n final vom oferi, pe scurt, unele noiuni legate de tratament, modalitile de transmitere i
respectiv de prevenire a transmiterii germenului discutat. n privina datelor epidemiologice,
pentru unele dintre microorganisme / boli vor fi prezentate date concrete (n cazul acelor
maladii pentru care exist un sistem de supraveghere i datele sunt disponibile). Exemplele vor
fi redactate comparativ, pentru sistemul de sntate american i cel romnesc. Motivaia
alegerii datelor din USA este reprezentat de faptul c sistemul american de sntate public i
supraveghere epidemiologic pentru sntatea public poate fi privit ca un model, iar aceste
date sunt publicate n mod periodic, fiind puse la dispoziia autoritilor sanitare, unitilor
sanitare, medicilor i oricrei persoane care dorete s obin aceste informaii
(http://www.cdc.gov). Recomandm, de asemenea, consultarea site-ului http://ecdc.eu.int, site
al Centrului European de Prevenire i Control al Bolilor Infecioase (communicable diseases),
mai recent nfiinat, dar cu o evoluie rapid i pozitiv.
n ceea ce privete tratamentul, este util s reinem c pentru majoritatea situaiilor este
necesar izolarea microorganismului implicat, identificarea acestuia i testarea sensibilitii la
antibiotice i chimioterapice (de ex. utiliznd cel puin antibiograma difuzimetric).
318
29. Genul Staphylococcus (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Anca StreinuCercel, Oana Streinu-Cercel)
29. 2. 1. Habitat
S. aureus se poate multiplica la nivelul tegumentelor i mucoaselor (n special n zonele piloase
i la nivelul vestibulului nazal).
Exist o serie de factori care determin i/sau influeneaz starea de purttor pentru S. aureus.
O parte dintre aceti factori sunt legai de aprarea la nivel de gazd, o parte sunt corelai cu
anumite proprieti ale bacteriei. Dintre acestea, menionm formarea de biofilm (caracteristic
tulpinilor care se preteaz portajului nazal, dar nu i celor care nu determin stare de portaj) (1),
care pare s faciliteze nu numai creterea supravieuirii bacteriilor n contextul tratamentului
antibiotic, dar i evitarea mecanismelor de aprare specifice gazdei, care pot fi de tip peptide
antimicrobiene precum: lizozimul, lactoferina, SLPI (secretory leukoprotease inhibitor),
catelicidine, alfa i beta defensine (2), inclusiv beta defensina uman 3 (HBD-3), cea mai
eficient dintre beta defensine n ceea privete rolul n infeciile cu S. aureus (3).
Deoarece unele studii arat c circa 20% dintre persoanele sntoase sunt purttoare n mod
permanent de S. aureus iar n circa alte 50-60% dintre cazuri este discutat situaia portajului
temporar, s-a intuit c exist un anumit grad de influen genetic privind starea de purttor de
S. aureus. ntr-un studiu transversal recent la care au participat n mod voluntar colegii tineri
aflai n finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studeni au fost
purttori de Staphylococcus aureus, nazal i/sau faringian. Un studiu similar, transversal,
efectuat n 2010 n Brazilia, pe un lot comparabil de voluntari (incluznd studeni aflai n finalul
319
Sunt relativ rezisteni la anumite antiseptice i dezinfectante (de exemplu, rezist peste 30
minute la alcool 70i peste 10 minute n fenol 2%). Sunt distrui n 60 minute la o temperatur
de 60C.
fibrin. Procesul difer de coagularea normal prin faptul c nu sunt necesari o serie de factori
(ex. Ca2+) iar cheagul care se formeaz este mai friabil i nu se retract. Studii recente
demonstreaz c TFPI (inhibitorul cii factorului tisular), prin secvena sa C-terminal, joac un
rol antimicrobian mpotriva S. aureus i mpotriva altor bacterii Gram-pozitive (Bacillus subtilis),
Gram-negative (Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa) i chiar mpotriva fungilor Candida
albicans i Candida parapsilosis (6).
c). Stafilococii pot produce o serie de hidrolaze cu structuri antigenice diferite, precum:
- stafilokinaza, care determin liza cheagului (prin convertirea plasminogenului n plasmin) sub
controlul unui material genetic fagic;
- nucleaza (termonucleaza), cu activitate endo- i exonucleazic asupra ADN i ARN, genernd
3'-nucleotide;
- diferite lipaze evideniabile prin opacifierea agarului cu glbenu de ou sau prin scindarea
substanei numit Tween; contribuie la supravieuirea stafilococului la nivel dermic;
- hialuronidaza;
- ureaza;
- diferite proteaze (serin proteaz, cistein proteaz, metaloproteaz).
d). n momentul se fa se cunosc patru hemolizine produse de stafilococi. O tulpin anume
poate produce mai multe hemolizine. Unele dintre hemolizine distrug i alte celule, ducnd la o
necroz local i pot avea efecte letale asupra animalelor de experien. Principalele caractere
ale hemolizinelor sunt urmtoarele:
1. a-hemolizina (a-toxina) este principala hemolizin produs de S. aureus. Are activitate
maxim asupra hematiilor de iepure; hematiile de om nu sunt susceptibile. Afecteaz
trombocitele i celulele umane n cultur. Are efect dermonecrotic asupra animalul de
experien (injectat local) i efect letal (injectat intravenos). Efectul ei principal este
reprezentat de producerea de spasme ale muchilor netezi vasculari. S-a identificat receptorul
de pe suprafaa membranei eritrocitului, o sialoglicoprotein. Este secretat sub forma unui
monomer hidrosolubil de 34.000 Da, care se rearanjeaz n contact cu un receptor de
membran, formnd un hexamer cilindric care strpunge membrana celulei i proemin la
suprafaa ei, genernd un por cu un diametru de 23 nm (exist asemnri cu complexul litic
C5b-C9 al C').
2. -hemolizina este produs de majoritatea stafilococilor identificai la animale, dar numai de
10-20% dintre stafilococii umani. Produce o hemoliz de tip cald-rece. Este de fapt o
sfingomielinaz C, activat de Mg2+, nu ns i de Ca2+. Efectul (n ordine descresctoare) se
exercit asupra hematiilor de oaie, om, cobai (ceea ce corespunde cu concentraia de
sfingomielin a hematiilor). Este citotoxic pentru diferite culturi de celule. n doze mari, este
toxic pentru animalele de experien.
3. g-hemolizina este un complex de dou proteine bazice care acioneaz n cooperare.
Hematiile susceptibile sunt cele de iepure, om, oaie, nu i cele de cal sau pasre. Efectul ei este
inhibat de agar i de diferii polimeri sulfatai. Nu are efect atunci cnd se utilizeaz plci cu
agar-snge. Aciunea este inhibat de colesterol i de alte lipide.
4. d-hemolizina este produs de majoritatea tulpinilor umane de S. aureus. Const din agregate
heterogene de subuniti de circa 5.000 Da. Acioneaz pe diferite celule (hematii, leucocite,
celule de mamifere cultivate) i nu are specificitate de specie.
e). Stafilococii pot produce o serie de exotoxine piretogene, un grup de toxine cu mai multe
activiti patogene, spre exemplu cu efecte imunosupresoare, cu un efect mitogen mai
pronunat la nivelul limfocitelor T supresoare (au capacitatea de a activa policlonal toate celule
322
323
S. aureus apare mai frecvent implicat n producerea unor infecii, de obicei la nivelul
tegumentelor i mucoaselor, nsoite de formarea de puroi, dar cu potenial de generalizare.
Tulpinile de S. aureus au capacitatea de a adera la mucoase, epitelii, endotelii, n special datorit
prezenei acidului lipoteichoic, proteinei A i altor adezine. Dup aderare i multiplicare, n
cursul infeciilor pot fi produse o serie de substane cu rol n patogenitate (enzimele i toxinele
elaborate au fost prezentate la punctul 29. 2. 6).
De menionat i faptul c stafilococii reprezint unele dintre primele microorganisme pentru
care s-a descris fenomenul apariiei rezistenei la antibiotice. Rezistena la penicilin (mediat
de o -lactamaz) a fost evideniat nc din anul 1947. Ulterior, pe msura utilizrii n infeciile
stafilococice a unor diferite antibiotice (inclusiv a penicilinelor penicinilazo-rezistente), s-au
selectat tulpini rezistente la meticilin, oxacilin, tetraciclin, cloramfenicol, macrolide,
aminoglicozide etc.
Un studiu recent a evaluat prevalena portajului de MSSA i de MRSA n departamentele de
urgen din SUA, la pacieni n principal fr manifestri sugestive pentru infecia stafilococic.
Prevalena portajului MSSA a fost estimat la 39% iar prevalena colonizrii cu MRSA a fost de
5%. Dintre pacienii colonizai MRSA, 80% au prezentat i cel puin o colonizare extranazal, pe
cnd 45% au prezentat colonizare exclusiv extranazal (8).
Pn n anul 1996, vancomicina reprezenta tratamentul de elecie al infeciilor cu S. aureus
rezistent la alte antibiotice i chimioterapice. Au fost raportate tulpini stafilococice intermediare
sau rezistente la vancomicin. n privina sensibilitii/rezistenei la vancomicin au fost descrise
trei variante de S. aureus, respectiv:
n mod clasic era considerat c o tulpin de S. aureus intr n categoria VISA n cazul n care CMI
este 6 g/ml (determinare prin E test) i n categoria VRSA n cazul n care CMI este 32
g/ml. Conform EUCAST (2010), o tulpin de stafilococ este rezistent la vancomicin n cazul n
care CMI este > 2 g/ml.
Opiunile de tratament n infeciile cu VRSA sunt limitate. O clas de antimicrobiene care poate
fi utilizat n tratamentul VRSA este reprezentat de streptogramine (quinupristin/dalfopristin,
pristinamicina, virginiamicina, NXL 103, etamycin).
Cu toate acestea, a fost identificat rezisten i la streptogramine (9), existnd totui
posibilitatea tratrii S. aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalena acestui
fenotip fiind ns redus, de 60,3%, spre deosebire de prevalena de 92,8% a tulpinilor
rezistente constitutiv la macrolide, lincosamide i streptogramina B (10).
326
29. 5. Tratament
327
Multe persoane sunt purttoare de stafilococi la nivel tegumentar, nazal sau faringian. Chiar
dac stafilococii ar fi eliminai complet de la nivelul vestibulului nazal, recolonizarea s-ar
produce foarte rapid (4).
Totui, n anumite situaii (ex. pacieni supui dializei peritoneale sau hemodializei, pacieni
infectai cu HIV sau la personalul medical care lucreaz de ex. n secii de ari) ncercarea de
eliminare a strii de purttor are justificare. Se poate utiliza tratamentul local cu mupirocin.
Este nc n studiu utilizarea lizostafinei n acest scop (lizostafina este o enzim litic produs de
o tulpin de S. simulans; atac puntea pentaglicinic de la nivelul lanurilor de peptidoglican ai S.
aureus; au fost fcute experimente pe animale de laborator obinndu-se rezultate
promitoare) (11).
Tratamentul unei stafilococii, n cazul n care este necesar antibioterapia, se va face conform
antibiogramei.
Principial, dac un stafilococ este sensibil la penicilin (majoritatea tulpinilor au devenit
rezistente prin producerea de beta-lactamaz, dar nu toate), atunci tratamentul ar trebui s
includ acest antibiotic. Din experiena centrului de referin din INCDMI Cantacuzino,
procentul tulpinilor sensibile la penicilin este de circa 5%. Datorit rezistenei la penicilin au
fost produse peniciline rezistente la aciunea beta-lactamazelor (penicilinele M de la
meticilin), de ex. oxacilina, cloxacilina i derivaii acestora.
Tulpinile meticilino-rezistente pot deveni destul de rapid multi-rezistente.
Ca i principiu de tratament, MRSA rspunde potenial la tratamentul cu vancomicin. VRSA
poate rspunde la streptogramine (de exemplu etamycin). Cu toate acestea, a fost identificat
rezisten i la streptogramine (9), existnd totui posibilitatea tratrii S. aureus rezistent la
streptogramina B cu lincosamide, prevalena acestui fenotip fiind ns redus, de 60,3%, spre
deosebire de prevalena de 92,8% a tulpinilor rezistente constitutiv la macrolide, lincosamide i
streptogramina B (10).
n cazul coleciilor purulente reamintim i considerm c este de reinut ca fiind de prim
importan utilizarea inciziei i drenajului, fr de care antibioterapia nu are nici un sens. De
multe ori, incizia i drenajul sunt suficiente.
29. 6. Epidemiologie
Stafilococii sunt ubicuitari. Sursa de infecie cea mai comun este reprezentat de leziunile
stafilococice de la nivelul tegumentului. De menionat posibilitatea rspndirii infeciei cu
stafilococi rezisteni la antibiotice (de spital), atunci cnd persoanele purttoare sunt
reprezentate chiar de personalul medical i auxiliar.
Referitor la sindromul de oc toxic stafilococic (SSTS), n SUA s-au raportat 157 de cazuri n 1997,
138 de cazuri n 1998 i 113 cazuri n 1999, cu o inciden anual de 0,050/0000. n anul 2005 au
fost raportate numai 90 de cazuri (incidena fiind 0,040/0000). Tot n anul 2005 s-au raportat 2
cazuri de infecie cu S. aureus cu sensibilitate intermediar la vancomicin (VISA) i 3 cazuri de
infecie cu S. aureusrezistent la vancomicin (VRSA).
n Romnia nu sunt disponibile (la nivel naional) date privind SSTS sau rezistena la vancomicin
a tulpinilor de S. aureus. Din datele laboratorului de referin pentru stafilococ din INCDMI
Cantacuzino, inclusiv cele provenite din supravegherea microorganismelor izolate din infectii
invazive pe baza protocoalelor EARSS (2002-2009), respectiv EARS.Net (din 2010), n Romnia
328
29. 7. Profilaxie
Prevenirea transmiterii infeciei are la baz metodele de igien, asepsie i antisepsie. n spital,
seciile cu risc sunt cele de neonatologie, terapie intensiv, slile operatorii i saloanele unde se
afl pacieni cu cancer aflai sub chimioterapie / sau cu alte cauze de imunodepresie. n aceste
situaii, personalul medical trebuie investigat prin metode de laborator i este de preferat ca
persoanele purttoare de stafilococi coagulaz-pozitivi s nu aib acces n aceste incinte i s nu
aib contact direct cu pacienii n cauz. Ca alternativ trebuie s se pun accentul pe proceduri
adecvate, care s evite contaminarea pacienilor.
Utilizarea substanelor antiseptice i ncercarea de eradicare cu ajutorul antibioticelor a
portajului nazal (ex. lizostafin, mupirocin) ar putea fi utile. (11)
Utilizarea vaccinului stafilococic poate s amelioreze starea clinic n anumite situaii, de ex. la
pacieni care necesit hemodializ, prezena de catetere etc. Din pcate la nivel internaional
(EU) nu exist un vaccin stafilococic care s fi primit autorizaie de utilizare. n ara noastr
vaccinul stafilococic produs de INCDMI Cantacuzino a avut autorizaie de utilizare pn n anul
2010.
identificarea altor antibiotice eficiente asupra tulpinilor rezistente ale diverselor specii
bacteriene. Etamycin a demonstrat de asemenea o eficien experimental asupra mai multor
patogeni Gram-pozitivi sau Gram-negativi, fiind ne-citotoxic la concentraii de 20 de ori mai
mari dect CMI-ul (care a fost de 1-2 mg/L pentru MRSA comunitar sau spitalicesc).
29.8.2 Detecia direct a rezistenei la meticilin
Printre metodele de detecie direct a rezistenei la meticilin a S. aureus se numr i testele
de latex aglutinare. Un tip particular de astfel de test a fost descris n 2010, de Qian et al. (14) n
Journal of Clinical Microbiology. Ei propun efectuarea acestui test de latex aglutinare (pe mediu
de tip geloz-snge) prin utilizarea unei proteine de legare a penicilinei (Penicillin Binding
Protein 2a).
Acest test (PBP-LA) i-a demonstrat o sensibilitate de 94,1% i o specificitate de 97,5%, valori
doar cu puin mai sczute fa de sensibilitatea i specificitatea efecturii tehnicii PCR. Dintre
avantajele utilizrii acestei metode menionm: obinerea de rezultate rapide, tehnic uor de
utilizat, preuri sczute ale reactivilor utilizai. n vederea creterii sensibilitii testului, acesta
poate fi utilizat n combinaie cu alte teste de identificare rapid, precum: DNA-aza
termostabil, API Rapidec, i FISH (peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization).
romane s-a infectat venind n contact cu o saltea de lupt contaminat de un coleg care s-a rnit
n timpul antrenamentului.
De multe ori, simpla respectare a unor reguli de igien general i personal pot contribui
semnificativ la prevenirea apariiei infeciilor stafilococice. Pentru restul cazurilor studiul
individual, cercetarea bazelor de date i experiena ctigat cu fiecare caz consultat, investigat,
analizat i discutat ne ajut s ajungem la cea mai bun ipotez diagnostic, la cel mai bun
diagnostic diferenial, la cel mai potrivit tratament n vederea celui mai bun prognostic pentru
pacientul sau pacienii pe care i vom examina de-a lungul ntregii cariere medicale sau medicochirurgicale.
331
332
30. 1. 2. 1.S. pyogenes. Cei mai muli dintre streptococii care conin antigenul de grup A
sunt streptococi piogeni. Ei sunt beta-hemolitici (produc n mod caracteristic zone largi
de hemoliz clar n jurul unor colonii de dimensiuni mici, punctiforme). S. pyogenes
este principalul microb asociat cu invazia local sau sistemic i cu tulburri imunologice
poststreptococice. De regul streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracin. Structura
de tip capsular pe care unele tulpini o prezint este chimic similar cu esutul conjunctiv
al organismului gazd (acid hialuronic), fiind ca atare neantigenic. Membrana sa
citoplasmatic are antigene similare cu miocardul, muchii scheletici i muchiul neted,
fibroblatii valvelor cardiace i esutul nervos.
30. 1. 2. 2.S. agalactiae. Face parte din flora normal a tractului genital feminin i poate
reprezenta o important cauz de sepsis i meningit neonatal. Sunt beta-hemolitici i
produc zone de hemoliz care sunt doar puin mai extinse dect coloniile (1-2 mm n
diametru). Streptococii de grup B hidrolizeaz hipuratul de sodiu i dau o reacie
pozitiv n testul CAMP (folosind discuri impregnate cu toxin stafilococic) (2).
30. 1. 2. 3.Grupele C i G. Aceti streptococi sunt izolai uneori din nazofaringe i pot
cauza sinuzit, bacteriemii sau endocardit. Deseori formeaz colonii asemntoare cu
cele ale streptococilor piogeni i sunt beta-hemolitici. Sunt identificai prin reacii cu
antiser specific pentru grupele C sau G.
30. 1. 2. 4.S bovis. Face parte din streptococii de grup D. Aparine florei normale.
Ocazional produce endocardit sau bacteriemie la pacienii cu carcinom de colon. Nu
produce hemoliz i d o reacie pozitiv la bil-esculin.
30. 1. 2. 5.S. pneumoniae.Pneumococii sunt alfa-hemolitici, creterea lor este inhibat
de optochin iar coloniile sunt distruse de bil i sruri biliare (vezi capitolul 31). n
continuare reprezint o cauz important de morbiditate i mortalitate (prin
pneumonie comunitar).
30. 1. 2. 6.S. viridans. Fac parte din flora normal la nivelul tractului respirator superior.
n mod caracteristic sunt alfa-hemolitici, dar pot fi nonhemolitici. Creterea lor nu este
inhibat de optochin. Pot ajunge n torentul sanguin ca urmare a unei traume i
reprezint o cauz important a endocarditei care survine la pacieni cu valve cardiace
patologice. Unii streptococi viridans (exempluS. mutans) sintetizeaz polizaharide care
contribuie la geneza cariilor dentare.
30. 1. 2. 7.Peptostreptococii. Cresc numai n condiii anaerobe sau microaerofile i
produc n mod variabil hemolizine. Fac parte din flora bucal normal, flora tractului
respirator superior, intestinal i genital feminin. Particip, adesea n asociere cu alte
specii bacteriene, n infeciile anaerobe polimicrobiene abdominale, pelviene,
pulmonare sau cerebrale.
333
334
335
Erizipelul- apare atunci cnd poarta de intrare este reprezentat de tegument (form
particular de celulit); este caracterizat prin leziuni lucioase, eritemtoase, indurate,
sub forma unei plci cu margini distincte; adesea este cauzat de streptococii de grup A
i mai rar de grupurile C sau G. (Fotografia nr. 2)
Febra puerperalse dezvolt n cazul unei infecii streptococice intrauterine.
Sepsisul streptococic - n 1992, American College of Chest Physicians i Society of
Critical Care Medicine (ACCP/SCCM) au elaborat cteva criterii care pot orienta medicul
spre a pune diagnosticul de sepsis, criterii care au fost revizuite n 2001. (Tabelul nr. 2)
(4)
Infeciile osoase i articulare;
Fasciita necrotizant- inocularea poate fi de la nivelul pielii sau de la nivel intestinal.
Prevalen este mai ridicat la persoanele ce folosesc droguri pe cale intravenoas. Este
cunoscut i drept gangrena streptococic, streptococul primind (n mass-media)
numele de bacteria mnctoare de carte. Aceast entitate clinic poate avea
determinare polimicrobian, cu flor aerob i anaerob, incluznd i Clostridium
perfringens, Bacteroides spp. Cnd infecia se localizeaz la nivelul perineului se
numete gangrena Fournier. Tabloul clinic include: febr, durere foarte intens, eritem,
tromboz la nivelul microvascularizaiei care conduce la necroz, gangren, oc si
insuficien renal. n multe dintre cazuri evoluia este nefast, spre exitus. (Fotografia
nr. 3)
Meningita etc.
Faringita streptococic care este cea mai obinuit infecie datorat streptococilor betahemolitici. Streptococii viruleni de grup A ader la epiteliul faringian prin intermediul
acidului lipoteichoic. Fibronectina glicoproteic de la nivelul celulelor epiteliale servete
probabil ca ligand pentru acidul lipoteichoic. Extinderea la nivel amigdalian i eventual
la nivelul altor structuri poart numele de angin streptococic. Boala se manifest cu
durere n gt, rinofaringit, amigdalit roie i purulent (pultacee), ganglioni limfatici
cervicali mrii i dureroi, febr (39-40C). Poate avea loc (n special la copiii mici)
extinderea infeciei ctre urechea mijlocie, mastoid i meninge. De menionat c circa
10-20% din infecii pot fi asimptomatice. (Figura nr. 4)
Impetigo streptococic reprezint o infecie localizat la nivelul straturilor superficiale ale
pielii, n special la copii. La majoritatea pacienilor nu se gsete o leziune
337
exces de complexe imune antigen-anticorp, care circul i se depun la nivelul membranei bazale
glomerulare. Toi glomerulii sunt afectai, mari i infiltrai cu PMN, monocite i eozinofile. n
nefrita acut apar hematurie microscopic i macroscopic, proteinurie pna la sindrom
nefrotic, edeme la nivelul feei (ex. periorbitale), hipertensiune arterial, retenie de uree,
oligurie i anurie, ascit, congestie sistemic (dispnee, tuse, staz n jugulare, cardiomegalie,
galop, edeme); nivelul complementului seric este sczut.
30. 3. 4. 2.Reumatismul articular acut (RAA) reprezint cea mai serioas sechel a infeciei
streptococice (tegumentar dar mai ales respiratorie - la care par s fie predispui cei cu grupa
de snge A II), deoarece duce la afectarea valvelor i a muchiului cardiac. Anumite tipuri de
streptococi de grup A conin antigene care reacioneaz ncruciat cu structuri din esutul
cardiac uman sau cu structuri de la nivelul ganglionilor bazali.
RAA este precedat de o infecie streptococic.
n patogenia RAA sunt incluse toate tipurile de hipersensibilitate, n special cele de tip II
(citotoxic) i de tip IV (mecanism celular / ntrziat), dar i fenomene autoimune. Semnele i
simptomele specifice din RAA includ febr, poliartrit migratorie i semne legate de inflamaia la
nivel cardiac (cardita reumatismal). (Tabelul nr. 3)
Nu dorim s intrm n toate detaliile care vor fi studiate n cadrul modulului de cardiologie, dar
dorim s punctm cteva aspecte. RAA este o boal inflamatorie acut neinfecioas,
nesupurativ. Apare n comuniti aglomerate, nivel economic sczut, igien precar,
alimentaie defectuoas, tulburri de imunitate. Incidena maxim a fost nregistrat la grupele
de vrst 5-15 ani. Nu exist predispoziie de sex dar leziunile cardiace sunt diferite n funcie de
sex.
339
Caractere antigenice:
o Se pot utiliza teste comerciale pentru detectarea rapid a polizaharidului
specific de grup A al streptococilor piogeni n p.p., dup extracie chimic sau
enzimatic (ex. cu pronaz). Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea indirect (latexaglutinare), coaglutinarea sau ELISA.
o Prin reacii de aglutinare (latexaglutinare, coaglutinare) pe lam, sau precipitare
se pot determina antigenele streptococice de grup (Lancefield) sau de tip.
o S. pyogenes este mprit n serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste
100 de serotipuri) prin reacia de precipitare n tuburi capilare i T (peste 28
serotipuri) prin reacia de aglutinare pe lam. Aceste testri se fac n centre de
referin.
Alte teste utilizate n identificare:
o Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea direct a streptococilor de
grup A n exsudatul faringian.
o Dup amplificare genic (PCR) pot fi identificate secvenele genetice care
codific pentru diferitele tipuri de protein M (genele enm). Au fost descoperite
peste 120 de secvene genetice diferite, aceast metod fiind mai
discriminativ n comparaie cu metoda clasic, de tipizare a S. pyogenesi tinde
s completeze i eventual s nlocuiasc aceast metod.
o Relativ recent a fost propus tehnica MLST (multilocus sequence typing),
accesibil unorcentre de referin.
343
Toi pneumococii secret IgA1 proteaz (una dintre Zn-proteinazele produse de S. pneumoniae).
31. 2. 7. Rspuns imun
Imunitatea fa de infecia pneumococic are specificitate de tip i depinde att de anticorpii
care apar mpotriva polizaharidului capsular, ct i de funcia fagocitelor. Vaccinarea induce
producerea de anticorpi fa de polizaharidul capsular.
31. 2. 8. Caractere de patogenitate
S. pneumoniae este un microb condiionat patogen care, atunci cnd este implicat n patologia
uman, se manifest prin multiplicare i invazivitate. Virulena pneumococilor depinde de
capsul, care confer rezistena la fagocitoz. Un ser care conine anticorpi mpotriva
polizaharidelor specifice de tip protejeaz mpotriva infeciei. Dac un astfel de ser este absorbit
cu polizaharide specifice de tip i pierde puterea protectoare.
Ali factori de patogenitate ar fi reprezentai de:
- IgA1 proteaz;
- hemolizina intracelular (pneumolizina), eliberat prin autoliz (inhib chemotactismul pentru
PMN, inhib proliferarea limfocitelor i sinteza de anticorpi);
- proteinele de suprafa (PspA) care au unele asemnri cu proteina M de la S. pyogenes;
- neuraminidazele (NanA i NanB) i hialuronidaza.
Deoarece circa 30-70% din oameni pot fi la un moment dat purttori de pneumococi, mucoasa
respiratorie normal are un grad important de rezisten natural fa de aceste
microorganisme. Printre factorii care predispun la infecie ar fi de menionat:
- anomalii constituionale sau dobndite ale tractului respirator (infecii virale, alergii locale,
obstrucii bronice, afectri ale tractului respirator datorate unor substane iritante etc.);
- intoxicaia cu alcool sau droguri, care deprim activitatea fagocitar i reflexul de tuse;
- consumul de tutun (fumatul);
- malnutriia, debilitatea general, hiposplenismul sau deficienele sistemului complement.
din genul Moraxella. Sunt coci Gram-negativi, dispui n diplo, dar pot forma i lanuri scurte. Se
pot dezvolta att la 35-37C ct i la 28-30C. Pot forma colonii pe medii care conin colistin.
Dac n urm cu 35 de ani prezenta sensibilitate la penicilin, actualmente se cunoate faptul c
produce -lactamaz (3 tipuri enzimatice diferite); prezint, de regul, rezisten la penicilin,
ampicilin, meticilin, clindamicin i vancomicin. Este unul dintre micro-organismele care,
alturi de S. pneumoniae i tulpinile ne-tipabile de H. influenzae, este studiat n vederea
producerii unui vaccin care s previn apariia otitei medii.
N. gonorrhoeaese poate gsi la nivelul mucoaselor genitale la gazdele infectate (indiferent dac
infecia este sau nu simptomatic). A fost remarcat pentru prima dat de Albert Neisser
(1879): coci intra-leucocitari la examenul secreiei purulente din uretra masculin, la pacieni cu
gonoree. Cultivarea a fost realizat cu 3 ani mai trziu. Cea mai recent definit subspecie de N.
gonorrhoeae a fost identificat n secreii conjunctivale (N. gonorrhoeae subspecia kochii).
Nivele crescute de Lactobacillus, genul dominant n microbiota vaginal, au fost evideniate n
strns legtur cu un risc sczut de infectare n urma expunerii la N. gonorrhoeae. Lactobacillus
scade aderena N. gonorrhoeae cu pn la 50% i inhib invazia celulelor epiteliale cu pn la
60%. Mai mult dect att, lactobacilii au posibilitatea s disloce gonococii aderai ceea ce ne
poate conduce cu la ideea c ar putea ajuta la profilaxia postexpunere. (5)
N. meningitidis a fost izolat la persoane sntoase de la nivel nazal sau faringian. La pacienii cu
meningit meningococic, germenul se multiplic n lichidul cefalorahidian (LCR). A fost izolat
pentru prima dat n anul 1887 din LCR de la un pacient cu meningit acut.
n prima decad a secolului 20 meningita meningococic netratatat avea o rat a mortalitaii
de 75-80%. n 1913, Simon Flexner a fost primul care a gndit o form de terapie folosind serul
antimeningococic cabalin intratecal. Mortalitatea a fost redus la 31% pe un lot de 1.300
pacieni. n perioada 1928-1936 169 de copii au fost tratai n acest fel la spitalul Bellevue din
New York iar mortalitatea a sczut la 20%. n 1930 odat cu introducerea sulfonamidelor
mortalitatea a sczut la 5-15%. Totui, odata cu era antibioticelor a nceput i era rezistenei
la antibiotice. (6)
Att adulii ct i copiii pot fi colonizai de mai multe specii de Neisserii, n acelai timp (de ex.
Neisseria spp. nepatogene i N. meningitidis). Neiseriile saprofite / comensale au fost descrise
pentru prima dat n 1906, purtnd iniial alte denumiri. Ceea ce este relativ interesant, N.
flavescens (1930) i N. lactamica (1969) au fost izolate din LCR, motiv pentru care se presupune
c pot determina meningit. Ultima specie de Neisseria a fost definit n 1993, drept N. weaweri
(numele iniial fiind grupul CDC M-5; de origine canin i rar izolat din rnile pacienilor
mucai de cini).
n continuare vor fi prezentate doar dou dintre speciile enumerate, respectiv N. gonorrhoeae i
N. meningitidis, microorganisme cu necesiti nutritive complexe i care se pot dezvolta doar la
35-37C.
32. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Att meningococul ct i gonococul sunt diplococi Gram-negativi, reniformi, imobili, nconjurai
de o structur capsular comun, cu o structur de polifosfat sau polizaharid-polifosfat (n cazul
meningococului), situaie n care capsula este mai evident. (Figura nr. 1 i Figura nr. 2) n
funcie de structura capsulei exist mai multe serogrupuri.
32. 2. 3. Caractere de cultur
Ambele microorganisme au nevoie n vederea izolrii de utilizarea unor medii de cultur
mbogite, necesitile nutritive fiind mult mai mari n cazul gonococului (exist tulpini de
meningococ care se pot dezvolta pe medii simple, cu sruri minerale, lactat i aminoacizi).
Principial se pot multiplica n cazul folosirii mediului Mueller-Hinton (amintit i la antibiograma
difuzimetric), la o temperatur de incubare de 35-37C i n condiiile unei atmosfere de 3-10%
CO2. (Figura nr. 3, exsicatorul) Gonococul nu se multiplic n lipsa unor surse energetice
(glucoz, piruvat, lactat). Coloniile apar n 24-48 de ore, mai rapid n cazul meningococului.
346
347
Variaia antigenic este important, cu o valoare de circa 10-3 (pentru OPA, LOZ, piline) i este
util pentru eludarea mecanismelor de aprare ale gazdei. De menionat prezena anumitor
plasmide implicate n rezistena la antibioticele beta-lactamice.
Gonoreea apare adesea n cadrul coinfeciei cu HIV. LOZ induce imunitatea nnscut legnduse de TLR4. S-au investigat efectele LOZ din 5 tulpini diferite de Neisseria gonorrhoeae asupra
infeciei HIV i a provirusului din macrofage. Macrofagele care conineau LOZ au devenit
rezistente la infecia HIV i la provirus. (7)
Neisseria meningitidis
n cazul meningococului, pe lng LOZ mai este important de menionat structura capsular,
care permite subdivizarea speciei n 13 serogrupuri. Dintre aceste grupuri serologice (notate cu
litere), mai importante datorit implicrii n patologie sunt grupele: 29E, A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z
i W-135. Vaccinurile conin numai o parte dintre aceste antigene.
Att pilii, ct i tipurile de proteine menionate mai sus sunt prezente i n cazul meningococului
(piline de clasa I i II, porine de clasa 1, 2 i 3, proteina Rmp, proteina OPA de clas 5 etc), ns
fr fenomenele de variaie antigenic (genetic) menionate.
32. 2. 7. Rspuns imun
n infeciile cu gonococ apare un rspuns imun, dar datorit fenomenelor prezentate mai sus,
practic nu exist imunitate postinfecioas; aceeai persoan poate face infecii repetate.
n cazul meningococului, imunitatea este asociat cu prezena seric a anticorpilor anticapsulari, anti-lipooligozaharid i anti-membran extern, care apar dup infecii subclinice.
Nou-nscuii sunt n general protejai datorit anticorpilor de tip IgG provenii de la mam.
Infeciile meningococice reprezint o problem n special pentru persoanele care au un deficit al
sistemului complement (mai ales componentele C6-C9).
LCR conine molecule implicate n imunitatea nnscut (ex. sistemul complement), molecule
eseniale n controlul infeciei i n activarea infiltrrii cu fagocite (neutrofile, monocite). Totui,
celulele epiteliale ale stratului ependimal care intr n structura tubului neural sau ale plexului
coroid ar putea fi foarte vulnerabile la atacul citotoxic i citolitic al componentelor
complementului. Un studiu publicat n 2006 (8) a artat capacitatea celulelor epiteliale
cerebrale de a exprima la nivelul membranei receptori pentru reglarea activitii
complementare (CD35, CD46, CD55, CD59). Prin studii de dubl imunofluorescen pentru
markeri ai celulelor ependimale (GFAp, S100, ZO-I) i ai receptorilor pentru reglarea
complementului s-a ajuns la concluzia c aceste celule au o cantitate mare de CD55 i CD59 i
mai mic de CD46 i CD35. La nivel tisular s-a observat c CD55 era slab exprimat la nivelul
plexurilor coroide i celulelor ependimale de control dar exprimarea era crescut n meningit.
Anti-CD59 era prezent la nivelul ambelor epitelii n timp ce CD59 a fost identificat doar la nivelul
plexurilor coroide inflamate. CD46 i CD35 nu au fost identificate n esuturile de control. Pe de
alt parte, n meningit aceste molecule erau puternic exprimate. Acest studiu arat
posibilitatea structurilor cerebrale de a raspunde i susine imunitatea nnscut mediat de
complement. (8)
Anumite defecte ale sistemului complement au fost asociate cu o cretere a incidenei
infeciilor cu Neisseria meningitidis. S-au fcut teste n acest sens i s-a recoltat sange i ser de
la pacieni aduli care aveau deficit complet de C2 sau C5. Pacienii aveau de asemenea deficit
de mannose-binding lectin (MBL). Proliferarea meningococilor introdui n snge a fost evaluat
prin numrul de CFU (colony-forming unit) i prin Real-time PCR. S-a investigat activitatea
bactericid seric i cea opsono-fagocitic a granulocitelor incluznd ser inactivat termic
postvaccinare pentru a evalua influena anticorpilor antimeningococici. Proliferarea
meningococic a fost de 2log10 pentru CFU i 4 sau 5log10 copii ADN. Proliferarea a sczut
moderat dup corectarea deficitului de C2, dar dup corectarea deficitului de C5 toi
meningococii au fost distrui (remarcndu-se i un titru mare de anticorpi). Activitatea opsonofagocitic a fost strict dependent de C2, a aprut n serul normal i a crescut n serul
348
postvaccinare. Activitatea bactericid seric a depins doar de C2, C5 i titrul anticorpilor. MBL nu
a influenat n nici un fel aceti parametri. (9)
Imunitatea adaptativ este pilonul cel mai important. esutul limfoid asociat nazofaringelui
(NALT) este locul principal al rspunsului imun. LTCD4+ interacioneaz n cele din urm cu LB i
duc la secreie de IgA i IgG. IgA faciliteaz clearance-ul microciliar, aglutinarea patogenilor i
mpiedicarea adeziunii epiteliale precum i neutralizarea toxinelor secretate. (10)
32. 2. 8. Caractere de patogenitate
n cazul ambelor microorganisme, patogenitatea se datoreaz existenei factorilor care permit
ataarea de celulele gazdei, multiplicrii la poarta de intrare i respectiv capacitii de
invazivitate. Prezena capsulei i a lipooligozaharidului contribuie n mod difereniat (mai
important n cazul meningococului) n patogenia bolilor produse.
Pentru cteva detalii, lum n discuie Neisseria meningitidis unde aderarea are loc la nivelul
nazofaringelui. Acest prim pas este mediat de pili. Acetia se pare c se leag de o protein
reglatoare a complementului de pe membrana celular, CD46. Pilii duc la modificri posttranscripionale n cele din urm glicozilarea acestora poate accelera detaarea bacterian de
pe suprafaa celulei unde deja s-au format colonii. Prin alterearea acestui mecanism, de
adeziune, bacteriile scap din agregate i pot disemina i forma noi agregate n noi locuri. (11)
Pentru a particulariza doar o parte din fenomenele desfurate n cursul procesului infecios,
vom lua drept exemplu infecia cu N. meningitidis. n timpul invaziei, meningococul se
localizeaz preferenial n capilarele cerebrale unde viteza de curgere a sngelui este redus, la
fel ca n capilarele din nazofaringe, viteza creia trebuie sa i reziste n timpul colonizrii. De
asemenea, el trebuie s reziste i forelor mecanice, mucusului, rspunsului inflamator i tusei.
Prin intermediul anumitor structuri pe care le deine, meningococul duce la polimerizarea
actinei i auto-protecie (formarea unor structuri de protecie). n plus, meningococii formeaz
la suprafaa celulei biofilme alctuite din lipide i polizaharide (evitnd astfel contactul cu
sistemul imun). Procesul poate continua pe 2 ci: transcelular sau paracelular.
Nu doar LOZ este util n aderare, dar i de proteinele Opa i Opc. Opc se leag de proteinele
matrixului extracelular, precum vibronectina. Opa se leag de moleculele de adeziune celular a
antigenului carcinoembrionar, de heparan sulfat i integrine.
O alt molecul cu o importan foarte mare este TspA (T-cell stimulating protein A) care duce
la proliferarea LT i LB. Nu este cunoscut bine mecanismul de aciune.
Lund n discuie capsula, portajul este favorizat de pierderea capsulei (aceasta inhib aderena
i formarea biofilmului), n schimb, n cursul procesului infecios prezena capsulei este necesar
(11).
n cazul sexului feminin, gonoreea se localizeaz endocervical, dar se poate extinde la nivelul
uretrei, vaginului, glandelor Bartholin, trompelor uterine (n ultimul caz, cu posibilitatea apariiei
unor fibroze i obstrucii care conduc la sterilitate). Dac mama are gonoree i nou-nscutul se
nate pe cale natural, va aprea oftalmia gonococic (prevenit de ex. prin instilaii cu soluie
de nitrat de Ag 1% n sacul conjunctival).
Rareori gonococul poate disemina pe cale sanguin (bacteriemie), cu apariia unor leziuni
dermice, artrite, tenosinovite gonococice etc.
Neisseria meningitidis
Meningococul poate produce i alte infecii, dar este important de menionat c reprezint una
din primele trei cauze de meningit infecioas la aduli (alturi de Haemophilus influenzae i
Streptococcus pneumoniae). Contagiozitatea este mare, dar se estimeaz c meningita
meningococic apare la 1/1.000 din persoanele contaminate.
n producerea meningitei sunt implicate succesiv colonizarea mucoasei respiratorii (portaj = o
relaie de comensalitate ntre bacterie i gazd, fr ca gazda s prezinte vreun semn sau
simptom care s ne duc cu gndul la patologie), invazia local, bacteriemia (favorizat de
prezena capsulei), invazia meningeal, alterarea barierei hemato-encefalice, inflamaia n
spaiul subarahnoidian i creterea presiunii intracraniene. Apariia vasculitei cerebrale i
scderea fluxului sanguin la nivel cerebral reprezint factori de agravare. Activarea mai multor
cascade inflamatorii (n special datorit eliberrii unor cantiti importante de endotoxin) pot
conduce la instalarea unui sindrom de coagulare intravascular diseminat i la o evoluie
nefast spre deces.
Caractere de cultur: Coloniile de gonococ sunt de tip S sau M (vezi punctul 3).
Caractere biochimice:
Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Gonococul
metabolizeaz glucoza dar nu i maltoza.
Produc citocrom-oxidaz, un test cheie n identificare (vezi anexa nr. 2).
Testul catalazei (superoxol) este intens pozitiv.
Auxotipia evalueaz necesitile nutriionale ale gonococului.
Exist o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatic a Neisseriilor (ex. Quad
Ferm+, RIM, Minitek, Gonochek II etc).
Utiliznd galeriaAPI NH(manual) putem identifica specii de Neisseria, Haemophilus i
Branhamella catarrhalis, n circa 4 ore.
Caractere antigenice:
n funcie de structura lipooligozaharidului exist 6 serotipuri. Gonococii pot exprima simultan
mai multe structuri antigenic diferite, ceea ce creeaz probleme tehnice. Aceste testri se
realizeaz n centre de referin.
Prezena gonococului poate fi detectat direct n produsul patologic prin coaglutinare (suspensie
de S. aureus tip Cowan I stabilizat i sensibilizat cu Ac monoclonali antiprotein I din
membrana extern a gonococilor) sau printr-o tehnic imunoenzimatic, ELISA (cu Ac
policlonali).
Se pot utiliza Ac monoclonali cunoscui, pentru identificare gonococului prin tehnica
imunofluorescenei directe.
Caractere utilizate n tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate sau direct pentru p.p.:
Exist diferite tehnici (imunologice, biochimice, de biologie molecular) care sunt practicate
numai n centrele de referin.
351
LCR (Ligase Chain Reaction); aceast metod se poate utiliza pornind de la urin sau de la secreii
vaginale dar are un dezavantaj - costul.
5. Antibiograma (testarea sensibilitii tulpinilor izolate n vederea stabilirii tratamentului) este
recomandat i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice (mediul utilizat este GC
suplimentat nutritiv dar fr pulbere de hemoglobin). Au fost identificate tulpini rezistente la
penicilin (fie datorit unui plasmid care codific o -lactamaz de tipul TEM, fie datorit unor
mutaii cromozomiale). Este necesar testarea producerii de -lactamaz (de ex. folosind discuri
cu nitrocefin). Determinarea CMI se poate realiza prin metode clasice sau cu ajutorul testului E
(vezi capitolul 7).
32. 4. 2. n meningita meningococic diagnosticul este urgent (risc de deces i evoluie cu
sechele), de importan maxim fiind recoltarea i transportul rapid al LCR ctre laborator. Este
de preferat realizarea unei cultivri la patul bolnavului, chiar dac pentru concentrarea
germenilor este necesar centrifugarea LCR. Analiza citologic i biochimic a LCR este util n
stabilirea etiologiei.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct).
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile
cunoscute (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct
mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de
asepsie i antisepsie etc). Aa cum am menionat, recoltarea LCR prin puncie (dup verificarea
presiunii din artera central a retinei prin examinarea fundului de ochi) trebuie fcut pe ct
posibil la patul bolnavului, avnd la dispoziie tot ce este necesar pentru pregtirea frotiurilor,
cultivarea pe diferite medii de cultur, repartizarea unei cantiti de LCR pentru examenul
citologic i biochimic (vezi i anexa nr. 6). LCR poate fi purulent. n cazul n care p.p. urmeaz a fi
transportat ctre laborator, transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o temperatur
apropiat de 37C). Meningococul ar putea fi izolat i prin hemocultur, cultivarea secreiilor
nazale sau faringiene etc. Prezena meningococului poate fi detectat direct n produsul
patologic prin latex aglutinare, coaglutinare sau contraimunoelectroforez utiliznd seruri
polivalente anti - A, C, Y, W-135 i respectiv seruri monovalente anti - B (care pot fi utile i n
identificarea ncruciat a antigenului K1 al E. coli).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din
produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de
metilen (AM) i respectiv Gram. Dac LCR este franc purulent, frotiurile se pot executa direct din
p.p., n caz contrar realizm iniial centrifugarea LCR. Frotiurile se examineaz la microscopul
optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocilor
Gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun,
situai intra sau extraleucocitar.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat
obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i anexa nr. 2).
Meningococii sunt germeni pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, sunt aerobi,
facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii n care se include vancomicin,
colistin, trimetoprim i nistatin) sau neselective (ex. Mueller-Hinton, geloz-snge sau gelozchocolate) pe care formeaz colonii de tip S sau de tip M. Este necesar o atmosfer de 3-5%
CO2, la o temperatur de 37C.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
Caractere biochimice:
Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Spre exemplu
meningococul metabolizeaz att glucoza ct i maltoza.
352
32. 5. Tratament
Pentru tulpinile de gonococ sensibile se putea utiliza penicilina, avnd ca alternativ
spectinomicina sau ceftriaxona. n momentul actual unica atitudine corect este izolarea tulpinii
i tratamentul conform antibiogramei. Ca o regul general este de reinut c este strict necesar
ca tratamentul s fie aplicat tuturor partenerilor sexuali.
n meningita cu meningococ pot fi utile penicilina G, ceftriaxona sau cloramfenicolul, dar nu
trebuie neglijat utilitatea antibiogramei. Foarte recent (2007-2008), au fost identificate n SUA
tulpini de meningococ rezistente la ciprofloxacin. n meningit tratamentul este mai complex,
avndu-se n vedere posibilele complicaii.
353
355
356
357
mediu care are ca unic surs de carbon citratul (caracter metabolic important pentru
diferenierea de alte enterobacterii).
Tulpinile EHEC/VTEC, de regul, nu fermenteaz sorbitolul.
34. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici
Germenii supravieuiesc n mediul extern (sol, ap) luni de zile. E. coli este distrus prin expunere
la 60C n 30 minute. Este sensibil la aciunea antisepticelor i dezinfectantelor uzuale.
34. 2. 6. Structur antigenic
Ca i n cazul celorlalte enterobacterii, diversele structuri antigenice situate la suprafaa
tulpinilor de E. coli servesc aa numitei serotipizri, metod util n epidemiologia infeciilor
cauzate de aceste microorganisme. Cele trei tipuri de antigene detectate prin reacii serologice
antigen-anticorp (ex. reacia de aglutinare) sunt: antigenul O (somatic), antigenul H (flagelar) i
antigenul K (capsular). Antigenul O (LPZ) a fost descris la caracterele generale ale
enterobacteriilor i definete serogrupul (numerotarea grupului antigenic este de utilitate
epidemiologic; ex. serotipurile O55 i O111 sunt implicate n izbucniri epidemice de meningit
neonatal). Exist peste 170 de variante de Ag O.
n cadrul unui serogrup O, pe baza diversitii antigenelor H (prezente numai la tulpinile mobile,
care posed flageli) i K (prezente la tulpinile care posed capsul) se definesc serotipuri.
Serogrupurile i serotipurile se noteaz printr-o combinaie de litere i cifre (ex. O55:K59:H6).
Structurile de suprafa pot masca prezena antigenului somatic O.
n majoritatea cazurilor, tipizarea serologic a tulpinilor de E. coli se rezum la identificarea
antigenelor O i H (ex. O157:H7).
Anumite serotipuri sunt asociate frecvent cu sindroame clinice bine definite, dar trebuie
menionat c nu antigenele de suprafa confer virulen bacteriei. Cu toate acestea, definirea
serotipului poate fi sugestiv pentru identificarea unor clone virulente (ex. serotipul E. coli
O157:H7, marker pentru subgrupul EHEC din patotipul VTEC).
Datorit faptului c au fost identificate peste 170 de variante de antigen O, peste 50 de tipuri de
antigen H, peste 90 de tipuri de antigen de tip K i o serie de tipuri antigenice fimbriale
(antigene F), prin combinaiile acestora rezult peste 1.000 de tipuri antigenice de Escherichia
coli.
Unele dintre tulpinile de E. coli elaboreaz exotoxine (vezi 37.2.8 i 37.3). Acestea pot fi, la
rndul lor, structuri antigenice identificate in vitro prin reacii antigen-anticorp.
34. 2. 7. Rspuns imun
Apare un rspuns imun umoral care nu are semnificaie nici n ceea ce privete protecia fa de
boal i cel mai adesea nici n diagnostic. De reinut ns c, un titru nalt al anticorpilor anti
O157, detectat la pacienii cu sindrom hemolitico-uremic (SHU), poate fi util pentru diagnosticul
indirect (imunologic) al infeciei cu E. coli O157:H7 (3).
34. 2. 8. Caractere de patogenitate
Tulpinile de E. coli domin microflora facultativ anaerob a colonului la individul sntos, marea
majoritate ntreinnd cu aceasta relaii de simbioz benefice ambilor. Ele pot produce infecii n
condiiile n care gazda este imunodeprimat sau cnd depesc bariera intestinal i ajung n
zone normal sterile.
Exist ns i tulpini de E. coli care au o virulena intrinsec, putnd declana variate procese
infecioase la indivizii imunocompeteni. Tulpinile patogene de E. coli sunt clasificate n aa
358
359
cele moderat selective. S-a raportat apariia unor tulpini ce dezvolta colonii hipermucoide,
aceste tulpini avnd i o virulen crescut [3].
35. 2. 4. Caractere biochimice
Pe mediile multitest germenii au urmtorul comportament enzimatic: pe mediul TSI sunt
glucoz-pozitivi i uneori fermenteaz glucoza cu producere de gaz, sunt lactoz-pozitivi, nu
produc hidrogen sulfurat; pe mediul MIU sunt imobili, indol-negativi i ureaz-pozitivi; pot
crete pe medii avnd citratul drept unic surs de carbon. Sunt germeni catalaz pozitivi,
oxidaz negativi.
35. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici
Sunt puin rezisteni la cldur (distrui n 5-7 minute la 100C); pe sol, n alimente rezist un
mare numr de zile. Dezinfectantele obinuite i distrug n intervale de timp cuprinse ntre 30 de
minute i 2 ore.
35. 2. 6. Structur antigenic
Particularitile morfologice ale klebsiellelor se reflect n structura antigenic. Au fost descrise
antigene somatice O (LPZ) specifice de grup i antigene capsulare polizaharidice K, specifice de
tip. Exist peste 80 de tipuri antigenice, identificabile de ex. prin reacia de umflare a capsulei i
(prin analize serologice sau de microbiologie molecular).
35. 2. 7. Caractere de patogenitate
Klebsiella pneumoniae este un microorganism condiionat patogen, care poate fi implicat n
patologia uman prin multiplicare i invazivitate.
Factorii de patogenitate sunt reprezentai de capsula (antigenul K) care i confer rezisten fa
de fagocitoz i de endotoxina (antigenul O) eliberat dup distrugerea bacteriei.
Sideroforii membranari sechestreaz Fe2+ n focarul infecios, pentru a asigura un nivel adecvat
creterii bacteriene. Dei nu reprezint un rol central n patogenitate, ntr-un model murin de
peritonit, s-a demonstrat creterea virulenei tulpinilor de Klebsiella prin introducerea genei
care codific sideroforul aerobactin.
Biofilmul reprezint o matrice extrem de bine organizata ce nconjoar bacteriile. Ele
favorizeaz aderarea bacterian pe suprafaa cateterelor.
Adezinele cele mai ntlnite la tulpinile de Klebsiella pneumoniae sunt fimbriile de tipul 1 i 3.
Exist o interrelaie ntre adezinele exprimate i cantitatea de biofilm produs [4].
Considerat iniial ca fiind agent etiologic al pneumoniilor, s-a dovedit c numai 1-3 % din
pneumonii sunt produse de Klebsiella pneumoniae, dar aceste pneumonii pot fi extrem de grave
(pneumonii necrotice i hemoragice), n special la pacieni cu un sistem de aprare deficitar.
Klebsiella pneumoniae poate fi implicat ntr-o mare varietate de boli precum toxiinfecii
alimentare de tip infecios, infecii ale tractului respirator superior, infecii urinare etc. Din ce n
ce mai frecvent acest microorganism apare n infecii nosocomiale (de spital), la fel ca i
Klebsiella oxytoca. Klebsiella ozaenae a fost izolat din mucoasa nazal a pacienilor cu ozen
(atrofie progresiv a mucoasei cu pierderea mirosului) iar Klebsiella rhinoscleromatis s-a izolat
de la pacieni cu rinosclerom (granulom distructiv al nasului i faringelui).
Tulpini aparinnd serotipurilor 1-5 au fost izolate din abcese la nivel pulmonar, hepatic,
cerebral. Dintre acestea o tulpin de Klebsiella pneumoniae deosebit de virulent a fost izolat
n special n rile asiatice, aceast tulpin produce majoritatea abceselor hepatice primare
bacteriene [5-7]. ntr-un model murin, secvena de evenimente ce a condus la constituirea unui
abces bacterian primar dup inoculare oral a fost:
colonizare intestinal (la 12 ore),
diseminare extraintestinal (ntre 12 i 24 ore),
361
specificitate a acestor metode sunt foarte bune, dar trebuie s fie folosite cu pruden, pentru a
nu oferi rezultate fals-negative prin limitarea altor germeni posibili implicai n procesul
patogenic. [11]
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
Caractere biochimice:
alte caractere biochimice se studiaz dup repicarea unor colonii pe medii multi- test (TSI,
MIU), pe mediul Simmons sau n sisteme multi-test comerciale de tip API;
produce acetoin din glucoz, caracter evideniat prin reacia Voges-Proskauer (adugarea
de hidroxid de potasiu duce la virarea n rou a unei culturi bacteriene n care se afl acetoin,
n prezena unui indicator de pH precum alfa-naftol).
Caractere de patogenitate: se poate utiliza inocularea la oarecele alb (vezi i anexa nr. 2).
Alte caractere / teste utilizate n identificare care se pot utiliza (n centre de referin):
bacteriocinotipie;
caractere testate prin metode ale biologiei moleculare (stabilirea spectrului plasmidic, cu
identificarea plasmidelor implicate n virulen etc.).
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii
tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice.
Determinarea CMI i CMB poate fi necesar (vezi capitolul 7). Klebsiella pneumoniae reprezint
unul dintre microorganismele cu o rezisten remarcabil fa de antibiotice i chimioterapice.
Cnd sunt detectate, tulpinile productoare de -lactamaze i carbapenemaze necesit teste
moleculare pentru a determina cu exactitate substratul rezistenei.
363
365
Modul n care o tulpin este definit din punct de vedere antigenic cuprinde 3 pri (antigenul
O, faza 1 de la antigenul H i faza 2 de la antigenul H).
Antigenul O este caracteristic tuturor microbilor Gram-negativi. Exist peste 60 de structuri
antigenice O diferite care definesc 46 de serogrupuri O; unul sau mai muli factori asociai
determin formula antigenic a unei anumite grupe serologice care este notat cu literele mari
ale alfabetului sau doar cu cifrele respective (AZ, O51O67) (1 ... 51 ... 67). A fost descris
fenomenul de variaie genetic n legtur cu antigenul O.
Antigenele de nveli includ de exemplu antigenul Vi la S. typhi i Salmonella ser. Paratyphi C;
structurile antigenice Vi reprezint substratul de fixare a bacteriofagilor, acoper antigenul O i
nu permit reacia de aglutinare; se asociaz virulenei i invazivitii (determin leucopenie, nu
permit legarea componentei C3b i n acest mod inhib fagocitoza i determin capacitatea de
multiplicare intrafagocitar).
Antigenul H este de natur proteic, se gsete la nivelul cililor peritrichi, este determinant de
tip, cu posibilitatea unei variaii de faz. Majoritatea serotipurilor de Salmonella pot exprima
alternativ dou tipuri de flageli cu specificiti antigenice diferite. Din 1986 s-a vzut c unele
tulpini de Salmonella pot exprima trei sau mai multe tipuri de flageli cu antigenicitate distinct.
Variaia antigenic se poate realiza de ex. prin transducie existnd mai multe posibiliti: pot
pierde antigenul H i devin imobile; pot pierde antigenul O, coloniile S se transform n colonii
R; pot pierde parial sau total antigenul Vi (homopolimer de acid N acetil-galactosaminuronic).
Exist antigene i la nivelul fimbriilor. Apariia anticorpilor anti fimbrii de tipul 1 la pacieni cu
febr tifoid sau la persoane care au fost vaccinate, poate duce la apariia unor reacii falspozitive n cadrul analizei serice cantitative (reacia de aglutinare n tuburi).
Schema de clasificare Ewing a fost prezentat anterior. Schema de identificare serologic
Kaufmann-White submparte genul Salmonella n foarte multe grupe i specii, spre ex. n
grupul A, S. paratyphi A; n grupul B, S. paratyphi B, S. typhimurium; n grupul C, S. paratyphi C;
n grupul D, S. typhi, S. enteritidis etc. Conform schemei Kaufman-White exist S. dublin, care n
schema Ewing poart numele de S. enteritidis serotipul dublin. Exist i alte scheme de
clasificare.
39. 2. 7. Rspuns imun
Apare rspuns imun umoral detectabil n special dup infeciile extraintestinale. Este cert
apariia rspunsului imun dup infecii produse de S. typhi i paratyphi (Paratyphi), cu punerea
n eviden a anticorpilor circulani anti O, anti H i anti Vi. Anticorpii anti O i anti Vi au rol
protector. Apariia anticorpilor din clasa IgA secretorii pot mpiedica ataarea la nivelul
epiteliului intestinal.
39. 2. 8. Caractere de patogenitate
Salmonella spp., devine patogen prin multiplicare i invazivitate. Primul pas, obligatoriu, este
reprezentat de colonizare, realizat cu ajutorul unor structuri de aderare, adezinele i fimbriile,
care induc modificri la nivelul membranei celulare. Studii de fiziopatologie fundamental au
reprezentat prima dovad a existenei unui receptor hormonal afectat prin ataare i invazie
bacterian.
De menionat faptul c la genul Salmonella a fost pus n eviden un grup de gene (genele de
invazivitate), unele din ele fiind asemntoare cu gene identificate la genul Yersinia.
Salmonella spp., supravieuiete intrafagocitar datorit prezenei unor structuri de suprafa
precum i prin sinteza unor proteine (peste 40 de proteine diferite) care apar ca rspuns la
fagocitare. Antigenul Vi contribuie (pentru S. typhi i Salmonella Paratyphi C la rezistena la
fagocitoz i rezistena dup fagocitoz).
Endotoxina (antigenul O, LPZ) eliberat dup distrugerea germenilor, are un rol important n
patogenitate.
Tulpinile care produc toxiinfecii alimentare secret enterotoxine cu proprieti antigenice i
biologice asemntoare toxinei holerice.
367
368
369
Infecia cu Shigella spp. duce la stimularea rspunsului imun umoral, cu apariia de anticorpi
care ns nu confer protecie. Apariia de anticorpi locali de tip IgA (eventual dup
administrarea de vaccinuri vii atenuate) ar putea avea o utilitate n prevenirea infeciei.
40. 2. 8. Caractere de patogenitate
Shigella este patogen prin multiplicare i invazivitate. n cazul serotipului 1 din subgrupul A (Sh.
shiga) este implicat i toxigeneza.
La fel ca toate microorganismele Gram-negative, shigellele elaboreaz lipopolizaharidul parietal,
care se elibereaz ca endotoxin, dup distrugerea bacteriei. Endotoxina (antigenul O) este
implicat n patogenia dizenteriei, avnd o aciune iritativ la nivel intestinal.
Exotoxina shiga afecteaz att intestinul (fiind implicat n mecanismul de producere al diareei),
ct i sistemul nervos central (putnd conduce la apariia unor fenomene de meningism sau
chiar pierderea strii de contien, com). Fa de animalele de experien are efect letal.
370
372
373
374
opsonizarea. n infeciile cronice, la aceti pacieni, a fost demonstrat trecerea tulpinilor din
forme S n forme de tip M, datorit unor mutaii care au fost identificate recent (2008).
375
Habitatul natural al vibrionilor include sursele de ap dulce i srat, unde exist liberi sau n
asociaie cu diferite vieti acvatice. Vibrio cholerae se gsete n intestinul i n materiile fecale
ale omului bolnav de holer. Prezena vibrionului holeric n mediul extern este explicat prin
contaminarea fecal i supravieuirea vibrionilor, existnd i posibilitatea unui ciclu de via
extraintestinal.
44. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
La izolarea primar, V. cholerae este un bacil Gram-negativ, curbat (forma de virgul a devenit
mai mult o reprezentare istoric), lung de 2-4 mm, mobil cu ajutorul unui flagel polar.
44. 2. 3. Caractere de cultur
Sunt germeni puin pretenioi i se pot dezvolta pe medii de cultur simple, inclusiv n apa
peptonat, ceea ce este util n izolarea primar (formeaz un vl la suprafaa mediului). V.
cholerae se dezvolt bine la un pH alcalin (9-9,5), mediile cu un astfel de pH avnd rolul de
medii de mbogire.
V. cholerae produce pe mediile de cultur solide colonii convexe, rotunde, de tip S cu un aspect
opac. Se dezvolt foarte bine la 37C pe multe tipuri de medii, inclusiv pe medii ce conin sruri
minerale i asparagin ca surse de carbon i azot. Crete bine pe TCBS (tiosulfat-citrat-bilsucroz-agar), pe care produce colonii galbene.
44. 2. 4. Caractere biochimice
V. cholerae fermenteaz de obicei sucroza i manoza. Fermenteaz glucoza. n funcie de
fermentarea zaharurilor vibrionii se pot submpri n grupe. Au metabolism respirator i
fermentativ. Sunt aerobi, facultativ anaerobi.
Testul oxidazei (pozitiv n cazul vibrionului holeric) este un test cheie n identificarea
preliminar. Majoritateavibrionilor sunt halotolerani i adesea prezena NaCl le stimuleaz
creterea prin alcalinizarea mediului.
44. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici
Vibrionii holerici sunt foarte sensibili la lumina solar i la aciunea cldurii (la 100 sunt distrui
aproape instantaneu); sunt sensibili la antiseptice. N ALIMENTE TRIESC (CU UNELE EXCEPII)
PN LA 7 ZILE. N AP SUPRAVIEUIESC UN NUMR DE ZILE, N FUNCIE DE EFICACITATEA
TRATAMENTULUI APLICAT APELOR UZATE. N INTESTINUL BOLNAVILOR NETRATAI SE POT
MENINE CTEVA SPTMNI.
44. 2. 6. Structur antigenic
Vibrionul holeric prezint la nivel parietal antigenul O (lipopolizaharid). n funcie de structura
antigenului somatic de grup O, vibrionii holerici au fost mprii n 6 serogrupe; vibrionul holeric
clasic i biotipul El Tor fac parte din grupul O:1, ceilali vibrioni fiind non-O:1NAG (nonaglutinabili cu seruri anti-O:1); aceste microorganisme nu pot fi distinse biochimic de vibrionul
holeric O:1. Abordri taxonomice au demonstrat c Vibrio cholerae O:1 i non-O:1 reprezint de
fapt aceleai specii. Antigenul serogrupului O:1 are determinani care fac posibil diferenierea
serotipurilor. MPRIREA VIBRIONULUI HOLERIC N SEROTIPURI I BIOTIPURI ESTE UTIL N
STUDII EPIDEMIOLOGICE, DAR TESTELE SE FAC NUMAI N LABORATOARE SPECIALIZATE.
Exist antigene la nivelul pililor.
Fiind mobil, vibrionul prezint antigenul H la nivel ciliar.
Vibrionul holeric i vibrionii nrudii produc o enterotoxin labil fa de cldur, cu masa
molecular de 84.000 Da, alctuit din dou subuniti A i B (activ i de legare).
44. 2. 7. Rspuns imun
Aciditatea gastric furnizeaz o oarecare protecie n cazul ingerrii unui numr mic de vibrioni.
Dup holer apare imunitate fa de reinfecie, dar durata i gradul acesteia nu sunt cunoscute.
La animalele de experien apar anticorpi specifici de tip IgA n lumenul intestinal. Anticorpii
fa de antigenul O protejeaz animalele de laborator fa de infectare. Anticorpi similari apar n
serul uman dup infecie i se consider c sunt asociai (ntr-o oarecare msur) cu protecia
376
Infeciile cu Vibrio cholerae grup non O:1sunt asociate cu cazuri de gastroenterit i cu infecii
extraintestinale. Sepsisul datorat grupului non O:1 a fost mai rar raportat (ex. la aduli cu
imunitate deficitar). Totui, a fost raportat un caz de sepsis cu Vibrio cholerae grup non O:1
plus gastroenterit la un copil de 8 ani, pacientul prezentnd diaree cu snge, febr i
deshidratare sever; vibrionii non O:1 au fost izolai din snge i din materiile fecale. (1)
3.
Flagelul: motilitatea este important pentru colonizarea gazdei de ctre bacterie. C. jejuni
prezint chemotaxie pentru aminoacizii i alte componente ale mucusului tractului intestinal.
4.
Toxina CDT (Cytolethal Distending Toxin) este produs i de alte bacterii (E. coli, Haemophilus
ducreyi, Helicobacter hepaticus). Aceasta cauzeaz oprirea ciclului celular n celulele-gazd.
Mecanismele precise prin care CDT ajunge la nivelul nucleului sunt nc n studiu.
5.
Molecule de adezivitate: sunt utilizate diferite proteine de adezivitate cum ar fi CadF, JlpA,
Peb1.
379
este descris n documentul suplimentar (Anexa nr. 1) mai precis stimularea secreiei de IL8 de
ctre acidul diaminopimelic.
Pentru a evita rspunsul imun nnscut, este necesar neutralizarea receptorilor Toll-like
(prescurtai n continuare TLR). Acetia recunosc PAMPs (pathogen associated molecular
patterns), adic recunosc anumite molecule specifice pentru o mare varietate de ageni
patogeni care sunt diferite din punct de vedere structural de moleculele organismului gazd.
Astfel, receptorii TLR-5 recunosc flagelina caracteristic mai multor specii bacteriene, ns nu i
pe cea coninut de H. pylori. TLR-9 recunosc ADN nemetilat al majoritii bacteriilor, dar H.
pylori are un ADN puternic metilat. LPS (lipopolizaharid) a suferit modificri, astfel nct este
recunoscut doar de TLR-4 de pe macrofage, nu ns i de receptorii aflai pe celulele epiteliale
gastrice. Unul din puinele mecanisme ale imunitii nnscute care nc este activat de catre H.
pylori este calea acid diaminopimelicNOD1stimularea NFkBsecreie IL8neutrofile (NOD
like receptors sunt un alt tip de pattern recognition receptors, receptori care recunosc PAMPs).
Pentru imunitatea dobndit sunt necesare prezentarea antigenelor i proliferarea LT,
evenimente inhibate de ctre vacA, dup am prezentat n Anexa nr. 1.
n timpul rspunsului imun dobndit, limfocitele Th0 (naive) se pot diferenia fie n Th1 (care
secret IL2 i IFN), fie n Th2 (care secret IL4, 5 i 10). Th2 stimuleaz LB care produc anticorpi
mpotriva patogenilor extracelulari, n timp ce Th1 stimuleaz rspunsul imun celular,
caracteristic pentru infeciile cu microbi intracelulari. n mod paradoxal H. pylori genereaz un
rspuns predominant Th1. Studiile pe oareci au artat ca acest raspuns predominant Th1 este
asociat cu apariia gastritei, n timp ce un rspuns Th2 este protector fa de inflamaia gastric
(gastrita se pare c este cauzat de secreia de IFN, o citokin caracteristic rspunsului imun
tip Th1). Studiile epidemiologice la om au artat o polarizare mai puin pronunat a rspunsului
imun. (Tabelul nr. 3 i Figura nr. 4)
45. 3. 1. 8. Caractere de patogenitate
H. pylori prezint structuri cu rol n patogenitate, respectiv antigenul de suprafa (de
colonizare, aderare), antigenul somatic O (endotoxina), toxina citotoxic care iniiaz inflamaia
local acionnd asupra celulelor din epiteliul gastric i duodenal i toxina care inhib secreia
acidului clorhidric la nivelul celulelor parietale gastrice (Anexa nr. 1)
Se pare c un rol destul de important n patogenitate l au ureaza, ca i prezena cililor.
glandelor gastrice i instalarea gastritei atrofice. Atrofia gastric reprezint unul dintre cei mai
importani factori de risc pentru cancerul gastric, mai multe ipoteze fiind formulate pentru a
explica trecerea de la atrofie la cancer. Cea mai cunoscut dintre acestea cuprinde secvena
atrofiemetaplazie intestinaldisplazieadenocarcinom. (Figura nr. 6)
Gastrita predominant antral se caracterizeaz prin hipergastrinemie care de aceast dat
acioneaz prin stimularea celulelor parietale care vor crete secreia de acid, rspunsul final
fiind reprezentat de ulcerul duodenal. Ulcerul duodenal este asociat cu scderea pH-ului
secreiei gastrice, n timp ce ulcerul gastric este asociat cu scderea mijloacelor de aprare ale
mucoasei stomacului. (Figura nr. 7)
382
383
Dup cultivare pe mediu Loeffler, apar ca bacili Gram-pozitivi, mciucai (Korynee nseamn
mciuc, ciomag), cu tinctorialitate inegal datorit prezenei granulelor de polifosfat
(corpusculi Babe-Ernst) i cu o dispoziie care ar putea fi comparat cu literele V, L etc. sau cu
nite litere chinezeti. Se poate afirma c bacilul difteric, cu o compoziie a peretelui celular
care cuprinde mai puin murein (circa 50-60%), este Gram-pozitiv la limit. Pe alte medii de
cultur morfologia este mai puin caracteristic.
Bacilii difteroizi (de exemplu C. hoffmanni, C. xerosis etc) prezint o colorare uniform i sunt
dispui n palisade.
46. 2. 3. Caractere de cultur
Bacilul difteric este izolat n cultur pur pentru prima oar n anul 1884, cnd Loeffler utilizeaz
un mediu cu ser coagulat de bou (mediul Loeffler). Dei este inclus ntr-o singur specie, bacilul
difteric prezint variabilitate n ceea ce privete caracterele de cultur i de metabolism,
deosebindu-se mai multe tipuri. Coloniile au aspect de cretere de tip R (rough). Pe mediul
Loeffler (mediu electiv) coloniile se dezvolt n 8-12-18 ore, iar aspectul pe frotiu este cel
caracteristic.
Trei tipuri de colonii (cu grade variate de patogenitate) se evideniaz pe mediile cu telurit (de
exemplu Gundel-Tietz): tipul gravis produce colonii nehemolitice, mari, cu suprafa granular,
gri-negre, n margaret, cu margini crenelate; tipul mitis produce colonii hemolitice, convexe,
cu margini circulare, de tip S; tipul intermedius produce colonii nehemolitice, mici, cu margini
circulare, cu suprafaa granular.
n cursul diagnosticului unei infecii cu bacil difteric este necesar utilizarea mediului de
mbogire OCST (ou-cistein-ser-telurit), un mediu lichid.
46. 2. 4. Caractere biochimice
Dei se poate multiplica pe medii simple, bacilul difteric are o dezvoltare mai favorabil pe medii
mbogite cu proteine animale (de exemplu ou, ser de bou).
Capacitatea de fermentare a mono i dizaharidelor permite identificarea speciei n cadrul
genului, iar fermentarea polizaharidelor permite stabilirea tipului (gravis) n cadrul speciei.
Bacilul difteric produce cistinaz (care descompune cistina, elibernd H2S), reduce srurile de
telur i elaboreaz bacteriocine.
46. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici
Poate rezista n fragmente din falsele membrane. Este distrus de cldura umed (10 minute la
60), alcool sau antiseptice uzuale, precum i de antibiotice (eritromicin, penicilin etc).
46. 2. 6. Structur antigenic
Exist diferene serologice ntre diferitele tulpini de Corynebacterium diphtheriae, dar nu s-a
putut elabora o clasificare serologic satisfctoare. n diagnostic nu se folosesc identificrile
serologice.
Cea mai important structur antigenic este reprezentat de toxina difteric, un polipeptid
termolabil cu greutatea molecular de 62.000 Da, care conine cel puin patru determinani
antigenici diferii.
46. 2. 7. Rspuns imun
Determin un rspuns imun umoral. Anticorpii antimicrobieni pot fi identificai, dar nu ofer
protecie (sunt specifici de tip). Anticorpii antitoxin (care este identic la toi bacilii difterici
toxigeni) ofer protecie (neutralizeaz toxina). Titrul protector trebuie s fie mai mare de 0,03
UA / ml.
46. 2. 8. Caractere de patogenitate
Bacilul difteric poate fi patogen prin multiplicare (la poarta de intrare) i toxinogenez (tulpinile
lizogenizate). Toxina (exotoxin) este aceeai pentru toate tulpinile toxigene. Infectarea cu
bacteriofagul temperat poate duce la starea de lizogenizare. Deoarece exist fagi tox+ i fagi
tox-, exist tulpini lizogene care produc i tulpini lizogene care nu produc toxin difteric.
384
n cazul producerii toxinei, s-a dovedit faptul c prezena fierului este esenial, producia
optim realizndu-se la concentraii care variaz ntre 0,14-0,50 mg Fe / ml.
Toxina difteric este alctuit din dou fragmente legate prin puni disulfidice. Fragmentul B
(greutate molecular 38.000 Da), reprezint fragmentul de legare pe receptorii specifici ai
celulelor susceptibile i faciliteaz ptrunderea fragmentului A. Fragmentul A este activ i inhib
elongarea lanurilor polipeptidice n curs de formare, cataliznd inactivarea translocazei ARNt
(numit factor de elongare 2) prezent numai n celulele eucariote. Factorul de elongare 2 este
necesar pentru translocarea polipeptidil-ARNt de pe situsul acceptor pe situsul donor al
ribozomului celulei eucariote; prin inactivarea lui nu mai are loc interacia ARNm-ARNt i se
stopeaz adugarea a noi aminoacizi lanului polipeptidic n curs de formare.
n mod practic, toxina difteric (fragmentul A) catalizeaz o reacie prin care se elibereaz
nicotinamid i adenozin difosfat riboz, care cuplndu-se cu factorul de elongare 2 formeaz
un complex inactiv (o toxin asemntoare ca mod de aciune poate fi produs de unele tulpini
de P. aeruginosa). O molecul de toxin oprete sinteza proteic n celul pentru mai multe ore.
Doza letal este de 0,1 mg / kg.
Genul Clostridium include peste 170 de specii (fa de 83 specii listate n 1986) care se pot gsi
n intestinul animalelor i se pot elimina n mediul exterior prin materiile fecale. O parte dintre
aceste specii sporuleaz. Cele mai multe dintre specii sunt anaerobe.
Fenomenul de anaerobioz a fost descoperit n anul 1861, de ctre Louis Pasteur, care a
identificat i fermentaia butiric produs de Vibrion butyrique (numele actual fiind Clostridium
butyricum). Pn n anul 1880, aceste specii erau incluse n genul Bacillus.
Reprezint un grup foarte heterogen, n cazul cruia secvenierea ARNr 16S nu a condus la o
clasificare suficient de clar. Se discut despre existena a 19 sub-grupuri.
Spre exemplu, primul sub-grup include: Clostridium tetani, C. botulinum, C. baratii, C. butyricum
etc. Trei dintre aceste sub-grupuri includ peste 70% din flora normal intestinal.
Sunt bacili Gram-pozitivi (uneori la limit), de dimensiuni mari, aezai n perechi sau lanuri,
mobili cu cili peritrichi (ex. cu excepia C. perfringens sau a C. butyricum). Multe dintre specii
sintetizeaz exotoxine.
n cele ce urmeaz vom discuta despre speciile care produc tetanosul, botulismul i gangrena
gazoas.
Tetanosul este produs de Clostridium tetani patogen prin multiplicare la poarta de intrare i
toxinogenez (produce o exotoxin neurotrop). Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibai
de ctre glicin i acidul g aminobutiric. Toxina blocheaz eliberarea acestor mediatori ceea ce
determin excitarea neuronilor motori spinali, cu apariia de spasme severe i dureroase ale
musculaturii striate (paralizie spastic). Contiena este pstrat. Toxina poate ajunge la nivelul
SNC i retrograd prin propagare pe cale axonal de la poarta de intrare sau pe cale sangvin.
Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale musculaturii din zona contaminat, apoi ale
muchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se mai poate deschide) i facies de tip
risus sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul extern precipit un atac de
tetanos. Moartea se poate produce prin asfixie; mortalitatea este de circa 50%.
Botulismul apare de obicei prin ingestia de alimente care conin toxina produs de Clostridium
botulinum, fiind o toxiinfecie alimentar de tip toxic (toxin preformat n aliment). Toxina
botulinic este cea mai puternic otrav cunoscut; doza letal pentru om este de circa 1-2 mg.
Dup ingerare, toxina se resoarbe la nivel intestinal, ajunge n circulaie, iar pe aceast cale la
nivelul plcilor neuromotorii unde mpiedic eliberarea de acetilcolin (determin paralizie
flasc). Paralizia ncepe la extremitatea cefalic (ex. paralizia muchilor globilor oculari care
apare la 18-24 ore de la ingestie i se manifest prin diplopie) i evolueaz descendent. Decesul
poate surveni prin asfixie (datorit paraliziei muchilor respiratori). Botulismul infantil (posibil i
386
la aduli) este urmare a formrii toxinei botulinice prin germinarea la nivel intestinal a sporilor
ingerai. Mortalitatea n botulismul neo-natal este foarte mare. Botulismul plgilor poate aprea
la persoane care folosesc droguri injectate intravenos sau prezint leziuni contaminate cu
pmnt.
Gangrena gazoas este produs de dou sau mai multe dintre urmtoarele specii: C.
perfringens, C. novyi (C. oedematiens), C. septicum, C. histolyticum, C. sporogenes etc. Sporii
clostridieni ajung la nivel tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). n condiii de
anaerobioz sporii germineaz, formele vegetative se multiplic, fermenteaz zaharuri i apare
gaz. Distensia tisular, obstrucia mecanic a structurilor vasculare n conjuncie cu sinteza de
toxine favorizeaz diseminarea infeciei. Enzimele (toxinele) produse contribuie i la alterarea
grav a strii generale. Gangrena gazoas este caracterizat prin edeme dure, crepitante
(datorit prezenei de gaz) i necroz. Necroza tisular se extinde, multiplicarea bacterian se
amplific, apare anemie hemolitic, toxemie i evoluie (n 20-80% din cazuri) ctre deces.
Clostridium tetani
Tetanosul a fost cunoscut nc de pe vremea lui Hipocrate, sau chiar i nainte de meniunile
fcute de acesta. Etiologia tetanosului a reprezentat un mister pn n anul 1884 (anul
vizualizrii la microscop a bacilului tetanic); n anul 1889 au fost obinute primele culturi de C.
tetani.
49. 1. Definiie. ncadrare
Sunt germeni strict anaerobi, sporulai, necapsulai, mobili, cu cili peritrichi, care se poate
identifica pe sol (germeni telurici). Clostridium tetani reprezint o specie patogen prin toxinele
(exotoxine) neurotrope elaborate.
49. 2. Caractere generale
49. 2. 1. Habitat
n stare vegetativ sunt prezeni n intestinul omului i al animalelor. Eliminai n mediul extern
(pe sol), sporuleaz. Sporii sunt foarte rezisteni.
49. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili mari, Gram-pozitivi, cu capetele rotunjite, mobili, cu cili peritrichi. n prezena
oxigenului sporuleaz, formnd un spor terminal, mai mare dect diametrul celulei bacteriene,
care confer germenului aspectul de b de chibrit.
49. 2. 3. Caractere de cultur
Cresc pe medii simple, n condiii de anaerobioz, formnd colonii rotunde, de tip S, nconjurate
de o zon pufoas.
49. 2. 4. Caractere biochimice
Elaboreaz o hemolizin, o exotoxin neurotrop, proteaze, gelatinaze etc.
387
388
49. 5. Tratament
Tratamentul trebuie realizat de urgen, prin administrarea de ser antitetanic (cu msurile de
precauie necesare n cazul seroterapiei) i eliminarea focarului tetanigen, pentru a se mpiedica
formarea unor noi cantiti de toxin. La tratamentul specific se asociaz administrarea
anatoxinei tetanice.
49. 6. Epidemiologie
Sursa de infecie este reprezentat de om i animale (prin dejectele acestora care ajung pe sol).
Transmiterea se face prin intermediul pmntului contaminat cu spori. Poarta de intrare este de
obicei o plag contaminat cu pmnt ce conine spori de bacili tetanici (plag cu risc
tetanigen).
n anul 1998, n Romnia au fost nregistrate 23 cazuri de tetanos ceea ce corespunde unei
incidene de 0,10/0000; n timp de n anii 1999-2000 au fost raportate 19, respectiv 14 cazuri de
tetanos. Numrul de cazuri raportate i respectiv incidena, au avut o evoluie fluctuant n
perioada 2001-2006, tendina general fiind de scdere (cel mai mare numr de cazuri a fost
raportat n 2001, 24 de cazuri iar cel mai mic n 2005, 8 cazuri). n anul 2006 au fost raportate
10 cazuri de tetanos, incidena fiind 0,050/0000).
n SUA au fost notificate 50 de cazuri n 1997 (inciden 0,020/0000) i respectiv 41 cazuri n 1998
i 40 de cazuri n 1999. n perioada 2000-2005 au fost raportate ntre 20 (2003) i 37 (2001) n
fiecare an. n anul 2005 au fost raportate 27 cazuri (inciden 0,010/0000). Este de menionat c
s-a nregistrat decesul n cazul a dou paciente (una n vrst de 94 ani care nu a fost niciodat
vaccinat anti-tetanic i a doua n vrst de 73 de ani, la care nu au putut fi gsite date cu privire
la vaccinri efectuate anterior).
49. 7. Profilaxie
Se adreseaz plgilor cu risc tetanigen, plgilor contaminate cu alte bacterii aerobe piogene
care consum oxigen i cele contaminate cu pmnt; acestea asigur condiii de anaerobioz, n
care sporii trec n form vegetativ, se multiplic i elaboreaz exotoxina ce ajunge la nivelul
centrilor motori bulbari.
Se face profilaxia tetanic a urmtoarelor tipuri de plgi:
- plgi nepate profunde, n care nu exist o suprafa de contact cu oxigenul;
- plgi traumatice mari, profunde, cu margini neregulate, cu resturi de esuturi devitalizate care
consum oxigenul din plag i care creeaz condiii de anaerobioz;
- plgi postoperatorii (septice) sau posttraumatice.
n orice situaie este obligatorie toaleta chirurgical a plgii, ce const n:
- deschiderea larg a plgii;
389
Avnd n vedere datele anamnestice, datele clinice i epidemiologice, s-a decis administrarea
unui rapel cu vaccin anti-tetanic (care s-a efectuat n muchiul deltoid al membrului superior
drept) dar i administrarea seroterapiei (anticorpi anti-toxin tetanic) la nivelul muchiului
deltoid al membrului superior stng.
Cu toate acestea, a fost necesar ca pacientul s fie internat ntr-o rezerv, ferit de orice stimul
(luminos, sonor etc) n msura posibilitilor, tiindu-se c reaciile i contracturile musculare
pot fi extrem de puternice i, pentru o perioad de 3 sptmni a primit tratament simptomatic
i i-au fost supravegheate i meninute funciile vitale.
Este de subliniat faptul c vaccinarea anti-tetanic ar trebui s fie administrat din 10 n 10 ani
la orice persoan, indiferent dac are sau nu o plag cu risc tetanigen.
Evoluia n cazul acestui pacient a fost favorabil, fiind externat la finele celor 3 sptmni.
49. 8. 2. Situaia a fost ns dramatic diferit n cazul unui alt pacient, n vrst de 11 ani, din
aceeai regiune a rii. Copilul se plimba cu bicicleta i din neatenie a czut, rezultnd o
fractur deschis la nivelul membrului superior drept. Fiind transportat de ctre rude la un
spital cu profil ortopedie, din punct de vedere ortopedic s-au realizat toate manevrele
corespunztoare, operaia a permis repunerea oaselor la loc ns din nefericire nu s-a instituit
profilaxia tetanosului.
Dup operaie, membrul superior a fost pus n aparat gipsat i, probabil sub gips i pansamentul
aplicat au fost realizate condiii de anaerobioz. n aceste condiii, sporii de Clostridium tetani
au trecut n form vegetativ, s-au multiplicat i au produs toxina tetanic.
La 12 zile de la operaie copilul a devenit febril, agitat, a nceput s prezinte contracturi spastice,
iniial la nivelul membrelor superioare, apoi i la nivelul membrelor inferioare, n timp
contracturile dezvoltndu-se att pe muchii flexori ct i pe muchii extensori.
Copilul a fost adus la camera de gard a unui spital de urgen i transferat imediat la un spital
de boli infecioase unde, tot imediat au fost administrate att serul anti-tetanic ct i vaccinul.
Cu toate acestea, starea general s-a degradat, contracturile au devenit brutale, copilul a ajuns
s prezinte poziia n coco de puc descris n literatur, i-a pierdut contiena i a decedat
la 3 zile de la internarea n spital.
Cu toate c memoria imunologic ar fi trebuit s funcioneze (cel puin teoretic, copilul fusese
vaccinat cu DT la intrarea n coal; lucru menionat n fia personal) n acest caz evoluia a fost
cea menionat, spre deces.
O toalet corespunztoare a plgii, eliminarea mecanic a tuturor structurilor anatomice
(distruse, dilacerate etc) care ar fi putut adposti spori i administrarea vaccinului tetanic n ziua
n care copilul a fost adus la spital datorit fracturii, ar fi putut s previn acest deces.
49. 3. 3. i tot despre tetanos ...
391
n faa unui pacient cu trismus, nu trebuie insistat s gsim cauza la nivelul cavitii bucale, de
exemplu un posibil abces dentar! Mai ales dac examinarea este chiar dificil datorita
trismusului eficient, suntem tentai s administrm un antibiotic i sa reexaminm pacientul
ulterior. S nu uitm ca trismusul poate fi produs i de tetanos nu numai de abcesele dentare!
392
393
n prima form de botulism, dup ingerarea alimentului, toxina se resoarbe la nivel intestinal,
ajunge n circulaie, iar pe aceast cale la nivelul plcilor neuromotorii (fa de care are
afinitate). Aici mpiedic eliberarea de acetilcolin, determinnd o paralizie flasc. Paralizia
ncepe la extremitatea cefalic (de exemplu, paralizia muchilor globilor oculari, care apare la
18-24 ore de la ingestie i se manifest prin diplopie-vedere dubl sau paralizie bulbar,
manifestat prin imposibilitate de nghiire i de vorbire) i este descendent, ajungnd pn la
paralizia musculaturii respiratorii. Moartea poate surveni prin asfixie (datorit paraliziei
muchilor respiratori). Bolnavul rmne contient pn aproape de exitus. Rata mortalitii n
aceast form de botulism este mare. Se estimeaz, n SUA, c managementul unui caz de
botulism cost cteva milioane de USD (spitalizare, tratament, aciuni n justiie, solicitare de
daune, campanii mass-media etc).
Botulismul intestinal (mai frecvent la sugari, posibil i la aduli), este urmarea formrii toxinei
botulinice prin germinarea la nivel intestinal a sporilor ingerai. Manifestrile clinice sunt
similare cu cele ale toxiinfeciei alimentare cu toxina preformat (paralizie respiratorie).
Mortalitatea este foarte mare. Nu se cunoate motivul pentru care cel mai mare numr de
cazuri este raportat n SUA. Autoritile americane recomand evitarea ingestiei de miere la
sugar (copii mai mici de 1 an).
Botulismul plgilor poate fi suspectat atunci cnd apar manifestri neurologice anormale i nu
pot fi implicate alimentele drept surs pentru toxina botulinic. Boala afecteaz persoanele care
folosesc droguri injectate intravenos, cele cu leziuni traumatice contaminate cu pmnt sau
gravidele la care s-a efectuat o cezarian.
50. 4. Diagnostic de laborator
Fiind o toxiinfecie alimentar de tip toxic, nu se face diagnostic bacteriologic.
Se poate ncerca determinarea a tipului (toxic) de Cl. botulinum implicat, prin toxinotipie. Din
aliment se extrage structura antigenic n form solubil. Produsul se trateaz prin fierbere
(toxina botulinic este inactivat prin fierbere). Produsul n care presupunem prezena toxinei,
att fiert (i rcit) ct i nefiert, se inoculeaz la oareci dup o schem care va fi detaliat la
lucrrile practice (vezi i capitolul 22 i anexa 2 - A.2.6.). Se investigheaz eventuala prezen a
toxinelor mai frecvent ntlnite n ara noastr (A, B). n cazul n care n produs exist toxin
botulinic, semnele clinice apar la circa 24 de ore iar oarecii mor dup circa 48 de ore de la
inocularea produsului care nu a fost supus fierberii (apariia decesului nainte de 2 ore sau dup
48 de ore de la inoculare semnific prezena unei alte cauze).
Se poate ncerca identificarea toxinei botulinice i printr-o reacie de tip ELISA.
Tehnicile de biologie molecular (PCR) pentru determinarea genei care codific pentru toxina
botulinic se pot efectua numai n cazul obinerii culturii de Cl. botulinum, nu i pornind de la
produsul patologic (ex. un aliment).
394
50. 5. Tratament
Se administreaz ser antibotulinic, preferabil monovalent (dac se cunoate tipul de toxin
implicat); dac nu, se folosete ser polivalent. Se poate administra ser trivalent (A, B, E),
prompt, pe cale i.v., cu precauiile seroterapiei, n condiii de ventilaie asistat.
50. 6. Epidemiologie
Botulismul apare n ntreaga lume, fiind asociat n principal cu consumul de conserve preparate
n cas (conserve de fructe, legume, pete).
Sursa este reprezentat de alimentele care conin toxina botulinic preformat (n majoritatea
cazurilor de botulism) sau de ctre solul contaminat cu spori de Cl. botulinum (ex. n botulismul
plgilor).
Transmiterea se poate face i prin ingestia de alimente contaminate cu spori (n botulismul
infantil i cel al adultului) sau prin inhalarea acestora.
Cazurile de botulism, nregistrate n Romnia n anul 1999, au fost n numr de 19, n timp ce n
anul 2000 au fost raportate 29 de cazuri, inciden 0,10/0000. n perioada 2000-2005 au fost
raportate ntre 14 (2002 i 2006) i 29 (2000) cazuri de botulism n fiecare an. Incidena n anul
2006 a fost de 0,060/0000.
n SUA, n 1997 s-au raportat 132 de cazuri de botulism (inciden 0,050/0000), 116 cazuri n 1998
i 154 de cazuri n 1999, cu o inciden de 0,060/0000. n perioada 2000-2005 au fost nregistrate
ntre 118 i 155 cazuri de botulism n fiecare an. n afar de sistemul de supraveghere de
rutin, autoritile de sntate public americate menin un sistem activ de supraveghere,
pentru botulism. n plus, urmresc cazurile de botulism n funcie de etiologie, respectiv cazurile
de toxiinfecie alimentar (19 cazuri n 2005, cu un numr de cazuri nregistrate n perioada
1998-2005 care au variat ntre 16 i 39), cazurile de botulism la nou-nscut (85 cazuri n 2005,
cu un numr de cazuri nregistrate n perioada 1998-2005 care au variat ntre 65 i 97) i
botulismul rnilor sau alte condiii n care cauza nu a fost identificat. Majoritate cazurilor de
botulism al rnilor a fost nregistrat la persoane care se drogheaz pe cale intra-venoas (100%
n 2005). n anul 2005 s-au nregistrat 2 decese la cazurile de botulism - toxiinfecie alimentar.
50. 7. Profilaxie
Este nespecific i const n prelucrarea termic adecvat a alimentelor conservate (preferabil
produse industrial), prevenirea contaminrii rnilor, prevenirea consumului de droguri pe cale
i.v. etc.
50. 8. Povestiri adevrate
50. 8. 1. Cazuri de botulism n Germania
Departamentul de Sntate Public din unul dintre landurile din Germania a comunicat n
luna iunie 2003 existena unui focar de botulism care a inclus apte cazuri. Toi cei apte
pacieni au participat la o petrecere organizat la o ferm din landul respectiv; ali 22 de
participani nu au acuzat nici o problem de sntate.
395
Dei experiena clinic era redus n aceast ar, orientarea spre diagnosticul real a fost
foarte rapid, n baza elementelor clinice: toi cei apte pacieni au prezentat uscciune a
mucoasei bucale, trei dintre pacieni au prezentat disfagie, n timp ce diplopia (vederea dubl) a
fost remarcat de doi dintre pacieni. innd cont i de apariia acestei situaii n focar (date
epidemiologice), s-a emis imediat suspiciunea de botulism.
Diagnosticul a fost certificat de toxinotipie (folosind animale de experien) i de punerea n
eviden printr-o tehnic de tip ELISA a toxinei botulinice la doi dintre pacieni.
Evoluia clinic la patru dintre pacieni a fost rapid favorabil, fr a se fi administrat ser antibotulinic. Aceeai patru pacieni au fost externai dup trei zile. n cazul a trei pacieni (toi
prezentnd iniial disfagie iar doi dintre ei prezentnd i diplopie) s-a administrat ser trivalent
(cu anticorpi anti toxin botulinic A, B i E), iar durata spitalizrii a fost de cinci zile. Evoluia a
fost favorabil n cazul tuturor pacienilor, probabil datorit faptului c au consumat o cantitate
foarte mic din preparatul incriminat.
Ancheta epidemiologic a permis emiterea ipotezei privind alimentul consumat i care ar fi
putut s conin toxina botulinic, respectiv crnai de porc preparai la grtar; carnea fusese
meninut sub vid n pungi speciale. Nici un alt aliment consumat de cei 29 de meseni nu a
putut fi incriminat. Au mai fost raportate i alte cazuri de botulism, n Europa de Vest.
50. 8. 2. Arm biologic sau produs de utilitate (cosmetic, tratament)?
Toxina botulinic este una dintre cele mai puternice substane cu caracter de otrav, cunoscute
de om. Din acest motiv, exist temerea c toxina produs de Clostridium botulinum (unul dintre
tipuri) ar putea s fie folosit ca arm biologic.
n scopul prevenirii unei astfel de situaii, att n SUA ct i n alte state occidentale au fost
constituite grupuri de specialiti care au drept obligaie monitorizarea oricror posibile atacuri
teroriste biologice.
Despre un posibil atac cu toxin botulinic, acetia spun c ar putea fi lansat fie prin aerosoli,
fie prin alimente iar manifestrile clinice ar putea aprea la 12-72 ore de la expunere. Rspunsul
autoritilor va depinde punerea corect (i rapid) a diagnosticului, de raportarea la timp a
cazurilor i de realizarea unor anchete epidemiologice eficiente. Cei afectai trebuie s
primeasc ser anti-toxin botulinic, precum i tratament complementar, inclusiv ventilaie
asistat, la nevoie. Nu se va ntrzia instituirea tratamentului, n ateptarea unui diagnostic de
certitudine.
n ultima vreme ns, toxina botulinic i-a gsit i alte utilizri, mai panice. Dintre acestea,
amintim folosirea ei n cosmetic (unde poate determina tergerea temporar a ridurilor),
utilizarea n neurologie (n tratamentul strabismului i blefarospasmului asociate cu distonia
cervical) precum i posibila utilizare n tratamentul transpiraiei axilare excesive
396
397
Caractere morfotinctoriale:
sunt bacili Gram-pozitivi cu dimensiunile menionate mai sus;
n culturi nvechite bacteriile pot fi Gram-negative i se pot detecta endosporii (care
deformeaz bacilii);
n cazul n care la examenul microscopic nu evideniem spori vom repica cultura pe
mediul Nagler, cu incubare 48 de ore la 35-36C i apoi la temperatura camerei;
urmrim sporularea pe un nou frotiu colorat Gram; putem evalua fenomenul de
sporogenez i prin metode de cultur (vezi mai jos);
400
Caractere de cultur:
speciile mobile (marea majoritate) formeaz la suprafaa mediului colonii de tip S,
cu margini ondulate, neregulate, cu tendin de invadare a mediului (datorit
mobilitii);
n jurul coloniilor remarcm prezena -hemolizei;
dac a avut loc inocularea i n profunzimea mediului, coloniile au aspect pufos;
Clostridium perfringens (specia imobil) formeaz colonii de dimensiuni mari, de tip
S, rotunde, cu margini regulate, convexe dar care pot avea i aspect rugos;
majoritatea tulpinilor produc hemoliz dubl (zona intern, de -hemoliz, este mai
ngust n timp ce zona extern, de -hemoliz este mai larg); exist i tulpini care
produc zone foarte largi de hemoliz precum i tulpini slab hemolitice;
prin cultivare putem s evalum i fenomenul de sporogenez (cunoscut fiind c
sporii rezist timp de 10 minute la temperatura de 80C);
dac pe frotiul din cultur colorat Gram nu evideniem spori, pregtim 2 tuburi cu bulion
pepton, glucoz, amidon i extract de levur;
repicm coloniile suspecte n cele 2 tuburi iar unul dintre tuburi n supunem unei temperaturi
de 80C, 10 minute;
401
dac dup o incubare de cel mult 10 zile nu apare multiplicare bacterian n tubul supus la
temperatur crescut, nu exist spori;
Caractere biochimice:
exist foarte numeroase caractere biochimice care pot fi utile n diferenierea speciilor de
clostridii (testarea este rezervat centrelor specializate);
n identificarea microorganismelor din acest gen utilizm iniial testarea producerii de lecitinaz
i lipaz;
pe mediul Nagler inoculm n striu tulpina (se pot testa concomitent mai multe tulpini);
n cazul n care testul este pozitiv (precipitat opac n mediul din jurul striului de cultur) poate fi
vorba de o tulpin de C. perfringens; testul este negativ pentru C. tetani sau pentru C.
botulinum;
402
pentru aprecierea producerii de lipaz incubarea dureaz 1 sptmn;
n cazul n care testul este pozitiv (film perlat, iridescent la nivelul striului de cultur i n mediul
adiacent) poate fi vorba de o tulpin de C. botulinum; testul este negativ pentru C. tetani i C.
perfringens;
testul plcilor semineutralizate poate fi practicat la nivelul centrului de referin;
dup uscarea plcii inoculm n striuri o tulpin martor pozitiv, o tulpin martor negativ i
cteva tulpini de testat;
C. perfringens (ca i tulpina M+) d un rezultat pozitiv doar pe jumtatea de plac fr antitoxin;
-
403
testul inhibiiei sialidazei se poate realiza n 2-6 ore; este pozitiv pentru C. perfringens i negativ
pentru C. septicum;
Creterea n lapte turnesolat sau cu bromcrezol purpur (C. perfringens produce cheag alveolar
n laptele turnesolat);
Clostridiile sunt sensibile la vancomicin i rezistente la colistin; ali autori propun testarea
sensibilitii la metronidazol;
spre ex. prelevm din bulionul VF pe care am identificat multiplicarea bacterian, centrifugm
iar supernatantul l mprim n 2 tuburi;
404
unul dintre tuburi l supunem temperaturii de 100C (toxina botulinic este termosensibil);
dac oarecii injectai cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba de toxina botulinic;
urmrim oarecii timp de 2-4 zile pentru a remarca apariia semnelor de botulism (reducerea
mobilitii, respiraii ample, contracii ale muchilor abdominali urmate de convulsii i deces);
prezena toxinei botulinice poate fi confirmat prin seroneutralizare (protejm spre ex. un
animal de laborator cu anti-toxin de tip A i un alt animal de laborator cu anti-toxin de tip B
dup care i injectm cu p.p. respectiv; dac animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A
supravieuiete iar cellalt animal moare cu semne caracteristice pentru botulism, n mediul de
cultur a existat C. botulinum de tip A);
Titrarea toxinei botulinice, prin metoda DL50 (folosind injectarea p.p. n vena cozii i curbe
standard pentru interpretare, pentru fiecare serotip);
Titrarea toxinei botulinice printr-o tehnic de tip ELISA (poate detecta pn la 10 picograme);
Utilizarea tehnologiei de amplificare genic (PCR) pentru structurile care codific sinteza
diferitelor toxine etc.
5. Antibiograma nu se realizeaz, de regul. Clostridiile sunt sensibile la penicilin,
cefalosporine, vancomicin, tetracicline, metronidazol etc, ns tratamentul este mult mai
complex; n unele dintre bolile clostridiene eficacitatea tratamentului cu antibiotice sau
chimioterapice nu a fost dovedit.
405
51. 5. Tratament
Tratamentul trebuie instituit de urgen i include n primul rnd toaleta chirurgical a plgii
(debridri extinse, eliminarea esuturilor devitalizate), administrarea de penicilin, administrare
de oxigen hiperbar precum i administrarea de ser antigangrenos.
51. 6. Epidemiologie
Sursa de infecie este reprezentat de om i animale, care elimin germenii pe sol prin dejecte.
Transmiterea se face prin pmnt contaminat cu spori; poarta de intrare n organism este de
regul o plag cutanat.
51. 7. Profilaxie
Se realizeaz prin tratamentul corespunztor al plgilor, n special al celor anfractuoase,
contaminate cu pmnt, praf etc. Utilizarea imunoglobulinelor antitoxice poate fi util.
Vaccinurile (anatoxine) sunt utilizabile, dar nu au intrat n practica curent.
51. 8. Povestiri adevrate
51. 8. 1. Gangren gazoas la un pacient traumatizat
Pacientul de sex masculin n vrst de 65 de ani s-a internat pentru multiple plgi mpucate la
nivelul toracelui i umrului stng, suferite n cursul unui accident de vntoare.
La internare, pacientul se afla sub influena alcoolului (alcoolemia era de 2,29o/oo), n stare de
oc traumatic, incontient, cu tulburri respiratorii. S-au iniiat procedurile obinuite de
resuscitare. Radiografia toraco-cardio-pulmonar a evideniat (pe lng multiple fracturi costale
i scapulare) un hemopneumothorax stng cu emfizem toracic subcutanat important. S-a
practicat toracotomie lateroposterioar cu evacuarea hematomului pleural i suturarea
esutului pulmonar dilacerat; s-a instalat drenaj aspirativ pleural. Dup intervenia chirurgical,
s-a instituit antibioterapia empiric cu spectru larg, administrndu-se piperacilin cu
tazobactam. Dup trei zile de tratament, starea pacientului prea s fie stabil. n a patra zi s-a
observat apariia (la nivelul plgii operatorii) a unui exsudat serosanguinolent, n jurul creia
esuturile erau edemaiate i hiperemice. La palparea zonei s-au perceput crepitaii
subcutanate. S-a intervenit chirurgical, s-a incizat i s-a constatat prezena esuturilor necrozate;
s-a realizat o excizare larg a acestor esuturi. S-au recoltat probe intraoperator i s-au utilizat
sisteme de transport att n aerobioz ct i n anaerobioz. Culturile obinute, n anaerobioz i
aerobioz, au fost pozitive pentru Clostridium perfringens tip A (productor de toxine alpha,
theta i kappa), Staphylococcus aureus i Enterococcus spp.
S-a luat decizia instituirii terapiei cu oxigen sub presiune. n urmtoarele opt zile, pacientul a
fost supus unui numr de cincisprezece edine de oxigenoterapie hiperbar.
Tratamentul antibiotic a fost modificat, eliminnd combinaia dintre piperacilin - tazobactam i
introducndu-se n tratament penicilin G asociat cu metronidazol (ambele administrate n
406
perfuzie i.v.). S-a efectuat zilnic toaletarea plgii, chiuretarea i eliminarea esuturilor sfacelate,
a tuturor zonelor care preau s prezinte necroz i s-au aplicat substane antiseptice, local.
Pe parcursul tratamentului au fost recoltate din nou probe, care au fost transmise ctre
laborator, pentru diagnostic bacteriologic; nu au mai fost puse n eviden specii de germeni
anaerobi, ns s-a identificat contaminarea plgii cu germeni multirezisteni, de spital, respectiv
cu Enterococcus faecium i Acinetobacter baumanii. n aceste condiii, tratamentul
medicamentos antibacterian a fost modificat, din nou, oprindu-se administrarea de penicilin G,
instituindu-se tratament cu vancomicin i netilmicin; administrarea de metronidazol pe cale
i.v. a continuat.
S-a continuat i examinarea zilnic a plgii, executnd excizarea esuturilor necrotice i n aceste
condiii, datorit pierderilor suferite, pacientul a fost supus i la dou operaii de autotransplant
tegumentar.
Dup 67 de zile de spitalizare, supraveghere foarte atent, tratament agresiv combinnd o
serie de medicamente cu utilizarea tehnicilor chirurgicale, pacientul a fost externat (stabil din
punct de vedere al funciilor vitale, cu o stare general relativ bun, fr febr, fr alte acuze
subiective, plaga nchizndu-se n condiii bune - comparativ cu situaia i riscurile iniiale).
Discuii:
Exist date statistice n baza crora se estimeaz c aproximativ 50% dintre infeciile cu
Clostridium spp. sunt post-traumatice, circa 35% se dezvolt la nivelul marilor plgi chirurgicale,
iar 15% ar putea s apar spontan (atraumatic sau metastatic). Evoluia acestor infecii este de
multe ori grav, cu potenial deces. Situaia prezentat se refer la o infecie sever cu
Clostridium perfringens tip A, infecie care a determinat mionecroz extins i stare toxic fa
de care personalul din serviciul ATI se putea atepta la orice tip de evoluie. De regul, n astfel
de cazuri, simptomele gangrenei gazoase pot s apar chiar la 6-8 ore de la momentul n care
sporii bacterieni au ptruns i n condiii de anaerobioz au trecut n form vegetativ i au
nceput s se multiplice i s sintetizeze o serie de factori de patogenitate (toxina , toxina ).
Accentuarea rspunsului inflamator poate fi extrem de rapid; leziunea (distrugerea tisular,
sfacelarea esuturilor, necrozele locale) poate avansa cu civa centimetri pe or. Incidena
ocului septic i a insuficienei multi-organice n aceste cazuri este estimat la 50%, iar procentul
de mortalitate la 40% (chiar i dac se instituie tratamentul potrivit).
Alfa-toxina, prin activitatea ei lecithinase-like i haemolysin-like, produce lezarea membranelor
celulare (cu efect letal la nivelul diverselor esuturi), produce liz, hemoliz i agregare
plachetar, lezarea leucocitelor i a celulelor endoteliale. Efectul toxinei creeaz conglomerate
de fibrin, leucocite i plachete care oblitereaz vasele sanguine. n plus, lezeaz celulele
miocardice, cu efecte asupra funciei cardiace (aritmii, hipotensiune, bradicardie i oc
cardiogenic). Alfa-toxina prezint i proprieti dermonecrotice; prin inhibiia asupra funciei
PMN neutrofile, acestea pierd capacitatea de a penetra la nivelul esutului lezat (leucostazis).
Teta-toxina (denumit hemolizin letal sau perfringolizina O) este responsabil pentru necroza
tisular, creterea permeabilitii vaselor sanguine; are i efect cardiotoxic.
407
Cazul prezentat a avut, n final, o evoluie favorabil, implicnd resurse extrem de importante,
umane, tehnice, materiale iar costurile au fost de asemenea foarte mari. Este un exemplu clar n
care prevenirea ar fi putut face cu mult mai mult i mult mai la timp n comparaie cu
tratamentul.
51. 8. 2. Miocardit prin infecie cu Clostridium novyi tip B
n literatura de specialitate a fost prezentat un caz de miocardit clostridian, cu debut acut, la
o pacient (n aparen) fr factori de risc pentru infecia cu clostridii.
Pacienta n vrst de 23 de ani se prezint la camera de gard pentru dureri toracice i dispnee.
Bolnava prezenta un istoric de o sptmn de afeciune la nivelul cilor respiratorii superioare,
iar nainte de debutul simptomelor, aparintorii i-au amintit, ulterior, c suferise un
traumatism cu plag minor la nivelul minii (probabil poarta de intrare pentru infecie).
Pacienta fusese diagnosticat n urm cu cinci ani cu lupus eritematos sistemic (LES), pentru
care nu primea tratament; a afirmat c nu consum alcool sau droguri.
La internare a prezentat febr (38,5C), hipotensiune arterial (90 / 50 mmHg). Testele de
laborator au evideniat 8.200 leucocite/ mm3 (63% neutrofile segmentate, 12% neutrofile
nesegmentate). Reactanii de faz acut au avut valori certificnd inflamaia.
Cu toate c examenul clinic pentru sistemul cardiovascular a fost n limite normale (cu excepiile
menionate mai sus), electrocardiografia a evideniat tulburri de ritm, ritm cardiac de 130 bti
/ minut i tulburri de conducere.
n ciuda tratamentului complex aplicat, pacienta a evoluat ctre stop cardiac i a decedat la 15
ore de la internare.
Examenul anatomopatologic a permis evidenierea la nivel miocardic a unor bacili Gram-pozitivi,
infiltrat inflamator i necroz miocardic, fr alte modificri patologice. Produsul recoltat a fost
transmis ctre laborator pentru diagnostic bacteriologic, care a rmas negativ. Extracia de ADN
urmat de amplificare genic (PCR) a permis stabilirea etiologiei, reprezentat de Clostridium
novyi tip B.
Discuii
Fcndu-se un studiu retrospectiv, al nregistrrilor medicale i a literaturii de specialitate, s-a
constatat c pe o perioad de circa 40 de ani au mai fost menionate alte 16 cazuri de
miocardit cu etiologie posibil clostridian, clasificate fie ca mionecroz (n lipsa rspunsului
inflamator) fie ca abces miocardic (asociat cu rspuns inflamator).
n cazul prezentat nu s-au evideniat leziuni gazoase la nivelul miocardului, iar reacia
inflamatorie a fost predominant limfocitar, n timp ce n toate celelalte cazuri raportate reacia
a fost cu neutrofile. n infeciile miocardice se estimeaz c etiologia clostridian este dominat
de C. perfringens urmat de C. septicum, C. fallax. Cu toate c la nivelul respectivului traumatism
de la mn nu s-a evideniat abces sau celulit, probabil c acesta a constituit poarta de intrare
pentru infecie.
408
grupul al IV-lea fac parte mycobacteriile cu ritm de multiplicare rapid (ex. M. fortuitum, M.
chelonae).
n momentul de fa n genul mycobacterium sunt clasificate peste de specii diferite, multe
dintre acestea fiind larg rspndite n natur.
52. 2. Caractere generale
52. 2. 1. Habitat
Mycobacteriile ne-tuberculoase se ntlnesc ubicvitar. M. tuberculosis (hominis, bovis,
africanum) se gsete n organismele infectate, de regul la nivel pulmonar i n cazul infecieiboal poate fi eliminat n mediul extern prin tuse (n sput sau n nuclei de pictur) sau prin
lapte (dac este cazul unui animal bolnav, infectat cu M. bovis).
52. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
n esuturile animalelor bolnave bacilii tuberculoi apar ca bastonae subiri, rectilinii, cu
dimensiunea de 0,4 / 3 m, acid-alcoolo rezisteni (apar roii pe fond albastru la coloraia ZiehlNeelsen), imobili, necapsulai, nesporulai.
Examenul microscopic rmne o etap esenial n diagnosticul unei infecii mycobacteriene
att n momentul examinrii unui produs patologic (examenul microscopic direct) ct i n
momentul cnd prin microscopie se confirm (sau infirm) morfologia i tinctorialitatea
microorganismelor dintr-o colonie izolat, respectiv acid-alcoolo rezistent i apartenena la
genul Mycobacterium. n tabelul urmtor este ilustrat modalitatea de interpretare a
rezultatelor examenului microscopic.
Tabelul nr. 5 Rezultatele examenului microscopic (coloraie fluorescent i Ziehl-Neelsen)
Notare semicantitativ
BAAR negativ
1-2/30cmpuri
1-2/300cmpuri
1-9/10cmpuri
1+ (+)
1-9/100cmpuri
1-9/1cmp
2+ (++)
1-9/10cmpuri
10-90/1cmp
3+ (+++)
1-9/1cmp
411
>90/1cmp
4+ (++++)
>9/1cmp
Fiecare treapt a gradaiei cantitative se refer la aceeai suprafa de frotiu examinat (cmpul
vizual examinat prin metoda fluorescent este de circa 10 mai mare dect n cazul coloraiei
Ziehl-Neelsen). Notaia semicantitativ este obligatorie deoarece exprim unitar densitatea
BAAR pe frotiu indiferent de metoda folosit, permind comparaii ntre laboratoare diferite,
ntre bolnavi diferii i pentru acelai bolnav n momente evolutive diferite. Dac rezultatul final
este nedeterminat trebuie s facem nc un frotiu din acelai produs patologic i s indicm
recoltarea unui nou produs patologic.
52. 2. 3. Caractere de cultur
n momentul actual, la nivel mondial exist o mare varietate de medii de cultur, unele dintre
acestea fiind produse n mod special pentru mycobacteriologie, mycobacteriile dezvoltndu-se
n general pe medii complexe. Singura specie cu semnificaie clinic necultivabil este M. leprae.
Principial, mediile de cultur utilizate n diagnosticarea unei infecii mycobacteriene se mpart n
3 grupe principale: medii de cultur lichide (bulion 7H9 etc), medii de cultur pe baz de ou (ex.
mediul Lwenstein) i medii de cultur bazate pe compoziia n agar. Pentru izolarea primar a
mycobacteriilor se pot folosi medii foarte variate, din fiecare grup menionat. Mediile pe baz
de ou au ca ingrediente: ou sau glbenu de ou, fin de cartof, sruri, asparagin i glicerol.
Mediul este solidificat prin coagulare. Aceste substane reprezint elementele de baz ale
mediului clasic Lwenstein-Jensen. Dezvoltarea M. bovis, M. africanum precum i a tulpinilor de
M. tuberculosis rezistente la HIN este favorizat de suplimentarea cu 0,4% piruvat de sodiu a
mediului Lwenstein-Jensen.
Atunci cnd ncercm s realizm izolarea primar, este necesar ca mediile de cultur s se
incubeze ntr-o atmosfer de 8-10% CO2. Culturile se incubeaz de rutin la o temperatur de
35-37C.
Mediile de cultur solide se vor examina zilnic n prima sptmn dup inoculare iar apoi
sptmnal pn la mplinirea a 6-8-12 sptmni, deoarece mycobacteriile tuberculoase au o
rat de diviziune de minim 12 ore (30 minute la E. coli).
M. tuberculosis i respectiv M.. bovis-BCG formeaz colonii R, rugoase, neregulate,
conopidiforme, grunjoase, greu de emulsionat. Tulpinile de M. tuberculosis rezistente la HIN pot
forma colonii de tip S. M. bovis formeaz colonii de tip S, rotunde, netede, umede, uor
emulsionabile.
52. 2. 4. Caractere biochimice
n cazul c mycobacteria izolat este non-cromogen (nu produce pigmeni) se vor examina
caracterele de cultur (colonii de tip R-rugoase pentru M. tuberculosis sau M. bovis, sau Snetede pentru M. bovis) i se va trece la identificarea speciei pe baza a cteva teste fenotipice
clasice i anume: testul producerii de niacin, testul reducerii nitrailor, testul catalazei la 22C i
412
imun de tip celular. Mecanismele imunitii celulare sunt implicate att n protecia fa de
mbolnvire ct i n unele evenimente patologice care apar n cursul tuberculozei.
52. 2. 8. Caractere de patogenitate
Se estimeaz c la nivel mondial, numrul persoanelor infectate cu M. tuberculosis este de
aproximativ 1,7 miliarde i cu toate c aproximativ 1/3 din populaia globului este infectat,
doar circa 10 milioane de persoane fac anual o form de tuberculoz clinic manifest. Cu alte
cuvinte s-ar putea considera c M. tuberculosis nu este un microorganism strict patogen ci
condiionat patogen. n plus, trebuie s reinem c atunci cnd este vorba de o persoan
imunocompromis, nu putem folosi termenul de mycobacterii nepatogene.
M. tuberculosis are capacitatea de a supravieui i de a se multiplica n macrofagele alveolare
care nu sunt activate. Interaciunea iniial ntre M. tuberculosis i macrofage, determin att
un rspuns din partea LT helper ct i din partea LT citotoxice. Un subset al LT helper (Th2)
stimuleaz sinteza de anticorpi, dar aceti anticorpi nu au nici un rol (dovedit) n ceea ce
privete protecia. Subsetul de LT helper Th1 sintetizeaz interferon (IFN-) cu rol n
stimularea activitii macrofagelor i celulelor endoteliale.
Este probabil c la supravieuirea intra-macrofagic s contribuie producerea unor substane
numite generic, invazine. Bacteriile sunt fagocitate, sunt incluse n fagolizozomi, dar o parte
dintre ele rezist i distrugnd fagolizozomul revin n citoplasma macrofagului. M. tuberculosis
are capacitatea de a mpiedica acidifierea la nivel de fagolizozom, probabil prin inducerea
sintezei de amoniac
Lipoarabinomananul (un glicolipid) din peretele mycobacterian inhib activarea LT, acelai efect
avndu-l i antigenul 85 (proteic) care are capacitatea de a lega fibronectina.
Factorul cord (acid mycolic parietal, 6-6 dimicolat de trehaloz) pare a fi implicat n producerea
leziunilor tisulare i n inhibarea migrrii leucocitare.
Fosfolipidele sunt implicate n inducerea necrozei de cazeificare.
S-a identificat la oareci o gen implicat n susceptibilitatea la infecia cu tulpina vaccinal. O
gen similar se afl la om la nivelul cromozomului 2q; se presupune c prin clonarea acestei
gene s-ar putea identifica grupele populaionale susceptibile la tuberculoza-boal.
Totui trebuie menionat c n ciuda a numeroase studii realizate n peste 100 de ani, nu s-a
stabilit de fapt care este structura implicat cu certitudine n patogenitatea mycobacterian i
nici care este mecanismul exact care face ca rezultatul interaciunii microorganism-gazd s fie
att de diferit de la un caz la altul.
52. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse
Nucleii de pictur care au diametrul de 1-3 m au capacitatea de a ajunge dup inhalare pn
la nivel alveolar. Intraalveolar chiar dac sunt fagocitate, o parte dintre mycobacterii rmn
viabile i chiar se pot multiplica n interiorul celulelor. Pe cale limfatic se poate realiza
diseminarea la nivelul majoritii organelor (foarte rar ns apare o multiplicare necontrolat
414
416
Atunci cnd ncercm s realizm izolarea primar, este necesar ca mediile de cultur s se
incubeze ntr-o atmosfer de 8-10% CO2. Culturile se incubeaz de rutin la o temperatur de
35-37C. Mediile de cultur solide se vor examina zilnic n prima sptmn dup inoculare iar
apoi sptmnal pn la mplinirea a 6-8-12 sptmni deoarece mycobacteriile tuberculoase
au o rat de diviziune de 12-27 ore.
Se pot utiliza i sisteme de cultivare rapid (ex. MB-Bact, Bactec) cu depistarea creterii
mycobacteriene n 4-25 de zile. n Romnia aceste sisteme au nceput s fie utilizate n unele
centre ncepnd cu anul 1998. Aceste sisteme permit testarea sensibilitii la medicamentele
anti-mycobacteriene pentru tulpinile izolate, conform recomandrilor programului naional.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
Caractere de cultur:
M. tuberculosis i respectiv M. bovis-BCG formeaz colonii R, rugoase, neregulate,
conopidiforme, grunjoase, greu de emulsionat, nepigmentate;
tulpinile de M. tuberculosis rezistente la HIN pot forma colonii de tip S;
Caractere biochimice:
identificarea speciei se realizeaz pe baza a cteva teste fenotipice clasice [testul
producerii de niacin, testul reducerii nitrailor, testul catalazei la 22C i la 68C,
hidroliza Tween 80, susceptibilitatea la hidrazida acidului 2-tiofen-carboxilic (TCH) i
susceptibilitatea la acidul p-amino salicilic (PAS)];
primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M. tuberculosis (n timp ce pentru M.
bovis numai al 3-lea test este pozitiv);
testul catalazei la 68C i respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative pentru ambele
specii (hidroliza Tween 80 poate fi pozitiv pentru M. tuberculosis);
417
Caractere de patogenitate: M. tuberculosis este patogen pentru cobai; inocularea p.p. la cobai
este uneori practicat n vederea diagnosticului;
Alte caractere / teste utilizate n identificare: se pot utiliza (la nivelul unor centre de referin)
teste care se bazeaz pe proprieti fenotipice moleculare (ex. studiul cromatografic al acizilor
grai din peretele celular) sau genotipice (fragmente de restricie ale materialului genetic, sonde
nucelotidice, PCR); exist i posibilitatea testrii sensibilitii fa de anumii mycobacteriofagi
etc.
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii
tratamentului) poate fi necesar i se realizeaz conform recomandrilor Programului Naional
de Control al Tuberculozei. Se pot utiliza metoda concentraiilor absolute, metoda proporiilor,
metoda rapoartelor de rezisten, metode radiometrice etc.
52. 4. 2. Diagnosticul imunobiologic are la baz un mecanism de rspuns imun de tip celular. Se
utilizeaz intradermoreacia cu tuberculin (PPD, derivat proteic purificat), vezi capitolele 17-18
i anexa nr. 3. IDR cu PPD este mai frecvent folosit n scop epidemiologic dar poate avea i
utilitate diagnostic, n special atunci cnd se observ virajul tuberculinic, respectiv test
tuberculinic negativ, urmat de pozitivarea testului la o determinare ulterioar.
52. 4. 3. Diagnosticul serologic se bazeaz pe rspunsul imun de tip umoral (anticorpii antimycobacterieni pot fi evideniai prin diferite tehnici, de ex. ELISA). Cu toate c metodologia nu
este perfect standardizat, subliniem faptul c n diagnosticul tuberculozei nici un element nu
poate fi considerat ca fiind lipsit de importan ntr-un anumit context clinic, paraclinic i
epidemiologic.
52. 4. 4. Dei nu am prezentat elementele necesare identificrii mycobacteriilor netuberculoase,
dorim s menionm c, n cazul utilizrii unui numr redus de teste, exist riscul de a pune un
diagnostic eronat i respectiv de a considera o tulpin drept Mycobacterium tuberculosis, cu
toate c a fost izolat o mycobacterie atipic.
418
52. 5. Tratament
Tratamentul nespecific include repausul (fizic, psihic) i o nutriie corespunztoare. Tratamentul
medicamentos se realizeaz cu anti-tuberculoase n asociere (3 sau 4 medicamente diferite n
funcie de situaie). Mai frecvent utilizate sunt izoniazida (HIN), rifampicina, pyrazinamida i
ethambutolul (medicamente de prim linie). Terapia este de lung durat (minim 4 luni n
formele uoare, 6 luni n majoritatea cazurilor) i ar trebui s se realizeze strict supravegheat.
inta operaional este vindecarea a minim 85% dintre pacienii cu tuberculoz pulmonar
pozitiv la microscopie.
Datorit apariiei i extinderii fenomenului de rezisten i multi-rezisten la antibiotice, pe
lng medicamentele de prim linie menionate mai sus exist i anti-tuberculoase de rezerv
(ex. ethionamida, prothionamida, cicloserina etc).
52. 6. Epidemiologie
Pacienii cu tuberculoz pulmonar a cror sput este pozitiv microscopic, reprezint sursa de
infecie cea mai important. Transmiterea se face de obicei pe cale respiratorie, fiind favorizat
de contactul prelungit, intrafamilial sau n colectiviti. Transmiterea prin intermediul laptelui
contaminat i netratat termic corespunztor este posibil.
Apariia bolii este influenat n mod decisiv de particulariti ale gazdei, majoritatea nc
neelucidate. Totui se cunoate c anumite condiii socio-economice, aglomerarea
populaional, vrsta (copilrie i 16-21 de ani), o anumit structur genetic (ex. HLA BW15) i
imunodepresia, se asociaz mai frecvent cu apariia tuberculozei manifest clinic.
Pe lng problematica TB, cunoscut de mai multe secole, n momentul de fa se discut din ce
n ce mai frecvent epidemiologia TB produs de microorganisme rezistente i multi-rezistente la
antibiotice i chimioterapice. De circa 15 ani s-au luat n considerare tulpinile de M. tuberculosis
numite MDR-TB / multi-drug resistant. Tulpina MDR-TB este definit drept acea tulpin de M.
tuberculosis rezistent cel puin la hidrazida acidului izonicotinic (izoniazid, HIN) i la
rifampicin.
Din anul 2005, n limbajul medical internaional a intrat i tulpina XDR-TB (Mycobacterium
tuberculosis extensiv rezistent la medicamente anti-TB). Tulpina XDR-TB este definit drept acea
tulpin de M. tuberculosis rezistent att la majoritatea medicamentelor anti-TB de prim
linie (inclusiv la izoniazid i rifampicin), ct i la cele mai utilizate medicamente anti-TB de
linia a doua (ex. fluorochinolone i la cel puin unul din cele 3 medicamente injectabile, cum ar
fi amikacina, kanamicina sau capreomicina).
n Romnia incidena tuberculozei a depit la un moment dat valoarea de 1400/0000. Lund ca
punct de reper anul 1985 (incidena TB fiind de 560/0000, cea mai mic valoare istoric a
incidenei TB n Romnia) i respectiv anul 2002 (anul n care incidena TB s-a meninut
staionar, pentru al doilea an consecutiv, valoarea incidenei pentru cazurile noi fiind
1210/0000), putem spune c n ultimii ani, numrul de cazuri raportate i respectiv incidena, au
sczut, an de an. Cel mai mare numr de cazuri din ultima perioad a fost raportat n 2002
(numr total de cazuri 31.075, numr de cazuri noi 26.637, numr de recidive prin TB 4.438,
numr de cazuri la copii 1.878). Numrul de cazuri noi de TB nregistrate ulterior (la aduli) a
419
fost de 25.245 (2003), 24.776 (2004), 22.860 (2005) i respectiv 20.842 de cazuri n 2006, cu o
inciden care s-a ntors ctre valoarea nregistrat n anul 1994 (96,60/0000). La copii, numrul
de cazuri raportate a sczut de la 1.519 (2003) pn la 1.066 cazuri n 2006.
n SUA s-au nregistrat 21.337 cazuri n 1996 (inciden 8,040/0000), 19.851 cazuri n 1997
(7,420/0000), 18.361 cazuri n 1998 (6,790/0000) i respectiv 17.531 cazuri n 1999, corespunznd la
o inciden de 6,430/0000. De altfel, numrul de cazuri de TB n SUA a sczut an de an n perioada
1998-2005. n 2005 au fost raportate 14.097 cazuri de TB (inciden 4,80/0000).
52. 7. Profilaxie
Depistarea precoce a surselor de infecie precum i tratamentul acestora corect i complet
reprezint una dintre cele mai importante msuri de prevenire i control.
Vaccinarea BCG este util cel puin pentru prevenirea meningitei tuberculoase la nou-nscut
(afeciune extrem de grav). Prima vaccinare se realizeaz n primele zile de via, n
maternitate. Revaccinrile se pot face numai la persoane IDR negative.
Pentru prevenirea TB, se recomand n anumite situaii chimioprofilaxia (de ex. administrarea
HIN la membrii de familie, contaci ai unei persoane cu TB pulmonar pozitiv la microscopie).
Eradicarea tuberculozei la vite i pasteurizare laptelui sunt de asemenea msuri utile profilactic.
52. 8. Povestire adevrat
A cltori, sau nu, atunci cnd ai XDR-TB ...
Aceasta este o istorie adevrat care arat c expunerea la microorganisme periculoase este
posibil (chiar dac transmiterea nu are loc n 100% din cazuri).
n acelai timp, dorim s subliniem pentru cel puin a treia oar c bolile infecioase nu
recunosc i nu respect graniele stabilite de om. Odat cu apariia traficului aerian omul poate
s cltoreasc i s ajung oriunde pe glob n mai puin de 24 de ore, iar dac este contagios ar
putea s-i mbolnveasc pe cei alturi de care cltorete. Acetia la rndul lor, pot, n mod
potenial, s transmit mai departe infecia n toate colurile lumii.
Este luat n discuie situaia n care un cetean american de origine greac a decis n luna mai
a anului 2007 s cltoreasc, pentru a se cstori, cu toate c tia c este bolnav de
tuberculoz. Anterior plecrii, tnrul a mers la Departamentul de Sntate Public din statul
american Georgia, unde locuia (este vorba chiar de statul unde se afl cel mai important centru
de supraveghere, prevenire i control al bolilor, CDC, Atlanta, GA). Aici ns, dup afirmaiile
cltorului (neconfirmate de autoriti) mai c nu i s-ar fi urat drum bun i ar fi fost informat
c dac i ia medicamentele regulat, nu ar fi multe anse ca s infecteze i ali ceteni. n
aceste condiii, tnrul A.S. a plecat spre Europa.
Rezultatele testrilor de laborator au artat, ulterior, c tulpina infectant intra n categoria
XDR-TB (Mycobacterium tuberculosis extensiv rezistent la medicamente anti-TB). Tulpina XDRTB este definit drept acea tulpin de M. tuberculosis rezistent att la majoritatea
420
Dintre cele mai importante probleme legale de acest caz ar fi de amintit inexistena unei legi
care s defineasc i soluioneze modul n care se poate institui carantina i respectiv efortul
substanial i dificultatea cu care autoritile (din diferite ri) au putut identifica persoanele
care au cltorit n aceleai avioane cu pacientul cu XDR-TB / MDR-TB.
Apariia Regulamentului Sanitar Internaional (votat la nivel mondial) i despre care ne-am
propus s discutm ntr-un capitol separat, probabil primul capitol de carte din Romnia care
trateaz acest subiect, ar putea rezolva ntructva aceste probleme; totui mai sunt foarte
multe aspecte de rezolvat.
422
dar n cazul n care boala este tratat corect, gazda redevine susceptibil la infecie. n vederea
obinerii rezistenei la infecie este necesar att rspunsul imun umoral ct i celular.
53. 2. 8. Caractere de patogenitate
T. pallidum este patogen prin multiplicare i invazivitate. T. pallidum afecteaz numai omul i
se transmite de regul prin contact sexual. Alte modaliti de transmitere posibile ar fi pe cale
sanguin sau de la mam la ft. Infectarea indirect, ex. prin intermediul unor obiecte
contaminate, se apreciaz c ar fi posibil n circa 0,1% din cazuri.
53. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse
Infecia natural cu T. pallidum este limitat la gazda uman. Infecia se transmite de obicei prin
contact sexual, iar leziunile de primoinfecie sunt cantonate la nivelul tegumentelor i
mucoaselor din zona genital. Totui n 10-20% din cazuri, leziunile primare sunt localizate la
nivel rectal, perianal sau oral. T. pallidum poate probabil penetra mucoasele intacte sau
ptrunde printr-o soluie de continuitate de la nivelul epidermului.
Spirochetele se multiplic local la poarta de intrare, iar unele se rspndesc n vecintatea
nodulilor limfatici, de unde ajung n torentul circulator. n 2-10 sptmni de la infecie, la locul
inoculrii se dezvolt o papul care se deprim pentru a forma o ulceraie cu baza curat,
indurat (ancru dur). Inflamaia se caracterizeaz prin prezena limfocitelor i a plasmocitelor.
Aceast leziune primar se vindec ntotdeauna spontan, dar dup 2-10 sptmni apar
leziunile secundare, care constau n leziuni eritematoase maculopapulare localizate oriunde pe
corp i papule umede, palide (condiloame) n regiunile anogenital, axilar i n cavitatea bucal.
Pot fi prezente de asemenea meningita sifilitic, corioretinita, hepatita, nefrita (datorit apariiei
complexelor imune) sau periostita. Leziunile secundare se remit i ele spontan. Att leziunile
primare, ct i cele secundare sunt bogate n spirochete i foarte contagioase. Leziunile
contagioase pot reaprea la 3-5 ani de la infecie, dar dup aceea individul nu este contagios.
Infecia sifilitic poate rmne subclinic i pacientul poate trece prin stadiile primar, secundar
sau prin ambele fr semne sau simptome, dezvoltnd totui sifilis teriar.
n aproximativ 30% din cazuri, infecia sifilitic precoce progreseaz spontan ctre vindecare
complet n absena tratamentului. n alte 30% din cazuri, infecia netratat rmne latent
(evideniat n special prin teste serologice pozitive). n celelalte cazuri, boala progreseaz spre
stadiul teriar, caracterizat prin dezvoltarea de leziuni granulomatoase (gome) n piele, oase,
ficat, prin modificri degenerative la nivelul SNC (sifilis meningovascular, pareze, tabes), sau prin
leziuni cardiovasculare (aortit, anevrism aortic, insuficien aortic). n toate leziunile teriare
treponemele sunt foarte rare, iar reaciile exagerate ale esuturilor se datoreaz
hipersensibilitii la antigene treponemice.
n cazul sifilisului congenital, o femeie nsrcinat infectat cu T. pallidum poate transmite
germenul ftului prin placent ntre sptmnile 10-15 de gestaie. n unele cazuri se produc
moarte in utero i avort spontan, iar n altele apare postmaturitate. Ali fei sunt nscui vii, dar
dezvolt semne de sifilis congenital n copilrie: keratit interstiial, dini Hutchinson, nas n a,
periostit i diferite anomalii ale SNC. Tratamentul adecvat al mamei n timpul sarcinii previne
sifilisul congenital. Titrul reaginelor n sngele copilului crete n infecia activ, dar scade cu
timpul dac anticorpii au fost transferai pasiv de la mam. n infecia congenital, copilul
424
produce anticorpi antitreponemici de tip IgM. Pentru prevenirea sifilisului congenital, femeile
nsrcinate trebuie s fie testate pe parcursul sarcinii, recomandarea fiind fcut de doctorul
obstetrician nc de la prima vizit (recomandarea trebuie fcut de asemenea i de medicul de
familie).
53. 4. Diagnosticul de laborator
Att leziunile primare, ct i cele secundare sunt bogate n spirochete i foarte contagioase. n
cele ce urmeaz vom aborda diagnosticul de laborator n cazul sifilisului primar sau secundar.
Diagnosticul pornete de la elemente clinice i epidemiologice, dar trebuie confirmat prin
metode de laborator.
Diagnosticul de laborator n sifilis poate fi bacteriologic (direct) sau serologic.
53. 4. 1. Diagnosticul bacteriologic
Treponema pallidum nu poate fi cultivat pe medii artificiale, n laborator. Din acest motiv,
diagnosticul bacteriologic cuprinde numai primele etape din structura clasic a schemei
diagnosticului direct. Diagnosticul bacteriologic poate fi realizat att n sifilisul primar ct i n
sifilisul secundar.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile
cunoscute (vezi anexa nr. 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de
iniierea antibioterapiei, avnd o serie de particulariti. Produsul patologic poate fi reprezentat
de lichidul clar (serozitatea) de la nivelul leziunilor primare n funcie de localizare (penian,
cervical, vaginal, perianal etc), de la nivelul leziunilor secundare (condiloma lata, rozeole sifilitice
etc), de la nivelul unor leziuni umede bogate n treponeme n cazul sifilisului congenital
timpuriu sau poate fi prelevat din ganglionii limfatici regionali.
n cazul ancrului, vom recolta p.p. dup ndeprtarea cu grij (fr a produce sngerare) a
crustelor care acoper leziunea. Ar putea fi necesar s comprimm baza leziunii pentru a
stimula acumularea de lichid (clar) din care vom efectua 2-3 preparate microscopice. Prelevm
lichidul fie cu ajutorul ansei bacteriologice, fie cu ajutorul unei pipete Pasteur, fie aplicnd pur i
simplu lama de sticl pe leziunea umed. Acoperim cu o lamel i eliminm prin uoar
apsare eventualele bule de aer. Transportul trebuie s fie realizat foarte rapid, de preferat n
maxim 20 de minute astfel nct se recomand ca recoltarea s fie realizat ntr-un spaiu
corespunztor, n imediata vecintate a laboratorului. Este o etap esenial.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic se poate realiza fie cu ajutorul microscopului
cu fond ntunecat, fie prin imunofluorescen direct (exist i alte tehnici, care nu vor fi
discutate n acest manual).
Pentru examenul microscopic pe fond ntunecat, pregtim 2 lame (preferabil 3) pentru fiecare
leziune pe care dorim s o examinm. Preparatele nu trebuie s conin hematii, leucocite,
fragmente de esut sau bule de aer. n timp ce examinm primul preparat microscopic vom
425
introduce celelalte 2 preparate ntr-o cutie Petri n care exist puin vat sau hrtie de filtru
umezit, pentru a pstra atmosfera umed i a preveni uscarea. Preparatul microscopic trebuie
examinat sistematic (minim 10 minute n cazul unui rezultat aparent negativ), iniial cu
obiectivul uscat, ulterior, dup vizualizarea unor microorganisme care par s aparin genului
Treponema, cu obiectivul de imersie. Este necesar ca examinatorul s aib experien n acest
tip de examinare. Microorganismele caracteristice sunt foarte subiri i lungi (0,25-0,3m / 6-14
m), spiralate, prezentnd 8-14 spire (regulate, strnse, adnci i rigide), mobile (spirele nu se
deformeaz), deplasarea n cmpul microscopic nu este foarte rapid dar seamn cu o micare
de nurubare (exist i microorganisme care sunt imobile dar pstreaz micrile de translaie,
rotaie lent, flexie uoar de la un cap la cellalt sau flexie median cu revenire ca un resort),
luminoase pe fondul negru al cmpului microscopic. n cazul unui rezultat negativ putem repeta
recoltarea i examinarea. n anumite situaii se poate recomanda nceperea tratamentului, iar
evoluia va fi monitorizat clinic i serologic (rezultatul negativ nu elimin diagnosticul de sifilis).
Rezultatul pozitiv, atunci cnd poate fi exclus prezena unor treponeme saprofite, pune
diagnosticul de sifilis primar nainte ca anticorpii s poat fi detectai serologic.
426
Inocularea p.p. la animale de laborator reprezint cea mai sensibil metod pentru detectarea
T. pallidum. Pentru meninerea n laborator a unor treponeme viabile sau pentru determinarea
infectivitii au fost utilizate diferite animale (hamsteri, cimpanzei etc) ns cel mai util este
iepurele. Iepurele poate fi inoculat (intratesticular sau cutanat) cu orice tip de p.p. cu condiia ca
ntre momentul recoltrii i inoculare s nu treac mai mult de 60 minute. n caz contrar, p.p.
trebuie adus rapid la o temperatur de cel puin -70C (ex. n azot lichid) i meninut astfel pn
n momentul inoculrii. Testul infectivitii la iepure (RIT) rmne metoda standard; cu ajutorul
RIT se apreciaz sensibilitatea i specificitatea oricrei alte metode care este propus pentru
diagnosticul sifilisului.
n centrele de referin au mai fost utilizate i tehnici ale biologiei moleculare (sondele
nucleotidice, PCR). Tehnica PCR ar putea avea utilitatea diagnostic atunci cnd p.p. este
reprezentat de lichidul amniotic.
Treponema pallidum i pstreaz sensibilitatea la penicilin, medicament care rmne de
elecie pentru tratamentul sifilisului. Exist i o serie de alternative, dar dorim s subliniem c n
vederea tratamentului acestei maladii trebuie respectate recomandrile fcute de ctre comisia
de specialitate a ministerului sntii, pentru fiecare form de sifilis n parte.
53. 4. 2. Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic se realizeaz folosind antigene nontreponemice i antigene treponemice.
Testele nontreponemice (nespecifice) i treponemice (specifice) sunt complementare; nu se
exclud. Testele nontreponemice sunt utilizate n screening, diagnostic i monitorizarea
pacienilor n cursul tratamentului. n vederea stabilirii diagnosticului vom utiliza i testele
treponemice n corelaie cu cele nontreponemice (nici unul dintre cele dou tipuri nu pot
acoperi din punct de vedere diagnostic toate stadiile sifilisului). Cel mai frecvent utilizm VDRL
sau RPR (din prima categorie) cuplat cu TPHA sau FTA-Abs (din a doua categorie). De obicei
utilizm serul provenit de la pacientul suspect, dar n anumite situaii testul este realizat
folosind plasm sau LCR.
53. 4. 2. 1. Reacii serologice care utilizeaz antigene nontreponemice
Antigenele nontreponemice sunt lipide care pot fi extrase din diferite esuturi. Cardiolipina este
un difosfatidil-glicerol. Pentru creterea sensibilitii, cardiolipina este cuplat cu colesterol i
lecitin. Anticorpii anti - cardiolipin au fost numii reagine. Sunt depistai n serul pacienilor
la 2-3 sptmni i n LCR la 4-8 sptmni de la debutul infeciei, n cazurile netratate.
427
Tehnica actual standard este VDRL (Veneral Disease Research Laboratories), un test de
floculare. Testele de floculare se bazeaz pe faptul c particulele antigenice rmn dispersate n
serul normal, dar formeaz grunji vizibili atunci cnd se combin cu reaginele. Testele se
preteaz la automatizare i la folosirea pentru screening datorit costului redus. O variant
economic i elegant este microreacia VDRL care se practic n plci cu godeuri.
Pregtirea serului de cercetat include controlul aspectului serului (se clarific prin centrifugare),
inactivarea timp de 30 minute la 56C i o nou centrifugare (n cazul apariiei unor particule n
suspensie). Nu vor fi testate serurile infectate sau hemolizate. n cazul n care trec mai mult de 4
ore din momentul inactivrii, serul va fi inactivat din nou timp de 10 minute la 56C.
Temperatura din camera de lucru trebuie s fie ntre 23-29C. Testul se efectueaz pe ser
nediluat (pentru monitorizarea evoluiei sub tratament se pot face diluii binare). Se pot testa
mai multe seruri concomitent i este necesar o notare clar a godeurilor, pentru fiecare godeu
n parte. Fiecare test va include martori (seruri cu reactivitate cunoscut, martor pentru Ag). n
fiecare godeu punem cte 0,05 ml ser (n godeul pentru martor Ag punem soluie salin
fiziologic). Dup agitarea flaconului cu suspensia antigenic, utiliznd o sering cu ac calibrat
depunem cte o pictur (1/60 ml) n fiecare godeu. Acoperim placa i o aezm pe un agitator
care poate fi reglat la 180 turaii pe minut, pe o durat de 4 minute.
Citim imediat rezultatul, prin transiluminare pe fond negru, cu ajutorul unei lupe, ncepnd cu
martorii (negativ, slab pozitiv, pozitiv, martorul pentru Ag) i continund cu serurile de testat.
428
Rezultatul este negativ dac lichidul nu prezint flocoane i este asemntor martorului negativ
i martorului Ag. Rezultatul este slab pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane de dimensiuni mici
ntr-un lichid uor turbid n timp ce rezultatul este intens pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane
de dimensiuni mari iar lichidul este clar. Repetm rezultatele slab pozitive sau dificil de
interpretat. n cazul n care suspicionm existena fenomenului de prozon (inhibiia total sau
parial a floculrii prin exces de Ac), vom repeta testarea se va repeta pe diluii de ser.
Vom lua n considerare un rezultat pozitiv n corelaie cu rezultatul obinut la testul treponemic,
rezultatul diagnosticului bacteriologic, elementele clinice i epidemiologice. Un rezultat pozitiv
n condiiile n care toate celelalte date sunt negative este de obicei un rezultat fals-pozitiv. Pot
aprea rezultate fals-pozitive la persoane cu hepatit viral acut, pneumonii virale, rujeol,
malarie, mononucleoz infecioas, alte infecii virale, la persoane care au fost recent vaccinate,
precum i la persoane cu boli ale esutului colagen, persoanele cu lepr, persoane cu diferite
neplazii, persoane care se drogheaz, la persoanele n vrst etc. Reacii fals-pozitive pot aprea
i pe parcursul sarcinii.
Testul VDRL semi-cantitativ, efectuat pe 2 probe consecutive de ser este util n urmtoarele
situaii: scderea de 4 ori a titrului n sifilisul recent, tratat, semnific de regul eficacitatea
tratamentului; creterea de 4 ori a titrului sugereaz o infecie activ n evoluie, o reinfecie
sau ineficacitatea tratamentului.
VDRL-CSF, reprezint o variant a VDRL, tehnica fiind utilizat n suspiciunea
de neurosifilis, pentru identificarea anticorpilor prezeni n LCR.
429
Testul RPR (Rapid Plasma Reagin) este executat pe carduri din material plastic pe care apar mai
multe cercuri de 18 mm. Antigenul este preparat dintr-o suspensie antigenic tip VDRL
modificat (pentru a elimina etapa de inactivare prin cldur). Reactivul conine i particule de
crbune. Antigenul RPR este amestecat cu serul de cercetat n cercul de pe card. Daca Ac anti-T.
pallidum sunt prezeni, se combin cu particulele lipidice din Ag i produc aglutinarea lor.
Particulele de crbune coaglutineaz cu Ac i duc la apariia unor granule negre pe fondul alb al
cardului. n absena Ac rezult un aspect gri uniform. Testul se poate realiza calitativ i cantitativ
(diluii de ser).
Au fost realizate i tehnici serologice care utilizeaz antigene treponemice extrase din T. reiter
(specifice de grup) de tipul RFC i CIE.
430
De mare utilitate practic sunt reaciile serologice care utilizeaz antigene treponemice extrase
din tulpina Nichols de T. pallidum, cu o mare specificitate.
Pentru o lung perioad de timp, tehnica standard a fost testul imobilizrii treponemelor (TIP).
Tehnica a fost pus la punct n anul 1949. Serul de cercetat era diluat i amestecat cu
complement i treponeme vii, mobile, obinute din ancrul testicular de la iepure. n prezena
Ac specifici, treponemele erau imobilizate, n timp ce n lipsa acestora, mobilitatea era pstrat
(examinarea se fcea cu microscopul pe fond ntunecat).
Testul de hemaglutinare (Treponema pallidum Hemagglutination Test, TPHA) a fost pus la punct
n urm cu 30 de ani. n prezena unor Ac fa de Ag adsorbite pe membrana lor, hematiile
aglutineaz n reele caracteristice formate din complexe imune. Ag treponemic este extras din
tulpina Nichols i adsorbit pe suprafaa hematiilor de oaie sau pasre fixate (hematii
sensibilizate). Drept martor sunt folosite hematii fr Ag treponemice (nesensibilizate). n cazul
n care n serul de cercetat sunt prezeni Ac anti-T. pallidum, hematiile sensibilizate aglutineaz;
hematiile nesensibilizate nu aglutineaz i se depun sub forma unui buton pe fundul godeului.
Pentru creterea specificitii, majoritatea truselor comerciale includ n diluent un extract de
treponeme nepatogene. Testul poate fi realizat calitativ sau semi-cantitativ (diluii ale serului de
cercetat). Exist metode automate, utilizate pentru testarea sngelui donat.
431
Tehnica ELISA
Tehnica ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM anti-T. pallidum; este util pentru documentarea
infecie intra-uterine.
Tehnica Western blot poate detecta att Ac de tip IgM ct i de tip IgG.
Aa cum am mai menionat, interpretarea rezultatelor obinute se face innd cont de contextul
clinic, epidemiologic i de laborator. Lund n considerare numai rezultatele de laborator pentru
testele menionate n acest capitol, ar putea rezulta mai multe variante. Spre exemplu, dac
testul VDRL este negativ i testul TPHA este tot negativ, de regul infecia este exclus. Dac ne
gndim c pacientul este la debutul bolii iar anticorpii sunt nc nedectabili, repetm testele
dup 3 sptmni. n cazul n care testul VDRL este pozitiv iar testul TPHA este negativ, este
posibil s ne aflm n situaia de mai sus, la debutul bolii i repetm testele dup 3 sptmni.
Dac rezultatele rmn nemodificate, este vorba de o reacie fals-pozitiv. Pot fi luate n
discuie i alte posibiliti.
53. 5. Tratament
Penicilina n concentraie de 0,003 uniti / ml are activitate bactericid dovedit i continu s
reprezinte tratamentul de elecie n sifilis. n sifilisul mai vechi de 1 an sau n sifilisul latent,
benzatin penicilina G (2,4 milioane uniti) se administreaz de 3 ori la interval de cte o
sptmn. n neurosifilis se accept aceeai terapie, dar se utilizeaz cantiti mai mari de
penicilin (penicilina G apoas, 20 de milioane uniti intravenos zilnic, timp de 2-3 sptmni).
La cteva ore de la nceperea tratamentului se poate produce o reacie advers (JarishHerxheimer), datorat eliberrii masive de endotoxine din treponemele distruse.
La persoanele care prezint hipersensibilitate de tip I fa de penicilin se pot administra
tetraciclin, doxiciclin sau ceftriaxon.
53. 6. Epidemiologie. Profilaxie
n prezent, incidena sifilisului i a altor boli cu transmitere sexual a crescut la nivel mondial. Cu
excepia sifilisului congenital i a expunerii profesionale la personalul sanitar, sifilisul este
dobndit pe cale sexual. Incidena bolii este n mod particular crescut la brbaii homosexuali,
iar reinfecia la persoane tratate este obinuit. O persoan infectat poate rmne infectat
timp de 3-5 ani pe parcursul sifilisului precoce. Sifilisul tardiv, mai vechi de 5 ani, este n mod
normal contagios. n consecin, msurile de control depind de: 1. tratamentul prompt i
adecvat al tuturor cazurilor depistate, 2. supravegherea surselor de infecie i a contacilor,
432
astfel nct acetia s fie tratai, 3. igien sexual, 4. profilaxia la momentul expunerii. Att
profilaxia mecanic (prezervative), ct i chimioprofilaxia (penicilin dup expunere) au limite.
De menionat c relativ frecvent pot fi contractate simultan mai multe infecii cu transmitere
sexual. De aceea, atunci cnd se descoper o infecie cu transmitere sexual trebuie s se ia n
calcul i posibilitatea unei infecii sifilitice.
n 1997, n Romnia, s-au raportat 7.704 cazuri de sifilis, ceea ce corespunde la o inciden de
34,20/0000. Numrul de cazuri raportate, la aduli a crescut, anual, pn n 2002 (12.702 cazuri
raportate, inciden 58,280/0000). ncepnd cu 2003, numrul de cazuri de sifilis la aduli a sczut,
raportndu-se 9.698 cazuri n 2003, 8.838 cazuri n 2004, 6.862 cazuri n 2005 i 5.661 cazuri n
2006, un numr istoric de mic, corespunznd la o inciden de 26,20/0000. n aceeai perioad de
timp, numrul de cazuri de sifilis congenital a crescut anual, atingnd valoarea maxim de 423
cazuri raportate n 2002, ulterior raportndu-se 202 cazuri n 2003, 136 cazuri n 2004, 38 cazuri
n 2005 i 16 cazuri n 2006. Comparnd tendina evolutiv a sifilisului n Romnia i SUA, ne
putem ntreba dac datele raportate reprezint situaia real, la fel cum ne puneam aceast
ntrebare i n cazul gonoreei.
Incidena sifilisului primar i secundar n SUA, n anul 1997, a fost de 3,19 0/0000 cu 8.550 cazuri;
n anul 1998 au fost declarate 6.993 cazuri, n anul 1999, 6.657 cazuri iar n anul 2000 au fost
raportate 5.979 cazuri. Tendina de scdere a luat sfrit n anul 2000; ncepnd cu anul 2001,
numrul de cazuri de sifilis primar i secundar, mpreun, a crescut an de an, valoarea maxim
nregistrndu-se n anul 2005 (8.724 cazuri).
Lund n considerare numrul total de cazuri de sifilis raportate n SUA n anul 1999 (35.628),
cifra corespundea la o inciden de 13,070/0000, n continu scdere, n ultimii 12 ani. Cel mai mic
numr de cazuri (indiferent de form) a fost nregistrat n anul 2000 (31.575), ns ncepnd cu
anul 2001, numrul de cazuri a crescut, depind n fiecare an cifra de 32.000, cu un maxim n
2003 (34.270 cazuri) i peste 33.000 cazuri raportate n 2004 i 2005.
n schimb, numrul de cazuri de sifilis congenital, n SUA, a sczut continuu, de la o valoare de
801 cazuri raportate n 1998, 441 cazuri raportate n 2001 i respectiv 329 cazuri n 2005.
53. 7. Boli nrudite cu sifilisul
Toate aceste boli sunt date de treponeme care nu pot fi deosebite de T. pallidum. n toate
cazurile apar reacii pozitive la testele treponemice i nontreponemice pentru sifilis, iar unele
reacii ncruciate pot fi demonstrate la animalele de laborator i probabil la oameni. Nici una
dintre aceste boli nu se transmite sexual; ele se transmit de obicei prin contact direct. Nici unul
dintre germenii implicai nu a fost cultivat pe medii artificiale.
7. 1. Bejelul se ntlnete n Africa, Orientul Mijlociu, Asia de Sud-Est i n alte zone. n mod
particular apare la copii i produce leziuni cutanate foarte contagioase; complicaiile viscerale
tardive sunt rare. Penicilina este antibioticul de elecie.
7. 2. Pianul este o infecie endemic, ce apare n mod particular la copii, n rile cu climat cald i
umed. Agentul cauzal este T. pertenue. Leziunea primar, o papul ulcerativ, apare de obicei
pe brae sau picioare. Transmiterea se face prin contact direct la copii sub 15 ani. Nu au fost
433
434
efectuarea unor noi analize, fiind trimis din nou la spitalul cu profil de boli infecioase (tnrul
coleg consider c aceste analize ar fi putut s fie fcute, local).
n clinica de boli infecioase, este consultat de ctre un alt medic, care recomand internare
pentru investigaii i stabilirea diagnosticului i atitudinii de urmat. Tnrul refuz internarea,
datorit faptului c urma s nceap sesiunea de examene. n aceste condiii semneaz c
refuz internarea i analizele nu se mai efectueaz.
Astfel, primul an de facultate se ncheie, suferina se menine (exceptnd durerile de tip
colicativ), fr diagnostic.
Avnd n memorie periplul din anul precedent, tnrul coleg nu mai solicit sprijin medical, dar,
nainte de nceperea noului an, dup ncheierea celor trei sptmni de practic de var
efectuate sub atenta ndrumare a unuia dintre profesorii de la facultate, la presiunea familiei
i a unor colegi apropiai, tnrul solicit sfatul medical de la respectivul profesor.
Datorit faptului c nu existau semne sau simptome care s orienteze pentru recoltarea unui
anumit produs i nu existau evidene c metodele de laborator ar putea rezolva problema n
mod individual, profesorul de la facultate ia legtura cu un coleg i prieten, n vederea realizrii
unui consult de specialitate, competent i fcut cu druirea care trebuie s fie caracteristic
fiecrui medic.
Pacientul s-a prezentat, a discutat n amnunime istoricul adenopatiei i al celorlalte simptome,
povestind i modul n care adenopatia a interferat cu viaa sa, din mai multe puncte de vedere.
n urma unui consult riguros, complet, s-a descoperit ganglioni inflamai i n zona axilar i
supraclavicular stng, dar activitilor cotidiene ale pacientului. Medicul a opinat c
adenopatia inghinal ar putea fi datorat microleziunilor peniene din timpul actului sexual, care
ar putea permite intrarea n organism a unor germeni provenii din flora microbian vaginal.
435
n urma infeciei apare un rspuns imun umoral, putnd fi detectai anticorpi aglutinani i
anticorpi fixatori de complement. De remarcat faptul c, inclusiv n decursul unei singure infecii
apar modificri antigenice, care explic recderile. Ultima vindecare (dup 3-10 recderi) este
asociat cu prezena anticorpilor mpotriva mai multor variante antigenice. Imunitatea
consecutiv infeciei este de obicei de scurt durat.
Dup o perioad de incubaie (3-10 zile), debutul este brusc, cu frisoane i creterea rapid a
temperaturii. n acest timp, spirochetele se afl n numr mare n snge. Febra persist 3-5 zile,
apoi scade. Perioada afebril dureaz 4-10 zile i este urmat de un al doilea atac de frisoane,
febr, cefalee intens i stare de ru. Pot apare succesiv pn la 10 asemenea recderi, a cror
severitate scade n general progresiv. Puseele febrile se asociaz cu bacteriemie.
Febra recurent este endemic n multe zone ale globului. Principalul rezervor este reprezentat
de roztoare, surs de infecie pentru cpue. Distribuia focarelor endemice i incidena
sezonier a bolii sunt n mare parte determinate de modul de rspndire al cpuelor. La aceste
insecte, Borrelia poate fi transmis transovarian din generaie n generaie. Spirochetele sunt
prezente n toate esuturile cpuelor, care pot transmite bacteriile prin muctur sau atunci
cnd sunt zdrobite. n cazul pduchilor, infecia nu se transmite generaiilor urmtoare, iar
boala la om se datoreaz contactului pduchilor zdrobii cu leziunile determinate de neptur.
La populaiile infectate cu pduchi pot aprea epidemii severe, transmiterea fiind favorizat de
aglomeraii, malnutriie i de climatul rece.
Prevenirea febrei recurente se bazeaz pe evitarea contactului cu cpue, pduchi i prin
despduchiere (curenie, dezinsecie).
Marea variabilitate a remisiunilor spontane n cazul febrei recurente, face foarte dificil
evaluarea eficacitii chimioterapiei. Tetraciclina, eritromicina (i alte macrolide), penicilina i
cefalosporinele de generaia a 3-a sunt considerate utile.
54. 3. 2. Diagnosticul de laborator n febra recurent
Diagnosticul de laborator n borrelioza recurent este bacteriologic, direct urmnd etapele
cunoscute. Diagnosticul serologic poate oferi unele informaii, n context.
54. 3. 2. 1. Diagnosticul borreliozelor pornete de la elemente clinice, epidemiologice, anumite
date de laborator i este confirmat prin diagnostic bacteriologic.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile
cunoscute (vezi anexa nr. 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de
iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de snge dar s-ar
putea recolta i vectori (pduchi, cpue) sau LCR, lichid sinovial etc, n funcie de manifestarea
clinic. Sngele trebuie recoltat n perioadele febrile. n cazul n care produsele nu se pot
examina imediat, recomandm transportul acestora la temperatura frigiderului (+4C) sau
inocularea unor animale receptive (ex. oareci albi sau obolani tineri) i transportul acestora
ctre laborator.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt
ntre lam i lamel utiliznd sngele ca p.p., cu examinare la microscopul cu fond ntunecat.
Borreliile se vd ca spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30 mm), cu
437
spire largi i inegale, foarte mobile (cu micri de rotaie i rsucire), pe fondul negru al
preparatului. Se pot realiza frotiuri subiri sau examenul picturii groase, colorate Giemsa
prelungit, May-Grnwald-Giemsa sau Wright precum i cu acridin-orange sau cu Ac monoclonali
marcai fluorescent i cu examinare la microscopul cu fluorescen. Pe frotiul colorat Giemsa
prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate, situate printre hematii. Examenul
microscopic realizat de ctre un medic experimentat permite identificarea borreliilor n circa
70% dintre cazuri, n condiiile respectrii normelor diagnosticului bacteriologic.
Preparatele microscopice ar mai putea fi realizate pornind de la hemolimfa vectorilor infectai
(pduche, cpu). De menionat faptul c n cazul acestui p.p. borreliile i menin pentru o
lung durat de timp forma i mobilitatea caracteristice n timp ce n sngele recoltat de la
gazda uman sufer modificri datorit prezenei anticorpilor specifici, iar n timp i pierd
mobilitatea).
n ultima perioad s-a introdus tehnica PCR pentru identificarea ADN-ului borrelian, pornind de
la produsul patologic.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz de regul la nivelul
centrului de referin, existnd mai multe tehnici care ar putea fi utilizate.
Se pot inocula animale de experien sensibile (ex. oareci sau obolani), cu inoculare
intraperitoneal. Animalele vor fi monitorizate zilnic clinic i prin examinarea microscopic a
sngelui (p.p. se poate recolta de la nivelul venei cozii). Se mai pot inocula vectori (pduchi sau
cpue) sau oul de gin embrionat (la nivel intra alantoidian sau n membrana
chorioalantoidian).
Se pot utiliza i medii de cultur artificiale speciale (cu ageni reductori, N-acetilglucozamin,
acizi grai nesaturai cu caten lung, ser de iepure), n condiii de microaerofilie, cu incubare la
32-37C. Se recomand i utilizarea mediilor selective care includ o combinaie de ageni
antimicrobieni precum rifampicin, amfotericin B i fosfomicin. Datorit faptului c mediile de
cultur sunt lichide, nu se obin colonii izolate. Creterea microbian trebuie verificat prin
realizare de preparate proaspete examinate la microscopul cu fond ntunecat la fiecare 3 zile,
pentru o durat de 2-6 sptmni.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se poate realiza pe baza:
Caracterelor morfotinctoriale
sunt spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30 mm), cu spire
largi i inegale, foarte mobile (cu micri de rotaie i rsucire), pe fondul negru al
preparatului;
pe frotiul colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele
efilate;
438
Caracterelor de cultur
dac are loc multiplicarea borreliilor pe mediul de cultur acesta rmne limpede, fr
sediment, dar i modific culoarea (ex. vireaz de la rou-portocaliu spre roz-glbui)
Caracterelor biochimice
Borreliile sunt microaerofile, fermenteaz glucoza producnd bioxid de carbon i acid lactic (dar
aceste teste nu sunt utilizate de regul n diagnostic);
440
441
Starea pacientului s-a mbuntit considerabil n urmtoarele zile i s-a decis externarea
acestuia, cu tratament antibiotic pn la o cur complet de 4 sptmni, sub strict
supraveghere medical, propunere acceptat de familie i pus n practic.
Cu toate c au existat numai semne i simptome n sfera neurologic (situaie rar ntlnit n
boala Lyme) i nu au existat nici alte leziuni foarte sugestive pentru aceast patologie, datele
obinute prin anamnez (ex. cltorie ntr-o zon endemic pentru boala Lyme) au orientat
cercetrile diagnostice. Lipsa de tipicitate a tabloului clinic, dar i punerea n final a unui
diagnostic care prea improbabil iniial, arat nc o dat afirmaia excepia ntrete regula.
Instituirea tratamentului (empiric), avnd la baz flerul medicului curant, s-a dovedit a fi a
atitudine foarte potrivit.
442
Anticorpii aprui n cursul bolii confer protecie de grup i tip pentru o perioad variabil (de
ordinul anilor).
55. 2. 7. Rspuns imun
Antigenele de suprafa sunt imunogene in vivo. Anticorpii rezultai din trecerea prin boal pot
conferi protecie pentru o perioad variabil, de ordinul anilor. Imunitatea postinfecie este
specific serotipului tulpinii infectante, respectiv tulpinii vaccinale. n cursul infeciei apar
anticorpi aglutinani, fixatori de complement i litici, care sunt evideniai n ser ncepnd cu
zilele 4-6 de la debutul bolii, ating nivelul maxim ntre sptmnile 3-6 de boal i scad apoi
progresiv.
55. 2. 8. Caractere de patogenitate
Sunt proprii speciei L. interrogans, care este patogen prin multiplicare i invazivitate. Virulena
este explicat pn n prezent prin mobilitate, gradul de ncovoiere a extremitilor celulei
bacteriene i prin prezena factorului de virulen Vi existent la suprafaa unor tulpini. Cu ct
extremitile celulei bacteriene sunt mai curbate, cu att puterea de penetrare a esuturilor de
ctre leptospire este mai mare.
55. 3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produse
Leptospiroza se caracterizeaz prin polimorfism, pe parcursul evoluiei modificndu-i aspectul
clinic (se asociaz noi sindroame sau apar atipii clinice).
Dup o perioad de incubaie de 1-2 sptmni, debutul bolii poate fi marcat de febr.
Microorganismul circul pe calea torentului sanguin i se cantoneaz n organele
parenchimatoase (ficat i rinichi), determinnd hemoragii, necroz tisular i disfuncii de organ
(pot aprea icter, hemoragii, manifestri datorit reteniei azotate etc). Boala are destul de
frecvent un aspect bifazic: dup o ameliorare iniial urmeaz faza a doua a bolii, marcat de
creterea titrului de anticorpi IgM. Leptospiroza se poate manifesta ca meningit aseptic (cu
lichid clar, asemntor macroscopic cu LCR recoltat de la pacienii cu meningit viral).
Afectarea renal la multe specii de animale este cronic, avnd drept efect eliminarea unui
numr de leptospire prin urin; acesta reprezint probabil principalul mod de contaminare la
om. Urina uman poate conine spirochete n a doua i a treia sptmn de boal.
Dei din leptospire nu a fost izolat un factor toxic bine difereniat toxicitatea care conduce la
apariia principalelor manifestri este determinat de eliberarea unei endotoxine. Intervenia
endotoxinei explic modificrile tisulare macro i microscopice de tip toxic degenerativ;
eficiena mai sczut a terapiei cu antibiotice dup 7-12 zile de la debutul bolii; producerea
ocului endotoxic (datorit lizei masive a leptospirelor), febra cu valori de peste 38,5C cu
aspect bi i uneori trifazic (relativ caracteristic pentru leptospiroz) sau instalarea
hipersensibilitii celulare de tip IV n leptospiroza acut.
444
Caractere morfotinctoriale:
realizm un preparat proaspt (fr a folosi lamela) din mediul de cultur i l
examinm la microscopul cu fond ntunecat;
leptospirele, cu dimensiuni de 0,1 m / 5-15 m, apar ca filamente luminoase,
spiralate, foarte mobile, cu micri de nurubare i flexiune, dar i cu o uoar
deplasare n spaiu, pe fondul negru al preparatului;
se pot realiza frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare argentic
(Fontana-Tribondeau) precum i prin IF direct;
446
Caractere antigenice:
se utilizeaz seruri de referin cu anticorpi fa de serogrupurile cunoscute i tulpina de
identificat izolat n cultur pur i concentrat la o densitate standard, prin reacii de
aglutinare microscopic, la nivelul centrului de referin care a elaborat protocolul standard de
operare; n mod similar se poate identifica i serovarul implicat;
447
55. 5. Tratament
Terapia cu antibiotice include n principal medicamente din grupa penicilinelor sau a
tetraciclinelor (ex. doxiciclin). Cloramfenicolul i rifampicina nu au efect asupra leptospirelor.
55. 6. Epidemiologie
Leptospirozele sunt, n esen, infecii ale animalelor, infecia uman aprnd accidental, de ex.
prin contactul cu apa sau cu alte materiale contaminate cu excremente ale animalelor.
Principalele surse de infecie sunt reprezentate de obolani, oareci, roztoare slbatice, porci,
cini sau vaci. Acestea excret leptospire prin urin i fecale att n timpul bolii active, ct i n
timpul evoluiei asimptomatice. Leptospirele rmn viabile mai multe sptmni n apele
stttoare, omul putndu-se infecta prin mbiere, not, prin consumul acestor ape sau prin
ingestia de mncruri contaminate. Persoanele cu cea mai mare probabilitate de a intra n
contact cu apa contaminat de obolani (mineri, lucrtorii din canalizare, fermieri, pescari) au
cel mai mare risc de infecie. Copiii se pot infecta cu leptospire de la cini, mult mai frecvent
dect adulii.
Cazurile de leptospiroz evideniate n anul 1998, n Romnia, au fost n numr de 557,
incidena bolii fiind de 2,50/0000. n anul 1999, numrul de cazuri a crescut la 755, incidena
ajungnd la valoarea de 3,40/0000 iar n anul 2000 au fost raportate 370 de cazuri. n perioada
2001-2004, numrul de cazuri nregistrate a fost mai mic, ntre 244 (2003) i 310 (2001), ns n
ultimii ani au fost raportate peste 380 de cazuri / an, respectiv 451 cazuri n anul 2005
(inciden 2,090/0000) i 386 cazuri n 2006 (inciden 1,790/0000).
n SUA, n 1974, au fost raportate 8.351 cazuri de leptospiroz. n perioada 1975-1994 au fost
raportate ntre 31 i 110 (o singur dat, n rest numrul de cazuri a fost 100) cazuri pe an. Din
1995 leptospiroza nu mai face parte din lista de boli cu declarare obligatorie.
55. 7. Profilaxie
Controlul leptospirozei const n prevenirea expunerii la apa potenial contaminat i reducerea
contaminrii prin inerea sub control a roztoarelor. Doxiciclina, administrat n doz de 200 mg
o dat pe sptmn n timpul expunerii, are un caracter profilactic. Cinii pot fi vaccinai
mpotriva infeciilor leptospirotice.
55. 8. Povestire adevrat
Diagnosticul diferenial face diferena
Evoluia tiinei n domeniul medical produce noi informaii; viitorii medici i medicii ar trebui s
le cunoasc i s le utilizeze, n interesul pacienilor. Pentru a ajunge un bun medic este nevoie
de rezisten (fizic i psihic), de sute i mii de ore de nvat, de studiu individual, practic i
de absorbit orice lucru util de la colegii mai mari, cu experien.
Este nevoie de studiu, pentru c este nevoie de performan. Este nevoie s acumulm
cunotine, care s consolideze o construcie care apare i se ntrete n ani i ani de munc,
iar la nceput (de via n clinic) trebuie s nvm n primul rnd s punem cele mai potrivite
ntrebri i s nelegem importana anamnezei. Pe aceast baz se poate aduga examenul
448
clinic, iniial pe segmente, dar care trebuie s ajung s fie complet, pn (cel trziu) n finalul
celui de-al treilea an de studiu.
Pentru a exemplifica cele de mai sus, din literatura internaional am extras urmtorul caz.
Un pacient de sex masculin, n vrst de 35 de ani, pasionat de viaa n natur i de vntoare,
se prezint la camera de gard a unui spital cu urmtoarele motive de internare: febr, stare
general alterat, dureri musculare i articulare.
n discuia cu pacientul, s-a putut afla c s-a simit bine pn n urm cu 4 zile, moment n care
s-a simit febril (nu a pus termometrul), a avut dureri n articulaiile membrelor inferioare,
dureri musculare i dureri la nivel lombar.
Cu 2 zile nainte de internare a folosit termometrul i a nregistrat temperatura (39,7C). Starea
general a nceput s fie mediocr, au aprut cefaleea, greaa i a vrsat de 2 ori.
Dup primele faze ale anamnezei, datele aflate nu permiteau orientarea spre cauza acestui
sindrom febril.
Continund discuia cu pacientul, au mai fost aflate urmtoarele informaii: a avut gonoree la
vrsta de 20 de ani, a consumat droguri (att pe cale oral ct i pe cale intravenoas), a
cltorit recent n California, fiind vntor i lucrnd n domeniu, intr frecvent n contact cu
animalele (inclusiv cele de la o ferm), a consumat frecvent carne de vnat (inclusiv n snge)
i nu a avut nici o problem n a consuma lapte nefiert sau nepasteurizat.
Aceste elemente, foarte variate, nu au putut s direcioneze foarte mult diagnosticul (pacientul
ar fi putut s aib orice infecie cu transmitere sexual, orice infecie transmis prin injectare probabil n condiii la limita igienei, sau ar fi putut s aib orice infecie comun animalelor i
care se poate transmite omului, de ex. tularemie, bruceloz, leptospiroz sau cium). i, ca
ntotdeauna, chiar dac discuia noastr se poart la microbiologie, nu trebuie s uitm faptul
c semnele i simptomele pot avea i cauze ne-infecioase.
Examenul clinic, pe aparate i sisteme, a fost normal cu excepia hipertermiei, prezena
adenopatiei axilare (ganglioni uor mrii, nedureroi, mobili cu planurile subiacente), o senzaie
de duritate la nivelul hipocondrului drept (ficat la rebord), fr leziuni muco-tegumentare,
dar prezentnd hemoragii subunghiale (pacientului le-a considerat ca fiind legate de munca
prestat). Nici aceste date nu au orientat diagnosticul.
Examenul clinic nu ofer elemente ajuttoare n stabilirea diagnosticului deoarece nu exist
semne patognomonice ce ar putea fi atribuite unei anumite boli sau sindrom.
Medicul curant, a apreciat c febra de peste 39C ar putea fi datorat unei infecii sistemice
(chiar dac nu a exclus o cauz ne-infecioas). Avnd n vedere c semnul febr, poate s
semnifice o cauz amenintoare de via, este important ca investigarea etiologiei i stabilirea
unui tratament adresat cauzei, sunt foarte importante. n cadrul diagnosticului diferenial,
medicul curant a luat n considerare existena unei infecii virale (virus hepatitic, virus EpsteinBarr, virus citomegalic, arbovirus, HIV) sau a unei infecii bacteriene (Francisella tularensis,
Brucella spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., Leptospira spp. sau Coxiella burnetii).
449
Nici analizele de laborator (probe bioumorale) nu au fost foarte utile n diagnosticul diferenial
(numr crescut de leucocite, procent de neutrofile n limite normale, VSH la limita unui rezultat
crescut, transaminaze cu valori mai mari dect normal). n ambulatoriu, un medic, a
recomandat i efectuat recoltarea sngelui pentru hemoculturi, care au rmas negative pn n
a 5-a zi (2 zile anterior internrii i nc 3 zile, dup internare).
n spital s-a recoltat snge pentru alte hemoculturi i pentru diferite examene serologice
(pentru HBV, HCV, HIV, EBV, CMV, Francisella tularensis, Brucella spp., Leptospira spp., Borrelia
spp. i Coxiella burnetii), un adevrat arsenal serologic. Radiografiile cardio-toraco-pulmonar
i cranian nu relevat nimic patologic n schimb tomografia computerizat a sugerat existena
unei adenopatii situat pelvian.
Numrul crescut de leucocite a sugerat c infecia este bacterian i nu viral.
S-a instituit tratament cu penicilin (injectabil) i doxiciclin.
n a treia zi de spitalizare, la nivel tibial a aprut o erupie eritematoas, iar la nivelul faringian
posterior i palatin, au aprut vezicule de mici dimensiuni.
Prin consultarea cu ali colegi, medicul curant a aflat c au existat i alte situaii, n care pacieni
cu leptospiroz au prezentat leziuni la nivel tibial; totui aspectul nu era caracteristic i s-a decis
ateptarea rezultatelor de laborator (serologice).
n a doua zi de la nceperea tratamentului temperatura a sczut (37,8C), iar la 4 zile leziunile au
disprut. La 7 zile de la prima recoltare (pentru examene serologice), a fost recoltat o nou
prob, pentru urmrirea n dinamic a rezultatelor. Anticorpii au fost prezeni, numai n a doua
prob, pentru Leptospira spp.
Punerea diagnosticului de leptospiroz i instituirea tratamentului antibiotic corespunztor
poate fi decisiv pentru evoluia pacientului; dei exist multe cazuri n care boala este
autolimitant, exist i cazuri n care rata fatalitii este foarte mare.
450